La présente invention se rapporte à un procédé de production de dextrane de poids moléculaire réduit, utilisable à des fins théra- peutiques.
Jusqu'à présent, les efforts pour produire
du dextrane, sous forme d'un polymère d'ordre élevé, avec le poids moléculaire voulu pour pouvoir être utilise comme agent antichoc ou pour diluer le plasma sanguin, se sont heurtés à de grandes difficultés.
Le dextrane a la formule générale sui
vante :
EMI1.1
Jusqu'à maintenant, on a été obligé de recourir à l'hydrolyse acide pour réduire en plusieurs étapes successives le poids moléculaire de ce corps approximativement au poids désiré. Toutefois, le résultat obtenu restait entaché de grandes imprécisions quant au poids moléculaire réel, les valeurs déterminées ne correspondant qu'à une moyenne de poids moléculaires variant considérablement entre e eux. Cette indétermination posait des problèmes d'ordre thérapeutique lorsque le dextrane était injecté par voie intraveineuse, sous forme de solution saline à 6"/ & pour di- luer le plasma sanguin.
L'hydrolyse à la vapeur sous pression, comme l'hydrolyse acide, est peu précise, coûteuse et longue. Par ailleurs, les deux seuls enzymes connus comme capables d'effectuer l'hydrolyse du dextrane donnaient lieu aux mêmes objections que l'hydrolyse aeide, c'est- à-dire que leur action était imprécise et lente et que le produit obtenu était incertain quant à la valeur de son poids moléculaire, ou encore la moyenne du poids variait de telle façon qu'il n'était pas possible d'obtenir un produit standard.
Le procédé selon l'invention permet d'éviter ces inconvénients et d'obtenir rapidement, économiquement et de façon précise, le poids moléculaire voulu.
Il est caractérisé en ce qu'on cultive un champignon de la famille Aspergillus Wentii dans un milieu contenant du dextrane et un hydrolysat de proteine et en ce qu'on fait agir l'enzyme produit par ce champignon sur du dextrane de façon à en scinder les molécules en des portions de poids'moléculaire ne s'abaissant toutefois pas au-dessous de 20 000.
Le nouveau produit obtenu est une gomme blanche.
Le champignon qu'on utilise est de la famille Aspergillus Wentii. A des fins d'iden- tification, on a étudié sa croissance sur l'agar de saccharose Czapek, qui est le milieu standard utilisé pour la classification des champignons. Sur ce milieu, le champignon produit des colonies croissant rapidement, avec un mycélium aérien formant des masses floculeuses denses. La culture est d'un blanc cotonneux pendant trois ou quatre jours, ensuite elle tourne à un gris sans tons verdâtres. En prolongeant la période d'incubation, la culture devient plus dense et se recouvre d'un manteau présentant différentes teintes grisâtres devenant lentement plus foncées et tournant au brun. Lorsque la culture est totalement développée, elle a la couleur du café.
La face intérieure de la culture prend des teintes allant du jaune au vert et devient finalement nettement rougeâtre, quoique des plages jaunes et vertes peuvent persister. Le substratam contient des pigments jaunes.
Les têtes conidiennes sont grandes et de la couleur du café lorsqu'elles sont à maturité, et les rayons ne présentent qu'une faible tendance à se diviser. Les parois eonidiophoriques sont unies et sensiblement incolores. Les vésicules sont globuleuses et spécialement, fertiles sur toute leur surface. Les stérigmates se présentent spécialement dans deux séries et portent des chaînes de conidies qui sont globuleuses, jaune brun et échinées. On n'a observé ni perithécies, ni sclérotes.
Si l'on compare les caractéristiques enre gistrées au sujet des différentes espèces d'Aspergillus par les autorités en la matière, il devient clair que ce champignon s'approche, mais ne coïncide pas avec l'Aspergillus Wentii déerit. Ce dernier est considéré par les autorités compétentes comme étant une forme transitoire. Une des autorités en la matière ( Manual of the Aspergilli , Thom and Raper, Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1945) indique que l'Aspergillus Wentii est intermédiaire entre le groupe A. niger et le groupe A. tamarii, A. flavus-oryzae ou un autre.
Une autre autorité ( Industrial Myco logyo Smith, E. Arnold and Co., London, 1946), groupe ensemble les espèces A. ustus,
A. candidus, A. niger et A. Wentii. En Orient, les espèces A. Wentii, A. tamarii, A. flavus et
A. oryzae sont groupées ensemble sous le nom
A. oryzae, ceci pour la préparation des différents produits enzymotiques. Il est clair qu'il n'existe aucune ligne de démarcation nette et que, quoique le champignon utilisé ici possède plusieurs des caractéristiques du champignon
A. Wentii, il a aussi des analogies avec ces autres espèces.
Comme il ne coïncide pas exactement avec l'espèce A. Wentii typique, ni avec aucune des autres espèces classées, on pourrait lui donner le nom d'expèces Aspergillus dextranicumo, ou encore A. Wentii, variété dextranicum . Toutefois, les autorités en mycologie sont opposées à ce qu'on crée des nouveaux noms d'espèces, et elles ont exprimé l'opinion qu'il est plus pratique de classer un nouveau champignon dans l'une des classes, même s'il ne coïncide pas exactement avec la description des types. En conséquence, on classe le champignon en cause dans la classe
Aspergillus Wentii.
Dans la présente description, le terme dextranase est utilisé parce qu'il correspond à la terminologie usitée dans la chimie des enzymes et dans laquelle le suffixe ase est à ajouter au mot de la substance attaquée par l'enzyme.
L'enzyme produit par le champignon dé- crit est capable d'hydrolyser ou de diviser la chaîne glucosique du dextrane le long de celle-ci, ceci en maintenant des fragments de la longueur moléculaire voulue. Jusqu'à maintenant, on connaissait déjà des dextranases capables de diviser le dextrane, mais qui paraissaient principalement réduire le sucre (glucose), ce qui indiquait que ces enzymes attaquaient les extrémités de la chaîne. Dans le cas présent, l'enzyme produit n'agit pas de la sorte. Au cours d'expériences répétées, dans lesquelles un excès d'enzyme pouvait agir pendant une durée prolongée sur le dextrane, on n'a observé que peu de sucre réduit.
L'enzyme produit, agissant pendant de longues périodes sur différents dextranes, ré duisa. it les molecules de ceux-ci à des dimensions relativement petites comprises entre 20 000 et 40 000 et présentait d'autres effets secondaires. Cet enzyme peut être qualifié d'endodextranase pour indiquer son affinité pour les liaisons glucosiques à l'intérieur des molécules de dextrane. L'espèce opposée d'enzyme, qui est un exodextranase, présente une affinité pour les liaisons glucosiques aux K
extrémités des chaînes polysaccharides qui
constituent la molécule de dextrane.
De tels
enzymes exodextranases provoquent prineipa
lement la réduction du sucre en attaquant le
dextrane et, par conséquent, sont sans valeur
pour la préparation de dextrane partiellement
hydrolyse, tel qu'on l'utilise pour diluer le
sang. Il ressort clairement de la littérature
que les seuls dextranases connus jusqu'au mo
ment de la présente invention appartiennent
à la classe des exodextranases.
L'enzyme qu'on obtient du champignon
utilisé ici, étant au contraire un endodextra-
nase, attaque la molécule de dextrane aux
liaisons situées en arrière des groupes termi
naux, ceci rapidement, et transforme les
grandes molécules en des produits de poids
moléculaire relativement bas et de faible vis
cosité. Ensuite se produit une réaction secon
daire qui est très lente et dans laquelle l'en-
zyme attaque lentement les produits de bas
poids moléculaire.
Ceci ressort clairement de
1'exemple suivant, dans l'equel une préparation
purifiée et à haute teneur de l'endodextra
nase a été ajoutée sous forme d'une dilution
à 1 : 100 à une solution de dextrane et dans
laquelle les changements de viscosité suivants
ont été observés :
Temps après le mélange Viscosité relative
(en minutes) (comparée à l'eau)
0 7, 25
2 4, 69
3, 5 4, 09
4, 5 3, 77
6 3, 62
viscosité réduite de 50 ouzo
7, 5 3, 47
9 3, 36
11, 5 3, 25
40 2, 77
58 2, 61
1498 1, 77
viscosité réduite de 75 /o
2938 1,70 @
La viscosité a été réduite à 50"/o de la
valeur originale en un temps de 6 munîtes
seulement, tandis qu'il a fallu 1492 minutes
supplémentaires pour faire tomber à 50 /o la s viscosité relative de cette solution intermé
diaire (ou 25 /o de la valeur originale). D'au
tres petits changements ont été notés durant
les 1440 minutes suivantes.
On peut démon
trer mathématiquement que les résultats ob-
tenus seraient impossibles si le dextranase
attaquait avee la même probabilité toutes les liaisons glueosiques dans la molécule de dextrane. Ce résultat peut être expliqué uni quement à l'aide de l'hypothèse que les s gtoupes terminaux des chaines polysaccharides de la molécule de dextrane perturbent d'une manière ou d'une autre l'union de dextrane avec l'enzyme, et par conséquent diminuent la vitesse de l'hydrolyse. Lorsque seuls des petits fragments subsistent, l'enzyme les attaque ensuite, quoique lentement et avec difficulté.
Le dextranase provenant du champignon
décrit de la famille Aspergillus Wentii, lors.
qu'il agit sur du dextrane, produit du suera
réduit en petite quantité seulement.
On peut cultiver ce champignon de la
façon suivante :
Premièrement, on fait croître le champi
gnon en vue de la production de l'enzyme en
présence d'un milieu nutritif contenant des vitamines, du dextrane et une source d'acides
aminés. Le dextrane qui vient d'être men tionné n'est pas constitué par la masse de dextrane qui sera hydrolysée par action de cet enzyme. On utilise lme quantité relative- ment petite de dextrane dans les milieux nutritifs, dans le but d'acclimater le champignon et ses enzymes au dextrane auquel il sera ensuite associé en grandes quantités.
Un milieu typique provoquant une croissance rapide du champignon dans l'espace de quelques jours afin de produire une solution riche en dextranase, est le suivant :
Tableau 1 :
Milieu PV
Composante Grammes par litre
Peptone 5, 0
Dextrane 10, 0
MgS04 0, 1
NaCl 0, 1
FeSO4 0, 01
MnS04 0, 01
1 < H2PO4 0, 1
Na2SO4 2, 0
< 2S 4 0, 5
Milligrammes
par litre
Acide nicotinique 1, 0
Riboflavine 0, 5
Vitamines Thiamine 0,5 @ PantothÚnate de Ca 0,5
Pyridoxine 0, 4
Aeide folique 0, 01
Biotine 0, 001
Le milieu ci-dessus est très satisfaisant au point de vue de la production d'enzyme,
mais probablement plus compliqué qu'il ne serait nécessaire. D'autres exemples sont les suivants :
1 Un milieu de composition donnée dans le tableau I, les vitamines B étant supprimées.
2 Un milieu selon composition donnée dans le tableau I, les vitamines B étant remplacées par un extrait de levure à raison de 0, 4 g par litre.
3 Un milieu de composition selon tableau I, mais avec la peptone remplacée par un hydrolysat de caséine à raison de 5, 0 g par litre, soit avec ou sans les vitamines B.
4 Un milieu de la composition indiquée, dans lequel ! la teneur en dextrane varie entre 5, 0 et 50, 0 g par litre.
Le point le plus important est que l'enri- chissement du milieu avee un hydrolysat de protéines tel que la peptone ou un hydrolysat de caséine provoque une stimulation remarquable de la production en dextranase.
L'invention est décrite en détail dans les exemples suivants, en ce. qui concerne la division enzymotique du dextrane.
Exemple I :
Une partie d'un milieu obtenu par croissance du champignon de la famille Aspergillus Wentii dans le milieu PV (tableau I) a été filtrée, un em. de filtrat a été addi tionné à 110 em3 d'un milieu de saccharose fermenté contenant du dextrane dans une eoneentratiOn de 7 /o. Le mélange a incubé 31/2 h à la température ambiante. Il a été transféré ensuite dans un récipient séparé et traité avec 50 cm3 d'acétone provoquant la séparation de la solution en deux couches de liquide.
La couche inférieure a été extraite pour constituer la fraction I du dextrane hydrolyse enzymotiquement. On-a a. jouté 25 cm3 d'acétone à la solution restant dans le récipient, ce qui a provoqué la séparation d'une nouvelle couche inférieure qui a été extraite pour former la fraction II. L'addition de 50 em3 d'acétone supplémentaires a ensuite provoqué la séparation de la fraction III.
Chacune des trois fractions a été traitée avec de l'alcool pour provoquer la précipitation du
dextrane sous forme de gomme blanche.
Les produits ont ensuite été sèches dans le vide à une température supérieure à 70 C à poids constant. Ainsi, on a obtenu : Fraction
I = 5, 0 g, fraction II = 1, 5 g, fraction III
= 0, 5 g, ce qui donne un total de 7 g de dextrane hydrolyse enzymotiquement, pour 7, 7 g de dextrane brut présent au début. Des solutions à l"/o des fractions ont été prépa- rées et les viscosités intrinsèques ont été trouvées égales à [où (n) = viscosité intrinsèque] :
I. (n) = 0, 174 : = 35 000 poids mol.
II. (n) = 0, 146 : = 24 000 poids mol.
III. (n) = 0, 137 : = 21000 poids mol.
Exemple Il :
5 em3 de filtrat de champignon contenant 1'enzyme préparé comme indiqué précédemment ont été ajoutés à un litre d'un milieu fermenté contenant du dextrane à une concentration de 7 /o. Le mélange a incubé à l'a température ambiante pendant 5 h et a été fractionné avec de l'acétone d'une façon similaire à celle décrite précédemment. Ainsi, on a obtenu : fraction I = 49 g et fraction II = 13, 2 g, en récupérant ainsi 60, 2 g de dextrane hydrolyse pour 70 g de dextrane brut utilisé au début. En déterminant les viscosités intrinsèques, on a trouvé qu'elles correspondent à des poids moléculaires d'approximativement I = 38 000 et II = 24 000.
Exemple III :
A 100 cm3 3d'un milieu fermenté contenant du dextrane à une concentration de 7 ! o, on a ajouté 0, 1 em3 d'un filtrat de champignon contenant de l'enzyme. On a laissé incuber à la température ambiante pendant 5 h et on a ensuite fractionné ce milieu avec de l'acétone, ce qui a produit : fraction I = 5, 9 g d'un poids moléculaire de 69 000 et fraction
II = 0, 7 g d'un poids moléculaire de 21000 g.
Exemple IV :
A 8 litres d'un milieu fermenté contenant du dextrane à une concentration de. 6, 1 /o, on a ajouté 80 em3 de filtrat de champignon. La viscosité du mélange a été mesurée à divers intervalles. Lorsque la viscosité relative a été réduite à la valeur de deux, telle que déterminée par le viscomètre Osterwald-Fenske N 300, l'action de l'enzyme a été arrêtée en ajoutant de l'alcali de façon à obtenir un pg de 10. Le temps qui a été nécessaire pour atteindre cette valeur a été de 40 minutes. Le mélange a été clarifié par traitement avec un gel d'alumine, ensuite duquel il a été traité à
La centrifugeuse de Sharples.
La solution a été ensuite précipitée par de l'alcool à une concentration de 55'/a. La gomme blanche a été redissoute dans 2 litres d'eau, traitée avec un adjuvant de filtration et filtrée. La solution acqueuse claire a été précipitée avec de
L'alcool et la gomme séchée à poids constant dans le vide à une température supérieure à 70 C. Ainsi, on a obtenu 400 g d'un produit blanc de poids moléculaire moyen de 71000.
Dans les exemples ci-dessus, 1'enzyme a été utilisé dans l'état où il se trouvait dans la solution de culture. Il est possible de pré cipiter 1'enzyme contenu dans la solution en ajoutant de l'acétone au filtrat pur de champignon, de façon à obtenir une concentration d'acétone comprise entre 35 et 55 O/o et de recueillir le précipité blanc obtenu. Cette poudre blanche peut être utilisée pour diviser le polymère de dextrane direetementenl'ajou- tant au milieu fermenté contenant le dextrane, ou elle peut d'abord être dissoute dans de
L'eau et ensuite ajoutée à la solution de dextrane.
D'autres méthodes ont été utilisées pour isoler L'enzyme : par exemple, la précipitation avec des solvants teLs ! que le dioxane ou un alcool, à la place de l'acétone. Il est aussi possible d'utiliser du sulfate d'ammonium, du sul- fate de sodium ou du chlorure de sodium par exemple.
A titre d'exemple, il a été obtenu des concentrations élevées en enzyme par le moyen suivant :
a) Filtration du milieu pour enlever le champignon.
b) Addition du sulfate d'ammonium à la teneur de 70 g par 100 cm3 de filtrat et vécu- pération du précipité.
c) Redissolution du dextranase contenu dans une quantité d'eau correspondant approximativement à un dixième du volume du filtrat indiqué sous b).
Reprécipitation de 1'enzyme à l'aide du sulfate d'ammonium.
d) Répétition de ce cycle de dissolution de 1'enzyme dans de l'eau et précipitation répétée de D'enzyme à l'aide de sulfate d'ammonium, en continuant à diminuer les volumes de solutions.
e) Dialyse de la solution finale pour enlever les sels étrangers. Précipitation de l'en- zyme par addition d'acétone à une concentration approximative de 70 /o et séchage du précipité résultant pour obtenir le dextranase sous forme d'une poudre stable à haute concentration. En variante, la solution di alysée peut être séchée à froid pour produire 1'enzyme sous forme d'une poudre stable et active.
Dans les exemples donnés, le filtrat de champignon a été employé en dilution allant de 1 : 100 à 1 : 1000 (par exemple 0, 1 em3 ajoutés à 100 em3). Dans d'autres expériences, a constaté qu'une dilution de 1 : 1000, en opé- rant pendant un laps de temps allant de 1 à 5 heures donne des résultats satisfaisants.
Toutefois, le filtrat de champignon est actif dans les dilutions allant de 1 : 10 000 à 1 : 100 000, quoique le temps de réaction doit être prolongé en conséquence.
Lorsqu'on veut arrêter l'action de l'enzyme, on peut le faire en rendant la solution alea- line à un pH d'environ 9-10. On peut aussi le faire en rendant la solution acide à un PH d'environ 2-3. Dans aucun cas, l'acidité ou l'alcalinité n'est utilisée pour obtenir des réactions ou des dégradations. Elle est seulement utilisée pour arrêter l'action enzymotique.
Une fois que l'action enzymotique est arrivée au degré voulu, les solutions peuvent être clarifiées avant d'être fractionnées. Ceci peut être exécuté de la façon suivante : En rendant la solution approximativement 0, 1 normale en alcali ou en acide et en chauffant pendant une période de 5 à 15 minutes, un précipité floculeux se forme. La solution est ensuite neutralisée, un adjuvant est ajouté et la solution filtrée, après quoi celle-ci doit être frac tionnée si cela est nécessaire. Il y a lieu de relever que si l'on a recours à un traitement avec un acide, il faut faire attention que les conditions de traitement soient douces afin d'éviter une nouvelle hydrolyse du dextrane.
Même avec cette restriction, il est préférable d'utiliser l'acide, étant donné que le chauffage dans une solution alcaline tend parfois à noireir les hydrates de carbone. Une autre méthode de purification également applicable pour des dextranes hydrolyses consiste à traiter le mélange de dextrane dégradé par l'en- zyme avec un gel d'alumine, à centrifuger et à le précipiter comme décrit dans 1'exemple
IV. En filtrant ensuite à l'aide d'un adjuvant de filtration, on enlève les dernières traces d'impuretés, et on obtient de ce fait des solutions limpides comme de l'eau.
Avantages résultant de l'utilisation rde l'en- zyme au lieu de l'utilisation de l'hydrolyse acide pour la production de dextrane scindé :
a) Le dextranase peut être utilisé rapidement et directement dans le milieu fermenté contenant le dextrane. De cette manière, il est possible d'éviter les dépenses et les inconvé- nients d'une première précipitation du dextrane brut avec des volumes élevés d'un solvant tel que l'alcool, et d'une redissolution du dextrane avant l'hydrolyse. Lorsqu'on utilise l'hydrolyse acide, il est d'usage d'employer ce procédé plus lent.
b) L'hydrolyse acide est difficile à contrôler et les produits en résultant ont des poids moléculaires variant beaucoup.
L'hydrolyse enzymotique est douce, donne un produit blanc et les dimensions moléculaires du produit varient peu entre elles. La dispersion exacte dépend évidemment de la concentration de l'enzyme et de la durée de l'hydrolyse.
Le contrôle du poids moléculaire est régi par la durée de la réaction et la température : pour diminuer le poids moléculaire du des :- trane que l'on veut obtenir, on peut augmenter soit la durée de la réaction, soit la tempé- rature ou soit les deux ensemble, avec cette restriction que l'enzyme étant une protéine, la température ne doit pas être augmentée audelà du point où cette protéine est déeompo- sée et, par conséquent, rendue inutilisable. La vitesse de la réaction peut aussi être contrôlée par le-degré de concentration de l'enzyme.
Plus la concentration de 1'enzyme est élevée, plus la vitesse de réaction sera grande.