DE529319C

DE529319C - Process for the production of the co-zymase

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Publication number: DE529319C
Application number: DEK105136D
Authority: DE
Original assignee: Knoll GmbH
Current assignee: Abbott GmbH and Co KG
Priority date: 1927-07-16
Filing date: 1927-07-16
Publication date: 1931-07-11

Description

Verfahren zur Herstellung der Co-Zymase Co-Zymase ist ein zum biologischen Kohlenhydratabbau notwendiger, nicht enzymatischer, spezifischer Stoff, der ganz charakteristische Wirkungen sowohl im lebenden Tier-und Pflanzenorganismus als auch in vitro auf die ersten Phasen der Gärung ausübt.Process for the production of the Co-Zymase Co-Zymase is a biological one Carbohydrate breakdown necessary, non-enzymatic, specific substance that is whole characteristic effects both in living animal and plant organisms as well exerts in vitro on the first stages of fermentation.

Es ist bekannt, die Co-Zymase aus Extrakten pflanzlichen und tierischen Ursprungs dadurch anzureichern, daß man die dialysierten Extrakte des Ausgangsmaterials nach Ausfällung mit löslichen Bleisalzen mit Phosphorwolframsäure oder Kieselwolframsäure behandelt (vgl. z. B. Hoppe Seylers Zeitschrift für physiologische Chemie, Band 139, 192q.. Seite 281 ff., und Band 169, 1927, Seite 102 ff.).It is known the co-zymase from extracts of vegetable and animal origin Enrich the origin by using the dialyzed extracts of the starting material after precipitation with soluble lead salts with phosphotungstic acid or silicatungstic acid treated (see e.g. Hoppe Seylers Zeitschrift für Physiologische Chemie, Volume 139, 192q .. page 281 ff., And Volume 169, 1927, page 102 ff.).

Statt mit Bleisalzen kann man auch die erste _ Reinigung mit Silbersalzen, und zwar in ämmoniakalischer oder. barythaltiger Lösung, vornehmen.Instead of using lead salts, you can also do the first _ cleaning with silver salts, namely in a ammoniacal or. solution containing barium.

Es hat sich nun gezeigt, daß die außerordentlich wechselnden und unsicheren Ergebnisse, die man bisher hinsichtlich der Aktivität (also hinsichtlich des Co-Zymasegehaltes) der Lösungen erhielt, wesentlich verbessert werden, wenn man nach der Fällung mit Bleisalzen, unmittelbar oder unter Zwischenschaltung einer Fällung mittels Quecksilbersalzen, die Lösung mit Pikrinsäure fällt und die am leichtesten lösliche Pikratfraktion nach Abscheidung aller schwerer löslichen Pikrate der weiteren Reinigung und Isolierung unterwirft, wobei man unter Benutzung der basischen Eigenschaften der zu isolierenden Co-AUSGEGEBEN AIi-11. JULI 1931 Zymase Kieselwolframsäure oder eine andere komplexe Säure verwendet.It has now been shown that the extraordinarily changing and uncertain Results that have so far been obtained with regard to the activity (i.e. with regard to the co-zymase content) of the solutions obtained can be significantly improved when using after the precipitation Lead salts, directly or with the interposition of precipitation by means of mercury salts, the solution with picric acid falls and the most easily soluble picrate fraction after separation of all sparingly soluble picrates for further purification and isolation subject, using the basic properties of the to be isolated Co-ISSUED AIi-11. JULY 1931 Zymase Silicatungstic Acid or other complex Acid used.

Die so dargestellten hochgereinigten Lösungen sind vielfacher biochemischer Anwendungen fähig, wo es sich darum handelt, Mangel an diesem Stoff in biochemischem Material zu ersetzen.The highly purified solutions presented in this way are many times more biochemical Capable of applications where there is a lack of this substance in biochemical Replace material.

Beispielr Man dialysiert 1 1 eingedunsteten Hefeextraktes durch Kollodiummenbranen gegen a bis 31 Wasser. Das Dialysat (Außenflüssigkeit) fällt man ohne Eindunsten mit einer kalt gesättigten Lösung von Bleiacetat in geringem überschuß. Die dabei entstehende Fällung wird verworfen, das Filtrat wird mit der gleichen Menge Bleiacetat gefällt und hierauf mit Natronlauge bis zur Acidität ph 1 o versetzt. Diese Fällung, welche abgeschleudert wird, enthält die Co-Zymase.Example 1 1 evaporated yeast extract is dialyzed through collodion membranes against a to 31 water. The dialysate (external liquid) falls without evaporation with a cold, saturated solution of lead acetate in slight excess. The one with it The resulting precipitate is discarded and the filtrate is treated with the same amount of lead acetate precipitated and then mixed with sodium hydroxide solution up to acidity ph 1 o. This precipitation which is thrown off contains the co-zymase.

Die Fällung wird mit Wasser aufgeschlämmt und mit Schwefelsäure im überschuß versetzt, so daß Methylorange bleibend stark gerötet wird; das Bleisulfat wird abfiltriert und durch Auswaschen von anhaftender Co-Zymase befreit.The precipitation is slurried with water and with sulfuric acid im excess added, so that methyl orange is permanently reddened; the lead sulfate is filtered off and freed from adhering co-zymase by washing out.

Man kann nun entweder die Fällung durch Pikrinsäure gleich vornehmen oder die annähernd neutrale Lösung mit Quecksilbernitrat versetzen (die Fällung soll vollständig sein ohne wesentlichen überschuß von Quecksilber). In letzterem Falle schleudert man von der entstandenen Fällung ab und wäscht sie mit Wasser aus. Aus dem Schleuderfiltrat wird das Quecksilber durch Schwefelwasserstoff entfernt und dieser durch Luft vertrieben.You can now either carry out the precipitation with picric acid straight away or add mercury nitrate to the almost neutral solution (the precipitation should be complete with no substantial excess of mercury). In the latter Trap is hurled from the precipitate and washed she with water. The centrifugal filtrate is converted into mercury by means of hydrogen sulfide removed and this expelled by air.

Das Volumen der weiter zu bearbeitenden Lösung beträgt nun wieder etwa 11. Man fällt nun mit (je nach der Menge der Verunreinigungen) ioo bis 3oo ccm einer gesättigten wäßrigen Pikrinsäurelösung, kühlt ab und filtriert. Alsdann wird bei möglichst tiefer Temperatur das Volumen der. Lösung auf ioo bis Zoo ccm gebracht. Dann kühlt man wieder ab und fällt Pikratfraktionen aus und wiederholt dieses Verfahren.The volume of the solution to be processed is now again about 11. One now falls with 100 to 300 (depending on the amount of impurities) ccm of a saturated aqueous picric acid solution, cooled and filtered. Then at the lowest possible temperature, the volume of the. Solution on ioo to zoo ccm brought. Then it is cooled again and picrate fractions are precipitated and repeated This method.

Man gewinnt dadurch eine hochaktive Lösung, aus welcher sich durch komplexe Säuren die Co-Zymase reiner und sicherer abscheiden läßt, als wenn man das Filtrat der Bleifällung unmittelbar mit Kieselwolframsäure behandelt. Bezeichnet man die Aktivität bzw. den relativen Co-Zymasegehalt der Ausgangslösung mit ioo, so wird durch die Pikrinsäurebehandlung nach dem hier beschriebenen Verfahren die Aktivität auf 2o ooo, somit auf das etwa Zoofache vergrößert. Ferner wird erreicht, daß bei der nachfolgenden Fällung mit l#',iesel#,volframsäure oder Phosphorwolframsäure, wodurch früher eine Aktivität von meist 8ooo bis 12 ooo, nur in einzelnen Fällen und durch nicht aufgeklärte Umstände eine höhere Aktivität erhalten werden konnte, nun Lösungen bis zur Aktivität von .,5o ooo bis 8o ooo erzielt werden. Die erwähnte Kiesehvolframsäurefällung geht folgendermaßen vor sich: ioo ccm der am leichtesten löslichen Pikratfraktion werden nach Ansäuern mit Schwefelsäure von Pikrinsäure befreit und hierauf in saurer Lösung mit Kieselwolframsäurelösung versetzt. Aus der Fällung wird die Kieselwolframsäure durch Baryt und das überschüssige Barium durch Schwefelsäure entfernt. Die Co-Zymase kann durch Alkohol gefällt werden; sie ist durch ein Molekulargewicht von 4oo bis 500 gekennzeichnet.In this way a highly active solution is obtained, from which the co-zymase can be separated more purely and more reliably by means of complex acids than if the filtrate of the lead precipitation is treated directly with silicatungstic acid. If the activity or the relative co-zymase content of the starting solution is denoted by 100, then the picric acid treatment according to the method described here increases the activity to 20,000, thus approximately zo-fold. In addition, it is achieved that in the subsequent precipitation with 1 # ', iesel #, volframic acid or phosphotungstic acid, which previously resulted in an activity of mostly 8,000 to 12,000, a higher activity only in individual cases and due to unexplained circumstances, now solutions to an activity of., 50,000 to 8o,000. The above-mentioned kiesvolframic acid precipitation proceeds as follows: 100 cc of the most easily soluble picrate fraction are freed from picric acid after acidification with sulfuric acid and then a silicatungstic acid solution is added in an acidic solution. The siliceous tungstic acid is removed from the precipitation with barite and the excess barium with sulfuric acid. The co-zymase can be precipitated with alcohol; it is characterized by a molecular weight of 400 to 500 .

Beispiel e 2 kg Muskelfleisch werden möglichst bald, nicht später als 1/2 Stunde nach dem Schlachten des Tieres, rasch mechanisch von Fett befreit, gemahlen und mit 51 i %iger Kochsalzlösung bei 95 bis 10o° C 4 Minuten oder nur mit Wasser von 8o° C 3o Minuten lang extrahiert. Der abgesiebte und rasch gekühlte Kochsaft (Fleischbrühe) wird mit Essigsäure beim isoelektrischen Punkt gefällt. 2 kg Muskel liefern etwa 350o ccm Kochsaft. Derselbe wird im Vakuum auf 1/1o seines Volumens eingedunstet. Nun wird der Saft in den inneren von zwei konzentrisch ineinander angebrachten Kollodiumschläuchen oder Schläuchen von anderem Dialysiermaterial zwecks fraktionierter Dialyse gebracht und der äußere Kollodiumscblauch mit Wasser umspült. Nach 9 Stunden wird die mittlere Lösung mit Bleiacetat gefällt, dann nach Abfiltrieren des Niederschlages mit Schwefelwasserstoff entbleit und hierauf mit Quecksilberacetat oder Quecksilbernitrat gefällt. Nach Entfernung des Quecksilbers mit Schwefelwasserstoff und nach Wiederholung des letzteren Verfahrens wird zunächst mit Pikrinsäure gefällt und dann die schließliche Fällung mit Phosphorwolframsäure vorgenommen. Letztere wird nach Ansäuern mit Amylalkohol entfernt.Example e 2 kg of muscle meat is quickly mechanically freed of fat as soon as possible, no later than 1/2 hour after slaughtering the animal, ground and treated with 51% saline solution at 95 to 10o ° C for 4 minutes or only with water at 8o ° C extracted for 30 minutes. The sieved and quickly cooled cooking juice (meat broth) is precipitated with acetic acid at the isoelectric point. 2 kg of muscle provide about 350o cc of cooking juice. The same is evaporated to 1/10 of its volume in a vacuum. Now the juice is brought into the inner of two concentric collodion tubes or tubes of other dialysis material for the purpose of fractional dialysis and the outer collodion tube is rinsed with water. After 9 hours, the middle solution is precipitated with lead acetate, then, after filtering off the precipitate, discharged with hydrogen sulfide and then precipitated with mercury acetate or mercury nitrate. After removing the mercury with hydrogen sulphide and after repeating the latter process, it is first precipitated with picric acid and then the final precipitation is carried out with phosphotungstic acid. The latter is removed after acidification with amyl alcohol.

Wenn der Wüksamkeitsgrad der Ausgangslösung= ioo gesetzt wird, beträgt derselbe nach der zweiten Quecksilberfällung 26 ooo und nach der Phosphorwolframsäurefällung 75000. Beispiel 3 5 kg Leber werden unmittelbar nach dem Schlachten in grobe Stücke zerschnitten und auf Eis gekühlt. Dann wird die ganze Masse möglichst bald gemahlen und in 81 kochendes Wasser eingetragen. Nach 5 Minuten wird rasch abgekühlt und filtriert. Nach der Fällung mit Essigsäure und dem Einengen des Filtrats auf 1/12 seines Volumens beträgt der Wirksamkeitsgrad (gemessen in den üblichen Einheiten) ACo Zoo.If the effectiveness of the starting solution is set = 100, it is 26,000 after the second mercury precipitation and 75,000 after the phosphotungstic acid precipitation. Example 3 Immediately after slaughtering, 5 kg of liver are cut into coarse pieces and chilled on ice. Then the whole mass is ground as soon as possible and poured into boiling water. After 5 minutes, the mixture is rapidly cooled and filtered. After precipitation with acetic acid and concentration of the filtrate to 1/12 of its volume, the degree of effectiveness (measured in the usual units) is ACo Zoo.

Nach einfacher Dialyse durch eine Kollodiummembran erfolgt die Fällung mit Bleiacetat und dann mit Quecksilberacetat oder Quecksilbernitrat wie im Beispiele. Die von Quecksilber befreite Lösung wird mit Pikrinsäure versetzt, und die ausgeschiedenen Pikrate werden .einer fraktionierten Kristallisation unterworfen, bei welcher bei zwei aufeinanderfolgenden Verfahren die wasserlöslichsten Pikratfraktionen, welche die Co-Zymase enthalten, gesammelt werden. Nach Ausschütteln der Pikrinsäure erfolgt die Fällung entweder durch Kieselwolframsäure oder durch Phosphorwolframsäure. Letztere kann aus den Co-Zymase haltigen Lösungen durch Amylalkohol ausgeschüttelt werden.After simple dialysis through a collodion membrane, precipitation takes place with lead acetate and then with mercury acetate or mercury nitrate as in the examples. The solution freed from mercury is mixed with picric acid and the precipitated Picrates are subjected to fractional crystallization, in which at two consecutive processes the most water-soluble picrate fractions, which containing co-zymases can be collected. After shaking out the picric acid takes place precipitation either by silicatungstic acid or by phosphotungstic acid. Latter can be shaken out of the solutions containing co-zymase with amyl alcohol.

Erreichte Wirksamkeit: ACo steigt von Zoo bis 82 ooo.Achieved effectiveness: ACo increases from zoo to 82,000.

Claims

PATENT ANSIIRficiiR: i. Process for the production of the Co-zymase from aqueous extracts of suitable starting materials, such as yeast, muscle substance, liver and the like. Like., after treatment with soluble lead or silver salts, characterized in that this solution is immediate or with the interposition of a precipitation by means of mercury salt with Picric acid precipitated and the separated picrates by fractionated Crystallization can be separated, whereupon the most easily soluble picrate is obtained decomposed complex acids. z. Method according to claim i, characterized in that the active substance is the salt of silicatungstic acid or some other complex Acid isolated in a known manner.