Verfahren zur Herstellung von 17-Oxy-steroiden Es ist bereits bekannt, mittels Enzymen aus Nebennieren, insbesondere mit deren IIomogenaten, oder auch bei ihrer Durehströ- mung Hydroxylgrtippeit, u. a. in 17a-Stellunc von. Steroiden einzuführen.
So interessant diese Funktion tierischer Enzyme vom theo retischen Standpunkt aus ist, so vermag sie zur präparativen und speziell industriellen Ge- winn.ung von 17a.-Oxy-steroiden nicht zu be friedigen. Mit mikrobiologischen Methoden, die sich aueh in grösstem Stile anwenden lassen, ist die genannte Reaktion bisher nicht durchführbar gewesen.
Es wurde nun gefunden, dass 17-Ox#-- steroide hergestellt werden können, wend man auf Verbindungen der Pregnanreihe, die in 17-Stellung ein '#Tasserstoffatom auf weisen, durch aerobe Kulturen von Pilzen der Arten Leptosphaeria maculans, Cucurbi- taria laburni, Lophotrichtts martinii,
Melano- spora parasit.ica und Thielavia terricola pro duzierte Enzyme einwirken. lässt.
Ausgangsstoffe für das neue Verfahren sind allgemein Verbindungen der Pregnan- reihe, zum Beispiel Pregnane, Allopregnane, Isopregnane, wie 14- oder 17-Isopregnane, sowie Homo- und Norpregnane, zum Beispiel A-Nor-, D-Homo- und 19-Nor-pregnane, die in 17-Stellung ein Wasserstoffatom aufwei sen.
Die Verbindungen können gesättigt oder ungesättigt sein und beliebige Substituenten aufweisen. Doppelbindungen können sich zum Beispiel in 1-, 4-, 5-, 6-, 7-, 9-, 14-, 15- und/oder 20-Stellung befinden. Die Konfigu ration der Ausgangsstoffe ist vorzugsweise diejenige des Pregnans, 5a-Pregnans, 17a- Pregnans oder entsprechender Racemate, wie sie bei der Totalsynthese erhalten werden.
Als Substituenten kommen besonders in Frage freie bzw. funktionell abgewandelte Hy- , droxyl-, Oxo-oder Carboxylgruppen, wie Ester-, Äther-, Thioester-, Thioäther-, Thiol- und Thionester-, Acetal-, Mercaptal-, Ketal-, Hy- drazon-, Semicarbazon- und Enolgruppen, zum Beispiel in 3-, 7-, 11-, 12-, 16-, 18-, 19-,
20- und 2.1-Stellung. Ausgangsstoffe sind u. a. Cortexon, 9,11- oder 11,12-Dehydro- cortexon, 16a-Oxy-cortexon, 18-Oxo- und 18- Oxy-cortexon, Corticosteron, 11-Epi-corticoste- ron, 11-Dehy dro-corticosteron, 18-Oxy-cortico- steron, d1>4-3,11,20-Triketo-21-oxy-pregnadien, 41,4 - 3,
20 -Diketo -11ss,21- dioxy - pregnadien, Progesteron, 17a-Progesteron, 11=Keto-proge- steron, 11a- sowie 11 l-Oxy-progesteron, 9,11- oder 11,12 - Dehydro - progesteron, 19 - Oxo- progesteron, 19-Nor-progesteron, Pregnenolon, 21- Oxy - pregnenolon,
Aldosteron bzw. ihre funktionellen Derivate.
Zur Einführung der 17-Oxygruppe inku- biert man meist direkt die Ausgangsstoffe mit den unter an sich bekannten aeroben Bedin gungen submers wachsenden Kulturen der ge nannten Pilze. Diese werden zweckmässig be- wegt, das heisst geschüttelt oder gerührt, und enthalten assimilierbaren Kohlenstoff, insbe sondere Kohlenhydrate sowie gegebenenfalls Wuehsstoffe, beispielsweise Maisquellwasser oder Bierwürze, und anorganische Salze.
Es sind somit natürliche, synthetische oder halb synthetische Nährlösungen brauchbar. Das praktisch einfachste Verfahren ist im folgen den geschildert: Man züchtet die Organismen in Apparaturen und unter ähnlichen Bedin gungen, wie sie bei der Antibiotika-Fabrika- tion als sogenanntes Tieftankverfahren be kannt sind. Nach Entwicklung der Kulturen gibt man die genannten Ausgangsstoffe in feiner Dispersion oder Lösung, beispielsweise in Methanol, Aceton oder Äthylenglykol zu und inkubiert weiter.
Schliesslich trennt man vom Myeel ab, extrahiert das Filtrat und/oder die Mycelmasse und isoliert aus dem Extrakt die Reaktionsprodukte in an sich bekannter Weise, zum Beispiel durch Entmischungsver- fahren, Adsorption, Chromatographie, Kri stallisation, Überführung in funktionelle Deri vate, wie Girard-Verbindungen und derglei chen.
Dieselben Umsetzungen lassen sich aber auch durchführen, indem man die wirksamen Enzyme aus entsprechenden aeroben Kulturen der genannten Arten zuerst abtrennt und un ter Ausschluss der wachsenden Kulturen ver wendet.
Die Verfahrensprodukte können als Heil mittel Verwendung finden oder als Zwischen produkte zu ihrer Herstellung dienen. Von grösstem praktischem Interesse sind zum Bei spiel Cortison, Hydroeortison, 1,2-Dehydro- cor tison, 1,2-Dehydro - hydrocortison, Reich steins Substanz S, 17a-Oxy-aldosteron sowie die zum Beispiel aus Progesteron,
Pregnen- olon und 11-Ketoprogesteron entstehenden 17- Oxy-derivate.
<I>Beispiel 1</I> 50 Volumteile sterilisierte 70prozentige Bierwürze werden mit Leptosphaeria macu- lans geimpft und 4 Tage bei 27 geschüttelt. Zur geit entwickelten Kultur wird eine Lö sung von 0,01 Gewichtsteilen Cortexon in 0,5 Volumteilen Aceton unter sterilen Be dingungen gegeben, und das Gemisch wird weiter bei 27 geschüttelt. Nach 3 Tagen wird das My cel abfiltriert und einige Male mit Wasser gewaschen.
Man extrahiert das Kulturfiltrat dreimal mit je 2'5 Volumteilen Essigester. Die Essigester-Lösungen werden mit 1-n. Salzsäure, Wasser, 1-n. Natriumbi- carbonat-Lösung und Wasser gewaschen, ge trocknet und bei 40 bis 50 im Vakuum ein gedampft. Der Rückstand wird an 0,2 CTe- wichtsteilen Silieagel chromatographiert, wo bei zuerst mit. Chloroform allein, dann mit.
Chloroform-Aceton-Gemischen mit steigendem Aceton-Gehalt eluiert wird. Mit Chloroform und Chloroform-Aceton (9'5:5) werden wenig Cortexon enthaltende Verunreinigungen elu- iert. Die ersten Chloroform-Fraktionen mit 10% Aceton geben beim Eindampfen einen Rückstand,
der mit konzentrierter Schwefel säure die für Substanz S (17a-Oxy-cortexon) charakteristische karminrote Färbung gibt. Dieser Rückstand wird aus Aceton--,@ther- Gemischen umkristallisiert, wobei reine Sub stanz S vom F. = ?02 bis 213" und der spe zifischen Drehung [.a] D = + 132 (in Äthanol) erhalten wird.
<I>Beispiel</I> 50 Volumteile sterilisierte 70prozentige Bierwürze werden mit Cucurbitaria laburni geimpft und 5 Tage bei 27 geschüttelt. Zur gut entwickelten Kultur wird eine Lösung von 0,01 llewicht.steilen Cortexon in 0,5 Volum- teilen Aceton unter sterilen Bedingungen ge geben, und das Gemisch wird weiter bei 27 geschüttelt. Nach 3 Tagen wird das Mveel ab filtriert und das Kulturfiltrat wie in Beispiel 1 beschrieben extrahiert.
Der Extraktions rückstand enthält, wie die papierehromatogra- phische L ntersuchung zeigt, zusammen mit etwas Ausgangsmaterial hauptsächlich 17a- Oxy-cortexon (Substanz S von Reichstein), welches wie in Beispiel 1 isoliert und kristalli siert wird.
<I>Beispiel 3</I> 50 Volumteile sterilisierte 70prozentige Bierwürze werden mit Lophotriehus martinii geimpft und 3 Tage bei 27 geschüttelt. Zur gut entwickelten Kultur wird eine Lösung von 0,01. Gewichtsteilen Cortexon in 0,5 Vo- lumteilen Aceton unter sterilen Bedingungen gegeben, und das Gemisch wird weiter bei 27 gesehüttelt. Nach 2 Tagen wird das 3lycel abfiltriert und das Kulturfiltrat wie in Bei spiel 1 beschrieben extrahiert.
Der Extrak tionsrückstand enthält, wie die papierchro- inat.ographische Untersuchung zeigt, zusam men mit etwas Ausgangsmaterial hauptsäch lich 1.7a-Oxy-cortexon (Substanz S von Reich stein), welches wie in Beispiel 1 isoliert und kristallisiert wird. <I>Beispiel</I> 50 Volumteile sterilisierte 70prozentige Bierwürze werden mit Melanospora parasitica geimpft, und 3 Tage bei 27 geschüttelt.
Zur gut entwickelten Kultur wird eine Lösung von 0,01 Gewichtsteilen Cortexon in 0,5 Vo- luniteilen Aceton unter sterilen Bedingungen gegeben, und das Gemisch wird weiter bei 27 geschüttelt. Nach 2 Tagen wird das Myeel abfiltriert und das Kulturfiltrat wie in Bei spiel 1 beschrieben extrahiert.
Der Extrak tionsrückstand enthält, wie die papierchro- matographische Untersuchung zeigt, zusam men mit etwas Ausgangsmaterial hauptsäch lich 17a-Oxy-cortexon (Substanz S von Reich stein), welches wie in Beispiel 1 isoliert und kristallisiert wird.
<I>Beispiel 5</I> 50 V olumteile sterilisierte 70prozentige Bierwürze werden mit Thielavia terricola ge impft und 3 Tage bei 27 geschüttelt. Zur gut entwickelten Kultur wird eine Lösung von 0,01 Gewichtsteilen Cortexon in 0,5 Volum- teilen Aceton unter sterilen Bedingungen ge geben, und das Gemisch wird weiter bei 27 geschüttelt. Nach 3 Tagen wird das Mycel abfiltriert und das Kulturfiltrat wie in Bei.. spiel 1 beschrieben extrahiert.
Der Extrak tionsrückstand enthält, wie die papierchro- matographische Untersuchung zeigt, zusammen mit etwas Ausgangsmaterial hauptsächlich 17a-Oxy-cortexon (Substanz S von Reich stein), welches wie in Beispiel 1 isoliert und kristallisiert wird.
Process for the production of 17-oxy-steroids It is already known to use enzymes from adrenal glands, in particular with their homogenates, or even with their flow, hydroxylgrtippeit, and the like. a. in 17a position of. Introduce steroids.
As interesting as this function of animal enzymes is from a theoretical point of view, it cannot be satisfactory for the preparative and especially industrial production of 17a-oxy-steroids. With microbiological methods, which can also be applied on a large scale, the mentioned reaction has not yet been feasible.
It has now been found that 17-Ox # - steroids can be prepared using compounds of the Pregnan series, which have a '# hydrogen atom in the 17 position, by aerobic cultures of fungi of the species Leptosphaeria maculans, Cucurbitaria laburni , Lophotrichtts martinii,
Melanospora parasit.ica and Thielavia terricola produced enzymes act. leaves.
Starting materials for the new process are generally compounds of the pregnane series, for example pregnanes, allopregnanes, isopregnanes, such as 14- or 17-isopregnanes, and homo- and norpregnanes, for example A-nor-, D-homo- and 19-nor -pregnane, which aufwei sen in the 17-position a hydrogen atom.
The compounds can be saturated or unsaturated and have any substituents. Double bonds can, for example, be in the 1-, 4-, 5-, 6-, 7-, 9-, 14-, 15- and / or 20-position. The configuration of the starting materials is preferably that of the pregnans, 5a-pregnans, 17a-pregnans or corresponding racemates as obtained in the total synthesis.
Particularly suitable substituents are free or functionally modified hydroxyl, oxo or carboxyl groups, such as ester, ether, thioester, thioether, thiol and thionester, acetal, mercaptal, ketal, Hydrazone, semicarbazone and enol groups, for example in 3-, 7-, 11-, 12-, 16-, 18-, 19-,
20 and 2.1 positions. Starting materials are u. a. Cortexon, 9,11- or 11,12-dehydro- cortexon, 16a-oxy-cortexon, 18-oxo- and 18-oxy-cortexon, corticosterone, 11-epi-corticosterone, 11-dehydro-corticosterone, 18 -Oxy-cortico- steron, d1> 4-3,11,20-triketo-21-oxy-pregnadiene, 41.4 - 3,
20 -diketo -11ss, 21- dioxy-pregnadien, progesterone, 17a-progesterone, 11 = keto-progesterone, 11a- as well as 11 l-oxy-progesterone, 9,11- or 11,12 - dehydro-progesterone, 19 - Oxo-progesterone, 19-nor-progesterone, pregnenolone, 21- Oxy - pregnenolone,
Aldosterone or its functional derivatives.
To introduce the 17-oxy group, the starting materials are usually incubated directly with the cultures of the fungi mentioned that grow submerged under aerobic conditions known per se. These are expediently agitated, that is to say shaken or stirred, and contain assimilable carbon, in particular special carbohydrates and, if appropriate, nutrients, for example corn steeple or wort, and inorganic salts.
Natural, synthetic or semi-synthetic nutrient solutions can therefore be used. The simplest process in practice is described below: The organisms are grown in equipment and under conditions similar to those known in the so-called deep-tank process in antibiotic manufacture. After the cultures have developed, the starting materials mentioned are added in a fine dispersion or solution, for example in methanol, acetone or ethylene glycol, and the incubation continues.
Finally, the myeel is separated off, the filtrate and / or the mycelial mass is extracted and the reaction products are isolated from the extract in a manner known per se, for example by separation processes, adsorption, chromatography, crystallization, conversion into functional derivatives, such as Girard -Connections and the like.
The same reactions can, however, also be carried out by first separating the active enzymes from corresponding aerobic cultures of the species mentioned and using them under the exclusion of the growing cultures.
The products of the process can be used as medicinal products or as intermediate products for their manufacture. Of the greatest practical interest are, for example, cortisone, hydroeortisone, 1,2-dehydrocortisone, 1,2-dehydrocortisone, Reichstein's substance S, 17a-oxy-aldosterone as well as those from progesterone,
Pregnenolone and 11-ketoprogesterone form 17-oxy derivatives.
<I> Example 1 </I> 50 parts by volume of sterilized 70 percent wort are inoculated with Leptosphaeria maculans and shaken at 27 for 4 days. To the recently developed culture, a solution of 0.01 part by weight of cortexone in 0.5 part by volume of acetone is added under sterile conditions, and the mixture is further shaken at 27. After 3 days, the mycelium is filtered off and washed a few times with water.
The culture filtrate is extracted three times with 2'5 parts by volume of ethyl acetate each time. The ethyl acetate solutions are 1-n. Hydrochloric acid, water, 1-n. Washed sodium bicarbonate solution and water, dried and evaporated at 40 to 50 in a vacuum. The residue is chromatographed on 0.2 parts by weight of silica gel, where first with. Chloroform alone, then with.
Chloroform-acetone mixtures with increasing acetone content is eluted. Impurities containing a small amount of cortexone are eluted with chloroform and chloroform-acetone (9'5: 5). The first chloroform fractions with 10% acetone give a residue on evaporation,
which, with concentrated sulfuric acid, gives the carmine-red color characteristic of substance S (17a-oxy-cortexon). This residue is recrystallized from acetone, @ ether mixtures, pure substance S from F. =? 02 to 213 "and the specific rotation [.a] D = + 132 (in ethanol) is obtained.
<I> Example </I> 50 parts by volume of sterilized 70 percent wort are inoculated with Cucurbitaria laburni and shaken at 27 for 5 days. A solution of 0.01 part by weight of cortexone in 0.5 parts by volume of acetone is added to the well-developed culture under sterile conditions, and the mixture is shaken further at 27. After 3 days the Mveel is filtered off and the culture filtrate is extracted as described in Example 1.
As the paper chromatographic examination shows, the extraction residue mainly contains 17a-oxycortexon (substance S from Reichstein), which is isolated and crystallized as in Example 1, together with some starting material.
<I> Example 3 </I> 50 parts by volume of sterilized 70 percent wort are inoculated with Lophotriehus martinii and shaken at 27 for 3 days. A solution of 0.01 becomes a well-developed culture. Part by weight of cortexone in 0.5 part by volume of acetone is added under sterile conditions and the mixture is shaken further at 27. After 2 days, the 3lycel is filtered off and the culture filtrate is extracted as described in Example 1.
The extraction residue contains, as the paper-chromatographic examination shows, together with some starting material mainly 1.7a-oxycortexon (substance S from Reichstein), which is isolated and crystallized as in Example 1. <I> Example </I> 50 parts by volume of sterilized 70 percent wort are inoculated with Melanospora parasitica and shaken at 27 for 3 days.
A solution of 0.01 part by weight of cortexone in 0.5 volume part of acetone is added to the well-developed culture under sterile conditions and the mixture is further shaken at 27. After 2 days, the Myeel is filtered off and the culture filtrate is extracted as described in Example 1.
As the paper chromatographic examination shows, the extraction residue contains, together with some starting material, mainly 17α-oxycortexon (substance S from Reichstein), which is isolated and crystallized as in Example 1.
<I> Example 5 </I> 50 volume parts sterilized 70 percent wort are inoculated with Thielavia terricola and shaken at 27 for 3 days. A solution of 0.01 part by weight of cortexone in 0.5 part by volume of acetone is added to the well-developed culture under sterile conditions and the mixture is shaken further at 27. After 3 days, the mycelium is filtered off and the culture filtrate is extracted as described in Example 1.
As the paper chromatographic examination shows, the extraction residue mainly contains 17α-oxycortexon (substance S from Reichstein), which is isolated and crystallized as in Example 1, together with some starting material.