CA2988109A1 - Procede pour la fabrication de nanocelluloses a partir d'un substrat cellulosique - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé pour la fabrication de nanocelluloses à partir d'un substrat cellulosique comprenant des fibres de cellulose, lequel procédé comprend les étapes successives suivantes : une étape de traitement enzymatique dudit substrat cellulosique, par la mise en contact avec au moins une enzyme de clivage, puis une étape de traitement mécanique dudit substrat cellulosique soumis à ladite étape de traitement enzymatique, pour délaminer lesdites fibres de cellulose et obtenir lesdites nanocelluloses, caractérisé en ce que ladite au moins une enzyme de clivage est choisie parmi les enzymes appartenant à la famille des mono-oxygénases lytiques de polysaccharides (LPMOs) aptes à assurer le clivage en présence d'un donneur d'électron. L'invention se rapporte également aux nanocelluloses obtenues selon ce procédé.

Description

Procédé pour la fabrication de nanocelluloses à partir d'un substrat cellulosique DOMAINE TECHNIQUE AUQUEL SE RAPPORTE L'INVENTION
La présente invention concerne de manière générale le domaine des nanocelluloses, et plus particulièrement les procédés pour la fabrication de ces nanocelluloses à partir d'un substrat cellulosique.
ARRIERE- PLAN TECHNOLOGIQUE
La cellulose est un des polymères naturels les plus importants, une matière première quasi inépuisable, et une source importante de matériaux durables à
l'échelle industrielle.
A ce jour, différentes formes de cellulose ont été identifiées avec une dimension de l'ordre du nanomètre, désignées sous le nom générique de nanocelluloses .
Les propriétés de ces nanocelluloses, notamment leurs propriétés mécaniques, leur capacité à former des films et leur viscosité, leur confèrent un intérêt majeur dans de nombreux domaines industriels.
Les nanocelluloses sont ainsi utilisées par exemple en tant qu'additif dispersant ou stabilisant dans les industries papetière, pharmaceutique, cosmétique ou agroalimentaire. Elles entrent également dans la composition de peintures et de vernis.
Les nanocelluloses sont également employées dans de nombreux dispositifs nécessitant un contrôle de la porosité nanométrique, en raison de leur surface spécifique élevée.
Enfin, de nombreux matériaux nanocomposites à base de nanocelluloses sont actuellement développés. En effet, les propriétés mécaniques remarquables des nanocelluloses, leur dispersion à l'échelle nanométrique ainsi que leur caractère hydrophile, leur confèrent des propriétés barrières au gaz excellentes. Ces caractéristiques suscitent notamment un intérêt important pour la fabrication d'emballages barrières.
Sur la base de leurs dimensions, fonctions et méthodes de préparation, qui elles-mêmes dépendent principalement de la source cellulosique et des conditions de traitement, les nanocelluloses peuvent être classées principalement dans deux familles :
les fibrilles de cellulose et les nanocristaux de cellulose.
Les nanocristaux de cellulose (dits encore nanocelluloses cristallines ou NCCs pour nanocrystalline cellulose ) sont en général obtenus par une hydrolyse avec un acide fort dans des conditions strictement contrôlées de température, de durée et d'agitation. Un tel traitement permet d'attaquer les régions amorphes des fibres tout en

2 PCT/FR2016/051306 laissant les régions cristallines, plus résistantes, intactes. La suspension obtenue est ensuite lavée par des centrifugations et des dialyses successives dans l'eau distillée. Les NCCs les plus classiquement obtenus ont une longueur de quelques dizaines de nanomètres à environ 1 lm (notamment de 40 nm à 1 lm et de préférence de 40 nm à
500 nm), et un diamètre allant de 5 à 70 nm, de préférence inférieur à 15 nm (typiquement de 5 à 10 nm).
Les fibrilles de cellulose, couramment désignées microfibrilles de cellulose (dites encore cellulose microfibrillée ou MFC pour microfibrillated cellulose ) ou nanofibrilles de cellulose (NFC pour nanofibrillated cellulose ) sont typiquement isolées à partir de matériaux cellulosiques issus de la biomasse, par des procédés mécaniques permettant de délaminer les fibres de cellulose et de libérer les fibrilles de cellulose.
Par exemple, le document US 4 483 743 décrit un procédé de fabrication de cellulose microfibrillée, qui implique le passage d'une suspension liquide de cellulose au travers d'un homogénéiseur type Gaulin à haute pression. Des passages répétés de la suspension de cellulose permettent d'obtenir des microfibrilles ayant typiquement une largeur allant de 25 à 100 nm et une longueur bien plus importante.
De manière générale, les procédés mécaniques d'obtention de fibrilles de cellulose ont l'inconvénient de consommer d'importantes quantités d'énergie. A
titre d'exemple, il a été évalué que l'utilisation d'un homogénéiseur entraîne une consommation d'énergie de l'ordre de 70000 kWh/t. Cette consommation énergétique importante, et en corollaire les coûts élevés de la production de nanocelluloses, restent donc un frein considérable à leur développement industriel.
Différentes stratégies de prétraitements des fibres de cellulose ont ainsi été

développées afin de réduire la consommation d'énergie requise pour leur délamination mécanique.
Une première stratégie de prétraitement, décrite par exemple dans la demande WO 2007/091942, consiste à prétraiter les fibres de cellulose par des cellulases de manière à déstructurer la fibre avant l'application du traitement mécanique par homogénéisation.
Cependant, ce prétraitement enzymatique est extrêmement versatile en fonction de l'état de la fibre et notamment en fonction de l'histoire thermochimique préalable de la fibre.
De plus, la qualité des nanocelluloses obtenues (en particulier l'état de dispersion et notamment la taille latérale des nanofibrilles qui conditionne les propriétés d'usage et les rendements énergétiques sont très variables.
Une seconde stratégie de prétraitement s'appuie sur une étape chimique d'oxydation des fibres de cellulose (par exemple Saito et al., Biomacromolecu les, Vol. 8,

3 PCT/FR2016/051306 No. 8, 2007, pp. 2485-2491).
Typiquement, les fibres sont oxydées avec un oxydant tel que hypochlorite de sodium catalysé par le radical 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl ( TEMPO
) avant de subir le traitement mécanique précité.
Le traitement oxydatif convertit la fonction alcool primaire en position 06 de l'unité de glucose de la cellulose en une fonction carboxylate, ce qui conduit à
l'introduction de charges à la surface des fibres de cellulose. Ces charges créent des répulsions électrostatiques qui facilitent la délamination et qui augmentent son efficacité.
Toutefois, l'élimination des produits de réaction conduit à de grandes quantités d'effluents fortement pollués. En outre, des résidus de réactifs persistent au sein du produit final et continuent à réagir, altérant in fine les propriétés des nanocelluloses.
Ainsi, malgré les nouvelles stratégies de prétraitement développées, les coûts de production des nanocelluloses restent élevés, les rendements incertains, et la qualité
et les propriétés sont variables.
Il reste donc nécessaire de proposer de nouveaux procédés pour obtenir des nanocelluloses, avec une moindre consommation énergétique et de façon simple et reproductible, selon une voie peu ou pas toxique.
OBJET DE L'INVENTION
Afin de remédier aux inconvénients précités de l'état de la technique, la présente invention propose un procédé de fabrication de nanocelluloses s'appuyant sur une étape de prétraitement de fibres de cellulose avec au moins une enzyme appartenant à la famille des mono-oxygénases lytiques de polysaccharides, couramment désignés LPM0s pour Lytic Polysaccharide MonoOxygenases .
Plus particulièrement, on propose selon l'invention un procédé pour la fabrication de nanocelluloses à partir d'un substrat cellulosique comprenant des fibres de cellulose, lequel procédé comprend les étapes successives suivantes :
- au moins une étape de traitement enzymatique dudit substrat cellulosique, par la mise en contact avec au moins une enzyme de clivage, puis - au moins une étape de traitement mécanique dudit substrat cellulosique soumis à ladite au moins une étape de traitement enzymatique, pour délaminer les fibres de cellulose et pour obtenir lesdites nanocelluloses, caractérisé en ce que ladite au moins une enzyme de clivage est choisie parmi les enzymes appartenant à la famille des LPM0s.
Typiquement, les LPM0s sont aptes à assurer un clivage oxydatif des fibres de cellulose, avantageusement des cycles de glucose des fibres de cellulose, en présence

4 PCT/FR2016/051306 d'un donneur d'électron.
Sans être limité par une quelconque théorie, l'action des LPM0s facilite la fabrication de nanocellulose à travers deux actions :
- le clivage des chaînes cellulosiques provoque des fragilités au sein des fibres, facilitant la délamination mécanique, - la formation de produits d'oxydation permet d'introduire des fonctions chimiques chargées sur la surface des fibres en induisant des répulsions électrostatiques.
Encore sans être limité par une quelconque théorie, ces modifications structurales combinées ont pour conséquence de favoriser la séparation des fibres jusqu'à dispersion nanométrique et de former des nanocelluloses (fibrilles ou nanocristaux) possédant des fonctionnalités nouvelles (taux de charges, fonctions chimiques actuellement non disponibles).
D'autres caractéristiques non limitatives et avantageuses du procédé de fabrication conforme à l'invention, prises individuellement ou selon toutes les combinaisons techniquement possibles, sont également décrites ci-après ainsi que dans la description détaillée de l'invention.
Le donneur d'électron peut être choisi parmi l'ascorbate, le gallate, le cathécol, le glutathion réduit, les fragments de lignine et les carbohydrates déshydrogénases fongiques (notamment les glucoses déshydrogénases, et les cellobiose déshydrogénases).
De préférence, les LPM0s sont choisies parmi les enzymes aptes à réaliser un clivage de la cellulose par oxydation de l'un au moins des atomes de carbone en position(s) Ci, 04 et 06 du cycle de glucose. De préférence encore, les LPM0s sont choisies parmi les enzymes aptes à réaliser un clivage de la cellulose par oxydation de l'un au moins des atomes de carbone en position(s) Ci et/ou 04, éventuellement en combinaison avec 06, du cycle de glucose.
Les LPM0s peuvent être choisies parmi les familles d'enzymes fongiques AA9 (anciennement dénommées GH61) et d'enzymes bactériennes AA10 (anciennement dénommées 0BM33) de la classification CAZy (www.cazy.org). Notamment, les LPM0s peuvent être choisies parmi les LPM0s issues de Podospora anserina et de préférence parmi PaLPM09A (Genbank 0AP68375), PaLPM09B (Genbank 0AP73254), PaLPM09D (Genbank 0AP66744) PaLPM09E (Genbank 0AP67740), PaLPM09F
(Genbank 0AP71839), PaLPM09G (Genbank 0AP73072), et PaLPM09H (Genbank CAP61476) Suivant les modes de réalisation de l'invention, le substrat cellulosique est obtenu à partir de bois, d'un végétal fibreux riche en cellulose, de betterave, d'agrumes, de plantes annuelles à paille, d'animaux marins, d'algues, de champignons ou de

5 PCT/FR2016/051306 bactéries.
De préférence, le substrat cellulosique est choisi parmi les pâtes papetières chimiques, de préférence les pâtes papetières de bois chimiques, de préférence encore l'une au moins des pâtes papetières suivantes :
- les pâtes blanchies, - les pâtes semi-blanchies, - les pâtes écrues, - les pâtes au bisulfite, - les pâtes au sulfate, - les pâtes à la soude, - les pâtes kraft.
Ladite au moins une étape de traitement mécanique comprend généralement l'un au moins des traitements mécaniques suivants :
- un traitement d'homogénéisation, - un traitement de microfluidisation, - un traitement d'abrasion, - un traitement de cryobroyage.
Le procédé peut également comprendre une étape de post-traitement, par exemple un traitement acide, un traitement enzymatique, une oxydation, une acétylation, une silylation, ou encore une dérivatisation de certains groupements chimiques portés par les nanocelluloses.
L'invention se rapporte également aux nanocelluloses obtenues par la mise en oeuvre du procédé de l'invention.
Typiquement, les nanocelluloses obtenues consistent en des nanofibrilles de cellulose et/ou en des nanocristaux de cellulose.
De préférence, les nanocelluloses comportent des cycles de glucose dont au moins un atome de carbone est oxydé en position(s) Ci et/ou 04, voire également en position 06.
FIGURES
Figure 1 : Aspect des fibres kraft de cellulose traitées avec l'enzyme PaLPM09H selon différents ratios enzyme/substrat et soumises à un traitement mécanique faible avec un homogénéiseur-disperseur du type d'Ultra-Turrax et un traitement ultrasons. Images en microscopie optique des fibres non traitées (témoin) avec l'enzyme (A) ou traitées avec des ratios enzyme/substrat de 1:50 (B); 1:100 (C); et 1: 500 (D).
Figure 2 : Aspect des fibres kraft de cellulose traitées avec l'enzyme

6 PCT/FR2016/051306 PaLPM09H à un ratio enzyme/substrat 1:50 et soumises à un traitement mécanique faible avec un homogénéiseur-disperseur du type d'Ultra-Turrax et un traitement ultrasons. Images en microscopie optique des fibres témoins (A) et des fibres traitées (B), et visualisation des nanofibrilles obtenues par microcopie électronique à
transmission (C) et microscopie de force atomique (D).
Figure 3 : Aspect des fibres kraft de cellulose traitées avec les enzymes PaLPM09H et PaLPM09E selon un ratio enzyme/substrat de 1:50 puis soumises à un traitement mécanique faible avec un homogénéiseur-disperseur du type d'Ultra-Turrax et un traitement ultrasons. Images en microscopie optique des fibres kraft traitées avec PaLPM09H (A) et avec PaLPM09E (B). Visualisation par microscopie de force atomique des nanofibrilles obtenues à partir des fibres kraft par traitement avec les enzymes LPM0s PaLPM09H (C) et PaLPM09E (D).
Figure 4 : Aspect des fibres kraft de cellulose soumises à deux traitements successifs avec l'enzyme PaLPM09H à différents ratios enzyme/substrat puis soumises à
un traitement mécanique faible avec un homogénéiseur-disperseur du type d'Ultra-Turrax et un traitement ultrasons. Images en microscopie optique des fibres traitées selon les ratios enzyme/substrat de 1:50 (A); 1:100 (B); 1: 500 (C) et 1:1000 (D).
Figure 5: Analyse des photos AFM pour l'enzyme PaLPM09H, pour caractériser le profil des hauteurs (Figure 5A) et la distribution en taille (Figure 5B) des nanocelluloses. Légende Figure SA: exemple d'un profil de hauteur obtenu sur la surface largeur (x, pm) versus hauteur (y, nm); légende Figure 5B : histogramme de distribution des hauteurs avec hauteur (x, nm) versus nombre (y).
DESCRIPTION DETAILLEE
La description qui va suivre, en combinaison avec les Résultats Expérimentaux donnés à titre d'exemples non limitatifs, fera bien comprendre en quoi consiste l'invention et comment elle peut être réalisée.
Définitions ménérales La présente invention concerne un procédé pour la fabrication de nanocelluloses, en particulier de fibrilles de cellulose et/ou de nanocristaux de cellulose, à
partir d'un substrat cellulosique.
Par cellulose , on entend un homopolysaccharide linéaire issu de la biomasse (englobant les matières organiques d'origine végétale, algues incluses, la cellulose d'origine animale ainsi que la cellulose d'origine bactérienne) et constitué
d'unités (ou cycles) de glucose (D-Anhydroglucopyranose ¨ AGU pour Anhydro glucose unit ) reliées entre elles par des liaisons glycosidiques 6-(1 -4). Le motif de répétition est

7 PCT/FR2016/051306 un dimère de glucose également appelé dimère de cellobiose.
Les AGU possèdent 3 fonctions hydroxyles : 2 alcools secondaires (sur les carbones en positions 2 et 3 du cycle de glucose) et un alcool primaire (sur le carbone en position 6 du cycle de glucose).
Ces polymères s'associent par des liaisons intermoléculaires de type liaison hydrogène, conférant ainsi une structure fibreuse à la cellulose. En particulier, l'association des dimères de cellobiose forme une nanofibrille élémentaire de cellulose (dont le diamètre est d'environ 5 nm). L'association de nanofibrilles élémentaires forme une nanofibrille (dont le diamètre varie généralement de 50 à 500 nm).
L'agencement de plusieurs de ces nanofibrilles forme ensuite ce qui est généralement appelé
une fibre de cellulose.
Le terme nanocelluloses désigne les différentes formes de cellulose ayant une dimension de l'ordre du nanomètre. Ce terme englobe en particulier selon l'invention, deux familles de nanocelluloses : les nanocristaux de cellulose et les fibrilles de cellulose.
Les termes fibrilles de cellulose , nanofibrilles (de cellulose) , nanofibres (de cellulose) , cellulose nanofibrillée , microfibrilles (de cellulose) , cellulose microfibrillée , microfibrillated cellulose , cellulose nanofibrils sont synonymes.
Dans la suite de la présente demande, le terme nanofibrilles de cellulose (NFCs) sera utilisé de manière générique.
Chaque nanofibrille de cellulose contient des parties cristallines stabilisées par un solide réseau de liaisons hydrogènes inter- et intra-chaines. Ces régions cristallines sont séparées par des régions amorphes.
L'élimination des parties amorphes des nanofibrilles de cellulose, permet d'obtenir des nanocristaux de cellulose (NCCs).
Les NCCs comportent avantageusement au moins 50% de partie cristalline, de préférence encore au moins 55% de partie cristalline. Ils ont généralement un diamètre allant de 5 à 70 nm (de préférence inférieur à 15 nm) et une longueur allant de 40 nm à
environ 1 iim, de préférence allant de 40 nm à 500 nm.
Les termes nanocristaux de cellulose , cellulose nanocristalline , cellulose whiskers , microcristaux ou cellulose nanocrystal sont synonymes.
Dans la suite de la présente demande, le terme nanocristaux de cellulose (NCCs) sera utilisé de manière générique.
Dans le cas de la cellulose bactérienne, les nanofibrilles, ou rubans, de cellulose bactérienne ont généralement une longueur de plusieurs micromètres et une largeur allant de 30 à 60 nm, notamment de 45 à 55 nm.

8 PCT/FR2016/051306 Procédé selon l'invention Le procédé pour la fabrication de nanocelluloses, selon l'invention, comprend les étapes successives suivantes :
- au moins une étape de traitement enzymatique d'un substrat cellulosique comprenant des fibres de cellulose, par sa mise en contact avec au moins une enzyme de clivage appartenant à la famille des mono-oxygénases lytiques de polysaccharides (LPM05), puis - au moins une étape de traitement mécanique dudit substrat cellulosique soumis à ladite au moins une étape de traitement enzymatique, pour délaminer lesdites fibres de cellulose et pour obtenir lesdites nanocelluloses.
Une ou plusieurs, et notamment au moins deux, étapes de traitement enzymatique peuvent être mises en oeuvre selon le procédé de l'invention, préalablement à ladite au moins une étape de traitement mécanique. Par exemple, au moins deux étapes de traitement enzymatique peuvent être mises en oeuvre successivement, préalablement à ladite au moins une étape de traitement mécanique.
Au moins une étape de traitement enzymatique peut également être mise en oeuvre après ladite au moins une étape de traitement mécanique.
Lorsque plusieurs étapes de traitement enzymatique sont mises en oeuvre, les conditions de traitement (durée, LPM0(s) choisie(s), ratio enzyme/cellulose, etc.) peuvent être identiques ou différentes entre elles.
Typiquement, ladite au moins une étape de traitement enzymatique, éventuellement suivie d'au moins une étape de traitement mécanique, peut être répétée, comme décrit ci-dessus, jusqu'à obtenir une délamination complète des fibres de cellulose.
Par exemple, le procédé de l'invention peut comprendre au moins deux cycles de traitement successifs, chaque cycle de traitement comprenant au moins une étape de traitement enzymatique du substrat cellulosique suivie d'au moins une étape de traitement mécanique dudit substrat.
Sans être limité par une quelconque théorie, la combinaison selon l'invention (i) d'un traitement enzymatique avec au moins une LPMO et (ii) d'un traitement mécanique de délamination, permet d'obtenir des nanocelluloses dont les caractéristiques structurelles et les propriétés mécaniques sont tout à fait différentes des nanocelluloses existantes dans l'état de la technique.
Encore sans être limité par une quelconque théorie, le procédé de l'invention permet d'obtenir des nanocelluloses de façon simple et reproductible. De préférence, la taille et les propriétés mécaniques de ces nanocelluloses sont homogènes.

9 PCT/FR2016/051306 Substrat cellulosique Le substrat cellulosique peut être obtenu selon l'invention à partir de toute matière de la biomasse (englobant les matières organiques d'origine végétale, algues incluses, animale ou fongique) comprenant des fibres cellulosiques (c.à.d. des fibres de cellulose).
Le substrat cellulosique est obtenu avantageusement à partir de bois (dont la cellulose est le composant principal), mais aussi de tout végétal fibreux riche en cellulose, comme par exemple, le coton, le lin, le chanvre, le bambou, le kapok, les fibre de noix de coco (coir), la ramie, la jute, le sisal, le raphia, le papyrus et certains roseaux, la bagasse de canne à sucre, la betterave (et notamment la pulpe de betterave), les agrumes, les tiges de maïs ou de sorgho, ou encore les plantes annuelles à paille.
Les substrats cellulosiques peuvent également être obtenus à partir d'animaux marins (comme le tunicier par exemple), d'algues (comme par exemple Valonia ou Cladophora) ou de bactéries pour la cellulose bactérienne (comme par exemple les souches bactériennes de types Gluconacetobacter).
On choisira, selon les applications, de la cellulose issue de parois primaires comme le parenchyme des fruits (par exemple les betteraves, les agrumes etc.) ou de parois secondaires, comme le bois.
Le substrat cellulosique consiste avantageusement en un matériau cellulosique préparé par des moyens chimiques ou mécaniques, à partir de toute source cellulosique telle que mentionnée ci-dessus (et notamment à partir du bois).
Le substrat cellulosique se présente avantageusement sous la forme d'une suspension de fibres de cellulose dans un milieu liquide (de préférence un milieu aqueux), ou d'une pâte de cellulose.
Les pâtes de cellulose peuvent être conditionnées à l'état sec , soit typiquement dans un état de siccité supérieur ou égal à 80%, notamment supérieur ou égal à 90%. La pâte de cellulose peut ensuite être redispersée dans un milieu aqueux par un traitement mécanique.
De préférence, le substrat cellulosique contient au moins 90%, notamment au moins 95% et de préférence 100% de fibres de celluloses.
De préférence, le substrat cellulosique est adapté à la fabrication de papier ou d'un produit cellulosique. Le substrat cellulosique est ainsi de préférence choisi parmi les pâtes papetières (ou pâte à papier), et en particulier les pâtes papetières chimiques.
De manière générale, la pâte de cellulose et notamment la pâte papetière peut contenir, en association avec les fibres de cellulose, de l'hémicellulose et de la lignine. De préférence, la pâte de cellulose contient moins de 10% et notamment moins de 5% de lignine et/ou d'hémicellulose.

10 PCT/FR2016/051306 De préférence, les pâtes papetières chimiques contiennent quasiment exclusivement, voire exclusivement des fibres de cellulose.
La pâte papetière peut être choisie parmi l'une au moins des pâtes papetières suivantes : les pâtes blanchies, les pâtes semi-blanchies, les pâtes écrues, les pâtes au bisulfite (écrues ou blanchies), les pâtes au sulfate (écrues ou blanchies), les pâtes à la soude (écrues ou blanchies) et les pâtes kraft.
Il est également possible d'utiliser des pâtes à dissoudre ayant une faible proportion d'hémicellulose, de préférence inférieure à 10% et notamment inférieure ou égale à 5%.
De préférence, les pâtes papetières utilisées dans un procédé de l'invention sont des pâtes de bois, notamment des pâtes papetières chimiques de bois.
Mono-oxyqénases lytiques de polysaccharides - LPMO
Le substrat cellulosique est ainsi soumis à au moins une étape de prétraitement avec au moins une enzyme de clivage appartenant à la famille des mono-oxygénases lytiques de polysaccharides ( Lytic Polysaccharide Ponooxygenases ou LPMO).
Les LPM0s sont des enzymes mononucléaires de type II à cuivre. Elles présentent des caractéristiques structurelles communes, notamment :
- une surface plane avec un site actif situé proche de son centre et - un site de liaison fortement conservé pour un ion cuivre de type II exposé à
la surface de la protéine.
L'interaction entre l'enzyme LPMO et la surface de la cellulose intervient par l'intermédiaire de la face plane de l'enzyme LPMO et met en jeu des interactions avec des résidus aromatiques polaires. Les LPM0s utilisables selon l'invention sont définies par leur capacité à catalyser un clivage oxydatif des fibres de cellulose du substrat cellulosique, par oxydation de l'un au moins des atomes de carbone en positions Ci, 04 et 06 d'un cycle glucose desdites fibres de cellulose.
Le principe du clivage oxydatif réalisé par les LPM0s implique l'activation d'un groupement C-H suivie par un clivage dépendant du dioxygène (02), produisant ainsi des oligomères oxydés sur l'un au moins des carbones en positions Ci, 04, et 06.
La ou les LPMO(s) mises en oeuvre sont aptes à catalyser un clivage des fibres de cellulose par oxydation de l'un au moins des carbones choisis parmi les carbones en positions Ci et/ou 04 et/ou 06 d'un cycle glucose de la cellulose. Le clivage oxydatif conduit à la formation de groupements carboxyles à la surface des fibres de cellulose :
- le clivage oxydatif en position Ci d'un cycle glucose d'une unité de cellobiose entraîne la formation d'une lactone, spontanément hydrolysée en acide aldonique, et - le clivage oxydatif en position 04 d'un cycle glucose d'une unité de cellobiose

11 PCT/FR2016/051306 conduit à la formation d'un kétoaldose.
L'oxydation du groupement alcool en position 06 d'un cycle glucose d'une unité

de cellobiose conduit à la formation d'un groupe carbonyle.
Dans certains modes de réalisation, la ou les LPMO(s) utilisées catalysent un clivage des fibres de cellulose par oxydation de l'un au moins des carbones choisis parmi les carbones en position(s) Ci et/ou 04 d'un cycle glucose de la cellulose, éventuellement en combinaison avec le carbone en position 06.
Les LPM0s catalysent le clivage oxydatif d'une unité de cellobiose en présence d'un donneur externe d'électron.
Ce donneur d'électron, généralement une molécule de faible poids moléculaire, est choisi parmi l'ascorbate, le glutathion réduit, le gallate, le cathécol, des fragments de lignine, ou encore une enzyme de la famille des carbohydrates déshydrogénases.
De préférence, les carbohydrates déshydrogénases sont choisies parmi les enzymes fongiques, notamment les cellobiose déshydrogénase (CDHs).
Les CDHs (ou Cellobiose oxidoréductases - EC 1.1.99.18) catalysent la réaction [Cellobiose + accepteur d'électron <=> cellobiono-1,5-lactone +
accepteur réduit].
Ce sont des hémoflavoenzymes fongiques appartenant à la superfamille des glucose-méthanol-choline (GMC) oxydoréductases. Les CDHs sont des enzymes monomériques portant deux groupes prosthétiques, un groupe hème b et une flavine adénine dinucléotide. Le domaine flavoprotéine des CDHs catalyse l'oxydation à deux électrons de la cellobiose en lactone en utilisant un accepteur d'électrons. Cet accepteur d'électron peut être par exemple choisi parmi le dioxygène, les quinones et les radicaux phénoxy ou les LPM0s.
L'activité d'une enzyme CDH peut être déterminée en suivant la réduction du réactif 2,6-dichlorophénol indophénol (DCPIP) dans un tampon sodium acétate contenant du cellobiose (Bey et al., 2011, Microb. Oeil Fact. 10:113).
Des exemples de CDHs utilisables en combinaison avec au moins une enzyme LPMO et agissant également en tant que donneur d'électron peuvent être choisis parmi les CDHs provenant de Pycnoporus cinnabarinus, Humicola insolens, Podospora anserina, ou Myceliophthora thermophila.
De préférence encore, on utilise une enzyme LPMO pour laquelle une activité
cellulolytique (c'est-à-dire catalysant le clivage oxydatif de la cellulose) a été identifiée.
L'activité de clivage oxydatif des LPM0s sur un substrat cellulosique peut être testée dans des tests de clivage tels que décrit dans la partie Exemple de la présente demande.
Plus précisément, les LPM0s mises en oeuvre dans l'invention sont avantageusement choisies parmi les enzymes dites à activité auxiliaire (ou Auxiliary Activity ¨ AA) selon la classification établie dans la base de données CAZy, relatives

12 PCT/FR2016/051306 aux enzymes actives sur les hydrates de carbone (CAZy ¨ Carbohydrate Active enZyme database - http://www.cazy.org/ - Voir aussi Levasseur et al., Biotechnology for Bio fuels 2013, 6 :41).
De préférence encore, l'étape de traitement enzymatique est réalisée avec au moins une enzyme choisie parmi les enzymes LPM0s des familles dites AA9, AA10, AA11 et AA13, selon la classification établie dans la base de données CAZy.
L'enzyme LPMO selon l'invention peut contenir un module protéique de fixation au carbohydrate ( carbohydrate binding module ) spécifique de la cellulose de type CBM1 selon la classification CAZy.
Les enzymes listées dans la présente demande sont identifiées par les références Genbank (identifiant une séquence génétique) et Uniprot lorsque cette dernière est disponible (identifiant une séquence protéique ¨ voir tableau 1).
Par défaut, la référence indiquée entre parenthèses pour chaque enzyme correspond à la référence Genbank .
De préférence, on utilise (avantageusement exclusivement) au moins une enzyme de la famille AA9 et/ou au moins une enzyme de la famille AA10 de la classification CAZy.
Les enzymes de la famille AA9, listées dans le tableau 1 ci-après, sont des enzymes fongiques largement distribuées dans le génome de la plupart des ascomycètes et chez certains basidiomycètes (champignons).
De manière générale, les enzymes de la famille AA9 étaient initialement classées dans la famille des glycosides hydrolases 61 (GH61) de la classification CAZy.
Des analyses spécifiques ont montré depuis, que l'activité endoglucanase des enzymes AA9 était faible, voire inexistante (Morgenstern I et al., Briefings in Functional Genomics vol.3(6P) :471-481).
De préférence, on utilise des LPM0s dont l'activité endoglucanase est non significative ou inexistante.
L'ion cuivre des LPM0s de la famille AA9 est lié à la protéine selon un modèle d'hexacoordination impliquant au moins 2 résidus conservés d'histidine et des molécules d'eau.
Les enzymes de la famille AA9 catalysent un clivage oxydatif de l'unité
cellobiose sur le carbone en position Ci et/ou 04 de préférence sur le carbone en position Ci ou 04. Certaines enzymes (T. aurantiacus TaGH61A (G3XAP7) et Podospora anserina PaGH61B (B2AVF1)) pourraient catalyser un clivage oxydatif de la cellobiose sur un carbone en position 06.
Les LPM0s de la famille AA9 exprimée chez les champignons présentent généralement une modification post-traductionnelle consistant en une méthylation du

13 PCT/FR2016/051306 résidu histidine N-terminal.
De préférence, on utilise des LPM0s de la famille AA9 comprenant au moins un domaine CBM1 ou CBM18 (CBM pour carbohydrate binding module ) en position N-terminale. Ces enzymes comprennent alors une surface plane formée de plusieurs résidus aromatiques polaires formant un domaine de type CBM1 ou CBM18.
De préférence encore, ladite au moins une LPMO de la famille AA9 est issue de Podospora anserina et/ou de Neurospora crassa.
Les enzymes de la famille AA9 issues de Podospora anserina sont typiquement choisies dans le groupe constitué de PaLPM09A (CAP68375), PaLPM09B (CAP73254), PaLPM09D (CAP66744), PaLPM09E (CAP67740), PaLPM09F (CAP71839), PaLPM09G (CAP73072), PaLPM09H (CAP61476).
De préférence, on utilise les enzymes PaLPM09E (CAP67740) et/ou PaLPM09H (CAP61476).
Les enzymes de la famille AA9 issues de Neurospora crassa sont typiquement choisies dans le groupe constitué de NcLPM09C (EAA36362), NcLPM09D (EAA32426 /CAD21296), NcLPM09E (EAA26873), NcLPM09F (EAA26656/CAD70347), NcLPM09M
(EAA33178), NcU00836 (EAA34466), NcU02240 (EAA30263), NcU07760 (EAA29018).
Les enzymes de la famille AA10 (classification CAZy) étaient anciennement classées dans la famille CBM33 (ou carbohydrate binding module family 33 ) de la classification CAZy.
La famille AA10 des LPM0s comprend à ce jour plus d'un millier d'enzymes, identifiées particulièrement chez les bactéries, mais aussi chez certains eucaryotes ainsi que dans quelques virus.
Les LPM0s de la famille AA10 possèdent une structure similaire à celle des enzymes de la famille AA9 et notamment au moins un résidu tyrosine conservé en position N-terminal qui est impliqué dans la liaison avec l'ion cuivre.
Cependant, dans la plupart des LPM0s de la famille AA10, l'un des autres résidus tyrosine impliqués dans la liaison axiale de l'ion cuivre est remplacé par un résidu phénylalanine. Pour ces enzymes, une activité oxydative a été démontrée sur la chitine et sur la cellulose.
De préférence, les enzymes de la famille AA10 sont multimodulaires et comprennent un domaine CBM en position N-terminal. Ces domaines sont typiquement des domaines CBM2, CBM5, CBM10, CBM12 ainsi que des modules fibronectine type III.
La famille AA11 est caractérisée par des enzymes qui réalisent un clivage oxydatif en C1 sur la chitine. On choisira de préférence l'enzyme d'Aspergillus oryzae (voir également Hemsworth et al., Nature Chemical Biology 2014(10):122-126 -Discovery and characterization of a new family of lytic polysaccharide monooxygenases).
La famille AA13 est caractérisée par des enzymes qui réalisent un clivage

14 PCT/FR2016/051306 oxydatif en Ci sur l'amidon. On choisira de préférence l'enzyme d'Aspergillus nidulans (Lo Leggio et al., Nat Commun. 2015(22) 6: 5961 -Structure and boosting activity of a starch-degrading lytic polysaccharide monooxygenase).
De manière générale, l'étape de traitement enzymatique est mise en oeuvre au moyen d'au moins une enzyme LPMO listée dans le tableau 2 ci-après.
Dans certains modes de réalisation du procédé de l'invention, ladite au moins une enzyme de la famille des LPM0s (avantageusement de la famille AA9 et/ou de la famille AA10) est utilisée en combinaison avec au moins une cellulase.
La cellulase est avantageusement choisie parmi au moins une endoglucanase (par exemple une endoglucanase) et/ou au moins une carbohydrate déshydrogénase (avantageusement une cellobiose déshydrogénase (CDHs)). Les carbohydrates déshydrogénases peuvent jouer le rôle de donneur d'électron pour les LPM0s.
En pratique, ladite au moins une enzyme LPMO mise en oeuvre est avantageusement purifiée à partir d'un surnageant de culture d'un champignon et/ou produite en système hétérologue, notamment dans une bactérie, un champignon ou une levure, par exemple chez la levure Pichia pastoris.
Ladite au moins une enzyme LPMO est mélangée avec le substrat cellulosique, de manière à permettre la mise en contact entre ladite au moins une enzyme et les fibres de cellulose.
L'étape de traitement enzymatique est de préférence réalisée sous agitation douce, de façon à assurer une bonne dispersion des enzymes au sein des fibres.
Cette étape de traitement enzymatique est par exemple mise en oeuvre pendant une durée allant de 24h à 72h (de préférence 48h).
De préférence, l'étape de traitement enzymatique est mise en oeuvre à une température allant de 30 à 45 C.
Selon l'invention ladite au moins une enzyme LPMO peut être ajoutée au substrat cellulosique selon un rapport (ou ratio) enzyme/cellulose allant de 1 :1000 à
1:50, notamment de 1:500 à 1:50 ou de 1:100 à 1:50 ou encore de 1:1000 à
1:500, del : 500 à 1 :100.
De préférence, ladite au moins une enzyme LPMO est utilisée à une concentration allant de 0,001 à 10 g/L, notamment de 0,1 à 5 g/L, et de préférence encore de 0,5 à 5 g/L.
Selon un mode de réalisation particulier, le substrat cellulosique est soumis à
au moins deux (voire seulement à deux) étapes de traitement enzymatique successives (en série, avantageusement séparées par une étape de rinçage).
La ou les LPM0s mises en oeuvre au cours de chacune de ces étapes de traitement enzymatique sont identiques ou différentes ; les conditions (notamment le ratio

15 PCT/FR2016/051306 enzyme/substrat) sont identiques ou différentes entre ces étapes successives.
Dans ce cas, les Exemples démontrent que les fibres sont entièrement déstructurées, y compris à des rapports enzyme/cellulose faibles.
Etape(s) de traitement (s) mécanique(s) Le substrat cellulosique prétraité est ensuite soumis à au moins une étape de traitement mécanique qui est destinée à délaminer les fibres de cellulose pour l'obtention des nanocelluloses.
La délamination (dite encore fibrillation ou défibrillation ) consiste à
séparer, par un phénomène mécanique, les fibres de cellulose en nanocelluloses.
Comme démontré au travers des Exemples ci-après, le clivage oxydatif des fibres de cellulose, catalysé par ladite au moins une LPMO, facilite la délamination de ces fibres de cellulose lors de l'étape de traitement mécanique.
Cette étape de délamination mécanique des fibres de cellulose peut alors être réalisée dans des conditions moins drastiques et donc moins coûteuses en énergie. Par ailleurs, l'utilisation de LPM0s selon l'invention permet d'introduire dans les fibres de cellulose des groupements chargés induisant des répulsions électrostatiques, sans contamination avec des réactifs de traitement, comme lors de l'utilisation de réactifs TEMPO.
Les traitements mécaniques visant à délaminer les fibres de cellulose sont connus de l'homme du métier et peuvent être mis en oeuvre dans le procédé de l'invention.
De manière générale, on peut citer les traitements mécaniques faibles avec un homogénéiseur-disperseur (par exemple du type d'Ultra-Turrax) et/ou les traitements ultrasons.
On peut encore par exemple se référer au document de Lavoine N et al (Carbohydrate Polymers, 2012, (92) :735-64) qui décrit notamment (pages 740 à
744) des traitements mécaniques pour la préparation de cellulose microfibrillée (par exemple des nanofibrilles de cellulose).
Typiquement, un traitement mécanique peut être choisi parmi des traitements mécaniques d'homogénéisation, de microfluidisation, d'abrasion, ou de cryobroyage.
Le traitement d'homogénéisation implique le passage du substrat cellulosique prétraité, typiquement une pâte de cellulose ou une suspension liquide de cellulose, au travers d'un espace étroit sous pression élevée (tel que décrit par exemple dans le brevet US 4,486,743).
Ce traitement d'homogénéisation est de préférence effectué au moyen d'un homogénéiseur de type Gaulin. Dans un tel dispositif, le substrat cellulosique prétraité,

16 PCT/FR2016/051306 typiquement sous forme d'une suspension de cellulose, est pompé à haute pression et distribué au travers d'une valve automatique de faible orifice. Une succession rapide d'ouvertures et de fermetures de la valve soumet les fibres à une importante chute de pression (généralement d'au moins 20 MPa) et à une action de cisaillement à
vitesse élevée suivie d'un impact de décélération à vitesse élevée. Le passage du substrat dans l'orifice est répété (généralement de 8 à 10 fois) jusqu'à ce que la suspension de cellulose devienne stable. Afin de maintenir une température du produit dans une gamme allant de 70 à 80 C durant le traitement d'homogénéisation, cb l'eau de refroidissement est généralement utilisée.
Ce traitement d'homogénéisation peut également être mis en oeuvre à l'aide d'un dispositif de type microfluidiseur (voir par exemple Sisqueira et al.
Polymer 2010 2(4) :728-65). Dans un tel dispositif, la suspension de cellulose passe au travers d'une fine chambre typiquement en forme de z (dont les dimensions du canal sont généralement comprises entre 200 et 400 lm) sous pression élevée (environ 2070 bars).
Le taux de cisaillement élevé qui est appliqué (généralement supérieur à
107.51 permet d'obtenir des nanofibrilles très fines. Un nombre variable de passages (par exemple de 2 à 30, notamment de 10 à 30 ou de 5 à 25, et en particulier de 5 à 20) avec des chambres de tailles différentes peut être utilisé, pour augmenter le degré de fibrillation.
Le traitement d'abrasion ou de meulage (voir par exemple lwamoto Set al., 2007 Applied Physics A89(2) :461-66) est basé sur l'utilisation d'un dispositif de meulage apte à exercer des forces de cisaillement fournies par des pierres de meulage.
Le substrat cellulosique prétraité, généralement sous forme d'une pâte de cellulose, est passé entre une pierre de meulage statique et une pierre de meulage en rotation, typiquement à une vitesse de l'ordre de 1500 rotations par minute (rpm).
Plusieurs passages (généralement entre 2 et 5) peuvent être nécessaires pour obtenir des fibrilles de taille nanométrique.
Un dispositif de type mixeur (par exemple tel que décrit dans Unetani K et al., Biomacromolécules 2011, 12(2), pp.348-53) peut également être utilisé pour produire des microfibrilles à partir du substrat cellulosique prétraité, par exemple à
partir d'une suspension de fibres de bois.
Le traitement de cryobroyage (ou cryoconcassage) (Dufresne et al., 1997, Journal of Applied Polymer Science, 64(6) :1185-94) consiste à broyer une suspension de substrat cellulosique prétraité préalablement congelée avec de l'azote liquide. Les cristaux de glace formés à l'intérieur des cellules font exploser les membranes cellulaires et libèrent des fragments de parois. Ces procédés sont généralement utilisés pour la production de microfibrilles de cellulose à partir de produits, ou de résidus, de l'agriculture.

17 PCT/FR2016/051306 Etape(s) de post-traitement du substrat cellulosique Dans certains modes de réalisation, le procédé de fabrication comprend au moins une étape de post-traitement du substrat cellulosique, mise en oeuvre après que ledit substrat ait été soumis au traitement mécanique.
Généralement, ladite au moins une étape de post-traitement vise à augmenter le degré de fibrillation des nanocelluloses obtenues et/ou à conférer auxdites nanocelluloses de nouvelles propriétés mécaniques, en fonction des applications envisagées.
Ladite au moins une étape de post-traitement peut notamment être choisie parmi un traitement acide, un traitement enzymatique, une oxydation, une acétylation, une silylation, ou encore une dérivatisation de certains groupements chimiques portés par les microfibrilles. On peut également se référer par exemple au document de Lavoine N et al (Carbohydrate Polymers, 2012, (92) :735-64) qui décrit notamment (point 2.3, pages 747 à 748) des post-traitements qui peuvent être combinés à différents prétraitements et traitements mécaniques des fibres de celluloses.
Nanocelluloses selon l'invention Le procédé selon l'invention permet ainsi l'obtention de nanocelluloses, en particulier de nanocristaux de cellulose et/ou de nanofibrilles de cellulose.
Contrairement aux NFCs obtenues après oxydation par des réactifs chimiques de type TEMPO, les nanocelluloses obtenues par le procédé de l'invention sont dépourvues de résidus de réactifs d'oxydation (à savoir par exemple le bromure de sodium, l'hypochlorite de sodium, le chlorite de sodium, le radical (2,2,6,6-tétraméthylpipéridin-1-yl)oxyl (TEMPO), les dérivés ou analogues).
De préférence, à l'issue du procédé selon l'invention, les nanocelluloses comportent au moins un cycle de glucose (typiquement plusieurs cycles de glucose) dont l'un au moins des atomes de carbone en positions C1 et/ou C4, voire aussi C6, est oxydé
par un phénomène de clivage oxydatif.
Les nanocelluloses selon l'invention comportent ainsi des cycles de glucose qui sont :
- mono-oxydés sur l'atome de carbone en position C1, et/ou - mono-oxydés sur l'atome de carbone en position C4, et/ou - doublement oxydés, sur les atomes en positions C1 et C4.
Ces cycles de glucose, oxydés sur les atomes en positions C1 et/ou C4, peuvent encore comporter un atome de carbone oxydé en position C6.
Par atome de carbone oxydé , on entend en particulier un atome de carbone

18 PCT/FR2016/051306 qui comporte une fonction carbonyle, et avantageusement encore une fonction carboxyle.
Les nanocelluloses selon l'invention sont ainsi avantageusement chargées négativement, du fait de la présence de différents fonctions en surface dont des fonctions carboxylates sur les carbones en positions Ci et/ou 04 (contrairement au procédé TEMPO
qui conduit à une oxydation spécifique du carbone en position C6).
RESULTATS EXPERIMENTAUX
1. Des tests de clivage de la cellulose par une enzyme LPMO peuvent être menés selon le protocole suivant :
Le test de clivage est réalisé dans un volume de 300 I de liquide contenant 4,4 1.1M d'enzyme LPMO et 1 mM d'ascorbate et 0,1 % (poids/volume) de poudre de cellulose gonflée à l'acide phosphorique (PASC phosphoric acid-swoller cellulose -préparée comme décrit dans Wood TM, Methods Enzym 1988, 160 :19-25) dans 50 mM d'un tampon acétate de sodium à pH 4,8 ou 5 1.1M de cello-oligosaccharides (Megazyme, Wicklow, Ireland) dans 10 mM de tampon acétate de sodium à pH 4,8.
La réaction enzymatique est mise en oeuvre dans un tube de 2 ml incubé dans un thermomixer (Eppendorf, Montesson, France) à 50 C et 580 rpm (rotation par minute).
Après 16h d'incubation, l'échantillon est porté à 100 C pendant 10 minutes afin de stopper la réaction enzymatique, puis centrifugé à 16 000 tours par minutes (rpm) pendant 15 minutes à 4 C afin de séparer la fracticn solution de la fraction insoluble restante.
Les produits clivés obtenus peuvent être analysés par chromatographie à
échange d'ions et/ou par spectrométrie de masse (MALDI-TOF).
2. Des essais préliminaires ont été menés pour démontrer l'efficacité du procédé de fabrication de nanocellulose selon l'invention.
Ces essais ont été réalisés sur une fibre papetière (fibres kraft de cellulose) au moyen d'enzyme LMPO de la famille AA9 issues de Podospora anserina (PaLPM09E
(Genbank CAP67740) et/ou PaLPM09H (Genbank CAP61476)) et produites en système hétérologue chez la levure (Pichia pastoris).
Les fibres sont mises en contact des enzymes (à une concentration d'1g/L et selon des rapports enzyme/cellulose de 1:50, 1:100, 1:500 et 1:1000) et d'ascorbate (2 mM) puis soumises à une agitation douce pendant 48 heures à 40 C.
Les fibres traitées sont ensuite soumises à une action mécanique avec un homogénéiseur-disperseur (Ultra-Turrax puissance 500 W, vitesse maximum pendant 3 minutes), suivie d'un traitement aux ultrasons pendant 3 minutes.
Comparativement aux substrats non traités à l'enzyme, on observe que la défibrillation est facilitée pour l'ensemble des rapports enzyme/cellulose utilisés (Figure

19 PCT/FR2016/051306 1B-D ¨ les photos montrent, de façon qualitative, la défibrillation).
En l'absence d'enzyme, les fibres restent intactes et aucune défibrillation n'est constatée (voir les fibres témoins non traitées, Figure 1A).
Les dispersions ont été ensuite analysées par TEM (Microscopie Electronique en Transmission) et AFM (Microscopie de Force Atomique).
En l'absence d'enzymes LPM0s (figure 2A), on constate que très peu de structures sont visibles à l'échelle nanométrique.
En revanche, pour les fibres traitées par l'enzyme LPMO, des structures de dimensions nanométriques sont facilement repérées aussi bien dans le surnageant que dans les culots d'expérience. Les fibres sont entièrement déstructurées, laissant apparaître les zones cristallines de la fibre (Figure 20-D).
Le traitement des fibres avec l'enzyme PaLPM09E combiné au traitement mécanique ultérieur (Figures 3B et D) produit une défibrillation de la cellulose similaire à
celle obtenue avec un procédé identique impliquant l'enzyme PaLPM09H (voir Figure 3A
et C).
De manière générale, les figures 20, 2D, 30 et 3D démontrent de façon indiscutable que des nanocelluloses sont obtenues.
Si les fibres ayant subies un premier traitement avec l'enzyme LPMO sont à
nouveau soumises à un second traitement successif avec une enzyme LPMO aux conditions décrites ci-dessus, suivi du traitement mécanique, les fibres sont entièrement déstructurées y compris aux rapports enzyme/cellulose faibles (c'est-à-dire les ratios 1/500 et 1/1000) (Figure 4).
Les photos AFM pour l'enzyme PaLPM09H ont été analysées par le logiciel WSxM pour caractériser le profil des hauteurs (Figure 5A) et la distribution en taille (Figure 5B) des nanocelluloses.
Cette analyse montre, qu'au ratio enzyme/cellulose 1 :50, les nanocelluloses ont un diamètre inférieur à 100 nm.
Ce résultat confirme que les produits obtenus par le procédé selon l'invention sont des nanocelluloses.

20 PCT/FR2016/051306 Tableau 1 :
Enzymes fongiques répertoriées de la famille AA9 (classification CAZy) Nom Organisme Ref. GenBank Réf.
Uniprot Oeil Agaricus bisporus AAA53434.1 000023 AfA5C5.025 Aspergillus fumigatus 0AF31975.1 Q6MYM8 endoglucanase / CMCase (Eng61) Aspergillus fumigatus AFJ54163.1 endo-13-1,4-glucanase B (EgIB ; Aspergillus kawachii BAB62318.1 Q96WQ9 AkCeI61A) (CeI61A) NBRC4308 AN1041.2 Aspergillus nidulans EAA65609.1 C8VTW9 AN3511.2 Aspergillus nidulans EAA59072.1 05B7G9 AN9524.2 Aspergillus nidulans EAA66740.1 08VI93 FGSC A4 0BF83171.1 05A0A6 AN7891.2 Aspergillus nidulans EAA59545.1 Q5AUY9 AN6428.2 Aspergillus nidulans EAA58450.1 08V0 F9 AN3046.2 Aspergillus nidulans EAA63617.1 C8VIS7 AN3860.2 (EgIF) Aspergillus nidulans EAA59125.1 08V6H2 endo-13-1,4-glucanase (ANI 602.2) Aspergillus nidulans EAA64722.1 05B0X8 FGSC A4 ABF50850.1 AN2388.2 Aspergillus nidulans EAA64499.1 08VNP4 An04g08550 Aspergillus figer 0AK38942.1 A2QJX0 CBS 513.88 An08g05230 Aspergillus figer 0AK45495.1 A20R94 CBS 513.88 Anl2g02540 Aspergillus figer CAK41095.1 A2QYU6 CBS 513.88 Anl 2g04610 Aspergillus figer CAK97151.1 A2QZE1 CBS 513.88 An14g02670 Aspergillus figer 0AK46515.1 A2R313 CBS 513.88 Anl5g04570 Aspergillus figer 0AK97324.1 A2R5J9 CBS 513.88 Anl5g04900 Aspergillus figer 0AK42466.1 A2R5NO
CBS 513.88

21 PCT/FR2016/051306 Nom Organisme Ref. GenBank Réf.
Uniprot A0090005000531 Aspergillus oryzae BAE55582.1 Q2US83 A0090001000221 Aspergillus oryzae BAE56764.1 Q2UNV1 A0090023000056 Aspergillus oryzae BAE58643.1 Q2U1H2 A0090023000159 Aspergillus oryzae BAE58735.1 Q2UI80 A0090023000787 Aspergillus oryzae BAE59290.1 Q2UGM5 A0090012000090 Aspergillus oryzae BAE60320.1 Q2UDP5 A0090138000004 Aspergillus oryzae BAE64395.1 Q2U220 A0090103000087 Aspergillus oryzae BAE65561.1 Q2TYW2 Ce16 (E6) Bipolaris maydis C4 AAM76663.1 Q8JOH7 glycoside hydrolase family 61 protein Botryotinia fuckeliana CCD34368.1 (Bof ut4_p103280.1) T4 glycoside hydrolase family 61 protein Botryotinia fuckeliana CCD47228.1 (Bof ut4_p003870.1) T4 glycoside hydrolase family 61 protein Botryotinia fuckeliana CCD48549.1 (Bof ut4_p109330.1) T4 glycoside hydrolase family 61 protein Botryotinia fuckeliana CCD50139.1 (Bof ut4_p025380.1) T4 glycoside hydrolase family 61 protein Botryotinia fuckeliana CCD50144.1 (Bof ut4_p025430.1) T4 glycoside hydrolase family 61 protein Botryotinia fuckeliana CCD51504.1 (Bofut4_p018100.1) T4 glycoside hydrolase family 61 protein Botryotinia fuckeliana CCD49290.1 (Bof ut4_p031660.1) T4 glycoside hydrolase family 61 protein Botryotinia fuckeliana CCD52645.1 (Bof ut4_p000920.1) T4 Bof uT4P 143000045001 Botryotinia fuckeliana CCD50451.2 T4 CCD50451.1 ORF Chaetomium AGY80102.1 thermophilum CT2 ORF (fragment) Chaetomium AGY80103.1 thermophilum CT2 ORF (fragment) Chaetomium AGY80104.1 thermophilum CT2 ORF (fragment) Chaetomium AGY80105.1 thermophilum CT2

22 PCT/FR2016/051306 Nom Organisme Ref. GenBank Réf.
Uniprot cellobiohydrolase family protein 61, Chaetomium AGY80103.1 partial (Cbh61-2) (fragment) thermophilum CT2 cellobiohydrolase family protein 61, Chaetomium AGY80104.1 partial (Cbh61-3) (fragment) thermophilum CT2 cellobiohydrolase family protein 61, Chaetomium AGY80105.1 partial (Cbh61-4) (fragment) thermophilum CT2 ORF (possible fragment) Colletotrichum CAQ16278.1 B5WYD8 graminicola M2 ORF Colletotrichum CAQ16206.1 B5WY66 graminicola M2 ORF Colletotrichum CAQ16208.1 B5WY68 graminicola M2 ORF Colletotrichum CAQ16217.1 B5WY77 graminicola M2 unnamed protein product Coprinopsis cinerea CAG27578.1 CGB A6300C Cryptococcus ADV19810.1 bacillisporus WM276 CNAG 00601 Cryptococcus AFR92731.1 neoformans var. AFR92731.2 grubii H99 (Cryne H99 1) Oeil Cryptococcus AAC39449.1 059899 neoformans var.
neoformans 0NA05840 (Oeil) Cryptococcus AAW41121.1 F5HH24 neoformans var.
neoformans JEC21 (Cryne JEC21 1) ORF (fragment) Flammulina velutipes ADX07320.1 FFUJ 12340 Fusarium fujikuroi IMI CCT72465.1 58289 (Fusful) FFUJ 13305 Fusarium fujikuroi IMI 00T671 19.1 58289 (Fusful) FFUJ 07829 Fusarium fujikuroi IMI CCT69268.1 58289 (Fusful) FFUJ 12621 Fusarium fujikuroi IMI 00T72729.1 58289 (Fusful) FFUJ 12840 Fusarium fujikuroi IMI 00T72942.1 58289 (Fusful) FFUJ 09373 Fusarium fujikuroi IMI 00T73805.1 58289 (Fusful) FFUJ 10599 Fusarium fujikuroi IMI CCT74544.1 58289 (Fusful)

23 PCT/FR2016/051306 Nom Organisme Ref. GenBank Réf.
Uniprot FFUJ 10643 Fusarium fujikuroi /Mi CCT74587.1 58289 (Fusful) FFUJ 14514 Fusarium fujikuroi /Mi CCT67584.1 58289 (Fusful) FFUJ 11399 Fusarium fujikuroi /Mi CCT75380.1 58289 (Fusful) FFUJ 14514 Fusarium fujikuroi /Mi CCT67584.1 FFUJ 11399 Fusarium fujikuroi /Mi CCT75380.1 FFUJ 04652 Fusarium fujikuroi /Mi CCT64153.1 58289 (Fusful) FFUJ 03777 Fusarium fujikuroi /Mi CCT64954.1 58289 (Fusful) FFUJ 04940 Fusarium fujikuroi /Mi CCT63889.1 58289 (Fusful) Sequence 122805 from patent US Fusarium ABT35335.1 7214786 graminearum FG03695.1 (CeI61E) Fusarium XP 383871.1 graminearum PH-1 unnamed protein product Fusarium CEF78545.1 graminearum PH-1 unnamed protein product Fusarium CEF74901.1 graminearum PH-1 unnamed protein product Fusarium CEF78472.1 graminearum PH-1 unnamed protein product Fusarium CEF86346.1 graminearum PH-1 unnamed protein product Fusarium CEF87450.1 graminearum PH-1 unnamed protein product Fusarium CEF85876.1 graminearum PH-1 unnamed protein product Fusarium CEF86254.1 graminearum PH-1 unnamed protein product Fusarium CEF87657.1 graminearum PH-1 unnamed protein product Fusarium CEF76256.1 graminearum PH-1 unnamed protein product Fusarium CEF78876.1 graminearum PH-1 unnamed protein product Fusarium CEF79735.1 graminearum PH-1

24 PCT/FR2016/051306 Nom Organisme Ref. GenBank Réf.
Uniprot unnamed protein product Fusarium CEF74460.1 graminearum PH-1 unnamed protein product Fusarium CEF84640.1 graminearum PH-1 endo-i3-1,4-glucanase (CeI61G) Gloeophyllum AEJ35168.1 trabeum GH61D Heterobasidion AF072234.1 parviporum GH61B Heterobasidion AF072233.1 parviporum GH61A Heterobasidion AF072232.1 parviporum GH61F Heterobasidion AF072235.1 parviporum GH61G Heterobasidion AF072236.1 parviporum GH61H Heterobasidion AF072237.1 parviporum GH61I Heterobasidion AF072238.1 parviporum GH61J Heterobasidion AF072239.1 parviporum unnamed protein product Humicola insolens CAG27577.1 endoglucanase IV (EgiV) Hypocrea orientalis AFD50197.1 GH61A (GH61A) Lasiodiplodia CAJ81215.1 theobromae CBS
247.96 GH61B (GH61B) Lasiodiplodia CAJ81216.1 theobromae CBS
247.96 GH61C (GH61C) Lasiodiplodia CAJ81217.1 theobromae CBS
247.96 GH61D (GH61D) Lasiodiplodia CAJ81218.1 theobromae CBS
247.96 ORF Leptosphaeria CBX91313.1 maculans v23.1.3 ORF Leptosphaeria CBX93546.1 maculans v23.1.3 ORF Leptosphaeria CBX94224.1 maculans v23.1.3

25 PCT/FR2016/051306 Nom Organisme Ref. GenBank Réf.
Uniprot ORF Leptosphaeria CBX94532.1 E4ZSU4 maculans v23.1.3 ORF Leptosphaeria CBX94572.1 E4ZSY4 maculans v23.1.3 ORF Leptosphaeria CBX95655.1 E4ZVM9 maculans v23.1.3 ORF Leptosphaeria CBX96476.1 E4ZZ41 maculans v23.1.3 ORF Leptosphaeria CBX96550.1 E4ZYM4 maculans v23.1.3 ORF Leptosphaeria CBX96949.1 E5A089 maculans v23.1.3 ORF Leptosphaeria CBX97718.1 E5A201 maculans v23.1.3 ORF Leptosphaeria CBX98126.1 E5A3B3 maculans v23.1.3 ORF Leptosphaeria CBY01974.1 E5AFI5 maculans v23.1.3 ORF Leptosphaeria CBY02242.1 E5ACP0 maculans v23.1.3 ORF Leptosphaeria CBX91667.1 E4ZK72 maculans v23.1.3 ORF Leptosphaeria CBX93965.1 E4ZQA3 maculans v23.1.3 ORF Leptosphaeria CBX98254.1 E5A3P1 maculans v23.1.3 ORF (fragment) Leptosphaeria CBY00196.1 E5A955 maculans v23.1.3 ORF Leptosphaeria CBY01204.1 E5AC13 maculans v23.1.3 predicted protein (Lema p000430.1) Leptosphaeria CBY01256.1 E5ADG7 (fragment) maculans v23.1.3 ORF (fragment) Leptosphaeria CBY01257.1 E5ADG8 maculans v23.1.3 lytic polysaccharide monooxygenase Leucoagaricus CDJ79823.1 gongylophorus Ae322 MG05364.4 Magnaporthe grisea EAA54572.1 70-15 (Maggr1) XP 359989.1 MG07686.4 Magnaporthe grisea EAA53409.1 G4N3E5 70-15 (Maggr1) XP 367775.1 MG07300.4 Magnaporthe grisea EAA56945.1 G4MUY8 70-15 (Maggr1) XP 367375.1

26 PCT/FR2016/051306 Nom Organisme Ref. GenBank Réf.
Uniprot MG08020.4 Magnaporthe grisea EAA57051.1 70-15 (Maggr1) XP 362437.1 MG08254.4 Magnaporthe grisea EAA57285.1 G4MXC7 70-15 (Maggr1) XP 362794.1 MG08066.4 (fragment) Magnaporthe grisea EAA57097.1 G4MXS5 70-15 (Maggr1) XP 362483.1 MG04547.4 Magnaporthe grisea EAA50788.1 G4MS66 70-15 (Maggr1) XP 362102.1 MG08409.4 Magnaporthe grisea EAA57439.1 G4MVX4 70-15 (Maggr1) XP 362640.1 MG09709.4 Magnaporthe grisea EAA49718.1 G4NA15 70-15 (Maggr1) XP 364864.1 MG06069.4 Magnaporthe grisea EAA52941.1 G4N560 70-15 (Maggr1) XP 369395.1 MG09439.4 Magnaporthe grisea EAA51422.1 G4NHT8 70-15 (Maggr1) XP 364487.1 MG06229.4 Magnaporthe grisea EAA56258.1 70-15 (Maggr1) XP 369714.1 MG07631.4 Magnaporthe grisea EAA53354.1 G4N2Z0 70-15 (Maggr1) XP 367720.1 MGG 06621 Magnaporthe grisea XP 003716906.1 70-15 (Maggr1) XP 370106.1 MGG 12696 Magnaporthe grisea XP 003721313.1 70-15 (Maggr1) MGG 02502 Magnaporthe grisea XP 003709306.1 70-15 (Maggr1) EAA54517.1 XP 365800.1 MGG 04057 Magnaporthe grisea XP 003719782.1 70-15 (Maggr1) EAA50298.1 XP 361583.1 MGG 13241 Magnaporthe grisea XP 003711808.1 70-15 (Maggr1) MGG 13622 Magnaporthe grisea XP 003717521.1 70-15 (Maggr1) MGG 07575 Magnaporthe grisea XP 003711490.1 70-15 (Maggr1) EAA53298.1 XP 367664.1 MGG 11948 Magnaporthe grisea XP 003709110.1 70-15 (Maggr1) MGG 16080 (fragment) Magnaporthe grisea XP 003709033.1 70-15 (Maggr1) MGG 16043 (fragment) Magnaporthe grisea XP 003708922.1 70-15 (Maggr1)

27 PCT/FR2016/051306 Nom Organisme Ref. GenBank Réf.
Uniprot MGG 12733 (probable fragment) Magnaporthe grisea XP 003716689.1 70-15 (Maggr1) copper-dependent polysaccharide Malbranchea CCP37674.1 monooxygenases (Gh61) (fragment) cinnamomea CBS
115.68 copper-dependent polysaccharide Melanocarpus CCP37668.1 monooxygenases (Gh61) (fragment) albomyces CBS
638.94 copper-dependent polysaccharide Myceliophthora CCP37667.1 monooxygenases (Gh61) (fragment) fergusii CBS 406.69 MYCTH 2112799 Myceliophthora AE061257.1 thermophila ATCC

MYCTH 79765 Myceliophthora AE056016.1 thermophila ATCC

MYCTH 110651 Myceliophthora AE054509.1 thermophila ATCC

MYCTH 2298502 Myceliophthora AE055082.1 thermophila ATCC

MYCTH 2299721 Myceliophthora AE055652.1 thermophila ATCC

MYCTH 2054500 Myceliophthora AE055776.1 thermophila ATCC

MYCTH 111088 Myceliophthora AE056416.1 thermophila ATCC

8-glycan-cleaving enzyme Myceliophthora AE056542.1 (StCeI61a ; MYCTH 46583) thermophila ATCC
(CeI61A) 42464 MYCTH 2301632 Myceliophthora AE056547.1 thermophila ATCC

MYCTH 100518 Myceliophthora AE056642.1 thermophila ATCC

lytic polysaccharide monooxygenases Myceliophthora AE056665.1 (active on cellulose) (MYCTH 92668) thermophila ATCC

28 PCT/FR2016/051306 Nom Organisme Ref. GenBank Réf.
Uniprot MYCTH 2060403 Mycetiophthora AE058412.1 thermophila ATCC

MYCTH 2306673 Mycetiophthora AE058921.1 thermophila ATCC

MYCTH 116175 (fragment) Mycetiophthora AE059482.1 thermophila ATCC

MYCTH 96032 Mycetiophthora AE059823.1 thermophila ATCC

MYCTH 103537 Mycetiophthora AE059836.1 thermophila ATCC

MYCTH 55803 Mycetiophthora AE059955.1 thermophila ATCC

lytic polysaccharide monooxygenases Mycetiophthora AE060271.1 (active on cellulose) thermophila ATCC
(MYCTH 112089) 42464 MYCTH 85556 Mycetiophthora AE061304.1 thermophila ATCC

MYCTH 2311323 Mycetiophthora AE061305.1 thermophila ATCC

MYCTH 47093 (fragment) Mycetiophthora AE056498.1 thermophila ATCC

MYCTH 80312 Mycetiophthora AE058169.1 thermophila ATCC

lytic polysaccharide monooxygenase Neurospora crassa CAD21296.1 Q1K8B6 (active on cellulose) (PM0- 0R74A EAA32426.1 Q8WZQ2 2;NcLPM09D;GH61- XP 326543.1 4;NCU01050) (LPM09D) lytic polysaccharide monooxygenase Neurospora crassa CAD70347.1 Q1K4Q1 (active on cellulose) (PM0- 0R74A EAA26656.1 Q873G1 03328;NcLPM09F;GH61- XP 322586.1 6;NCU03328) (LPM09F) lytic polysaccharide monooxygenase Neurospora crassa CAE81966.1 Q7SHD9 (PM0-01867 ; NcLPM09J ; GH61- 0R74A EAA36262.1 ; NCU01867 ; XP 329057.1 B13N4.070) (LPM09J)

29 PCT/FR2016/051306 Nom Organisme Ref. GenBank Réf.
Uniprot NCU02344.1 (B23N11.050) Neurospora crassa CAF05857.1 Q7S411 0R74A EAA30230.1 XP 331120.1 lytic polysaccharide monooxygenase Neurospora crassa EAA33178.1 Q7SA19 (active on cellulose) (PM0- 0R74A XP 328604.1 3;NcLPM09M;GH61-13;NcPM0-3;NCU07898) (LPM09M) NCU05969.1 Neurospora crassa EAA29347.1 Q7S1V2 0R74A XP 325824.1 lytic polysaccharide monooxygenase Neurospora crassa EAA36362.1 Q7SH18 (active on cellulose and 0R74A XP 330104.1 cellooligosaccharides) (PM0-02916;NcLPM09C;GH61-3;NCU02916) (LPM09C) lytic polysaccharide monooxygenase Neurospora crassa EAA29018.1 Q7S111 (active on cellulose) (GH61- 0R74A XP 328466.1 2;NCU07760) NCU07520.1 Neurospora crassa EAA29132.1 Q7S1A0 0R74A XP 327806.1 lytic polysaccharide monooxygenase Neurospora crassa EAA30263.1 Q7S439 (active on cellulose) (GH61- 0R74A XP 331016.1 1;NCU02240) lytic polysaccharide monooxygenase Neurospora crassa EAA34466.1 Q7SCJ5 (active on cellulose) (NCU00836) 0R74A XP 325016.1 lytic polysaccharide monooxygenase Neurospora crassa EAA26873.1 Q7RWN7 (active on cellulose) (PM0- 0R74A XP 330877.1 08760;NcLPM09E;GH61-5;NCU08760) (LPM09E) NCU07974.1 Neurospora crassa EAA33408.1 Q7SAR4 0R74A XP 328680.1 NCU03000.1 (B24P7.180) Neurospora crassa EAA36150.1 Q7RV41 0R74A CAB97283.2 Q9P3R7 XP 330187.1 cellulose monooxygenase Penicillium oxalicum A1006742.1 Pc12g13610 Penicillium CAP80988.1 B6H016 chrysogenum Wisconsin 54-1255 (PenchWisc1 1) Pc13g07400 Penicillium CAP91809.1 B6H3U0 chrysogenum Wisconsin 54-1255 (PenchWisc1 1)

30 PCT/FR2016/051306 Nom Organisme Ref. GenBank Réf.
Uniprot Pc13g13110 Penicillium CAP92380.1 B6H3A3 chrysogenum Wisconsin 54-1255 (PenchWisc1 1) Pc20g11100 Penicillium CAP86439.1 B6HG02 chrysogenum Wisconsin 54-1255 (PenchWisc1 1) CeI61 (CeI61A) Phanerochaete AAM22493.1 Q8NJI9 chrysosporium BKM-Lytic polysaccharide mono- Phanerochaete BAL43430.1 oxygenase active on cellulose chrysosporium K-3 (Gh61D;PcGH61D) PIIN 01487 Piriformospora indica CCA67659.1 (Pirinl) PIIN 02110 Piriformospora indica CCA68244.1 (Pirinl) PI IN 03975 Piriformospora indica CCA70035.1 (Pirinl) P I IN 04357 Piriformospora indica CCA70418.1 (Pirinl) PIIN 04637 Piriformospora indica CCA70703.1 (Pirinl) PIIN 06117 Piriformospora indica CCA72182.1 (Pirinl) PIIN 06118 Piriformospora indica CCA72183.1 (Pirinl) PIIN 06127 Piriformospora indica CCA72192.1 (Pirinl) PIIN 06155 Piriformospora indica CCA72220.1 (Pirinl) PI IN 07098 Piriformospora indica CCA73144.1 (Pirinl) PIIN 07105 Piriformospora indica CCA73151.1 (Pirinl) PIIN 08199 Piriformospora indica CCA74246.1 (Pirinl) PI IN 08783 Piriformospora indica CCA74814.1 (Pirinl) PI IN 09022 Piriformospora indica CCA75037.1 (Pirinl) PIIN 00566 (fragment) Piriformospora indica CCA66803.1 (Pirinl)

31 Nom Organisme Ref.
GenBank Réf.
Uniprot Pli N_01484 Piriformospora indica CCA67656.1 (Pirinl) PIIN 01485 (fragment) Piriformospora indica CCA67657.1 (Pirinl) PIIN 01486 (fragment) Piriformospora indica CCA67658.1 (Pirinl) P I IN 04356 Piriformospora indica CCA70417.1 (Pirinl) PIIN 05699 (fragment) Piriformospora indica CCA71764.1 (Pirinl) PIIN 06156 Piriformospora indica CCA72221.1 (Pirinl) Pli N_08402 Piriformospora indica CCA74449.1 (Pirinl) PI IN 10315 (fragment) Piriformospora indica CCA76320.1 (Pirinl) P I IN 10660 (fragment) Piriformospora indica CCA76671.1 (Pirinl) PIIN 00523 (fragment) Piriformospora indica CCA77877.1 (Pirinl) Putative Glycoside Hydrolase Family Podospora anserina CDP30131.1 B2AL94 61 S mat+ (Podan2) CAP64732.1 Putative Glycoside Hydrolase Family Podospora anserina CDP30928.1 B2B346 61 S mat+ (Podan2) CAP71532.1 Pa 1 500 Podospora anserina CAP59702.1 B2A9F5 S mat+ (Podan2) CDP22345.1 Pa 4 350 Podospora anserina CAP61395.1 B2AD80 S mat+ (Podan2) CDP27750.1 Pa 4 1020 Podospora anserina CAP61476.1 B2ADG1 S mat+ (Podan2) CDP27830.1 Pa 0 270 Podospora anserina CAP61650.1 B2ADY5 S mat+ (Podan2) CDP28001.1 Pa 5 8940 Podospora anserina CAP64619.1 B2AKU6 S mat+ (Podan2) CDP30017.1 Pa 5 4100 (fragment) Podospora anserina CAP64865.1 B2ALM7 S mat+ (Podan2) CDP29378.1 Pa 5 6950 Podospora anserina CAP65111.1 B2AMI8 S mat+ (Podan2) CDP29800.1 Pa 5 10660 Podospora anserina CAP65855.1 B2APD8 S mat+ (Podan2) CDP30283.1 Pa 5 10760 Podospora anserina CAP65866.1 B2APE9 S mat+ (Podan2) CDP30272.1

32 Nom Organisme Ref.
GenBank Réf.
Uniprot Pa 5 11630 (fragment) Podospora anserina CAP65971.1 B2AP19 S mat+ (Podan2) CDP30166.1 Pa 4 7570 Podospora anserina CAP66744.1 B2ARG6 S mat+ (Podan2) CDP28479.1 Pa 1 21900 (fragment) Podospora anserina CAP67176.1 B2AS05 S mat+ (Podan2) CDP24589.1 Pa 1 22040 Podospora anserina CAP67190.1 B2AS19 S mat+ (Podan2) CDP24603.1 Pa 1 22150 (fragment) Podospora anserina CAP67201.1 B2AS30 S mat+ (Podan2) CDP24614.1 Pa 6 11220 Podospora anserina CAP67466.1 B2ASU3 S mat+ (Podan2) CDP30332.1 Pa 6 11370 Podospora anserina CAP67481.1 B2ASV8 S mat+ (Podan2) CDP30347.1 Pa 6 11470 Podospora anserina CAP67493.1 B2ASX0 S mat+ (Podan2) CDP30359.1 Pa 1 16300 Podospora anserina CAP67740.1 B2ATL7 S mat+ (Podan2) CDP23998.1 Pa 7 5030 Podospora anserina CAP68173.1 B2AUVO
S mat+ (Podan2) CDP31642.1 Pa 7 3770 Podospora anserina CAP68309.1 B2AV86 S mat+ (Podan2) CDP31780.1 Pa 7 3390 Podospora anserina CAP68352.1 B2AVC8 S mat+ (Podan2) CDP31823.1 lytic polysaccharide mono-oxygenase Podospora anserina CAP68375.1 B2AVF1 active on cellulose S mat+ (Podan2) CDP31846.1 (Gh61B;Pa 7 3160)(Gh61B) Pa 6 7780 Podospora anserina CAP71839.1 B2B403 S mat+ (Podan2) CDP31230.1 Pa 2 1700 Podospora anserina CAP72740.1 B2B4L5 S mat+ (Podan2) CDP25137.1 Pa 2 4860 Podospora anserina CAP73072.1 B2B5J7 S mat+ (Podan2) CDP25472.1 lytic polysaccharide mono-oxygenase Podospora anserina CAP73254.1 B2B629 active on cellulose S mat+ (Podan2) CDP25655.1 (Gh61A;Pa 2 6530)(Gh61A) Pa 2 7040 Podospora anserina CAP73311.1 B2B686 S mat+ (Podan2) CDP25714.1 Pa 2 7120 Podospora anserina CAP73320.1 B2B695 S mat+ (Podan2) CDP25723.1 Pa 3 190 Podospora anserina CAP61048.1 B2AC83 S mat+ (Podan2) CDP26500.1

33 PCT/FR2016/051306 Nom Organisme Ref. GenBank Réf.
Uniprot Pa 3 2580 Podospora anserina CAP70156.1 S mat+ (Podan2) CDP26748.1 Pa 3 3310 Podospora anserina CAP70248.1 S mat+ (Podan2) CDP26841.1 endo-i3-1,4-glucanase (Egll ; Pyrenochaeta AEV53599.1 PIEGL1) lycopersici ISPaVe copper-dependent polysaccharide Rasamsonia CCP37669.1 monooxygenases (Gh61) (fragment) byssochlamydoides CBS 151.75 copper-dependent polysaccharide Remersonia CCP37675.1 monooxygenases (Gh61) (fragment) thermophila CBS
540.69 RHTOOS 28e01816g Rhodosporidium CDR49619.1 toruloides CECT1137 copper-dependent polysaccharide Scytalidium CCP37676.1 monooxygenases (Gh61) (fragment) indonesiacum CBS
259.81 SMU2916 (fragment) Sordaria macrospora CAQ58424.1 Cl k-hell lytic polysaccharide mono-oxygenase Thermoascus ABW56451.1 active on cellulose aurantiacus ACS05720.1 copper-dependent polysaccharide Thermoascus CCP37673.1 monooxygenases (Gh61) (fragment) aurantiacus CBS
891.70 ORF Thermoascus AG068294.1 aurantiacus var.
levisporus copper-dependent polysaccharide Thermomyces CCP37672.1 monooxygenases (Gh61) (fragment) dupontii CBS 236.58 copper-dependent polysaccharide Thermomyces CCP37678.1 monooxygenases (Gh61) (fragment) lanuginosus CBS
632.91 unnamed protein product Thiela via terrestris CAG27576.1 TH ITE 2106556 Thiela via terrestris AE062422.1 THITE 2116536 Thiela via terrestris AE067662.1 TH ITE 2040127 Thiela via terrestris AE064605.1 THITE 2119040 Thiela via terrestris AE069044.1 TH ITE 115795 Thiela via terrestris AE064177.1

34 PCT/FR2016/051306 Nom Organisme Ref. GenBank Réf.
Uniprot THITE 2110890 Thiela via terrestris AE064593.1 THITE 2112626 Thiela via terrestris AE065532.1 THITE 2076863 Thiela via terrestris AE065580.1 TH ITE 170174 Thiela via terrestris AE066274.1 THITE 2044372 Thiela via terrestris AE067396.1 THITE 2170662 Thiela via terrestris AE068023.1 TH ITE 128130 Thiela via terrestris AE068157.1 THITE 2145386 Thiela via terrestris AE068577.1 THITE 2054543 Thiela via terrestris AE068763.1 THITE 2059487 Thiela via terrestris AE071031.1 THITE 2142696 Thiela via terrestris AE067395.1 THITE 43665 Thiela via terrestris AE069043.1 THITE 2085430 (fragment) Thiela via terrestris AE063926.1 THITE 2122979 Thiela via terrestris XP 003657366.1 cellulase-enhancing factor (GH61B) Thiela via terrestris ACE10231.1 Sequence 4 from patent US Thiela via terrestris ACE10232.1 7361495 (GH61C) NRRL 8126 Sequence 4 from patent US Thiela via terrestris ACE10232.1 7361495 (GH61C) NRRL 8126 Sequence 6 from patent US Thiela via terrestris ACE10233.1 7361495 (GH61D) NRRL 8126 Sequence 6 from patent US Thiela via terrestris ACE10233.1 7361495 (GH61D) NRRL 8126 lytic polysaccharide mono-oxygenase Thielavia terrestris AE071030.1 active on cellulose NRRL 8126 ACE10234.1 (131562 ;TtGH61E)(GH61E) Sequence 10 from patent US Thiela via terrestris ACE10235.1 7361495 (GH61G) NRRL 8126

35 PCT/FR2016/051306 Nom Organisme Ref. GenBank Réf.
Uniprot Sequence 10 from patent US Thiela via terrestris ACE10235.1 7361495 (GH61G) NRRL 8126 Lytic polysaccharide mono- Trichoderma reesei AAP57753.1 Q7Z9M7 oxygenase active on cellulose QM6A ABH82048.1 (EG7;HjGH616)(Ce161B=GH61B) ACK19226.1 ACR92640.1 endo-i3-1,4-glucanase IV Trichoderma reesei CAA71999.1 014405 (EGIV;Eg14;EG4) (CeI61A) RUTC-30 endoglucanase (EnGluIV;EndoGluIV) Trichoderma ADB89217.1 D3JTC4 satumisporum endoglucanase IV (EgIV;EG IV) Trichoderma sp. SSL ACH92573.1 B5TYI4 endoglucanase VII (EgvII) Trichoderma viride ACD36971.1 B4YEW1 AS 3.3711 endoglucanase IV (EgIV) Trichoderma viride ADJ57703.1 B4YEW3 AS 3.3711 ACD36973.1 D9IXC6 AAA12YMO5FL uncultured eukaryote CCA94933.1 AAA2YGO1FL uncultured eukaryote CCA94930.1 AAA15Y110FL uncultured eukaryote CCA94931.1 AAA21YH11FL uncultured eukaryote CCA94932.1 ABA3YPO5FL uncultured eukaryote CCA94934.1 endoglucanasell(Eg11) Volvariella volvacea AFP23133.1 endoglucanasell(Eg11) Volvariella volvacea AAT64005.1 Q6E5B4 unknown Zea mays 873 ACF86151.1 unknown (ZM BFc0036G02) Zea mays 873 ACF78974.1 B4FA31 ACR36748.1

36 PCT/FR2016/051306 Tableau 2:
LPM0s (familles AA9, AA10 et AA11 de la classification CAZy).
Par spécificité de substrat , on entend le type de substrat clivé (clivage oxydatif) par l'enzyme LPMO correspondante.
Par sélectivité connue , on entend le carbone du cycle de glucose oxydé
par l'enzyme LPMO correspondante Par Modularité , on entend la classe CAZy (AA9, 10 ou 11) de l'enzyme et la présence connue d'un domaine conservé (CBM ou X278).
Réf. Réf. Spécificité
Sélectivité
Organisme Uniprot GenBank Autres noms de Modularité
substrat connue champignons A. oryzae Q2UA85 BAE61530 AoAAll chitine Cl AA11-X278 A. nidulan EAA AA13-s C8VGF8 62623.1 AnAA13 amidon Cl CBM20 M. MYCTH 1120 thermophila G2QI82 AE060271 89 cellulose Cl M. MYCTH 9266 thermophila G2QAB5 AE056665 8 cellulose Cl N. crassa 7 EAA26873 NcLPM09E cellulose Cl AA9¨CBM1 N. crassa 2 CAD21296 NcLPM09D
cellulose 04 AA9 N. crassa Q75A19 EAA33178 NcLPM09M cellulose 01,04 AA9 cellulose hemicellu-N. crassa Q75HI8 EAA36362 NcLPM09C lose 04 AA9¨CBM1 N. crassa Q1K4Q1 0AD70347 NcLPM09F cellulose Cl N. crassa Q7SCJ5 EAA34466 NcU00836 cellulose Cl N. crassa 07SCE9 34371.2 NcAA13 amidon Cl CBM20 N. crassa 07S439 EAA30263 NcU02240 cellulose 04 N. crassa Q7S111 EAA29018 NcU07760 cellulose Cl , 04 AA9-CBM1 P.
chrysosporium H1AE14 BAL43430 PcLPM09D cellulose Cl PaGH61A
P. anserina B2B629 CAP73254 PaLMPOB cellulose Cl a, C4a AA9-CBM1 PaGH61B
P. anserina B2AVF1 CAP68375 PaLMPO9A cellulose Cl, 04 AA9-CBM1 P. anserina B2ARG6 CAP66744 PaLPM09D cellulose Cl CBM1

37 PCT/FR2016/051306 Réf. Réf. Spécificité
Sélectivité
Organisme Autres noms de Modularité
Uniprot GenBank connue substrat P. anserina B2ATL7 CAP67740 PaLPM09E cellulose Cl P. anserina B2B403 CAP71839 PaLPM09F cellulose n.d P. anserina B2B5J7 CAP73072 PaLPM09G cellulose n.d P. anserina B2ADG1 CAP64476 PaLPM09H cellulose Cl, 04 T. ABW5645 aurantiacus G3XAP7 1 TaGH61A cellulose Cl AA9 T. terrestris G2RGE5 AE071030 cellulose n.d. AA9 T. reesei Q7Z9M7 AAP57753 cellulose n.d. AA9 T. reesei 014405 CAA71999 CeI61A cellulose n.d. AA9 Bacteria Bacillus amyloliquefa-ciens El UUV3 CBI42985 n.d. n.d. AA10 Burkholderia BURPS1710b pseudomallei 0114 1710b Q3JY22 ABA49030 (BpAA10A) n.d. n.d. AA10 Bacillus licheniformes Q62YN7 AAU22121 chitine Cl AA10 [3-1,4-Caldibacillus man nanase cellulovorans Q9RFX5 AAF22274 (ManA) n.d. n.d. AA10 Enterococcus faecalis Q838S1 AA080225 EfLPM010A chitine Cl AA10 LPMO
(HcAA10-Hahella 2;HCH 00807 chejuensis Q25N53 ABC27701 ) cellulose nd AA10 Serratia marcescens 083009 AAU88202 SmLPM010A chitine Cl AA10 Streptomyces cellulose coelicolor Q9RJC1 CAB61160 ScLPM010B chitine 01,04 AA10 Streptomyces AA10-coelicolor Q9RJY2 CAB61600 ScLPM0100 cellulose Cl CBM2

38 PCT/FR2016/051306 Réf. Réf. Spécificité
Sélectivité
Organisme Uniprot GenBank Autres noms de Modularité
substrat connue Thermobifida cellulose fusca Q47QG3 AAZ55306 TfLPM010A chitine Cl , C4 AA10 Thermobifida AA10-fusca Q47PB9 AAZ55700 TfLPM010B cellulose Cl CBM2 V.
cholerae01 Q9KLD5 AAF96709 VcLPM010B n.d. n.d. AA10

Claims (12)

REVENDICATIONS

1. Procédé pour la fabrication de nanocelluloses à partir d'un substrat cellulosique comprenant des fibres de cellulose, lequel procédé comprend les étapes successives suivantes :
- au moins une étape de traitement enzymatique dudit substrat cellulosique, par la mise en contact avec au moins une enzyme de clivage, puis - au moins une étape de traitement mécanique dudit substrat cellulosique soumis à ladite au moins une étape de traitement enzymatique, pour délaminer lesdites fibres de cellulose et pour obtenir lesdites nanocelluloses, caractérisé en ce que ladite au moins une enzyme de clivage est choisie parmi les enzymes appartenant à la famille des mono-oxygénases lytiques de polysaccharides (LPMOs) aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose en présence d'un donneur d'électron.

2. Procédé pour la fabrication de nanocelluloses selon la revendication 1, caractérisé en ce que les LPMOs sont choisies parmi les enzymes aptes à
réaliser un clivage de la cellulose par oxydation de l'un au moins des atomes de carbone en positions C1, C4 et C6 du cycle de glucose.

3. Procédé pour la fabrication de nanocelluloses selon la revendication 2, caractérisé en ce que les LPMOs sont choisies parmi les familles AA9 et AA10 de la classification CAZy.

4. Procédé pour la fabrication de nanocelluloses selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les LMPOs sont choisies parmi les LPMOs issues de Podospora anserina, de préférence parmi PaLPMO9A (Genbank CAP68375), PaLPMO9B (Genbank CAP73254), PaLPMO9D (Genbank CAP66744) PaLPMO9E
(Genbank CAP67740), PaLPMO9F (Genbank CAP71839), PaLPMO9G (Genbank CAP73072), PaLPMO9H (Genbank CAP61476).

5. Procédé pour la fabrication de nanocelluloses selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le donneur d'électron est choisi parmi l'ascorbate, le gallate, le catéchol, le glutathion réduit, les fragments de lignine et les carbohydrates déshydrogénases fongiques.

6. Procédé pour la fabrication de nanocelluloses selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le substrat cellulosique est obtenu à partir de bois, d'un végétal fibreux riche en cellulose, de betterave, d'agrumes, de plantes annuelles à paille, d'animaux marins, d'algues, de champignons ou de bactéries.

7. Procédé pour la fabrication de nanocelluloses selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le substrat cellulosique est choisi parmi les pâtes papetières chimiques, de préférence les pâtes papetières de bois chimiques, de préférence encore l'une au moins des pâtes papetières suivantes :
- les pâtes blanchies, - les pâtes semi-blanchies, - les pâtes écrues, - les pâtes au bisulfite, - les pâtes au sulfate, - les pâtes à la soude, - les pâtes kraft.

8. Procédé pour la fabrication de nanocelluloses selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que ladite au moins une étape de traitement mécanique comprend l'un au moins des traitements mécaniques suivants :
- un traitement d'homogénéisation, - un traitement de microfluidisation, - un traitement d'abrasion, - un traitement de cryobroyage.

9. Procédé pour la fabrication de nanocelluloses selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que, suite à ladite au moins une étape de traitement mécanique, ledit procédé comprend une étape de post-traitement, par exemple un traitement acide, un traitement enzymatique, une oxydation, une acétylation, une silylation, ou encore une dérivatisation de certains groupements chimiques portés par les nanocelluloses.

10. Procédé pour la fabrication de nanocelluloses selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que les nanocelluloses obtenues consistent en des nanofibrilles de cellulose et/ou en des nanocristaux de cellulose.

11. Nanocelluloses issues d'un procédé de fabrication selon l'une quelconque des revendications 1 à 10.

12. Nanocelluloses selon la revendication 11, caractérisées en ce que lesdits nanocelluloses comportent des cycles de glucose dont au moins un atome de carbone est oxydé en position(s) C1 et/ou C4, voire également C6.