Procédé de fabrication d'insuline cristallisée. On sait que certains métaux sont néces saires à la cristallisation de Fins Mine. On a tenu compte de ce fait dans la production commerciale d'insuline cristallisée, en ajou tant du zinc, sous forme d'un sel, tel que le elilorure, au milieu aqueux dans lequel la cristallisation est effectuée. En opérant de cette manière, on obtient des cristaux d'insu line présentant une teneur limitée en zinc, en général 0,4 % environ.
Selon Elsenbrand et Wegel [voir 3ledizizi ad C hemie , IV, page 290 (1942) 1, il n'a pas été possible, jusqu'à présent., de produire (les cristaux d'insuline ayant une teneur en zinc supérieure à 0,8 0/0.
La présente invention concerne un pro cédé de fabrication d'insuline cristallisée ayant une teneur en zinc supérieure à. 0,8 %. Ce pro- cédé est caractérisé par le fait qu'on prépare une suspension d'insuline cristallisée dans un milieu aqueux ayant un pH supérieur à 2 et inférieur à 9,
ce milieu contenant une telle proportion de zinc que l'insuline cristallisée régisse chimiquement. avec les ions de zinc du iuilieu en formant des cristaux d'insuline dont. la teneur en zinc est. supérieure à. 0,8 %, et. par le fait. qu'on sépare ensuite ces cristaux d'insuline dudit milieu aqueux.
Les cristaux d'insuline ainsi obtenus sont pratiquement in solubles dans l'eau à. pH - 7, et lorsqu'ils sont injectés dans l'organisme par voie intramiaseu- laine ou sous-cutanée, en suspension aqueuse, ils se caractérisent par une action retard.
L'existence d'une réaction chimique entre l'insuline précipitée et le zinc a été démontrée par Eisenbrand et ZV egel dans Medizin und Chemie , IV, pages 278-292 (1942). Selon ces auteurs, l'insuline amorphe est capable de fixer du zinc en quantité correspondant à l'équivalent. de ses groupes carboxyliques libres.
Des cristaux d'insuline ayant une teneur en zinc supérieure à 0,8 % se distinguent par une .solubilité très limitée au pH du sang par rapport à.
celle des cristaux d'insuline conte nant du zinc jusqu'à 0,8 0/m. Par exemple, des cristaux d'insuline ayant une teneur en zinc d'environ 1 % restent insolubles dans un mi- lieu aqueux ayant un pH de 7, pourvu que le milieu ne contienne pas de ,substance ayant une affinité plus grande pour le zinc que les cristaux d'insuline.
Des cristaux d'insuline ayant une teneur en zinc supérieure à 0,8 0/0, obtenus selon l'in vention, peuvent- ainsi servir à la, préparation de suspensions de cristaux injectables avec effet. retard pour injection sous-cutanée ou intramusculaire.
Si on prend des cristaux d'insuline avec une teneur en zinc d'environ 0,4 %, et si on les met en suspension dans de l'eau contenant des ions de zinc, ce dernier doit être pré- dent à une concentration ;supérieure à 11 @:
A @,' 10--3 milliéquiv alents par litre, A désignant le nombre d'unités internationales d'insuline par millilitre de la suspension.
La teneur en zinc dudit milieu aqueux dé pend, en outre, de .soit pH; en règle générale, il est nécessaire d'avoir une concentration croissante en ce métal pour un pi, du milieu décroissant. Pour une quantité déterminée de cristaux d'insuline par unité de volume du milieu aqueux, une augmentation de la con centration du zinc dans le milieu correspon dra, dans des conditions identiques, à une augmentation de la teneur en zinc des cris taux.
En outre, pour déterminer la teneur en zinc du milieu aqueux, il faut. voir s'il ne con tient pas de substances ayant une affinité plus grande pour le zinc que les cristaux d'insu line, auquel cas on doit employer une plus grande concentration de zinc que si de telles substances n'étaient pas présentes dans le mi lieu.
Il n'y a pas de limite supérieure pour la concentration en zinc du milieu aqueux.
Si le milieu aqueux a. ou est, amené à. un pli d'environ 7, la teneur en zinc des cristaux pourra atteindre \?,7 % environ, ce qui corres- pond ait nombre de groupements acides de la molécule d'insuline; à, des pH plttss élevés, on petit toutefois obtenir des teneurs en zinc en core plus grandes.
Il est préférable que le milieu aqueux con tienne le zinc sous forme d'un sel tel que ehlo- rttre, sulfate, nitrate, acétate ou citrate, mais on peut aussi utiliser un oxyde ou hydroxyde de zinc, un composé complexe ou le métal lui- même, à condition que le zinc. ou le composé de zinc employé soit, aux conditions régnant dans le milieu, apte à réagir avec les cristaux d'insuline.
Le pH dit milieu aqueux a une influence décisive sur la. solubilité des cristaux d'insu- line dans le milieu et sur leur capacité de réagir avec le zinc contenu dans le milieu aqueux.
Naturellement, il faut pour mettre en oeuvre ce procédé, que les cristaux ne se dissolvent pas complètement dans le milieu. D'autre part, il n'est pas nécessaire que les cristaux soient totalement. insolubles dans le milieu, étant. donné que cette partie d'insuline entrant en solution, s'il y en a. petit être récupérée sort.; forme cristalline.
Bien qu'il suffise, pour empêcher la. solu bilité totale des cristaux d'insuline, que le mi lieu aqueux ait le pH indiqué, compris entre 2 et 9, il est. préférable de donner au milieu aqueux un pH compris entre 5 et 8, étant donné que les cristaux d'insuline se dissolvent le plus difficilement. dans ce domaine du pli.
Il est même de beaucoup préférable que le milieu aqueux ait. ou soit amené à. un pH com pris entre 6 et 7, d'une part., parce qu'on @j observé que les cristaux d'insuline dont let teneur en zinc est.
,supérieure à 0,8 /o sont beaucoup moins solubles dans ce domaine de pH et, d'autre part., parce qu'il faut une con centration du milieu en zinc relativement plus grande à un pH plus bas et que, à des<B>pi(</B> supérieurs à 7, il se produit souvent, eu même temps, une précipitation de sels de zinc qu'on doit enlever ensuite des cristaux d'insuline sé parés, si on veut des cristaux purs.
On peut ajuster et stabiliser le pH du mi lieu aqueux au moyen d'une ou plusieurs subs- tanees-tampon. Comme exemples de substan- ces-tampon utilisables, on petit mentionner les tampons à, l'acétate, au borate, ait citrate, ati diéthylbarbiturate, au phosphate, ait maléate et leurs mélanges.
En clioisie:sant la substanee-tanipon et d'an tres adjonetion.s éventuelles au milieu aqueux, il faut prendre en considération le fait sui vant: On a. observé que la présence de certains anions dans le milieu aqueux influence la réaction du zinc avec les cristaux d'insuline. Si le milieu aqueux contient un phosphate ou un citrate, et la. eoneentration en zinc norma lement suffisante pour donner des cristaux d'insuline à. teneur en zinc supérieure à. 0,8 ;
''o. les cristaux d'insuline, ait pH :5 du milieu, tic réagiront pas avec le zinc du milieu, tandis que les cristaux entreront en solution si on amène le pH du milieu à. 7. Ce n'est que si l'on ajoute assez de zinc pour que les ions phosphate ou citrate présents soient fixés par le zinc et que, après cela, il reste encore du zinc pour les cristaux, que ces derniers pour ront. réagir avec le zinc.
Dans des conditions normales, les cristaux rPagiront avec le zinc pour ainsi dire instan tanément. De toute faon, il n'y a aucune rai- f*on de les laisser reposer un certain temps avant de les séparer du milieu de suspension. ('e temps de repos, par exemple pendant une nuit, n'augmentera la teneur en zinc que de 10 / au plus et un repos de plus de 24 heures ne donnera aucune augmentation supplémen taire.
En appliquant le procédé selon l'invention, ion petit partir des cristaux d'insuline courants étui contiennent, en général, 0,4% de zinc en- viron et auxquels on désire conférer une te- Iieur en zinc supérieure à 0,8 /o.
Exemple <I>1:</I> On met en suspension 174 milligrammes d'insuline cristallisée, contenant. environ 0,4 /o <B>(le</B> zinc. dans 100 millilitres d'une solution ,iyuense de chlorure de zinc, contenant 0,009 /o de zinc et amenée à un pH de 7 en-%#i- ron. Après réaction, on sépare les cristaux, par filtration ou centrifugation, et on les lave à l'eau. Les cristaux séparés présentent. une teneur en zinc d'environ 2,3 /o.
<I>Exemple</I> ?: On met en suspension 43,5 milligrammes d'insuline cristallisée, avec une teneur ci). zinc d'environ 0,4 /o, dans 100 millilitres de la so lution de chlorure de zinc employée dans l'exemple 1 et., après réaction, on sépare les cristaux et. les lave à l'eau.
Les cristaux sépa rés présentent. une teneur en zinc d'environ <B>2,60/0.</B><I>Exemple 3:</I> On met. en suspension 3-18 milligrammes d'insuline cristallisée, avec une teneur en zinc d'environ 0,4 /o, clans 100 millilitres de la so lution de chlorure de zinc employée dans l'exemple 1 et, après réaction, on sépare les cristaux et. les lave à l'eau.
Les cristaux sépa rés présentent une teneur en zinc d'environ 1,81/0. Exemple <I>4:</I> On met en suspension 174 milligrammes d'insuline cristallisée, avec une teneur en zinc d'environ 0,4 /o, dans 100 millilitres d'une so lution aqueuse, qui contient 0,008 /o de zinc (sous forme de sulfate) et de l'acétate de so dium (pour rendre la solution 1/12o molaire) et dont le pH a été ramené à environ 6 par IICl; après réaction, les cristaux sont séparés et lavés à l'eau. On obtient des cristaux d'in suline avec une teneur en zinc d'environ 1 /o.
Exemple <I>5:</I> On procède, comme dans l'exemple 4, excepté que la solution aqueuse a été amenée à. un pH d'environ 7. On obtient. ainsi des cris taux d'insuline avec une teneur en zinc d'en viron 1,9 / .
Exemple <I>6:</I> On met. en suspension 174 milligrammes d'insuline cristallisée dans 100 millilitres d'une solution aqueuse qui contient 0,002 /o de zinc (sous forme de chlorure) et. de l'acide diéthylbarbiturique (pour rendre la solution 1/12e molaire) et dont<I>le pH</I> a été, porté à en viron 7,2 par de l'hydroxyde de sodium; après réaction, on sépare les cristaux. Ils présentent une teneur en zinc d'environ 1,1 /o.
<I>Exemple 7:</I> On procède comme dans l'exemple 6, excepté que l'on donne à la solution aqueuse une concentration en zinc de 0,004%. On obtient, ainsi des cristaux avec une teneur en zinc d'environ 1,7 %.
<I>Exemple 8:</I> On procède comme dans l'exemple 6, excepté qu'on donne à la solution aqueuse une concentration en zinc de 0,016 %. On obtient ainsi des cristaux avec une teneur en zinc d'en viron 2,5 %.
<I>Exemple 9:</I> On procède comme dans l'exemple 6, excepté qu'on donne à la solution aqueuse une concentration en zinc d'environ 0,03 %. Les cristaux séparés contiendront alors environ 2,7 /o de zinc.
Exemple <I>10:</I> On met en suspension<B>17-1</B> milligrammes d'insuline cristallisée, avec une teneur en zinc d'environ 0,-1- o/o, dans 100 millilitres d'une so- lution aqueuse qui contient 0,016 % de zinc (sous forme de chlorure) et de l'acide bori que (pour rendre la solution 1/12o molaire)
et dont le pli a été amené à environ 7. Après réaction, on ,sépare les cristaux et les lave à l'eau. Ils contiennent environ 2,5% de zinc.
Dans les exemples donnés ei-dessns, on emploie comme matière de départ des cristaux d'insuline préparés auparavant, et ayant la teneur usuelle en zinc. Cependant, le procédé selon l'invention peut aussi être appliqué en connexion avec la. préparation de cristaux d'insuline à partir d'insuline amorphe ou par recristallisation d'insuline cristallisée.
Dans ce cas, on provoque la cristallisation de l'insuline dans un milieu aqueux et on introduit alors le zinc nécessaire dans ce mi lieu ou on modifie le pH du milieu, contenant déjà. la quantité voulue de zinc, de façon à. obtenir des cristaux d'insuline à teneur en zinc supérieure à 0,8 0/0.
La cristallisation peut être effectuée, comme connu en soi, en faisant cristalliser une solution aqueuse acide d'insuline, contenant un ou plusieurs tampons, un solvant. organi que favorisant la cristallisation et un sel de zinc, en modifiant le pH de la ,solution jusqu'à une valeur comprise entre 5,5 et 6,5.
En ehoissant le tampon, il faut prendre garde à ce qui a été dit. ci-dessus concernant l'influence de certains anions sur la faculté des cristaux de réagir avec le zinc après la cristallisation. Quand on se sert. comme milieu aqueux de suspension de la liqueur mère des cristaux d'insuline, il n'est donc- pas indiqué que celle-ci renferme un tampon au phosphate ou au citrate.
<I>Exemple 11:</I> On dissout 200 milligrammes d'insuline amorphe (20 unités internationales par milli gramme) dans 100 millilitres d'une solution d'acide chlorhydrique contenant. 0,001 % de zinc (sous forme de chlorure), de l'acétate de sodium (pour rendre la solution 1, lee mo laire) et de l'acide diéthylbarbiturique (pour rendre la solution 1;
12o molaire), puis le pli de la solution est ponté à 5,6-5,8 par Na011. Si on laisse reposer, avec agitation si on le désire, l'insuline cristallise.
Lousque la cristal- lisation est achevée, on ajoute 0,01% de zinc (sous forme de chlorure) et on élève le hjl à environ 7 par Na01I. Après la réaction entre les cristaux d'insuline et. les ions de zinc, on sépare les cristaux en filtrant par le vide et on les lave à, l'eau. Ils présentent une teneur en zinc d'environ 2 010.
Exemple 1;3: On dissout 2,0 g d'insuline amorphe (20 unités internationales par milligramme), an mov en d'acide chlorhydrique, dans un litre d'une solution contenant 5 % d'acétone, 0,
001 % de zinc (sous forme de chlorure), de l'acétate de sodium (pour rendre la. solution 1/12o molaire) et.
de l'acide diéthv1barbituri- que (pour rendre la solution 1'leo nuolaire), et on élève le pjl de la ,solution à environ 5,8 par NaOH, provoquant ainsi la cristallisation de l'insuline. Lorsque la cristallisation est achevée, on ajoute 200 milligrammes de zinc (sous forme de chlorure) et. on élève le pll de la solution à. environ 7 par NaOH. Après la réaction entre les cristaux d'insuline et. les ions de zinc, on sépare alors les cristaux et on les lave à. l'eau.
Ils présentent une teneur en zinc d'environ 2,5 0/0.
<I>Exemple 13:</I> On dissout 1,7 g de cristaux d'insuline au moyen d'acide chloi-livdrique dans un litre d'une solution contenant de l'acétate de so dium (pour rendre la. solution 1;'12o Mo laire), de l'acide diéthylbarbiturique (pour rendre la solution 1;12" molaire), et on amène le pli de la solution à .5,5-.;,7 par NaOH. Après avoir reposé, avec agi tation si on le désire, l'insuline cristallise.
Lorsque la cristallisation est achevée, on ajoute 100 milligrammes de zinc (sous forme de chlorure) et on élève le pli à 7 environ par NaOH. Après avoir agité la. suspension de cristaux, pour leur permettre de réagir avec le zinc, on les sépare et les lave à l'eau.
Ils présentent une teneur en zinc d'environ 2 %. <I>Exemple</I> 1.1: On dissout 174 milligrammes d'insuline cristallisée dans 20 millilitres d'acide chlor hydrique 0,01 n et on ajoute dans l'ordre indiqué: 10 millilitres d'une solution d'acétate de sodium i/12 molaire.
70 millilitres d'une solution contenant 0,004% de zinc (sous forme de chlo rure) et on abaisse le pH à 5 environ. Lorsque, ayant. reposé, l'insuline précipitée est devenue cris talline, on amène le pH de la suspension de cristaux à environ 7 et, après réaction, on sépare les cristaux par filtration par le vide et on les lave à l'eau. Ils présentent une te- neur en zinc d'environ 1,4 %.
Process for manufacturing crystallized insulin. It is known that certain metals are necessary for the crystallization of Fins Mine. This fact has been taken into account in the commercial production of crystallized insulin, by adding zinc, in the form of a salt, such as eliloride, to the aqueous medium in which the crystallization is carried out. By operating in this way, insulin crystals are obtained having a limited zinc content, in general about 0.4%.
According to Elsenbrand and Wegel [see 3ledizizi ad C hemie, IV, page 290 (1942) 1, it has so far not been possible to produce (insulin crystals with a zinc content greater than 0 , 8 0/0.
The present invention relates to a process for the manufacture of crystallized insulin having a zinc content greater than. 0.8%. This process is characterized by the fact that a suspension of insulin crystallized in an aqueous medium having a pH greater than 2 and less than 9 is prepared,
this medium containing such a proportion of zinc that crystallized insulin chemically regulates. with the zinc ions of the medium, forming insulin crystals. the zinc content is. better than. 0.8%, and. by the fact. that these insulin crystals are then separated from said aqueous medium.
The insulin crystals thus obtained are practically insoluble in water. pH - 7, and when injected into the organism intramiaseu- wool or subcutaneously, in aqueous suspension, they are characterized by a depot action.
The existence of a chemical reaction between precipitated insulin and zinc has been demonstrated by Eisenbrand and ZV egel in Medizin und Chemie, IV, pages 278-292 (1942). According to these authors, amorphous insulin is capable of fixing zinc in an amount corresponding to the equivalent. of its free carboxylic groups.
Insulin crystals with a zinc content greater than 0.8% are distinguished by a very limited solubility at blood pH relative to.
that of insulin crystals containing zinc up to 0.8 0 / m. For example, insulin crystals with a zinc content of about 1% remain insoluble in an aqueous medium having a pH of 7, provided the medium does not contain any substance having a greater affinity for zinc. than insulin crystals.
Insulin crystals having a zinc content greater than 0.8%, obtained according to the invention, can thus be used for the preparation of suspensions of injectable crystals with effect. delay for subcutaneous or intramuscular injection.
If one takes insulin crystals with a zinc content of about 0.4%, and if they are suspended in water containing zinc ions, the latter must be present at a concentration; greater than 11 @:
A @, '10--3 milliequiv alents per liter, A denoting the number of international units of insulin per milliliter of the suspension.
The zinc content of said aqueous medium further depends on pH; as a general rule, it is necessary to have an increasing concentration of this metal for one pi, of the decreasing medium. For a determined quantity of insulin crystals per unit volume of the aqueous medium, an increase in the zinc concentration in the medium will correspond, under identical conditions, to an increase in the zinc content of the cris rates.
In addition, to determine the zinc content of the aqueous medium, it is necessary. see if it does not contain substances having a greater affinity for zinc than insulin crystals, in which case a greater concentration of zinc should be used than if such substances were not present in the medium. location.
There is no upper limit for the zinc concentration of the aqueous medium.
If the aqueous medium has. or is, brought to. a fold of about 7, the zinc content of the crystals may reach about \ ?, 7%, which corresponds to the number of acid groups of the insulin molecule; at higher pHs, however, even higher zinc contents can be obtained.
It is preferable that the aqueous medium contains the zinc in the form of a salt such as chloride, sulphate, nitrate, acetate or citrate, but a zinc oxide or hydroxide, a complex compound or the metal can also be used. - same, provided the zinc. or the zinc compound employed is, under the conditions prevailing in the medium, capable of reacting with the insulin crystals.
The so-called aqueous medium pH has a decisive influence on the. solubility of insulin crystals in the medium and on their ability to react with the zinc contained in the aqueous medium.
Of course, in order to carry out this process, the crystals must not dissolve completely in the medium. On the other hand, it is not necessary that the crystals are totally. insoluble in the medium, being. given that this part of insulin going into solution, if there is any. small be recovered fate .; crystalline form.
Although it is enough, to prevent the. total solu bility of insulin crystals, whether the aqueous medium has the indicated pH, between 2 and 9, it is. It is preferable to give the aqueous medium a pH between 5 and 8, since the crystals of insulin dissolve the most difficult. in this area of the fold.
It is even much preferable that the aqueous medium has. or be brought to. a pH between 6 and 7, on the one hand., because it was observed that the insulin crystals whose zinc content is.
, greater than 0.8 / o are much less soluble in this pH range and, on the other hand., because a relatively greater zinc concentration of the medium is required at a lower pH and that at <B> pi (</B> greater than 7, there is often, at the same time, a precipitation of zinc salts which must then be removed from the separated insulin crystals, if pure crystals are desired.
The pH of the aqueous medium can be adjusted and stabilized by means of one or more buffer substances. As examples of suitable buffer substances, there may be mentioned acetate, borate, citrate, diethyl barbiturate, phosphate, maleate buffers and mixtures thereof.
In clioisie: sant the substanee-tanipon and other possible addonetion.s to the aqueous medium, the following fact must be taken into consideration: We have. observed that the presence of certain anions in the aqueous medium influences the reaction of zinc with insulin crystals. If the aqueous medium contains a phosphate or a citrate, and the. Zinc concentration normally sufficient to give insulin crystals to. zinc content greater than. 0.8;
'' o. the insulin crystals, having a pH: 5 of the medium, will not react with the zinc of the medium, while the crystals will go into solution if the pH of the medium is brought to. 7. It is only if enough zinc is added so that the phosphate or citrate ions present are fixed by the zinc and, after that, there is still zinc left for the crystals, that the latter will fail. react with zinc.
Under normal conditions the crystals will react with the zinc almost instantly. Anyway, there is no reason to let them sit for a while before separating them from the suspending medium. (Resting time, eg overnight, will only increase the zinc content by 10% at most and rest for more than 24 hours will not give any further increase.
By applying the process according to the invention, starting from the common insulin crystals packaged, in general, about 0.4% zinc and to which it is desired to give a zinc content greater than 0.8%. o.
Example <I> 1: </I> 174 milligrams of crystallized insulin, containing. about 0.4 / o <B> (the </B> zinc. in 100 milliliters of a solution, iyuense of zinc chloride, containing 0.009 / o of zinc and brought to a pH of 7 in -% # i- After the reaction, the crystals are separated by filtration or centrifugation and washed with water The crystals separated have a zinc content of about 2.3%.
<I> Example </I> ?: We suspend 43.5 milligrams of crystallized insulin, with a content of). zinc of about 0.4% in 100 milliliters of the zinc chloride solution used in Example 1 and., after reaction, the crystals are separated and. washes them with water.
The separate crystals present. a zinc content of approximately <B>2.60/0.</B> <I> Example 3: </I> We put. in suspension 3-18 milligrams of crystallized insulin, with a zinc content of about 0.4 / o, in 100 milliliters of the zinc chloride solution employed in Example 1 and, after reaction, the crystals and. washes them with water.
The separated crystals have a zinc content of about 1.81 / 0. Example <I> 4: </I> 174 milligrams of crystallized insulin, with a zinc content of about 0.4 / o, are suspended in 100 milliliters of an aqueous solution, which contains 0.008 / o zinc (in the form of sulphate) and sodium acetate (to make the solution 1/12 molar) and the pH of which has been brought to about 6 by IICl; after reaction, the crystals are separated and washed with water. Insulin crystals are obtained with a zinc content of about 1 / o.
Example <I> 5: </I> The procedure is as in Example 4, except that the aqueous solution has been brought to. a pH of about 7. This gives. thus cries insulin levels with a zinc content of around 1.9 /.
Example <I> 6: </I> We put. in suspension 174 milligrams of crystallized insulin in 100 milliliters of an aqueous solution which contains 0.002 / o of zinc (in the form of chloride) and. diethylbarbituric acid (to make the solution 1/12 molar) and the <I> pH </I> of which has been brought to about 7.2 by sodium hydroxide; after reaction, the crystals are separated. They have a zinc content of around 1.1 / o.
<I> Example 7: </I> The procedure is as in Example 6, except that the aqueous solution is given a zinc concentration of 0.004%. This gives crystals with a zinc content of about 1.7%.
<I> Example 8: </I> The procedure is as in Example 6, except that the aqueous solution is given a zinc concentration of 0.016%. This gives crystals with a zinc content of about 2.5%.
<I> Example 9: </I> The procedure is as in Example 6, except that the aqueous solution is given a zinc concentration of about 0.03%. The separated crystals will then contain about 2.7% zinc.
Example <I> 10: </I> We suspend <B> 17-1 </B> milligrams of crystallized insulin, with a zinc content of approximately 0, -1- o / o, in 100 milliliters an aqueous solution which contains 0.016% zinc (as chloride) and boric acid (to make the solution 1/12 molar)
and the fold of which has been brought to about 7. After reaction, the crystals are separated and washed with water. They contain around 2.5% zinc.
In the examples given above, insulin crystals prepared previously and having the usual zinc content are used as starting material. However, the method according to the invention can also be applied in connection with the. preparation of insulin crystals from amorphous insulin or by recrystallization of crystallized insulin.
In this case, the crystallization of the insulin is caused in an aqueous medium and the necessary zinc is then introduced into this medium or the pH of the medium, already containing it, is modified. the desired amount of zinc, so as to. obtain insulin crystals with a zinc content greater than 0.8%.
Crystallization can be carried out, as known per se, by crystallizing an acidic aqueous solution of insulin, containing one or more buffers, a solvent. organi that promoting crystallization and a zinc salt, modifying the pH of the solution to a value between 5.5 and 6.5.
When choosing the tampon, care must be taken as to what has been said. above concerning the influence of certain anions on the ability of crystals to react with zinc after crystallization. When we help ourselves. as the aqueous medium for suspending the mother liquor of the insulin crystals, it is therefore not indicated that the latter contains a phosphate or citrate buffer.
<I> Example 11: </I> 200 milligrams of amorphous insulin (20 international units per milli gram) are dissolved in 100 milliliters of a hydrochloric acid solution containing. 0.001% zinc (as chloride), sodium acetate (to make solution 1, the molar) and diethylbarbituric acid (to make solution 1;
12o molar), then the fold of the solution is bridged to 5.6-5.8 with NaO11. If left to stand, with agitation if desired, the insulin crystallizes.
When crystallization is complete, 0.01% zinc (as chloride) is added and the hjl is raised to about 7 with NaOlI. After the reaction between the insulin crystals and. zinc ions, the crystals are separated by vacuum filtering and washed with water. They have a zinc content of about 2,010.
Example 1; 3: 2.0 g of amorphous insulin (20 international units per milligram), without hydrochloric acid, are dissolved in one liter of a solution containing 5% acetone, 0,
001% zinc (as chloride), sodium acetate (to make the solution 1 / 12o molar) and.
diethybarbituric acid (to make the solution leo nuolar), and the µl of the solution is raised to about 5.8 with NaOH, thereby causing the insulin to crystallize. When crystallization is complete, 200 milligrams of zinc (as chloride) are added and. the pll of the solution is raised to. about 7 per NaOH. After the reaction between the insulin crystals and. zinc ions, the crystals are then separated and washed with. the water.
They have a zinc content of about 2.5%.
<I> Example 13: </I> 1.7 g of insulin crystals are dissolved by means of hydrochloric acid in one liter of a solution containing sodium acetate (to make the solution. 1.120 Mo lar), diethylbarbituric acid (to make the solution 1; 12 "molar), and the fold of the solution is brought to .5.5 -.;, 7 with NaOH. After standing, with agitation if desired, the insulin crystallizes.
When crystallization is complete, 100 milligrams of zinc (as chloride) are added and the fold is raised to about 7 with NaOH. After shaking the. suspension of crystals, to allow them to react with zinc, they are separated and washed with water.
They have a zinc content of around 2%. <I> Example </I> 1.1: 174 milligrams of crystallized insulin are dissolved in 20 milliliters of 0.01 n hydrochloric acid and added in the order indicated: 10 milliliters of sodium acetate solution i / 12 molar.
70 milliliters of a solution containing 0.004% zinc (as chloride) and the pH is lowered to approximately 5. When, having. When standing, the precipitated insulin has become crystalline, the pH of the crystal suspension is brought to about 7 and, after reaction, the crystals are filtered off with vacuum and washed with water. They have a zinc content of about 1.4%.