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Procédé de préparation d'un nonapeptide La présente invention est relative à un procédé de préparation d'un nonapeptide, terme intermédiaire pour la synthèse de l'ocytocine, hormone nonapepti- dique dont la formule de constitution suivante
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a été démontrée par Du Vigneaud et collaborateurs, J. Am. Chem. Soc., 1954, 76, 3115.
Le nonapeptide dont le procédé fait l'objet de la présente invention est le (S,N-ditrityl-L-cystéinyl)L-tyrosyl-L-isoleucyl-(y-méthyl-L-glutamyl)-((i-mé, thyl-L-aspartyl)-(S-trityl-L-cystéinyl)-L-prolyl-Lleucyl-glucinate de méthyle, composé de formule Il dont la préparation figure au schéma annexé.
Comme il ressort du dessin annexé, ce composé de formule II préfigure l'enchaînement peptidique de la molécule d'ocytocine et représente un intermé- diaire de grande valeur pour la synthèse de cette hormone du lobe postérieur de l'hypophyse.
Les avantages, de la préparation du (S,N-ditrityl- L-cystéinyl) -L-tyrosyl-L-isoleucyl-(y-méthyl-L-gluta- myl)-((3-anéthyl-L-aspartyl)-(S-trityl-L-cystéinyl)-L- prolyl-L-leucyl-glycinate de méthyle selon l'invention résident entre autres dans l'utilisation de produits comportant un blocage tritylé pouvant être facilement clivé par des réactifs simples et dans des installations courantes.
La grande simplicité du procédé selon l'invention, remarquable par la répétition de techniques identiques et l'excellence des rendements, le rend particulièrement apte à l'industriali- sation.
Le procédé selon l'invention est caractérisé par le fait qu'on dissout dans un solvant un sel de l'acide (N-trityl-y-méthyl-L-glutamyl)-(3-m6thyl-L- aspartique, un ses d'un ester de la (S-trityl-L-cys- téinyl)-L-prolyl-L-leucyl-glycine en présence d'un excès de dicyclohexylcarbodiimide, détruit après réaction de l'excédent de dicyclohexylcarbodiimide, filtre, évapore à sec, isole l'ester de la (N-trityl-y@né- thyl-L-glutamyl)
- f -méthyl-L-aspartyl) - (S-trityl-L- cystéinyl)-L prolyl-L-leucyl-glycine, le traite par un agent acide, isole après détritylation sélective à l'azote le sel de l'ester de la (y-méthyl-L-glutamyl)- ((3-méthyl-L-aspartyl)-(S-trityl-L-cystéinyl)-L-prolyl- L leucyl-glycine, le dissout dans un solvant avec un sel de la (S,N-ditrityl-L-cystéinyl)-L-tyrosyl-L-iso- leucine en présence d'un excès de dicyclohexylcar- bodiimide, détruit,
après réaction, l'excédent de dicyclohexylcarbodiimide, filtre, évapore à sec et isole l'ester de la (S,N-ditrityl-L,cystéinyl)-L-tyrosyl- L-isoleucyl-(y-méthyl-L-glutamyl)-(P-m6thyl-L-aspar- tyl)-(S-trityl-L-cystéinyl)-L-prolyl-L-leucyl-glycine.
Selon un mode préféré de réalisation du procédé selon l'invention, on dissout dans le chlorure de
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méthylène le sel de diéthylamine de l'acide (N-trityl- y-méthyl-L-glutamyl)-(3-méthyl-L-aspartique de formule B et le chlorhydrate du (S-trityl-L-cystéinyl)-L- prolyl-L-leucyl-glycinate de méthyle de formule A, ajoute un excès compris entre 10 et 30 % de dicy- clohexylcarbodiimide, détruit, après réaction, l'excédent de dicyclohexylcarbodiimidepar lavage à l'acide chlorhydrique dilué, filtre,
évapore à sec et isole le (N-trityl-y-méthyl-L-glutamyl)-((3-méthyl-L-aspar- tyl) - (S-trityl-L-cystéinyl)-L-prolyl-L-leucyl-glycinate de méthyle de formule C. Cet ester hexapeptidique est mis en solution dans l'acétone chlorhydrique, le chlorhydrate du (,r-méthyl-L-glutamyl)-((3-méthyl-L- aspartyl)-(S-trityl-L-cyst6inyl)-L prolyl-L-leucyl-glyci- nate de méthyle de formule D est isolé puis condensé dans le chlorure de méthylène et en présence de dicyclohexylcarbodiimide,
avec le sel de diéthyl- amine de la (S,N-ditrityl-L-cystéinyl)-L-tyrosyl-L- isoleucine de formule E comme indiqué plus haut pour la première condensation. On isole après réaction le nonapeptide de formule II.
Le chlorhydrate du (S-trityl-L-cystéinyl)-L-pro- lyl-L-leucyl-glycinate de méthyle de formule A est préparé selon le brevet No 362085, ledit procédé consistant essentiellement à condenser la S,N-ditrityl- L-cystéine avec un ester de L proline en présence de dicyclohexylcarbodiimide. On isole l'ester de (S,N-ditrityl-L-cystéinyl)-L-proline qui est saponifié avant condensation avec un ester de la L-leucine pour fournir l'ester correspondant de la (S,N-ditrityl- Ircystéinyl)
-L-prolyl-L-leucine. Ce dernier est saponifié et le tripeptide obtenu est condensé à son tour, toujours en présence de dicyclohexylcarbodiimide, avec le glycinate de méthyle. Le S,N-ditrityl-tétra- peptide isolé est enfin détritylé sélectivement à l'azote par traitement en acide acétique aqueux ou en acétone chlorhydrique.
Le sel de diéthylamine de l'acide (N-trityl-y- méthyl-L-glutamyl)-[3-méthyl-L-aspartique de formule B est préparé selon le brevet NI, 362087, ledit pro- cédé consistant à faire réagir un N-trityl-L-glutamate de y-méthyle sur un L-aspartate d'a-benzyle et p-méthyle en présence de dicyclohexylcarbodiimide et à soumettre le (N-trityl-,r-méthyl-L-glutamyl)
-L- aspartate d'a-benzyle et P-méthyle .à l'hydrogénolyse.
La (S,N-ditrityl-L-cystéinyl)-L-tyrosyl-L-isoleu- cine de formule E est préparée selon le brevet N 362086, ledit procédé consistant essentiellement à condenser au sein du chlorure de méthylène et en présence de diméthylformamide, un sel d'un ester de la L-tyrosine et un sel de S,N-ditrityl-L-cystéine, à isoler l'ester du dipeptide formé qui est saponifié avant sa condensation avec un ester -de la L-isoleu- cine. On obtient ainsi un ester de la (S,N-ditrityl- L-cystéinyl)
-L-tyrosyl L-isodeucine qui est saponifié par -les traitements usuels, par exemple par chauffage en potasse méthanolique.
Dans l'exemple qui suit, le mode opératoire décrit peut évidemment être utilisé au départ de peptides racémiques ou énantiomorphes. On peut également faire varier les températures de réactions, modifier la nature des solvants, employer d'autres esters que ceux mentionnés ou préparer les matières premières par d'autres voies que celles préconisées ici, détrityler par toute autre méthode connue.
Exemple Préparation du (N-trityl-y-méthyl-L-glutamyl)-([3- méthyl-L-aspartyl)-(S-trityl-L-cystéinyl)-L-prolyl- L-leucyl-glycinate de méthyle (Formule C) On dissout 3,55 g de chlorhydrate de (S-trityl-L- cystéinyl)-L-prolyl-L-leucyl-glycinyte de méthyle (Formule A), préparé selon le brevet No 362085 et 3,1g de sel de diéthylamine de l'acide (N-trityl-y- méthyl-L-glutamyl)-(3-méthyl-L-aspartique (Formule B) obtenu comme indiqué dans le brevet No 362087 dans 10 ce de chlorure de méthylène.
On sèche sur sulfate de sodium, ajoute à la solution filtrée 1,15 g de dicyclohexylcarbodiimide et abandonne une nuit à la température ambiante. On filtre, lave la solution avec 10 cm-3 d'acide chlorhydrique 0,1 N, 10 cm' d'eau, 5 ce d'une solution à 10 % de carbonate de sodium et 10 ce d'eau, la sèche sur sulfate de sodium et l'évapore à sec sous vide.
On dissout le résidu dans 2 ce d'alcool absolu chauffé à 351, C, ajoute à cette même température 20 ce d'éther, abandonne une heure à la température ambiante, ajoute encore 20 ce d'éther, laisse reposer une heure à la température du laboratoire, une heure au bain-marie glacé, essore, lave à l'éther et sèche. On obtient ainsi 4,2 g (72 %) de (N-trityl-y-méthyl-L- glutamyl)-((3-méthyl-L-aspartyl)-(S-trityl-L-cystéinyl)- L-prolyl-L-.leucyl-glycinate de méthyle (Formule C) F. = environ 1301, C, [a]ri = - 26 1 (c = 2 %, chloroforme).
Ce produit, qui n'a pas encore été décrit, se présente sous forme de fines aiguilles incolores inso- lubles dans l'eau et l'éther, solubles dans l'alcool, l'acétone, le benzène et le chloroforme.
Analyse : C,;6H7,1O11N6S = 1159,4 Calculé: C 68,37 % H 6,43 % O 15,18 % N 7,25 % S2,76% Trouvé: C68,4% H6,4% 015,0% N7,3% S2,8% Préparation du chlorhydrate dit (#j-fnéthyl-L-gluta- rnyl)-(r) -métlzyl-L-aspartyl)-(S-trityl-L-cystéinyl)- L-prolyl-L-leeicyl-glycinate de méthyle (Formule D) On dissout 4 g de (N-trityl-y-méthyl-L-glutamyl)- ((3-méthyl-L-aspartyl)-(S-trityl-L-cystéinyl)-L prolyl- L- leucyl-glycinate de méthyle (Formule C), dans 8 cm3 d'acétone, ajoute 4 ce d'acide chlorhydrique 5 N et abandonne quinze minutes à la température ambiante.
On extrait par 40 ce de chloroforme, lave la solution organique obtenue avec 8 ce d'acide chlorhydrique N, la sèche sur sulfate de sodium et la concentre à 5 ce. On ajoute 80 em3 d'éther, essore et sèche pour obtenir, après recristallisation
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dans 50 cm3 d'un mélange chloroforme éther (1 : 5), 3,1 g (94 %) de chlorhydrate du (y-méthyl-L-glutamyl) - (P - méthyl - L- aspartyl) - (S-trityl-L-cystéinyl)-Lprolyl-L-leucyl-glycinate de méthyle (Formule D), F. = environ 1250 C, [a]D = - 300 - 1 (c = 2 %, chloroforme). Ce produit, qui est nouveau, est insoluble dans l'éther et le benzène, peu soluble dans l'eau, soluble dans l'alcool, l'acétone et le chloroforme.
Analyse: C,17H6oO11N6S HCl = 953,54 Calculé: C59,2% H6,45% N8,81% S3,36% Cl 3,72 % Trouvé: C59,5% H6,4% N8,7% S3,8% Cl 3,6 % Préparation du (S,N-ditrityl-L-cystéinyl)-L-tyrosyl- L-isoleucyl-(y-méthyl-L-glutamyl)-(r)-méthyl-L- aspartyl)-(S-trityl-L-cystéinyl)-L-prolyl-L-leucyl- glycinate de méthyle (Formule II) On dissout 4 g de (S,N-ditrityl-L-cystéinyl)-Ltyrosyl-L-isoleucine (Formule E) dans 5 cm3 d'acétate d'éthyle, dilue par 40 cm3 d'éther, ajoute 0,8 cm3 de diéthylamine en solution dans 10 em3 d'éther, essore, lave à l'éther et sèche.
On reprend 3 g du sel de diéthylamine ainsi obtenu dans 10 cm3 de chlorure de méthylène, ajoute 2,95 g de chlorhydrate du (y-méthyl-L-glutamyl)-((1-méthyl-L-aspartyl)-(Strityl-L-cystéinyl)-Lrprolyl-Lrleucyl-glycinate de méthyle (Formule D), 750 mg de dicyclohexylcarbodiimide et abandonne une nuit à la température ambiante. On filtre, lave la solution avec 20 ce d'eau contenant 1,5 cm3 d'acide chlorhydrique N, 10 em3 d'eau, la sèche sur sulfate de sodium et l'évapore à sec sous vide.
On dissout le résidu dans 3 cm3 d'acétate d'éthyle, ajoute 60 cm3 d'éther, essore, lave à l'éther, à l'alcool à 50 %, à l'alcool à 25 %, à l'eau et sèche à 500 C pour obtenir 3,7 g (69 %) de (S,N-ditrityl-L-cystéinyl)-L-tyrosyl-L-isoleucyl-(y-méthyl-L-glutamyl)-((P-méthyl-L-aspartyl)- (S-trityl-L-cystéinyl)-L-prolyl-L-leucyl-glycinate de méthyle (Formule II), F. = environ 1200 C, [a] D = 0 1 (c = 2 %, chloroforme).
Ce produit, qui n'a pas encore été décrit, est insoluble dans l'eau, très peu soluble dans l'éther, peu soluble dans le benzène, soluble dans l'alcool, l'acétone et le chloroforme.
Analyse: C103H113015N9S2 = 178,1,4 Calculé: C 69,45 % H 6,30 % O 13,47 % N 7,08 % S3,60% Trouvé: C69,4% H6,2% 013,3% N7,1% S4,0%