Procédé pour séparer, dans une solution, une ptéridine des impuretés qui l'accompagnent. L'acide ptéroylglutamique est un composé chi mique dont le nom exacte est: acide N- [4- 1 [ (2- amino-4-hydroxy-6-pyrimido [4;5-b] pyrazyl)- méthyl] -amino } -benzoy 1] -glutamique. Ce corps est un adjuvant de la croissance de divers organismes et présente donc des propriétés semblables à celles des vitamines et paraît identique à l'acide folique naturel.
Ce produit fait, à l'heure actuelle, l'objet d'une fabrica tion massive et est utilisé pour stimuler la formation de l'hémoglobine, ainsi que dans le traitement de l'agranulocytose; du psilosis et d'autres maladies apparentées.
On a mis au point diverses méthodes de préparation de l'acide ptéroylglutamique. La plupart de ces méthodes sont basées sur la réaction simultanée de la 2,4,5-triamino-6- hydroxy-pyrimidine, de l'acide p-aminoben- zoylglutamique et d'un composé approprié à 3 atomes de carbone renfermant des groupe ments aldéhyde et/ou halogénés réagissants, tel que l'alpha-bêta-dibromopropionaldéhyde. On prépare des produits connexes présentant des propriétés semblables ou contraires à celles des vitamines, par des procédés ana logues,
en partant d'autres amides de l'acide p-aminobenzoïque.
L'acide ptéroylglutamique a une molécule très complexe. Le processus par lequel cet acide se forme est, lui aussi, complexe. De nombreuses réactions secondaires sont suscep tibles de se produire en même temps que la réaction principale ou à la suite de celle-ci. En conséquence, le produit brut de réaction contient en général un nombre et une pro portion relativement considérables de subs tances indésirables parmi lesquelles se trou vent des produits intermédiaires qui ont in complètement réagi, des produits de conden sation et/ou de polymérisation, des isomères de position, des produits d'oxydation et di vers autres produits d'hydrolyse et de dégra dation.
Un grand nombre de ces produits contiennent un noyau pyrimidopyrazinique et présentent des caractéristiques physiques et chimiques voisines de celles de l'acide ptéroyl- glutamique lui-même. L'acide ptéroylglutami- que étant destiné à la thérapeutique, il est désirable de séparer les ptéridines biologique- ment inertes qui se forment dans le mélange réactionnel.
Bien que l'on ait mis au point divers pro cédés pour séparer l'acide ptéroylglutamique des ptéridines connexes qui sont présentes dâns le mélange de réaction brut, la plupart de ces procédés sont coûteux ou très com pliqués, exigeant des manipulations précises si l'on veut aboutir à une récupération moyennement satisfaisante de l'acide ptéroyl- glutamique. La présente invention a pour but de fournir un procédé permettant de séparer, en solution,
l'acide ptéroylglutamique ou autres ptéridines biologiquement actives des ptéridines inactives ou autres impuretés, avec une facilité relative et avec un rendement relativement bon. Ce procédé peut s'adapter aisément à la production industrielle.
Le procédé suivant l'invention pour sépa rer dans une solution contenant une ptéridine correspondant à la formule générale
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où R est le reste d'un aminoacide ou d'un peptide, ladite ptéridine des impuretés qui l'accompagnent et notamment de ptéridines de formule autre que la formule ci-dessus, est caractérisé en ce qu'on ajoute à cette solu tion un sel de zinc soluble et règle le pH du liquide à une valeur comprise entre 10,5 et 11,2, en ce qu'on sépare les matières préci pitées, constituées essentiellement desdites im puretés sous forme de combinaisons de zinc, d'avec la.
solution qui contient la majeure partie de la ptéridine désirée sous forme d'un sel de zinc, soluble, et régénère finalement cette ptéridine.
Le procédé suivant l'invention repose donc essentiellement sur les différences de solubi lité que présentent les sels de zinc des di verses ptéridines présentes dans le mélange de réaction brut. Les sels de zinc de nom breuses ptéridines inactives sont pratique ment insolubles pour un pH compris entre 10,5 et 11,2, tandis que le sel de zinc de l'acide ptéroylglutamique ou autres ptéri- dines actives est moyennement soluble pour ces valeurs du pH.
Par contre, pour les pH d'environ 6,5 à 7,0, les sels de zinc des ptéri- dines actives sont pratiquement insolubles, tandis que ceux des ptéridines inactives sont relativement solubles. _ De préférence, on part d'une solution de ptéridines fortement alcaline et on réalise simultanément l'ajustement du pH de cette solution à une valeur comprise entre 10,5 à 11,2, et la précipitation des impuretés par addition à. ladite solution, chaude ou froide, d'un sel acide de zinc. La solution peut alors être filtrée ou centrifugée, pour en éliminer les impuretés précipitées.
On peut ensuite ramener le pH clé la solu tion jusqu'à une valeur comprise entre 6,5 st 7,0 environ, en y ajoutant de nouvelles quan tités d'un sel acide de zinc ou par une addi tion d'acide. Dans ces conditions, le sel de zinc de l'acide ptéroylglutamique, par exem ple, présente une solubilité minimum et pré cipite.
La solubilité du ptéroy lglutamate de zinc n'augmentant que légèrement lorsque la tem pérature s'élève, tandis que celle des sels de zinc -des impuretés augmente plus fortement, il est donc préférable que la précipitation du ptéroy lglutamate de zinc ait lieu à chaud, de préférence entre 50 et 95 C environ.
Le ptéroylglutamate de zinc ainsi préci pité est déjà d'une pureté relativement élevée; cependant, il est en général utile de répéter le processus jusqu'à ce que la presque tota lité des impuretés ait été éliminée. Pour cela, on dissout ledit sel de zinc dans une solution aqueuse d'une base, telle que la soude caus tique, la chaux, l'hydrate de baryum, etc., à un .pH supérieur à 11,5. On peut alors sépa rer l'hydrate de zinc et autres substances in solubles par filtration et répéter l'opération de précipitation décrite plus haut..
Lorsqu'on juge avoir poussé l'épuration assez loin, on traite la. solution du sel de zinc par un acide pour ramener son pH en dessous de 5, de préférence à 3 environ, ce qui pré cipite l'acide ptéroy lglutamiquc libre. Le pro duit peut être séparé de sa liqueur mère et séché, ou bien incorporé à des produits phar maceutiques divers.
Bien que le présent. procédé soit particu lièrement utile en vue de l'épuration de l'acide ptéroy lglutamique, on a constaté qu'il est également intéressant en vue de la sépara tion d'autres ptéridines biologiquement actives telles que l'acide ptéroylglutamylglutamique, l'acide ptéroyldiglutamique, et autres amides d'aminoacides de l'acide ptéroique, des impu retés qui les accompagnent. On va maintenant décrire de façon géné rale une application du procédé à la purifi cation d'acide ptéroylglutamique.
De l'acide ptéroylglutamique, en mélange avec des ptéridines non identifiées et autres produits de la synthèse, est traité dans l'eau à une température comprise entre 25 et 75 C environ par de l'hydrate de calcium ou de baryum, à raison de deux ou trois parties au moins d'hydrate pour une partie d'acide ptéroylglutamique et de façon à obtenir une solution dont la concentration en acide ptéroylglutamique vrai est de 0,2 à 3,0 g par litre. Le pH de la solution doit être d'au moins 11,5. La solution est ensuite filtrée pour en éliminer les impuretés insolubles.
On ajoute alors au filtrat une solution de chlorure de zinc, de sulfate de zinc, d'acétate de zinc ou autre sel acide soluble de zinc, pour -en ramener le pH à une valeur comprise entre 10,5 et 11,2. La quantité de sel de zinc ajoutée doit être dosée avec précision, car lorsque le pH est inférieur à 10,5, une grande partie de l'acide ptéroylglutamique est per due, tandis que lorsque le pH dépasse 11,2, on n'arrive pas à éliminer les impuretés en quantité suffisante.
On filtre ensuite la solution pour en sépa rer les impuretés qui précipitent à la suite du traitement par le sel de zinc. On obtient une solution jaune limpide qui contient entre 6 5 et 901/o environ de l'acide ptéroy1glutami- que initial.
La solution chauffée est. portée à une tem pérature comprise entre 50 et 95 C et est traitée de nouveau par le sel de zinc ou par un acide pour en ramener le pH à une valeur comprise entre 6,5 et 7,0, le sel de zinc de l'acide ptéroylglutamique -étant alors préci pité de la solution.
Le sel de zinc précipité est soumis à une nouvelle purification, le cas échéant, par re- dissolution dans l'eau avec la soude caustique, le carbonate de sodium, l'hydrate de calcium, l'hydrate de baryum, ou une autre base, puis précipitation sous forme du sel de zinc comme on vient de le décrire. Dans certaines circons tances, il peut falloir jusqu'à cinq précipita- tions du sel de zinc, ou davantage, pour enle ver toutes les impuretés associées à 1-'acide ptéroylglutamique.
On dissout le sel de zinc final dans une solution d'hydrate de calcium ou de baryum et on la clarifie pour en éliminer les composés insolubles de zinc. On ajoute alors de la solu tion de chlorure de zinc pour réduire le pH à une valeur comprise entre 9,5 et 11,5 afin d'éliminer les dernières traces de pigment rouge, après quoi on filtre la solution et on la traite par uni acide pour précipiter l'acide ptéroylglutamique à un degré de pureté qui suffit à la plupart des applications.
Les exemples qui suivent se réfèrent à des exécutions précises du procédé de l'invention. <I>Exemple 1:</I> On dissout dans l'eau de l'acide ptéroyl- glutamique résultant de la réaction de la 2,1,5-triamino-6-hy droxypyrimidine de l'alpha- bêta-dibromopropionaldéhy de et de l'acide p-amino-benzoylglutamique, avec de la chaux à 60 sous une concentration de 1 g d'acide ptéroylglutamique vrai par litre et à un pH de 11,5 à 12,1. On filtre la solution pour en séparer .les sels de calcium insolubles et une partie des impuretés.
On ajoute au filtrat une solution de chlo- rure de zinc à 20 % pour en ramener le pH à 10,6-10,8 et l'on filtre de nouveau la solu tion pour obtenir une solution jaune limpide, contenant la plus grande partie de l'acide ptéroylglutamique initial.
On traite alors la solution du sel de zinc de l'acide ptéroylglutamique par une nouvelle quantité de la solution de chlorure de zinc, à une température de 80 C, pour en ramener le pH à 6,8, valeur pour laquelle le sel de zinc précipite de la solution.
On redissout le sel de zinc précipité avec de la chaux dans l'eau et l'on recommence cinq fois le processus que l'on vient de dé crire. La solution finale de sel de zinc à un pH de 10,6-10,8 est alors traitée par l'acide sulfurique jusqu'à un pH de 3 environ pour précipiter de l'acide ptéroylglutamique ayant un degré de pureté de 85 à 90 0/0.
Exemple <I>2:</I> On met en suspension 3 g d'acide ptéroyl- g 0# lutamique vrai sous la forme de 100 g de matière brute, dans un peu d'eau pour ob tenir une pâte homogène et l'on étend à 2000 cm3. On traite cette pâte par 40 cm' d'une solution normale de soude caustique, on la chauffe à 500 C et on étend encore à 3400 cm3.
On ajoute à cette solution, en agitant énergiquement 14 g de chlorure de calcium sous la forme d'une solution aqueuse à 15 0/0, de manière à ne pas modifier le pH de 11,7. On sépare par filtration le précipité de cou leur foncée et lave sur le filtre avec de l'eau froide.
On traite ce filtrat par une solution aqueuse à 10 0/0 :de chlorure de zinc jusqu'à un pH de 10,8, on ajoute 20 g d'adjuvant de filtrage et l'on sépare par filtration le pré cipité de couleur foncée.
0 traite le filtrat de couleur jaune clair par une solution aqueuse à 10 % de nitrate de plomb, jusqu'à un pH de 6,8. Après addi tion de 40 g d'adjuvant de filtrage, on chauffe la solution à 80\0 C et la filtre à chaud.
On dilue le tourteau de filtrage humide dans un litre d'eau et on le traite par de la saude caustique diluée jusqu'à ce qu'il donne une tache rose à peine sensible sur un papier à la Benzoazurine, puis on l'étend à 3 litres et on le traite par une solution de nitrate de plomb jusqu'à un pH de 7,5. On le chauffe alors à 800 C et l'on sépare l'insoluble par filtration. On soumet le tourteau de filtra tion trois fois à l'opération décrite ci-dessus, jusqu'à ce que sa teneur en ptéridines neutres soit inférieure à 15 gammas par ml.
Après le dernier traitement, on étend le tourteau humide dans 1,5 litre d'une solution de soude caustique 0,1 N et l'on sépare les insolubles par filtration. Après addition de 20 g d'adjuvant de filtrage, on ajuste le pli du filtrat à 3,2 par l'acide chlorhydrique. On recueille le précipité sur le filtre en même temps que l'adjuvant de filtrage. On traite ce tourteau par un excès de chaux dans 1500 cm' d'eau et on le filtre. On chauffe le filtrat à 850 C et on l'acidule jusqu'à un pli de 3 à 4 par l'acide acétique. L'acide ptéroylglutami- que précipite et on le recueille sur filtre après refroidissement, on le lave à l'eau -et à l'alcool et le sèche.
On obtient 1,4 g de ma tière ayant un degré de pureté de 86,5 010.
<I>Exemple 3:</I> On dissout 1884 g d'un produit. de réaction brut contenant 12,9 0/a d'acide ptéroylglutamyl- gluta.mique et obtenu par réaction du sulfate de 2,4,5-triamino-6-hy droxypyrimidine avec la dibromopropionaldéhyde et l'acide p-amino- benzoylglutamy lglutamique, dans 250 litres d'une solution 0,1 normale de soude caustique à. 600 C. Ensuite, on ajoute 500 g d'un adju vant de filtration à. base de terre de diatomées et encore 1350 g de chlorure de chaux dissous dans une petite quantité d'eau. Le mélange ainsi obtenu était ensuite filtré.
Aux 255 litres du filtrat contenant 0,759 mg d'acide ptéroyl- glutamy1glutamique par cm', on ajoute 2 kg d'adjuvant de filtrage et une solution conte- nant 20 % de chlorure de zinc jusqu'à un pH de 10,8-10,9. La température de la solution est maintenue à 400 C.
La suspension est filtrée et le filtrat, consistant en 267 litres contenant 0,570 mg d'acide ptéroy1glutamyl- glutamique par em3, est traité encore une fois avec 2 kg d'adjuvant de filtrage ainsi qu'avec une solution contenant 20 % de chlorure de zinc jusqu'à l'obtention d'un pH de 6,8. La suspension est de nouveau filtrée et le filtrat écarté.
Le tourteau de filtrage est traité dans 35 litres de soude caustique 0,1 N à une tem pérature de 400 C pendant 20 minutes. Après, on ajoute de l'acide chlorhydrique concentré jusqu'au pH 2,4 et refroidit la solution à une température de 100 C à l'aide de glace. La solution est ensuite filtrée et le tourteau con tenant l'adjuvant de filtrage et l'acide ptéroyl- glutamylglutamique est récupéré.
Le tourteau obtenu de cette façon est dis persé dans 2,8 litres d'eau et 280 cm3 de soude caustique 10 N à 500 C et ensuite filtré. Le tourteau est lavé deux fois en le disper- sant dans 4,2 litres d'eau et 100 cm' de soude caustique 10 N et en filtrant. Le filtrat est dilué à 14 litres à une température de 40" C. On ajoute rapidement 960 cm? d'acide chlor- hy drique concentré en agitant. La solution est ensuite refroidie un peu au-dessous de 0" C, pendant 3 heures, après quoi on ajoute 700g d'adjuvant de filtrage, filtre et lave le tourteau avec de l'eau.
Le tourteau de filtrage obtenu de cette taon est traité à 60" C avec 20 litres d'eau et 224 cm' de soude caustique 10 N, après quoi on ajoute 415 cm-" d'une solution de chlorure de calcium à 30 "/o et filtre la solu tion. Au filtrat, on ajoute à une température de 40" C 700 g d'adjuvant de filtrage et assez (le chlorure de zinc pour établir un pH de 10,85 dans la solution. La suspension est. fil trée et le filtrat traité avec assez d'acide chlorhydrique concentré pour dissoudre de nouveau le précipité formé préalablement. La solution est ensuite refroidie à une tempéra ture un peu au-dessous de 0" C pendant 3 heures, après quoi on récupère le précipité formé et le lave deux fois à l'eau en le dis persant chaque fois dans 1 litre d'eau.
Après avoir séché un petit échantillon dans le vide à 100"C, l'analyse chimique montra qu'il contenait 951/o d'acide ptéroylglutamyl- glutamique pur.
<I>Exemple 4:</I> De l'acide ptéroyl-y-glutamyl-y-glïitamyl- glutamique brut contenant 10,6 parties d'acide pur ainsi que les impuretés provenant clé la réaction, est mis en suspension dans 10 000 parties de soude caustique 0,1 N, et la température élevée à. 60" C. A cette solution on ajoute 260 parties d'une solution de chlo rure de calcium à 30 "/o et 100 parties d'adju vant de filtrage, après quoi on clarifie la solution par filtration.
Le filtrat est refroidi à 45" C et on y ajoute assez d'une solution de chlorure de zinc à 10 % pour abaisser le pH à 10,6-10,8. On ajoute encore 100 par ties d'adjuvant de filtrage et filtre.
Le pfr du filtrat obtenu est réglé à une valeur de 6,7 à 6,9 par addition de solution de chlorure de zinc à 10 % et on élève la température à 70" C. On ajoute de nouveau 100 parties d'adjuvant de -filtrage et filtre.
Le tourteau contenant le sel .de zinc de l'acide ptéroyl-y-glutamyl-y-glutamylglutamique dé siré est mis en suspension dans 1000 parties d'eau et assez de chaux pour que la solution donne une tache forte sur le papier à. la benzoazurine. La température est élevée à. 50" C et la solution clarifiée. On acidifie le filtrat à un pH de 2,5 à l'aide d'acide chlor hydrique concentré et on abaisse la tempéra ture à 5" C. On ajoute de nouveau de l'adju vant de filtrage et filtre la solution. Le tour teau de filtrage contient l'acide ptéroyl-y- glutamyl-y-glutamylglutamique débarrassé de la majeure partie des impuretés présentes dans le mélange de réaction brut.
Le produit peut être purifié plus à fond en répétant la précipitation à l'aide du sel de zinc, comme décrit phis haut.