Procédé pour la séparation d'acide ptéroy1glutamique d'avec des ptérines apparentées. Cette invention se rapporte<B>à</B> un procédé pour la séparation d'acide ptéroylglutamique d'avec des ptérines apparentées.
La synthèse, réalisée avec succès, du L. easei factor. également connu sous le nom (Vaeide folique, a été mentionnée dans ,Seienee , vol.<B>103,</B> page<B>667, 31</B> mai 1M. Ce produit synthétique, qui porte le nom scientifique d'acide N-[4-1-[(2-amino-4 liydroxy-6-pyrimido-[4,5-bl-pyrazyl)-métliyll- iiminol-benzoyll-,-Iutamique, et qui est d'or dinaire appelé de façon pl-Lis concise acide ptéroylalutamique, est identique ou analogue au L. casei factor isolé de sources naturelles.
La formule de structure de l'acide ptéroyl- glutamique est la suivante:
EMI0001.0015
<B>Il</B> a été constaté que ce produit synthétique est un agent thérapeutique important<B>dans</B> le traitement d'anémies macroeytiques et autres maladies analogues du sang.
En raison de l'importance de ce nouveau produit m-nthétique dans l'art médical, il est devenu nécessaire (le le préparer en grandes quantités et<B>à</B> un de-ré relativement élevé de pureté. Bien qu'il ait été proposé divers pro cédés<B>(le</B> préparation de l'acide ptérovigluta- inique, tous ces procédés conduisent<B>à</B> la for mation de proportions considérables de pro duits secondaires biologiquement inactifs, qui doivent être éliminés de la substance théra peutique.
Beaucoup de ces produits secon daires sort étroitement apparentés<B>à</B> l'acide ptéroviglutamique et, comme on pouvait s'y attendre, possèdent des propriétés physiques el ehimiques analogues, telles que la solubilité, <B>1</B> par exemple.<B>Il</B> est par conséquent difficile tic séparer l'acide ptéroy1glutamique des pté- rines apparentées dans les mélanges résul tant d'une synthèse chimique,
et les procédés proposés jusqu'ici<B>à</B> cet effet impliquent un grand nombre de manipulation- et convien nent mal<B>à</B> une production industrielle.<B>Il</B> a été maintenant découvert un procédé très simple de purification d'acide ptéroy1gluta- inique produit par svnthèse, procédé qui peut être utilisé dans la production industrielle sur une grande échelle pour obtenir un produit possédant un degré beaucoup élevé de pureté. Ce procédé peut être utilisé seul ou en com binaison avec d'autres prQcédés.
Le procédé selon l'invention, pour la sépa ration d'acide ptéroylglutamique d'avec, des ptérines apparentées, est caractérisé en ce qu'on dissout l'acide ptérovIgliitamique impur dans une solution aqueuse d'un acide fort, d'une concentration d'a-Li moins<B>2N</B> en cet acide,
pour former un sel<B>de</B> l'acide ptéroyl- glutainique et en ce qu#on dilue la solution avec de Peau de façon<B>à</B> provoquer la disso- eiation dudit sel et la séparation d'acide ptéroy1glutamique d'un degré de pureté plus élevé que l'acide initial.
Le présent procédé est basé sur la décou verte que, lors de la dilution de solution du produit impur, dilution entraînant la disso ciation des sels formés, l'acide ptéroyl-lutami- que tend<B>à</B> se séparer en premier lieu et qu'il est donc possible de régler cette dilution de façon<B>à</B> obtenir une séparation sélective dadit acide, la plupart des ptérines biologiquement inactives restant en solution dans l'acide di lué, mais encore modérément concentré.
L'acide chlorhydrique est Facide utilisé de préférence pour exécuter le procédé selon l'invention, bien qu'on puisse utiliser d'autres acides forts, tels que les acides broinhydri- cinés, nitriques, sulfuriques, phosphoriques, chloracétiques, formique, toluène-sulfonique et analogues. On dissout de préférence l'acide ptéroy1glutamique brut dans une solution d'un acide fort dune concentration supé rieure<B>à 5N</B> et en quantité aussi grande que possible.<B>Il</B> West ordinairement pas nécessaire de chauffer la solution.
Des essais de stabilité, ont montré que l'acide ptéroylci-LLtamiqiie pe Lit être récupéré avec un rendement de<B>90</B> Oio <B>à</B> partir d'acide chlorhydrique 12N après<B>6</B> heLires <B>à</B> la température ambiante.
Aprèq 48 heures, il était encore possible d'en réeupérer la plus grande partie.<B>A 500 C,</B> l'acide ptéro#,lglutami- que peut rester en contact avec l'acide chlor hydrique 12-NT pendant<B>3</B> heures environ sans décomposition sérieuse.<B>A</B> des températures de l'ordre de<B>750</B> C, il se produit une forte décomposition, même en utilisant des acides d'une concentration plus faible.<B>Il</B> est par conséquent préférable de réaliser le procédé clans un intervalle de températures allant clé 0'- <B>C</B> ou moins,
jusqu'à une température qui n'est pas supérieure<B>à 750 C.</B>
La précipitation de l'acide ptéroylglutami- que s'effectue avantageusement en diluant la solution acide j,,isqii#ù ce que sa concentration en acide fort soit comprise entre<B>0,5N</B> et<B>5N.</B> La dilution<B>à</B> une concentration inférieure<B>à</B> <B>0,5N</B> aurait pour résultat la précipitation d'une partie des: impuretés avec l'acide pté- ro#,1,c,,I-Litamiq Lie, tandis que. pour une concen tration supérieure<B>à, 5N,</B> il ne se produira pas une précipitation complète du produit actif.
La concentration optimum de la solution di luée pour une précipitation complète et ra pide de l'acide pt6royl'-i-Litamique est de<B>1 à</B> <B>2N,</B> quand elle contient<B>1</B> partie d'acide ptéroy-1glatainique pour<B>100 à</B> 200 parties de solution.
On peut, améliorer considérablement l'effi cacité du procédé par l'utilisation de charbon de bois activé, notamment lorsque la matièe première est clé faible ptireté. On traite alors avec du charbon<B>de</B> bois activé la solution acide avant, dilution et on élimine eelui-ci par filtration avant de diluer la solution. Le char bon de bois ne doit pas être utilisé clams des solutions de concentration relativement faible en acide fort, car il tend alors<B>à</B> adsorber l'acide ptéro:rlglutamiqiie.
L'invention peut être réalisée comme indi qué dans les exemples suivants: <I>Exemple<B>1:</B></I> On a dissous une certaine (Ictantité d'acide ptéroyl-littamiqiie brut. eoiiteiiant <B>1 g</B> de 'la matière active., le reste étant des ptérines constituant (les sous-produits de la synthèse, dans<B>20</B> em3 d'acide ehlorhydrique concentré (12N) <B>à</B> la température ambiante.
On a en suite traité la solution par quelques grammes de charbon clé bois activé et on a filtré. lia solution claire a ensuite été diluée avec de Veau jusqueà une concentration clé<B>1N</B> en acide chlorhydrique. Par repos, des cristaux d'acide ptéroyl-lutamique se sont séparés de <B>la</B> solution.
<I>Exemple 2:</I> Un mélange clé réaction brut de<B>17,5 g,</B> contenant d'acide i)téroviglutaniique réel, a été mélairgé avec<B>100 g</B> d'acide ehlorhydri- que <B>12N à 320C.</B> La plus grande partie de la matière s'est dissoute eii donnant une solu- tion brun-clair, qui est toutefois devenue légè- renient trouble après un repos cle <B>15</B> minutes.
On a ensuite ajouté<B>25</B> de charbon de bois activé et, après 20 minutes, on a filtré le mé lange. On a lavé le gâteau de filtration, d'abord avec 20 em3 d'acide chlorhydrique l-2N et ensuite avec<B>10</B> em3 de cet acide fort, et on a dilué le filtrat et les produits de la vage combiné-, avec<B>100</B> cm.3 d'eau, puis oit a refroidi<B>à 51 C</B> pendant une heure enviroD. Le précipité a été recueilli sur le filtre, lavé avec de J'eau et de l'acétone, et séché.
Un essai chimique du produit a montré qu'il est constitué d'acide ptéroylo-lutamique <B>à</B> 82,1%.
Après repos pendant la nuit, la solution a déposé une seconde récolte de cristaux qui,<B>à</B> l'essai, ont montré une pureté légèrement plus grande.
<I>Exemple<B>3:</B></I> On a mélangé 4<B>g</B> d'un produit de réaction brut, contenant 24,8 % d'acide ptéroylglutaini- que réel, le reste étant constitué par des pté- rines apparentées et quelques produits aidant la filtration, avec 20 em3 d'acide chlorhydri que<B>12N.</B> On a ajouté<B>1 g</B> de charbon de bois activé, et on<B>a</B> filtré la suspension. Le filtrat jaune clair<B>a</B> été dilué.<B>à 1.00</B> cm? avec de l'eau et a été refroidi.
Après<B>16</B> heures, le précipité jaune qui s'était formé a été re cueilli, lavé avec de 15eau et de l'acétone, et séché.<B>A</B> J'analyse, on a constaté que le pro duit consistait en acide ptéroy1glutamique <B>à</B> 85,5%.
<I>Exemple<B>-1:</B></I> Un mélange brut, pesant 1.0,4<B>1-</B> et conte nant<B>1. g</B> diacide ptéro-%,Igl-Lttamiqi.-te réel sous la forme de son sel clé zinc, a été mis en sus pension dans<B>9-0</B> cm' d'acide chlorhydrique <B>12N</B> et<B>a</B> été traité par<B>1</B> clé charbon de bois activé.
La suspension .3 ensuite été filtrée et le gâteau de filtration a été lavé avec une quantité d'eau suffisante pour donner un vo lume total. de<B>100</B> em3. De l'acide ptéroyl- glutamique, dans -tin état beaucoup plus élevé (le pureté, a précipité clé la solution par repos. <I>Exemple<B>5:</B></I> <B>A</B> 40 eni3 d'acide chlorhydrique concentré, à la température ambiante, on a ajouté<B>9 1<U>g</U></B> d'acide ptéroy1glutamique a<B>39,3 %,<I>10</I> g</B> de charbon de bois activé, et on a agité la sus pension pendant l/. heure.
Après filtration<B>à</B> travers un filtre en verre fritté, le filtrat a été dilué<B>à</B> 430 em3. Après '/,, heure<B>à</B> la tem pérature ambiante, l'acide ptéroylgl-uitamique a commencé<B>à.</B> cristalliser<B>à</B> partir de la solu tion. On a agité la solution pendant % heure <B>à 250 C</B> et on a ensuite refroidi<B>à 100</B> C; la matière solide a été séparée par filtration, lavée avec de l'eau et de l'acétone.
Par sé chage<B>à</B> 601, C et analyse, on a constaté qu'elle contient de l'acide ptéroviglulamique <B>à</B> 92,21/o et<B>2,9</B> % d'eau.
<I>Exemple<B>6:</B></I> Le mode opératoire décrit dans l'exemple précédent a été répété en utilisant moins de charbon de bois,<B>3</B> parties en poids pour cha que partie d'acide ptéroy1glutamique réel. Le produit obtenu était d'un degré de pureté légèrement plus élevé et a été recueilli avec un rendement sensiblement plus élevé.
<I>Exemple<B>7:</B></I> Un échantillon de<B>5 g</B> d'acide ptéroyl- glutamique <B>à</B> 88 /o a été dissous dans<B>50</B> cm, d'acide chlorhydrique<B>à 37</B> %, a été traité par <B>5 g</B> de charbon de bois aetivé et a été filtré. Le charbon de bois a été lavé avec<B>100</B> eni- de l'acide chlorhydrique, et les produits du lavage ont été combinés avec le filtrat qui a ensuite été dilué<B>à. 500</B> em3 avec<B>de</B> l'eau chaude. Par repos<B>à</B> 4-60<B>C,</B> il s'est déposé 4,6<B>g</B> d'acide ptéroylgl-Litamiq-uie cristallin.
Après répétition de l'opération de cristallisation, le produit a été recueilli. a été lavé avec de l'eau, de l'alcool et de l'éther et, a été séché<B>à</B> 1-401, <B>0</B> pendant 4 heures. L'analyse chimique cl-Li produit au point de vue de sa teneur en carbone, hydrogène et azote, coïncidait<B>à</B> peu près parfaitement avec les valeurs théoriques pour C191TI906N7. JJ20. Exeni.ple <B><I>8:
</I></B> Un échantillon de<B>2,78 g</B> de matière brute, contenant 129% d'acide ptéroy1glutamique, a été dissous dans<B>15</B> cins d'acide phosphorique 15N. La solution a ensuite été traitée par <B>2,78 g</B> de charbon de bois activé et a été fil trée. Le charbon de bois a été lavé aVeC <B>10</B> CM3 clé la solution d'acide phosphorique; les pro duits de lavage et le filtrat ont été combinâ et dilués<B>à 100</B> ellis avec de l'eau.
Après repos pendant la nuit ùâ 4-60<B>C,</B> il a été re cueilli de l'acide ptéroy1glutamique d'une pu reté de<B>50</B> %.
En répétant deux fois le traitement décrit ci-dessus, la pureté de Facide ptéroyl,-I-Litami- que a été accrue jusqu'à<B>92 "/'0</B> environ.
<I>Exemple</I> 9: Un échantillon de<B>2,78 g</B> d'acide ptéroyl- glutamique <B>à</B> 1211/o a été dissous dans un mé lange de 20<B>g</B> d'acide trichloracétique dans 20<B>g</B> d'eau. Cette solution a été traitée par<B>1 g</B> de charbon de bois activé, a été filtrée et, di- hiée <B>à</B> 120 ciii3 avec de l'eau, Le mélange a été chauffé jusqu'à, ce quon obtienne une so'lu- tion claire, qui a ensuite été traitée par<B>1 g</B> de charbon activé et a été filtrée.
Par refroi- dissenient rapide du filtrat, il s'est séparé une Par matière repos <B>à</B> goudronneuse 4-60 C,
il s'est qui déposé a été des enlevée' cris- taux d'acide ptéroy1glutamique <B>à</B> 801/o. Une seconde récolte de cristaux, qui se sont<B>dé-</B> posés après un repos supplémentaire, ont montré <B>à</B> Fessai une pureté de 90%.
<I>Exemple<B>10.</B></I>
Uri échantillon de<B>2,78<U>-</U></B> de matière brute, contenant<B>de</B> 12 11/o d'acide ptéro.# Ighitamique, <B>a</B> été dissous dans<B>8</B> em- d'acide sulfurique <B>18N,</B> traité par<B>1 g</B> de charbon de bois et filtré. Le charbon de bois a été lavé a7,Tec 2 em3 de l'acide sulfurique 12'#N;'Ies produit.-, de lavage obtenus ont été combinés avec le filtrat. qui a été dilué<B>à 90</B> ems et a été main tenu<B>à</B> 4-W<B>C</B> pendant ïa nuit.
La solution refroidie a été filtrée et le filtrat a été dilué <B>à 180</B> em3 avec de l'eau. Après repos<B>à</B> -1-60C, il s'est déposé de lacide ptéro.0- -ÇYluta,niiqtie d'une pureté de 501/o.
<I>Exemple<B>11:</B></I> Un échantillon de<B>5 g</B> d'acide ptéroyl- gl utamique <B>à</B> 12 % a été dissous dans 20 eT-ii3 d'acide bromhydrique <B>à</B> 48 'Io, a été traité par <B>9</B> <B>1</B> g, <B>(le</B> charbon clé bois, filtré, traité -une, se- eonde fois par<B>3 g</B> de charbon de bois et filtré <B>à</B> nouveau.
Le filtrat a été dilué<B>à</B> 200 ems avec de l'eau et a été abandonné au repos pendant la nuit<B>à</B> la température ambiante. Le produit cristallin qui s'est déposé a étk recueilli, lavé, séché et examiné. On a constaté qu'il s#agït d'acide ptéroy1glutamique d'une pureté de<B>88</B> 1/0.
<I>Exemple .12:</I> On peut se dispenser d'utiliser du charbon de bois activé lorsqu'on part diacide ptéroyl- glutamique qui a<B>déjà</B> été purifié Jusqu'à un degré de pureté de 75-90%.
<B>1</B> -d'acide ptéroyl.-lutamique, d'une pu reté de<B>88 0/û,</B> a été dissous dans 20 enil d'acide phosphorique 20<B>N.</B> La solution a en suite été diluée<B>à 100</B> em3 avec de l'eau chaude. La cristallisation a commencé immé diatement. Après repos<B>à</B> 4-60<B>C</B> pendant la nuit, il a été recueilli<B>0,88<U>- y</U></B> d'acide ptéroyl- gl <B>-</B> utamique dune pureté améliorée.
On a répété le même mode opératoire en utilisant de l'acide sulfurique<B>18N,</B> de l'acide nitrique<B>à</B> 70%, de l'acide dichloracétique, de Facide formique<B>à</B> 9011/o et de l'acide toluène- sulfonique <B>à</B> 75%. Dans chaque cas, les ré sultats ont<B>été</B> sensiblement les mêmes: il s'est déposé de Facide ptéroy1glutamique d'une pureté améliorée.