Verfahren zur Gewinnung eines antithyreoidal wirkenden Produktes. F. Blum konnte dartun (F. Blum, Experi mentelle und klinische Studien über Epithel- körperchen, Schilddrüse und Blut. Aus "Endokrinologie" Bd. VIII, 1931.
Dort auch die übrige Literatur angegeben.), dass in jedem Normalblut - im Blut schild- drüsenloser Tiere ohne besondere Mengen vermehrung - eine antithyreoi.dale Kompo nente vorhanden ist, die offenbar eine wich tige Regulierung der .Schilddrüsentätigkeit ausübt.
In neueren Versuchen F. Blums er gab sich, dass die genannte antithyreoidale Wirkung des Blutes nicht auf eine Adsorp- tion oder auf die kolloidale Beschaffenheit des Blutes zurückzuführen' ist; dass sie viel mehr einer bestimmten Komponente des Blutes zuzuschreiben ist, die als "antithyreoi- dale Komponente" bezeichnet wird.
Gegenstand vorliegender Erfindung ist nun ein Verfahren zur Gewinnung eines anti- thyreoidal wirkenden Produktes, welches da- .durch gekennzeichnet ist, dass man ein Aus- gangsmaterial, das den antithyreoidal wir kenden, eiweisshaltigen Blutanteil enthält, mit einem Mittel behandelt, das das anti- thyreoidal wirkende Produkt aus seiner Bin dung an Eiweiss abspaltet und gleichzeitig das Eiweiss koaguliert, darauf das Eiweiss koagulatextrahiert und in .dem Filtrat der Eiweisskoagulation,
sowie den Extrakten aus dem Eiweisskoagulat das antithyreoidal wir kende Produkt durch Einengen anreichert. Wie Versuche ergaben, befindet sich im Fil trat des Eiweisskoagulats die Hauptmenge .des antithyreoidal wirkenden Produktes und in den Extrakten der restliche Anteil. Die Extraktion !des Eiweisskoagulats erfolgt zweckmässig mit Wasser, doch hat sich auch als. vorteilhaft erwiesen, verdünntes Alkali zur wässerigen Extraktion - auch unter ge lindem Erwärmen - anzuwenden.
An Stelle von Wasser oder von aIkalihaltigem Wasser kann man auch das Eiweisskoagulat mit was serlöslichen organischen Lösungsmitteln, wie Alkohol oder Aceton, extrahieren. Das anti- tIlyreoidal wirkende Produkt ist nämlich lös lich in Wasser und in wasserhaltigen organi schen Lösungsmitteln. Es hat ferner die Eigenschaft nicht :durch eine Membran zu -dialysieren. Das erhaltene Produkt ist ein therapeutisch ausserordentlich wirksamer und wichtiger Schilddrüsenschutzstoff.
Als Ausgangsmaterial :dient vorzugsweise das Gesamtblut. Vergleichende Untersuchun gen haben ergeben, :dass in diesem die roten Blutkörperchen und insbesondere deren Hämoglobin die hauptsächlichen Träger .der antithyreoidalen Kraft darstellen. Aber auch im Serum ist sie vorhanden. Als Koagu- lationsmittel für :das Verfahren gemäss der Erfindung haben sich unter anderem Alkohol und Aceton als .geeignet erwiesen.
So wird durch Aceton der Eiweissanteil des Blutes und der roten Blutkörperchen koaguliert und dadurch gleichzeitig die Haftung der anti- thyreoi:dalen Komponente so gelockert, :dass, sie zum Teil sofort in den Acetonextrakt übergeht. Nach Abdestillation des Acetons verbleibt in :dem wässerigen Rückstand, wie Versuche ergaben, ein erheblicher Anteil der gesamten Antithyreoidalkoinponente, und zwar frei von anhaftendem Eiweiss.
Soweit dem Blutkoagulum die gelockerte anti- thyreoidale Komponente noch nicht entzogen ist, wird sie gemäss dem Verfahrender Erfin dung aus demselben durch Extraktion ge wonnen. Schon einfache Wassereinwirkung entzieht zum Beispiel dem Koagulum die antithyreoidale Komponente. Eine Abtrennung des antithyreoidalen Produktes vom Eiweiss und Eiweisskoagula tion wird auch dadurch erreicht, dass man dem Ausgangsmaterial .Säure zusetzt und ge linde erwärmt.
Die Bildungs- respektive Umwandlungs- stätten des Blutes, Leber und die Milz ent halten, wie das Blut, die antithyreoidale Komponente, so :dassdiese auch aus Leber und Milz nach :dem Verfahren gemäss :der Erfin dung gewonnen werden kann.
Bei .der Gewinnung ,der antithyreoidalen Komponente aus den Organen und Körper- flüssigkeiten handelt es sich :darum, die anti- thyreGidale Komponente von ihrer Bindung an das Eiweiss- zu trennen. Nicht jede Art von Eiweissabscheidung ist dazu geeignet. So findet zum Beispiel keine Trennung :der anti- thyreoidalen Komponente von Eiweiss statt, wenn :das Eiweiss :durch hohe Salzkonzentra tion niederschlagen wird. In :diesem Falle bleibt :die antithyreoidaleKomponente an das Eiweiss gebunden und geht nicht in die flüs sige Phase über.
Es müssen also, wie bei dem Verfahren gemäss :der Erfindung, Mittel an gewendet werden, die gleichzeitig mit der Eiweissfällung eine Abspaltung :der anti- thyreoidalen Komponente bewirken.
Zur weitgehenden Konzentrierung der antithyreoidalen Komponente hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die Salze zu entfernen. Nach,den Eigenschaften der antithyreoidalen Komponente war mit einem kleinen Molekül zu rechnen, so dass anzunehmen war, dass die antithyreoidale Komponente bei der Dialyse durch die Dialysiermembranen hindurch gehen würde. Versuche haben jedoch gezeigt, :dass dies nicht der Fall ist.
Man kann Aus gangsmaterial oder Extrakt, die die anti- thyreoidale Komponente enthalten der Di alyse zur Entfernung von Salzen und andern dialysablen Verunreinigungen unterwerfen und so weitgehend reinigen und nachher kon zentrieren.
Die antithyreoidale Komponente lässt sich am besten biologisch, und zwar :dadurch charakterisieren, :dass sie die sehr prägnante Einwirkung von Schilddrüsenpräparaten (Thyreoglobulin, Thyroxin etc.) auf Amphi bien (überstürzte Metamorphose und Wachs tumshemmung) aufhebt oder weitgehend ab schwächt. Bestimmte Mengen, zum Beispiel von Thyroxin, dessen umwandelnde Kraft - etwa auf Kaulquappen - jeweils quanti tativ festzustellen ist, werden von genau :dosierbaren Mengen der antithyreoidalen Komponente in ihrer Wirkung abgeschwächt oder aufgehoben.
Das Verfahren gemäss der Erfindung führt zu einem neuen, bisher nicht dargestell ten Wirkstoff, der im Blute und in den 0T- ganen nur in Eiweisshaftung vorhanden ist und bisher weder gereinigt noch konzentriert werden konnte. Es liegen schon jetzt Präpa rate vor, die die Wirksamkeit von 1 Liter Blut in weniger als 1 gr Substanz enthalten. Es gelingt also durch das Verfahren eine 1.000fache Anreicherung und so .die Herstel lung in einer solchen Konzentration, dass sie eine zweckmässige therapeutische Anwendung ermöglicht.
Dass es sich bei den Massnahmen zur Ab spaltung der antithyreoidaien Komponente aus der Eiweisshaftung tatsächlich um chemische Vorgänge handelt, geht auch aus der Beobachtung hervor, dass die antithyreoi- dale Komponente, wie aus Beispiel 1 ersicht lich, neben einer Löslichkeit in bestimmten organischen Lösungsmitteln auch Wasserlös lichkeit besitzt, .da sie nach vorangegangener Abspaltung durch Alkohol oder Aceton mit Wasser extrahierbar ist.
<I>Beispiel 1:</I> 1 Liter Blut (oder zerkleinertes Gewebe von Leber oder Milz) wird in ein genügendes Quantum (1 bis 4 Liter) von Aceton oder Alkohol einfliessen lassen, wobei Koagulation des Eiweisses und dabei Sprengung,der Bin dung der antithyreoidalen Komponente an Eiweiss eintritt. Nach längerem Stehen wer den Koagulat und Lösung getrennt. Nach schonendem Abdestillieren des Lösungsmit tels wird ausgeschiedenes Fett entfernt. Die wässerige Lösung wird dialysiert und dann schonend konzentriert und eventuell zur Trockne gebracht und kann .direkt verwendet werden.
Weitere Mengen von Wirkstoffen werden aus dem Koagulatdadurch gewon nen, dass man dieses mit 1 bis 2 Liter Wasser bei gelindem Erwärmen erschöpfend extra hiert. Nach Abtrennen des Koagulats wird die Extraktionsflüssigkeit einige Stunden gegen Wasserdialysiert und darnach die Lö sung stark eingeengt, etwa in Lösung ge gangenes Eiweiss mit Alkohol oder Aceton gefällt respektive unlöslich in Wasser ge macht und mit Wasser nachgewaschen. Das eiweissfreie Filtrat wird durch Verjagen des Lösungsmittels eingeengt und kann mit .dem ersten Anteil vereinigt und therapeutisch verwendet werden.
<I>Beispiel 2:</I> 1 Liter Blut wird mit soviel Schwefel säure versetzt, dass das Gemisch in bezug auf die Schwefelsäure etwa 1/2%ig ist, worauf man; das Ganze erwärmt. Das .gefällte Eiweiss wird abfiltriert, aus dem Filtrat wird die Schwefelsäure mit Bariumhydroxyd als Bariumverbindung gefällt, die filtrierte neu trale Lösung dialysiert und eingeengt, etwaiges noch in Lösung verbliebenes Eiweiss wird, wie in Beispiel 1, gefällt.
Dem Koagu- lat wird der Wirkstoff durch erschöpfende Extraktion mit wasserhaltigem Aceton oder Alkohol entzogen und in dem Extrakt durch Einengen angereichert. <I>Beispiel 3:</I> 1 Liter ungerinnbar gemachten Blutes wird zur Befreiung von Salzen und andern @dialysablen Substanzen ein- bis zweimal 24 Stunden gegen Wasser dialysiert. Die Ab trennung des antithyreoidalen Produktes und Eiweisskoagulats erfolgt nach Beispiel 1, ebenso die Weiterbehandlung des Filtrats.
Das Eiweisskoagulat wird erschöpfend mit verdünnten Alkalien, am besten unter gelin- ,dem Erwärmen, extrahiert. In den Extrakten wird etwa gelöstes Eiweiss nach Beispiel 1 abgeschieden und der Wirkstoff durch Ein engen angereichert.
Process for obtaining an antithyroid product. F. Blum was able to show (F. Blum, Experimental and clinical studies on epithelial bodies, thyroid and blood. From "Endokrinologie" Vol. VIII, 1931.
The rest of the literature is also given there.) That in every normal blood - in the blood of thyroid-free animals without any particular increase in numbers - there is an antithyroid component which evidently exercises an important regulation of thyroid activity.
In more recent experiments by F. Blum, he found that the antithyroid effect of the blood mentioned is not due to adsorption or to the colloidal nature of the blood; that it is much more attributable to a particular component of the blood called the "antithyroid component".
The present invention now relates to a method for obtaining an anti-thyroid product, which is characterized in that a starting material which contains the anti-thyroid active, protein-containing blood component is treated with an agent that contains the anti-thyroid thyroid-acting product splits off from its binding to protein and at the same time coagulates the protein, then the protein is coagulated and in the filtrate of the protein coagulation,
as well as the extracts from the protein coagulate the antithyroidal we kende product enriched by concentration. As tests have shown, the bulk of the protein coagulate is found in the filtrate of the antithyroid product and the remainder in the extracts. The extraction of the protein coagulate is expediently carried out with water, but it has also proven to be. proven to be advantageous to use diluted alkali for aqueous extraction - even with gentle heating.
Instead of water or water containing alkali, the protein coagulate can also be extracted with water-soluble organic solvents such as alcohol or acetone. The anti-lyreoidal product is in fact soluble in water and in water-based organic solvents. Furthermore, it does not have the property: to dialyze through a membrane. The product obtained is a therapeutically extremely effective and important thyroid protective substance.
As a starting material: Whole blood is preferably used. Comparative studies have shown that: in this case, the red blood cells and in particular their hemoglobin are the main carriers of the antithyroid power. But it is also present in the serum. As coagulants for: the method according to the invention, alcohol and acetone, among others, have proven to be suitable.
Acetone coagulates the protein content of the blood and the red blood cells and at the same time loosens the adhesion of the anti-thyreoi: dalen component in such a way that, in part, it passes immediately into the acetone extract. After the acetone has been distilled off, a considerable proportion of the total antithyroid alcohol component remains in the aqueous residue, as tests have shown, and indeed free of adhering protein.
If the loosened anti-thyroid component has not yet been withdrawn from the blood clot, it is obtained from the same by extraction according to the method of the invention. Even simple exposure to water, for example, removes the antithyroid component from the coagulum. A separation of the antithyroid product from the protein and protein coagulation is also achieved by adding acid to the starting material and heating it gently.
The sites of formation or transformation of the blood, liver and spleen, like blood, contain the antithyroid component, so that this can also be obtained from the liver and spleen according to: the method according to: the invention.
When extracting the antithyroid component from the organs and body fluids, it is a matter of separating the antithyroid component from its binding to the protein. Not every type of protein separation is suitable for this. For example, there is no separation of: the anti-thyroid component of protein if: the protein: is precipitated by a high salt concentration. In: this case, the antithyroid component remains bound to the protein and does not pass into the liquid phase.
As in the case of the method according to the invention, means must therefore be used which, at the same time as the protein precipitation, cause the antithyroid component to be split off.
In order to concentrate the antithyroid component to a large extent, it has proven advantageous to remove the salts. According to the properties of the antithyroid component, a small molecule was to be expected, so that it was assumed that the antithyroid component would pass through the dialysis membranes during dialysis. However, tests have shown: that this is not the case.
From starting material or extract that contain the antithyroid component of the dialysis to remove salts and other dialysable impurities and so largely clean and then concentrate.
The antithyroid component can best be characterized biologically, namely: by: that it cancels or largely weakens the very pronounced effect of thyroid preparations (thyroglobulin, thyroxine, etc.) on amphibians (rapid metamorphosis and growth inhibition). Certain amounts, for example of thyroxine, whose transforming power - for example on tadpoles - can be determined quantitatively in each case, are precisely: dosed amounts of the antithyroid component weakened or canceled out.
The method according to the invention leads to a new, previously unrepresented active ingredient, which is only present in the blood and in the OT-gans in protein adhesion and so far could neither be purified nor concentrated. Preparations are already available which contain the effectiveness of 1 liter of blood in less than 1 gram of substance. The process thus achieves a 1,000-fold enrichment and so the production in such a concentration that it enables a suitable therapeutic application.
The fact that the measures for splitting off the antithyroid component from the protein adhesion are actually chemical processes can also be seen from the observation that the antithyroid component, as can be seen from Example 1, in addition to being soluble in certain organic solvents It is water-soluble because it can be extracted with water after it has been split off with alcohol or acetone.
<I> Example 1: </I> 1 liter of blood (or shredded tissue from the liver or spleen) is poured into a sufficient quantity (1 to 4 liters) of acetone or alcohol, with coagulation of the protein and disintegration of the bin The antithyroid component is formed in protein. After standing for a long time, the coagulate and solution are separated. After carefully distilling off the solvent, the excreted fat is removed. The aqueous solution is dialyzed and then gently concentrated and possibly brought to dryness and can be used directly.
Additional quantities of active ingredients are obtained from the coagulate by extracting it with 1 to 2 liters of water and gently warming it. After the coagulate has been separated off, the extraction liquid is dialyzed against water for a few hours and then the solution is strongly concentrated, for example protein that has gone into solution is precipitated with alcohol or acetone or made insoluble in water and washed with water. The protein-free filtrate is concentrated by driving off the solvent and can be combined with the first portion and used therapeutically.
<I> Example 2: </I> 1 liter of blood is mixed with so much sulfuric acid that the mixture is about 1/2% in relation to the sulfuric acid, whereupon; the whole thing warmed up. The precipitated protein is filtered off, the sulfuric acid is precipitated from the filtrate with barium hydroxide as a barium compound, the filtered neutral solution is dialyzed and concentrated, and any protein that remains in solution is precipitated as in Example 1.
The active ingredient is removed from the coagulate by exhaustive extraction with aqueous acetone or alcohol and enriched in the extract by concentration. <I> Example 3: </I> 1 liter of blood which has been rendered incoagulable is dialyzed against water once or twice for 24 hours to free it from salts and other dialysable substances. The antithyroid product and protein coagulate are separated off according to Example 1, as is the further treatment of the filtrate.
The protein coagulate is extracted exhaustively with diluted alkalis, preferably with gelatinous, warming. Any dissolved protein according to Example 1 is deposited in the extracts and the active ingredient is enriched by a narrow.