DE1212679B

DE1212679B - Process for the preparation of insulin solutions

Info

Publication number: DE1212679B
Application number: DEN15365A
Authority: DE
Inventors: Jorgen Schlichtkrull
Original assignee: Novo Terapeutisk Laboratorium AS
Current assignee: Novo Terapeutisk Laboratorium AS
Priority date: 1957-08-03
Filing date: 1958-07-18
Publication date: 1966-03-17

Description

Verfahren zur Herstellung von Insulinlösungen - ,. Die vorliegende Erfindung betrifft ein. Verfahren zur Herstellung eines schnellwirkenden stabilen Insulinpräparates durch Auflösung von Insulin in einem wäßrigen injizierbaren Medium.Process for the preparation of insulin solutions -,. The present Invention relates to a. Method of making a fast-acting stable Insulin preparation by dissolving insulin in an aqueous injectable medium.

Von der sich auf die chemischen Eigenschaften des Insulins beziehenden Literatur ist es bekannt, daß Insulin bei seinem isoelektrischen Punkt (pH rund 5,5) in Wasser am schwersten löslich ist, und daß die Löslichkeit mit fallendem bzw. steigendem pH-Wert zunimmt. So ist es bekannt, daß Insulin bei einem pH-Wert von 2 bis 3 bzw. 7 bis 8 in Wasser löslich ist.From the one related to the chemical properties of insulin It is known from literature that insulin at its isoelectric point (pH around 5.5) is the least soluble in water, and that the solubility with decreasing or increasing pH value increases. So it is known that insulin is at a pH from 2 to 3 or 7 to 8 is soluble in water.

Die in der Therapie verwendeten Insulinlösungen sind indessen immer auf einem pH-Wert von 2,5 bis 3,5 eingestellt. Ein solcher pH-Wert wird beispielsweise sowohl in der englischen als auch in der amerikanischen Pharmacopea vorgeschrieben. Dies hängt damit zusammen, daß für therapeutische Zwecke eine langdauernde Stabilität der Insulinlösungen unbedingt erforderlich ist, und .daß man bisher der Ansicht war, daß Insulinlösungen bei einem pH-Wert von 3 zehnmal stabiler sind als bei pH 7,2.The insulin solutions used in therapy are, however, always adjusted to a pH of 2.5 to 3.5. Such a pH is, for example prescribed in both the English and American Pharmacopea. This is due to the fact that long-term stability for therapeutic purposes of insulin solutions is absolutely necessary, and that one has so far been of the opinion was that insulin solutions are ten times more stable at pH 3 than at pH 7.2.

Die vorliegende Erfindung beruht auf der neuen überraschenden Beobachtung,. daß es im Widerspruch zu der bisher alleinherrschenden Auffassung möglich ist, für therapeutische Zwecke verwendbare Insulinlösungen mit einem pH-Wert von 7 bis 8 und mit hegvorragender Stabilität herzustellen.The present invention is based on the new surprising observation. that it is possible for Insulin solutions suitable for therapeutic purposes with a pH value of 7 to 8 and to be produced with excellent stability.

Zu der Erfindung. führende Untersuchungen haben gezeigt, daß Rinderinsulinkristalle mit einem Zinkgehalt von 0,340/0 in einem wäßrigen Medium bei pH 7,0 ohne Zusatz von Zinkionen rekristallisiert werden können, während dies mit Schweineinsulinkristallen nicht möglich ist, weil das Schweineinsulin bei pH 7,0 in Lösung verbleibt. Es besteht mit anderen Worten ein großer Unterschied der Löslichkeit von Rinderinsulin und Schweineinsulin im wäßrxgen Medium bei neutraler Reaktion, was als völlig unerwartet betrachtet werden muß. Durch die Verwendung von Schweineinsulin eröffnet sich zum erstenmal die Möglichkeit, therapeutische Insulinlösungen mit dem- pH-Wert des Blutes und mit der erforderlichen Stabilität herzustellen.To the invention. leading research has shown that bovine insulin crystals with a zinc content of 0.340 / 0 in an aqueous medium at pH 7.0 without addition can be recrystallized from zinc ions, while this can be done with porcine insulin crystals is not possible because the pig insulin remains in solution at pH 7.0. It exists in other words, a big difference in the solubility of bovine insulin and Porcine insulin in an aqueous medium with a neutral reaction, which was completely unexpected must be considered. The use of pig insulin opens up to the For the first time the possibility of therapeutic insulin solutions with the pH value of the blood and with the required stability.

Im Einklang mit den obigen Erläuterungen kennzeichnet sich das mit dem Stand der Technik grundsätzlich brechende Verfahren nach der Erfindung durch die Verwendung von Schweineinsulin und Einstellung des pH-Wertes der Lösung auf 7 bis B.In line with the explanations above, this is marked with the prior art fundamentally breaking method according to the invention the use of porcine insulin and adjustment of the pH of the solution 7 to B.

Es wurde ferner gefunden, daß die Stabilität der Schweineinsulinlösungen selbst bei der Anwesenheit von Ionen der für die Kristallisation des Insulins erforderlichen Metalle, insbesondere Zink,. nicht beeinträchtigt wird, wenn der Gehalt der Lösungen, an diesen Metallionen weniger als 13 - A - 10-3 Milli. äquivalente pro Liter ist, wobei A die Anzahl der internationalen Einheiten von Insulin pro Kubikzentimeter angibt. Mit einer Insulinkonzentration von 40 internationalen Einheiten pro Kubikzentimeter bedeutet dies für Zink, daß die Schweineinsulinlösungen weniger als etwa 1,7 mg°/o an Zinkionen aufweisen sollen. Die Zulässigkeit solcher Zinkionenkonzentrationen war nicht zu erwarten, wenn man berücksichtigt, daß Rinderinsulin schon bei der Gegenwart von Zinkionen in einer Menge von 0,6 mg°/o bei einer Insulinkonzentration von 40 internationalen Einheiten pro Kubikzentimeter kristallisiert.It was also found that the stability of the porcine insulin solutions even in the presence of ions, those necessary for the crystallization of the insulin Metals, especially zinc. is not affected if the content of the solutions, of these metal ions less than 13 - A - 10-3 milli. equivalents per liter, where A is the number of international units of insulin per cubic centimeter indicates. With an insulin concentration of 40 international units per cubic centimeter For zinc this means that the porcine insulin solutions are less than about 1.7 mg% to have zinc ions. The permissibility of such zinc ion concentrations was not to be expected, considering that beef insulin was already used in the Presence of zinc ions in an amount of 0.6 mg% at an insulin concentration crystallized from 40 international units per cubic centimeter.

Die nach der Erfindung hergestellten Insulinpräparate zeigen selbst nach jahrelanger Aufbewahrung. keine Veränderung des physikalischen Zustandes und der biologischen Aktivität der Lösung. Insbesondere erfolgt keine Ausfällung des gelösten Insulins während der Aufbewahrung, selbst dann nicht, wenn in der Lösung Metallionen vorhanden sind, welche die Kristallisation des Insulins begünstigen.The insulin preparations produced according to the invention show themselves after years of storage. no change in the physical state and the biological activity of the solution. In particular, there is no precipitation of the dissolved insulin during storage, even if in solution Metal ions are present, which promote the crystallization of the insulin.

Zum Nachweis der unerwarteten Stabilität der erfindungsgemäß hergestellten Insulinlösungen wird auf die Zeichnung verwiesen, woraus hervorgeht, daß eine frisch hergestellte Lösung nach der Erfindung auf Kaninchen dieselbe Insulinwirkung ausübt wie die 22 Monate bei 4'C aufbewahrte Insulinlösung. Die geprüfte Insulinlösung hatte einem .pH-Wert von etwa 7 und enthielt iii 11 cm3: 40 Einheiten von gelöstem Schweineinsulin, 7,0 mg NaCl, `- _ - .- .-1 mg Nipagin, 1,4 mg CH.COONa,,3 H20. , _ Neben der unerwarteten Stabilität der erfindungsgemäß hergestellten Insulinlösungen weisen diese auch noch andere wesentliche Vorteile- auf.To demonstrate the unexpected stability of those produced according to the invention Insulin solutions are referred to the drawing, which shows that one fresh prepared solution according to the invention exerts the same insulin effect on rabbits how the insulin solution stored at 4'C for 22 months. The checked Insulin solution had a pH of about 7 and contained 11 cm3: 40 units of dissolved pig insulin, 7.0 mg NaCl, `- _ - .-. -1 mg nipagin, 1.4 mg CH.COONa ,, 3 H20. , _ In addition to the unexpected stability of the insulin solutions prepared according to the invention these also have other significant advantages.

Bei der Verwendung der Insulinlösungen bei der Schockbehandlung--in--der Psychiatrie reichen- ganz bedeutend kleinere Insuhnmengen aus, um die gewünschte Wirkung zu erzielen. Die Bedeutung dieser Tatsache bedarf--keiner näheren Erläuterung, denn bekanntlich ist Einspritzen von Insulin in nicht zuckerkranke Menschen infolge hypoglykämischer Erscheinungen immer-gefährlich. - -- - - -In vielen Fällen von Diabetes ist es für die gute Einstellung des Patienten mit so wenigen Injektionen pro Tag wie möglich- erwünscht, daß das verwendete Insulinpräparat nicht nur eine protahierte Wirkung, sondern auch eine ausgesprochene Initialwirkung entfaltet.When using insulin solutions in shock treatment - in - the Psychiatry suffice - significantly smaller amounts of money to get the desired To make an impact. The significance of this fact does not require any further explanation, because it is well known that insulin is injected into non-diabetic people hypoglycemic phenomena always dangerous. - - - - -In many cases of Diabetes it is for the good attitude of the patient with so few injections per day as possible - desirable that the insulin preparation used not just one protahed effect, but also a pronounced initial effect unfolds.

Die Depotinsuline weisen im allgemeinen eine für solche Fälle ausreichende- Initialwirkung nicht auf, weshalb Zumischung einer injizierbaren Insulinlösung Verwendung gefunden- hat. -Da die--meisten-Depot= insuhne den pH-Wert des Blutes haben, vertragen sich die .bisher- bekannten sauren. :Insulinlösungen nicht mit Depotinsnlnen.-'Es wär-deshälb erforderlich, die Zumischung in der Spritze Vorzunehmen. Däß dadurch ein Unsicherheitsfaktor eingeführt wird, dürfte klar sein.The depot insulins generally have a sufficient- Initial effect does not affect, which is why admixture of an injectable insulin solution is used has found. -As the - most-Depot = insuhne have the pH value of the blood, tolerated the previously known acidic. : Insulin solutions not with Depotinsnlnen .- 'It it would therefore be necessary to mix it in the syringe. That way an uncertainty factor is introduced should be clear.

Mittels . der nach der- Erfindung - hergestellten Insulinlösung wird es zum erstenmal möglich, Depotinsulin und Insulinlösung fabrikmäßig zu vermischen. Diese Vermischbarkeit der nach der Erfindung hergestellten Insulinlösüng mit Depotinsulin, insbesondere mit protahiert wirkenden Insülinkristallsuspensionen mit niedrigem Gehalt an für die Kristallisation des Insulins erforderlichen Metallen, stellt einen erheblichen Fortschritt dar.Means. according to the invention - produced insulin solution it is possible for the first time to mix depot insulin and insulin solution in the factory. This miscibility of the insulin solution prepared according to the invention with depot insulin, especially with protahed insulin crystal suspensions with low The content of metals required for the crystallization of insulin represents a significant progress.

Es ist bekannt, bei der Herstellung von aus einer wäßrigen Suspension einer Insulinausfällung bestehenden Präparaten mit neutraler Reaktion und verzögerter Wirkung zur Aufrechterhaltung der neutralen Reaktion eine Puffersubstanz zu verwenden. Als Puffersubstanzen können beispielsweise Phosphat-, G`itrat-, Azetat-, Borat-, Maleat-, Diäthylbarbiturat-und Glycinpuffer verwendet werden. Mich ist es bekannt, daß einzelne dieser Puffersubstanzen Ionen der für die Kristallisation des Insulins erforderlichen Metalle, wie Zink, derart binden, daß die Löslichkeit des Insulins bei neutraler Reaktion nicht verringert wird. So werden die Ionen all dieser Metalle beispielsweise durch Citratpuffer komplex gebunden.It is known in the manufacture of from an aqueous suspension insulin precipitation with neutral and delayed reactions Effect of using a buffer substance to maintain the neutral reaction. Phosphate, nitrate, acetate, borate, Maleate, diethyl barbiturate and glycine buffers can be used. I know that some of these buffer substances ions are responsible for the crystallization of the insulin necessary metals, such as zinc, bind in such a way that the solubility of the insulin is not reduced in the case of a neutral reaction. So are the ions of all these metals for example bound in complex by citrate buffer.

Wenn man beim Verfahren der Erfindung eine Zusetzung einer Lösung der erwähnten Metalle verwendet, ist die zulässige Menge davon von der gewählten Puffersubstanz abhängig. Bei der Verwendung von Citrat- oder Phosphatpuffer sind somit viel größere Zinkmengen zulässig, als wenn eine andere, das Zink bei - neutraler Reaktion nichtbindende Puffersubstanz gebraucht wird. Im Hinblick auf die Stabilität der_ Insulinlösung bei' -läügerer Aufbewahrung richtet - sich` die .obere Grenze für den Gehalt .an-den genannten Metallen in der Insulinlösung nach dem pH-Wert und der Aufbewahrungstemperatur der Lösung. Je höher der Metallgehalt' und je niedriger die. Aufbewahrungstemperatur ist, desto höher muß -der pH-Wert der Lösung sein, um letztere auch bei langer Aufbewahrung stabil zu. erhalten. , Die folgenden Ausführungsbeispiele dienen zur weiteren Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens.If in the method of the invention an addition of a solution of the metals mentioned is used, the allowable amount thereof depends on the one chosen Buffer substance dependent. When using citrate or phosphate buffers are thus much larger amounts of zinc are permitted than if another, the zinc at - more neutral Reaction non-binding buffer substance is needed. In terms of stability der_ insulin solution for `` longer storage is set '' - the upper limit is set for the content of the mentioned metals in the insulin solution according to the pH value and the storage temperature of the solution. The higher the metal content and the lower the. The storage temperature, the higher the pH value of the solution must be, to keep the latter stable even when stored for a long time. obtain. , The following embodiments serve to further explain the method according to the invention.

Beispiel 1 1,74 g (40 000 internationale Einheiten) amorphen, zinkfreien Schweineinsulins werden in 500 cm3 Wasser, das 2 cm3 1 n-HCl, 50 g Glukose und 2 g Phenol enthält, gelöst. Die Lösung wird steril gefiltert, mit 1 n-NaOH auf einen pH-Wert von 7,6 eingestellt und mit sterilem Wasser auf 1000 cm3 verdünnt.Example 1 1.74 g (40,000 international units) amorphous, zinc-free Pig insulin is dissolved in 500 cm3 of water, the 2 cm3 of 1 n-HCl, 50 g of glucose and 2 g of phenol, dissolved. The solution is filtered sterile, with 1N NaOH on one Adjusted pH to 7.6 and diluted to 1000 cm3 with sterile water.

-.Beispiel 2 1,74 g (40 000 internationale Einheiten) kristallinen Schweineinsulins, das etwa 0,4 °/o Zink enthält, werden in 500 cm3 Wasser; das 2 cm3 1 n-HCI, 50 g Glukose und -1 g p-Oxybenzoesäuremethylester enthält, gelöst. Die Lösung wird steril gefiltert und mit 500 cm3 einer sterilen Lösung - von 0,Ö2molarem Natriumpliosphat neutralisiert (pH.=.7,5). -Wenn erforderlich, wird der pH der Mischung mit 1 ri-NaOH auf einen pH von 7,3 bis 7,5 eingestellt.- Example 2 1.74 g (40,000 international units) crystalline Pig insulin, which contains about 0.4% zinc, is dissolved in 500 cm3 of water; the 2nd cm3 contains 1 n-HCl, 50 g glucose and -1 g p-oxybenzoic acid methyl ester, dissolved. The solution is filtered sterile and with 500 cm3 of a sterile solution - from 0, Ö2molarem Sodium phosphate neutralized (pH = 7.5). -If necessary, adjust the pH of the mixture adjusted to a pH of 7.3 to 7.5 with 1 ri-NaOH.

Beispiel 3- ' 1,74 g (40 000 internationale Einheiten) etwa 0,7 °/o Zink enthaltenden kristallinen Schweineinsulins werden in 400 cm3 Wasser, das 2 cm3 1 n-HCI und 1 g p-Oxybenzoesäuremethylester enthält, gelöst. Die Lösung wird steril gefiltert, und es werden 500 cm3 einer sterilen 0,02molaren Natriumazetatlbsung zugegeben, die 1,40/, NaCl enthält. Der pH-Wert wird mit 1 n-NaOH auf 7,3 bis 7,5 eingestellt und anschließend- die Lösung mit. sterilem Wasser auf 1000 cm3 verdünnt.Example 3- '1.74 g (40,000 international units) about 0.7% Crystalline pig insulin containing zinc is dissolved in 400 cm3 of water, the 2nd cm3 contains 1 n-HCl and 1 g p-oxybenzoic acid methyl ester, dissolved. The solution will be sterile filtered, and there are 500 cm3 of a sterile 0.02 molar sodium acetate solution added, which contains 1.40 /, NaCl. The pH is adjusted to 7.3 to 7.5 with 1N NaOH set and then- the solution with. sterile water diluted to 1000 cm3.

Bei all den vorgenannten Beispielen haben die erhaltenen Lösungen einen Insulingehalt von 40 internationalen Einheiten pro Kubikzentimeter. Man kann indessen auch Lösungen mit einer höheren Insulinkonzentration wie beispielsweise 80 internationale Einheiten pro Kubikzentimeter herstellen. Mit zunehmender Insulinkonzentration und übrigens derselben Zusammensetzung der Lösungen ist es zweckmäßig, einen höheren pH-Wert einzustellen, damit bei der Aufbewahrung mit Sicherheit kein Insulin aus den Lösungen ausfällt.In all of the above examples, the solutions obtained have an insulin content of 40 international units per cubic centimeter. One can however, also solutions with a higher insulin concentration such as Manufacture 80 international units per cubic centimeter. With increasing insulin concentration and besides the same composition of the solutions it is appropriate to use a higher Adjust the pH value so that no insulin runs out during storage the solutions fail.

Wie bereits vorstehend betont, hat der Gehalt der Lösungen an Zink und ähnlichen Metallen und die Art des gegebenenfalls verwendeten Puffers Einfluß auf die Löslichkeit des Schweineinsulins. Dies ist zu beachten, wenn höhere Insulinkonzentrationen verwendet werden.As already emphasized above, the content of the solutions is zinc and similar metals and the type of buffer used, if any, influence on the solubility of porcine insulin. This should be taken into account when using higher insulin concentrations be used.

Claims

Claim: Method for producing a fast-acting and stable insulin preparation by increasing Solution of insulin in one aqueous injectable medium, characterized by the use of porcine insulin and adjusting the pH of the solution to 7 to B.

Considered publications: British Patent Nos. 708,888, 709,927; French Patent No. 1054122; V i n c k e, »Presentation of hormone preparations,«,

3rd edition, Leipzig 1955, p. 57 and 58.