Procédé d'obtention du chlorhydrate de chlortétracycline
Le présent brevet additionnel concerne, comme le brevet principal No 303460, l'extraction du chlorhydrate de chlortétracycline à partir des moûts de fermentation de Streptomyces Aureofaciens. La chlortétracycline, substance antibiotique connue également sous la marque Auréomycine , est un dérivé naphthacénique à savoir la chloro-7-diméthylamino 4-octahydro-l, 4, 4a, 5, 5a, 6, 11, 12a-pentahydroxy-3, 6, 10, 12, 12a-méthyl-6-dioxo-l, 1 l-naphtacène-carboxamide-2 ou une forme tau tomère. L'invention a pour but de séparer la chlortétracycline des impuretés contenues dans le moût de fermentation.
Ainsi qu'il est connu, l'une des grosses diffi cultés rencontrées dans la production commerciale des antibiotiques, tels que la chlortétracycline, par des procédés de fermentation, réside dans l'extraction de la substance active à partir du milieu de culture (moût de fermentation) dans lequel elle a pris naissance. A cet égard il est connu d'alcaliniser le milieu de culture de façon à former un précipité, ou gâteau (dû à la présence dans le milieu de culture d'ions solubles de métaux alcalino-terreux, par exemple calcium, baryum, strontium ou magnésium utilisés comme constituants du milieu nutritif pour le champignon), de séparer ce précipité de la liqueur surnageante et d'extraire le précipité au moyen d'un solvant.
Dans le brevet principal, on a décrit, pour effectuer une telle extraction, un nouveau procédé qui présente des avantages sur les modes opératoires antérieurement connus. Ce procédé comporte les stades suivants: acidification à un pH d'environ 1,5 puis filtration du jus acide, traitement du filtrat pour en précipiter la chlortétracycline brute que l'on isole par filtration, puis traitement du gâteau alcalin de filtration par de l'isopropanol acidifié pour en extraire la chlortétracycline, salage de l'extrait isopropylique acide et concentration de la solution en présence d'éthoxyéthanol pour provoquer la cristallisation du chlorhydrate de chlortétracycline.
Le stade préliminaire d'acidification et de clarification est essentiel dans ce procédé et a, sur le procédé qui comporte l'alcalinisation directe du milieu de culture et le traitement du précipité résultant au moyen du solvant choisi, l'avantage d'une plus grande économie dans l'emploi du solvant et d'un plus grand degré de pureté dans l'extrait.
Le présent brevet additionnel a pour objet un procédé d'extraction sous forme de son chlorhydrate de la chlortétracycline présente dans un milieu de culture liquide résultant de la croissance de Streptomyces Aureofaciens, caractérisé en ce qu'on acidifie le jus de fermentation à un pH d'environ 1,5, on filtre le jus acide, puis on alcalinise le filtrat pour en préci piter la chlortétracycline brute, laquelle est isolée par filtration, en ce qu'on traite le gâteau alcalin de filtration par du propanol normal acidifié pour en extraire la chlortétracycline, on sale l'extrait propylique acide, puis on retire le chlorhydrate de chlortétracycline de la solution dans le propanol normal, en concentrant cette dernière pour provoquer la cristallisation dudit chlorhydrate, en présence d'éthoxyéthanol.
Du fait de sa miscibilité à l'eau, le propanol normal mouille bien les solides pendant l'extraction initiale en l'absence de toute quantité substantielle de chlorure minéral; après l'addition du chlorure à l'extrait alcoolique clarifié, néanmoins, l'eau qui se trouve dans l'extrait se sépare sous forme d'une couche aqueuse, qui contient la totalité des impuretés solubles dans l'eau, la chlortétracycline restant dans la couche de solvant. Avec un seul solvant par conséquent, on obtient le double avantage d'une extraction aqueuse et d'une extraction par solvant.
La nature de l'acide employé dans le stade préliminaire d'acidification n'a vraisemblablement pas d'importance critique, mais, pour des raisons de commodité et d'économie, on emploie de préférence des acides minéraux tels que l'acide sulfurique, l'acide chlorhydrique ou l'acide phosphorique. La quantité et la concentration de l'acide doivent être telles qu'on obtient un pH d'environ 1,5. L'acidification du solvant d'extraction se fait de préférence au même pH.
Dans le traitement du milieu clarifié au moyen d'un alcali, le pH du milieu est amené de préférence entre 7 et 9. Comme alcalis convenables, on peut citer par exemple la soude caustique, le carbonate de sodium et l'ammoniaque.
On peut utiliser des températures d'extraction comprises entre 0 et 600. ll est préférable d'opérer à température ordinaire, c'est-à-dire à une température de l'ordre de 200. La quantité de solvant d'extraction peut varier dans d'assez larges limites, mais, de préférence, le poids d'alcool choisi est approximativement celui du précipité à extraire.
On isole la chlorotétracycline sous forme de son chlorhydrate, et on a trouvé que ceci peut être réalisé avec l'élimination simultanée d'une grande quantité d'eau et d'impuretés avant l'isolement final du chlorhydrate, en ajoutant à l'extrait alcoolique un chlorure minéral soluble dans l'eau et relativement insoluble dans l'alcool d'extraction. Un tel chlorure est par exemple le chlorure de sodium ou le chlorure d'ammonium. Par addition du chlorure, l'extrait se sépare en une phase aqueuse et une phase alcoolique, cette dernière étant alors séparée, par exemple par décantation, puis, après concentration à un volume substantiellement plus faible, on laisse cristalliser le chlorhydrate de chlorotétracycline. La cristallisation est effectuée en présence d'éthoxy-2 éthanol.
L'exemple suivant montre comment l'invention peut être mise en pratique.
Exemple
30 litres d'un milieu de culture contenant 960 unités de chlortétracycline par cm3 sont acidifiés à un pH de 1,5 au moyen d'acide sulfurique à 25 %. On ajoute 0,5 kg de Supercel Hyflo et on filtre la solution. Le précipité est lavé à plusieurs reprises avec 15 litres d'eau acidifiée à un pH 2. Le filtrat et les lavages sont réunis et on ajoute une solution à 10 % de soude caustique jusqu'à obtenir un pH compris entre 8 et 9. On ajoute 250 g de Supercel
Hyflo , filtre la solution et lave le précipité avec 3 litres d'eau.
Le gâteau alcalin résultant est mis en suspension dans 1,5 litre de propanol normal et on ajoute à la suspension une quantité d'acide sulfurique à 25 % suffisante pour obtenir un pH de 1,5. Après agitation et filtration de la suspension, le précipité est lavé avec 1 litre de propanol normal à 70 %. A la solution obtenue, on ajoute, en agitant, 0,4 kg de chlorure de sodium.
On laisse reposer la solution et sépare par décantation les deux couches qui se sont formées. La couche aqueuse est extraite à nouveau avec 0,5 litre de propanol, puis on filtre les deux extraits propanoliques.
Après addition de 0,3 litre d'éthoxyéthanol, le filtrat est concentré dans le vide à une température d'environ 350, jusqu'à ce que le volume soit devenu environ 0,2 litre. Après cristallisation, la bouillie résultante est filtrée et lavée avec 20 cm3 d'éthoxyéthanol à 80 % et 20 cm3 d'eau. Le produit brut obtenu est mis en suspension dans 50 cm3 d'eau, puis filtré. L'opération est recommencée et le résidu est finalement lavé au moyen de 20 cm3 d'éthanol. Le produit est séché dans le vide (2 mm de pression) à 400. On obtient ainsi 20 g de chlorhydrate de chlortétracycline titrant 980 y par milligramme.
Process for obtaining chlortetracycline hydrochloride
This additional patent relates, like main patent No. 303460, to the extraction of chlortetracycline hydrochloride from the fermentation musts of Streptomyces Aureofaciens. Chlortetracycline, an antibiotic substance also known under the brand name Aureomycin, is a naphthacenic derivative, namely chloro-7-dimethylamino 4-octahydro-l, 4, 4a, 5, 5a, 6, 11, 12a-pentahydroxy-3, 6, 10, 12, 12a-methyl-6-dioxo-1,1,1-naphtacene-carboxamide-2 or a tau-tomeric form. The object of the invention is to separate chlortetracycline from the impurities contained in the fermentation must.
As is known, one of the great difficulties encountered in the commercial production of antibiotics, such as chlortetracycline, by fermentation processes, lies in the extraction of the active substance from the culture medium (must fermentation) in which it originated. In this regard, it is known to alkalinize the culture medium so as to form a precipitate, or cake (due to the presence in the culture medium of soluble ions of alkaline earth metals, for example calcium, barium, strontium or magnesium used as constituents of the nutrient medium for the fungus), to separate this precipitate from the supernatant liquor and to extract the precipitate by means of a solvent.
In the main patent, a new process has been described for carrying out such an extraction, which has advantages over the previously known procedures. This process comprises the following stages: acidification to a pH of about 1.5 then filtration of the acid juice, treatment of the filtrate to precipitate the crude chlortetracycline therefrom which is isolated by filtration, then treatment of the alkaline filter cake with acidified isopropanol to extract the chlortetracycline therefrom, salting of the acidic isopropyl extract and concentration of the solution in the presence of ethoxyethanol to cause crystallization of the chlortetracycline hydrochloride.
The preliminary stage of acidification and clarification is essential in this process and has, over the process which involves the direct alkalinization of the culture medium and the treatment of the resulting precipitate by means of the chosen solvent, the advantage of greater economy in the use of the solvent and a greater degree of purity in the extract.
The subject of the present additional patent is a process for extracting in the form of its hydrochloride from chlortetracycline present in a liquid culture medium resulting from the growth of Streptomyces Aureofaciens, characterized in that the fermentation juice is acidified to a pH of 'about 1.5, the acidic juice is filtered, then the filtrate is made alkaline to precipitate the crude chlortetracycline, which is isolated by filtration, in that the alkaline filter cake is treated with acidified normal propanol to extract therefrom. chlortetracycline, the acid propyl extract is salted, then chlortetracycline hydrochloride is removed from the solution in normal propanol, concentrating the latter to cause crystallization of said hydrochloride, in the presence of ethoxyethanol.
Due to its miscibility with water, normal propanol wets solids well during the initial extraction in the absence of any substantial amount of inorganic chloride; after the addition of the chloride to the clarified alcoholic extract, however, the water in the extract separates out as an aqueous layer, which contains all of the water-soluble impurities, with the remaining chlortetracycline in the solvent layer. With a single solvent, therefore, the dual advantage of aqueous extraction and solvent extraction is obtained.
The nature of the acid employed in the preliminary acidification stage is unlikely to be of critical importance, but for reasons of convenience and economy mineral acids such as sulfuric acid are preferably employed. hydrochloric acid or phosphoric acid. The amount and concentration of the acid should be such that a pH of about 1.5 is obtained. The acidification of the extraction solvent is preferably carried out at the same pH.
In the treatment of the clarified medium by means of an alkali, the pH of the medium is preferably brought to between 7 and 9. As suitable alkalis, there may be mentioned, for example, caustic soda, sodium carbonate and ammonia.
Extraction temperatures between 0 and 600 can be used. It is preferable to operate at room temperature, that is to say at a temperature of the order of 200. The amount of extraction solvent can vary. within fairly wide limits, but preferably the weight of alcohol chosen is approximately that of the precipitate to be extracted.
Chlorotetracycline is isolated as its hydrochloride, and it has been found that this can be achieved with the simultaneous removal of a large amount of water and impurities before the final isolation of the hydrochloride, adding to the extract alcoholic a mineral chloride soluble in water and relatively insoluble in the extraction alcohol. Such a chloride is, for example, sodium chloride or ammonium chloride. By adding the chloride, the extract separates into an aqueous phase and an alcoholic phase, the latter then being separated, for example by decantation, then, after concentration to a substantially smaller volume, the chlorotetracycline hydrochloride is allowed to crystallize. Crystallization is carried out in the presence of 2-ethoxyethanol.
The following example shows how the invention can be put into practice.
Example
30 liters of a culture medium containing 960 units of chlortetracycline per cm 3 are acidified to a pH of 1.5 using 25% sulfuric acid. 0.5 kg of Supercel Hyflo is added and the solution is filtered. The precipitate is washed several times with 15 liters of water acidified to pH 2. The filtrate and the washings are combined and a 10% solution of caustic soda is added until a pH of between 8 and 9 is obtained. add 250 g of Supercel
Hyflo, filter the solution and wash the precipitate with 3 liters of water.
The resulting alkaline cake is suspended in 1.5 liters of normal propanol and a quantity of 25% sulfuric acid sufficient to obtain a pH of 1.5 is added to the suspension. After stirring and filtration of the suspension, the precipitate is washed with 1 liter of normal 70% propanol. To the solution obtained, 0.4 kg of sodium chloride is added with stirring.
The solution is left to stand and the two layers which have formed are separated by decantation. The aqueous layer is extracted again with 0.5 liter of propanol, then the two propanol extracts are filtered.
After the addition of 0.3 liters of ethoxyethanol, the filtrate is concentrated in vacuo at a temperature of about 350, until the volume has become about 0.2 liters. After crystallization, the resulting slurry is filtered and washed with 20 cm3 of 80% ethoxyethanol and 20 cm3 of water. The crude product obtained is suspended in 50 cm3 of water and then filtered. The operation is restarted and the residue is finally washed with 20 cm3 of ethanol. The product is dried in a vacuum (2 mm pressure) at 400. 20 g of chlortetracycline hydrochloride are thus obtained, assaying 980 μ per milligram.