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PROCEDE DE PRODUCTION DE PREPARATIONS D'INSULINE A ACTION PROLONGEE.
La présente invention est'relative à un procédé de production de préparations d'insuline à action prolongée ou "insuline retard".
L'effet "retard" du dépôt ordinaire servant aux préparations d'insuline est dû à la présence ou à la formation d'insuline solide peu so- luble au pH sanguine L'insolubilisation de l'insuline est obtenue au moyen de substances étrangères à réaction basique, telles que-la protamine, glo- bine et surfène, lesquelles forment des composés peu solubles avec l'insu- line en milieu neutre.
Pour la formation du dépôt en vue de.l'obtention de préparations d'insuline, on estimait donc jusqu'ici nécessaire d'utiliser des procédés nécessitant l'intermédiaire et l'emploi de substances spéciales auxiliaires.
Suivant la présente invention, on a constaté qu'il était possible d'abandon- ner complètement ces principes- et de ne plus devoir utiliser de substances auxiliaires lesquelles compliquent la formation et l'utilisation clinique des préparations d'insuline.
Par conséquent, d'après la présente invention, il a été trouvé qu'il est possible d'obtenir des préparations d'insuline 'tretard" en uti- lisant de l'insuline pure à l'état cristallin- afin de former une suspension de cristaux d'insuline,laquelle- présente par litre une concentration en certains métaux, tels que le zinc, cobalt, nickel, cadmium, cuivre, manga- nèse ou fer, qui favorise la cristallisation de l'insuline, à plus-de 5 x A x 10-3 milliéquivalents, dans laquelle "A" indique le nombre d'unités in- ternationales d'insuline par millilitre de suspension.
Il est connu que Fisher et Scott (cfr. Journal of Pharmacology, 58, 93 - 104 (1936), après des recherches scientifiques sur'l'importance de la présence de zinc dans des préparations de protamine-insuline, ont pu
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obtenir une suspension de cristaux d'insuline dans de l'eau distillée, mais ont constaté que l'effet de l'injection sous-cutanée au lapin de la suspen- sion des cristaux d'insuline obtenue, ne présentait pas de différences ap- préciables avec l'effet de l'insuline dissoute.
Ceci résulte probablement du fait que les cristaux d'insuline ordinaire se dissolvent comparativement aisément à la valeur de pH 7,2 exis- tant dans le sang et dans les liquides tissulaires.
Par conséquent, si des cristaux d'insuline ordinaires sont mis en suspension dans l'eau distillée et la suspension est alors ajustée à pH = 7 par exemple à l'aide de soude caustique, les cristaux se dissolvent tota- lement ou pour la plus grande part. Par conséquent, les suspensions de cris- taux d'insuline dans l'eau distillée n'ont pas trouvé d'utilisation clinique.
Les essais biologiques et cliniques effectués par les inventeurs ont prouvé actuellement qu'il est possible d'obtenir, en utilisant les sus- pensions de cristaux d'insuline préparées d'après l'invention dans des injec- tions sous-cutanées ou intramusculaires, un degré d'effet "retard" équiva- lent, et même beaucoup plus grand que le degré de "retard" des préparations d'insuline connues jusqu'ici..
L'exemple suivant illustrera ce qui précède : une solution de cristaux d'insuline à la concentration de 40 unités internationales par millilitre,' à laquelle il a été ajouté 4 milligrammes de chlorure de zinc par 100 millilitres, ne possède pas d'effet "retard" appréciable.
D'autre part, la même solution aura un effet "retard" considé- rable, excédant 24 heures, après que son pH a été ajusté à la valeur de 5 et qu'elle a pu reposer, de manière à provoquer une cristallisation du dé- pôt d'insuline et la formation d'une suspension de ae corps.
La cause de l'effet "retard" présenté par les préparations éta- blies d'après l'invention n'a pas été déterminée avec certitude, mais peut être attribuée au fait que l'insuline s'y trouve à l'état cristallin et que les cristaux existant.dans la suspension mentionnée sont peu solubles au pH sanguin.
Ainsi, si des cristaux d'insuline connus sont mis en suspension par exemple à la concentration de 40 unités internationales par millilitre, dans une solution de chlorure de zinc ajusté à une valeur de pH d'environ 7 et contenant par exemple 0,008 % de zinc, de l'insuline dissoute ne sera pas décelable dans le milieu en- suspension.
Si le milieu dans lequel se fait la suspension est préparé sui- vant l'invention et présente une valeur de pH d'environ 7 ou est ajusté à cette valeur, on peut faire la constatation étonnante que les-cristaux sé- parés d'insuline obtenus présentent à l'analyse une concentration accrue de métal par rapport à la concentration initiale-(environ 0,4 % pour-le zinc).
L'effet "retard" constaté pour les préparations faites suivant l'invention peut par conséquent être attribué également à la présence ou for- mation de cristaux d'insuline à concentration métallique accrue. Par consé- quent l'effet "retard" recherché peut être- obtenu par suspension- de cristaux d'insuline- à concentration métallique accrue dans un milieu ne contenant pas- lui-même le métal dont les cristaux présentent une- concentration accrue.
Afin d'obtenir l'effet "retard" recherché, il suffit que le mi- lieu dans lequel se fait la suspension présente ces conditions à la valeur du pH existant dans le sang et les liquides tissulaires et que- les cristaux montrent une concentration métallique accrue.
En concordance avec ces conditions, le procédé de la présente invention présente comme caractéristiques supplémentaires que-la composition du milieu de suspension est telle que les cristaux d'insuline en suspension- montrent une teneur accrue du métal en question, pourvu que le milieu en suspension ait une valeur de pH d'environ 7 ou est amené à cette valeur.
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En utilisant les cristaux d'insuline connus contenant environ 0,4 % de zinc ou une quantité correspondante d'un autre métal, le milieu de suspension doit présenter une concentration des métaux considérés, telle que les cristaux d'insuline en suspension possèdent, lorsque ce milieu se trouve à un pH 7, une concentration métallique excédant approximativement 0,10 milliéquivalent par gramme de cristaux.
Cependant, afin d'obtenir un effet "retard" prononcé pour des préparations faites d'après l'invention, il a été trouvé intéressant de pré- parer les cristaux avec- une concentration métallique dépassant environ 0,20 milliéquivalent par gramme de cristaux, c'est-à-dire environ 0,65 % de zinc, lorsque ce métal est utilisé, en supposant que l'insuline est amenée à l'é- tat cristallin au moyen de zinc.
Lorsque les cristaux présentent par exemple une teneur en zinc de 1 %, la préparation obtenue présente un effet "retard" qui n'est pas in- férieur à celui des préparations de protamine-zinc-insuline connues. Il sera possible d'obtenir un effet "retard" plus prononcé avec une concentration accrue en zinc.
Pour ce qui concerne la concentration métallique nécessaire dans le milieu de suspension aqueux, il y a lieu-de noter en premier lieu que, pour obtenir des cristaux d'insuline à concentration métallique prédétermi- née et accrue,il est nécessaire d'utiliser un milieu à suspension ayant é- galement une concentration plus forte en métal et en insuline.
Si la concen- tration en insuline du milieu de suspension est portée à 40 unités interna- tionales par millilitre, des cristaux d'insuline à concentration zincique d'environ 2,3 % seront donc.obtenus lorsque le pH du milieu sera ajusté à 7 au moyen d'hydroxyde alcalin et que sa concentration en zinc sera de 0,008 %, tandis que des cristaux à environ 2,6 % de zinc seront formés lorsque' le mi- lieu contiendra 10 unités internationales d'insuline par millilitre et des cristaux d'insuline à 1,8 % de zinc se formeront avec une concentration de 80 unités internationales d'insuline par millilitre, le toutà condition que les cristaux aient contenu-,environ 0,4 % de zinc préalablement à la sus- pension.
Avec une concentration prédéterminée de cristaux d'insuline par unité de volume de milieu de la suspension, une augmentation de concentra- tion de métal dans ce milieu provoquera une augmentation de la concentration métallique des cristaux obtenus.
Lorsque le milieu de suspension se trouve ou est ajusté à un pH d'environ 7 dans des conditions normales, il se combinera à raison de 7 % pour ce qui concerne le zinc, ce qui correspond au nombre de groupes acides dans la molécule d'insuline. Des conditions similaires sont applicables à d'autres métaux.
Pourvu que le milieu à suspension ne contienne pas de substance ayant une plus grande affinité pour les métaux cités que les cristaux d'in- suline et que ceux-ci aient une concentration métallique normale, le milieu devrait contenir au moins l'un des métaux cités en une concentration par litre d'au moins 5 x A x 10-3 milliéquivalent, "A" indiquant le nombre d'u- nités internationales d'insuline ajoutées par millilitre de milieu.
A l'aide de la concentration d'insuline de 40 unités interna- tionales par millilitre, qui est la plus fréquemment utilisée en pratique, d'un milieu à suspension à teneur en zinc d'environ 0,002 % et de cristaux d'insuline à environ 0,4 % de zinc, on obtiendra des cristaux d'insuline en suspension à 1,1% de zinc à un pH de 7.
Pour un milieu à suspension à 0,004 % de zinc, on obtiendra des cristaux à 1,7 % de zinc, tandis que. dans un milieu à 0,008 % de- zinc, les cristaux d'insuline obtenus contiendront 2,2 % de zinc.
Si les cristaux d'insuline en suspension doivent être saturés de zinc, c'est-à-dire en contenir environ 2,7 %, le milieu à suspension devra contenir beaucoup plus de zinc, c'est-à-dire environ 0,3% pour une
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concentration en insuline de 40 unités internationales par millilitre, les conditions dont question ci-dessus étant maintenues.
Le pH du milieu à suspension est l'un des facteurs ayant une in- fluence décisive sur la solubilité des cristaux d'insuline dans ce milieu ainsi que sur la concentration métallique accrue des cristaux obtenus.
A condition que le milieu ne contienne pas de substances ayant la propriété spécifique de supprimer la solubilité des cristaux, il n'est pas possible, dans les préparations destinées à l'usage pratique, d'empê- cher que tous les cristaux d'insuline se dissolvent lorsqu'ils sont mis en suspension dans un milieu ayant une valeur de pH supérieure à 9.
De plus, au-dessus de cette valeur de pH, il est difficile de faire des préparations ayant une conservation suffisante. Il n'est égale- ment pas possible dans des conditions normales d'éviter que les cristaux se dissolvent lorsque le pH du milieu à suspension est inférieur à 3 - 4.
Par conséquent, si le milieu à suspension ne contient pas de substances ayant la propriété spécifique de réduire la solubilité de l'insuline, il est nécessaire de maintenir la valeur du pH du milieu dans les limites renseignées.
Il résulte de ce qui a été établi ci-dessus, que le milieu à suspension ne contient des cristaux d'insuline à concentration métallique accrue lorsque son pH est d'environ 7,que pour autant que ce milieu ne contienne pas de substances ayant une plus grande affinité pour les métaux utilisés que les cristaux d'insuline. La concentration métallique accrue diminue avec l'abaissement de la valeur du pH et ne peut être obtenue dans des conditions normales à un pH de 4-5 ou moins.
Pour obtenir l'effet "retard" désiré il n'est pas nécessaire que la suspension préparée in vitro contienne des cristaux d'insuline à concentration métallique accrue. Il suffit que cette concentration métal- lique accrue soit obtenue dans la suspension en amenant la valeur de son pH à 7. Ceci est probablement dû au fait que la modification de la valeur du pH à environ 7 se produit lors de l'injection d'une telle suspension, par laquelle les cristaux d'insuline à concentration métallique accrue se forment in vivo.
Il résulte donc de tests cliniques que deux suspensions de com- position autrement identique dont l'une est ajustée à un pH 4,5 et l'autre à un pH 7, produisent le même effet "retard". L'analyse de la concentration métallique des cristaux d'insuline en suspension dans les deux milieux mon- tre que la concentration métallique des cristaux se- trouvant dans le milieu à pH 4,5 est restée la même, tandis que ceux du milieu à, pH 7 ont une con- centration métallique accrue.
Par conséquent, une caractéristique supplémentaire de la pré- sente invention réside dans le fait que le milieu à suspension aqueux pré- sente une réaction acide ou est amené à une telle réaction.
L'ajustement du milieu à suspension à la valeur du pH désiré peut être effectué d'après l'invention à l'aide d'une substance tampon ou d'un mélange de substances tampon. Des exemples de cette opération sont donnés plus loin.
Il y a,lieu de tenir compte d'un autre fait lors du choix de la substance tampon ou du mélange tampon. Il a été constaté que la pré- sence de certains anions dans le milieu à suspension influence'l'effet' "retard" des préparations d'insuline, probablement par suite de l'influen- ce de ces anions sur la solubilité des cristaux d'insuline dans le milieu, ainsi que sur la propriété de ces cristaux d'absorber du métal contenu, dans le milieu à suspension ou de maintenir la concentration accrue de ce métal.
Donc si à titre d'exemple, des cristaux ordinaires d'insuline sont mis en suspension dans une solution aqueuse contenant 0,008 % de chlorure de zinc, du phosphate de sodium 1/120 molaire et porté à un pH 5, et si le milieu à suspension est alors ajusté à un pH 7, on constate que les cristaux se
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dissolvent entièrement ou partiellement sans se combiner au zinc. Il en est de même si le tampon au phosphate est remplacé par un tampon au citrate. Ce- pendant si on utilise du nickel au lieu de zinc avec un tampon au phosphate, les cristaux ne seront pas dissous en portant le pH à 7 et absorberont du nickel du milieu à suspension.
Il est à supposer que les ions phosphate ont une plus grande af- finité pour le zinc que pour les cristaux d'insuline et se combinent donc avec le zinc en milieu neutre, alors que ces ions phosphate ne peuvent se combiner aux ions nickel de telle manière qu'ils ne sont pas disponibles pour les cristaux d'insuline.
De ce fait, lorsqu'on désire obtenir un effet "retard" le plus' grand possible et qu'on utilise une substance tampon pour ajuster la valeur du pH du milieu à suspension,.-il faudra que l'anion de celle-ci ne se combi- ne pas au.métal employé en milieu neutre.
D'autre part, il peut être utile d'avoir une certaine solubili- té des cristaux d'insuline, étant donné qu'il est possible d'obtenir des préparations d'insuline donnant partiellement un effet "initial" d'insuline et partiellement un effet "retard".
Il est possible de donner au milieu à suspension une composition et une acidité telles que celui-ci contienne ou contiendra de l'insuline à l'état dissous ou amorphe et précipité.
-La présence d'insuline dissoute ou d'insuline amorphe précipitée peut être obtenue soit en ajoutant d'avance- ou en faisant dissoudr.e une par- tie des cristaux d'insuline qui sera-précipitée ensuite à l'état amorphe.
D'accord avec ces observations, une caractéristique importante de l'invention permet d'employer un milieu à suspension contenant d'avance- de l'insuline dissoute ou précipitée à l'état amorphe ou dans lequel ces corps peuvent être formés à partir des cristaux d'insuline ajoutés.
L'effet "initial" d'insuline peut ainsi être obtenu en ajoutant des anions, lesquels favorisent la¯ solubilité des cristaux d'insuline dans le milieu à suspension à pH neutre.
En faisant varier la concentration du zinc ou de métaux similai- res dans le milieu à suspension, son pH, sa concentration en anions et sa teneur en insuline dissoute ou précipitée, il est possible- d'après l'inven- tion de fabriquer des préparations d'insuline ayant à la fois un effet "re- tard" d'une durée prédéterminée et un effet d'insuline dissoute à un degré également prédéterminé.
La présente invention est basée en outre sur l'observation que l'effet "retard" des suspensions de cristaux d'insuline dépend de la dimen- sion des cristaux.
Des essais biologiques faits en concordance avec l'invention sur des chiens privés de pancréas ont montré que des cristaux d'insuline me- surant environ 10# dans une suspension contenant du zinc, ont,dans des con- ditions comparables le même effet "retard" que ceux de protamine-zinc-insu- line, tandis que-les cristaux d'insuline ayant une dimension de 25-100- présentent toujours un effet "retard" plus intense.
On pourra donc tenir compte de cette propriété en utilisant des cristaux d'insuline d'une dimension définie. La dimension désirée peut être obtenue en réglant les conditions de cristallisation et/ou en broyant ou concassant les cristaux obtenus.
Les cristaux d'insuline obtenus par une méthode de cristallisa- tion quelconque peuvent être utilisés dans la fabrication des nouvelles pré- parations d'insuline.
Cependant la méthode dite au citrate est préférable, (cfr. par exemple le brevet danois n 70270). Une autre méthode intéressante a été établie par Scott, (cfr. Biochemical J. 28, 1592 1934} ainsi que d'autres
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plus récentes dérivées de celle-ci.
Le milieu à suspension contenant l'un des métaux cités peut être ' obtenu en dissolvant simplement un sel de ce métal dans l'eau distillée. Pour des raisons cliniques, il est cependant plus avantageux d'utiliser un milieu isotonique qui peut être obtenu à l'aide d'une solution aqueuse de glucose, de chlorure de sodium ou de glycérine.
Ces substances ne-sont données qu'à titre d'exemples, d'autres sont citées dans la littérature relative-à ce sujet.
Pour la conservation des préparations d'insuline, il est avanta- geux d'ajouter l'un ou l'autre agent conservateur utilisés pour les liquides à injections par exemple le phénol et ses dérivés, le p-hydroxybenzoate de méthyle (nipagine), le p-hydrobenzoate de propyle- (nipasol) et l'acétate phényl-mercurique.
Différents exemples de milieux aqueux à suspension utilisables pour l'obtention de préparations d'insuline conformes à l'invention et contenant des métaux cités sont décrits ci-dessous.
EXEMPLE 1 -
On mélange un milieu à suspension constitué par une solution iso- tonique d'un corps conservateur et une autre solution d'un des métaux cités précédemment, de manière à obtenir la composition suivante :
0,9 % de chlorure de sodium 0,1 % de nipagine 0,004 % de zinc (chlorure)
En ajustant ce milieu à suspension à une valeur de pH intermé- diaire à 6 et 7, les cristaux ordinaires d'insuline s'y dissolvent beaucoup plus difficilement que dans l'eau pure et, en y "suspendant" les cristaux, il y a formation de cristaux à teneur accrue en zinc.
Si les cristaux contiennent environ 0,4 % de zinc avant d'être mis en suspension, et si on en ajoute au milieu à suspension de manière que celui-ci contienne 40 U.I./ml. les cristaux formés contiendront environ 1,7% de zinc.
En utilisant des cristaux d'insuline sensiblement plus grands que 10# il est avantageux d'ajouter un stabilisant au milieu, lequel aug- . mente la viscosité du milieu servant à la suspension de telle sorte que les cristaux restent en suspension un certain temps après avoir agité l'ampoule.
Comme stabilisateur de suspension on peut utiliser un polysaccha- ride macromoléculaire, mais la présente invention n'est pas limitée à cette utilisation. D'autres stabilisateurs peuvent être utilisés à condition d'ê- tre. inertes, dans les circonstances données, vis-à-vis des cristaux d'insu- line et des autres constituants du milieu à suspension.
EXEMPLE 2 -
On forme un milieu à suspension en mélangeant une solution aqueu- se isotonique, un agent conservateur, un des métaux mentionnés ci-dessus et un stabilisateur de suspension de manière à obtenir la. composition suivante : 0,9% chlorure sodique
0,2% tricrésol 0,005% nickel (chlorure)
5% dextranum dépolymerisatum
Le pH est ajusté entre 6 et 7 à l'aide de soude caustique.
Si les cristaux d'insuline ne contenant pas de nickel y sont mis en suspension en quantité telle que le milieu de suspension contienne 40 U.I./ml,
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les cristaux en suspension contiendront du nickel.
Il a été indiqué au préalable que le milieu à suspension devra contenir une substance-tampon ou un mélange de substances-tampon tant pour régler et maintenir la valeur du pH du milieu que pour régulariser l'effet initial de la préparation in vivo. A titre d'exemples de substances-tampon utilisables, il faut citer le tampon acétique, au borate, au citrate, au barbiturate diéthylique, au phosphate, au malate et leurs mélanges. Parmi les tampons cités, ceux au phosphate et au citrate sont les plus intéressants pour la régularisation de l'effet "initial" des préparations.
EXEMPLE 3 -
Un mélange d'une solution aqueuse isotonique, d'un agent conser- vateur, d'un des métaux cités et d'une substance tampon pour stabiliser le pH du milieu aura la- composition sttivante
0,8% de chlorure de sodium
0,1% nipagine 0,008% zinc (chlorure)
Acétate sodique 1/120 molaire
Le pH est ajusté approximativement à 4,5 à l'aide de HCL.
Les cristaux ordinaires d'insuline sont aussi peu solubles dans ce milieu de suspension que dans celui décrit dans l'exemple 1. En y mettant en suspension des cristaux d'insuline contenant environ 0,4% de zinc en quan- tité telle qu'il contienne 40 U.I./ml et si le pH de la suspension est porté à 7 à l'aide de NaOh, les cristaux obtenus contiendront environ 2,2% de zinc.
EXEMPLE 4 -
Le milieu à suspension aqueux ayant la même acidité que le liqui- de tissulaire humain et étant isotonique avec le sang, aura la composition suivante :
1,3 volume % glycérine
0,1% nipagine
0,002% zinc (chlorure)
Acide diéthylbarbiturique 1/120 molaire.
Le pH est ajusté approximativement à 7,2 par NaOH.
Ce milieu dissout moins de 2 unités internationales d'insuline par ml. Si les cristaux d'insuline mis ensuspension contiennent environ 0,4% de zinc de manière que le milieu contienne 40 U.I./ml, les cristaux résul- tants contiendront environ 1,1% de zinc.
EXEMPLE 5 -
Le milieu aqueux à suspension à réaction faiblement alcaline au- ra la composition suivante
1,3 volume % glycérine
0,1% nipagine 0,016 % zinc (chlorure)
Acide borique 1/120 molaire.
Le pH est ajusté approximativement à 8 par NaOH.
Ce mmlieu à suspension dissout également moins de 2 U.I./ml d'in- suline. En plaçant en suspension dans ce milieu des cristaux d'insuline con- tenant environ 0,4% de zinc en quantité telle qu'un ml contienne 40 U.I./ml et en ajustant le pH à 7, avec HCl par exemple, les cristaux, d'insuline con- tiendront environ 2,5 % de zinc.
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EXEMPLE 6 -
Le milieu aqueux à suspension contiendra :
0,8% de chlorure de sodium
0,1% nipagine
0,001% zinc (chlorure)
Acétate sodique 1/120 molaire. et le pH est ajusté à 5 par HCl.
Si des cristaux d'insuline contenant environ 0,4 % de zinc sont introduits dans ce milieu en proportion telle que celui-ci contiénne 40 U.I./ml, les cristaux en suspension contiendront environ 0,8% de zinc, pour autant que le pH aura été ajusté à 7 avec NaOH.
EXEMPLE 7 -
On prépare une solution aqueuse contenant :
0,8% chlorure de sodium
0,1% nipagine
0,008% nickel (chlorure)
Phosphate sodique 1/120 molaire et on ajuste cette solution à pH 7 avec HCl.
Si on introduit dans cette solution des cristaux d'insuline con- tenant environ 0,3% de nickel en quantité telle qu'elle contient 40 U.I./ml, les cristaux d'insuline en suspension obtenus présentent une concentration en nickel accrue.
EXEMPLE 8 -
On prépare une solution aqueuse contenant :
1,3 vol. % glycérine-
0,2 % tricrésol 0,014 % cadmium (chlorure)
Acétate sodique 1/120 molaire. et on ajuste la solution à pH 5 avec HCl.
Lorsqu'on place des cristaux d'insuline contenant environ 0,4 % de zinc dans ce milieu de manière à obtenir une suspension à 40 U.I./ml, les cristaux obtenus contiendront environ 3% de cadmium, pour autant que le pH de la suspenion soit amené à 7 avec NaOH.
EXEMPLE 9 -
On prépare une solution aqueuse contenant :
0,8% de chlorure de sodium
0,1% nipagine 0,006% de cuivre (chlorure)
Acétate sodique : 1/120 molaire et on ajuste la solution à pH 6 avec HCl.
Lorsqu'on introduit des cristaux d'insuline d'une teneur en zinc d'environ 0,4 % dans ce milieu de manière-à obtenir une concentration de 40 U.I./ml, l'insuline en suspension contiendra du cuivre.
Les milieux à suspension pour cristaux d'insuline décrits dans les exemples mentionnés ont une composition telle que les cristaux y sont
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pratiquement insolubles. Ces préparations d'insuline obtenues se distinguent surtout par leur effet "retard". D'autre part, des préparations ayant par- tiellement un effet "retard" et partiellement un effet d'insuline "initial" peuvent également être fabriquées.
EXEMPLE 10 -
On prépare une solution contenant :
1,3 vol. % de glycérine
0,1 % nipagine 0,008% de chlorure de zinc
Acétate sodique 1/120 molaire et on ajuste le pH à 4 par HCl.
Lorsque des cristaux d'insuline contenant environ 0,4% de zinc sont mis en suspension en proportion de 40 U.I./ml, 1/3 des cristaux d'in- suline se dissolveront au point que le milieu à suspension contiendra 12- 14 U.I. d'insuline dissoute/ml. Lors d'injections sous-cutanées ou intramus- culaires de la suspension résiduaire, on obtient un effet "initial" dû à l'insuline dissoute et ensuite un effet "retard" résultant des cristaux d'insuline restés en suspension.
EXEMPLE 11 -
Dans une solution chlorhydrique contenant :
1,3 vol. % de glycérine
0,1% nipagine 0,008 % de chlorure de zinc de l'acide diéthylbarbiturique 1/120 molaire
0,087 % d'insuline (23 U.I. par milligramme) dissous dans HCl, on ajuste le pH à ¯ 7 avec NaOH, ce qui précipite quantitativement l'insuli- ne à l'étatamorphe (20 U.I./ml). En mettant des cristaux d'insuline en sus- pension dans ce milieu, celui-ci donnera un effet "initial" et "retard" par injection sous-cutanée ou intramusculaire de la suspension.
Dans les exemples ci-dessus, les métaux sont ajoutés sous forme de leurs chlorures. Ceux-ci peuvent être utilisés sous d'autres formes inor- ganiques ou organiques telles que sulfate, nitrate, acétate, citrate, hydro- xyde, oxyde ou complexes métalliques, ou le métal lui-même, à condition que le métal ou le composé métallique employé soit présent dans des conditions permettant son absorption par les cristaux d'insuline.
En outre, il est à noter que la modification du pH après suspen- sion des cristaux d'insuline dans le milieu dont il est question dans diffé- rents exemples doit uniquement être considérée comme auxiliaire analytique.
Les milieux à suspension peuvent être utilisés à la valeur de pH à laquelle ils ont été ajustés lorsqu'ils sont préparés.
Dans les exemples précédents, les cristaux d'insuline sont pré- parés séparément par cristallisation aseptique, et les cristaux sont ensuite ajoutés à un milieu aqueux à suspension stérile en utilisant les conditions d'aseptie nécessaires.-
D'après l'invention, il est ainsi possible de faire cristalliser l'insuline dans le milieu à suspension préparé comme- il est décrit dans les exemples ci-dessous.
EXEMPLE 12 -
174 milligrammes d'insuline pure sont dissous dans 20 millili- tres de HCl O,Oln, on ajoute ensuite dans-l'ordre indiqué :
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20 ml d'une solution à 4% de chlorure de sodium
10 ml d'une solution d'acétate de soude 1/12 molaire
50 ml d'une solution contenant 0,004% de zinc et
0,2% nipagine
La valeur du pH est ensuite ramenée à 5 à l'aide de HCl et la suspension est ensuite versée dans une ampoule. Après un repos déterminé, l'insuline précipitée passe à l'état cristallin..
D'après l'invention, l'eau-mère de la cristallisation d'insu- line peut être utilisée comme milieu à suspension en y ajoutant les sub- stances nécessaires, telles que isotoniques, le zinc ou les métaux similai- res, stabilisateurs de suspensions et les correcteurs de pH.
EXEMPLE 13 -
174 milligrammes d'insuline cristalline sont dissous dans 20 ml de HCl 0,01n, on ajoute ensuite 20 ml d'une solution de chlorure de sodium et 10 ml d'une solution d'acétate.de sodium 1/12 molaire.
Le pH du mélange est ensuite ramené à 5,5.
Lorsque la cristallisation est terminée, on ajoute 50 millili- tres d'une solution contenant 0,016% de zinc et 0,2% de nipagine. Le pH de la suspension obtenue est à ajuster si c'est nécessaire. Gomme il résulte de ce qui a été énoncé précédemment, conformément à l'invention, le métal peut être ajouté avant aussi bien qu'après avoir formé la suspension des cristaux d'insuline dans le milieu. Il est donc possible de commencer par mettre des cristaux d'insuline aseptiques en suspension dans un milieu a- queux et d'y ajouter ensuite le métal choisi.
EXEMPLE 14 -
174 milligrammes de cristaux d'insuline sont mis en suspension dans 50 ml d'un milieu aqueux à suspension contenant : 1,6 % de chlorure de sodium 0,2 % de nipagine et de l'acétate de sodium 1/60 molaire et on amène à un pH de valeur 5,5 par addition de HCl.
A cette suspension on ajoute 50 ml d'une solution de zinc de même acidité et contenant 0,016 % de zinc. Une solution zincique d'une autre acidité que le milieu à suspension peut être utilisée, mais dans ce cas l'ajustement de la valeur du pH de la suspension finale doit être effectué si c'est nécessaire. En portant la valeur du pH du milieu à sus- pension à 7, les cristaux d'insuline de la suspension contiendront envi- ron 2,2 % de zinc à condition que la concentration initiale des cristaux ait été de 0,4 % de zinc.
Pareillement, la concentration en métal de la suspension peut être préparée complètement ou partiellement en utilisant des-cristaux ayant une concentration métallique accrue.
EXEMPLE 15 -
On prépare une solution contenant :
1,3 vol. % de glycérine 0,1 % de nipagine de l'acétate de sodium 1/120 molaire et dont la valeur du pH est ajustée à 5 par HCl.
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En ajoutant 1,7 gramme de cristaux d'insuline contenant environ 2 % de zinc à 1 litre de cette suspension, les cristaux restent insolubles; mais une partie du zinc passe en solution dans le milieu à suspension ; celui- ci contient alors du zinc.
Dans l'exemple ci-dessus, le'métal en question est ajouté au milieu à suspension par l'intermédiaire des cristaux pendant la mise en sus- pension. Ceci peut s'obtenir également en mettant en suspension des cris- taux à concentration métallique normale, tout en ajoutant simultanément le métal en question.
Les exemples cités ci-dessus l'ont été uniquement afin d'illus- trer des applications de l'invention, dont les caractéristiques principales consistent dans les possibilités de la mise en suspension des cristaux d'in- suline, lesquels ont une concentration métallique plus forte que celle des particules d'insuline avant la mise en suspension.
La portée de l'invention comporte donc ainsi la mise en suspen- sion de cristaux d'insuline à concentration accrue en l'un des métaux men- tionnés dans un milieu utilisable en injection-et ne montre pas des concen- trations des métaux après que les cristaux y ont été mis en suspension. A titre d'exemple, de tels milieux, on peut citer l'eau distillée et des hui- les végétales, telles que celle d'olives, de sésame et d'arachide.
Il y a enfin lieu de noter que les préparations d'insuline obte- nues d'après l'invention peuvent être mises sur le marché en deux ampoules dont l'une contient le milieu à suspension et l'autre les cristaux d'insu- line auxquels si'on le désire on a pu donner.une concentration métallique accrue.
REVENDICATIONS.
1/ Procédé de production de préparations d'insuline à action pro- longée ou effet 'retard", caractérisé par la production d'une suspension de cristaux d'insuline présentant par litre une concentration en certains mé- taux comme le zinc, le cobalt, le nickel, le cadmium, le cuivre, le manga- nèse ou le fer telle qu'elle favorise la cristallisation de l'insuline, cet- te concentration étant supérieure à 5 x A x 10-3 milliéquivalents, où "A" représente le nombre d'unités internationales d'insuline par millilitre de la suspension.
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PROCESS FOR THE PRODUCTION OF LONG-ACTION INSULIN PREPARATIONS.
The present invention relates to a process for producing long-acting insulin preparations or "depot insulin".
The "retarding" effect of the ordinary depot used in insulin preparations is due to the presence or formation of solid insulin which is poorly soluble at blood pH. Insulinization of insulin is obtained by means of substances foreign to the blood. basic reaction, such as protamine, globin and surfene, which form compounds which are poorly soluble with insulin in a neutral medium.
For the formation of the deposit for the production of insulin preparations, therefore, it has hitherto been considered necessary to use methods requiring the intermediary and the use of special auxiliary substances.
In accordance with the present invention, it has been found that it is possible to completely abandon these principles and no longer have to use auxiliary substances which complicate the formation and clinical use of insulin preparations.
Therefore, according to the present invention, it has been found that it is possible to obtain "tretard" insulin preparations by using pure insulin in the crystalline state to form a suspension. of insulin crystals, which - per liter has a concentration of certain metals, such as zinc, cobalt, nickel, cadmium, copper, manganese or iron, which promotes the crystallization of insulin, at more than 5 x A x 10-3 milliequivalents, where "A" indicates the number of international units of insulin per milliliter of suspension.
It is known that Fisher and Scott (cf. Journal of Pharmacology, 58, 93 - 104 (1936), after scientific research on the importance of the presence of zinc in protamine-insulin preparations, were able to
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obtain a suspension of insulin crystals in distilled water, but found that the effect of the subcutaneous injection into the rabbit of the suspension of the insulin crystals obtained, did not show any apparent differences. valuable with the effect of dissolved insulin.
This probably results from the fact that the crystals of ordinary insulin dissolve comparatively easily at the pH value of 7.2 existing in blood and tissue fluids.
Therefore, if ordinary insulin crystals are suspended in distilled water and the suspension is then adjusted to pH = 7, for example using caustic soda, the crystals will dissolve completely or for the most. large part. Therefore, suspensions of insulin crystals in distilled water have not found clinical use.
The biological and clinical tests carried out by the inventors have currently proved that it is possible to obtain, by using the insulin crystal suspensions prepared according to the invention in subcutaneous or intramuscular injections, an equivalent degree of "retardation" effect, and even much greater than the degree of "retardation" of insulin preparations known heretofore.
The following example will illustrate the above: a solution of insulin crystals at a concentration of 40 international units per milliliter, 'to which 4 milligrams of zinc chloride per 100 milliliter has been added, has no effect ". "appreciable delay."
On the other hand, the same solution will have a considerable "retarding" effect, exceeding 24 hours, after its pH has been adjusted to the value of 5 and has been able to stand, so as to cause crystallization of the die. - deposition of insulin and the formation of a suspension of ae body.
The cause of the "depot" effect exhibited by the preparations made according to the invention has not been determined with certainty, but can be attributed to the fact that insulin is present therein crystalline. and that the crystals existing in the said suspension are poorly soluble at blood pH.
Thus, if known insulin crystals are suspended, for example at a concentration of 40 international units per milliliter, in a solution of zinc chloride adjusted to a pH value of about 7 and containing for example 0.008% zinc , dissolved insulin will not be detectable in the suspended medium.
If the medium in which the suspension is made is prepared according to the invention and has a pH value of about 7 or is adjusted to this value, it can be surprisingly found that the separated crystals of insulin obtained show on analysis an increased concentration of metal compared to the initial concentration (approximately 0.4% for zinc).
The "retarding" effect observed for the preparations made according to the invention can therefore also be attributed to the presence or formation of insulin crystals of increased metal concentration. Consequently, the desired "retarding" effect can be obtained by suspending insulin crystals with an increased metal concentration in a medium not itself containing the metal, the crystals of which have an increased concentration.
In order to obtain the desired "retard" effect, it is sufficient that the medium in which the suspension is made has these conditions at the pH value existing in the blood and the tissue fluids and that the crystals show a metallic concentration. increased.
In accordance with these conditions, the process of the present invention exhibits as additional characteristics that - the composition of the suspending medium is such that the suspended insulin crystals - show an increased content of the metal in question, provided that the suspended medium has a pH value of about 7 or is brought to this value.
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Using the known insulin crystals containing about 0.4% zinc or a corresponding amount of another metal, the suspending medium should have a concentration of the metals of interest, such that the suspended insulin crystals have, when this medium is at pH 7, a metal concentration exceeding approximately 0.10 milliequivalents per gram of crystals.
However, in order to obtain a pronounced "retarding" effect for preparations made according to the invention, it has been found advantageous to prepare the crystals with a metal concentration exceeding about 0.20 milliequivalents per gram of crystals. that is, about 0.65% zinc, when this metal is used, assuming that the insulin is brought to the crystalline state by means of zinc.
When the crystals have, for example, a zinc content of 1%, the preparation obtained exhibits a "retarding" effect which is not inferior to that of the known protamine-zinc-insulin preparations. It will be possible to obtain a more pronounced "retard" effect with an increased zinc concentration.
With regard to the necessary metal concentration in the aqueous suspending medium, it should first be noted that in order to obtain insulin crystals of predetermined and increased metal concentration it is necessary to use a. a suspension medium also having a higher concentration of metal and insulin.
If the insulin concentration of the suspension medium is increased to 40 international units per milliliter, insulin crystals with a zinc concentration of about 2.3% will therefore be obtained when the pH of the medium is adjusted to 7. with alkali hydroxide and its zinc concentration will be 0.008%, while crystals of about 2.6% zinc will be formed when the medium contains 10 international units of insulin per milliliter and crystals of zinc. Insulin at 1.8% zinc will form at a concentration of 80 international units of insulin per milliliter, all provided that the crystals have contained approximately 0.4% zinc prior to suspension.
With a predetermined concentration of insulin crystals per unit volume of suspension medium, an increase in metal concentration in this medium will cause an increase in the metal concentration of the resulting crystals.
When the suspending medium is found or adjusted to a pH of about 7 under normal conditions, it will combine at a rate of 7% for zinc, which is the number of acid groups in the molecule of insulin. Similar conditions apply to other metals.
Provided that the suspension medium does not contain any substance having a greater affinity for the metals mentioned than the crystals of insulin and that these have a normal metallic concentration, the medium should contain at least one of the metals. quoted at a concentration per liter of at least 5 x A x 10-3 milliequivalent, "A" indicating the number of international units of insulin added per milliliter of medium.
Using the insulin concentration of 40 international units per milliliter, which is the most frequently used in practice, a suspension medium with a zinc content of about 0.002% and insulin crystals at about 0.4% zinc, insulin crystals in suspension with 1.1% zinc will be obtained at a pH of 7.
For a suspension medium at 0.004% zinc, crystals at 1.7% zinc will be obtained, while. in 0.008% zinc medium, the resulting insulin crystals will contain 2.2% zinc.
If the insulin crystals in suspension are to be saturated with zinc, i.e. contain about 2.7%, the suspension medium should contain much more zinc, i.e. about 0, 3% for one
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insulin concentration of 40 international units per milliliter, the conditions referred to above being maintained.
The pH of the suspension medium is one of the factors having a decisive influence on the solubility of the insulin crystals in this medium as well as on the increased metal concentration of the crystals obtained.
Provided that the medium does not contain substances having the specific property of suppressing the solubility of crystals, it is not possible in preparations intended for practical use to prevent all crystals of insulin. dissolve when suspended in medium with a pH value greater than 9.
In addition, above this pH value, it is difficult to make preparations with sufficient preservation. It is also not possible under normal conditions to prevent crystals from dissolving when the pH of the suspension medium is below 3 - 4.
Consequently, if the suspension medium does not contain substances having the specific property of reducing the solubility of insulin, it is necessary to maintain the pH value of the medium within the given limits.
It follows from what has been established above, that the suspension medium contains crystals of insulin with increased metal concentration when its pH is around 7, only as long as this medium does not contain substances having a greater affinity for the metals used than insulin crystals. The increased metal concentration decreases with lowering of the pH value and cannot be obtained under normal conditions at a pH of 4-5 or less.
To obtain the desired "retard" effect, it is not necessary for the suspension prepared in vitro to contain insulin crystals of increased metal concentration. It suffices that this increased metal concentration is obtained in the suspension by bringing the value of its pH to 7. This is probably due to the fact that the change in the value of the pH to about 7 occurs during the injection of. such a suspension, whereby insulin crystals with increased metal concentration are formed in vivo.
It therefore results from clinical tests that two suspensions of otherwise identical composition, one of which is adjusted to a pH 4.5 and the other to a pH 7, produce the same "retard" effect. Analysis of the metal concentration of the insulin crystals suspended in the two media shows that the metal concentration of the crystals in the medium at pH 4.5 remained the same, while those of the medium at. pH 7 have an increased metallic concentration.
Therefore, a further feature of the present invention is that the aqueous suspension medium exhibits an acidic reaction or is brought to such an acid reaction.
The adjustment of the suspension medium to the desired pH value can be carried out according to the invention with the aid of a buffer substance or a mixture of buffer substances. Examples of this operation are given below.
Another fact should be taken into account when choosing the buffer substance or buffer mixture. It has been found that the presence of certain anions in the suspension medium influences the "depot" effect of insulin preparations, probably as a result of the influence of these anions on the solubility of the crystals of insulin. insulin in the medium, as well as the property of these crystals to absorb the metal contained in the suspension medium or to maintain the increased concentration of this metal.
So if, for example, ordinary insulin crystals are suspended in an aqueous solution containing 0.008% zinc chloride, 1/120 molar sodium phosphate and brought to pH 5, and the medium to suspension is then adjusted to a pH 7, it is observed that the crystals are
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fully or partially dissolve without combining with zinc. It is the same if the phosphate buffer is replaced by a citrate buffer. However, if nickel is used instead of zinc with a phosphate buffer, the crystals will not dissolve by raising the pH to 7 and will absorb nickel from the suspension medium.
It is assumed that the phosphate ions have a greater affinity for zinc than for insulin crystals and therefore combine with zinc in a neutral medium, whereas these phosphate ions cannot combine with nickel ions of such way that they are not available for insulin crystals.
Therefore, when it is desired to obtain the greatest possible "delay" effect and when a buffer substance is used to adjust the pH value of the suspension medium, it will be necessary that the anion thereof does not combine with metal used in a neutral environment.
On the other hand, it may be useful to have a certain solubility of the insulin crystals, since it is possible to obtain insulin preparations partially giving an "initial" effect of insulin and partially a "delay" effect.
It is possible to give the suspension medium a composition and acidity such that it contains or will contain insulin in the dissolved or amorphous and precipitated state.
The presence of dissolved insulin or precipitated amorphous insulin can be obtained either by adding in advance or by dissolving part of the insulin crystals which will then be precipitated in the amorphous state.
In agreement with these observations, an important feature of the invention allows the use of a suspension medium pre-containing insulin dissolved or precipitated in the amorphous state or in which these bodies can be formed from the compounds. insulin crystals added.
The "initial" effect of insulin can thus be obtained by adding anions, which promote the solubility of the insulin crystals in the suspension medium at neutral pH.
By varying the concentration of zinc or similar metals in the suspension medium, its pH, its anion concentration and its content of dissolved or precipitated insulin, it is possible according to the invention to manufacture insulin preparations having both a "delay" effect of a predetermined duration and an effect of dissolved insulin to an equally predetermined degree.
The present invention is further based on the observation that the "delay" effect of insulin crystal suspensions depends on the size of the crystals.
Biological tests carried out in accordance with the invention on dogs deprived of pancreas have shown that insulin crystals measuring about 10% in a suspension containing zinc, have, under comparable conditions, the same "retarding effect". than those of protamine-zinc-insulin, while insulin crystals having a size of 25-100 always show a more intense "retard" effect.
This property can therefore be taken into account by using insulin crystals of a defined size. The desired size can be obtained by adjusting the crystallization conditions and / or by grinding or crushing the crystals obtained.
The insulin crystals obtained by any method of crystallization can be used in the manufacture of the novel insulin preparations.
However, the so-called citrate method is preferable (cf. for example Danish Patent No. 70270). Another interesting method has been established by Scott, (cf. Biochemical J. 28, 1592 1934} as well as others.
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more recent derivatives thereof.
The suspension medium containing one of the mentioned metals can be obtained by simply dissolving a salt of this metal in distilled water. For clinical reasons, however, it is more advantageous to use an isotonic medium which can be obtained using an aqueous solution of glucose, sodium chloride or glycerin.
These substances are given only as examples, others are cited in the literature relating to this subject.
For the preservation of insulin preparations, it is advantageous to add one or the other preservative used for injection fluids, for example phenol and its derivatives, methyl p-hydroxybenzoate (nipagine), propyl- p-hydrobenzoate (nipasol) and phenyl-mercuric acetate.
Various examples of aqueous suspension media which can be used for obtaining insulin preparations in accordance with the invention and containing the metals mentioned are described below.
EXAMPLE 1 -
A suspension medium consisting of an isotonic solution of a preservative substance and another solution of one of the metals mentioned above is mixed, so as to obtain the following composition:
0.9% sodium chloride 0.1% nipagine 0.004% zinc (chloride)
By adjusting this suspension medium to an intermediate pH value of 6 and 7, ordinary insulin crystals dissolve in it much more difficult than in pure water, and by "hanging" the crystals therein, there are a formation of crystals with increased zinc content.
If the crystals contain about 0.4% zinc before being suspended, and if it is added to the suspension medium so that it contains 40 I.U./ml. the crystals formed will contain about 1.7% zinc.
When using insulin crystals significantly larger than 10 # it is advantageous to add a stabilizer to the medium which increases. The viscosity of the medium used for the suspension is calculated so that the crystals remain in suspension for some time after shaking the ampoule.
As the suspension stabilizer, a macromolecular polysaccharide can be used, but the present invention is not limited to this use. Other stabilizers can be used provided they are. inert, under the given circumstances, to insulin crystals and other constituents of the suspension medium.
EXAMPLE 2 -
A suspension medium is formed by mixing an isotonic aqueous solution, a preservative, one of the metals mentioned above and a suspension stabilizer so as to obtain the. following composition: 0.9% sodium chloride
0.2% tricresol 0.005% nickel (chloride)
5% dextranum depolymerisatum
The pH is adjusted between 6 and 7 using caustic soda.
If the insulin crystals which do not contain nickel are suspended therein in an amount such that the suspension medium contains 40 IU / ml,
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suspended crystals will contain nickel.
It has been previously indicated that the suspension medium should contain a buffer substance or a mixture of buffer substances both to adjust and maintain the pH value of the medium and to regulate the initial effect of the preparation in vivo. As examples of buffer substances which can be used, mention should be made of acetic, borate, citrate, diethyl barbiturate, phosphate, malate and mixtures thereof. Among the buffers mentioned, those containing phosphate and citrate are the most useful for regulating the “initial” effect of the preparations.
EXAMPLE 3 -
A mixture of an isotonic aqueous solution, a preservative, one of the metals mentioned and a buffering substance to stabilize the pH of the medium will have the stabilizing composition.
0.8% sodium chloride
0.1% nipagine 0.008% zinc (chloride)
1/120 molar sodium acetate
The pH is adjusted to approximately 4.5 using HCL.
Ordinary insulin crystals are as poorly soluble in this suspending medium as in that described in Example 1. By suspending therein insulin crystals containing about 0.4% zinc in such amount as. it contains 40 IU / ml and if the pH of the suspension is brought to 7 using NaOh, the crystals obtained will contain approximately 2.2% zinc.
EXAMPLE 4 -
The aqueous suspension medium having the same acidity as human tissue fluid and being isotonic with blood will have the following composition:
1.3 volume% glycerin
0.1% nipagine
0.002% zinc (chloride)
1/120 molar diethylbarbituric acid.
The pH is adjusted to approximately 7.2 with NaOH.
This medium dissolves less than 2 international units of insulin per ml. If the suspended insulin crystals contain about 0.4% zinc so that the medium contains 40 I.U./ml, the resulting crystals will contain about 1.1% zinc.
EXAMPLE 5 -
The weakly alkaline reacting aqueous suspension medium will have the following composition:
1.3 volume% glycerin
0.1% nipagine 0.016% zinc (chloride)
Boric acid 1/120 molar.
The pH is adjusted to approximately 8 with NaOH.
This suspension medium also dissolves less than 2 IU / ml of insulin. By placing in suspension in this medium insulin crystals containing about 0.4% zinc in an amount such that one ml contains 40 IU / ml and adjusting the pH to 7, with HCl for example, the crystals, of insulin will contain about 2.5% zinc.
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EXAMPLE 6 -
The aqueous suspension medium will contain:
0.8% sodium chloride
0.1% nipagine
0.001% zinc (chloride)
1/120 molar sodium acetate. and the pH is adjusted to 5 with HCl.
If insulin crystals containing about 0.4% zinc are introduced into this medium in a proportion such that it contains 40 IU / ml, the crystals in suspension will contain about 0.8% zinc, provided that the pH will have been adjusted to 7 with NaOH.
EXAMPLE 7 -
An aqueous solution is prepared containing:
0.8% sodium chloride
0.1% nipagine
0.008% nickel (chloride)
1/120 molar sodium phosphate and this solution is adjusted to pH 7 with HCl.
If insulin crystals containing about 0.3% nickel are introduced into this solution in an amount such that it contains 40 IU / ml, the suspended insulin crystals obtained show an increased nickel concentration.
EXAMPLE 8 -
An aqueous solution is prepared containing:
1.3 vol. % glycerin-
0.2% tricresol 0.014% cadmium (chloride)
1/120 molar sodium acetate. and the solution is adjusted to pH 5 with HCl.
When insulin crystals containing approximately 0.4% zinc are placed in this medium so as to obtain a suspension of 40 IU / ml, the crystals obtained will contain approximately 3% cadmium, provided that the pH of the suspension or brought to 7 with NaOH.
EXAMPLE 9 -
An aqueous solution is prepared containing:
0.8% sodium chloride
0.1% nipagine 0.006% copper (chloride)
Sodium acetate: 1/120 molar and the solution is adjusted to pH 6 with HCl.
When insulin crystals with a zinc content of about 0.4% are introduced into this medium so as to obtain a concentration of 40 IU / ml, the insulin in suspension will contain copper.
The suspension media for insulin crystals described in the examples mentioned have a composition such that the crystals are therein.
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practically insoluble. These insulin preparations obtained are distinguished above all by their "delay" effect. On the other hand, preparations having partly a "depot" effect and partly an "initial" insulin effect can also be manufactured.
EXAMPLE 10 -
A solution is prepared containing:
1.3 vol. % glycerin
0.1% nipagine 0.008% zinc chloride
1/120 molar sodium acetate and the pH is adjusted to 4 with HCl.
When insulin crystals containing about 0.4% zinc are suspended in a proportion of 40 IU / ml, 1/3 of the insulin crystals will dissolve to the point that the suspension medium will contain 12-14 IU. dissolved insulin / ml. During subcutaneous or intramuscular injections of the residual suspension, an "initial" effect is obtained due to the dissolved insulin and then a "retard" effect resulting from the insulin crystals which remain in suspension.
EXAMPLE 11 -
In hydrochloric solution containing:
1.3 vol. % glycerin
0.1% nipagine 0.008% diethylbarbituric acid zinc chloride 1/120 molar
0.087% insulin (23 I.U. per milligram) dissolved in HCl, the pH is adjusted to ¯ 7 with NaOH, which quantitatively precipitates the insulin in the amorphous state (20 I.U./ml). By suspending insulin crystals in this medium, it will give an "initial" and "retard" effect by subcutaneous or intramuscular injection of the suspension.
In the examples above, the metals are added in the form of their chlorides. These can be used in other inorganic or organic forms such as sulfate, nitrate, acetate, citrate, hydroxide, oxide or metal complexes, or the metal itself, provided that the metal or compound metal used is present under conditions allowing its absorption by the insulin crystals.
In addition, it should be noted that the change in pH after suspension of the insulin crystals in the medium referred to in various examples should only be considered as an analytical aid.
Suspension media can be used at the pH value to which they have been adjusted when prepared.
In the preceding examples, the insulin crystals are separately prepared by aseptic crystallization, and the crystals are then added to a sterile suspension aqueous medium using the necessary aseptic conditions.
According to the invention, it is thus possible to crystallize insulin in the suspension medium prepared as described in the examples below.
EXAMPLE 12 -
174 milligrams of pure insulin are dissolved in 20 milliliters of HCl O, Oln, then added in the order shown:
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20 ml of a 4% sodium chloride solution
10 ml of a 1/12 molar sodium acetate solution
50 ml of a solution containing 0.004% zinc and
0.2% nipagine
The pH value is then brought back to 5 with HCl and the suspension is then poured into an ampoule. After a determined rest, the precipitated insulin changes to a crystalline state.
According to the invention, the mother liquor from the crystallization of insulin can be used as a suspension medium by adding thereto the necessary substances, such as isotonics, zinc or similar metals, stabilizers. suspensions and pH correctors.
EXAMPLE 13 -
174 milligrams of crystalline insulin are dissolved in 20 ml of 0.01 n HCl, then 20 ml of a sodium chloride solution and 10 ml of a 1/12 molar sodium acetate solution are added.
The pH of the mixture is then brought back to 5.5.
When crystallization is complete, 50 milliliters of a solution containing 0.016% zinc and 0.2% nipagine are added. The pH of the suspension obtained is to be adjusted if necessary. As it follows from what has been stated previously, in accordance with the invention, the metal can be added before as well as after having formed the suspension of the insulin crystals in the medium. It is therefore possible to start by suspending aseptic insulin crystals in an aqueous medium and then adding the chosen metal thereto.
EXAMPLE 14 -
174 milligrams of insulin crystals are suspended in 50 ml of an aqueous suspension medium containing: 1.6% sodium chloride 0.2% nipagine and 1/60 molar sodium acetate and one brings to a pH value of 5.5 by adding HCl.
To this suspension is added 50 ml of a zinc solution of the same acidity and containing 0.016% zinc. A zinc solution of other acidity than the suspension medium can be used, but in this case the adjustment of the pH value of the final suspension should be carried out if necessary. By raising the pH value of the suspension medium to 7, the insulin crystals in the suspension will contain approximately 2.2% zinc provided the initial concentration of the crystals was 0.4% zinc. .
Likewise, the metal concentration of the slurry can be prepared completely or partially by using crystals having increased metal concentration.
EXAMPLE 15 -
A solution is prepared containing:
1.3 vol. % of glycerin 0.1% of nipagine of sodium acetate 1/120 molar and whose pH value is adjusted to 5 by HCl.
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By adding 1.7 grams of insulin crystals containing about 2% zinc to 1 liter of this suspension, the crystals remain insoluble; but part of the zinc goes into solution in the suspension medium; this then contains zinc.
In the example above, the metal in question is added to the suspension medium via the crystals during the suspension. This can also be achieved by suspending crystals of normal metal concentration, while simultaneously adding the metal in question.
The examples cited above have been used only in order to illustrate applications of the invention, the main characteristics of which consist in the possibilities of suspending insulin crystals, which have a metallic concentration. stronger than that of the insulin particles before suspension.
The scope of the invention thus comprises the suspension of insulin crystals with an increased concentration of one of the metals mentioned in a medium which can be used in injection - and does not show concentrations of the metals afterwards. that the crystals were suspended there. By way of example, such media include distilled water and vegetable oils, such as that of olives, sesame and peanuts.
Finally, it should be noted that the insulin preparations obtained according to the invention can be marketed in two ampoules, one of which contains the suspension medium and the other the insulin crystals. line which, if desired, could be given an increased metallic concentration.
CLAIMS.
1 / A process for the production of insulin preparations with a long-acting or 'depot' effect, characterized by the production of a suspension of insulin crystals having per liter a concentration of certain metals such as zinc, cobalt. , nickel, cadmium, copper, manganese or iron such as to promote the crystallization of insulin, this concentration being greater than 5 x A x 10-3 milliequivalents, where "A" represents the number of international units of insulin per milliliter of the suspension.