Procédé de fabrication de préparations injectables d'insuline à effet prolongé
On connaît des préparations injectables d'insuline qui contiennent comme constituant actif de l'insuline protamine-zinc précipitée amorphe en suspension aqueuse (pH voisin de 7). Les préparations de ce genre, qui sont sur le marché, contiennent environ 2 mg de zinc et 8,5 ou 12,5 mg de protamine par mille unités internationales d'insuline, cette teneur en protamine étant notablement supérieure à la quantité de protamine nécessaire pour la précipitation de l'insuline. Cet excès a été considéré comme nécessaire jusqu'ici afin d'être certain qu'il n'y ait pas des quantités variables d'insuline présentes à l'état dissous, vu que ceci aboutirait à une variation de l'effet biologique des préparations.
Bien que ces préparations connues ayant un effet s'étendant sur plus de vingt-quatre heures aient été utilisées de façon intensive et qu'il ait été possible de réaliser un réglage utile dans de nombreux cas de diabète, on a constaté souvent que l'effet est plus prolongé qu'on ne le désire, si bien que le niveau de sucre dans le sang des diabétiques devient trop élevé pendant le jour et trop faible pendant la nuit. Dans des cas pareils, on a essayé de modifier l'effet des préparations en y adjoignant de l'insuline à l'état dissous.
Cette adjonction a été pratiquée industriellement de façon que les ampoules ou fioles contenant la suspension d'insuline zinc-protamine amorphe contiennent également de l'insuline à l'état dissous, ou encore on introduit l'insuline dissoute dans des ampoules séparées de façon à l'administrer avec la seringue d'injection conjointement avec la suspension d'insuline protamine-zinc. Le rapport de mélange le plus communément en usage était de 2 volumes d'insuline dissoute pour un volume de suspension d'insuline protamine-zinc, ce qui permettait d'obtenir un effet pendant 18 à 24 heures.
Toutefois, les préparations produites par mélange industriel ne montrent pas la stabilité chimique et biologique nécessaire lorsqu'elles sont entreposées pendant une durée prolongée, tandis que l'adjonction de l'insuline dissoute à la suspension d'insuline zinc-protamine dans la seringue d'injection. est trop facilement la cause d'erreurs dans le dosage quand cette opération est exécutée par les patients euxmêmes.
On a alors essayé d'obtenir l'effet modifié souhaité en produisant des suspensions d'insuline protamine-zinc précipitée amorphe sans un excès de protamine, mais, de cette façon, il n'était pas possible d'obtenir des préparations qui demeurent stables pendant une durée suf fisante.
Le but du présent procédé est de permettre la fabrication de suspensions d'insuline protamine-zinc précipftée amorphe sans excès de protamine mais présentant toutefois néanmoins une stabilité suffisante pour permettre leur conservation pendant un certain temps.
La présente invention a pour objet un procédé de fabrication de préparations injectables d'insuline à effet prolongé, contenant comme constituant actif principal de l'insuline protamine-zinc précipitée amorphe en suspension aqueuse.
Dans ce procédé, un milieu aqueux contenant une protamine, de l'insuline et des ions zinc ainsi que des substances auxiliaires, est amené à un pH de 6 à 8 de façon à former par réaction chimique partiellement entre l'insuline et la protamine, d'une part, et partiellement entre l'insuline et les ions zinc, d'autre part, une suspension stérile d'insuline protamine-zinc précipitée amorphe.
Ce procédé est caractérisé en ce que les proportions de protamine et de zinc utilisées sont respectivement au plus 7,5 mg et au moins t/4 de mg par 1000 unités internationales d'insuline et en ce qu'on utilise des substances auxiliaires telles qu'elles ne puissent pas, dans les conditions de la réaction, se combiner au zinc et empêcher ainsi l'insuline qui n'a pas réagi chimiquement avec la protamine de réagir chimiquement avec le zinc pour former un composé insoluble.
Comme substances auxiliaires, on utilise en général des substances-tampons, un composé isotonique, un agent de conservation ou des substances correctrices de pH.
On utilisera de préférence 1 à 5 mg de zinc par mille unités internationales d'insuline, quoique des proportions de zinc beaucoup plus considérables puissent être utilisées. Ainsi, on peut très bien employer une addition de zinc de 20 mg ou plus par mille unités internationales d'insuline pourvu que la quantité de zinc ajoutée ne soit pas grande au point de déterminer des réactions indésirables, notamment des douleurs à l'emplacement de l'injection. En ce qui concerne la protamine, on en utilisera de préférence 2 à 5 mg par 1000 unités internationales d'insuline.
Les tampons acétate, barbital, borate et maléate conviennent bien au cas où l'on effectue une addition de substances-tampons. Par contre, le tampon citrate ne convient pas, étant donné que les ions citrate forment des composés complexes avec le zinc.
Grâce à la présente invention, il devient possible non seulement de produire des préparations à base d'insuline protamine-zinc précipitée amorphe, avec effet utile pendant 18 à 24 heures qui ont fait l'objet de recherches pendant de si nombreuses années, mais il devient également possible de graduer l'effet vers le bas à volonté en réduisant la teneur en protamine des préparations, sans affecter leur stabilité, vu que le zinc présent assurera la stabilité. Rien que pour cette raison, la présente invention implique un progrès considérable parce qu'elle offre la possibilité de réaliser une application clinique plus étendue des préparations d'insuline basées sur l'insuline protamine-zinc précipitée amorphe, recherchée vainement depuis si longtemps.
Comme composé de zinc, on peut utiliser un sel minéral ou organique comme le chlorure, le sulfate, le nitrate ou l'acétate, l'hydroxyde ou l'oxyde.
Comme exemples de protamines appropriées, on a la salmiridine, la clupéine, la scombrine, la sturine, la thymine, la cyprimine et la cycloptérine, qui sont utilisées de préférence sous la forme de solutions aqueuses de sels avec des acides minéraux ou organiques.
Suivant un mode de mise en oeuvre préféré du procédé, on mélange une solution acide d'insuline, une solution de protamine, un composé du zinc et des substances auxiliaires, sauf la substance-tampon, après quoi le mélange est stérilisé et ensuite additionné dans des conditions aseptiques d'une solution stérilisée de la substance-tampon pour en ajuster le pH à une valeur comprise entre 6 et 8, ce qui a pour effet de provoquer la précipitation sous forme amorphe d'insuline protamine-zinc.
L'insuline est à même de se combiner avec des quantités variables de zinc. Par conséquent, il est également possible d'employer de l'insuline avec une teneur en zinc telle que la teneur en ions zinc du milieu aqueux provienne de cette insuline.
En vue de produire l'isotonicité, on peut employer des substances telles que le glucose, le chlorure de sodium et le glycérol. Comme exemples d'agents de conservation appropriés, on a le p-oxybenzoate de méthyle, le p-oxybenzoate de propyle et le phényl-mercuri-acétate.
Les exemples ci-dessous montrent différents modes de réalisation de l'invention.
On y a utilisé les solutions de base stériles suivantes
Solution de base 1 :
On dissout 2,2 g d'insuline recristallisée
dans 25 cm3 d'acide chlorhydrique 0,1 N,
et l'on ajoute de l'eau distillée pour ob
tenir un volume de 125 cms.
Solution de base 2
On dissout 500 mg de sulfate de salmiridine
dans de l'eau jusqu'à un volume de
100 cm3.
Solution de base 3
A 20 cm3 d'une solution aqueuse de chlo
rure de zinc contenant 1 /o de zinc, on
ajoute de l'eau distillée pour obtenir un
volume de 125 cm3.
Solution de base 4
On dissout 1,36 g d'acétate de sodium, cris
tallisé avec 3 molécules d'eau, dans de
l'eau distillée pour obtenir un volume de
100 cm3.
Solution de base 5
On dissout 1,16 g d'acide maléique dans de
l'eau distillée pour obtenir un volume de
100 cm3.
Solution de base 6:
On dissout 2,06 g de barbital de sodium
dans de l'eau distillée pour obtenir un
volume de 100 cm3.
Solution de base 7 :
On dissout 0,95 g de borax dans de l'eau
distillée pour obtenir un volume de
100 cm3.
Exemple 1
On mélange 1,3 cm3 de glycérol avec 0,5 cm3 d'une solution à 25 25 /o de p-oxyben- zoate de méthyle dans de l'éthanol, puis on ajoute une quantité d'eau distillée de 50 cm3.
Au mélange ainsi obtenu on ajoute, après filtration stérile, 10 cm3 de solution de base (1), 1 cm3 de solution de base (2), 2,5 cm3 de solution de base (3) et 10 cm3 de solution de base (4), après quoi on ajoute-3,0 cm3 de NaOH 0, 1 N stérile et l'on complète le mélange avec de l'eau distillée stérile jusqu'à un volume de 100 cm3.
Par l'addition de NaOH, l'insuline zincprotamine est précipitée à l'état amorphe et la suspension obtenue montrera une valeur de pH de 7. Elle contient environ 1 mg de zinc et 1,25 mg de protamine par 1000 unités internationales d'insuline.
Exemple 2
Le procédé est le même que dans l'exemple 1, mais toutefois on utilise une quantité double des solutions de base (2) et (3), le résultat étant que la suspension produite contiendra environ 2 mg de zinc et 2,5 mg de protamine par 1000 unités internationales d'insuline.
Exemple 3
Le procédé est le même que dans l'exem- ple 2, mais on emploie toutefois le double de la quantité (4 cm3) de solution de base (2), le résultat étant que la suspension finale contiendra environ 2 mg de zinc et 5 mg de protamine par 1000 unités internationales d'insuline.
Exemple 4
Le procédé est le même que dans l'exemple 3, sauf qu'on emploie 20 cm3 au lieu de 5 cm3 de solution de base (3). La suspension finale contiendra alors 8 mg de zinc et 5 mg de protamine par 1000 unités internationales d'insuline.
Exemple 5
Le procédé est le même que dans l'exemple 3, sauf qu'on emploie 6 cm3 de solution de base (2). La suspension finale contiendra alors 2 mg de zinc et 7,5 mg de protamine par 1000 unités internationales d'insuline.
Exemple 6
On mélange 1,3 cm3 de glycérol avec 0,5 cm3 d'une solution à 25 o/o de p-oxybenzoate de méthyle dans de l'éthanol, puis on ajoute 50 cm3 d'eau distillée. Au mélange ainsi obtenu, on ajoute, après filtration stérile, 10 cm3 de solution de base (1), 5 cm3 de solution de base (3), 4 cm3 de solution de base (2) et 10 cm3 de solution de base (5), après quoi on ajoute 21,5 cm3 de NaOH, 0, 1 N stérile, puis on dilue le mélange avec de l'eau jusqu'à un volume de 100 cm3. La suspension obtenue d'insuline protamine-zinc amorphe a une valeur de pH de 7 et elle contient environ 2 mg de zinc et 5 mg de protamine par 1000 unités internationales d'insuline.
Exemple 7
Le procédé est le même que dans l'exemple 6, sauf qu'on utilise 10 cm3 de solution de base (6) au lieu de 10 cm3 de solution de base (5), en outre on utilise 4,5 cm3 de HC1 0, 1 N stérile au lieu de 21,5 cma de NaOH 0,1 N. La suspension obtenue contiendra 2 mg de zinc et 5 mg de protamine par 1000 unités internationales d'insuline et présentera un pH égal à 7.
Exemple 8
Le procédé est le même que dans l'exemple 7, sauf qu'on emploie 10 cm3 de solution de base (7) au lieu de 10 cm3 de solution de base (6) et qu'en outre on utilise 0,9 cm3 de
HCI 0, 1 N stérile au lieu de 4,5 cm3. La suspension obtenue présentera la même teneur en zinc et en protamine que celle obtenue à l'exemple 7 et aura un pH égal à 7.
Process for the production of injectable insulin preparations with a long-lasting effect
Insulin injectable preparations are known which contain as active constituent protamine-zinc insulin precipitated amorphous in aqueous suspension (pH close to 7). Preparations of this kind, which are on the market, contain about 2 mg of zinc and 8.5 or 12.5 mg of protamine per thousand international units of insulin, this protamine content being considerably greater than the quantity of protamine required. for the precipitation of insulin. This excess has been considered necessary heretofore in order to be certain that there are not varying amounts of insulin present in the dissolved state, as this would result in a variation in the biological effect of the preparations. .
Although these known preparations having an effect extending over more than twenty-four hours have been used extensively and it has been possible to achieve useful adjustment in many cases of diabetes, it has often been found that the effect is longer than desired, so the blood sugar level in diabetics becomes too high during the day and too low at night. In such cases, attempts have been made to modify the effect of the preparations by adding insulin in the dissolved state.
This addition has been practiced industrially so that the ampoules or vials containing the suspension of amorphous zinc-protamine insulin also contain insulin in the dissolved state, or else the dissolved insulin is introduced into separate ampoules so as to Administer it from the injection syringe together with the protamine-zinc insulin suspension. The most commonly used mixing ratio was 2 volumes of dissolved insulin to one volume of protamine-zinc insulin suspension, which provided an effect for 18 to 24 hours.
However, the preparations produced by industrial mixing do not show the necessary chemical and biological stability when stored for a prolonged period of time, while the addition of the dissolved insulin to the suspension of zinc-protamine insulin in the syringe d 'injection. is too easily the cause of errors in dosing when this operation is performed by the patients themselves.
Attempts were then made to achieve the desired modified effect by producing amorphous precipitated protamine-zinc insulin suspensions without excess protamine, but in this way it was not possible to obtain preparations which remain stable. for a sufficient period of time.
The aim of the present process is to allow the manufacture of amorphous precipitated protamine-zinc insulin suspensions without excess of protamine but nevertheless having sufficient stability to allow their storage for a certain time.
The present invention relates to a process for the manufacture of injectable insulin preparations with a long-lasting effect, containing as main active constituent protamine-zinc insulin precipitated amorphous in aqueous suspension.
In this process, an aqueous medium containing protamine, insulin and zinc ions as well as auxiliary substances is brought to a pH of 6 to 8 so as to form by chemical reaction partially between insulin and protamine, on the one hand, and partially between the insulin and the zinc ions, on the other hand, a sterile suspension of protamine-zinc insulin precipitated amorphous.
This process is characterized in that the proportions of protamine and zinc used are respectively at most 7.5 mg and at least t / 4 mg per 1000 international units of insulin and in that auxiliary substances such as they cannot, under the reaction conditions, combine with zinc and thus prevent insulin which has not chemically reacted with protamine from chemically reacting with zinc to form an insoluble compound.
As auxiliary substances, in general, buffer substances, an isotonic compound, a preservative or pH-correcting substances are used.
Preferably 1 to 5 mg of zinc per thousand international units of insulin will be used, although much larger proportions of zinc can be used. Thus, an addition of zinc of 20 mg or more per thousand international units of insulin can very well be employed, provided that the amount of zinc added is not so great as to cause undesirable reactions, in particular pain at the site of the insulin. injection. As regards protamine, preferably 2 to 5 mg will be used per 1000 international units of insulin.
Acetate, barbital, borate and maleate buffers are well suited for the case of adding buffer substances. On the other hand, citrate buffer is not suitable, since citrate ions form complex compounds with zinc.
With the present invention, it becomes possible not only to produce amorphous precipitated protamine-zinc insulin preparations, with useful effect for 18-24 hours which have been researched for so many years, but also also becomes possible to scale the effect down at will by reducing the protamine content of the preparations, without affecting their stability, since the zinc present will ensure the stability. For this reason alone, the present invention involves a considerable progress because it offers the possibility of realizing a more extensive clinical application of the insulin preparations based on the amorphous precipitated protamine-zinc insulin, sought in vain for so long.
As the zinc compound, an inorganic or organic salt such as chloride, sulfate, nitrate or acetate, hydroxide or oxide can be used.
Examples of suitable protamines are salmiridin, clupeine, scombrin, sturine, thymine, cyprimin and cyclopterin, which are preferably used in the form of aqueous solutions of salts with inorganic or organic acids.
According to a preferred embodiment of the method, an acidic insulin solution, a protamine solution, a zinc compound and auxiliary substances, except the buffer substance, are mixed, after which the mixture is sterilized and then added to the mixture. aseptic conditions of a sterilized solution of the buffer substance to adjust the pH thereof to a value between 6 and 8, which has the effect of causing the precipitation in the amorphous form of protamine-zinc insulin.
Insulin is able to combine with varying amounts of zinc. Therefore, it is also possible to employ insulin with a zinc content such that the zinc ion content of the aqueous medium is derived from this insulin.
In order to produce isotonicity, substances such as glucose, sodium chloride and glycerol can be employed. Examples of suitable preservatives are methyl p-oxybenzoate, propyl p-oxybenzoate and phenyl-mercuri-acetate.
The examples below show different embodiments of the invention.
The following sterile stock solutions were used
Basic solution 1:
2.2 g of recrystallized insulin are dissolved
in 25 cm3 of 0.1 N hydrochloric acid,
and we add distilled water to ob
hold a volume of 125 cms.
Basic solution 2
500 mg of salmiridine sulfate are dissolved
in water up to a volume of
100 cm3.
Basic solution 3
At 20 cm3 of an aqueous solution of chlo
zinc ride containing 1 / o zinc, we
add distilled water to obtain a
volume of 125 cm3.
Basic solution 4
1.36 g of sodium acetate are dissolved, cris
tallized with 3 water molecules, in
distilled water to obtain a volume of
100 cm3.
Basic solution 5
1.16 g of maleic acid are dissolved in
distilled water to obtain a volume of
100 cm3.
Basic solution 6:
2.06 g of sodium barbital are dissolved
in distilled water to obtain a
volume of 100 cm3.
Basic solution 7:
0.95 g of borax are dissolved in water
distilled to obtain a volume of
100 cm3.
Example 1
1.3 cm3 of glycerol are mixed with 0.5 cm3 of a 25% solution of methyl p-oxybenzoate in ethanol, then a quantity of distilled water of 50 cm3 is added.
To the mixture thus obtained is added, after sterile filtration, 10 cm3 of base solution (1), 1 cm3 of base solution (2), 2.5 cm3 of base solution (3) and 10 cm3 of base solution ( 4), after which 3.0 cm3 of sterile 0.1N NaOH is added and the mixture is made up with sterile distilled water to a volume of 100 cm3.
By the addition of NaOH, zincprotamine insulin is precipitated in an amorphous state and the resulting suspension will show a pH value of 7. It contains approximately 1 mg of zinc and 1.25 mg of protamine per 1000 international units of insulin.
Example 2
The process is the same as in Example 1, but however double the amount of the base solutions (2) and (3) is used, the result being that the suspension produced will contain approximately 2 mg of zinc and 2.5 mg of protamine per 1000 international units of insulin.
Example 3
The procedure is the same as in Example 2, but however double the amount (4 cm3) of stock solution (2) is used, the result being that the final suspension will contain approximately 2 mg of zinc and 5 mg. mg of protamine per 1000 international units of insulin.
Example 4
The process is the same as in Example 3, except that 20 cm3 is used instead of 5 cm3 of stock solution (3). The final suspension will then contain 8 mg of zinc and 5 mg of protamine per 1000 international units of insulin.
Example 5
The process is the same as in Example 3, except that 6 cm3 of stock solution (2) is used. The final suspension will then contain 2 mg of zinc and 7.5 mg of protamine per 1000 international units of insulin.
Example 6
1.3 cm3 of glycerol are mixed with 0.5 cm3 of a 25 o / o solution of methyl p-oxybenzoate in ethanol, then 50 cm3 of distilled water are added. To the mixture thus obtained, one adds, after sterile filtration, 10 cm3 of base solution (1), 5 cm3 of base solution (3), 4 cm3 of base solution (2) and 10 cm3 of base solution (5 ), after which 21.5 cm3 of sterile 0.1N NaOH, 0.1N is added, then the mixture is diluted with water to a volume of 100 cm3. The resulting suspension of amorphous protamine-zinc insulin has a pH value of 7 and it contains approximately 2 mg of zinc and 5 mg of protamine per 1000 international units of insulin.
Example 7
The process is the same as in Example 6, except that 10 cm3 of base solution (6) is used instead of 10 cm3 of base solution (5), in addition 4.5 cm3 of HCl 0 are used. , Sterile 1 N instead of 21.5 cma of 0.1 N NaOH. The suspension obtained will contain 2 mg of zinc and 5 mg of protamine per 1000 international units of insulin and will have a pH equal to 7.
Example 8
The process is the same as in Example 7, except that 10 cm3 of stock solution (7) is used instead of 10 cm3 of stock solution (6) and that in addition 0.9 cm3 of
HCl 0.1 N sterile instead of 4.5 cm3. The suspension obtained will have the same zinc and protamine content as that obtained in Example 7 and will have a pH equal to 7.