fabrication d'une préparation d'insuline injectable, avec effet retard.
Procéde de L'importance de la présence de zinc dans diverses préparations d'insuline, pour injec- tion sous-cutanée ou intramutsculaire, a fait l'objet de nombreux tests chimiques, biologies et cliniques.
lin. si, on sait qu'un effet thérapeutique prolonge peut tre obtenu par injection sous- cutanée a des lapins d'insuline dissoute, si la solution d'insuline contient de grandes quan- tités de zinc (environ 10--200 gamma par unité d'insuline).
Toutefois, de grandes quan- tités de zinc provoquent de graves irritations à l'endroit de l'injection, si bien qu'on peut aussi se demander si de telles quantités de zinc peuvent tre administrées quotidienne- ment. sans danger pour l'organisme humain.
Hn conséquence, les préparations d'insuline consistant en insuline dissoute avee adjone- tion de zinc n'ont trouvé aucun emploi clini- que pratique.
Eisenbrand et Weoel ont étudié la capacité de l'insuline amorphe de fixer du zinc [voir Medizin und C'hemie, IV, pages 278, 292 n !) 42 ! J. De l'insuline cristalline fut dissoute dans s de l'acide chlorhydride et du chlo- rltle de zinc additionné en quantité variable ;
le Pil de la solution fut ensuite ajusté à 6, 5 au moyen, de soude caustique, après quoi la te neur en zinc du précipité résultant fut exa- minée. () trouva que l'insuline amorphe était capable de fixer le zinc par réaction chimique en quantités correspondant au nombre de groupes carboxyliques libres de la molécule d'insuline. Toutefois, aucune des suspen- sions contenant du zinc obtenues par Eisenbrand et Wegel n'a été expérimentée biolo- giquement ou cliniquement et aucune des suspensions obtenues ne convient pour un usage clinique pratique.
La présente invention se rapporte à un procédé de fabrication d'une préparation d'insuline injectable avec effet retard basé sur les observations nouvelles suivantes :
1 De l'insuline amorphe précipitée peut réagir chimiquement non seulement avec du zinc, mais également avec d'autres métaux dont la présence est nécessaire à la eristallisation de l'insuline. Ainsi, si le zinc est remplacé par du cobalt, du nickel, du cadmium, du cuivre, du manganèse ou du fer, on trouvera que ces métaux sont fixés chimiquement par l'insuline amorphe d'une manière simi laire au zine.
90 Afin d'obtenir des suspensions aqueuses d'insuline amorphe ayant une valeur quelcon- que pour des usages cliniques pratiques, il est nécessaire de maintenir la valeur du pH du milieu de suspension aqueux entre 6 et 8,5, étant donné qu'autrement l'insuline précipitée sous forme amorphe risquerait d'tre trans formée en insuline cristalline, ce qui changerait l'effet thérapeutique de la suspension.
3 D'autre part., on a trouvé que lors du choix des adjuvants, tels que substances-tampon, agents d'isotonie et agents de conservation, lors de la préparation des suspensions aqueuses, il faut s'assurer que les susbstances ainsi ajoutées ne libèrent pas des ions présentant en milieu neutre une plus grande affinité pour les métaux envisagés que l'insuline n'en a. De tels ions, lorsqu'ils sont présents en quantité suffisante, empcheraient la réaction chimique entre l'insuline et lesdits métaux de se produire.
Ainsi, le tampon le plus courant, au phos- phate, est inutilisablesauf danslespréparations à base de nickel. Les tampons au citrate sont inutilisables avec l'un quelconque de ces métaux. Des tampons adéquats seront mentionnés plus loin.
Le procédé selon l'invention est caracté- risé par le fait que l'on prépare une suspen- sion d'insuline amorphe dans un milieu aqueux injectable présentant un PH compris entre 6 et 8,5 et contenant une quantité telle d'au moins l'un des métaux dont la présence est nécessaire à la cristallisation de l'insuline, que l'insuline amorphe fixe, par réaction chi- mique, une partie du métal présent dans ce milieu, ce dernier ne contenant pas d'ions présentant en milieu neutre une plus grande affinité pour les métaux mentionnés que l'in- suline, en quantité suffisante pour empcher la réaction chimique entre métal et insuline.
Des essais chimiques ont montré qu'il est possible d'arriver, de cette manière, à des préparations d'insuline injectable qui présentent un effet retard de 24 heures environ et qui, dans bien des cas, permettent une meilleure utilisation de l'insuline injectée que lors de l'utilisation des préparations connues d'insuline, à cet effet retard correspondant, ce qui donne bien une économie d'insuline.
L'effet clinique obtenu est absolument reproductible mme après que les préparations obtenues ont été conservées pendant longtemps. La raison en est, à la fois, le pu des préparations et la minime quantité d'insuline en solution.
Etant donné que les s préparations sont le plus stable lorsque leur milieu est neutre, il est indiqué de donner au milieu de suspension aqueux un pH ;d'environ 7, correspondant éga- lement à l'acidité des tissus de l'organisme humain.
Dans la thérapeutique pratique du diabète, il est très important d'administrer des prépa- rations d'insuline ayant un effet thérapeuti- que tel qu'une seule injection journalière soit suffisante dans la grande majorité des cas de diabète. La preuve a été faite que des prépa- rations d'insuline avec une teneur en métal d'environ 3X.X10--sà environ 18X, lXiO 5 milliéquivalents par millilitre, A eorrespon- dant au nombre d'unités internationales d'insuline par millilitre de suspension, ce qui cor respond, dans le cas du zinc, à environ 1 à environ 6 gamma de zinc par unité d'insuline, répondent à cette exigence.
Une seule injee- tion journalière d'une préparation de cette composition permet d'assurer au patient une réserve adéquate d'insuline pendant la matinée et. l'après-midi et il restera encore assez d'insuline en fin de journée pour couvrir la consommation d'insuline pendant la soirée et la nuit.
Ceci permet d'arriver, sans employer de substances non présentes normalement dans l'organisme, à des préparations d'insuline possédant un degré de prolongation d'action par ticulièrement convenable, et supérieures aux préparations connues d'insuline en ce qui concerne l'utilisation de la quantité d'insuline injectée et. l'adaptation du patient à la préparation. Comme il est important que les préparations obtenues soient maintenues à un pH entre 6 et 8,5 mme après avoir été conservées pendant une longue période, il convient de stabiliser le pli du milieu de suspension au moyen d'une substance-tampon.
Comme exem- ples de substances-tampon employables, on peut citer le tampon à l'acétate, le tampon au borate, le tampon au diéthyl-barbiturate et le tampon a. u maléate.
Pour des raisons cliniques, il est préférable d'employer des milieux de suspension isotoniques. Des substances telles que glucose, chlorure de sodium ou glycérine peuvent tre utilisées pour rendre isotoniques les milieux aqueux.
Pour la stabilité des préparations d'insuline il est, en outre, avantageux d'ajouter un ou plusieurs des agents de conservation em- ployés d'ordinaire pour les liquides à injecter.
Le p-oxybenzoate de méthyle et le p-oxybenzoate de propyle, ainsi que l'acétate de mercure-phényle, sont des exemples de tels agents de conservation.
Un mode d'exécution particulièrement avantageux du procédé selon l'invention con siste à préparer une solution aqueuse stérile et acide d'insuline et d'au moins l'un des métaux mentionnés et à mélanger ladite solution avec une solution aqueuse basique contenant une substance-tampon, de façon à ajuster le pB du mélange à 7 environ et à précipiter l'insuline a l'état amorphe. De cette façon, la précipi- tation de l'insuline amorphe est effectuée au cours de la préparation elle-mme, ce qui com- munique les propriétés physiques les plus favorables à l'insuline amorphe.
On peut employer, comme composé métallique, un sel organique ou inorganique, tel que chlorure, sulfate, nitrate ou acétate, ou un hydroxyde, oxyde, ou un composé métallique complexe qui, une fois ajouté, se présentera dans un état tel que le métal puisse réagir avee l'insuline amorphe.
On peut. employer de l'insuline cristalline eomme produit de départ au lieu d'insuline amorphe, mais, dans ce cas, il est indispensable que l'insuline soit d'abord mise en solu- tion au cours de la mise en oeuvre du procédé.
Il est. préférable d'utiliser le zinc comme métal destiné à permettre la cristallisation de l'insuline, et le zinc est utilisé de préférence à raison de 6 X A X 10-5 milliéquivalents par r millilitre, A représentant le nombre d'unités internationales d'insuline par millilitre.
Si on emploie des solutions des différents produits de départ, dans la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, ces dernières peuvent tre stérilisées séparément et tre employées comme base pour l'obtention de préparations différentes. Par exemple, on peut préparer les solutions de départ suivantes :
Solution de départ I : On dissout 2,18 grammes d'insuline recristallisée dans 23 millilitres d'acide chlorhydrique 0, 1 n et on ajoute de l'eau distillée jusqu'à un volume de 125 millilitres.
Solution de départ II : A 20 millilitres d'une solution aqueuse de chlorure de zinc contenant 1 /o de zinc, on ajoute de l'eau distillée jusqu'à un volume de 125 millilitres.
Solution de départ III : A 10 millilitres d'une solution aqueuse de chlorure de nickel contenant 1 /o de nickel, on ajoute de l'eau distillée jusqu'à un volume de 100 millilitres.
Solution de départ IV : On dissout 1,36 gramme d'acétate de sodium avec 3 molécules d'eau de cristallisation dans de l'eau distillée jusqu'à un volume de 100 millilitres.
Solution de départ V : On dissout 3,58 grammes de phosphate de sodium secondaire avec 12 molécules d'eau de cristallisation dans de l'eau distillée jusqu'à un volume de 100 millilitres.
Exemple l :
On mélange 1,3 millilitre de glycérine avec 0,5 millilitre d'une solution à 25 ouzo de p-oxybenzoate de méthyle dans de l'éthanol et on ajoute 50 millilitres d'eau distillée. On ajoute au mélange obtenu, après filtration stérile, 10 millilitres de la solution de départ I, 2,5 millilitres de la solution de départ II et 10 millilitres de la solution de départ IV, après quoi on ajoute 3,0 millilitres d'hydroxyde de sodium 0,1 n stérile et on complète le volume du mélange à 100 millilitres avec de l'eau distillée stérile.
L'insuline est précipitée à l'état amorphe par l'adjonction d'hydroxyde de sodium et l'insuline amorphe précipitée réagit chimiquement avec le zinc en solution et en fixe une partie. La suspension ainsi obtenue a un pH de 7 et contient approximativement un gamma de zinc par unité d'insuline.
Exemple 2 :
On mélange 1,3 millilitre de glycérine avec 0,5 millilitre d'une solution à 25"/9 de p-oxy- benzoate de méthyle dans de l'éthanol et on ajoute 50 millilitres d'eau distillée. On ajoute au mélange obtenu, après passage à l'autoclave, 10 millilitres de la solution de départ I, 10 millilitres de la solution de départ III et 10 millilitres de la solution de départ V, après quoi on ajoute 0,5 millilitre d'acide chlorhydrique 0,1 n stérile et on dilue le mélange à un volume de 100 millilitres avec de l'eau distillée stérile. L'insuline est précipitée sous forme amorphe par l'addition de la solution de départ V et l'insuline amorphe ainsi pré cipitée fixe par réaction chimique une partie du nickel contenu dans le milieu aqueux.
La suspension d'insuline amorphe obtenue a un pu de 7 et contient environ 2,5 gamma de nickel par unité d'insuline.
Exemple 3 :
On dissout 174 milligrammes d'insuline cristallisée dans 10 millilitres d'HCl 0,02 n.
On ajoute alors la solution suivante :
1,3 millilitre de glycérine
0, 5 millilitre de solution de p-oxybenzoate
de méthyle à 25"/o dans de l'éthanol
8 milligrammes de zinc (sous forme de
chlorure)
plus de l'eau distillée jusqu'à un volume
totale de 80 millilitres.
On filtre stérilement le mélange, après quoi on ajoute un mélange passé à l'autoclave consistant en :
3,0 millilitres de Na. OH 0,1 n
136 milligrammeWs d'acétate de Na, 3H20
plus de l'eau jusqu'à un volume total de
10 millilitres.
L'insuline est précipitée sous tonne amorphe, réagit chimiquement avee le zinc en solution et en fixe une partie. La suspension d'insuline amorphe ainsi préparée contient environ 2 gamma de zinc par unité d'insuline et a un pg de 7.
Exeslpte-j :
On cli sout 174 milligrammes d'insuline cristalli. sée dans 10 millilitres d'HGl 0,02 n contenant 16 milligrammes de Zn sous forme de chlorure et on filtre la solution stérilement.
On prépare alors une solution contenant :
136 milligrammes'd'acétate de Na, 311,, 2O 1, 3 millilitre de glycérine
0, 5 millilitre de solution de p-oxybenzoate
de méthyle à. 25"/e dans de 1'éthanol
3, 4 millilitres de NaOH 0,1 n
plus de l'eau jusqu'à un volume total de
90 millilitres.
On filtre aussi cette solution stérilement, après quoi on mélange dans des conditions aseptiques les deux solutions filtrées stérilement, de façon à provoquer Sa précipitation de l'insuline sous forme amorphe et la fixation sur elle par réaction chimique d'une partie du zinc présent en solution.
La préparation ainsi obtenue eontient environ 4 gamma de zinc par unité d'insuline et son pg est. égal à 7.
Exernplc 5 :
On met en suspension 4000 unité. s interna- tonales d'insuline amorphe dans 10 millilitres d'une solution de chlorure de zinc contenant 0, 16"/o de Zn+4. On la dissout alors par adjonction de 10 millilitre, a cl'HCl 0,1 n.
On a. jon. te, comme substanee d'isot. onie, 1,3 millilitre de glycérine et, comme agent de conservation 0,5 millilitre d'une solution de poxybenzoate de méthvle à o /o dans de l'étha- nol. On dilue alors à 90 millilitres avec dp l'eau et on filtre stérilement, après quoi on ajoute 10 millilitres de NaOH 0,1 n, passé à l'autoclave, contenant 136 milligrammes d'acé- tate de Na,., H20. Enfin. on porte le pu à 6 avee 0,07 millilitre de-NaOH 1 n stérile. L'addition de NaOH provoque la précipitation de l'insuline à l'état amorphe et la fixation par réaction chimique sur l'insuline d'une partie du zinc en solution.
La préparation ainsi obtenue contient environ 4 gamma de zinc par unité d'insuline.
Exemple 6 :
On met en suspension 4000 unités internationales d'insuline amorphe stérile dans le milieu de suspension, filtré stérilement, indi- qué ci-dessous :
S milligrammes de zinc (sous forme de
chlorure)
206 milligrammes de diéthyl-barbiturate
de sodium
1,3 millilitre de glycérine
0,5 millilitre de solution de p-oxybenzoate
de méthyle à 25 /o dans l'éthanol
6,5 millilitres de HCl 0,1 n
plus de l'eau jusqu'à un volume total de
100 millilitres.
Par mise en suspension de l'insuline amor phe, eette dernière réagit chimiquement avec le zinc en solution et. en fixe une partie.
La suspension d'insuline amorphe ainsi obtenue a un pg de 7 et contient environ 2 gamma de zinc par unité d'insuline.
manufacture of an injectable insulin preparation, with a depot effect.
Procedure The extent of the presence of zinc in various insulin preparations, for subcutaneous or intramutsular injection, has been the subject of numerous chemical, biological and clinical tests.
linen. if, it is known that a prolonged therapeutic effect can be obtained by subcutaneous injection into rabbits of dissolved insulin, if the insulin solution contains large quantities of zinc (approximately 10--200 gamma per unit of 'insulin).
However, large quantities of zinc cause serious irritation at the site of the injection, so that one can also wonder whether such quantities of zinc can be administered daily. harmless to the human body.
Consequently, insulin preparations consisting of dissolved insulin with added zinc have found no practical clinical use.
Eisenbrand and Weoel studied the capacity of amorphous insulin to bind zinc [see Medizin und C'hemie, IV, pages 278, 292 n!) 42! J. Crystalline insulin was dissolved in hydrochloride acid and zinc chloride added in varying amounts;
The PIL of the solution was then adjusted to 6.5 by means of caustic soda, after which the zinc content of the resulting precipitate was examined. () found that amorphous insulin was able to bind zinc by chemical reaction in amounts corresponding to the number of free carboxylic groups in the insulin molecule. However, none of the suspensions containing zinc obtained by Eisenbrand and Wegel have been tested biologically or clinically and none of the suspensions obtained are suitable for practical clinical use.
The present invention relates to a method of manufacturing an injectable insulin preparation with a delayed effect based on the following new observations:
1 Precipitated amorphous insulin can react chemically not only with zinc, but also with other metals whose presence is necessary for the crystallization of insulin. Thus, if zinc is replaced by cobalt, nickel, cadmium, copper, manganese or iron, these metals will be found to be chemically attached by amorphous insulin in a zine-like manner.
90 In order to obtain aqueous suspensions of amorphous insulin having any value for practical clinical uses, it is necessary to maintain the pH value of the aqueous suspension medium between 6 and 8.5, since otherwise insulin precipitated in amorphous form would risk being transformed into crystalline insulin, which would change the therapeutic effect of the suspension.
3 On the other hand, it has been found that when choosing adjuvants, such as buffer substances, isotonic agents and preservatives, when preparing aqueous suspensions, it must be ensured that the substances thus added do not release ions exhibiting in a neutral medium a greater affinity for the metals envisaged than insulin does. Such ions, when present in sufficient quantity, would prevent the chemical reaction between insulin and said metals from occurring.
Thus, the most common buffer, phosphate, is unusable except in preparations based on nickel. Citrate buffers cannot be used with any of these metals. Adequate buffers will be mentioned later.
The process according to the invention is characterized in that a suspension of amorphous insulin is prepared in an injectable aqueous medium having a pH of between 6 and 8.5 and containing such a quantity of at least one of the metals whose presence is necessary for the crystallization of insulin, which the amorphous insulin fixes, by chemical reaction, a part of the metal present in this medium, the latter not containing ions presenting in neutral medium a greater affinity for the metals mentioned than insulin, in an amount sufficient to prevent the chemical reaction between the metal and insulin.
Chemical tests have shown that it is possible in this way to arrive at injectable insulin preparations which exhibit a delay effect of approximately 24 hours and which, in many cases, allow better use of the insulin. injected only when using the known insulin preparations, for this corresponding delay effect, which indeed gives an insulin saving.
The clinical effect obtained is absolutely reproducible even after the preparations obtained have been stored for a long time. The reason is, at the same time, the pu of the preparations and the small amount of insulin in solution.
Since preparations are most stable when their medium is neutral, it is advisable to give the aqueous suspension medium a pH of about 7, also corresponding to the acidity of the tissues of the human organism.
In the practical therapy of diabetes, it is very important to administer insulin preparations having such a therapeutic effect that a single daily injection is sufficient in the great majority of cases of diabetes. It has been shown that preparations of insulin with a metal content of about 3X.X10 - s to about 18X, lXiO 5 milliequivalents per milliliter, corresponding to the number of international units of insulin per milliliter. milliliter of suspension, which corresponds, in the case of zinc, to about 1 to about 6 gamma of zinc per unit of insulin, meets this requirement.
A single daily injection of a preparation of this composition makes it possible to ensure the patient an adequate supply of insulin during the morning and. afternoon and there will still be enough insulin left at the end of the day to cover insulin consumption during the evening and night.
This makes it possible to arrive, without the use of substances not normally present in the organism, at insulin preparations possessing a particularly suitable degree of prolongation of action, and superior to the known insulin preparations with regard to the use of the amount of insulin injected and. patient adaptation to preparation. Since it is important that the preparations obtained be maintained at a pH between 6 and 8.5 even after having been stored for a long period, it is appropriate to stabilize the fold of the suspension medium by means of a buffer substance.
Examples of employable buffer substances include acetate buffer, borate buffer, diethyl barbiturate buffer and α buffer. u maleate.
For clinical reasons, it is preferable to use isotonic suspension media. Substances such as glucose, sodium chloride or glycerin can be used to make aqueous media isotonic.
For the stability of the insulin preparations it is further advantageous to add one or more of the preservatives ordinarily employed for the liquids to be injected.
Methyl p-oxybenzoate and propyl p-oxybenzoate, as well as mercury-phenyl acetate, are examples of such preservatives.
A particularly advantageous embodiment of the process according to the invention consists in preparing a sterile and acidic aqueous solution of insulin and at least one of the metals mentioned and in mixing said solution with a basic aqueous solution containing a substance. -buffer, so as to adjust the pB of the mixture to approximately 7 and to precipitate the insulin in the amorphous state. In this way, the precipitation of the amorphous insulin is effected during the preparation itself, which communicates the physical properties most favorable to the amorphous insulin.
As the metallic compound, an organic or inorganic salt, such as chloride, sulfate, nitrate or acetate, or a hydroxide, oxide, or a complex metallic compound which, when added, will be in a state such as metal, can be employed. may react with amorphous insulin.
We can. use crystalline insulin as the starting material instead of amorphous insulin, but in this case it is essential that the insulin be first dissolved during the course of the process.
It is. preferable to use zinc as the metal intended to allow crystallization of insulin, and zinc is preferably used in an amount of 6 XAX 10-5 milliequivalents per r milliliter, A representing the number of international units of insulin per milliliter.
If solutions of the different starting products are used, in the implementation of the process according to the invention, the latter can be sterilized separately and be used as a base for obtaining different preparations. For example, the following starting solutions can be prepared:
Starting solution I: 2.18 grams of recrystallized insulin are dissolved in 23 milliliters of 0.1 n hydrochloric acid and distilled water is added to a volume of 125 milliliters.
Starting solution II: To 20 milliliters of an aqueous solution of zinc chloride containing 1 / o of zinc, distilled water is added to a volume of 125 milliliters.
Starting solution III: To 10 milliliters of an aqueous solution of nickel chloride containing 1 / o of nickel, distilled water is added to a volume of 100 milliliters.
Starting solution IV: 1.36 grams of sodium acetate are dissolved with 3 molecules of water of crystallization in distilled water to a volume of 100 milliliters.
Starting solution V: 3.58 grams of secondary sodium phosphate are dissolved with 12 molecules of water of crystallization in distilled water to a volume of 100 milliliters.
Example l:
1.3 milliliters of glycerin are mixed with 0.5 milliliters of an ouzo solution of methyl p-oxybenzoate in ethanol and 50 milliliters of distilled water are added. To the mixture obtained, after sterile filtration, 10 milliliters of the starting solution I, 2.5 milliliters of the starting solution II and 10 milliliters of the starting solution IV are added, after which 3.0 milliliters of hydroxide are added. 0.1N sterile sodium and the mixture is made up to 100 milliliters with sterile distilled water.
The insulin is precipitated in the amorphous state by the addition of sodium hydroxide and the precipitated amorphous insulin reacts chemically with the zinc in solution and fixes part of it. The suspension thus obtained has a pH of 7 and contains approximately one gamma of zinc per unit of insulin.
Example 2:
1.3 milliliters of glycerin are mixed with 0.5 milliliters of a 25/9 solution of methyl p-oxybenzoate in ethanol and 50 milliliters of distilled water are added to the resulting mixture. , after autoclaving, 10 milliliters of the starting solution I, 10 milliliters of the starting solution III and 10 milliliters of the starting solution V, after which 0.5 milliliters of 0.1 hydrochloric acid are added n sterile and the mixture is diluted to a volume of 100 milliliters with sterile distilled water. The insulin is precipitated in amorphous form by the addition of the starting solution V and the amorphous insulin thus precipitated fixes by reaction chemical part of the nickel contained in the aqueous medium.
The resulting amorphous insulin suspension has a pu of 7 and contains about 2.5 gamma nickel per unit of insulin.
Example 3:
174 milligrams of crystallized insulin are dissolved in 10 milliliters of 0.02 n HCl.
We then add the following solution:
1.3 milliliters of glycerin
0.5 milliliter of p-oxybenzoate solution
methyl at 25 "/ o in ethanol
8 milligrams of zinc (as
chloride)
more distilled water to a volume
total of 80 milliliters.
The mixture is sterilized, after which an autoclaved mixture consisting of:
3.0 milliliters of Na. OH 0.1 n
136 milligramWs of Na acetate, 3H20
more water to a total volume of
10 milliliters.
Insulin is precipitated in amorphous ton, reacts chemically with zinc in solution and fixes part of it. The amorphous insulin suspension thus prepared contains about 2 gamma zinc per unit of insulin and has a pg of 7.
Exeslpte-j:
174 milligrams of crystallized insulin were produced. Sean in 10 milliliters of 0.02 n HG1 containing 16 milligrams of Zn as chloride and the solution is filtered sterile.
A solution is then prepared containing:
136 milligrams of sodium acetate, 311 ,, 2O 1, 3 milliliter of glycerin
0.5 milliliter of p-oxybenzoate solution
methyl to. 25 "/ e in ethanol
3, 4 milliliters of 0.1 n NaOH
more water to a total volume of
90 milliliters.
This solution is also sterile filtered, after which the two sterile filtered solutions are mixed under aseptic conditions, so as to cause its precipitation of the insulin in amorphous form and the attachment to it by chemical reaction of part of the zinc present in solution.
The preparation thus obtained contains about 4 gamma of zinc per unit of insulin and its pg is. equal to 7.
Exernplc 5:
4000 units are suspended. s international amorphous insulin in 10 milliliters of a zinc chloride solution containing 0.16% Zn + 4. It is then dissolved by adding 10 milliliters to 0.1 n HCl.
We have. jon. te, as isot substanee. onie, 1.3 milliliters of glycerin and, as a preservative, 0.5 milliliters of an o / o solution of methanol poxybenzoate in ethanol. The mixture is then diluted to 90 milliliters with dp water and sterilized filtered, after which 10 milliliters of 0.1 n NaOH, autoclaved, containing 136 milligrams of Na 3 H 2 O acetate are added. Finally. the pu is brought to 6 avee 0.07 ml of sterile 1-NaOH. The addition of NaOH causes the precipitation of insulin in the amorphous state and the fixing by chemical reaction on the insulin of a part of the zinc in solution.
The preparation thus obtained contains approximately 4 gamma of zinc per unit of insulin.
Example 6:
4000 international units of sterile amorphous insulin are suspended in the suspension medium, sterilely filtered, indicated below:
S milligrams of zinc (as
chloride)
206 milligrams of diethyl barbiturate
sodium
1.3 milliliters of glycerin
0.5 milliliter of p-oxybenzoate solution
25 / o methyl in ethanol
6.5 milliliters of 0.1 n HCl
more water to a total volume of
100 milliliters.
By suspending the amorphous insulin, the latter reacts chemically with the zinc in solution and. fixes part of it.
The amorphous insulin suspension thus obtained has a µg of 7 and contains about 2 gamma zinc per unit of insulin.