Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums Gegenstand :der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Avil- amycin, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man den Stz@mm Streptomyces viridochromogenes A 23575 oder eine Variante dieses Stammes unter aeroben Bedingungen züchtet und das Antibiotikum Avil- amycin hierauf isoliert.
Das Antibiotikum Avilamycin entsteht bei der Kultur eines neuen Aktinomyceten-Stammesder Gat tung Strep:tomyces, der im folgenden als Strepto- myces viridochromogenes A 23575 beschrieben wird.
Er wurde aus eigner in Caracas, Venezuela, gesam melten Bodenprohe isoliert und wird in unseren Laboratorien und in der Eidg. Technischen Hoch schule, Institut für spezielle Botanik, Zürich, unter dieser Bezeichnung aufbewahrt.
Streptomyces viridochromogene,s A 23575 bildet ein hellblaues Luftmycel. Die Sporenkettenbilden zahlreiche offene, meist regelmässige Spiralen mit monopodialen Verzweigungen und langer, gerader Hauptachse. Die Sporen sind elliptisch bis oval. Die Oberfläche .der einzelnen Sporen ist mit etwa 0,2 ,u langen Stacheln bedeckt, die an der Basis breit sind und eine Spitze bilden.
Beim Wachstum auf pepton- haltigen Nährsubstraten verursacht der Stamm A 23575 eine dunkle melanoide Verfärbung des Nährbodens. Das Wachstum des Stammes ist relativ wenig abhängig von der Temperatur, sowohl bei 18 als auch bei 40 entwickelt sich der Pilz .gut, doch liegt das Optimum zwischen 25 und 32 .
Zur weiteren Charakterisierung wird ,im folgen den das Wachstum von Streptomyces viridochromo- genes A 23575 auf verschiedenen Nährmedien be schrieben. Die Nährmedien 1-7 und 10 wurden nach W. Lindenbein, Arch. Mikrobiol. 17, 361 (1952) hergestellt. 1.
Synthetischer A,gar: Wachstum anfangs dünn, schleierartig und weiss gelb, später runzelig und hellgelb; Luftmycel einen staubigen Überzug bildend, kreideweiss.
2. Synthetische Lösung: Grundwachstum und Sediment punktförmig, milchweiss, .selten Sediment als Flocken; spärliche, farblose Pellikula.
3. Glukose-Agar: Wachstum dünn, schleierartig bis runzelig, hell- braun bis kastanienbraun; Luftmycel sammetig bis wollig, hellblau; Substrat kastanienbraun.
4. Glukose-Asparagin Aga:r: Wachstum :dünn, schleierartig, hellgelb bis grün- lichgelb; Luftmycel wenig wollig, weiss, ,teilweise hellblau.
5. Calciummalat-Agar: Wachstum dünn, schleierartig, hellgelb; Luftmycel anfangs sammetig und weiss, stellenweise .nach 10 bis 15 Tagen sammetig und hellblau.
6. Gelatinestich (18 ): Wachstum :sehr langsam und spärlich; Substrat kastanienbraun bis dunkelbraun; Verflüssigung nach 15 Tagen etwa 1 :cm. 7. Stärkeplatte: Wachstum dünn, -schleierartig, weissgelb bis hell gelb; Luftmycel sammetig bis wollig, mehlweiss; Hydrolyse nach 5 Tagen 5 mm, nach 12 Tagen 13 nun.
B. Kartoffel: Wachstum pustelig, hellbraun; Luftmycel dick wollig, anfangs weissgrau, später hellblau; Substrat kaastanienbraun bis dunkelbraun.
9. Karotte: Wachstum ispärlich, punktförmig bis pustelig; Luftmycel spärlich, kreideweiss. 10. Lackmusmilch: Wachstum in Form einer dicken, zusammenhän- genden, runzeligen Oberflächendecke, kastanien- braun bis :dunkelbraun bis bräunlich-pechschwarz; Luftmycel spärlich, grauweiss;
starke Peptonisie- rung, aber nur sehr schwach,. Koagulation; Substrat dunkelbraun.
Weiter reduziert der Stamm A 23575 Nitrate lang sam zu Nitriten.
Gemäss Ettlinger et a1. [Archiv Mikrobiologie,<I>31,</I> 326 (l958)] werden :die Arten der Gattung Strepto- myce,s charakterisiert durch Farbe des Luftmycels, Morphologie .der einzelnen Sporen und der .Sporen- ketten und schliesslich durch die melanoide Verfär bung von peptonhalti.gen Nährsubstraten.
Der Stamm A 23575 stimmt in diesen vier Merkmalen mit Streptomyces viridochromogenes (Krainsky) Waksma:n et Henrici überein und wird deshalb vor läufig dieser Art zugezählt.
Aus der Literatur ist bekannt, dass Stämme von Streptomyces viridochromo.genes das Antibiotikum Chartreusin bilden. Chartreusin ist eine gelb gefärbte Säure und hat völlig andere Eigenschaften als das farblose, neutrale Avilamycin.
Zur Herstellung des Antibiotikums Avil,amycin können auch Varianten, wie sie z. B. durch Selek- tionierung oder Mutation, insbesondere unter der Einwirkung von Ultraviolett oder Röntgenstrahlen oder von Stickstoffsenfölen, gewonnen werden, Ver wendung finden.
Der Streptomyceae.nstamm A 23575 kann z. B. in wässriger, anorganische Salze, eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle enthaltender Nährlösung gezüchtet werden, beispielsweise in ruhender Oberflächenkultuir oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttelflaschen oder den bekannten Fermentern. Als Temperatur eignet eich eine solche zwischen 18 und 40 .
Eine wesentliche antibakterielle Wirkung zeigt die, Nähr lösung dabei im allgemeinen nach 11/2-5 Tagen.
Die Nährlösung enthält als anorganische Salze beispielsweise Chloride, Nitrate, Carbonate, Sulfate von Alkalien, Erdalkalien, Magnesium, Eisen, Zink, Mangan. Als Stickstoff- und Kohlenstoffquelle und wachstumsfördernde Stoffe seien z.
B. genannt: Aminosäuren und ihre Gemische, Peptide und Pro teine sowie ihre Hydrolysate, wie Pepton oder Tryp- ton, Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Ge treidekörnern, wie Mais und Weizen, von Destilla- tionsrückständen bei der Alkoholherstellung, von Hefe, Bohnen, insbesondere der Sojapflanze, von Samen, beispielsweise der Baumwollpflanze oder von Erdnuss und Kokosnuss, ferner Glukose,
Saecharose, Lactose, Stärke, Mannit, Glycerin usw.
Zur Isolierung des Antibiotikums dienen z. B. folgende Verfahren: man trennt das Mycel vom Kulturfiltrat ab, wonach die Hauptmenge des Anti biotikums im Kulturfiltrat gefunden wird. Es bleiben aber trotzdem namhafte Mengen des Antibiotikums am Mycel adsorbiert. Es ist daher vorteilhaft, letzteres gut auszuwaschen. Dazu eignen sich beson ders organische, mindestens teilweise wasserlösliche Lösungsmittel, wie Alkohole, z.
B. Methanol, Ätha- nol und Butanole, oder Ketone_, z. B. Aceton und Methyläthylketon. Die Mycelextrakte werden ent weder direkt oder nach vorheriger Konzentration im Vakuum zum Kulturfiltrat gegeben. Man extrahiert das Gemisch mit einem mit Wasser nicht mischbaren, organischen Lösungsmittel, wie Ester niederer Fett säuren, beispielsweise Äthylacetat oder Amylacetat, Kohlenwasserstoffen, z. B.
Benzol, chlorierten. Koh- lenwasserstoffen, z. B. Äthylenchlorid, Methylen- chlorid oder Chloroform, Ketonen, z. B. Methyl- pro:pylketon, Methylamylketon oder Diisobutyl.keton, Alkoholen, wie Butylalkoholen oder Amylialkoholen, Äthern, z.
B. Äthyläth:er, Diisopropyläther, Dibu;tyl- äthern oder Glykoläthern und dergleichen. Anstelle einer Lösungsmittelextraktion der Kulturen, oder in Kombination mit einer solchen als weitere Reini gungsoperation, kann man das Antibiotikum auch durch Ad;sorption gewinnen, beispielsweise an Aktiv kohle oder an aktivierten Erden, wie Fullererde oder Floridin, und anschliessende Extraktion des Adsor- bates, z.
B. mit einem in Wasser wenigstens teil weise löslichen organischen Lösungsmittel, wie Aceton, Buta;nol oder Methyläthylketon.
Man kann auch die Kulturen direkt, ohne vor gängige Abtrennung des Mycels, in der angegebenen Art und Weise extrahieren.
Eine weitere Anreicherung lässt sich dadurch erzielen, dass man die antibiotiku:mh altigen orga nischen Extrakte zuerst mit einer sauren wässrigen Lösung mit einem pH unter 5 und dann mit einer alkalischen wässrige:
n Lösung mit einem pH über 8 wiederholt auszieht, wobei die Hauptmenge der anti biotischen Aktivität in der organischen Phase bleibt. Aus dieser wird .das Antibiotikum Avilamyci.n ent weder direkt mittels Krista disaition oder nach vorhe riger Anreicheiling in reinem Zustand isoliert.
Ein gutes Anreicherungsverfahren für das neue Antibiotikum stellt die Verteilung zwischen einer alkoholischen wässrigen Lösung und einem mit Was ser ,nicht mischbaren Lösungsmittel dar. Zweck mässig erfolgt die Verteilung nach dem Gegenstrom verfahren in entsprechenden Apparaten. Auch Chro- matographie z. B. an Aluminiumoxyd ist zur Anrei cherung sehr geeignet. Die Gewinnung des reinen Antibiotikums in kristalliner Form nimmt man z. B.
aus organischen Lösungsmitteln, wie aus Aceton, Methanol, Äthanol, Chloroform, Aceton-Methanol- Gemischen, Ace;ton-Äth:er-Gemischen oder Aceton- Petroläther-Gemisch.en vor. Zum Umkristallisieren dienen dieselben Lösungsmittel oder auch wässrig organische Lösungen, wie verdünnte Alkohole, ver dünntes Aceton.
Das neue, neutrale Antibiotikum erhält man als farblose Kristalle, die bei der Verwendung von aceton-haltigen Lösungsmitteln als Nadeln ausgebil det :sind. F. 188-189,5 , MM = + 0,8 (in Fein- sprit) und -7,7 (in Chloroform). Die Elementar- analyse liefert folgende Werte: C = 5l,24 0/0, H = 6,54 0/a, Cl = 4,93,1/03 CH30 = 8,79 0/0, (C)CH3 = 8,97 0/0 und akt. H = 0,68 %.
Nach der Methode von Signer wurde ein Molgewicht von 708 gefunden. Diese Werte weisen auf die For mel C"H47017C1 hin, wobei die Substanz keinen Stickstoff und keinen Schwefel enthält. UV.- und IR.-Absorptionsspektrum siehe Fig. 1 und 2.
Mit alkoholischer äFerritchlorid-Lösung zeigt das neue Antibiotikum keine Farbreaktion. Die Jodo- formprobe ist stark, der Legal-Te:st nur schwach positiv. Tetranitromethan wird nicht verfärbt.
Bei der alkalischen Hydrolyse des neuen Anti biotikums werden 1,80 Mol einer flüchtigen Säure abgespalten, die im Papierchromatogramm (System Äthanol-Ammoniak-Wasser 8:1:1) etwas weiter wandert als Essigsäure (RL = 1,20, bezogen auf Essigsäure = 1).
Wird dass Antibiotikum mittels verdünnter Säu ren, z. B. mit verdünnter Schwefelsäure, hydrolysiert, so werden drei zuckerartige reduzierende Substanzen abgespalten, die im Papierchromatogramm (System n-Butanol-Eisessig-Wasser 4: 1 :1) Rr-Werte von 0,18, 0,41 und 0,52 aufweisen.
Antibiotika, die, wie das neue Antibiotikum Avila@mycin Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Chlor, hingegen weder Stickstoff noch Schwefel ent halten, sind relativ selten. Das einzige .bekannte Anti biotikum dieser Art ist das von Umezawa et a1. [J. Antibiotics Japan, 5, 466 (1952)] beschriebene Exfoliatin. Obwohl -diese Substanz in gewisser Hin sicht (z.
B. UV-Spektrum) ähnlich ist mit dem Avilamycin, bestehen doch deutliche Unterschiede, die im folgenden aufgeführt werden: Die für Exfoliatin vorgeschlagene Summenformel Cz7H4001.CI stimmt nicht mit den für Avilamycin gefundenen Analysenwerten überein.
Exfoliatin besitzt einen niedrigeren Schmelzpunkt als Avilamycin (172 verglichen mit l89 ). Exfoliatin zeigt im Gegensatz zu Avilamycin eine positive Eisenchlorid-Reaktion.
Die IR: Spektren von Exfoliatin und von Avilamycin zeigen einige deutliche Unterschiede. Exfoliatin und Avilamycin lassen sich durch ihr papierchromatographisches Verhalten gut unterschei den, indem mit dem Fliessmittel Benzol-Chloroform auf mit Formamid imprägniertem Papier Exfoliatm einen Rf-Wert von 0,63, Avila@mycin aber einen sol chen von 0,51 besitzt.
Weiter ist der Produzent von Exfoliatin, Stamm Z-3-5 [Jap. J. Med. Ser. 5, 466 (l952)] deutlich ver schieden von Stamm A 23575. Das Luftmycel des Exfoliatin-Produzenten weist Quirle, aber keine Spi ralen auf, während der Stamm A 23575 keine Quirle, dagegen aber Spiralen bildet. Aus diesen Befunden geht eindeutig hervor, dass Avilamycn nicht identisch ist mit dem bekannten Antibiotikum Exfoliatin.
Das Antibiotikum Avilamycin besitzt eine sehr hohe antibiotische Wirksamkeit gegenüber verschie- denen Testorganismen. Verwendet ,man als Test methode in vitro Verdünnungsreihen (Zehnerpoten- zen) in Glukosebouillon, die während 24 Stundenbei 37 #be#brütet werden, so ergeben sich folgende noch hemmende Konzentrationen:
EMI0003.0103
Hemmende
<tb> Testorganismen <SEP> Konzentration
<tb> <U>,u</U>g/Cm3
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes, <SEP> var. <SEP> aureus
<tb> Penicillin-resistent <SEP> 10
<tb> Streptococcus <SEP> pyo@genes <SEP> 0,1
<tb> Streptococcus <SEP> viridans <SEP> 10
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis <SEP> 100
<tb> Co:rynebacterium <SEP> diphtheriae <SEP> 10
<tb> Pasteurella <SEP> pestis <SEP> 100
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> 10
<tb> Mycobacterium <SEP> tubereulosis" <SEP> 100
<tb> Trichomonas <SEP> foetus <SEP> ** <SEP> 100 In Kirchners synthetischem Medium mit 5% bovinem Albumin kultiviert; Ablesung des Wachstums nach zwei Wochen.
\-@\ In Bouillon mit 10% Pferdeserum bei 37o kultiviert; Ablesung nach 4 Tagen. In vivo ist .das Antibiotikum Avilamyein ebenfalls ,gut wirksam. Bei fünfmaliger subkutaner Verabrei chung von 100 mg/kg resp. von 33 mg/kg an mit Mioroco,ccus pyo:
genes, var. aureus infizierte Mäuse werden 100 0/a resp. 75 % Überleibende beobachtet. Eine ähnliche Heilwirkung wird bei Mäusen festge stellt, die mit Streptococcus haemolyticus infiziert sind.
Dabei ist die Toxizität ;gering, indem eine ein malige subkutane Applikation von 1000 mg/kg bei Mäusen keine Schädigungen hervorruft. Höhere Dosen wurden noch nicht geprüft.
Das Antibiotikum Avilamycin oder seine Um- wandlungs- und Spaltprodukte oder entsprechende Gemische davon können .als Heilmittel, z.
B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die enterale, parenterale oder lokale Applikation geeigneten pharmazeutischen organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen .solche Stoffe in Frage, die mit den neuen Verbindungen nicht reagieren, wie z. B.
Ge latine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkoholz, Gummi, Polyalkylen- glykole, Vaseline, Cholesterin oder andere. bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z.
B. als Tabletten, Drag6es, Pulver, Salben, Cremen, Suppositorien, oder in flüssiger Form .als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und. bzw.
oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisie- rungs-, Netz- oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.
In den nachfolgenden Beispielen sind die Tern peraturen in Celsiusgraden angegeben. <I>Beispiel 1</I> Man bereitet eine Nährlösung der Zusammen- setzung: 20 :g Fleischmehl, 20g Malzextrakt, 10 g Calciumcarbonat und 1 Liter Leitungswasser und stellt sie auf pH 7,2 ein.
Diese, bzw. ein Vielfaches derselben, wird in 500-cm3-Erlenmeyein (mit je 100 cm3 Nährlösung) oder in 500-Liter-Fermentern (mit je 300 Liter Nährlösung) abgefüllt und 20 bis 30 Minuten bei 1 atü sterilisiert. Dann impft man mit bis zu 10 % einer teilweise sporulrierenden,
vege- tativen Kultur von Streptomyces viridochromogenes A 23575 an und irrkubiert unter gutem Schütteln bzw. Rühren und in den Fermentern unter Belüftung (mit etwa 1 Vol. steriler Luft pro Vol. Nährlösung pro Minute) bei 279.
Nach 24-48 Stunden Wachstum filtriert man die Kulturen unter Zusatz von etwa 1,5 % :
eines Filterhilfsmittels je nach Volumen durch eine Nutsche ,oder durch eine Filterpresse oder einen rotierenden Filter und befreit so die antibiotisch wirksame wässri@ge Lösung vom Myoel und anderen festen Bestandteilen.
<I>Beispiel 2</I> Verwendet man anstelle des in Beispiel 1 ange gebenen Mediums die im folgenden beschriebenen Nährlösungen<I>a, b</I> oder c, so erhält man nach analo ger Sterilisation, Beimpfung mit Streptomyces A 23575, Inkubation bei 279 und Filtration wässrige antibiotisch wirksame Lösungen.
a) 10 .g Rohglukose, 5 g Pepton, 3 g Fleisch extrakt (Oxo Lab Lemco), 5 ,g Natrinnichlorid, 10 g Calciumcarbonat und. 1 Liter Leitungswasser; pH vor der Sterilisation 7,5.
b) 40 g Erdnuss-schrot, 10 g Rohglukose, 200 mg sek. Kaliumhydrophosphat, 10 g Calcium- carbonat und 1 Liter Leitungswasser; pH vor der Calciumcarbonatzugabe 7,5.
c) 20 g Kokosnuss=sehrot, 20 g Malzextrakt, 10 g Calciumcarbonat und 1 Liter Leitungswasser; pH vor der Calciumcarbonatzugabe 7,2.
<I>Beispiel 3</I> 25 Liter eines gemäss Beispiel 1 oder 2 erhaltenen Kulturfiltrates werden mit 10 Liter Essigester ausge zogen und der Extrakt im Vakuum auf ein. Volumen von etwa 200 ml eingeengt. Die konzentrierte Lösung schüttelt man dreimal mit je 100 ml 0,5.n wässriger Essigsäure aus. Die abgetrennte wässrige Phase wird mit Natriumcarbonatlösung alkalisiertund wieder mit Essigester ausgeschüttelt.
Man dampft den ge waschenen und getrockneten Extrakt im Vakuum ein und erhält 19 mg Trockenrückstand, der das Wachstum von B. subtilis und Staph. aureus nicht zu hemmen vermag.
Der, wie soeben beschrieben, von den Basen be freite Essigester-Auszug wird dann dreimal mit wäss- riger NatriumcarbonatLösung ausgeschüttelt, worauf die wässrige Phase mit Salzsäure angesäuert und mit Äthylacetat ausgezogen wird. In gleicher Weise wie oben werden aus dieser Lösung 64 mg antibiotisch unwirksame Säuren erhalten.
Der von Basen und Säuren befreite Rohextrakt wird schliesslich mit Wasser gewaschen, mit Natrium sulfat getrocknet und im Vakuum cinigedampft. Man versetzt den öligen Rückstand mit Petroläther. Der Petro:läther, der nur unwirksame Bestandteile aufzu lösen vermag, wird abdekantiert. Es hinterbleiben 91 mag des rohen Antibiotikums Avilamycin, das die gesamte Aktivität des ursprünglichen Extraktes ent hält.
<I>Beispiel 4</I> 90 Liter reines gemäss Beispiel 1 oder 2 erhaltenen Kulturfiltrates werden mit 20 Liter Essigester extra hiert und der Extrakt auf 400 ml eingeengt. Bei 20stündigem Stehen bei 29 fällt das Avilamycin in Formeines dichten flockigen Niederschlages aus, der abfiltriert wird. Nach dem Trocknen im Exsikkator wiegt der nahezu farblose, aus stark verfilzten Nädel- chen :bestehende Kristallkuchen 3,07 g.
Die Mutter laugen werden auf etwa 200 ml eingeengt und mit der doppelten Menge Äther versetzt. Nach 4 Tagen Stehen bei, 09 kristallisieren weitere 3,28g Avilamycin aus.
3,0 g des Kris:tallisates löst man in 50 ml Aceton. Von einem geringen unlöslichen Schlamm wird ab- filtriert. Dass klare Filtrat wird nun unter Zugabe von Äther kornzentriert. Beim Erkalten scheiden sich 2,0 g farblose Kristalle in feinen Nädelchen ab.
Durch Ein- engen der Mutterlaugen auf :etwa 1i des Volumens können nochmals 0,48g Kristalle gewonnen werden. Zur Analyse wird eine Probe dieser Kristalle noch viermal aus Aceton-Äther umkristallisiert und 20 Stunden im Hochvakuum bei 709 getrocknet.
Das analysenreine Antibiotikum zeigt folgende Eigen schaften: F. 188-189,5 (unter dem Mikroskop be- stimmt). [a]D = + 0,89 (c = 1,165 in Feinsprit) oder - 7,7 (c - 1,083 in Chloroform).
Mit alkoholischer Eisen-(111)-chloridlösung tritt keine Farbreaktion ein. In konz. Schwefelsäure löst eich das Antibiotikum anfangs mit olivbrauner Farbe; später verändert sich der Farbton nach violettbraun. Die Jodoformprobe ist positiv, der Legaltest schwach positiv. Tetranitromethan wird nicht verfärbt.
Die Elementaranalyse gibt folgende Werte: C = 51,24 0/a, H = 6,54 %, Cl = 4,93 %, CH30 - 8,79 %, CH3 (C) = 8,97 0/0,
HRTI ID="0004.0220" WI="6" HE="4" LX="1264"LY="2660"> akt. = 0,68 0/a. Stickstoff und Schwefel sind nicht nachweisbar. Nach der Methode von S:igner in Chloroform mit Azo- be:nzol als Referenzsubstanz wird ein Mokkular- gewicht von 708 gefunden.
Diese Werte sind am besten mit einer Bruttoformel von C.1H47017C1 ver träglich. UV-Absorptionsspektrum in Feinsprit siehe Fig. 1; IR-Absorptionsspektrum in Kaliumbromid siehe Fig. 2.
Bei der alkalischen Hydrolyse werden 1,80 Mol flüchtige Säure abgespalten, die im Papierchromato- gramm (Äthanol-Ammoniak-Wasser 8:l:1) einen einheitlichen Fleck gibt und etwas weiter wandert als Essigsäure und Propionsäure (R, = 1,20 bezogen auf Essigsäure = 1).
<I>Beispiel 5</I> Die vereinigten Mutterlaugen der in Beispiel 4 beschriebenen Kristallisationen werden im Vakuum eingedampft und der Rückstand mit Petroläther ge waschen.
Der in Petroläther unlösliche Anteil von 5,8g wird in Benzol aufgenommen und an einer Säule aus 170<B>g</B> Aluminiumoxyd (Aktivität III) chro- matographiert. 200 ml Benzol, 500 ml abs.. Chloro- form und 500 ml Chloroform-Methanol 99:
1 eluieren nur inaktive Begleitstoffe. Die mit 500 ml Chloroform-Methanol <B>97:</B> 3 und 500 ml Chloroform- Methanol 9 : 1 eluierten Fraktionen enthalten die ge samte Aktivität. Sie hinterlassen beim Eindampfen <B>2,25,g</B> Rückstand, aus dem sich durch Kristallisation 1,04 g reines Avilamycin vom F. 187-188 :gewinnen lassen.
Zur weiteren Charakterisierung werden 2,51 g kristallisiertes Avilamycin mit einer Lösung von 1,5 g konz. Schwefelsäure in 30 ml Wasser versetzt und während 2 Stunden im Wasserbad (etwa 95 ) erwärmt.
Das abgekühlte Reaktionsgemisch wird durch Ausschütteln mit Äther von lipophilen An teilen (850 mg braunes Öl) befreit und die wässrige Phase :anschliessend durch eine Säule aus 70 ml Dowex 3 (OH-Form) perkoliert. Das neutrale Eluat wird im Vakuum zur Trockene verdampft und hinter lässt 1,02 g eines nahezu farblosen zähflüssigen Öls.
Proben von 300 Icg dieses Öls werden auf Filter- papier Whatman Nr. 1 papierchromatographisch untersucht. Als Flie:ssmittcl dient ein Gemisch .aus n-Butanol, Eisessig und Wasser im Volumenverhält nis 4: 1 : 1. Bei der Entwicklung mit Anilin-Phthal- säure sowie mit ammoniakalischer Silbernitratlösung lassen sich 3 reduzierende Zucker nachweisen.
Der eine mit R f 0,18 zeigt eine rötliche, der zweite mit Rf 0,41 eine bräunliche-,gelbe und der dritte mit Rf 0,52 wieder eine rötliche Anilin-Phthalsäure- reaktion.
Die drei Zucker lassen sich präparativ an einer Cellulosepulversäule mit :demselben Lösungsmittel gemisch trennen. Für 1,02- Zuckergemisch wird eine Cellulosepulversäure von 3 cm Querschnitt und 42 cm Höhe verwendet. Die Eluate werden in Frak tionen von 16 ml aufgefangen.
Aus den Fraktionen 19-20 werden 330 mg des papierchromatogmaphisch einheitlichen Zuckers mit Rf 0,52 als zähes Öl ge- wonn:en. Die Fraktionen 21-22 geben 348 mg des selben Zuckers im Gemisch mit denjenigen mit Rf 0,41. Der einheitliche zweite Zucker wird in einer Menge von 93 mg aus den Fraktionen 23 und 24 des Chromato:gramms gewonnen. Von der Verbin dung mit R f 0,18 werden 340 mg aus den Fraktio nen 27-32 :erhalten.
Process for the production of a new antibiotic Subject: the present invention is a process for the production of the antibiotic avilamycin, which is characterized in that the Stz @ mm Streptomyces viridochromogenes A 23575 or a variant of this strain is cultured under aerobic conditions and the antibiotic Avil - amycin isolated on this.
The antibiotic avilamycin arises from the culture of a new actinomycete strain of the genus Strep: tomyces, which is described below as Streptomyces viridochromogenes A 23575.
It was isolated from soil samples collected by the owner in Caracas, Venezuela, and is stored under this name in our laboratories and in the Swiss Federal Institute of Technology, Institute for Special Botany, Zurich.
Streptomyces viridochromogene, s A 23575 forms a light blue aerial mycelium. The spore chains form numerous open, mostly regular spirals with monopodial branches and a long, straight main axis. The spores are elliptical to oval. The surface of the individual spores is covered with spines about 0.2 .mu.m long, which are broad at the base and form a point.
When growing on peptone-containing nutrient substrates, strain A 23575 causes a dark melanoid discoloration of the nutrient substrate. The growth of the stem is relatively little dependent on the temperature, at both 18 and 40 the fungus develops well, but the optimum is between 25 and 32.
For further characterization, the following describes the growth of Streptomyces viridochromogenes A 23575 on various nutrient media. The nutrient media 1-7 and 10 were according to W. Lindenbein, Arch. Mikrobiol. 17, 361 (1952). 1.
Synthetic A, even: growth initially thin, veil-like and white yellow, later wrinkled and light yellow; Aerial mycelium forming a dusty coating, chalk white.
2. Synthetic solution: basic growth and sediment punctiform, milk-white, rare sediment as flakes; sparse, colorless pellicle.
3. Glucose agar: growth thin, veil-like to wrinkled, light brown to chestnut brown; Aerial mycelium velvety to woolly, light blue; Substrate chestnut brown.
4. Glucose-asparagine Aga: r: growth: thin, veil-like, light yellow to greenish yellow; Aerial mycelium not very woolly, white, partly light blue.
5. Calcium malate agar: growth thin, haze-like, light yellow; Aerial mycelium initially velvety and white, in places velvety and light blue after 10 to 15 days.
6. Gelatin prick (18): growth: very slow and sparse; Substrate chestnut to dark brown; Liquefaction after 15 days about 1: cm. 7. Starch plate: growth thin, veil-like, white-yellow to light yellow; Aerial mycelium velvety to woolly, powdery white; Hydrolysis after 5 days 5 mm, after 12 days 13 now.
B. Potato: growth pimple, light brown; Aerial mycelium thickly woolly, initially white-gray, later light blue; The substrate is chestnut brown to dark brown.
9. Carrot: growth is sparse, punctiform to pustular; Aerial mycelium sparse, chalky white. 10. Litmus milk: growth in the form of a thick, coherent, wrinkled surface cover, chestnut brown to: dark brown to brownish-pitch black; Aerial mycelium sparse, gray-white;
strong peptonization, but only very weakly. Coagulation; Substrate dark brown.
In addition, strain A 23575 slowly reduces nitrates to nitrites.
According to Ettlinger et a1. [Archiv Mikrobiologie, <I> 31, </I> 326 (l958)] are: the species of the genus Streptomyces, characterized by the color of the air mycelium, the morphology of the individual spores and the spore chains, and finally by the melanoid discoloration of peptone-containing nutrient substrates.
The strain A 23575 agrees with Streptomyces viridochromogenes (Krainsky) Waksma: n et Henrici in these four characteristics and is therefore provisionally included in this species.
It is known from the literature that strains of Streptomyces viridochromo.genes produce the antibiotic chartreusin. Chartreusin is a yellow colored acid and has completely different properties than the colorless, neutral avilamycin.
For the production of the antibiotic Avil, amycin variants can also be used as they are, for B. be obtained by selection or mutation, in particular under the action of ultraviolet or X-rays or nitrogen mustard oils, are used.
The Streptomyceae.nstamm A 23575 can e.g. B. in aqueous, inorganic salts, a carbon and nitrogen source containing nutrient solution are grown, for example in dormant surface culture or preferably submerged with shaking or stirring with air or oxygen in shaker bottles or the known fermenters. A suitable temperature is between 18 and 40.
The nutrient solution shows a significant antibacterial effect after 11 / 2-5 days.
The nutrient solution contains, as inorganic salts, for example chlorides, nitrates, carbonates, sulfates of alkalis, alkaline earths, magnesium, iron, zinc, manganese. As nitrogen and carbon sources and growth-promoting substances are z.
B. named: Amino acids and their mixtures, peptides and proteins as well as their hydrolysates, such as peptone or triptone, meat extracts, water-soluble parts of grains such as corn and wheat, of distillation residues from alcohol production, of yeast, beans, in particular of the soy plant, of seeds, for example the cotton plant or of peanuts and coconut, and also glucose,
Saecharose, lactose, starch, mannitol, glycerin, etc.
To isolate the antibiotic z. B. the following procedure: the mycelium is separated from the culture filtrate, after which the main amount of the antibiotic is found in the culture filtrate. Nevertheless, significant amounts of the antibiotic remain adsorbed on the mycelium. It is therefore advantageous to wash out the latter well. For this purpose, FITS organic, at least partially water-soluble solvents such as alcohols, eg.
B. methanol, ethanol and butanols, or Ketone_, z. B. acetone and methyl ethyl ketone. The mycelium extracts are added to the culture filtrate either directly or after prior concentration in vacuo. The mixture is extracted with a water-immiscible, organic solvent such as esters of lower fatty acids, for example ethyl acetate or amyl acetate, hydrocarbons, e.g. B.
Benzene, chlorinated. Hydrocarbons, e.g. B. ethylene chloride, methylene chloride or chloroform, ketones, z. B. methyl pro: pyl ketone, methyl amyl ketone or Diisobutyl.keton, alcohols such as butyl alcohols or amyl alcohols, ethers, z.
B. Ethyl ethers, diisopropyl ethers, dibutyl ethers or glycol ethers and the like. Instead of solvent extraction of the cultures, or in combination with such as a further cleaning operation, the antibiotic can also be obtained by adsorption, for example on activated charcoal or on activated earths such as fuller's earth or floridine, and subsequent extraction of the adsorbate, z.
B. with an at least partially soluble organic solvent in water, such as acetone, butanol or methyl ethyl ketone.
You can also extract the cultures directly, without prior separation of the mycelium, in the manner indicated.
A further enrichment can be achieved by first treating the antibiotic organic extracts with an acidic aqueous solution with a pH below 5 and then with an alkaline aqueous:
n solution with a pH above 8 repeatedly withdraws, with the main amount of the anti-biotic activity remaining in the organic phase. The antibiotic Avilamycin is isolated from this either directly by means of crystallization or in a pure state after prior enrichment.
A good enrichment process for the new antibiotic is the distribution between an alcoholic aqueous solution and a water-immiscible solvent. The distribution is expediently carried out using the countercurrent method in appropriate apparatus. Chromatography e.g. B. aluminum oxide is very suitable for enrichment. The extraction of the pure antibiotic in crystalline form takes z. B.
from organic solvents, such as from acetone, methanol, ethanol, chloroform, acetone-methanol mixtures, acetone; clay-ether mixtures or acetone-petroleum ether mixtures. The same solvents or aqueous organic solutions, such as dilute alcohols and dilute acetone, are used for recrystallization.
The new, neutral antibiotic is obtained as colorless crystals, which are ausgebil det as needles when acetone-containing solvents are used. F. 188-189.5, MM = + 0.8 (in fine gasoline) and -7.7 (in chloroform). The elementary analysis gives the following values: C = 5l, 24 0/0, H = 6.54 0 / a, Cl = 4.93.1 / 03 CH30 = 8.79 0/0, (C) CH3 = 8 , 97 0/0 and act. H = 0.68%.
According to Signer's method, a molecular weight of 708 was found. These values indicate the formula C "H47017C1, the substance containing no nitrogen and no sulfur. UV and IR absorption spectrum see FIGS. 1 and 2.
The new antibiotic shows no color reaction with alcoholic ferrite chloride solution. The iodo form test is strong, the legal test is only weakly positive. Tetranitromethane is not discolored.
During the alkaline hydrolysis of the new antibiotic, 1.80 mol of a volatile acid are split off, which in the paper chromatogram (system ethanol-ammonia-water 8: 1: 1) migrates a little further than acetic acid (RL = 1.20, based on acetic acid = 1).
If that antibiotic using dilute acids such. B. with dilute sulfuric acid, hydrolyzed, three sugar-like reducing substances are split off, which in the paper chromatogram (system n-butanol-glacial acetic acid-water 4: 1: 1) have Rr values of 0.18, 0.41 and 0.52 .
Antibiotics that, like the new antibiotic Avila @ mycin, contain carbon, hydrogen, oxygen and chlorine, but neither nitrogen nor sulfur, are relatively rare. The only known anti-biotic of this type is that of Umezawa et al. [J. Antibiotics Japan, 5, 466 (1952)]. Although this substance in certain respects (e.g.
B. UV spectrum) is similar to that of avilamycin, but there are clear differences, which are listed below: The empirical formula Cz7H4001.CI proposed for exfoliatin does not match the analytical values found for avilamycin.
Exfoliatin has a lower melting point than avilamycin (172 compared to 189). In contrast to avilamycin, exfoliatin shows a positive ferric chloride reaction.
The IR: spectra of exfoliatin and avilamycin show some clear differences. Exfoliatin and avilamycin can be easily distinguished by their paper chromatographic behavior, in that Exfoliatm has an Rf value of 0.63 on paper impregnated with formamide with the solvent benzene-chloroform, while Avila @ mycin has an Rf value of 0.51.
Next is the producer of exfoliate, strain Z-3-5 [Jap. J. Med. Ser. 5, 466 (1952)] clearly different from strain A 23575. The aerial mycelium of the exfoliatin producer has whorls but no spirals, while the strain A 23575 does not form whorls but spirals. From these findings it is clear that avilamycn is not identical to the well-known antibiotic exfoliatin.
The antibiotic avilamycin has a very high antibiotic effectiveness against various test organisms. If the test method used is in vitro dilution series (powers of ten) in glucose broth, which are incubated for 24 hours at 37 #, the following inhibitory concentrations result:
EMI0003.0103
Inhibitory
<tb> test organisms <SEP> concentration
<tb> <U>, u </U> g / Cm3
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes, <SEP> var. <SEP> aureus
<tb> Penicillin-resistant <SEP> 10
<tb> Streptococcus <SEP> pyo @ genes <SEP> 0.1
<tb> Streptococcus <SEP> viridans <SEP> 10
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis <SEP> 100
<tb> Co: rynebacterium <SEP> diphtheriae <SEP> 10
<tb> Pasteurella <SEP> pestis <SEP> 100
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> 10
<tb> Mycobacterium <SEP> tubereulosis "<SEP> 100
<tb> Trichomonas <SEP> fetus <SEP> ** <SEP> 100 Cultivated in Kirchner's synthetic medium with 5% bovine albumin; Read the growth after two weeks.
\ - @ \ Cultivated in broth with 10% horse serum at 37o; Reading after 4 days. The antibiotic avilamein is also very effective in vivo. With five subcutaneous administration of 100 mg / kg, respectively. from 33 mg / kg on with Mioroco, ccus pyo:
genes, var. aureus infected mice are 100 0 / a resp. 75% survivors observed. A similar healing effect is found in mice infected with Streptococcus haemolyticus.
The toxicity is low in that a single subcutaneous application of 1000 mg / kg in mice does not cause any damage. Higher doses have not yet been tested.
The antibiotic avilamycin or its conversion and cleavage products or corresponding mixtures thereof can .als remedies, e.g.
B. in the form of pharmaceutical preparations, use. These contain the compounds mentioned in a mixture with a pharmaceutical, organic or inorganic carrier material suitable for enteral, parenteral or local administration. For the same thing .solche substances come into question that do not react with the new compounds, such as. B.
Gelatin, milk sugar, starch, magnesium stearate, talc, vegetable oils, benzyl alcohol, rubber, polyalkylene glycols, petrolatum, cholesterol and others. known excipients. The pharmaceutical preparations can e.g.
B. as tablets, dragons, powders, ointments, creams, suppositories, or in liquid form .as solutions, suspensions or emulsions. If necessary, they are sterilized and. or.
or contain auxiliaries such as preservatives, stabilizers, wetting agents or emulsifiers. They can also contain other therapeutically valuable substances.
In the following examples, the temperatures are given in degrees Celsius. <I> Example 1 </I> A nutrient solution is prepared with the following composition: 20 g meat meal, 20 g malt extract, 10 g calcium carbonate and 1 liter tap water and adjusts it to pH 7.2.
This, or a multiple thereof, is filled into 500 cm3 Erlenmeyein (with 100 cm3 nutrient solution each) or in 500 liter fermenters (with 300 liters each nutrient solution) and sterilized for 20 to 30 minutes at 1 atm. Then you vaccinate with up to 10% of a partially sporulating,
vegetative culture of Streptomyces viridochromogenes A 23575 and incubated with good shaking or stirring and in the fermenters with aeration (with about 1 vol. sterile air per vol. nutrient solution per minute) at 279.
After 24-48 hours of growth, the cultures are filtered with the addition of about 1.5%:
a filter aid depending on the volume through a suction filter, or through a filter press or a rotating filter and frees the antibiotic effective aqueous solution from myoel and other solid components.
<I> Example 2 </I> If the nutrient solutions <I> a, b </I> or c described below are used instead of the medium given in Example 1, inoculation with Streptomyces A 23575 is obtained after analogous sterilization , Incubation at 279 and filtration of aqueous antibiotic solutions.
a) 10 g raw glucose, 5 g peptone, 3 g meat extract (Oxo Lab Lemco), 5 g sodium dichloride, 10 g calcium carbonate and. 1 liter of tap water; pH 7.5 before sterilization.
b) 40 g peanut meal, 10 g raw glucose, 200 mg sec. Potassium hydrophosphate, 10 g calcium carbonate and 1 liter of tap water; pH 7.5 before calcium carbonate addition.
c) 20 g coconut = very red, 20 g malt extract, 10 g calcium carbonate and 1 liter of tap water; pH before calcium carbonate addition 7.2.
<I> Example 3 </I> 25 liters of a culture filtrate obtained according to Example 1 or 2 are drawn out with 10 liters of ethyl acetate and the extract is absorbed in vacuo. Concentrated volume of about 200 ml. The concentrated solution is shaken out three times with 100 ml of 0.5.N aqueous acetic acid each time. The separated aqueous phase is made alkaline with sodium carbonate solution and extracted again with ethyl acetate.
The washed and dried extract is evaporated in vacuo and 19 mg of dry residue is obtained, which supports the growth of B. subtilis and Staph. aureus is unable to inhibit.
The ethyl acetate extract, freed from the bases as just described, is then extracted three times with aqueous sodium carbonate solution, whereupon the aqueous phase is acidified with hydrochloric acid and extracted with ethyl acetate. In the same way as above, 64 mg of antibiotically inactive acids are obtained from this solution.
The crude extract, freed of bases and acids, is finally washed with water, dried with sodium sulfate and evaporated in vacuo. Petroleum ether is added to the oily residue. The petroleum ether, which can only dissolve ineffective components, is decanted off. What remains may be the raw antibiotic avilamycin, which contains all of the activity of the original extract.
<I> Example 4 </I> 90 liters of pure culture filtrate obtained according to Example 1 or 2 are extracted with 20 liters of ethyl acetate and the extract is concentrated to 400 ml. On standing at 29 for 20 hours, the avilamycin precipitates in the form of a dense, flaky precipitate which is filtered off. After drying in the desiccator, the almost colorless, strongly matted needles weighs 3.07 g.
The mother liquors are concentrated to about 200 ml and mixed with twice the amount of ether. After standing for 4 days at, 09 a further 3.28 g of avilamycin crystallize out.
3.0 g of the crystals are dissolved in 50 ml of acetone. A small amount of insoluble sludge is filtered off. The clear filtrate is now grain-centered with the addition of ether. When it cools, 2.0 g of colorless crystals separate in fine needles.
By reducing the mother liquor to: about 1i of the volume, another 0.48 g of crystals can be obtained. For analysis, a sample of these crystals is recrystallized four times from acetone-ether and dried at 709 in a high vacuum for 20 hours.
The analytically pure antibiotic shows the following properties: F. 188-189.5 (determined under the microscope). [a] D = + 0.89 (c = 1.165 in fine spirits) or - 7.7 (c - 1.083 in chloroform).
No color reaction occurs with alcoholic iron (111) chloride solution. In conc. Sulfuric acid initially dissolves the antibiotic with an olive-brown color; later the color changes to purple-brown. The iodoform test is positive, the legal test is weakly positive. Tetranitromethane is not discolored.
The elemental analysis gives the following values: C = 51.24 0 / a, H = 6.54%, Cl = 4.93%, CH30 - 8.79%, CH3 (C) = 8.97 0/0,
HRTI ID = "0004.0220" WI = "6" HE = "4" LX = "1264" LY = "2660"> act. = 0.68 0 / a. Nitrogen and sulfur cannot be detected. According to S: igner's method in chloroform with azobene: nzol as reference substance, a mocular weight of 708 is found.
These values are best with a gross formula of C.1H47017C1. UV absorption spectrum in fine spirits see Fig. 1; For IR absorption spectrum in potassium bromide, see FIG. 2.
During the alkaline hydrolysis 1.80 mol of volatile acid are split off, which gives a uniform spot in the paper chromatogram (ethanol-ammonia-water 8: 1: 1) and moves a little further than acetic acid and propionic acid (R, = 1.20 related on acetic acid = 1).
<I> Example 5 </I> The combined mother liquors from the crystallizations described in Example 4 are evaporated in vacuo and the residue is washed with petroleum ether.
The portion of 5.8 g which is insoluble in petroleum ether is taken up in benzene and chromatographed on a column of 170 g aluminum oxide (activity III). 200 ml benzene, 500 ml abs .. chloroform and 500 ml chloroform-methanol 99:
1 only inactive accompanying substances elute. The fractions eluted with 500 ml of chloroform-methanol <B> 97: </B> 3 and 500 ml of chloroform-methanol 9: 1 contain the entire activity. During evaporation, they leave behind 2.25 g residue, from which 1.04 g of pure avilamycin from F. 187-188: can be obtained by crystallization.
For further characterization, 2.51 g of crystallized avilamycin are concentrated with a solution of 1.5 g. Sulfuric acid is added to 30 ml of water and heated for 2 hours in a water bath (about 95).
The cooled reaction mixture is freed from lipophilic parts by shaking with ether (850 mg brown oil) and the aqueous phase: then percolated through a column of 70 ml Dowex 3 (OH form). The neutral eluate is evaporated to dryness in vacuo, leaving 1.02 g of an almost colorless viscous oil.
300 μg samples of this oil are analyzed by paper chromatography on Whatman No. 1 filter paper. A mixture of n-butanol, glacial acetic acid and water in a volume ratio of 4: 1: 1 serves as the flow agent. When developing with aniline-phthalic acid and with ammoniacal silver nitrate solution, 3 reducing sugars can be detected.
One with R f 0.18 shows a reddish, the second with Rf 0.41 a brownish, yellow and the third with Rf 0.52 again a reddish aniline-phthalic acid reaction.
The three sugars can be separated preparatively on a cellulose powder column with: the same solvent mixture. A cellulose powder acid with a cross section of 3 cm and a height of 42 cm is used for 1.02 sugar mixture. The eluates are collected in fractions of 16 ml.
330 mg of the sugar, which is uniform according to paper chromatography and has an Rf 0.52, are obtained as a viscous oil from fractions 19-20. Fractions 21-22 give 348 mg of the same sugar mixed with those with Rf 0.41. The uniform second sugar is obtained in an amount of 93 mg from fractions 23 and 24 of the chromatogram. 340 mg of the compound with R f 0.18 are obtained from fractions 27-32 :.