Verfahren zur Gewinnung eines physiologisch wirksamen Extraktes aus Muskeln. Nach dem Verfahren des Patentes Nr. 13.58,88 wird ein die Herztätigkeit stark fördernder Extrakt aus Herzen vonWarm- blütern dadurch erhalten, dass man zerklei- lierte Herzen bei schwach alkalischer Reak tion extrahiert und die die wirksamen Sub stanzen enthaltende Lösung von Ballast stoffen befreit.
In weiterer Ausarbeitung dieser Methode wurde nun gefunden, dass man ausser a;as Herzen ganz allgemein aus Muskeln von Warmblütern durch Ausziehen mit orga- risehen Lösungsmitteln bei Gegenwart von Wasser und durch nachfolgende Befreiung des so gewonnenen Produktes von uuspezi- fischen Ballaststoffen einen Extrakt erhält, der ebenso wie die genannten Herzextrakte eine stark pllysiologische Wirksamkeit aus zuüben vermag.
Die Gewinnung dieses Extraktes geschieht nach dem Verfahren der Erfindung in der Weise, dass man die zerkleinerten Muskeln mit wasserlöslichen organischen Lösungs- initteln, wie Methylalkohol, Äthylalkohol oder Aceton in Gegenwart von Wasser bei einem Ph-Wert von ungefähr<B>3-10,</B> vor zugsweise jedoch bei einem solchen von zirka <B>7-9</B> extraliiert.
Hierbei werden durch die in den Muskeln vorhandenen Enzyme und das in der Gewebsflüssigkeit enthaltene Wasser bei der angewandten Wasserstoff- ionenkonzentration die Eiweissstoffe, an die die wirksame Substanz gebunden. ist, hydro lytisch abgebaut und dadurch die wirksame Substanz isoliert.
Die so erhaltenen Rohextrakte zeigen in folge Beimengung von unspezifischen Bal laststoffen eine Reihe unerwünschter Neben wirkungen. Man befreit sie deshalb vor die sen zum Beispiel durch Behandlung nach be- kanüten Methoden.
Die in den Rohextrakten enthaltenen, un spezifisch wirkenden Eiweissstoffe entfernt man, zum Beispiel indem man die Roh- extrakte stark kühlt, durch Zentriftigieren -von den abgeschiedenen Ballaststoffen befreit und eindampft. Weitere Ballaststoffe kön nen durch Versetzen dieser Konzentrate mit niederprozentigem Alkohol abgeschieden wer den. Diese Filtrate scheiden dann auf Zu satz von hochprozentigem Alkohol die wirk samen Substanzen in bereits ziemlich reiner Form, ab.
Eine noch weitgehendere Befreiung von Ballaststoffeit erreicht man, indem die wässerigen Lösungen dieser Abscheidungen einer anschliessenden Behandlung mit den üblichen Enteiweissungsmitteln -unterworfen werden.
Die Befreiung von Lipoiden kann in ver schiedenen Phasen stattfinden. Geht man von frischen Muskeln aus, so ist es zweck mässig, eine Behandlung mit den wasser unlöslichen Lösungsmitteln mit dem von dem wasserlöslichen, organischen Lösungsmittel befreiten Rohkonzentrat, das heisst vor der Enteiweissung vorzunehmen. Dieser Reini gungsmethode äquivalent ist die Vorbehand- lung der trockenen Muskeln mit den wasser unlöslichen Lösungsmitteln, das heisst vor der eigentlichen Extraktion.
Eiweissabbauprodukte, die im Laufe des Verfahrens unter den angegebenen Bedin gungen entstehen und das pharmakologisclie und klinische Bild der reinen Herzwirkung <B>,Z</B> störend beeinflussen können, werden z. B. entfernt, indem man die Extrakte mit ver- seifenden Mitteln behandelt. Man lässt letz tere zweckmässig so lange einwirken,<B>'</B> bis die Extrakte keine Wirkung mehr auf den iso lierten ITterus oder Darm erkennen lassen. Die herzwirksamen Substanzen erleiden durch diese Behandlung, wie Versuche er gaben, keinen Schaden.
Die erhaltenen Ex- fraktlösungen können nach Entfernung der verseifenden Mittel sterilisiert oder mit Kon servierungsmitteln versetzt werden. Die Ver- seifung kann vor, zweckmässig aber nach der Behandlung der Extrakte mit den wasser unlöslichen Lösungsmitteln vorgenommen werden.
Die Darstellung der in den Beispielen zum Teil verwandten Trockenpräparate er- folgt, indem man die frischen Muskeln bei der durch die natürliche Milchsäure beding, ten sauren Reaktion mit Ätliylalkohol be- liandelt, wobei gleichzeitig eine teilweise Reinigung erreicht wird, ohne dass allzuviel an wirksamer Substanz entzogen wird.
Der nach diesem Verfahren erhaltene Ex trakt zeigt eine intensive herzerregende Wir kung und sollen in der Therapie der Herz erkrankungen Verwendung finden. <I>Beispiele:</I> <B>1. 1 kg</B> Muskeln wird gemahlen, mit <B>100</B> cm# <B>1/u</B> NaOH versetzt, so dass die Wasserstoffionenkonzentration zirka pH <B>= 8</B> beträgt, und mit<B>je</B> 1,2 Liter Aceton vier mal kalt extrahiert. Die vereinigten Extrakte, werden auf<B>- 15 ' C</B> abgekühlt und fil triert. Das Filtrat wird zur Trockne ein geengt und mit Wasser aufgenommen.
Durch Zusatz von<B>50 %</B> Alkohol werden unspezi fische Ballaststoffe zur Floakung gebracht, filtriert und das klare Filtrat mit der zehn fachen Menge hochprozentigem Alkohol ver setzt und zwei Tage im Eisschrank gelassen. Der an der Wandung haftende Niederschlag, welcher die wirksamen Substanzen enthält, wird in Wasser aufgenommen und die noch vorhandenen geringen Mengen Eiweiss nach bekannten Verfahren entfernt. Die so erhal tene Lösung ist reizlos und sterilisierbar.
2. 20,0 gr getrocknete Muskeln werden nach erfolgter Behandlung mit wasser unlöslichen Lösungsmitteln zur Extraktion mit zirka<B>800</B> cm-' Wasser versetzt und mit Alkali auf zirka pH <B><U>8.0</U></B> eingestellt. Hier auf wird 1,2 Liter Alkohol zugesetzt, -extra hiert abgepresst und der Rückstand noch 7,-v#,eimal mit<B>je</B> 1,2 Liter Alkohol extrahiert und die vereinigten Extrakte bei<B>- 15 ' C</B> filtriert. Nach Entfernung des Alkohols im Vakuum wird der Extrakt wie in Beispiel<B>1</B> weiterverarbeitet.
An Stelle von Äthylalko- hol kann auch MetliyIalkohol verwendet wer den.
<B>3. 10 kg</B> Muskelfleisch, werden fein ge mahlen, mit 2,0 Liter Äthylalkohol drei Stun- den verrührt und abgepresst. Die Extraktion wird zweimal mit je<B>1,0</B> Liter Alkohol wie derholt, dann wird das abgepresste Produkt an der Luft getrocknet und fein gemahlen. Durch diese Vorbehandlung, bei der durch den Milchsäuregehalt des Muskels bedingten schwach sauren Reaktion werden nur Spuren der wirksamen Substanz in Lösung gebracht.
Die nach dieser Behandlung aus<B>10 kg</B> Huskelfleisch erhaltene Menge Trocken präparat wird dann mit einer Mischung von <B>8</B> Liter Wasser und,20 Liter Methylalkohol bei neutraler Reaktion drei Stunden gerührt und abgepresst. Dann wird noch zweimal mit <B>je 10</B> Liter Methylalkohol extrahiert; die Extrakte werden vereinigt, ausgefroren und klar filtriert. Die Lösung wird im Vakuum. auf <B>1</B> Liter eingeengt, zweimal mit<B>je 500</B> cm' Äther extrahiert, worauf der in der wässe- rigen Flüssigkeit noch vorhandene Äther durch Evakuieren entfernt wird.
Zur weiteren Reinigung kann die Lösung vorsichtig zur Trockne gebracht und der Rückstand durch Extraktion mit hochpro zentigem Metl-iylolkol-iol von weiteren Bal laststoffen befreit werden.
4. 2<B>kg</B> Muskeln werden mit 4 Liter Methylalkohol bei pH==4,5 extrahiert. Die Extraktion wird mit<B>je</B> 2 Liter Methylalko- bol zweimal wiederholt und die vereinigten Extrakte filfriert und auf 2,00 cm' eingeengt. Der erhaltene Extrakt wird nach Beispiel<B>3</B> weiter gereinigt.
<B>5.</B> 2<B>kg</B> Kalbfleisch werden gemahlen und mit<B>2,5</B> Liter Aceton und 200 cm' n-Natron- lauge bei pll=:8,5 <B>3</B> Stunden lang kalt extra hiert. Hierauf wird mit<B>je</B> 2 Liter Aceton die Extraktion noch dreimal wiederholt. Der Ge samtextrakt wird bei -.l2' <B>C</B> filtriert und im Vakuum eingedampft. Das Konzentrat wird mit Äther extrahiert.
Der wässerige Extrakt ist eiweissfrei und sierilisierbar. Er kann sowohl in schwach saurer, wie in schwach alkalischer Reaktion zur Anwendung gelangen.
<B>6.</B> 2<B>kg</B> Herz werden fettfrei präpariert, zerkleinert und bei pll # <B>7</B> mit<B>2,5</B> Liter Aceton und 200 am' n-Natronlauge <B>3</B> Stun- den kalt extrahiert. Die Acetonextraktion wird dreimal mit je<B>29</B> Liter Aceton wieder holt. Die weitere Behandlung geschieht wie in Beispiel<B>5.</B> Die letzten pastenähnlichen Rückstände können nach bekannten Metho den vom Cholesterin usw. befreit werden.
<B>7. 1</B> Liter wässeriges eiweissfreies Roh konzentrat, wie es nach dem in den Bei spielen<B>1</B> bis<B>6</B> beschriebenen Verfahren ge wonnen *erden kann, schüttelt man mit der doppelten Menge Äther aus und lässt ab sitzen, bis die wässerige Schicht völlig klar ist. Der wässerige Extrakt wird mit<B>100</B> cm' 3j5%iger Natronlauge zirka 4 bis<B>6</B> Stunden auf 45 bis<B>50 ' C</B> bis zum Verschwinden der uteruswirksamen Substanz erhitzt, mit Salz säure abgestumpft, bis auf pH 7,5-8,0 und sterilisiert. Man kann die Verseifung auch bei höherer Temperatur, zum Beispiel<B>8,0</B> vornehmen.
Process for obtaining a physiologically effective extract from muscles. According to the method of patent no. 13.58.88, an extract from warm blooded hearts that strongly stimulates cardiac activity is obtained by extracting pulverized hearts in a weakly alkaline reaction and removing dietary fiber from the solution containing the active substances.
In a further elaboration of this method, it has now been found that, in addition to the heart, an extract can be obtained from muscles of warm-blooded animals in general by pulling them out with organic solvents in the presence of water and by subsequently freeing the product obtained from unspecific dietary fibers, which, like the heart extracts mentioned, is able to exert a strong pllysiological activity.
This extract is obtained according to the process of the invention in such a way that the minced muscles are treated with water-soluble organic solvents such as methyl alcohol, ethyl alcohol or acetone in the presence of water at a pH of approximately <B> 3-10, </B> but preferably extralated from approximately <B> 7-9 </B> in the case of one.
The enzymes present in the muscles and the water contained in the tissue fluid binds the proteins to which the active substance is applied at the hydrogen ion concentration used. is hydrolyzed, thereby isolating the active substance.
The crude extracts obtained in this way show a number of undesirable side effects as a result of the addition of unspecific ballast substances. They are therefore freed from these, for example by treatment according to the canopy methods.
The unspecific acting proteins contained in the raw extracts are removed, for example by strongly cooling the raw extracts, freed from the separated roughage by centrifugation and evaporating. Additional dietary fiber can be separated out by adding low-percentage alcohol to these concentrates. These filtrates then separate the active substances in a fairly pure form with the addition of high-percentage alcohol.
An even more extensive liberation from dietary fiber is achieved by subjecting the aqueous solutions of these deposits to a subsequent treatment with the usual deproteinizers.
The liberation of lipoids can take place in different phases. Assuming fresh muscles, it is advisable to carry out a treatment with the water-insoluble solvents with the raw concentrate freed from the water-soluble, organic solvent, that is, before the deproteinization. This cleaning method is equivalent to the pretreatment of the dry muscles with the water-insoluble solvents, ie before the actual extraction.
Protein breakdown products that arise in the course of the process under the specified conditions and that can interfere with the pharmacological and clinical picture of the pure cardiac effect are used, for example. B. removed by treating the extracts with saponifying agents. The latter is expediently left to act until the extracts no longer show any effect on the isolated uterus or intestine. Experiments have shown that the substances active in the heart suffer no damage from this treatment.
The resulting exact solutions can be sterilized after the saponifying agents have been removed, or preservatives can be added. The saponification can be carried out before, but expediently after the treatment of the extracts with the water-insoluble solvents.
The dry preparations, some of which are used in the examples, are presented by treating the fresh muscles with ethyl alcohol during the acidic reaction caused by natural lactic acid, with partial cleansing being achieved at the same time without too much active substance is withdrawn.
The extract obtained by this process shows an intense heart-stimulating effect and is said to be used in the therapy of heart diseases. <I> Examples: </I> <B> 1. 1 kg </B> muscle is ground, and <B> 100 </B> cm # <B> 1 / u </B> NaOH is added so that the hydrogen ion concentration is around pH <B> = 8 </B> , and extracted four times cold with <B> each </B> 1.2 liters of acetone. The combined extracts are cooled to <B> - 15 'C </B> and filtered. The filtrate is concentrated to dryness and taken up in water.
By adding <B> 50% </B> alcohol, unspecific dietary fiber is made to flocculate, filtered, and the clear filtrate is mixed with ten times the amount of high-percentage alcohol and left in the refrigerator for two days. The precipitate adhering to the wall, which contains the active substances, is absorbed in water and the small amounts of protein still present are removed using known methods. The solution obtained in this way is non-irritating and sterilizable.
2. After treatment with water-insoluble solvents, 20.0 g of dried muscles are extracted with approx. 800 cm- 'of water and with alkali to approx. PH <B> <U> 8.0 </U> </B> set. Here, 1.2 liters of alcohol are added, extracted and pressed out and the residue is extracted a further 7, -v #, once with 1.2 liters of alcohol each and the combined extracts at <B> - 15 'C </B> filtered. After removing the alcohol in vacuo, the extract is processed further as in example <B> 1 </B>.
Instead of ethyl alcohol, methyl alcohol can also be used.
<B> 3. 10 kg </B> muscle meat are finely ground, mixed with 2.0 liters of ethyl alcohol for three hours and pressed. The extraction is repeated twice with <B> 1.0 </B> liters of alcohol each time, then the pressed product is air-dried and finely ground. Through this pretreatment, in the weakly acidic reaction caused by the lactic acid content of the muscle, only traces of the active substance are dissolved.
The amount of dry preparation obtained from <B> 10 kg </B> husk meat after this treatment is then stirred for three hours with a mixture of <B> 8 </B> liters of water and 20 liters of methyl alcohol with a neutral reaction and pressed off. Then it is extracted twice with 10 liters of methyl alcohol each time; the extracts are combined, frozen out and filtered until clear. The solution is in vacuo. concentrated to <B> 1 </B> liter, extracted twice with <B> 500 </B> cm 'ether, whereupon the ether still present in the aqueous liquid is removed by evacuation.
For further purification, the solution can be carefully brought to dryness and the residue can be freed from further ballast substances by extraction with hochpercent methylol col-iol.
4. 2 <B> kg </B> muscles are extracted with 4 liters of methyl alcohol at pH == 4.5. The extraction is repeated twice with 2 liters of methyl alcohol each time and the combined extracts are filtered and concentrated to 2.00 cm '. The extract obtained is purified further according to Example 3.
<B> 5. </B> 2 <B> kg </B> veal are ground and mixed with <B> 2.5 </B> liters of acetone and 200 cm 'n sodium hydroxide solution at pll =: 8, Extra cold for 5 <B> 3 </B> hours. The extraction is then repeated three times with <B> each </B> 2 liters of acetone. The entire extract is filtered at -.l2 'C and evaporated in vacuo. The concentrate is extracted with ether.
The aqueous extract is protein-free and sterilizable. It can be used in both weakly acidic and weakly alkaline reactions.
<B> 6. </B> 2 <B> kg </B> hearts are prepared fat-free, minced and at pll # <B> 7 </B> with <B> 2.5 </B> liters of acetone and 200 am 'n sodium hydroxide solution <B> 3 </B> hours extracted cold. The acetone extraction is repeated three times with <B> 29 </B> liters of acetone each time. The further treatment takes place as in example <B> 5. </B> The last paste-like residues can be freed from cholesterol etc. by known methods.
<B> 7. 1 </B> liter of watery protein-free raw concentrate, as it can be obtained * using the method described in examples <B> 1 </B> to <B> 6 </B>, is shaken with twice the amount Ether out and let sit until the watery layer is completely clear. The aqueous extract is mixed with <B> 100 </B> cm 3j5% sodium hydroxide solution for about 4 to <B> 6 </B> hours at 45 to <B> 50 </B> C until the uterine substance disappears heated, blunted with hydrochloric acid, down to pH 7.5-8.0 and sterilized. The saponification can also be carried out at a higher temperature, for example <B> 8.0 </B>.