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La présente addition concerne, comme le brevet principal, la purification de la chlorotétracycline, substance antibiotique connue égale- ment sous la dénomination commerciale "Auréomycine" qui est, dans certains pays, une marque de fabrique de l'American Cyanamid Company. La chloroté- tracycline est un dérivé naphtacénique qu'on suppose être le diméthyl-amino-1 dioxo-4,6 chloro-10 méthyl-11 pentahydroxy-2,4a,5,7,11 octahydro-1,4,4a,6,
11,11a,12,12a naphtacène carboxamide-3 ou une forme tautomère et peut être obtenue par développement de Streptomyces Aureofaciens dans un milieu de fermentation convenable. En particulier, l'invention concerne un procédé pour séparer la chlorotétracycline des impuretés contenues dans le moût de fermentation.
Ainsi qu'il est connu, l'une des grosses difficultés rencontrées dans la production commerciale des antibiotiques, tels que la chlorotétra- cycline, par des procédés de fermentation, réside dans l'extraction de la substance active à partir du milieu de culture (moût de fermentation) dans lequel elle a près naissance. A cet égard il est connu d'alcaliniser le milieu de culture de façon à former un précipité, ou gâteau (dû à la pré- sence dans le milieu de culture d'ions solubles de métaux alcalino-terreux, par exemple calcium, baryum, strontium ou magnésium utilisés comme consti- tuants du milieu nutritif pour le champignon, de séparer ce précipité de la liqueur surnageante et d'extraire le précipité au moyen d'un solvant.
Dans le brevet principal on a décrit, pour effectuer une telle extraction, un nouveau procédé qui présente des avantages sur les modes opératoires antérieurement connus. Ce procédé comporte les stades suivants: acidification puis clarification du milieu de culture, traitement du milieu de culture au moyen d'un alcali pour former un précipité, séparation dudit précipité de la liqueur surnageante et extraction du précipité au moyen d'isopropanol acidifié. Le stade préliminaire d'acidification et de clarification est essentiel dans ce procédé et a, sur le procédé qui comporte l'alcalinisation directe du milieu de culture et le traitement du précipité résultant au moyen du solvant choisi, l'avantage d'une plus grande économie dans l'emploi du solvant et d'un plus grand degré de pureté dans l'extrait.
Selon la présente addition, l'extraction de la chlorotétracycline présente dans un milieu de culture liquide résultant de la croissance de Streptomyces Aureofaciens, est effectué en acidifiant tout d'abord, puis clarifiant ledit milieu de culture, ajoutant au milieu clarifié une quantité d'alcali suffisante pour amener le pH à une valeur comprise entre 6 et 10 d'où résulte un précipité, extrayant ce précipité au moyen de propanol normal acidifié, ou de butanol tertiaire acidifié, séparant l'insoluble de l'extrait alcoolique, ajoutant à l'extrait alcoolique clarifié un chlorure minéral (comme le chlorure de sodium) soluble dans l'eau, mais relativement insoluble dans le propanol normal ou le butanol tertiaire, en quantité suffisante pour former une phase aqueuse et une phase alcoolique,
séparant la phase alcoolique et traitant celle-ci pour en séparer le chlorhydrate de chlorotétracycline. Le propanol normal et le butanol tertiaire sont particulièrement appropriés au traitement selon l'addition. Du fait de leur miscibilité à l'eau ils mouillent bien les solides pendant l'extraction initiale en l'absence de toute quantité substantielle de chlorure minéral ; après l'addition du chlorure à l'extrait alcoolique clarifié, néanmoins, l'eau qui se trouve dans l'extrait se sépare sous forme d'une couche aqueuse, qui contient la totalité des impuretés solubles dans l'eau, la chlorotétracycline restant dans la couche de solvant. Avec un seul solvant. par conséquent, on obtient le double avantage d'une extraction aqueuse et d'une extraction par solvant.
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La nature ci:6 l'acide employé dans le stade rlüt.2?c11r d'acidification n'a vrais±LfJ,¯b] ement pas d'importance critique, nais, rour de.., raisons de commodité et ;'économie, en emploi de préférence des acides ;:ir'3'aU'?- tels que l'acide sulfurique, l'acide chicrhydrique ou l'acide phoR- -::.=-r:..:. Le:. quantit<:'; :.1; la concentration de l'acide doivent être telles o'j'cu obtient un rI i-nf 1 - à. 4 et, de préférence, inférieur à 2; le pH .jjli=.:-i ;-;t environ 1.5. Ce qui Yrëcède est valable également pour l'aciaii2..#l;io:# 1":. solvant .'¯a-¯xctiars.
1)Qns le trai tE':!1'.'.':ll";; du milieu clarifié au moyen d'un alcali, le vi u mll -;, izt amené <te préférence entre 7 et 9. Comme alcalis ccnve- 1- - on peut citer par e:.;àx.=1e la souae caustique, le carbonate de sodium 3-r; ::..;"3.r:r:(,niBq:169 On peut utiliser des températures d'extraction comprises entre
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. 2t 6Cc. Il est préférable d'opérer à température ordinaire, c'est à aire 1 .mie t5r,:! 8::-'. ture de l'ordre de 20 . A la température préférée, le butancl t0rti':.Í: {-: est un solide et e:ar e=1 conséquence employé sous forme de 'L31ange avec une petite quanTité d'eau, par exemple 10--' en poids, de façon " obtenir un milieu solvant sati5faisant. La quantité de solvant d'extractioK. peut varier dans d'assez larges limites, mais, de préférence, le poids '.'alcool choisi est approxinativenent celui du précipité à extraire.
Il est préférable d'isoler la chlorotétracycline sous forme de son chlorhydrate, et on a trouvé que ceci peut être réalisé avec l'élimina- tion simultanée d'une grande quantité d'eau et d'impuretés avant l'isolement final du chlorhydrate, en ajoutant l'extrait alcoolique un chlorure minéral soluble dans l'eau et relativement insoluble dans l'alcool d'ex- traction. Un tel chlorure est par exemple le chlorure de sodium ou le chlo- rure d'ammonium.
Par addition du chlorure, l'extrait se sépare en une pha- @e aqueuse et une phase alcoolique, cette dernière étant alors séparée, par exemple par décantation, puis, après concentration à un volume substan- tiellement plus faible. on laisse cristalliser le chlorhydrate de chlorotétracycline. De préférence, la cristallisation est effectuée en présence
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. ' thoxy 2 éthanol. Les exemples suivants montrent consent l'invention reut être
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mise en 'or.t.c:vû9 EXtFLE , ¯ 30 litres d'un milieu de culture contenant 960 unités de chlorot;ze:-4-,iacycline par cm3 sont acidifies à un TH de 1,5 au moyen d'acide sul- .:'urique à 25'.. On ajoute C, 5 g cle Supercel Xyflo et on fi7 tre la solution.
1:# pr4cicité c:st 1*vé l- plusieurs reprises avec 15 litres d'eau acidifiée 2 tm DR 2. Le filtra.! et les lavages sont réunis et on ajoute une solution w ::.O;. de soud<= caustique jusou's obtenir un pH compris entre 8 et 9. con -i;ute 250 g de Supercel Hyflo, filtre la solution et lave le précipité :..c 3 litres d'6a.
Le gâteau aLcaLin résultant est mis en suspension dans 1,5 litrie de prJfa=1ok normal et on ajouta h la suspension une quantité d'acide 'jlfurique à 25âa suffisante 'cur obtenir un pH de 1,5. Après agitation t filtration de la suspension, le précipité est lavé avec 1 litre we jàro- panol normal à 70%. A la solution obtenue, on ajoute, en agitant, 0,4 kg .¯¯ chlorure de sodium,- On laisse reposer la solution et sépare par décantation les deux couches qui se sont formées. La couche aqueuse est extraite à nouveau avec 0,5 litre de proanol, puis on filtre les deux extraits propanoliques.
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Après addition de 0,3 litre d'éthoxyéthanol, le filtrat est ccncentré dans le vide à une température d'environ 35 , jusqu'à ce que le volume soit devenu environ 0,2 litre. Après cristallisation, la bouillie résultante est filtrée et lavée avec 20 cm3 d'éthoxyéthanol à 80% et 20 cm3 d'eau. Le produit brut obtenu est mis en suspension dans 50 cm3 d'eau, nuis filtré. L'opération est recommencée et le résidu est finalement lavé au moyen de 20 cm3 d'éthanol. Le produit est séché dans le vide (2 mm de prèssion) à 40 . On obtient ainsi 20 g de chlorhydrate de chlorotétracycline titant 980 -or par milligramme.
EXEMPLE 2. -
En opérant comme dans l'exemple 1, mais en remplaçant le propanol par du butanol tertiaire à 90%, on obtient 18,5 g de chlorhydrate de chlorotétracycline titrant 970 # par milligramme.
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The present addition relates, like the main patent, to the purification of chlorotetracycline, an antibiotic substance also known under the trade name "Aureomycin" which is, in some countries, a trademark of the American Cyanamid Company. Chlorotetracycline is a naphthacene derivative believed to be 1-dimethyl-amino-4,6-chloro-10-methyl-11-pentahydroxy-2,4a, 5,7,11 octahydro-1,4,4a, 6 ,
11,11a, 12,12a naphtacene carboxamide-3 or a tautomeric form and can be obtained by growing Streptomyces Aureofaciens in a suitable fermentation medium. In particular, the invention relates to a process for separating chlorotetracycline from the impurities contained in the fermentation must.
As is known, one of the great difficulties encountered in the commercial production of antibiotics, such as chlorotetracyclin, by fermentation processes, lies in the extraction of the active substance from the culture medium ( fermentation must) in which it is born. In this respect, it is known practice to alkalinize the culture medium so as to form a precipitate, or cake (due to the presence in the culture medium of soluble ions of alkaline earth metals, for example calcium, barium, etc. strontium or magnesium used as constituents of the nutrient medium for the fungus, to separate this precipitate from the supernatant liquor and to extract the precipitate by means of a solvent.
In the main patent, a new process has been described for carrying out such an extraction, which has advantages over previously known procedures. This process comprises the following stages: acidification and then clarification of the culture medium, treatment of the culture medium by means of an alkali to form a precipitate, separation of said precipitate from the supernatant liquor and extraction of the precipitate by means of acidified isopropanol. The preliminary stage of acidification and clarification is essential in this process and has, over the process which involves the direct alkalinization of the culture medium and the treatment of the resulting precipitate by means of the chosen solvent, the advantage of greater economy in the use of the solvent and a greater degree of purity in the extract.
According to the present addition, the extraction of the chlorotetracycline present in a liquid culture medium resulting from the growth of Streptomyces Aureofaciens, is carried out by first acidifying and then clarifying said culture medium, adding to the clarified medium an amount of sufficient alkali to bring the pH to a value between 6 and 10 from which a precipitate results, extracting this precipitate by means of acidified normal propanol, or acidified tertiary butanol, separating the insoluble from the alcoholic extract, adding to the 'clarified alcohol extract a mineral chloride (such as sodium chloride) soluble in water, but relatively insoluble in normal propanol or tertiary butanol, in an amount sufficient to form an aqueous phase and an alcoholic phase,
separating the alcoholic phase and treating the latter to separate the chlorotetracycline hydrochloride therefrom. Normal propanol and tertiary butanol are particularly suitable for addition processing. Due to their miscibility with water they wet solids well during the initial extraction in the absence of any substantial amount of inorganic chloride; after the addition of the chloride to the clarified alcoholic extract, however, the water in the extract separates out as an aqueous layer, which contains all of the water-soluble impurities, with the remaining chlorotetracycline in the solvent layer. With just one solvent. therefore, the double advantage of aqueous extraction and solvent extraction is obtained.
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The nature here: 6 the acid employed in the acidification stage is not true ± LfJ, ¯b] not of critical importance, but, for reasons of convenience and; economy, preferably using acids;: ir'3'aU '? - such as sulfuric acid, hydrochloric acid or phoR- - ::. = - r: ..:. The:. quantity <: '; : .1; the concentration of the acid must be such where one obtains a rI i-nf 1 - to. 4 and, preferably, less than 2; the pH .jjli =.: - i; -; t approximately 1.5. The above is also valid for aciaii2 .. # l; io: # 1 ":. solvent .'¯a-¯xctiars.
1) When the treatment:! 1 '.'. ': Ll ";; of the medium clarified by means of an alkali, the vi u mll - ;, izt brought <te preferably between 7 and 9. As alkali ccnve - 1- - we can cite by e:.; Àx. = 1e the caustic souae, sodium carbonate 3-r; :: ..; "3.r: r :(, niBq: 169 We can use temperatures extraction between
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. 2t 6Cc. It is preferable to operate at ordinary temperature, it is at area 1 .mie t5r,:! 8 :: - '. ture of the order of 20. At the preferred temperature, the butancl t0rti ':. Í: {-: is a solid and e: ar e = 1 consequence used in the form of' L31ange with a small amount of water, for example 10-- 'by weight, so as to obtain a satisfactory solvent medium. The amount of extracting solvent can vary within fairly wide limits, but preferably the weight of the alcohol chosen is approximately that of the precipitate to be extracted.
It is preferable to isolate the chlorotetracycline as its hydrochloride, and it has been found that this can be achieved with the simultaneous removal of a large amount of water and impurities before the final isolation of the hydrochloride. by adding the alcoholic extract a mineral chloride soluble in water and relatively insoluble in the extraction alcohol. Such a chloride is, for example, sodium chloride or ammonium chloride.
On addition of the chloride, the extract separates into an aqueous phase and an alcoholic phase, the latter then being separated, for example by decantation, then, after concentration to a substantially smaller volume. the chlorotetracycline hydrochloride is left to crystallize. Preferably, crystallization is carried out in the presence
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. thoxy 2 ethanol. The following examples show the invention can be
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setting 'or.tc:vû9 EXtFLE, ¯ 30 liters of a culture medium containing 960 units of chlorot; ze: -4-, iacycline per cm3 are acidified to a TH of 1.5 by means of sul- acid .: 'uric at 25' .. C. 5 g of Supercel Xyflo are added and the solution is filtered.
1: # pr4cicité c: st 1 * vé l- several times with 15 liters of acidified water 2 tm DR 2. The filter! and the washes are combined and a w ::. O; solution is added. of solder <= caustic jusou's obtain a pH between 8 and 9. Con -i; ute 250 g of Supercel Hyflo, filter the solution and wash the precipitate: .. c 3 liters of 6a.
The resulting aLcaLin cake is suspended in 1.5 liters of normal prJfa = 1ok and a sufficient quantity of 25% jlfuric acid is added to the suspension to obtain a pH of 1.5. After stirring and filtration of the suspension, the precipitate is washed with 1 liter of 70% normal jaropanol. 0.4 kg is added to the solution obtained, while stirring. ¯ ¯ sodium chloride, - The solution is left to stand and the two layers which have formed are separated by decantation. The aqueous layer is extracted again with 0.5 liter of proanol, then the two propanol extracts are filtered.
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After the addition of 0.3 liters of ethoxyethanol, the filtrate is concentrated in vacuum at a temperature of about 35, until the volume has become about 0.2 liters. After crystallization, the resulting slurry is filtered and washed with 20 cm3 of 80% ethoxyethanol and 20 cm3 of water. The crude product obtained is suspended in 50 cm3 of water, filtered off. The operation is restarted and the residue is finally washed with 20 cm3 of ethanol. The product is dried in a vacuum (2 mm pressure) at 40. In this way 20 g of chlorotetracycline hydrochloride assaying 980 -or per milligram is obtained.
EXAMPLE 2. -
By operating as in Example 1, but replacing the propanol with 90% tertiary butanol, 18.5 g of chlorotetracycline hydrochloride is obtained, assaying 970 # per milligram.