La présente invention se rapporte à un procédé de production de dextrane de poids moléculaire réduit, utilisable à des fins théra- peutiques.
Jusqu'à présent, les efforts pour produire
du dextrane, sous forme d'un polymère d'ordre élevé, avec le poids moléculaire voulu pour pouvoir être utilise comme agent antichoc ou pour diluer le plasma sanguin, se sont heurtés à de grandes difficultés.
Le dextrane a la formule générale sui
vante :
EMI1.1
Jusqu'à maintenant, on a été obligé de recourir à l'hydrolyse acide pour réduire en plusieurs étapes successives le poids moléculaire de ce corps approximativement au poids désiré. Toutefois, le résultat obtenu restait entaché de grandes imprécisions quant au poids moléculaire réel, les valeurs déterminées ne correspondant qu'à une moyenne de poids moléculaires variant considérablement entre e eux. Cette indétermination posait des problèmes d'ordre thérapeutique lorsque le dextrane était injecté par voie intraveineuse, sous forme de solution saline à 6"/ & pour di- luer le plasma sanguin.
L'hydrolyse à la vapeur sous pression, comme l'hydrolyse acide, est peu précise, coûteuse et longue. Par ailleurs, les deux seuls enzymes connus comme capables d'effectuer l'hydrolyse du dextrane donnaient lieu aux mêmes objections que l'hydrolyse aeide, c'est- à-dire que leur action était imprécise et lente et que le produit obtenu était incertain quant à la valeur de son poids moléculaire, ou encore la moyenne du poids variait de telle façon qu'il n'était pas possible d'obtenir un produit standard.
Le procédé selon l'invention permet d'éviter ces inconvénients et d'obtenir rapidement, économiquement et de façon précise, le poids moléculaire voulu.
Il est caractérisé en ce qu'on cultive un champignon de la famille Aspergillus Wentii dans un milieu contenant du dextrane et un hydrolysat de proteine et en ce qu'on fait agir l'enzyme produit par ce champignon sur du dextrane de façon à en scinder les molécules en des portions de poids'moléculaire ne s'abaissant toutefois pas au-dessous de 20 000.
Le nouveau produit obtenu est une gomme blanche.
Le champignon qu'on utilise est de la famille Aspergillus Wentii. A des fins d'iden- tification, on a étudié sa croissance sur l'agar de saccharose Czapek, qui est le milieu standard utilisé pour la classification des champignons. Sur ce milieu, le champignon produit des colonies croissant rapidement, avec un mycélium aérien formant des masses floculeuses denses. La culture est d'un blanc cotonneux pendant trois ou quatre jours, ensuite elle tourne à un gris sans tons verdâtres. En prolongeant la période d'incubation, la culture devient plus dense et se recouvre d'un manteau présentant différentes teintes grisâtres devenant lentement plus foncées et tournant au brun. Lorsque la culture est totalement développée, elle a la couleur du café.
La face intérieure de la culture prend des teintes allant du jaune au vert et devient finalement nettement rougeâtre, quoique des plages jaunes et vertes peuvent persister. Le substratam contient des pigments jaunes.
Les têtes conidiennes sont grandes et de la couleur du café lorsqu'elles sont à maturité, et les rayons ne présentent qu'une faible tendance à se diviser. Les parois eonidiophoriques sont unies et sensiblement incolores. Les vésicules sont globuleuses et spécialement, fertiles sur toute leur surface. Les stérigmates se présentent spécialement dans deux séries et portent des chaînes de conidies qui sont globuleuses, jaune brun et échinées. On n'a observé ni perithécies, ni sclérotes.
Si l'on compare les caractéristiques enre gistrées au sujet des différentes espèces d'Aspergillus par les autorités en la matière, il devient clair que ce champignon s'approche, mais ne coïncide pas avec l'Aspergillus Wentii déerit. Ce dernier est considéré par les autorités compétentes comme étant une forme transitoire. Une des autorités en la matière ( Manual of the Aspergilli , Thom and Raper, Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1945) indique que l'Aspergillus Wentii est intermédiaire entre le groupe A. niger et le groupe A. tamarii, A. flavus-oryzae ou un autre.
Une autre autorité ( Industrial Myco logyo Smith, E. Arnold and Co., London, 1946), groupe ensemble les espèces A. ustus,
A. candidus, A. niger et A. Wentii. En Orient, les espèces A. Wentii, A. tamarii, A. flavus et
A. oryzae sont groupées ensemble sous le nom
A. oryzae, ceci pour la préparation des différents produits enzymotiques. Il est clair qu'il n'existe aucune ligne de démarcation nette et que, quoique le champignon utilisé ici possède plusieurs des caractéristiques du champignon
A. Wentii, il a aussi des analogies avec ces autres espèces.
Comme il ne coïncide pas exactement avec l'espèce A. Wentii typique, ni avec aucune des autres espèces classées, on pourrait lui donner le nom d'expèces Aspergillus dextranicumo, ou encore A. Wentii, variété dextranicum . Toutefois, les autorités en mycologie sont opposées à ce qu'on crée des nouveaux noms d'espèces, et elles ont exprimé l'opinion qu'il est plus pratique de classer un nouveau champignon dans l'une des classes, même s'il ne coïncide pas exactement avec la description des types. En conséquence, on classe le champignon en cause dans la classe
Aspergillus Wentii.
Dans la présente description, le terme dextranase est utilisé parce qu'il correspond à la terminologie usitée dans la chimie des enzymes et dans laquelle le suffixe ase est à ajouter au mot de la substance attaquée par l'enzyme.
L'enzyme produit par le champignon dé- crit est capable d'hydrolyser ou de diviser la chaîne glucosique du dextrane le long de celle-ci, ceci en maintenant des fragments de la longueur moléculaire voulue. Jusqu'à maintenant, on connaissait déjà des dextranases capables de diviser le dextrane, mais qui paraissaient principalement réduire le sucre (glucose), ce qui indiquait que ces enzymes attaquaient les extrémités de la chaîne. Dans le cas présent, l'enzyme produit n'agit pas de la sorte. Au cours d'expériences répétées, dans lesquelles un excès d'enzyme pouvait agir pendant une durée prolongée sur le dextrane, on n'a observé que peu de sucre réduit.
L'enzyme produit, agissant pendant de longues périodes sur différents dextranes, ré duisa. it les molecules de ceux-ci à des dimensions relativement petites comprises entre 20 000 et 40 000 et présentait d'autres effets secondaires. Cet enzyme peut être qualifié d'endodextranase pour indiquer son affinité pour les liaisons glucosiques à l'intérieur des molécules de dextrane. L'espèce opposée d'enzyme, qui est un exodextranase, présente une affinité pour les liaisons glucosiques aux K
extrémités des chaînes polysaccharides qui
constituent la molécule de dextrane.
De tels
enzymes exodextranases provoquent prineipa
lement la réduction du sucre en attaquant le
dextrane et, par conséquent, sont sans valeur
pour la préparation de dextrane partiellement
hydrolyse, tel qu'on l'utilise pour diluer le
sang. Il ressort clairement de la littérature
que les seuls dextranases connus jusqu'au mo
ment de la présente invention appartiennent
à la classe des exodextranases.
L'enzyme qu'on obtient du champignon
utilisé ici, étant au contraire un endodextra-
nase, attaque la molécule de dextrane aux
liaisons situées en arrière des groupes termi
naux, ceci rapidement, et transforme les
grandes molécules en des produits de poids
moléculaire relativement bas et de faible vis
cosité. Ensuite se produit une réaction secon
daire qui est très lente et dans laquelle l'en-
zyme attaque lentement les produits de bas
poids moléculaire.
Ceci ressort clairement de
1'exemple suivant, dans l'equel une préparation
purifiée et à haute teneur de l'endodextra
nase a été ajoutée sous forme d'une dilution
à 1 : 100 à une solution de dextrane et dans
laquelle les changements de viscosité suivants
ont été observés :
Temps après le mélange Viscosité relative
(en minutes) (comparée à l'eau)
0 7, 25
2 4, 69
3, 5 4, 09
4, 5 3, 77
6 3, 62
viscosité réduite de 50 ouzo
7, 5 3, 47
9 3, 36
11, 5 3, 25
40 2, 77
58 2, 61
1498 1, 77
viscosité réduite de 75 /o
2938 1,70 @
La viscosité a été réduite à 50"/o de la
valeur originale en un temps de 6 munîtes
seulement, tandis qu'il a fallu 1492 minutes
supplémentaires pour faire tomber à 50 /o la s viscosité relative de cette solution intermé
diaire (ou 25 /o de la valeur originale). D'au
tres petits changements ont été notés durant
les 1440 minutes suivantes.
On peut démon
trer mathématiquement que les résultats ob-
tenus seraient impossibles si le dextranase
attaquait avee la même probabilité toutes les liaisons glueosiques dans la molécule de dextrane. Ce résultat peut être expliqué uni quement à l'aide de l'hypothèse que les s gtoupes terminaux des chaines polysaccharides de la molécule de dextrane perturbent d'une manière ou d'une autre l'union de dextrane avec l'enzyme, et par conséquent diminuent la vitesse de l'hydrolyse. Lorsque seuls des petits fragments subsistent, l'enzyme les attaque ensuite, quoique lentement et avec difficulté.
Le dextranase provenant du champignon
décrit de la famille Aspergillus Wentii, lors.
qu'il agit sur du dextrane, produit du suera
réduit en petite quantité seulement.
On peut cultiver ce champignon de la
façon suivante :
Premièrement, on fait croître le champi
gnon en vue de la production de l'enzyme en
présence d'un milieu nutritif contenant des vitamines, du dextrane et une source d'acides
aminés. Le dextrane qui vient d'être men tionné n'est pas constitué par la masse de dextrane qui sera hydrolysée par action de cet enzyme. On utilise lme quantité relative- ment petite de dextrane dans les milieux nutritifs, dans le but d'acclimater le champignon et ses enzymes au dextrane auquel il sera ensuite associé en grandes quantités.
Un milieu typique provoquant une croissance rapide du champignon dans l'espace de quelques jours afin de produire une solution riche en dextranase, est le suivant :
Tableau 1 :
Milieu PV
Composante Grammes par litre
Peptone 5, 0
Dextrane 10, 0
MgS04 0, 1
NaCl 0, 1
FeSO4 0, 01
MnS04 0, 01
1 < H2PO4 0, 1
Na2SO4 2, 0
< 2S 4 0, 5
Milligrammes
par litre
Acide nicotinique 1, 0
Riboflavine 0, 5
Vitamines Thiamine 0,5 @ PantothÚnate de Ca 0,5
Pyridoxine 0, 4
Aeide folique 0, 01
Biotine 0, 001
Le milieu ci-dessus est très satisfaisant au point de vue de la production d'enzyme,
mais probablement plus compliqué qu'il ne serait nécessaire. D'autres exemples sont les suivants :
1 Un milieu de composition donnée dans le tableau I, les vitamines B étant supprimées.
2 Un milieu selon composition donnée dans le tableau I, les vitamines B étant remplacées par un extrait de levure à raison de 0, 4 g par litre.
3 Un milieu de composition selon tableau I, mais avec la peptone remplacée par un hydrolysat de caséine à raison de 5, 0 g par litre, soit avec ou sans les vitamines B.
4 Un milieu de la composition indiquée, dans lequel ! la teneur en dextrane varie entre 5, 0 et 50, 0 g par litre.
Le point le plus important est que l'enri- chissement du milieu avee un hydrolysat de protéines tel que la peptone ou un hydrolysat de caséine provoque une stimulation remarquable de la production en dextranase.
L'invention est décrite en détail dans les exemples suivants, en ce. qui concerne la division enzymotique du dextrane.
Exemple I :
Une partie d'un milieu obtenu par croissance du champignon de la famille Aspergillus Wentii dans le milieu PV (tableau I) a été filtrée, un em. de filtrat a été addi tionné à 110 em3 d'un milieu de saccharose fermenté contenant du dextrane dans une eoneentratiOn de 7 /o. Le mélange a incubé 31/2 h à la température ambiante. Il a été transféré ensuite dans un récipient séparé et traité avec 50 cm3 d'acétone provoquant la séparation de la solution en deux couches de liquide.
La couche inférieure a été extraite pour constituer la fraction I du dextrane hydrolyse enzymotiquement. On-a a. jouté 25 cm3 d'acétone à la solution restant dans le récipient, ce qui a provoqué la séparation d'une nouvelle couche inférieure qui a été extraite pour former la fraction II. L'addition de 50 em3 d'acétone supplémentaires a ensuite provoqué la séparation de la fraction III.
Chacune des trois fractions a été traitée avec de l'alcool pour provoquer la précipitation du
dextrane sous forme de gomme blanche.
Les produits ont ensuite été sèches dans le vide à une température supérieure à 70 C à poids constant. Ainsi, on a obtenu : Fraction
I = 5, 0 g, fraction II = 1, 5 g, fraction III
= 0, 5 g, ce qui donne un total de 7 g de dextrane hydrolyse enzymotiquement, pour 7, 7 g de dextrane brut présent au début. Des solutions à l"/o des fractions ont été prépa- rées et les viscosités intrinsèques ont été trouvées égales à [où (n) = viscosité intrinsèque] :
I. (n) = 0, 174 : = 35 000 poids mol.
II. (n) = 0, 146 : = 24 000 poids mol.
III. (n) = 0, 137 : = 21000 poids mol.
Exemple Il :
5 em3 de filtrat de champignon contenant 1'enzyme préparé comme indiqué précédemment ont été ajoutés à un litre d'un milieu fermenté contenant du dextrane à une concentration de 7 /o. Le mélange a incubé à l'a température ambiante pendant 5 h et a été fractionné avec de l'acétone d'une façon similaire à celle décrite précédemment. Ainsi, on a obtenu : fraction I = 49 g et fraction II = 13, 2 g, en récupérant ainsi 60, 2 g de dextrane hydrolyse pour 70 g de dextrane brut utilisé au début. En déterminant les viscosités intrinsèques, on a trouvé qu'elles correspondent à des poids moléculaires d'approximativement I = 38 000 et II = 24 000.
Exemple III :
A 100 cm3 3d'un milieu fermenté contenant du dextrane à une concentration de 7 ! o, on a ajouté 0, 1 em3 d'un filtrat de champignon contenant de l'enzyme. On a laissé incuber à la température ambiante pendant 5 h et on a ensuite fractionné ce milieu avec de l'acétone, ce qui a produit : fraction I = 5, 9 g d'un poids moléculaire de 69 000 et fraction
II = 0, 7 g d'un poids moléculaire de 21000 g.
Exemple IV :
A 8 litres d'un milieu fermenté contenant du dextrane à une concentration de. 6, 1 /o, on a ajouté 80 em3 de filtrat de champignon. La viscosité du mélange a été mesurée à divers intervalles. Lorsque la viscosité relative a été réduite à la valeur de deux, telle que déterminée par le viscomètre Osterwald-Fenske N 300, l'action de l'enzyme a été arrêtée en ajoutant de l'alcali de façon à obtenir un pg de 10. Le temps qui a été nécessaire pour atteindre cette valeur a été de 40 minutes. Le mélange a été clarifié par traitement avec un gel d'alumine, ensuite duquel il a été traité à
La centrifugeuse de Sharples.
La solution a été ensuite précipitée par de l'alcool à une concentration de 55'/a. La gomme blanche a été redissoute dans 2 litres d'eau, traitée avec un adjuvant de filtration et filtrée. La solution acqueuse claire a été précipitée avec de
L'alcool et la gomme séchée à poids constant dans le vide à une température supérieure à 70 C. Ainsi, on a obtenu 400 g d'un produit blanc de poids moléculaire moyen de 71000.
Dans les exemples ci-dessus, 1'enzyme a été utilisé dans l'état où il se trouvait dans la solution de culture. Il est possible de pré cipiter 1'enzyme contenu dans la solution en ajoutant de l'acétone au filtrat pur de champignon, de façon à obtenir une concentration d'acétone comprise entre 35 et 55 O/o et de recueillir le précipité blanc obtenu. Cette poudre blanche peut être utilisée pour diviser le polymère de dextrane direetementenl'ajou- tant au milieu fermenté contenant le dextrane, ou elle peut d'abord être dissoute dans de
L'eau et ensuite ajoutée à la solution de dextrane.
D'autres méthodes ont été utilisées pour isoler L'enzyme : par exemple, la précipitation avec des solvants teLs ! que le dioxane ou un alcool, à la place de l'acétone. Il est aussi possible d'utiliser du sulfate d'ammonium, du sul- fate de sodium ou du chlorure de sodium par exemple.
A titre d'exemple, il a été obtenu des concentrations élevées en enzyme par le moyen suivant :
a) Filtration du milieu pour enlever le champignon.
b) Addition du sulfate d'ammonium à la teneur de 70 g par 100 cm3 de filtrat et vécu- pération du précipité.
c) Redissolution du dextranase contenu dans une quantité d'eau correspondant approximativement à un dixième du volume du filtrat indiqué sous b).
Reprécipitation de 1'enzyme à l'aide du sulfate d'ammonium.
d) Répétition de ce cycle de dissolution de 1'enzyme dans de l'eau et précipitation répétée de D'enzyme à l'aide de sulfate d'ammonium, en continuant à diminuer les volumes de solutions.
e) Dialyse de la solution finale pour enlever les sels étrangers. Précipitation de l'en- zyme par addition d'acétone à une concentration approximative de 70 /o et séchage du précipité résultant pour obtenir le dextranase sous forme d'une poudre stable à haute concentration. En variante, la solution di alysée peut être séchée à froid pour produire 1'enzyme sous forme d'une poudre stable et active.
Dans les exemples donnés, le filtrat de champignon a été employé en dilution allant de 1 : 100 à 1 : 1000 (par exemple 0, 1 em3 ajoutés à 100 em3). Dans d'autres expériences, a constaté qu'une dilution de 1 : 1000, en opé- rant pendant un laps de temps allant de 1 à 5 heures donne des résultats satisfaisants.
Toutefois, le filtrat de champignon est actif dans les dilutions allant de 1 : 10 000 à 1 : 100 000, quoique le temps de réaction doit être prolongé en conséquence.
Lorsqu'on veut arrêter l'action de l'enzyme, on peut le faire en rendant la solution alea- line à un pH d'environ 9-10. On peut aussi le faire en rendant la solution acide à un PH d'environ 2-3. Dans aucun cas, l'acidité ou l'alcalinité n'est utilisée pour obtenir des réactions ou des dégradations. Elle est seulement utilisée pour arrêter l'action enzymotique.
Une fois que l'action enzymotique est arrivée au degré voulu, les solutions peuvent être clarifiées avant d'être fractionnées. Ceci peut être exécuté de la façon suivante : En rendant la solution approximativement 0, 1 normale en alcali ou en acide et en chauffant pendant une période de 5 à 15 minutes, un précipité floculeux se forme. La solution est ensuite neutralisée, un adjuvant est ajouté et la solution filtrée, après quoi celle-ci doit être frac tionnée si cela est nécessaire. Il y a lieu de relever que si l'on a recours à un traitement avec un acide, il faut faire attention que les conditions de traitement soient douces afin d'éviter une nouvelle hydrolyse du dextrane.
Même avec cette restriction, il est préférable d'utiliser l'acide, étant donné que le chauffage dans une solution alcaline tend parfois à noireir les hydrates de carbone. Une autre méthode de purification également applicable pour des dextranes hydrolyses consiste à traiter le mélange de dextrane dégradé par l'en- zyme avec un gel d'alumine, à centrifuger et à le précipiter comme décrit dans 1'exemple
IV. En filtrant ensuite à l'aide d'un adjuvant de filtration, on enlève les dernières traces d'impuretés, et on obtient de ce fait des solutions limpides comme de l'eau.
Avantages résultant de l'utilisation rde l'en- zyme au lieu de l'utilisation de l'hydrolyse acide pour la production de dextrane scindé :
a) Le dextranase peut être utilisé rapidement et directement dans le milieu fermenté contenant le dextrane. De cette manière, il est possible d'éviter les dépenses et les inconvé- nients d'une première précipitation du dextrane brut avec des volumes élevés d'un solvant tel que l'alcool, et d'une redissolution du dextrane avant l'hydrolyse. Lorsqu'on utilise l'hydrolyse acide, il est d'usage d'employer ce procédé plus lent.
b) L'hydrolyse acide est difficile à contrôler et les produits en résultant ont des poids moléculaires variant beaucoup.
L'hydrolyse enzymotique est douce, donne un produit blanc et les dimensions moléculaires du produit varient peu entre elles. La dispersion exacte dépend évidemment de la concentration de l'enzyme et de la durée de l'hydrolyse.
Le contrôle du poids moléculaire est régi par la durée de la réaction et la température : pour diminuer le poids moléculaire du des :- trane que l'on veut obtenir, on peut augmenter soit la durée de la réaction, soit la tempé- rature ou soit les deux ensemble, avec cette restriction que l'enzyme étant une protéine, la température ne doit pas être augmentée audelà du point où cette protéine est déeompo- sée et, par conséquent, rendue inutilisable. La vitesse de la réaction peut aussi être contrôlée par le-degré de concentration de l'enzyme.
Plus la concentration de 1'enzyme est élevée, plus la vitesse de réaction sera grande.
The present invention relates to a process for producing dextran of reduced molecular weight which can be used for therapeutic purposes.
So far, efforts to produce
dextran, in the form of a high-order polymer, with the desired molecular weight to be able to be used as an anti-shock agent or to dilute blood plasma, have encountered great difficulties.
Dextran has the general formula sui
boasts:
EMI1.1
Heretofore, it has been necessary to resort to acid hydrolysis to reduce in successive stages the molecular weight of this body to approximately the desired weight. However, the result obtained remained marred by great inaccuracies as to the actual molecular weight, the values determined corresponding only to an average of molecular weights varying considerably between them. This indeterminacy posed therapeutic problems when dextran was injected intravenously, as a 6% saline solution to dilute the blood plasma.
Pressurized steam hydrolysis, like acid hydrolysis, is imprecise, expensive and time consuming. Moreover, the only two enzymes known to be capable of effecting the hydrolysis of dextran gave rise to the same objections as aeide hydrolysis, that is to say that their action was imprecise and slow and that the product obtained was uncertain. as to the value of its molecular weight, or else the average weight varied in such a way that it was not possible to obtain a standard product.
The process according to the invention makes it possible to avoid these drawbacks and to obtain the desired molecular weight quickly, economically and precisely.
It is characterized in that a fungus of the Aspergillus Wentii family is cultivated in a medium containing dextran and a protein hydrolyzate and in that the enzyme produced by this fungus is made to act on dextran so as to split it. the molecules in portions of molecular weight, however, not lowering below 20,000.
The new product obtained is a white gum.
The fungus we use is from the Aspergillus Wentii family. For identification purposes, its growth was studied on Czapek sucrose agar, which is the standard medium used for classifying fungi. On this medium, the fungus produces rapidly growing colonies, with aerial mycelium forming dense flocculent masses. The crop is cottony white for three or four days, then it turns a gray without greenish tones. By prolonging the incubation period, the culture becomes denser and becomes covered with a mantle showing various grayish tints slowly becoming darker and turning brown. When the crop is fully developed, it is the color of coffee.
The inner side of the crop turns yellow to green and eventually becomes distinctly reddish, although yellow and green patches may persist. Substrate contains yellow pigments.
The conidial heads are large and coffee colored when ripe, and the combs show little tendency to divide. The eonidiophoric walls are smooth and substantially colorless. The vesicles are globular and especially fertile over their entire surface. The sterigmas occur specially in two series and bear chains of conidia which are globose, yellow-brown, and spine. No perithecia or sclerotia were observed.
If we compare the characteristics recorded about the different species of Aspergillus by the authorities in the matter, it becomes clear that this fungus approaches, but does not coincide with Aspergillus Wentii deerit. The latter is considered by the competent authorities to be a transitional form. One of the authorities in the matter (Manual of the Aspergilli, Thom and Raper, Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1945) indicates that Aspergillus Wentii is intermediate between the group A. niger and the group A. tamarii, A. flavus -oryzae or another.
Another authority (Industrial Myco logyo Smith, E. Arnold and Co., London, 1946), groups together the species A. ustus,
A. candidus, A. niger and A. Wentii. In the East, the species A. Wentii, A. tamarii, A. flavus and
A. oryzae are grouped together under the name
A. oryzae, this for the preparation of the various enzymotic products. It is clear that there is no sharp line of demarcation and that, although the fungus used here has many of the characteristics of the fungus
A. Wentii, it also has analogies with these other species.
As it does not exactly coincide with the typical A. Wentii species, nor with any of the other classified species, it could be given the species name Aspergillus dextranicumo, or even A. Wentii, variety dextranicum. However, mycological authorities are opposed to creating new species names, and have expressed the opinion that it is more practical to classify a new fungus in one of the classes, even if it is does not exactly match the description of types. Consequently, the fungus in question is classified in the class
Aspergillus Wentii.
In the present description, the term dextranase is used because it corresponds to the terminology used in the chemistry of enzymes and in which the suffix ase is to be added to the word of the substance attacked by the enzyme.
The enzyme produced by the fungus described is capable of hydrolyzing or splitting the dextran glucose chain along it, maintaining fragments of the desired molecular length. Until now, dextranases capable of splitting dextran were already known, but which appeared to mainly reduce sugar (glucose), indicating that these enzymes attacked the ends of the chain. In the present case, the enzyme produced does not act in this way. In repeated experiments, in which an excess of enzyme could act for a prolonged period on dextran, little reduced sugar was observed.
The enzyme produced, acting for long periods on different dextrans, reduced. It the molecules thereof to relatively small dimensions of between 20,000 and 40,000 and exhibited other side effects. This enzyme can be termed endodextranase to indicate its affinity for glucose bonds inside dextran molecules. The opposite species of enzyme, which is an exodextranase, exhibits an affinity for glucosic linkages to K
ends of polysaccharide chains which
constitute the dextran molecule.
Such
exodextranase enzymes cause prineipa
the reduction of sugar by attacking the
dextran and, therefore, are worthless
for the preparation of partially dextran
hydrolysis, as used to dilute the
blood. It is clear from the literature
that the only dextranases known until mo
ment of the present invention belong
to the class of exodextranases.
The enzyme obtained from the fungus
used here, being on the contrary an endodextra-
nase, attacks the dextran molecule with
links located behind the terminated groups
end, this quickly, and transforms
large molecules in weight products
relatively low molecular weight and low screw
cosity. Then a second reaction occurs.
daire which is very slow and in which the
zyme slowly attacks stockings products
molecular weight.
This is clear from
The following example, in which a preparation
purified and high endodextra content
nase was added as a dilution
at 1: 100 to a solution of dextran and in
which the following viscosity changes
were observed:
Time after mixing Relative viscosity
(in minutes) (compared to water)
0 7, 25
2 4, 69
3, 5 4, 09
4, 5 3, 77
6 3, 62
reduced viscosity of 50 ouzo
7, 5 3, 47
9 3, 36
11, 5 3, 25
40 2, 77
58 2, 61
1498 1, 77
viscosity reduced by 75 / o
2938 1.70 @
The viscosity has been reduced to 50 "/ o of the
original value in a time of 6 munites
only, while it took 1492 minutes
additional to reduce to 50 / o the relative viscosity of this intermediate solution
diary (or 25 / o of the original value). Water
very small changes were noted during
the following 1440 minutes.
We can demon
mathematically that the results obtained
required would be impossible if dextranase
attacked all the glueosic bonds in the dextran molecule with the same probability. This result can be explained only by the hypothesis that the terminal groups of the polysaccharide chains of the dextran molecule somehow disrupt the union of dextran with the enzyme, and by therefore decrease the rate of hydrolysis. When only small fragments remain, the enzyme then attacks them, albeit slowly and with difficulty.
Dextranase from the fungus
described from the family Aspergillus Wentii, then.
that it acts on dextran, produces suera
reduced in small quantities only.
This fungus can be grown from
following way:
First, we grow the mushroom
gnon for the production of the enzyme in
presence of a nutrient medium containing vitamins, dextran and a source of acids
amines. The dextran which has just been mentioned is not constituted by the mass of dextran which will be hydrolyzed by the action of this enzyme. A relatively small amount of dextran is used in nutrient media in order to acclimate the fungus and its enzymes to the dextran with which it will then be combined in large amounts.
A typical medium that causes the fungus to grow rapidly within a few days to produce a dextranase-rich solution is as follows:
Table 1:
PV medium
Component Grams per liter
Peptone 5, 0
Dextran 10.0
MgS04 0, 1
NaCl 0.1
FeSO4 0.01
MnS04 0.01
1 <H2PO4 0, 1
Na2SO4 2.0
<2S 4 0, 5
Milligrams
per liter
Nicotinic acid 1, 0
Riboflavin 0, 5
Vitamins Thiamine 0.5 @ Ca PantothÚnate 0.5
Pyridoxine 0, 4
Folic aid 0.01
Biotin 0, 001
The above medium is very satisfactory from the point of view of enzyme production,
but probably more complicated than necessary. Other examples are as follows:
1 A medium of composition given in Table I, the B vitamins being removed.
2 A medium according to the composition given in Table I, the B vitamins being replaced by a yeast extract at a rate of 0.4 g per liter.
3 A medium of composition according to Table I, but with the peptone replaced by a casein hydrolyzate at a rate of 5.0 g per liter, either with or without the B vitamins.
4 A medium of the composition shown, in which! the dextran content varies between 5.0 and 50.0 g per liter.
The most important point is that the enrichment of the medium with a protein hydrolyzate such as peptone or a casein hydrolyzate causes a remarkable stimulation of dextranase production.
The invention is described in detail in the following examples, in that. which concerns the enzymotic division of dextran.
Example I:
Part of a medium obtained by growing the fungus of the Aspergillus Wentii family in PV medium (Table I) was filtered, an em. of filtrate was added to 110 em3 of a fermented sucrose medium containing dextran in an eoneentratiOn of 7 / o. The mixture was incubated 31/2 h at room temperature. It was then transferred to a separate container and treated with 50 cm3 of acetone causing the solution to separate into two layers of liquid.
The lower layer was extracted to constitute fraction I of the enzymotically hydrolyzed dextran. We have a. 25 cm3 of acetone were added to the solution remaining in the container, which caused the separation of a new lower layer which was extracted to form fraction II. Addition of an additional 50 em3 of acetone then caused fraction III to separate.
Each of the three fractions was treated with alcohol to precipitate the
dextran as a white gum.
The products were then dried in a vacuum at a temperature above 70 C at constant weight. Thus, we obtained: Fraction
I = 5.0 g, fraction II = 1.5 g, fraction III
= 0.5 g, which gives a total of 7 g of enzymotically hydrolyzed dextran, for 7.7 g of crude dextran present at the start. Solutions at l "/ o of the fractions were prepared and the intrinsic viscosities were found equal to [where (n) = intrinsic viscosity]:
I. (n) = 0.14: = 35,000 mol weight.
II. (n) = 0.146: = 24000 mol weight.
III. (n) = 0.17: = 21000 mol weight.
Example He:
5 em3 of fungus filtrate containing the enzyme prepared as indicated above was added to one liter of a fermented medium containing dextran at a concentration of 7%. The mixture was incubated at room temperature for 5 h and was fractionated with acetone in a manner similar to that described previously. Thus, we obtained: fraction I = 49 g and fraction II = 13.2 g, thus recovering 60.2 g of hydrolyzed dextran per 70 g of crude dextran used at the start. By determining the intrinsic viscosities, it was found that they correspond to molecular weights of approximately I = 38,000 and II = 24,000.
Example III:
At 100 cm3 3d'a fermented medium containing dextran at a concentration of 7! o, 0.1 em3 of a fungus filtrate containing the enzyme was added. This was incubated at room temperature for 5 h and then this medium was fractionated with acetone, which yielded: fraction I = 5.6 g with a molecular weight of 69,000 and fraction
II = 0.7 g with a molecular weight of 21000 g.
Example IV:
A 8 liters of a fermented medium containing dextran at a concentration of. 6, 1 / o, 80 em3 of mushroom filtrate was added. The viscosity of the mixture was measured at various intervals. When the relative viscosity was reduced to the value of two, as determined by the Osterwald-Fenske N 300 viscometer, the action of the enzyme was stopped by adding alkali so as to obtain a µg of 10. The time it took to reach this value was 40 minutes. The mixture was clarified by treatment with alumina gel, after which it was treated with
The Sharples centrifuge.
The solution was then precipitated with alcohol to a concentration of 55% / a. The white gum was redissolved in 2 liters of water, treated with filter aid and filtered. The clear aqueous solution was precipitated with
Alcohol and gum dried to constant weight in vacuum at a temperature above 70 ° C. Thus, 400 g of a white product with an average molecular weight of 71000 were obtained.
In the above examples, the enzyme was used as it was in the culture solution. It is possible to precipitate the enzyme contained in the solution by adding acetone to the pure mushroom filtrate, so as to obtain an acetone concentration of between 35 and 55 O / o and to collect the white precipitate obtained. This white powder can be used to partition the dextran polymer by adding it to the fermented medium containing the dextran, or it can first be dissolved in dextran.
Water and then added to the dextran solution.
Other methods have been used to isolate the enzyme: for example, precipitation with such solvents! than dioxane or an alcohol, instead of acetone. It is also possible to use ammonium sulfate, sodium sulfate or sodium chloride, for example.
For example, high concentrations of enzyme were obtained by the following means:
a) Filtration of the medium to remove the fungus.
b) Addition of ammonium sulphate at a content of 70 g per 100 cm 3 of filtrate and evaporation of the precipitate.
c) Redissolution of the dextranase contained in a quantity of water corresponding approximately to one tenth of the volume of the filtrate indicated under b).
Reprecipitation of the enzyme using ammonium sulfate.
d) Repeating this cycle of dissolving the enzyme in water and repeatedly precipitating the enzyme with ammonium sulfate, continuing to decrease the volumes of solutions.
e) Dialysis of the final solution to remove foreign salts. Precipitation of the enzyme by adding acetone to an approximate concentration of 70% and drying the resulting precipitate to obtain dextranase as a stable powder at high concentration. Alternatively, the di-alysed solution can be cold dried to produce the enzyme as a stable and active powder.
In the examples given, the mushroom filtrate was used in a dilution ranging from 1: 100 to 1: 1000 (for example 0.1 em3 added to 100 em3). In other experiments, it has been found that a dilution of 1: 1000, working for a period of 1 to 5 hours gives satisfactory results.
However, the fungus filtrate is active in dilutions ranging from 1: 10,000 to 1: 100,000, although the reaction time should be prolonged accordingly.
When it is desired to stop the action of the enzyme, this can be done by making the solution alaline to a pH of about 9-10. This can also be done by making the solution acidic to a pH of around 2-3. In no case is acidity or alkalinity used to obtain reactions or degradations. It is only used to stop the enzymotic action.
Once the enzymotic action has reached the desired degree, the solutions can be clarified before being fractionated. This can be done as follows: By making the solution approximately 0.1 normal to alkali or acid and heating for a period of 5 to 15 minutes, a flocculent precipitate is formed. The solution is then neutralized, an adjuvant is added and the solution filtered, after which it should be fractionated if necessary. It should be noted that if treatment with an acid is used, care must be taken that the treatment conditions are mild in order to avoid further hydrolysis of the dextran.
Even with this restriction, it is preferable to use the acid, since heating in an alkaline solution sometimes tends to blacken the carbohydrates. Another purification method also applicable for hydrolyzed dextrans consists in treating the mixture of dextran degraded by the enzyme with an alumina gel, centrifuging and precipitating it as described in Example.
IV. By then filtering with a filter aid, the last traces of impurities are removed, thereby obtaining clear solutions such as water.
Advantages resulting from the use of the enzyme instead of the use of acid hydrolysis for the production of split dextran:
a) The dextranase can be used quickly and directly in the fermented medium containing the dextran. In this way, it is possible to avoid the expense and inconvenience of first precipitating the crude dextran with high volumes of a solvent such as alcohol, and redissolving the dextran prior to hydrolysis. . When using acid hydrolysis, it is customary to employ this slower process.
b) Acid hydrolysis is difficult to control and the resulting products have widely varying molecular weights.
The enzymotic hydrolysis is gentle, gives a white product and the molecular dimensions of the product vary little between them. The exact dispersion obviously depends on the concentration of the enzyme and the duration of the hydrolysis.
The control of the molecular weight is governed by the duration of the reaction and the temperature: to reduce the molecular weight of the des: - trane that we want to obtain, we can increase either the duration of the reaction, or the temperature or or both together, with the restriction that the enzyme being a protein, the temperature must not be increased beyond the point where this protein is broken down and, therefore, rendered unusable. The rate of the reaction can also be controlled by the degree of concentration of the enzyme.
The higher the concentration of the enzyme, the faster the reaction rate will be.