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Il est connu de cristalliser de l'insuline dans un milieu aqueux con- tenant des ions,'appelés ci-après ions M, d'un ou plusieurs métaux activant la cristallisation (Zn, Cd, Co, Ni et Ou), de préférence le zinc, et ayant un degré pH compris entre 5,5 et 7.Pour la cristallisation, on emploie un produit tampon, d'habitude le phosphate de sodium, le citrate de .sodium, l'acétate ammonique ou l'acétate sodique, En ce qui concerne l'emploi du tampon au phosphate de sodium et le tampon à l'acétate ammonique, on se référera au brevet américain N 2143590 et, en ce qui concerne l'emploi du tampon au citrate de sodium, on se référera au brevet américain n 2626228. Parfois,on emploie également une addition de sol- vants pouvant empêcher la précipitation de l'insuline amorphe.
Comme solvants de ce genre, il y a, par exemple, l'acétone, les alcools propylique, butylique et amylique.
Les cristaux d'insuline ainsi obtenus contiennent des ions M chimi- quement liés dans la structure cristalline elle-même; leur quantité varie suivant les conditions de cristallisation appliquées. Elle peut être exprimée par le nom- bre d'atomes métalliques par cellule unitaire, c'est-à-dir e que l'unité cristal- lographique contient 390 atomes d'azote protéinique ; elle peut être également ex- primée par la quantité, en pourcents, de métal dans les cristaux secs ou par la quantité de métal, en équivalents en gr., par gr: de cristaux secs. Par cristaux secs, on entend des cristaux dont la teneur en eau est telle que leur teneur en azote protéinique est d'environ 14,2 %.
Lorsqu'on emploie un tampon au citrate, les cristaux obtenus devront contenir 2 atomes métalliques par cellule unitaire, soit 0,34 % de zinc. En ap- pliquant le procédé du brevet américain ? 2143590, suivant lequel on effectue la cristallisation en présence d'un tampon au phosphate de sodium et la recristalli- sation en présence d'un tampon à l'acétate ammonique, sans addition d'ions de zinc, les cristaux recristallisés contiendront 3 atomes de zinc par cellule uni- taire des cristaux, soit 0,52 de zinc.
Si l'on cristallise l'insuline dans une solution en absence de pro- duits précipitant le zinc;'- comme par exemple les ions de phosphate, ou des pro- duits formant des composés complexes de zinc, par exemple des ions de citrates, tout en employant, par exemple un tampon à l'acétate de sodium, les cristaux ob- tenus contiendront, si l'on emploie une teneur suffisamment élevée en ions M dans le milieu de cristallisation, jusqu'à 5 atomes métalliques par cellule unitaire, ce qui, pour autant qu'il s'agisse du zinc, correspond à une teneur en zinc d'en- viron 0,8 %.
Si le milieu de cristallisation possède une concentration élevée en ions M de telle sorte qu'un cristal d'insuline, qui s'y trouve en suspension, contienne plus d'environ 6 atomes métalliques par cellule unitaire, les cristaux d'insuline ne se formeront que très lentement ou pas du tout.
Les cristaux d'insuline obtenus de ces différentes manières ont une structure rhomboédrique et la forme de mâcles, d'"étoiles" ou de rhomboèdres dé- formés, lorsque l'insuline provient du pancréas du boeuf ou du veau.
Il est à noter qu'en employant de l'insuline provenant du pancréas du boeuf ou du veau, on peut obtenir des cristaux d'insuline ayant la forme de rhomboèdres à arêtes vives et à faces planes, si le milieu de cristallisation con- tient des ions d'halogène, par exemple sous forme d'addition de chlorure de so- dium, en une forte concentration appropriée (cnfo brevet ? 520.686). Les cris- taux de ce genre n'entrent pas en considération dans la présente description.
On a mis des cristaux d'insuline ayant une teneur en zinc de 0,52 %, en suspension dans de l'eau distillée et on les a injectés à des lapins, (voir, JoPharm. 58, 93-104, 1936). On a trouvé que l'effet se distinguait très nettement de l'action brève et rapide d'une solution de cristaux. Si,'d'autre part, on ajou- te des ions M, en quantité appropriée, à la suspension cristalline, on obtiendra, de façon connue, un effet très prolongé, les cristaux en suspension se combinant
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en réaction neutre (pH du sang),avec les ions M, tout en formant un composé insu- line-métal légèrement soluble, se résorbât lentement et contenant au moins 5-6 @ atomes métalliques par cellule unitaire (voir p.ex.
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A présent, on a montré, de façon surprenante, qu'il n'y a pas de con- dition pour obtenir un effet très prolongé des suspensions cristallines' d'insuli- ne et que cette absorption des métaux activant la cristallisation par les cris- taux d'insuline se produit à un pH 7 de la suspension.
La présente invention, se rapportant à un procédé de préparation de suspensions cristallines d'insuline ayant un effet prolongé, est basée sur les découvertes suivantes :
Si l'on met les cristaux d'insuline de boeuf ou de veau du type préci- té, en suspension dans un milieu aqueux ayant un pH de 5,5 et une composition tel- le que la teneur en ions M libres de la suspension obtenue soit faible, à tel point que, pour un pH 7 du milieu, les cristaux d'insuline contiennent moins de
5-6 atomes métalliques par cellule unitaire, on constatera que cette suspension n'exerce pas un effet prolongé remarquable. Si, d'autre part, la suspension est réglée à un pH 7, on constatera, de façon surprenante, que l'action de la suspen- sion est fortement prolongée.
Cette constatation est la plus surprenante pour les propriétés des cristaux d'insuline obtenus à partir du pancréas du porc. Si l'on prépare une suspension du type précité à partir d'insuline de porc et si on la règle à un pH de 5,5 cette suspension n'exercera pas un effet prolongé et il en se sera de même si l'on change le pH en le réglant à 7, les cristaux d'insuline de porc se dissolvant en procédant de la sorte.
De plus, on a trouvé que la durée d'action des suspensions aqueuses de cristaux d'insuline de boeuf ou de veau augmentera si ces suspensions sont stockées pendant une période prolongée à la température ambiante ou à des tempé- ratures plus élevées et si elles ont un pH sensiblement inférieur à 7 ; d'autre part, il n'y aura pas de changement important dans la durée d'action si les sus- pensions ont un pH d'environ 7 (6,5 à 7,5). Une préparation d'insuline doit être stable; des essais effectués ont montré que ces suspensions sont stables à un pH d'environ 7 (6,5 à 7,5) et uniquement dans cette gamme de pH.
D'après les constatations ci-dessus, le procédé de la présente inven- tion, suivant lequel on prépare une suspension de cristaux d'insuline dans un mi- lieu pouvant être injecté, est caractérisé en ce qu'on emploie des cristaux d'in- suline provenant du pancréas du boeuf ou du veau et ayant une structure rhomboé- drique et la forme de mâcles, d'"étoiles" ou de rhomboèdres;
ce procédé est éga- lement caractérisé en ce qu'on emploie un milieu aqueux ayant ou auquel on a don- né un degré d'acidité tel que le pH de la suspension soit d'environ 7 (6,5 à 7,5), tout en se composant également d'ions de métaux activant la cristallisation de l'insuline et de produits, comme par exemple des produits tampons, liant ces ions, de telle sorte que les cristaux d'insuline en suspension, à un pH 7 du milieu, contiennent 5-6 atomes maximum de ces métaux par cellule unitaire, soit, au maxi- mum, 0,25 à 0,30 milli-équivalent de métal par gr. de cristaux secs.
On peut effectuer le procédé en mettant les cristaux d'insuline, pré- alablement préparés, en suspension dans un milieu aqueux pouvant être injecté,
Dans ce cas, il est préférable d'employer des cristaux d'insuline n'ayant pas été préalablement soumis à l'un ou l'autre séchage, car on a constaté qu'un procédé de séchage diminuait la durée d'action des suspensions.
Toutefois, il convient mieux d'effectuer la cristallisation de ]insu- line dans des conditions stériles et de donner, au milieu de cristallisation, une composition telle qu'il puisse être injecté, de sorte que, suivant la présen- te invention, on utilise la liqueur mère des cristaux comme milieu de cristalli- sation, auquel on a ajouté l'un ou l'autre produit manquant, comme par exemple ;l'eau, les isotoniques et les agents de conservation.
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La durée d'action des suspensions obtenues dépend de la grosseur des; cristaux d'insuline en suspensiong la duxée d'action étant réduite si la grosseur des cristaux diminue. Suivant la présente invention, on emploie, de préférence, des cristaux d'insuline d'une grosseur prédéterminée et uniforme allant jusqu'à environ 40 #. On peut régler la grosseur des cristaux, par exemple en appliquant les procédés faisant l'objet des brevets N 533.252 et 533.298.
Il est préférable d'utiliser un milieu aqueux ne contenant pas des produits liant des ions M libres, par exemple des produits tampons, la teneur to- tale en ions M de la suspension obtenue atteignant, dans ce cas, au maximum 13 x, A x 10-3 milli-équivalents par litre, A indiquant le nombre d'unités d'insuline par millilitre.
Les suspensions cr,istalline d'insuline obtenues suivant la présente invention possèdent un effet initial supérieur à celui obtenu avec les suspensions aqueuses cristallines connues d'insuline contenant, en outre, de l'insuline amor- phe en suspension et ayant une teneur supérieure en ions de zinc, de telle sorte que,les cristaux d'insuline en suspension, à un pH 7 du milieu de suspension, con- tiennent environ 2,3 % de zinc.
Si l'on veut obtenir un effet initial plus élevé avec les suspensions cristallines d'insuline préparées suivant la présente invention, on peut employer une addition d'une solution d'insuline provenant du pancréas du pancréas du porc, cette solution ayant le même degré pH. La stabilité des suspensions n'en est pas influencée au cours du stockage.
L'exemple ci-après illustre le procédé suivant la présente invention.
Exemple.
On met 3,48 gr. de cristaux d'insuline de boeuf, contenant 0,78 % de zinc, en suspension dans 100 millilitres d'eau et on les dissout en ajoutant 4 millilitres de HC1 1N. On filtre la solution dans des conditions stériles et on la dilue jusqu'à 150 millilitres avec de l'eau stérilisée. A cette solution, on ajoute 50 millilitres de 0,4 mole d'acétate de sodium contenant de l'hydroxyde de sodium en quantité telle que le mélange atteint un pH = 5,5. Après le mélange, l'insuline se cristallise tout en étant agitée lentement pendant environ 24 heu- res.
Ensuite, on dilue la suspension en ajoutant 1800 millilitres d'une solution de benzoate p-hydroxy-méthylique contenant 0,11 % de benzoate p-hydroxy-méthyii- que et 14 gr. de chlorure de sodium et du NaOH en quantité telle que le pH de la suspension finale sera de 7,3/7,4.
Au lieu d'employer un tampon d'acétate de sodium comme dans l'exemple ci-dessus, on peut employer un tampon de phosphate de sodium ou de citrate de so- dium. On peut également utiliser des cristaux d'insuline ayant une plus faible teneur en zinc ou des cristaux d'insuline contenant des métaux activant la cris- tallisation, autres que le zinc.
De plus, on peut également ajouter, au milieu de suspension aqueux? . des ions supplémentaires de métaux activant la cristallisation.
REVENDICATIONS.
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It is known to crystallize insulin in an aqueous medium containing ions, hereinafter called M ions, of one or more crystallization-activating metals (Zn, Cd, Co, Ni and Ou), preferably. zinc, and having a pH between 5.5 and 7. For crystallization, a buffer product is used, usually sodium phosphate, sodium citrate, ammonium acetate or sodium acetate, As regards the use of the sodium phosphate buffer and the ammonium acetate buffer, reference will be made to U.S. Patent No. 2143590 and, as regards the use of the sodium citrate buffer, reference will be made to US Patent No. 2626228. Sometimes addition of solvents which may prevent precipitation of amorphous insulin is also employed.
As such solvents, there are, for example, acetone, propyl, butyl and amyl alcohols.
The insulin crystals thus obtained contain M ions chemically bound in the crystal structure itself; their amount varies according to the crystallization conditions applied. It can be expressed as the number of metal atoms per unit cell, ie the crystallographic unit contains 390 protein nitrogen atoms; it can also be expressed by the quantity, in percent, of metal in the dry crystals or by the quantity of metal, in gr equivalents, per gr: of dry crystals. By dry crystals, is meant crystals whose water content is such that their protein nitrogen content is approximately 14.2%.
When using a citrate buffer, the crystals obtained should contain 2 metal atoms per unit cell, or 0.34% zinc. By applying the process of the US patent? 2143590, according to which the crystallization is carried out in the presence of a sodium phosphate buffer and the recrystallization in the presence of an ammonium acetate buffer, without the addition of zinc ions, the recrystallized crystals will contain 3 atoms of zinc per unit cell of crystals, or 0.52 zinc.
If insulin is crystallized in a solution in the absence of products which precipitate zinc; '- such as for example phosphate ions, or products forming complex zinc compounds, for example citrate ions, while employing, for example, a sodium acetate buffer, the crystals obtained will contain, if a sufficiently high content of M ions in the crystallization medium is employed, up to 5 metal atoms per unit cell, which, in so far as it is zinc, corresponds to a zinc content of about 0.8%.
If the crystallization medium has a high concentration of M ions such that a crystal of insulin suspended in it contains more than about 6 metal atoms per unit cell, the insulin crystals will not form. will form only very slowly or not at all.
The insulin crystals obtained in these different manners have a rhombohedral structure and the shape of twins, "stars" or deformed rhombohedra, when the insulin comes from the pancreas of the beef or the calf.
It should be noted that by employing insulin from the pancreas of the beef or the calf, one can obtain insulin crystals having the form of rhombohedra with sharp edges and flat faces, if the crystallization medium contains halogen ions, for example as an addition of sodium chloride, in a suitable high concentration (Cnfo patent No. 520,686). Crystals of this kind are not taken into consideration in the present description.
Insulin crystals with 0.52% zinc content were suspended in distilled water and injected into rabbits (see, JoPharm. 58, 93-104, 1936). The effect was found to be very distinct from the short and rapid action of a solution of crystals. If, on the other hand, M ions are added in an appropriate amount to the crystalline suspension, a very long-lasting effect will be obtained, in a known manner, the suspended crystals combining.
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in neutral reaction (pH of blood), with M ions, while forming a slightly soluble insulin-metal compound, slowly reabsorbs and contains at least 5-6 @ metal atoms per unit cell (see eg.
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394-398 (1952). '
Now, surprisingly, it has been shown that there is no condition for obtaining a very prolonged effect of crystalline insulin suspensions and that this absorption of metals activating crystallization by the cries. - insulin level occurs at a pH 7 of the suspension.
The present invention, relating to a process for the preparation of crystalline insulin suspensions having a prolonged effect, is based on the following findings:
If the crystals of beef or veal insulin of the above type are suspended in an aqueous medium having a pH of 5.5 and a composition such as the content of free M ions in the suspension. obtained is low, to such an extent that, for a pH 7 of the medium, the insulin crystals contain less
5-6 metal atoms per unit cell, it will be noted that this suspension does not exert a remarkable prolonged effect. If, on the other hand, the suspension is adjusted to pH 7, it will surprisingly be found that the action of the suspension is greatly prolonged.
This finding is most surprising for the properties of insulin crystals obtained from the pancreas of the pig. If a suspension of the above-mentioned type is prepared from pork insulin and if it is adjusted to a pH of 5.5 this suspension will not exert a prolonged effect and it will be the same if one changes the pH by adjusting it to 7, the pork insulin crystals dissolving by doing so.
In addition, it has been found that the duration of action of aqueous suspensions of beef or calf insulin crystals will increase if these suspensions are stored for a prolonged period at room temperature or at higher temperatures and if they are stored for a long time. have a pH significantly less than 7; on the other hand, there will be no significant change in the duration of action if the suspensions have a pH of about 7 (6.5 to 7.5). An insulin preparation must be stable; tests carried out have shown that these suspensions are stable at a pH of about 7 (6.5 to 7.5) and only in this pH range.
From the above findings, the process of the present invention, whereby a suspension of insulin crystals is prepared in an injectable medium, is characterized by employing crystals of insulin. insulin obtained from the pancreas of beef or calf and having a rhomboidal structure and the shape of jaws, "stars" or rhombohedra;
this process is also characterized in that an aqueous medium is used having or to which a degree of acidity has been given such that the pH of the suspension is about 7 (6.5 to 7.5) , while also consisting of metal ions activating the crystallization of insulin and products, such as for example buffer products, binding these ions, so that the insulin crystals in suspension, at a pH 7 of the medium, contain a maximum of 5-6 atoms of these metals per unit cell, ie, at most, 0.25 to 0.30 milli-equivalent of metal per gr. of dry crystals.
The process can be carried out by suspending the previously prepared insulin crystals in an aqueous medium suitable for injection,
In this case, it is preferable to use insulin crystals which have not previously been subjected to one or the other drying, since it has been found that a drying process reduces the duration of action of the suspensions. .
However, it is more convenient to carry out the crystallization of insulin under sterile conditions and to give the crystallization medium a composition such that it can be injected, so that, according to the present invention, one. uses the mother liquor of the crystals as the crystallization medium, to which one or the other missing product has been added, such as, for example, water, isotonics and preservatives.
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The duration of action of the suspensions obtained depends on the size of; insulin crystals in suspension g the duration of action being reduced if the size of the crystals decreases. In accordance with the present invention, preferably, insulin crystals of a predetermined and uniform size of up to about 40% are employed. The size of the crystals can be controlled, for example by applying the methods which are the subject of patents Nos. 533,252 and 533,298.
It is preferable to use an aqueous medium which does not contain products which bind free M ions, for example buffer products, the total content of M ions in the suspension obtained reaching, in this case, at most 13 x. x 10-3 milli-equivalents per liter, A indicating the number of units of insulin per milliliter.
The crystalline insulin suspensions obtained according to the present invention have a higher initial effect than that obtained with the known crystalline aqueous insulin suspensions containing, in addition, amorphous insulin in suspension and having a higher content of insulin. zinc ions, so that the insulin crystals in suspension, at pH 7 of the suspension medium, contain about 2.3% zinc.
If a higher initial effect is to be obtained with the crystalline insulin suspensions prepared according to the present invention, an addition of an insulin solution from the pancreas of the pancreas of the pig can be employed, this solution having the same degree. pH. The stability of the suspensions is not affected by this during storage.
The example below illustrates the process according to the present invention.
Example.
We put 3.48 gr. crystals of beef insulin, containing 0.78% zinc, suspended in 100 milliliters of water and dissolved by adding 4 milliliters of 1N HCl. The solution is filtered under sterile conditions and diluted to 150 milliliters with sterilized water. To this solution are added 50 milliliters of 0.4 mol of sodium acetate containing sodium hydroxide in an amount such that the mixture reaches a pH = 5.5. After mixing, the insulin crystallizes while being stirred slowly for about 24 hours.
Then the suspension is diluted by adding 1800 milliliters of a p-hydroxy-methyl benzoate solution containing 0.11% p-hydroxy-methyl benzoate and 14 gr. of sodium chloride and NaOH in an amount such that the pH of the final suspension will be 7.3 / 7.4.
Instead of employing a sodium acetate buffer as in the example above, a sodium phosphate or sodium citrate buffer can be employed. It is also possible to use insulin crystals having a lower zinc content or insulin crystals containing crystallization activating metals other than zinc.
In addition, it is also possible to add to the aqueous suspension medium? . additional metal ions which activate crystallization.
CLAIMS.