WO2016193617A1 - Procédé pour la fabrication de nanocelluloses à partir d'un substrat cellulosique - Google Patents

Procédé pour la fabrication de nanocelluloses à partir d'un substrat cellulosique Download PDF

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WO2016193617A1
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nanocelluloses
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Bernard Cathala
Ana VILLARES
Jean-Guy BERRIN
Céline MOREAU
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Institut National De La Recherche Agronomique - Inra
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    • D21H25/00—After-treatment of paper not provided for in groups D21H17/00 - D21H23/00
    • D21H25/005—Mechanical treatment

Definitions

  • the present invention relates generally to the field of nanocelluloses, and more particularly to the processes for producing these nanocelluloses from a cellulosic substrate.
  • Cellulose is one of the most important natural polymers, a virtually inexhaustible raw material, and an important source of sustainable materials on an industrial scale.
  • nanocelluloses have been identified with a dimension of the order of a nanometer, referred to as the generic name of "nanocelluloses”.
  • nanocelluloses in particular their mechanical properties, their ability to form films and their viscosity, give them a major interest in many industrial fields.
  • Nanocelluloses are thus used for example as a dispersant or stabilizer additive in the paper, pharmaceutical, cosmetic or agri-food industries. They are also used in the composition of paints and varnishes.
  • Nanocelluloses are also used in many devices requiring control of nanoscale porosity because of their high surface area.
  • nanocomposite materials based on nanocelluloses are currently being developed. Indeed, the remarkable mechanical properties of nanocelluloses, their nanoscale dispersion as well as their hydrophilic nature, give them excellent gas barrier properties. These characteristics are of particular interest for the manufacture of barrier packaging.
  • the nanocelluloses can be classified mainly in two families: cellulose fibrils and cellulose nanocrystals.
  • Cellulose nanocrystals also known as “crystalline nanocelluloses” or NCCs for “nanocrystalline cellulose" are generally obtained by hydrolysis with a strong acid under strictly controlled conditions of temperature, duration and agitation. Such a treatment makes it possible to attack the amorphous regions of the fibers while leaving the crystalline regions, more resistant, intact. The suspension obtained is then washed by successive centrifugations and dialyses in distilled water.
  • NCCs have a length from a few tens of nanometers to about 1 ⁇ (in particular from 40 nm to 1 ⁇ and preferably from 40 nm to 500 nm), and a diameter ranging from 5 to 70 nm, preferably less than at 15 nm (typically 5 to 10 nm).
  • Cellulose fibrils commonly referred to as cellulose microfibrils (also known as microfibrillated cellulose) or cellulose nanofibrils (NFC) are typically isolated from cellulosic by mechanical methods to delaminate the cellulose fibers and release the cellulose fibrils.
  • cellulose microfibrils also known as microfibrillated cellulose
  • NFC cellulose nanofibrils
  • US 4,483,743 discloses a process for producing microfibrillated cellulose, which involves the passage of a liquid suspension of cellulose through a homogenizer type Gaulin high pressure. Repeated passages of the cellulose suspension make it possible to obtain microfibrils typically having a width ranging from 25 to 100 nm and a much longer length.
  • a first pretreatment strategy consists in pretreating the cellulose fibers with cellulases in order to destructure the fiber before the application of the mechanical homogenization treatment.
  • the quality of the nanocelluloses obtained (in particular the state of dispersion and in particular the lateral size of the nanofibrils which conditions the properties of use and the energy yields are very variable.
  • a second pretreatment strategy is based on a chemical oxidation step of the cellulose fibers (for example Saito et al., Biomacromolecules, Vol 8, No. 8, 2007, pp. 2485-2491).
  • the fibers are oxidized with an oxidant such as sodium hypochlorite catalyzed by the 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1 -oxyl ("TEMPO") radical before undergoing the aforementioned mechanical treatment.
  • an oxidant such as sodium hypochlorite catalyzed by the 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1 -oxyl ("TEMPO") radical before undergoing the aforementioned mechanical treatment.
  • the oxidative treatment converts the primary alcohol function at the C 6 position of the glucose unit of the cellulose into a carboxylate function, which leads to the introduction of fillers on the surface of the cellulose fibers. These charges create electrostatic repulsions that facilitate delamination and increase its efficiency.
  • nanocellulose production costs remain high, yields uncertain, and quality and properties are variable.
  • the present invention proposes a process for manufacturing nanocelluloses based on a pretreatment step of cellulose fibers with at least one enzyme belonging to the family of lytic monooxygenases.
  • polysaccharides commonly referred to as "LPMOs” for “Lytic Polysaccharide Monooxygenases”.
  • At least one step of enzymatic treatment of said cellulosic substrate by placing it in contact with at least one cleavage enzyme, and then
  • said at least one cleavage enzyme is selected from enzymes belonging to the family of LPMOs.
  • the LPMOs are capable of ensuring an oxidative cleavage of the cellulose fibers, advantageously glucose cycles of the cellulose fibers, in the presence of an electron donor.
  • LPMOs facilitates the manufacture of nanocellulose through two actions:
  • the cleavage of the cellulosic chains causes fragilities within the fibers, facilitating the mechanical delamination
  • the electron donor may be selected from ascorbate, gallate, cathecol, reduced glutathione, lignin fragments and fungal carbohydrate dehydrogenases (especially glucose dehydrogenases, and cellobiose dehydrogenases).
  • the LPMOs are chosen from enzymes capable of cleaving the cellulose by oxidation of at least one of the carbon atoms in position (s) Ci, C 4 and C 6 of the glucose cycle. More preferably, the LPMOs are chosen from enzymes capable of effecting a cleavage of the cellulose by oxidation of at least one of the carbon atoms in position (s) Ci and / or C 4 , optionally in combination with C 6 , of the glucose cycle.
  • the LPMOs can be selected from the fungal enzyme families AA9 (formerly known as GH61) and bacterial enzymes AA10 (formerly known as CBM33) of the CAZy classification (www.cazy.org).
  • the LPMOs may be chosen from LPMOs derived from Podospora anserina and preferably from PaLPM09A (Genbank CAP68375), PaLPM09B (Genbank CAP73254), PaLPM09D (Genbank CAP66744) PaLPM09E (Genbank CAP67740), PaLPM09F (Genbank CAP71839), PaLPM09G (Genbank CAP73072), and PaLPM09H (Genbank CAP61476)
  • the cellulosic substrate is obtained from wood, a fibrous plant rich in cellulose, beetroot, citrus, annual straw plants, marine animals, seaweeds. , mushrooms or bacteria.
  • the cellulosic substrate is chosen from chemical papermaking pulps, preferably chemical wood pulp, and more preferably at least one of the following papermaking pulps:
  • Said at least one mechanical treatment step generally comprises at least one of the following mechanical treatments:
  • the method may also comprise a post-treatment step, for example an acid treatment, an enzymatic treatment, an oxidation, an acetylation, a silylation, or a derivatisation of certain chemical groups carried by the nanocelluloses.
  • a post-treatment step for example an acid treatment, an enzymatic treatment, an oxidation, an acetylation, a silylation, or a derivatisation of certain chemical groups carried by the nanocelluloses.
  • the invention also relates to nanocelluloses obtained by implementing the method of the invention.
  • the nanocelluloses obtained consist of cellulose nanofibrils and / or of cellulose nanocrystals.
  • the nanocelluloses comprise glucose rings of which at least one carbon atom is oxidized in position (s) Ci and / or C 4 , or even in position C 6 .
  • FIGURES
  • Figure 1 Appearance of cellulose kraft fibers treated with the enzyme PaLPM09H according to different enzyme / substrate ratios and subjected to a weak mechanical treatment with a homogenizer-disperser of the type of Ultra-Turrax and an ultrasonic treatment.
  • Figure 2 Appearance of cellulose kraft fibers treated with the enzyme Pal_PM09H at an enzyme / substrate ratio 1:50 and subjected to a weak mechanical treatment with a homogenizer-disperser of the type of Ultra-Turrax and an ultrasonic treatment.
  • Figure 4 Appearance of cellulose kraft fibers subjected to two successive treatments with the enzyme Pal_PM09H at different enzyme / substrate ratios and then subjected to a weak mechanical treatment with a homogenizer-disperser of the type of Ultra-Turrax and an ultrasonic treatment.
  • Figure 5 Analysis of AFM photos for the enzyme Pal_PM09H, to characterize the height profile (Figure 5A) and the size distribution (Figure 5B) of the nanocelluloses.
  • Key Figure 5A example of a height profile obtained on the surface width (x, ⁇ ) versus height (y, nm); legend Figure 5B: height distribution histogram with height (x, nm) versus number (y).
  • the present invention relates to a method for producing nanocelluloses, in particular cellulose fibrils and / or cellulose nanocrystals, from a cellulosic substrate.
  • Cellulose means a linear homopolysaccharide derived from biomass (including organic matter of plant origin, including algae, cellulose of animal origin and cellulose of bacterial origin) and consisting of units (or cycles ) glucose (D-Anhydroglucopyranose - AGU for "Anhydro glucose unit”) interconnected by ⁇ - (1 -4) glycosidic linkages.
  • the repetition pattern is a dimer of glucose also called cellobiose dimer.
  • AGUs have 3 hydroxyl functions: 2 secondary alcohols (on carbons in positions 2 and 3 of the glucose cycle) and a primary alcohol (on carbon in position 6 of the glucose cycle).
  • these polymers associate with intermolecular links of the hydrogen bonding type, thus conferring a fibrous structure on the cellulose.
  • the combination of cellobiose dimers forms an elemental cellulose nanofibril (whose diameter is about 5 nm).
  • the combination of elementary nanofibrils forms a nanofibril (whose diameter generally varies from 50 to 500 nm).
  • the arrangement of several of these nanofibrils then forms what is generally called a cellulose fiber.
  • nanocellulose refers to the various forms of cellulose having a dimension of the order of one nanometer. This term includes, in particular according to the invention, two families of nanocelluloses: cellulose nanocrystals and cellulose fibrils.
  • cellulose "nanofibrillated cellulose”, “microfibrils (of cellulose)”, “microfibrillated cellulose”, “microfibrillated cellulose”, “cellulose nanofibrils” are synonymous.
  • NFCs cellulose nanofibrils
  • Each cellulose nanofibril contains crystalline portions stabilized by a solid network of inter and intra-chain hydrogen bonds. These crystalline regions are separated by amorphous regions.
  • NCCs cellulose nanocrystals
  • the NCCs advantageously comprise at least 50% of crystalline part, more preferably at least 55% of crystalline part. They generally have a diameter ranging from 5 to 70 nm (preferably less than 15 nm) and a length ranging from 40 nm to approximately 1 ⁇ , preferably ranging from 40 nm to 500 nm.
  • cellulose nanocrystals are synonymous.
  • nanocrystalline cellulose cellulose whiskers
  • microcrystals or “nanocrystal cellulose” are synonymous.
  • NCCs cellulose nanocrystals
  • the nanofibrils, or ribbons, of bacterial cellulose generally have a length of several micrometers and a width ranging from 30 to 60 nm, especially from 45 to 55 nm.
  • the process for producing nanocelluloses according to the invention comprises the following successive steps:
  • One or more, and especially at least two, enzymatic treatment steps can be implemented according to the method of the invention, prior to said at least one mechanical treatment step.
  • at least two enzymatic treatment steps can be implemented successively, prior to said at least one mechanical treatment step.
  • At least one enzymatic treatment step may also be carried out after said at least one mechanical treatment step.
  • the treatment conditions may be identical or different from each other.
  • said at least one enzymatic treatment step may be repeated, as described above, until a complete delamination of the cellulose fibers is obtained.
  • the process of the invention may comprise at least two successive treatment cycles, each treatment cycle comprising at least one step of enzymatic treatment of the cellulosic substrate followed by at least one step of mechanical treatment of said substrate.
  • the combination according to the invention (i) of an enzymatic treatment with at least one LPMO and (ii) a mechanical delamination treatment, makes it possible to obtain nanocelluloses whose structural characteristics and the mechanical properties are quite different from the existing nanocelluloses in the state of the art.
  • the process of the invention makes it possible to obtain nanocelluloses in a simple and reproducible manner.
  • the size and the mechanical properties of these nanocelluloses are homogeneous.
  • the cellulosic substrate can be obtained according to the invention from any biomass material (including organic matter of plant origin, including algae, animal or fungal) comprising cellulosic fibers (ie cellulose fibers). ).
  • biomass material including organic matter of plant origin, including algae, animal or fungal
  • cellulosic fibers ie cellulose fibers.
  • the cellulosic substrate is advantageously obtained from wood (of which cellulose is the main component), but also from any fibrous plant rich in cellulose, such as, for example, cotton, flax, hemp, bamboo, kapok, coconut fiber (coir), ramie, jute, sisal, raffia, papyrus and certain reeds, sugarcane bagasse, beetroot (including beet pulp), citrus fruits, stems maize or sorghum, or annual straw plants.
  • wood of which cellulose is the main component
  • any fibrous plant rich in cellulose such as, for example, cotton, flax, hemp, bamboo, kapok, coconut fiber (coir), ramie, jute, sisal, raffia, papyrus and certain reeds, sugarcane bagasse, beetroot (including beet pulp), citrus fruits, stems maize or sorghum, or annual straw plants.
  • the cellulosic substrates can also be obtained from marine animals (such as tunicate for example), algae (such as for example Valonia or Cladophora) or bacteria for bacterial cellulose (for example bacterial strains of Gluconacetobacter types). .
  • marine animals such as tunicate for example
  • algae such as for example Valonia or Cladophora
  • bacteria for bacterial cellulose for example bacterial strains of Gluconacetobacter types.
  • cellulose from primary walls such as the parenchyma of fruits (for example beetroot, citrus fruits, etc.) or secondary walls, such as wood, will be chosen.
  • the cellulosic substrate advantageously consists of a cellulosic material prepared by chemical or mechanical means, from any cellulosic source as mentioned above (and in particular from wood).
  • the cellulosic substrate is advantageously in the form of a suspension of cellulose fibers in a liquid medium (preferably an aqueous medium), or a cellulose pulp.
  • the cellulose pulps may be packaged in the "dry" state, ie typically in a state of dryness greater than or equal to 80%, especially greater than or equal to 90%.
  • the cellulose pulp can then be redispersed in an aqueous medium by mechanical treatment.
  • the cellulosic substrate contains at least 90%, especially at least 95% and preferably 100% of cellulosic fibers.
  • the cellulosic substrate is suitable for making paper or a cellulosic product.
  • the cellulosic substrate is thus preferably chosen from papermaking pulps (or paper pulp), and in particular chemical pulps.
  • the cellulose pulp may contain, in association with the cellulose fibers, hemicellulose and lignin.
  • the cellulose pulp contains less than 10% and especially less than 5% of lignin and / or hemicellulose.
  • the chemical papermaking pulps contain almost exclusively or exclusively cellulose fibers.
  • the paper pulp may be chosen from at least one of the following paper pulps: blanched pastes, semi-bleached pastes, unbleached pastes, sulphite pastes (unbleached or bleached), sulphate pastes (unbleached or bleached) , pasta with soda (unbleached or blanched) and kraft pasta.
  • dissolving pastes having a low proportion of hemicellulose, preferably less than 10% and in particular less than or equal to 5%.
  • the paper pulps used in a process of the invention are wood pulps, in particular chemical wood pulp.
  • the cellulosic substrate is thus subjected to at least one pretreatment step with at least one cleavage enzyme belonging to the family of lytic monooxygenases of polysaccharides ("Lytic Polysaccharide Ponooxygenases" or LPMO).
  • LPMOs type II copper mononuclear enzymes. They exhibit common structural features, including:
  • the interaction between the LPMO enzyme and the surface of the cellulose occurs via the flat face of the LPMO enzyme and involves interactions with polar aromatic residues.
  • the LPMOs that can be used according to the invention are defined by their capacity to catalyze an oxidative cleavage of the cellulose fibers of the cellulosic substrate, by oxidation of at least one of the carbon atoms in positions Ci, C 4 and
  • the principle of oxidative cleavage achieved by the LPMOs involves the activation of a CH group followed by dioxygen-dependent cleavage (O 2 ), thus producing oligomers oxidized on at least one of the carbon atoms in the C 1, C 4 positions . and C 6 .
  • the LPMO (s) used is capable of catalyzing a cleavage of the cellulose fibers by oxidation of at least one of the carbons selected from the carbon atoms at the C and / or C 4 and / or C 6 positions of a glucose cycle of cellulose. Oxidative cleavage leads to the formation of carboxyl groups on the surface of the cellulose fibers:
  • the LPMO (s) used catalyze cleavage of the cellulose fibers by oxidation of at least one of the carbons chosen from carbon atoms in the C 1 and / or C 4 position of a ring. glucose of the cellulose, optionally in combination with carbon in the C 6 position.
  • LPMOs catalyze the oxidative cleavage of a cellobiose unit in the presence of an external electron donor.
  • This electron donor generally a low molecular weight molecule, is selected from ascorbate, reduced glutathione, gallate, cathecol, lignin fragments, or an enzyme of the carbohydrate dehydrogenase family.
  • the carbohydrate dehydrogenases are chosen from fungal enzymes, in particular cellobiose dehydrogenase (CDHs).
  • CDHs cellobiose dehydrogenase
  • CDHs are monomeric enzymes bearing two prosthetic groups, a heme group b and a flavin adenine dinucleotide. The flavoprotein domain of CDHs catalyzes the two-electron oxidation of cellobiose to lactone using an electron acceptor. This electron acceptor may for example be chosen from dioxygen, quinones and phenoxy radicals or LPMOs.
  • the activity of a CDH enzyme can be determined by following the reduction of the 2,6-dichlorophenol indophenol reagent (DCPIP) in a sodium acetate buffer containing cellobiose (Bey et al., 201 1, Microb Cell Fact. : 1 13).
  • DCPIP 2,6-dichlorophenol indophenol reagent
  • an LPMO enzyme is used for which cellulolytic activity (i.e., catalyzing the oxidative cleavage of cellulose) has been identified.
  • cellulolytic activity i.e., catalyzing the oxidative cleavage of cellulose
  • the oxidative cleavage activity of LPMOs on a cellulosic substrate can be tested in cleavage assays as described in the Example portion of the present application.
  • the LPMOs used in the invention are advantageously chosen from the enzymes known as "auxiliary activity” (or “Auxiliary Activity” - AA) according to the classification established in the CAZy database, relative to carbohydrate-active enzymes (CAZy - Carbohydrate Active enZyme database - http://www.cazy.org/ - See also Levasseur et al., Biotechnology for Biofuels 2013, 6:41).
  • the enzymatic treatment step is carried out with at least one enzyme chosen from the LPMOs enzymes of the so-called AA9, AA10, AA1 1 and AA13 families, according to the classification established in the CAZy database.
  • the LPMO enzyme according to the invention may contain a carbohydrate binding module (CBM1), which is specific for CBM1 type cellulose according to the CAZy classification.
  • CBM1 carbohydrate binding module
  • the enzymes listed in the present application are identified by references Genbank (identifying a genetic sequence) and Uniprot when the latter is available (identifying a protein sequence - see Table 1). By default, the reference indicated in parentheses for each enzyme corresponds to the reference "Genbank”.
  • At least one enzyme of the AA9 family and / or at least one enzyme of the AA10 family of the CAZy classification is used (advantageously exclusively).
  • the enzymes of the AA9 family listed in Table 1 below, are fungal enzymes widely distributed in the genome of most ascomycetes and some basidiomycetes (fungi).
  • the enzymes of the AA9 family were initially classified in the family of glycoside hydrolases 61 (GH61) of the CAZy classification. Specific analyzes have since shown that the endoglucanase activity of AA9 enzymes was low or non-existent (Morgenstern I et al., Briefings in Functional Genomics vol.3 (6P): 471-481).
  • LPMOs whose endoglucanase activity is insignificant or non-existent are used.
  • the copper ion of LPMOs of the AA9 family is bound to the protein according to a hexacoordination model involving at least 2 conserved histidine residues and water molecules.
  • the enzymes of the AA9 family catalyze an oxidative cleavage of the cellobiose unit on the carbon in the C 1 and / or C 4 position, preferably on the C 1 or C 4 carbon.
  • Some enzymes T. aurantiacus TaGH6 ⁇ ⁇ A (G3XAP7) and Podospora anserina PaGH61 B (B2AVF1) could catalyze an oxidative cleavage of cellobiose on a C 6 carbon.
  • the LPMOs of the AA9 family expressed in fungi generally exhibit a post-translational modification consisting of a methylation of N-terminal histidine residue.
  • LPMOs of the AA9 family comprising at least one CBM1 or CBM18 (CBM for "carbohydrate binding module”) domain are used in the N-terminal position.
  • CBM carboxymethyl methacrylate
  • These enzymes then comprise a flat surface formed of several polar aromatic residues forming a CBM1 or CBM1 type domain.
  • said at least one LPMO of the AA9 family is derived from Podospora anserina and / or Neurospora crassa.
  • the enzymes of the AA9 family from Podospora anserina are typically selected from the group consisting of PaLPM09A (CAP68375), PaLPM09B (CAP73254), PaLPM09D (CAP66744), PaLPM09E (CAP67740), PaLPM09F (CAP71 839), PaLPM09G (CAP73072), PaLPM09H (CAP61476).
  • the enzymes PaLPM09E (CAP67740) and / or PaLPM09H (CAP61476) are used.
  • the AA9 family of enzymes derived from Neurospora crassa are typically selected from the group consisting of A / cLPMO9C (EAA36362), A / cLPM09D (EAA32426 / CAD21 296), A / cLPM09E (EAA26873), A / cLPM09F (EAA26656 / CAD70347).
  • a / cLPMO9M (EAA331 78), A / c00836 (EAA34466), A / c02040 (EAA30263), A / c07760 (EAA2901 8).
  • the enzymes of the AA10 family were formerly classified in the CBM33 family (or "carbohydrate binding module family 33") of the CAZy classification.
  • the AA10 family of LPMOs currently comprises more than a thousand enzymes, identified particularly in bacteria, but also in some eukaryotes as well as in a few viruses.
  • the LPMOs of the AA10 family have a structure similar to that of the AA9 family of enzymes and in particular at least one N-terminal tyrosine residue which is involved in the binding with the copper ion. However, in most LPMOs of the AA10 family, one of the other tyrosine residues involved in the axial bonding of the copper ion is replaced by a phenylalanine residue. For these enzymes, oxidative activity has been demonstrated on chitin and cellulose.
  • the enzymes of the AA10 family are multimodular and include a CBM domain in the N-terminal position. These domains are typically CBM2, CBM5, CBM1 0, CBM12 domains as well as fibronectin type I I I.
  • the AA1 family is characterized by enzymes that perform a C1 cleavage cleavage on chitin.
  • the enzyme Aspergillus oryzae will preferably be selected (see also Hemsworth et al., Nature Chemical Biology 2014 (10): 1 22-1 26 - Discovery and characterization of a new family of lytic polysaccharide monooxygenases).
  • the AA1 3 family is characterized by enzymes that cleave oxidative reaction on starch.
  • the Aspergillus nidulans enzyme (Lo Leggio et al., Nat. Commun. 2015 (22) 6: 5961 -Structure and boosting activity of a starch-degrading lytic polysaccharide monooxygenase) will preferably be selected.
  • the enzymatic treatment step is carried out using at least one LPMO enzyme listed in Table 2 below.
  • said at least one enzyme of the family of LPMOs is used in combination with at least one cellulase.
  • the cellulase is advantageously chosen from at least one endoglucanase (for example an endoglucanase) and / or at least one carbohydrate dehydrogenase (advantageously a cellobiose dehydrogenase (CDHs)).
  • Carbohydrate dehydrogenases can act as electron donors for LPMOs.
  • said at least one LPMO enzyme used is advantageously purified from a culture supernatant of a fungus and / or produced in a heterologous system, in particular in a bacterium, a fungus or a yeast, for example in the yeast Pichia pastoris.
  • Said at least one LPMO enzyme is mixed with the cellulosic substrate, so as to allow contact between said at least one enzyme and the cellulose fibers.
  • the enzymatic treatment step is preferably carried out with gentle stirring, so as to ensure good dispersion of the enzymes within the fibers.
  • This enzymatic treatment step is for example carried out for a period ranging from 24 to 72 hours (preferably 48 hours).
  • the enzymatic treatment step is carried out at a temperature ranging from 30 to 45 ° C.
  • said at least one LPMO enzyme can be added to the cellulosic substrate in an enzyme / cellulose ratio (or ratio) ranging from 1: 1000 to 1: 50, in particular from 1: 500 to 1: 50 or 1: 1. 00 to 1:50 or 1: 1,000 to 1: 500, 1: 500 to 1: 1 00.
  • said at least one LPMO enzyme is used at a concentration ranging from 0.001 to 10 g / l, in particular from 0.1 to 5 g / l, and more preferably from 0.5 to 5 g / l.
  • the cellulosic substrate is subjected to at least two (or only two) successive enzymatic treatment steps (in series, advantageously separated by a rinsing step).
  • the LPMO or LPMOs implemented during each of these enzymatic treatment steps are identical or different; the conditions (in particular the ratio enzyme / substrate) are identical or different between these successive steps.
  • the Examples demonstrate that the fibers are fully destructured, including at low enzyme / cellulose ratios.
  • the pretreated cellulosic substrate is then subjected to at least one mechanical treatment step which is intended to delaminate the cellulose fibers to obtain the nanocelluloses.
  • Delamination also called “fibrillation” or “defibrillation” consists in separating, by a mechanical phenomenon, the cellulose fibers into nanocelluloses.
  • the oxidative cleavage of the cellulose fibers catalyzed by the at least one LPMO facilitates the delamination of these cellulose fibers during the mechanical treatment step.
  • This mechanical delamination step of the cellulose fibers can then be carried out under less stringent conditions and therefore less expensive in terms of energy.
  • the use of LPMOs according to the invention makes it possible to introduce into the cellulose fibers charged groups inducing electrostatic repulsions, without contamination with treatment reagents, as when using TEMPO reagents.
  • a mechanical treatment may be chosen from mechanical treatments for homogenization, microfluidization, abrasion, or cryomilling.
  • the homogenization treatment involves the passage of the pretreated cellulosic substrate, typically a cellulose pulp or a liquid suspension of cellulose, through a narrow space under high pressure (as described for example in US Pat. No. 4,486,743).
  • the pretreated cellulosic substrate typically a cellulose pulp or a liquid suspension of cellulose
  • This homogenization treatment is preferably carried out using a Gaulin type homogenizer.
  • the pretreated cellulosic substrate typically in the form of a cellulose suspension
  • the pretreated cellulosic substrate is pumped at high pressure and dispensed through a small orifice automatic valve.
  • a rapid succession of valve openings and closures subject the fibers to a large pressure drop (typically at least 20 MPa) and high speed shear action followed by high velocity deceleration impact.
  • the passage of the substrate into the orifice is repeated (generally 8 to 10 times) until the cellulose suspension becomes stable.
  • the cooling water is generally used.
  • This homogenization treatment can also be implemented using a device of microfluidizer type (see for example Sisqueira et al., Polymer 2010 2 (4): 728-65).
  • a device of microfluidizer type see for example Sisqueira et al., Polymer 2010 2 (4): 728-65.
  • the cellulose suspension passes through a thin chamber typically shaped "z" (whose channel dimensions are generally between 200 and 400 ⁇ ) under high pressure (about 2070 bar).
  • the high shear rate that is applied generally greater than 10 7 % -1 ) makes it possible to obtain very fine nanofibrils
  • a variable number of passages for example from 2 to 30, in particular from 10 to 30 or from 5 to 25, and in particular 5 to 20
  • chambers of different sizes can be used, to increase the degree of fibrillation.
  • the abrasion or grinding treatment (see for example Iwamoto Set et al., 2007 Applied Physics A89 (2): 461-66) is based on the use of a grinding device capable of exerting shear forces provided by grinding stones.
  • the pretreated cellulosic substrate generally in the form of a cellulose pulp, is passed between a static grinding stone and a rotating grinding stone, typically at a rate in the order of 1500 rotations per minute (rpm). Several passes (usually between 2 and 5) may be necessary to obtain nano-sized fibrils.
  • a mixer-type device (for example as described in Unetani K et al., Biomacromolecules 201 1, 12 (2), pp.348-53) can also be used to produce microfibrils from the pretreated cellulosic substrate, for example from a suspension of wood fibers.
  • cryomilling (or cryoconcassage) treatment (Dufresne et al., 1997, Journal of Applied Polymer Science, 64 (6): 1185-94) consists in grinding a suspension of pretreated cellulosic substrate previously frozen with liquid nitrogen. The ice crystals formed inside the cells detonate the cell membranes and release fragments of walls. These processes are generally used for the production of cellulose microfibrils from products, or residues, of agriculture. Etaoe (s) of post-treatment of the cellulosic substrate
  • the manufacturing method comprises at least one post-treatment step of the cellulosic substrate, carried out after said substrate has been subjected to mechanical treatment.
  • said at least one post-treatment step aims to increase the degree of fibrillation of the obtained nanocelluloses and / or to confer on said nanocelluloses new mechanical properties, depending on the applications envisaged.
  • Said at least one post-treatment step can in particular be chosen from an acid treatment, an enzymatic treatment, an oxidation, an acetylation, a silylation, or a derivatization of certain chemical groups carried by the microfibrils.
  • the process according to the invention thus makes it possible to obtain nanocelluloses, in particular cellulose nanocrystals and / or cellulose nanofibrils.
  • the nanocelluloses obtained by the process of the invention are devoid of residues of oxidation reagents (ie for example sodium bromide, sodium hypochlorite, sodium chlorite, the radical (2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-yl) oxyl (TEMPO), derivatives or the like).
  • oxidation reagents ie for example sodium bromide, sodium hypochlorite, sodium chlorite, the radical (2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-yl) oxyl (TEMPO), derivatives or the like.
  • the nanocelluloses comprise at least one glucose cycle (typically several glucose cycles) of which at least one of the carbon atoms in positions Ci and / or C 4 , or even also C 6 , is oxidized by an oxidative cleavage phenomenon.
  • glucose cycle typically several glucose cycles
  • the nanocelluloses according to the invention thus comprise glucose cycles which are:
  • glucose rings oxidized on the atoms in positions Ci and / or C 4 , may further comprise an oxidized carbon atom in position C 6 .
  • oxidized carbon atom is meant in particular a carbon atom which has a carbonyl function, and advantageously also a carboxyl function.
  • the nanocelluloses according to the invention are thus advantageously negatively charged, because of the presence of various surface functions, including carboxylate functions on the carbons at the Ci and / or C 4 positions (unlike the TEMPO process which leads to a specific oxidation of the carbon in position C 6 ).
  • Cellulose cleavage tests with an LPMO enzyme can be carried out according to the following protocol:
  • the cleavage test is performed in a volume of 300 ⁇ of liquid containing 4.4 ⁇ of LPMO enzyme and 1 mM of ascorbate and 0.1% (weight / volume) of cellulose powder swollen with phosphoric acid ( PASC phosphoric acid-swoller cellulose - prepared as described in Wood TM, Methods Enzym 1988, 160: 19-25) in 50 mM sodium acetate buffer at pH 4.8 or 5 ⁇ l cello-oligosaccharides (Megazyme, Wicklow) , Ireland) in 10 mM sodium acetate buffer at pH 4.8.
  • the enzymatic reaction is carried out in a 2 ml tube incubated in a thermomixer (Eppendorf, Montesson, France) at 50 ° C. and 580 rpm (rotation per minute).
  • the sample After 16 hours of incubation, the sample is heated at 100 ° C. for 10 minutes in order to stop the enzymatic reaction, and then centrifuged at 16,000 rpm for 15 minutes at 4 ° C. in order to separate the solution fraction. of the remaining insoluble fraction.
  • the cleaved products obtained can be analyzed by ion exchange chromatography and / or by mass spectrometry (MALDI-TOF).
  • the fibers are contacted with enzymes (at a concentration of 1 g / L and in enzyme / cellulose ratios of 1:50, 1: 100, 1: 500 and 1: 1000) and ascorbate (2 mM). then subjected to gentle stirring for 48 hours at 40 ° C.
  • the treated fibers are then subjected to mechanical action with a homogenizer-disperser (Ultra-Turrax power 500 W, maximum speed for 3 minutes), followed by sonication for 3 minutes.
  • a homogenizer-disperser Ultra-Turrax power 500 W, maximum speed for 3 minutes
  • the dispersions were then analyzed by TEM (Transmission Electron Microscopy) and AFM (Atomic Force Microscopy).
  • FIGS. 2C, 2D, 3C and 3D demonstrate indisputably that nanocelluloses are obtained.
  • the fibers having undergone a first treatment with the LPMO enzyme are again subjected to a second successive treatment with an LPMO enzyme under the conditions described above, followed by the mechanical treatment, the fibers are completely destructured, including the enzyme / cellulose ratios. low (ie the ratios 1/500 and 1/1000) ( Figure 4).
  • the AFM photos for the enzyme PaLPM09H were analyzed by the WSxM software to characterize the height profile (Figure 5A) and the size distribution (Figure 5B) of the nanocelluloses.
  • thermophilum CT2 partial (Cbh61 -2) (fragment) thermophilum CT2
  • thermophilum CT2 partial (Cbh61 -3) (fragment) thermophilum CT2
  • thermophilum CT2 partial (Cbh61 -4) (fragment) thermophilum CT2
  • thermophila ATCC (active on cellulose) (MYCTH_92668) thermophila ATCC
  • Cel61 Phanerochaete AAM22493.1 Q8NJI9 chrysosporium BKM-F-1767
  • Pa_5_4100 fragment
  • Pa_5_1 1630 fragment
  • Pa_1_21900 fragment) Podospora anserina CAP67176.1 B2AS05
  • Pa_1_22040 Podospora anserina CAP67190.1 B2AS19
  • Pa_1_22150 fragment
  • Pa_6_1 1470 Podospora anserina CAP67493.1 B2ASX0
  • GH61 B cellulase-enhancing factor Thielavia terrestris ACE10231 .1
  • LPMOs (families AA9, AA10 and AA11 of CAZy classification).
  • substrate specificity is meant the type of cleaved substrate (oxidative cleavage) by the corresponding LPMO enzyme.
  • selectivity is meant the carbon of the glucose cycle oxidized by the corresponding LPMO enzyme.
  • Modularity is meant the CAZy class (AA9, 10 or 1 1) of the enzyme and the known presence of a conserved domain (CBM or X278).

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Abstract

Procédé pour la fabrication de nanocelluloses à partir d'un substrat cellulosique ABREGE DESCRIPTIF L'invention concerne un procédé pour la fabrication de nanocelluloses à partir d'un substrat cellulosique comprenant des fibres de cellulose, lequel procédé comprend les étapes successives suivantes : - une étape de traitement enzymatique dudit substrat cellulosique, par la mise en contact avec au moins une enzyme de clivage, puis - une étape de traitement mécanique dudit substrat cellulosique soumis à ladite étape de traitement enzymatique, pour délaminer lesdites fibres de cellulose et obtenir lesdites nanocelluloses, caractérisé en ce que ladite au moins une enzyme de clivage est choisie parmi les enzymes appartenant à la famille des mono-oxygénases lytiques de polysaccharides (LPMOs) aptes à assurer le clivage en présence d'un donneur d'électron. L'invention se rapporte également aux nanocelluloses obtenues selon ce procédé. Pas de figure

Description

Procédé pour la fabrication de nanocelluloses à partir d'un substrat cellulosique
DOMAINE TECHNIQUE AUQUEL SE RAPPORTE L'INVENTION La présente invention concerne de manière générale le domaine des nanocelluloses, et plus particulièrement les procédés pour la fabrication de ces nanocelluloses à partir d'un substrat cellulosique.
ARRI ERE-PLAN TECHNOLOGIQUE
La cellulose est un des polymères naturels les plus importants, une matière première quasi inépuisable, et une source importante de matériaux durables à l'échelle industrielle.
A ce jour, différentes formes de cellulose ont été identifiées avec une dimension de l'ordre du nanomètre, désignées sous le nom générique de « nanocelluloses ».
Les propriétés de ces nanocelluloses, notamment leurs propriétés mécaniques, leur capacité à former des films et leur viscosité, leur confèrent un intérêt majeur dans de nombreux domaines industriels.
Les nanocelluloses sont ainsi utilisées par exemple en tant qu'additif dispersant ou stabilisant dans les industries papetière, pharmaceutique, cosmétique ou agroalimentaire. Elles entrent également dans la composition de peintures et de vernis.
Les nanocelluloses sont également employées dans de nombreux dispositifs nécessitant un contrôle de la porosité nanométrique, en raison de leur surface spécifique élevée.
Enfin, de nombreux matériaux nanocomposites à base de nanocelluloses sont actuellement développés. En effet, les propriétés mécaniques remarquables des nanocelluloses, leur dispersion à l'échelle nanométrique ainsi que leur caractère hydrophile, leur confèrent des propriétés barrières au gaz excellentes. Ces caractéristiques suscitent notamment un intérêt important pour la fabrication d'emballages barrières.
Sur la base de leurs dimensions, fonctions et méthodes de préparation, qui elles-mêmes dépendent principalement de la source cellulosique et des conditions de traitement, les nanocelluloses peuvent être classées principalement dans deux familles : les fibrilles de cellulose et les nanocristaux de cellulose.
Les nanocristaux de cellulose (dits encore « nanocelluloses cristallines » ou NCCs pour « nanocrystalline cellulose ») sont en général obtenus par une hydrolyse avec un acide fort dans des conditions strictement contrôlées de température, de durée et d'agitation. Un tel traitement permet d'attaquer les régions amorphes des fibres tout en laissant les régions cristallines, plus résistantes, intactes. La suspension obtenue est ensuite lavée par des centrifugations et des dialyses successives dans l'eau distillée. Les NCCs les plus classiquement obtenus ont une longueur de quelques dizaines de nanomètres à environ 1 μηι (notamment de 40 nm à 1 μηι et de préférence de 40 nm à 500 nm), et un diamètre allant de 5 à 70 nm, de préférence inférieur à 15 nm (typiquement de 5 à 10 nm).
Les fibrilles de cellulose, couramment désignées microfibrilles de cellulose (dites encore « cellulose microfibrillée » ou MFC pour « microfibrillated cellulose ») ou nanofibrilles de cellulose (NFC pour « nanofibrillated cellulose ») sont typiquement isolées à partir de matériaux cellulosiques issus de la biomasse, par des procédés mécaniques permettant de délaminer les fibres de cellulose et de libérer les fibrilles de cellulose.
Par exemple, le document US 4 483 743 décrit un procédé de fabrication de cellulose microfibrillée, qui implique le passage d'une suspension liquide de cellulose au travers d'un homogénéiseur type Gaulin à haute pression. Des passages répétés de la suspension de cellulose permettent d'obtenir des microfibrilles ayant typiquement une largeur allant de 25 à 100 nm et une longueur bien plus importante.
De manière générale, les procédés mécaniques d'obtention de fibrilles de cellulose ont l'inconvénient de consommer d'importantes quantités d'énergie. A titre d'exemple, il a été évalué que l'utilisation d'un homogénéiseur entraîne une consommation d'énergie de l'ordre de 70000 kWh/t. Cette consommation énergétique importante, et en corollaire les coûts élevés de la production de nanocelluloses, restent donc un frein considérable à leur développement industriel.
Différentes stratégies de prétraitements des fibres de cellulose ont ainsi été développées afin de réduire la consommation d'énergie requise pour leur délamination mécanique.
Une première stratégie de prétraitement, décrite par exemple dans la demande WO 2007/091942, consiste à prétraiter les fibres de cellulose par des cellulases de manière à déstructurer la fibre avant l'application du traitement mécanique par homogénéisation.
Cependant, ce prétraitement enzymatique est extrêmement versatile en fonction de l'état de la fibre et notamment en fonction de l'histoire thermochimique préalable de la fibre.
De plus, la qualité des nanocelluloses obtenues (en particulier l'état de dispersion et notamment la taille latérale des nanofibrilles qui conditionne les propriétés d'usage et les rendements énergétiques sont très variables.
Une seconde stratégie de prétraitement s'appuie sur une étape chimique d'oxydation des fibres de cellulose (par exemple Saito et al., Biomacromolecules, Vol. 8, No. 8, 2007, pp. 2485-2491 ).
Typiquement, les fibres sont oxydées avec un oxydant tel que hypochlorite de sodium catalysé par le radical 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1 -oxyl (« TEMPO ») avant de subir le traitement mécanique précité.
Le traitement oxydatif convertit la fonction alcool primaire en position C6 de l'unité de glucose de la cellulose en une fonction carboxylate, ce qui conduit à l'introduction de charges à la surface des fibres de cellulose. Ces charges créent des répulsions électrostatiques qui facilitent la délamination et qui augmentent son efficacité.
Toutefois, l'élimination des produits de réaction conduit à de grandes quantités d'effluents fortement pollués. En outre, des résidus de réactifs persistent au sein du produit final et continuent à réagir, altérant in fine les propriétés des nanocelluloses.
Ainsi, malgré les nouvelles stratégies de prétraitement développées, les coûts de production des nanocelluloses restent élevés, les rendements incertains, et la qualité et les propriétés sont variables.
II reste donc nécessaire de proposer de nouveaux procédés pour obtenir des nanocelluloses, avec une moindre consommation énergétique et de façon simple et reproductible, selon une voie peu ou pas toxique.
OBJET DE L'INVENTION
Afin de remédier aux inconvénients précités de l'état de la technique, la présente invention propose un procédé de fabrication de nanocelluloses s'appuyant sur une étape de prétraitement de fibres de cellulose avec au moins une enzyme appartenant à la famille des mono-oxygénases lytiques de polysaccharides, couramment désignés « LPMOs » pour « Lytic Polysaccharide MonoOxygenases ».
Plus particulièrement, on propose selon l'invention un procédé pour la fabrication de nanocelluloses à partir d'un substrat cellulosique comprenant des fibres de cellulose,
lequel procédé comprend les étapes successives suivantes :
- au moins une étape de traitement enzymatique dudit substrat cellulosique, par la mise en contact avec au moins une enzyme de clivage, puis
- au moins une étape de traitement mécanique dudit substrat cellulosique soumis à ladite au moins une étape de traitement enzymatique, pour délaminer les fibres de cellulose et pour obtenir lesdites nanocelluloses,
caractérisé en ce que ladite au moins une enzyme de clivage est choisie parmi les enzymes appartenant à la famille des LPMOs.
Typiquement, les LPMOs sont aptes à assurer un clivage oxydatif des fibres de cellulose, avantageusement des cycles de glucose des fibres de cellulose, en présence d'un donneur d'électron.
Sans être limité par une quelconque théorie, l'action des LPMOs facilite la fabrication de nanocellulose à travers deux actions :
- le clivage des chaînes cellulosiques provoque des fragilités au sein des fibres, facilitant la délamination mécanique,
- la formation de produits d'oxydation permet d'introduire des fonctions chimiques chargées sur la surface des fibres en induisant des répulsions électrostatiques.
Encore sans être limité par une quelconque théorie, ces modifications structurales combinées ont pour conséquence de favoriser la séparation des fibres jusqu'à dispersion nanométrique et de former des nanocelluloses (fibrilles ou nanocristaux) possédant des fonctionnalités nouvelles (taux de charges, fonctions chimiques actuellement non disponibles).
D'autres caractéristiques non limitatives et avantageuses du procédé de fabrication conforme à l'invention, prises individuellement ou selon toutes les combinaisons techniquement possibles, sont également décrites ci-après ainsi que dans la description détaillée de l'invention.
Le donneur d'électron peut être choisi parmi l'ascorbate, le gallate, le cathécol, le glutathion réduit, les fragments de lignine et les carbohydrates déshydrogénases fongiques (notamment les glucoses déshydrogénases, et les cellobiose déshydrogénases).
De préférence, les LPMOs sont choisies parmi les enzymes aptes à réaliser un clivage de la cellulose par oxydation de l'un au moins des atomes de carbone en position(s) Ci , C4 et C6 du cycle de glucose. De préférence encore, les LPMOs sont choisies parmi les enzymes aptes à réaliser un clivage de la cellulose par oxydation de l'un au moins des atomes de carbone en position(s) Ci et/ou C4, éventuellement en combinaison avec C6, du cycle de glucose.
Les LPMOs peuvent être choisies parmi les familles d'enzymes fongiques AA9 (anciennement dénommées GH61 ) et d'enzymes bactériennes AA10 (anciennement dénommées CBM33) de la classification CAZy (www.cazy.org). Notamment, les LPMOs peuvent être choisies parmi les LPMOs issues de Podospora anserina et de préférence parmi PaLPM09A (Genbank CAP68375), PaLPM09B (Genbank CAP73254), PaLPM09D (Genbank CAP66744) PaLPM09E (Genbank CAP67740), PaLPM09F (Genbank CAP71839), PaLPM09G (Genbank CAP73072), et PaLPM09H (Genbank CAP61476)
Suivant les modes de réalisation de l'invention, le substrat cellulosique est obtenu à partir de bois, d'un végétal fibreux riche en cellulose, de betterave, d'agrumes, de plantes annuelles à paille, d'animaux marins, d'algues, de champignons ou de bactéries.
De préférence, le substrat cellulosique est choisi parmi les pâtes papetières chimiques, de préférence les pâtes papetières de bois chimiques, de préférence encore l'une au moins des pâtes papetières suivantes :
- les pâtes blanchies,
- les pâtes semi-blanchies,
- les pâtes écrues,
- les pâtes au bisulfite,
- les pâtes au sulfate,
- les pâtes à la soude,
- les pâtes kraft.
Ladite au moins une étape de traitement mécanique comprend généralement l'un au moins des traitements mécaniques suivants :
- un traitement d'homogénéisation,
- un traitement de microfluidisation,
- un traitement d'abrasion,
- un traitement de cryobroyage.
Le procédé peut également comprendre une étape de post-traitement, par exemple un traitement acide, un traitement enzymatique, une oxydation, une acétylation, une silylation, ou encore une dérivatisation de certains groupements chimiques portés par les nanocelluloses.
L'invention se rapporte également aux nanocelluloses obtenues par la mise en œuvre du procédé de l'invention.
Typiquement, les nanocelluloses obtenues consistent en des nanofibrilles de cellulose et/ou en des nanocristaux de cellulose.
De préférence, les nanocelluloses comportent des cycles de glucose dont au moins un atome de carbone est oxydé en position(s) Ci et/ou C4, voire également en position C6. FIGURES
Figure 1 : Aspect des fibres kraft de cellulose traitées avec l'enzyme PaLPM09H selon différents ratios enzyme/substrat et soumises à un traitement mécanique faible avec un homogénéiseur-disperseur du type d'Ultra-Turrax et un traitement ultrasons. Images en microscopie optique des fibres non traitées (témoin) avec l'enzyme (A) ou traitées avec des ratios enzyme/substrat de 1 :50 (B); 1 :100 (C); et 1 : 500 (D).
Figure 2 : Aspect des fibres kraft de cellulose traitées avec l'enzyme Pal_PM09H à un ratio enzyme/substrat 1 :50 et soumises à un traitement mécanique faible avec un homogénéiseur-disperseur du type d'Ultra-Turrax et un traitement ultrasons. Images en microscopie optique des fibres témoins (A) et des fibres traitées (B), et visualisation des nanofibrilles obtenues par microcopie électronique à transmission (C) et microscopie de force atomique (D).
Figure 3 : Aspect des fibres kraft de cellulose traitées avec les enzymes Pal_PM09H et Pal_PM09E selon un ratio enzyme/substrat de 1 :50 puis soumises à un traitement mécanique faible avec un homogénéiseur-disperseur du type d'Ultra-Turrax et un traitement ultrasons. Images en microscopie optique des fibres kraft traitées avec Pal_PM09H (A) et avec Pal_PM09E (B). Visualisation par microscopie de force atomique des nanofibrilles obtenues à partir des fibres kraft par traitement avec les enzymes LPMOs Pal_PM09H (C) et Pal_PM09E (D).
Figure 4 : Aspect des fibres kraft de cellulose soumises à deux traitements successifs avec l'enzyme Pal_PM09H à différents ratios enzyme/substrat puis soumises à un traitement mécanique faible avec un homogénéiseur-disperseur du type d'Ultra-Turrax et un traitement ultrasons. Images en microscopie optique des fibres traitées selon les ratios enzyme/substrat de 1 :50 (A); 1 :100 (B); 1 : 500 (C) et 1 :1000 (D).
Figure 5 : Analyse des photos AFM pour l'enzyme Pal_PM09H, pour caractériser le profil des hauteurs (Figure 5A) et la distribution en taille (Figure 5B) des nanocelluloses. Légende Figure 5A : exemple d'un profil de hauteur obtenu sur la surface largeur (x, μηι) versus hauteur (y, nm); légende Figure 5B : histogramme de distribution des hauteurs avec hauteur (x, nm) versus nombre (y).
DESCRIPTION DÉTAILLÉE
La description qui va suivre, en combinaison avec les Résultats Expérimentaux donnés à titre d'exemples non limitatifs, fera bien comprendre en quoi consiste l'invention et comment elle peut être réalisée.
Définitions générales
La présente invention concerne un procédé pour la fabrication de nanocelluloses, en particulier de fibrilles de cellulose et/ou de nanocristaux de cellulose, à partir d'un substrat cellulosique.
Par « cellulose », on entend un homopolysaccharide linéaire issu de la biomasse (englobant les matières organiques d'origine végétale, algues incluses, la cellulose d'origine animale ainsi que la cellulose d'origine bactérienne) et constitué d'unités (ou cycles) de glucose (D-Anhydroglucopyranose - AGU pour « Anhydro glucose unit ») reliées entre elles par des liaisons glycosidiques β-(1 -4). Le motif de répétition est un dimère de glucose également appelé dimère de cellobiose.
Les AGU possèdent 3 fonctions hydroxyles : 2 alcools secondaires (sur les carbones en positions 2 et 3 du cycle de glucose) et un alcool primaire (sur le carbone en position 6 du cycle de glucose).
Ces polymères s'associent par des liaisons intermoléculaires de type liaison hydrogène, conférant ainsi une structure fibreuse à la cellulose. En particulier, l'association des dimères de cellobiose forme une nanofibrille élémentaire de cellulose (dont le diamètre est d'environ 5 nm). L'association de nanofibrilles élémentaires forme une nanofibrille (dont le diamètre varie généralement de 50 à 500 nm). L'agencement de plusieurs de ces nanofibrilles forme ensuite ce qui est généralement appelé une fibre de cellulose.
Le terme « nanocelluloses » désigne les différentes formes de cellulose ayant une dimension de l'ordre du nanomètre. Ce terme englobe en particulier selon l'invention, deux familles de nanocelluloses : les nanocristaux de cellulose et les fibrilles de cellulose.
Les termes « fibrilles de cellulose », « nanofibrilles (de cellulose) », « nanofibres
(de cellulose) », « cellulose nanofibrillée », « microfibrilles (de cellulose) », « cellulose microfibrillée », « microfibrillated cellulose », « cellulose nanofibrils » sont synonymes.
Dans la suite de la présente demande, le terme « nanofibrilles de cellulose » (NFCs) sera utilisé de manière générique.
Chaque nanofibrille de cellulose contient des parties cristallines stabilisées par un solide réseau de liaisons hydrogènes inter- et intra-chaines. Ces régions cristallines sont séparées par des régions amorphes.
L'élimination des parties amorphes des nanofibrilles de cellulose, permet d'obtenir des nanocristaux de cellulose (NCCs).
Les NCCs comportent avantageusement au moins 50% de partie cristalline, de préférence encore au moins 55% de partie cristalline. Ils ont généralement un diamètre allant de 5 à 70 nm (de préférence inférieur à 15 nm) et une longueur allant de 40 nm à environ 1 μηι, de préférence allant de 40 nm à 500 nm.
Les termes « nanocristaux de cellulose », « cellulose nanocristalline », « cellulose whiskers », « microcristaux » ou « cellulose nanocrystal » sont synonymes.
Dans la suite de la présente demande, le terme « nanocristaux de cellulose » (NCCs) sera utilisé de manière générique.
Dans le cas de la cellulose bactérienne, les nanofibrilles, ou rubans, de cellulose bactérienne ont généralement une longueur de plusieurs micromètres et une largeur allant de 30 à 60 nm, notamment de 45 à 55 nm. Procédé selon l'invention
Le procédé pour la fabrication de nanocelluloses, selon l'invention, comprend les étapes successives suivantes :
- au moins une étape de traitement enzymatique d'un substrat cellulosique comprenant des fibres de cellulose, par sa mise en contact avec au moins une enzyme de clivage appartenant à la famille des mono-oxygénases lytiques de polysaccharides (LPMOs), puis
- au moins une étape de traitement mécanique dudit substrat cellulosique soumis à ladite au moins une étape de traitement enzymatique, pour délaminer lesdites fibres de cellulose et pour obtenir lesdites nanocelluloses.
Une ou plusieurs, et notamment au moins deux, étapes de traitement enzymatique peuvent être mises en œuvre selon le procédé de l'invention, préalablement à ladite au moins une étape de traitement mécanique. Par exemple, au moins deux étapes de traitement enzymatique peuvent être mises en œuvre successivement, préalablement à ladite au moins une étape de traitement mécanique.
Au moins une étape de traitement enzymatique peut également être mise en œuvre après ladite au moins une étape de traitement mécanique.
Lorsque plusieurs étapes de traitement enzymatique sont mises en œuvre, les conditions de traitement (durée, LPMO(s) choisie(s), ratio enzyme/cellulose, etc.) peuvent être identiques ou différentes entre elles.
Typiquement, ladite au moins une étape de traitement enzymatique, éventuellement suivie d'au moins une étape de traitement mécanique, peut être répétée, comme décrit ci-dessus, jusqu'à obtenir une délamination complète des fibres de cellulose.
Par exemple, le procédé de l'invention peut comprendre au moins deux cycles de traitement successifs, chaque cycle de traitement comprenant au moins une étape de traitement enzymatique du substrat cellulosique suivie d'au moins une étape de traitement mécanique dudit substrat.
Sans être limité par une quelconque théorie, la combinaison selon l'invention (i) d'un traitement enzymatique avec au moins une LPMO et (ii) d'un traitement mécanique de délamination, permet d'obtenir des nanocelluloses dont les caractéristiques structurelles et les propriétés mécaniques sont tout à fait différentes des nanocelluloses existantes dans l'état de la technique.
Encore sans être limité par une quelconque théorie, le procédé de l'invention permet d'obtenir des nanocelluloses de façon simple et reproductible. De préférence, la taille et les propriétés mécaniques de ces nanocelluloses sont homogènes. Substrat cellulosique
Le substrat cellulosique peut être obtenu selon l'invention à partir de toute matière de la biomasse (englobant les matières organiques d'origine végétale, algues incluses, animale ou fongique) comprenant des fibres cellulosiques (c.à.d. des fibres de cellulose).
Le substrat cellulosique est obtenu avantageusement à partir de bois (dont la cellulose est le composant principal), mais aussi de tout végétal fibreux riche en cellulose, comme par exemple, le coton, le lin, le chanvre, le bambou, le kapok, les fibre de noix de coco (coir), la ramie, la jute, le sisal, le raphia, le papyrus et certains roseaux, la bagasse de canne à sucre, la betterave (et notamment la pulpe de betterave), les agrumes, les tiges de maïs ou de sorgho, ou encore les plantes annuelles à paille.
Les substrats cellulosiques peuvent également être obtenus à partir d'animaux marins (comme le tunicier par exemple), d'algues (comme par exemple Valonia ou Cladophora) ou de bactéries pour la cellulose bactérienne (comme par exemple les souches bactériennes de types Gluconacetobacter).
On choisira, selon les applications, de la cellulose issue de parois primaires comme le parenchyme des fruits (par exemple les betteraves, les agrumes etc.) ou de parois secondaires, comme le bois.
Le substrat cellulosique consiste avantageusement en un matériau cellulosique préparé par des moyens chimiques ou mécaniques, à partir de toute source cellulosique telle que mentionnée ci-dessus (et notamment à partir du bois).
Le substrat cellulosique se présente avantageusement sous la forme d'une suspension de fibres de cellulose dans un milieu liquide (de préférence un milieu aqueux), ou d'une pâte de cellulose.
Les pâtes de cellulose peuvent être conditionnées à l'état « sec », soit typiquement dans un état de siccité supérieur ou égal à 80%, notamment supérieur ou égal à 90%. La pâte de cellulose peut ensuite être redispersée dans un milieu aqueux par un traitement mécanique.
De préférence, le substrat cellulosique contient au moins 90%, notamment au moins 95% et de préférence 100% de fibres de celluloses.
De préférence, le substrat cellulosique est adapté à la fabrication de papier ou d'un produit cellulosique. Le substrat cellulosique est ainsi de préférence choisi parmi les pâtes papetières (ou pâte à papier), et en particulier les pâtes papetières chimiques.
De manière générale, la pâte de cellulose et notamment la pâte papetière peut contenir, en association avec les fibres de cellulose, de l'hémicellulose et de la lignine. De préférence, la pâte de cellulose contient moins de 10% et notamment moins de 5% de lignine et/ou d'hémicellulose. De préférence, les pâtes papetières chimiques contiennent quasiment exclusivement, voire exclusivement des fibres de cellulose.
La pâte papetière peut être choisie parmi l'une au moins des pâtes papetières suivantes : les pâtes blanchies, les pâtes semi-blanchies, les pâtes écrues, les pâtes au bisulfite (écrues ou blanchies), les pâtes au sulfate (écrues ou blanchies), les pâtes à la soude (écrues ou blanchies) et les pâtes kraft.
Il est également possible d'utiliser des pâtes à dissoudre ayant une faible proportion d'hémicellulose, de préférence inférieure à 10% et notamment inférieure ou égale à 5%.
De préférence, les pâtes papetières utilisées dans un procédé de l'invention sont des pâtes de bois, notamment des pâtes papetières chimiques de bois.
Mono-oxygénases lytigues de polysaccharides - LPMO
Le substrat cellulosique est ainsi soumis à au moins une étape de prétraitement avec au moins une enzyme de clivage appartenant à la famille des mono-oxygénases lytiques de polysaccharides (« Lytic Polysaccharide Ponooxygenases » ou LPMO).
Les LPMOs sont des enzymes mononucléaires de type II à cuivre. Elles présentent des caractéristiques structurelles communes, notamment :
- une surface plane avec un site actif situé proche de son centre et
- un site de liaison fortement conservé pour un ion cuivre de type II exposé à la surface de la protéine.
L'interaction entre l'enzyme LPMO et la surface de la cellulose intervient par l'intermédiaire de la face plane de l'enzyme LPMO et met en jeu des interactions avec des résidus aromatiques polaires. Les LPMOs utilisables selon l'invention sont définies par leur capacité à catalyser un clivage oxydatif des fibres de cellulose du substrat cellulosique, par oxydation de l'un au moins des atomes de carbone en positions Ci , C4 et
C6 d'un cycle glucose desdites fibres de cellulose.
Le principe du clivage oxydatif réalisé par les LPMOs implique l'activation d'un groupement C-H suivie par un clivage dépendant du dioxygène (02), produisant ainsi des oligomères oxydés sur l'un au moins des carbones en positions Ci , C4, et C6.
La ou les LPMO(s) mises en œuvre sont aptes à catalyser un clivage des fibres de cellulose par oxydation de l'un au moins des carbones choisis parmi les carbones en positions Ci et/ou C4 et/ou C6 d'un cycle glucose de la cellulose. Le clivage oxydatif conduit à la formation de groupements carboxyles à la surface des fibres de cellulose :
- le clivage oxydatif en position Ci d'un cycle glucose d'une unité de cellobiose entraîne la formation d'une lactone, spontanément hydrolysée en acide aldonique, et
- le clivage oxydatif en position C4 d'un cycle glucose d'une unité de cellobiose conduit à la formation d'un kétoaldose.
L'oxydation du groupement alcool en position C6 d'un cycle glucose d'une unité de cellobiose conduit à la formation d'un groupe carbonyle.
Dans certains modes de réalisation, la ou les LPMO(s) utilisées catalysent un clivage des fibres de cellulose par oxydation de l'un au moins des carbones choisis parmi les carbones en position(s) Ci et/ou C4 d'un cycle glucose de la cellulose, éventuellement en combinaison avec le carbone en position C6.
Les LPMOs catalysent le clivage oxydatif d'une unité de cellobiose en présence d'un donneur externe d'électron.
Ce donneur d'électron, généralement une molécule de faible poids moléculaire, est choisi parmi l'ascorbate, le glutathion réduit, le gallate, le cathécol, des fragments de lignine, ou encore une enzyme de la famille des carbohydrates déshydrogénases.
De préférence, les carbohydrates déshydrogénases sont choisies parmi les enzymes fongiques, notamment les cellobiose déshydrogénase (CDHs).
Les CDHs (ou Cellobiose oxidoréductases - EC 1 .1 .99.1 8) catalysent la réaction [Cellobiose + accepteur d'électron <=> cellobiono-1 ,5-lactone + accepteur réduit]. Ce sont des hémoflavoenzymes fongiques appartenant à la superfamille des glucose- méthanol-choline (GMC) oxydoréductases. Les CDHs sont des enzymes monomériques portant deux groupes prosthétiques, un groupe hème b et une flavine adénine dinucléotide. Le domaine flavoprotéine des CDHs catalyse l'oxydation à deux électrons de la cellobiose en lactone en utilisant un accepteur d'électrons. Cet accepteur d'électron peut être par exemple choisi parmi le dioxygène, les quinones et les radicaux phénoxy ou les LPMOs.
L'activité d'une enzyme CDH peut être déterminée en suivant la réduction du réactif 2,6-dichlorophénol indophénol (DCPIP) dans un tampon sodium acétate contenant du cellobiose (Bey et al., 201 1 , Microb. Cell Fact. 1 0:1 13).
Des exemples de CDHs utilisables en combinaison avec au moins une enzyme LPMO et agissant également en tant que donneur d'électron peuvent être choisis parmi les CDHs provenant de Pycnoporus cinnabarinus, Humicola insolens, Podospora anserina, ou Myceliophthora thermophila.
De préférence encore, on utilise une enzyme LPMO pour laquelle une activité cellulolytique (c'est-à-dire catalysant le clivage oxydatif de la cellulose) a été identifiée. L'activité de clivage oxydatif des LPMOs sur un substrat cellulosique peut être testée dans des tests de clivage tels que décrit dans la partie Exemple de la présente demande.
Plus précisément, les LPMOs mises en œuvre dans l'invention sont avantageusement choisies parmi les enzymes dites « à activité auxiliaire » (ou « Auxiliary Activity » - AA) selon la classification établie dans la base de données CAZy, relatives aux enzymes actives sur les hydrates de carbone (CAZy - Carbohydrate Active enZyme database - http://www.cazy.org/ - Voir aussi Levasseur et al., Biotechnology for Biofuels 2013, 6 :41 ).
De préférence encore, l'étape de traitement enzymatique est réalisée avec au moins une enzyme choisie parmi les enzymes LPMOs des familles dites AA9, AA10, AA1 1 et AA13, selon la classification établie dans la base de données CAZy.
L'enzyme LPMO selon l'invention peut contenir un module protéique de fixation au carbohydrate (« carbohydrate binding module ») spécifique de la cellulose de type CBM1 selon la classification CAZy.
Les enzymes listées dans la présente demande sont identifiées par les références Genbank (identifiant une séquence génétique) et Uniprot lorsque cette dernière est disponible (identifiant une séquence protéique - voir tableau 1 ). Par défaut, la référence indiquée entre parenthèses pour chaque enzyme correspond à la référence « Genbank ».
De préférence, on utilise (avantageusement exclusivement) au moins une enzyme de la famille AA9 et/ou au moins une enzyme de la famille AA10 de la classification CAZy.
Les enzymes de la famille AA9, listées dans le tableau 1 ci-après, sont des enzymes fongiques largement distribuées dans le génome de la plupart des ascomycètes et chez certains basidiomycètes (champignons).
De manière générale, les enzymes de la famille AA9 étaient initialement classées dans la famille des glycosides hydrolases 61 (GH61 ) de la classification CAZy. Des analyses spécifiques ont montré depuis, que l'activité endoglucanase des enzymes AA9 était faible, voire inexistante (Morgenstern I et al., Briefings in Functional Genomics vol.3(6P) : 471 -481 ).
De préférence, on utilise des LPMOs dont l'activité endoglucanase est non significative ou inexistante.
L'ion cuivre des LPMOs de la famille AA9 est lié à la protéine selon un modèle d'hexacoordination impliquant au moins 2 résidus conservés d'histidine et des molécules d'eau.
Les enzymes de la famille AA9 catalysent un clivage oxydatif de l'unité cellobiose sur le carbone en position Ci et/ou C4, de préférence sur le carbone en position Ci ou C4. Certaines enzymes (T. aurantiacus TaGH6~\ A (G3XAP7) et Podospora anserina PaGH61 B (B2AVF1 )) pourraient catalyser un clivage oxydatif de la cellobiose sur un carbone en position C6.
Les LPMOs de la famille AA9 exprimée chez les champignons présentent généralement une modification post-traductionnelle consistant en une méthylation du résidu histidine N-terminal.
De préférence, on utilise des LPMOs de la famille AA9 comprenant au moins un domaine CBM1 ou CBM18 (CBM pour « carbohydrate binding module ») en position N- terminale. Ces enzymes comprennent alors une surface plane formée de plusieurs résidus aromatiques polaires formant un domaine de type CBM1 ou CBM1 8.
De préférence encore, ladite au moins une LPMO de la famille AA9 est issue de Podospora anserina et/ou de Neurospora crassa.
Les enzymes de la famille AA9 issues de Podospora anserina sont typiquement choisies dans le groupe constitué de PaLPM09A (CAP68375), PaLPM09B (CAP73254), PaLPM09D (CAP66744), PaLPM09E (CAP67740), PaLPM09F (CAP71 839), PaLPM09G (CAP73072), PaLPM09H (CAP61476).
De préférence, on utilise les enzymes PaLPM09E (CAP67740) et/ou PaLPM09H (CAP61476).
Les enzymes de la famille AA9 issues de Neurospora crassa sont typiquement choisies dans le groupe constitué de A/cLPM09C (EAA36362), A/cLPM09D (EAA32426 /CAD21 296), A/cLPM09E (EAA26873), A/cLPM09F (EAA26656/CAD70347), A/cLPM09M (EAA331 78), A/cU00836 (EAA34466), A/cU02240 (EAA30263), A/cU07760 (EAA2901 8).
Les enzymes de la famille AA10 (classification CAZy) étaient anciennement classées dans la famille CBM33 (ou « carbohydrate binding module family 33 ») de la classification CAZy.
La famille AA10 des LPMOs comprend à ce jour plus d'un millier d'enzymes, identifiées particulièrement chez les bactéries, mais aussi chez certains eucaryotes ainsi que dans quelques virus.
Les LPMOs de la famille AA10 possèdent une structure similaire à celle des enzymes de la famille AA9 et notamment au moins un résidu tyrosine conservé en position N-terminal qui est impliqué dans la liaison avec l'ion cuivre. Cependant, dans la plupart des LPMOs de la famille AA1 0, l'un des autres résidus tyrosine impliqués dans la liaison axiale de l'ion cuivre est remplacé par un résidu phénylalanine. Pour ces enzymes, une activité oxydative a été démontrée sur la chitine et sur la cellulose.
De préférence, les enzymes de la famille AA10 sont multimodulaires et comprennent un domaine CBM en position N-terminal. Ces domaines sont typiquement des domaines CBM2, CBM5, CBM1 0, CBM12 ainsi que des modules fibronectine type I I I.
La famille AA1 1 est caractérisée par des enzymes qui réalisent un clivage oxydatif en Ci sur la chitine. On choisira de préférence l'enzyme d'Aspergillus oryzae (voir également Hemsworth et al., Nature Chemical Biology 2014(1 0):1 22-1 26 - Discovery and characterization of a new family of lytic polysaccharide monooxygenases).
La famille AA1 3 est caractérisée par des enzymes qui réalisent un clivage oxydatif en Ci sur l'amidon. On choisira de préférence l'enzyme d'Aspergillus nidulans (Lo Leggio et al., Nat Commun. 2015(22) 6: 5961 -Structure and boosting activity of a starch- degrading lytic polysaccharide monooxygenase).
De manière générale, l'étape de traitement enzymatique est mise en œuvre au moyen d'au moins une enzyme LPMO listée dans le tableau 2 ci-après.
Dans certains modes de réalisation du procédé de l'invention, ladite au moins une enzyme de la famille des LPMOs (avantageusement de la famille AA9 et/ou de la famille AA10) est utilisée en combinaison avec au moins une cellulase.
La cellulase est avantageusement choisie parmi au moins une endoglucanase (par exemple une endoglucanase) et/ou au moins une carbohydrate déshydrogénase (avantageusement une cellobiose déshydrogénase (CDHs)). Les carbohydrates déshydrogénases peuvent jouer le rôle de donneur d'électron pour les LPMOs.
En pratique, ladite au moins une enzyme LPMO mise en œuvre est avantageusement purifiée à partir d'un surnageant de culture d'un champignon et/ou produite en système hétérologue, notamment dans une bactérie, un champignon ou une levure, par exemple chez la levure Pichia pastoris.
Ladite au moins une enzyme LPMO est mélangée avec le substrat cellulosique, de manière à permettre la mise en contact entre ladite au moins une enzyme et les fibres de cellulose.
L'étape de traitement enzymatique est de préférence réalisée sous agitation douce, de façon à assurer une bonne dispersion des enzymes au sein des fibres. Cette étape de traitement enzymatique est par exemple mise en œuvre pendant une durée allant de 24h à 72h (de préférence 48h).
De préférence, l'étape de traitement enzymatique est mise en œuvre à une température allant de 30 à 45 ° C.
Selon l'invention ladite au moins une enzyme LPMO peut être ajoutée au substrat cellulosique selon un rapport (ou ratio) enzyme/cellulose allant de 1 :1000 à 1 :50, notamment de 1 :500 à 1 :50 ou de 1 :1 00 à 1 :50 ou encore de 1 :1 000 à 1 :500, de 1 : 500 à 1 : 1 00.
De préférence, ladite au moins une enzyme LPMO est utilisée à une concentration allant de 0,001 à 1 0 g/L, notamment de 0, 1 à 5 g/L, et de préférence encore de 0,5 à 5 g/L.
Selon un mode de réalisation particulier, le substrat cellulosique est soumis à au moins deux (voire seulement à deux) étapes de traitement enzymatique successives (en série, avantageusement séparées par une étape de rinçage).
La ou les LPMOs mises en œuvre au cours de chacune de ces étapes de traitement enzymatique sont identiques ou différentes ; les conditions (notamment le ratio enzyme/substrat) sont identiques ou différentes entre ces étapes successives.
Dans ce cas, les Exemples démontrent que les fibres sont entièrement déstructurées, y compris à des rapports enzyme/cellulose faibles. Etaoe(s) de traitement(s) mécaniaue(s)
Le substrat cellulosique prétraité est ensuite soumis à au moins une étape de traitement mécanique qui est destinée à délaminer les fibres de cellulose pour l'obtention des nanocelluloses.
La délamination (dite encore « fibrillation » ou « défibrillation ») consiste à séparer, par un phénomène mécanique, les fibres de cellulose en nanocelluloses.
Comme démontré au travers des Exemples ci-après, le clivage oxydatif des fibres de cellulose, catalysé par ladite au moins une LPMO, facilite la délamination de ces fibres de cellulose lors de l'étape de traitement mécanique.
Cette étape de délamination mécanique des fibres de cellulose peut alors être réalisée dans des conditions moins drastiques et donc moins coûteuses en énergie. Par ailleurs, l'utilisation de LPMOs selon l'invention permet d'introduire dans les fibres de cellulose des groupements chargés induisant des répulsions électrostatiques, sans contamination avec des réactifs de traitement, comme lors de l'utilisation de réactifs TEMPO.
Les traitements mécaniques visant à délaminer les fibres de cellulose sont connus de l'homme du métier et peuvent être mis en œuvre dans le procédé de l'invention.
De manière générale, on peut citer les traitements mécaniques faibles avec un homogénéiseur-disperseur (par exemple du type d'Ultra-Turrax) et/ou les traitements ultrasons.
On peut encore par exemple se référer au document de Lavoine N et al (Carbohydrate Polymers, 2012, (92) :735-64) qui décrit notamment (pages 740 à 744) des traitements mécaniques pour la préparation de cellulose microfibrillée (par exemple des nanofibrilles de cellulose).
Typiquement, un traitement mécanique peut être choisi parmi des traitements mécaniques d'homogénéisation, de microfluidisation, d'abrasion, ou de cryobroyage.
Le traitement d'homogénéisation implique le passage du substrat cellulosique prétraité, typiquement une pâte de cellulose ou une suspension liquide de cellulose, au travers d'un espace étroit sous pression élevée (tel que décrit par exemple dans le brevet US 4,486,743).
Ce traitement d'homogénéisation est de préférence effectué au moyen d'un homogénéiseur de type Gaulin. Dans un tel dispositif, le substrat cellulosique prétraité, typiquement sous forme d'une suspension de cellulose, est pompé à haute pression et distribué au travers d'une valve automatique de faible orifice. Une succession rapide d'ouvertures et de fermetures de la valve soumet les fibres à une importante chute de pression (généralement d'au moins 20 MPa) et à une action de cisaillement à vitesse élevée suivie d'un impact de décélération à vitesse élevée. Le passage du substrat dans l'orifice est répété (généralement de 8 à 10 fois) jusqu'à ce que la suspension de cellulose devienne stable. Afin de maintenir une température du produit dans une gamme allant de 70 à 80 °C durant le traitement d'homogénéisation, ce l'eau de refroidissement est généralement utilisée.
Ce traitement d'homogénéisation peut également être mis en œuvre à l'aide d'un dispositif de type microfluidiseur (voir par exemple Sisqueira et al. Polymer 2010 2(4) :728-65). Dans un tel dispositif, la suspension de cellulose passe au travers d'une fine chambre typiquement en forme de « z » (dont les dimensions du canal sont généralement comprises entre 200 et 400 μηι) sous pression élevée (environ 2070 bars). Le taux de cisaillement élevé qui est appliqué (généralement supérieur à 107.s"1) permet d'obtenir des nanofibrilles très fines. Un nombre variable de passages (par exemple de 2 à 30, notamment de 10 à 30 ou de 5 à 25, et en particulier de 5 à 20) avec des chambres de tailles différentes peut être utilisé, pour augmenter le degré de fibrillation.
Le traitement d'abrasion ou de meulage (voir par exemple Iwamoto Set al., 2007 Applied Physics A89(2) :461 -66) est basé sur l'utilisation d'un dispositif de meulage apte à exercer des forces de cisaillement fournies par des pierres de meulage.
Le substrat cellulosique prétraité, généralement sous forme d'une pâte de cellulose, est passé entre une pierre de meulage statique et une pierre de meulage en rotation, typiquement à une vitesse de l'ordre de 1500 rotations par minute (rpm). Plusieurs passages (généralement entre 2 et 5) peuvent être nécessaires pour obtenir des fibrilles de taille nanométrique.
Un dispositif de type mixeur (par exemple tel que décrit dans Unetani K et al., Biomacromolécules 201 1 , 12(2), pp.348-53) peut également être utilisé pour produire des microfibrilles à partir du substrat cellulosique prétraité, par exemple à partir d'une suspension de fibres de bois.
Le traitement de cryobroyage (ou cryoconcassage) (Dufresne et al., 1997, Journal of Applied Polymer Science, 64(6) :1 185-94) consiste à broyer une suspension de substrat cellulosique prétraité préalablement congelée avec de l'azote liquide. Les cristaux de glace formés à l'intérieur des cellules font exploser les membranes cellulaires et libèrent des fragments de parois. Ces procédés sont généralement utilisés pour la production de microfibrilles de cellulose à partir de produits, ou de résidus, de l'agriculture. Etaoe(s) de post-traitement du substrat cellulosique
Dans certains modes de réalisation, le procédé de fabrication comprend au moins une étape de post-traitement du substrat cellulosique, mise en œuvre après que ledit substrat ait été soumis au traitement mécanique.
Généralement, ladite au moins une étape de post-traitement vise à augmenter le degré de fibrillation des nanocelluloses obtenues et/ou à conférer auxdites nanocelluloses de nouvelles propriétés mécaniques, en fonction des applications envisagées.
Ladite au moins une étape de post-traitement peut notamment être choisie parmi un traitement acide, un traitement enzymatique, une oxydation, une acétylation, une silylation, ou encore une dérivatisation de certains groupements chimiques portés par les microfibrilles. On peut également se référer par exemple au document de Lavoine N et al (Carbohydrate Polymers, 2012, (92) :735-64) qui décrit notamment (point 2.3, pages 747 à 748) des post-traitements qui peuvent être combinés à différents prétraitements et traitements mécaniques des fibres de celluloses.
Nanocelluloses selon l'invention
Le procédé selon l'invention permet ainsi l'obtention de nanocelluloses, en particulier de nanocristaux de cellulose et/ou de nanofibrilles de cellulose.
Contrairement aux NFCs obtenues après oxydation par des réactifs chimiques de type TEMPO, les nanocelluloses obtenues par le procédé de l'invention sont dépourvues de résidus de réactifs d'oxydation (à savoir par exemple le bromure de sodium, l'hypochlorite de sodium, le chlorite de sodium, le radical (2,2,6,6- tétraméthylpipéridin-1 -yl)oxyl (TEMPO), les dérivés ou analogues).
De préférence, à l'issue du procédé selon l'invention, les nanocelluloses comportent au moins un cycle de glucose (typiquement plusieurs cycles de glucose) dont l'un au moins des atomes de carbone en positions Ci et/ou C4, voire aussi C6, est oxydé par un phénomène de clivage oxydatif.
Les nanocelluloses selon l'invention comportent ainsi des cycles de glucose qui sont :
- mono-oxydés sur l'atome de carbone en position Ci , et/ou
- mono-oxydés sur l'atome de carbone en position C4, et/ou
- doublement oxydés, sur les atomes en positions Ci et C4.
Ces cycles de glucose, oxydés sur les atomes en positions Ci et/ou C4, peuvent encore comporter un atome de carbone oxydé en position C6.
Par « atome de carbone oxydé », on entend en particulier un atome de carbone qui comporte une fonction carbonyle, et avantageusement encore une fonction carboxyle.
Les nanocelluloses selon l'invention sont ainsi avantageusement chargées négativement, du fait de la présence de différents fonctions en surface dont des fonctions carboxylates sur les carbones en positions Ci et/ou C4 (contrairement au procédé TEMPO qui conduit à une oxydation spécifique du carbone en position C6).
RESULTATS EXPERIMENTAUX
1 . Des tests de clivage de la cellulose par une enzyme LPMO peuvent être menés selon le protocole suivant :
Le test de clivage est réalisé dans un volume de 300 μΙ de liquide contenant 4,4 μΜ d'enzyme LPMO et 1 mM d'ascorbate et 0,1 % (poids/volume) de poudre de cellulose gonflée à l'acide phosphorique (PASC phosphoric acid-swoller cellulose - préparée comme décrit dans Wood TM, Methods Enzym 1988, 160 :19-25) dans 50 mM d'un tampon acétate de sodium à pH 4,8 ou 5 μΜ de cello-oligosaccharides (Megazyme, Wicklow, Ireland) dans 10 mM de tampon acétate de sodium à pH 4,8.
La réaction enzymatique est mise en œuvre dans un tube de 2 ml incubé dans un thermomixer (Eppendorf, Montesson, France) à 50 °C et 580 rpm (rotation par minute).
Après 16 h d'incubation, l'échantillon est porté à 100°C pendant 10 minutes afin de stopper la réaction enzymatique, puis centrifugé à 16 000 tours par minutes (rpm) pendant 15 minutes à 4°C afin de séparer la fraction solution de la fraction insoluble restante.
Les produits clivés obtenus peuvent être analysés par chromatographie à échange d'ions et/ou par spectrométrie de masse (MALDI-TOF).
2. Des essais préliminaires ont été menés pour démontrer l'efficacité du procédé de fabrication de nanocellulose selon l'invention.
Ces essais ont été réalisés sur une fibre papetière (fibres kraft de cellulose) au moyen d'enzyme LMPO de la famille AA9 issues de Podospora anserina (PaLPM09E (Genbank CAP67740) et/ou PaLPM09H (Genbank CAP61476)) et produites en système hétérologue chez la levure (Pichia pastoris).
Les fibres sont mises en contact des enzymes (à une concentration d'1 g/L et selon des rapports enzyme/cellulose de 1 :50, 1 :100, 1 :500 et 1 :1000) et d'ascorbate (2 mM) puis soumises à une agitation douce pendant 48 heures à 40 °C.
Les fibres traitées sont ensuite soumises à une action mécanique avec un homogénéiseur-disperseur (Ultra-Turrax puissance 500 W, vitesse maximum pendant 3 minutes), suivie d'un traitement aux ultrasons pendant 3 minutes.
Comparativement aux substrats non traités à l'enzyme, on observe que la défibrillation est facilitée pour l'ensemble des rapports enzyme/cellulose utilisés (Figure 1 B-D - les photos montrent, de façon qualitative, la défibrillation).
En l'absence d'enzyme, les fibres restent intactes et aucune défibrillation n'est constatée (voir les fibres témoins non traitées, Figure 1 A).
Les dispersions ont été ensuite analysées par TEM (Microscopie Electronique en Transmission) et AFM (Microscopie de Force Atomique).
En l'absence d'enzymes LPMOs (figure 2A), on constate que très peu de structures sont visibles à l'échelle nanométrique.
En revanche, pour les fibres traitées par l'enzyme LPMO, des structures de dimensions nanométriques sont facilement repérées aussi bien dans le surnageant que dans les culots d'expérience. Les fibres sont entièrement déstructurées, laissant apparaître les zones cristallines de la fibre (Figure 2C-D).
Le traitement des fibres avec l'enzyme PaLPM09E combiné au traitement mécanique ultérieur (Figures 3B et D) produit une défibrillation de la cellulose similaire à celle obtenue avec un procédé identique impliquant l'enzyme PaLPM09H (voir Figure 3A et C).
De manière générale, les figures 2C, 2D, 3C et 3D démontrent de façon indiscutable que des nanocelluloses sont obtenues.
Si les fibres ayant subies un premier traitement avec l'enzyme LPMO sont à nouveau soumises à un second traitement successif avec une enzyme LPMO aux conditions décrites ci-dessus, suivi du traitement mécanique, les fibres sont entièrement déstructurées y compris aux rapports enzyme/cellulose faibles (c'est-à-dire les ratios 1/500 et 1/1000) (Figure 4).
Les photos AFM pour l'enzyme PaLPM09H ont été analysées par le logiciel WSxM pour caractériser le profil des hauteurs (Figure 5A) et la distribution en taille (Figure 5B) des nanocelluloses.
Cette analyse montre, qu'au ratio enzyme/cellulose 1 :50, les nanocelluloses ont un diamètre inférieur à 100 nm.
Ce résultat confirme que les produits obtenus par le procédé selon l'invention sont des nanocelluloses. Tableau 1 :
Enzymes fongiques répertoriées de la famille AA9 (classification CAZy)
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000022_0001
Nom Organisme Réf. GenBank Réf.
Uniprot cellobiohydrolase family protein 61 , Chaetomium AGY80103.1
partial (Cbh61 -2) (fragment) thermophilum CT2
cellobiohydrolase family protein 61 , Chaetomium AGY80104.1
partial (Cbh61 -3) (fragment) thermophilum CT2
cellobiohydrolase family protein 61 , Chaetomium AGY80105.1
partial (Cbh61 -4) (fragment) thermophilum CT2
ORF (possible fragment) Colletotrichum CAQ16278.1 B5WYD8 graminicola M2
ORF Colletotrichum CAQ16206.1 B5WY66 graminicola M2
ORF Colletotrichum CAQ16208.1 B5WY68 graminicola M2
ORF Colletotrichum CAQ16217.1 B5WY77 graminicola M2
unnamed protein product Coprinopsis cinerea CAG27578.1
CGB_A6300C Cryptococcus ADV19810.1
bacillisporus WM276
CNAG_00601 Cryptococcus AFR92731 .1
neoformans var. AFR92731 .2
grubii H99
(Cryne_H99_ 1 )
CeM Cryptococcus AAC39449.1 059899 neoformans var.
neoformans
CNA05840 (CeM ) Cryptococcus AAW41 121 .1 F5HH24 neoformans var.
neoformans JEC21
(Cryne_JEC21_ 1)
ORF (fragment) Flammulina velutipes ADX07320.1
KACC 42777
FFUJJ 2340 Fusarium fujikuroi IMI CCT72465.1
58289 (Fusful)
FFUJJ 3305 Fusarium fujikuroi IMI CCT671 19.1
58289 (Fusful)
FFUJ_07829 Fusarium fujikuroi IMI CCT69268.1
58289 (Fusful)
FFUJJ 2621 Fusarium fujikuroi IMI CCT72729.1
58289 (Fusful)
FFUJJ 2840 Fusarium fujikuroi IMI CCT72942.1
58289 (Fusful)
FFUJ_09373 Fusarium fujikuroi IMI CCT73805.1
58289 (Fusful)
FFUJJ 0599 Fusarium fujikuroi IMI CCT74544.1
58289 (Fusful) Nom Organisme Réf. GenBank Réf.
Uniprot
FFUJJ 0643 Fusarium fujikuroi IMI CCT74587.1
58289 (Fusful)
FFUJJ 4514 Fusarium fujikuroi IMI CCT67584.1
58289 (Fusful)
FFUJ_1 1399 Fusarium fujikuroi IMI CCT75380.1
58289 (Fusful)
FFUJJ 4514 Fusarium fujikuroi IMI CCT67584.1
58289
FFUJ_1 1399 Fusarium fujikuroi IMI CCT75380.1
58289
FFUJ_04652 Fusarium fujikuroi IMI CCT64153.1
58289 (Fusful)
FFUJ_03777 Fusarium fujikuroi IMI CCT64954.1
58289 (Fusful)
FFUJ_04940 Fusarium fujikuroi IMI CCT63889.1
58289 (Fusful)
Séquence 122805 from patent US Fusarium ABT35335.1
7214786 graminearum
FG03695.1 (Cel61 E) Fusarium XP_383871 .1
graminearum PH- 1
unnamed protein product Fusarium CEF78545.1
graminearum PH- 1
unnamed protein product Fusarium CEF74901 .1
graminearum PH- 1
unnamed protein product Fusarium CEF78472.1
graminearum PH- 1
unnamed protein product Fusarium CEF86346.1
graminearum PH- 1
unnamed protein product Fusarium CEF87450.1
graminearum PH- 1
unnamed protein product Fusarium CEF85876.1
graminearum PH- 1
unnamed protein product Fusarium CEF86254.1
graminearum PH- 1
unnamed protein product Fusarium CEF87657.1
graminearum PH- 1
unnamed protein product Fusarium CEF76256.1
graminearum PH- 1
unnamed protein product Fusarium CEF78876.1
graminearum PH- 1
unnamed protein product Fusarium CEF79735.1
graminearum PH- 1 om Organisme Réf. GenBank Réf.
Uniprot unnamed protein product Fusarium CEF74460.1
graminearum PH- 1
unnamed protein product Fusarium CEF84640.1
graminearum PH- 1
endo-3-1 ,4-glucanase (Cel61 G) Gloeophyllum AEJ35168.1
trabeum
GH61 D Heterobasidion AF072234.1
parviporum
GH61 B Heterobasidion AF072233.1
parviporum
GH61 A Heterobasidion AF072232.1
parviporum
GH61 F Heterobasidion AF072235.1
parviporum
GH61 G Heterobasidion AF072236.1
parviporum
GH61 H Heterobasidion AF072237.1
parviporum
GH61 I Heterobasidion AF072238.1
parviporum
GH61 J Heterobasidion AF072239.1
parviporum
unnamed protein product Humicola insolens CAG27577.1
endoglucanase IV (EgiV) Hypocrea orientalis AFD50197.1
EU7-22
GH61 A (GH61 A) Lasiodiplodia CAJ81215.1
theobromae CBS
247.96
GH61 B (GH61 B) Lasiodiplodia CAJ81216.1
theobromae CBS
247.96
GH61 C (GH61 C) Lasiodiplodia CAJ81217.1
theobromae CBS
247.96
GH61 D (GH61 D) Lasiodiplodia CAJ81218.1
theobromae CBS
247.96
ORF Leptosphaeria CBX91313.1 E4ZJM8 maculans v23. 1.3
ORF Leptosphaeria CBX93546.1 E4ZQ1 1 maculans v23. 1.3
ORF Leptosphaeria CBX94224.1 E4ZS44 maculans v23. 1.3
Figure imgf000026_0001
Figure imgf000027_0001
Nom Organisme Réf. GenBank Réf.
Uniprot
MGG_12733 (probable fragment) Magnaporthe grisea XP_003716689.1
70- 15 (Maggrl)
copper-dependent polysaccharide Malbranchea CCP37674.1
monooxygenases (Gh61 ) (fragment) cinnamomea CBS
115.68
copper-dependent polysaccharide Melanocarpus CCP37668.1
monooxygenases (Gh61 ) (fragment) albomyces CBS
638.94
copper-dependent polysaccharide Myceliophthora CCP37667.1
monooxygenases (Gh61 ) (fragment) fergusii CBS 406.69
MYCTH_21 12799 Myceliophthora AE061257.1
thermophila ATCC
42464
MYCTH_79765 Myceliophthora AEO56016.1
thermophila ATCC
42464
MYCTHJ 10651 Myceliophthora AEO54509.1
thermophila ATCC
42464
MYCTH_2298502 Myceliophthora AEO55082.1
thermophila ATCC
42464
MYCTH_2299721 Myceliophthora AE055652.1
thermophila ATCC
42464
MYCTH_2054500 Myceliophthora AE055776.1
thermophila ATCC
42464
MYCTHJ 1 1088 Myceliophthora AE056416.1
thermophila ATCC
42464
β-glycan-cleaving enzyme Myceliophthora AE056542.1
(StCel61 a ; MYCTH_46583) thermophila ATCC
(Cel61 A) 42464
MYCTH_2301632 Myceliophthora AE056547.1
thermophila ATCC
42464
MYCTHJ 00518 Myceliophthora AE056642.1
thermophila ATCC
42464
lytic polysaccharide monooxygenases Myceliophthora AE056665.1
(active on cellulose) (MYCTH_92668) thermophila ATCC
42464
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000030_0001
Nom Organisme Réf. GenBank Réf.
Uniprot
Pc13g131 10 Pénicillium CAP92380.1 B6H3A3 chrysogenum
Wisconsin 54- 1255
(PenchWisc1_ 1)
Pc20g1 1 100 Pénicillium CAP86439.1 B6HG02 chrysogenum
Wisconsin 54- 1255
(PenchWisc1_ 1)
Cel61 (Cel61 A) Phanerochaete AAM22493.1 Q8NJI9 chrysosporium BKM- F- 1767
Lytic polysaccharide mono- Phanerochaete BAL43430.1
oxygenase active on cellulose chrysosporium K-3
(Gh61 D;PcGH61 D)
PIIN_01487 Piriformospora indica CCA67659.1
(Pirinl)
PIIN_021 10 Piriformospora indica CCA68244.1
(Pirinl)
PIIN_03975 Piriformospora indica CCA70035.1
(Pirinl)
PIIN_04357 Piriformospora indica CCA70418.1
(Pirinl)
PIIN_04637 Piriformospora indica CCA70703.1
(Pirinl)
PIIN_061 17 Piriformospora indica CCA72182.1
(Pirinl)
PIIN_061 18 Piriformospora indica CCA72183.1
(Pirinl)
PIIN_06127 Piriformospora indica CCA72192.1
(Pirinl)
PIIN_06155 Piriformospora indica CCA72220.1
(Pirinl)
PIIN_07098 Piriformospora indica CCA73144.1
(Pirinl)
PIIN_07105 Piriformospora indica CCA73151 .1
(Pirinl)
PIIN_08199 Piriformospora indica CCA74246.1
(Pirinl)
PIIN_08783 Piriformospora indica CCA74814.1
(Pirinl)
PIIN_09022 Piriformospora indica CCA75037.1
(Pirinl)
PIIN_00566 (fragment) Piriformospora indica CCA66803.1
(Pirinl) om Organisme Réf. GenBank Réf.
Uniprot
PIIN_01484 Piriformospora indica CCA67656.1
(Pirinl)
PIIN_01485 (fragment) Piriformospora indica CCA67657.1
(Pirinl)
PIIN_01486 (fragment) Piriformospora indica CCA67658.1
(Pirinl)
PIIN_04356 Piriformospora indica CCA70417.1
(Pirinl)
PIIN_05699 (fragment) Piriformospora indica CCA71764.1
(Pirinl)
PIIN_06156 Piriformospora indica CCA72221 .1
(Pirinl)
PIIN_08402 Piriformospora indica CCA74449.1
(Pirinl)
PIINJ 0315 (fragment) Piriformospora indica CCA76320.1
(Pirinl)
PIINJ 0660 (fragment) Piriformospora indica CCA76671 .1
(Pirinl)
PIIN_00523 (fragment) Piriformospora indica CCA77877.1
(Pirinl)
Putative Glycoside Hydrolase Family Podospora anserina CDP30131 .1 B2AL941 S mat+ (Podan2) CAP64732.1
Putative Glycoside Hydrolase Family Podospora anserina CDP30928.1 B2B3461 S mat+ (Podan2) CAP71532.1
Pa_1_500 Podospora anserina CAP59702.1 B2A9F5
S mat+ (Podan2) CDP22345.1
Pa_4_350 Podospora anserina CAP61395.1 B2AD80
S mat+ (Podan2) CDP27750.1
Pa_4_1020 Podospora anserina CAP61476.1 B2ADG1
S mat+ (Podan2) CDP27830.1
Pa_0_270 Podospora anserina CAP61650.1 B2ADY5
S mat+ (Podan2) CDP28001 .1
Pa_5_8940 Podospora anserina CAP64619.1 B2AKU6
S mat+ (Podan2) CDP30017.1
Pa_5_4100 (fragment) Podospora anserina CAP64865.1 B2ALM7
S mat+ (Podan2) CDP29378.1
Pa_5_6950 Podospora anserina CAP651 1 1 .1 B2AMI8
S mat+ (Podan2) CDP29800.1
Pa_5_10660 Podospora anserina CAP65855.1 B2APD8
S mat+ (Podan2) CDP30283.1
Pa_5_10760 Podospora anserina CAP65866.1 B2APE9
S mat+ (Podan2) CDP30272.1 Nom Organisme Réf. GenBank Réf.
Uniprot
Pa_5_1 1630 (fragment) Podospora anserina CAP65971 .1 B2API9
S mat+ (Podan2) CDP30166.1
Pa_4_7570 Podospora anserina CAP66744.1 B2ARG6
S mat+ (Podan2) CDP28479.1
Pa_1_21900 (fragment) Podospora anserina CAP67176.1 B2AS05
S mat+ (Podan2) CDP24589.1
Pa_1_22040 Podospora anserina CAP67190.1 B2AS19
S mat+ (Podan2) CDP24603.1
Pa_1_22150 (fragment) Podospora anserina CAP67201 .1 B2AS30
S mat+ (Podan2) CDP24614.1
Pa_6_1 1220 Podospora anserina CAP67466.1 B2ASU3
S mat+ (Podan2) CDP30332.1
Pa_6_1 1370 Podospora anserina CAP67481 .1 B2ASV8
S mat+ (Podan2) CDP30347.1
Pa_6_1 1470 Podospora anserina CAP67493.1 B2ASX0
S mat+ (Podan2) CDP30359.1
Pa_1_16300 Podospora anserina CAP67740.1 B2ATL7
S mat+ (Podan2) CDP23998.1
Pa_7_5030 Podospora anserina CAP68173.1 B2AUV0
S mat+ (Podan2) CDP31642.1
Pa_7_3770 Podospora anserina CAP68309.1 B2AV86
S mat+ (Podan2) CDP31780.1
Pa_7_3390 Podospora anserina CAP68352.1 B2AVC8
S mat+ (Podan2) CDP31823.1
lytic polysaccharide mono-oxygenase Podospora anserina CAP68375.1 B2AVF1 active on cellulose S mat+ (Podan2) CDP31846.1
(Gh61 B;Pa_7_3160)(Gh61 B)
Pa_6_7780 Podospora anserina CAP71839.1 B2B403
S mat+ (Podan2) CDP31230.1
Pa_2_1700 Podospora anserina CAP72740.1 B2B4L5
S mat+ (Podan2) CDP25137.1
Pa_2_4860 Podospora anserina CAP73072.1 B2B5J7
S mat+ (Podan2) CDP25472.1
lytic polysaccharide mono-oxygenase Podospora anserina CAP73254.1 B2B629 active on cellulose S mat+ (Podan2) CDP25655.1
(Gh61 A;Pa_2_6530)(Gh61 A)
Pa_2_7040 Podospora anserina CAP7331 1 .1 B2B686
S mat+ (Podan2) CDP25714.1
Pa_2_7120 Podospora anserina CAP73320.1 B2B695
S mat+ (Podan2) CDP25723.1
Pa_3_190 Podospora anserina CAP61048.1 B2AC83
S mat+ (Podan2) CDP26500.1 Nom Organisme Réf. GenBank Réf.
Uniprot
Pa_3_2580 Podospora anserina CAP70156.1 B2AZV6
S mat+ (Podan2) CDP26748.1
Pa_3_3310 Podospora anserina CAP70248.1 B2AZD4
S mat+ (Podan2) CDP26841 .1
endo-3-1 ,4-glucanase (EgM ; Pyrenochaeta AEV53599.1
PIEGL1 ) lycopersici ISPaVe
ER 1211
copper-dependent polysaccharide Rasamsonia CCP37669.1
monooxygenases (Gh61 ) (fragment) byssochlamydoides
CBS 151.75
copper-dependent polysaccharide Remersonia CCP37675.1
monooxygenases (Gh61 ) (fragment) thermophila CBS
540.69
RHTO0S_28e01816g Rhodosporidium CDR49619.1
toruloides CECT1137
copper-dependent polysaccharide Scytalidium CCP37676.1
monooxygenases (Gh61 ) (fragment) indonesiacum CBS
259.81
SMU2916 (fragment) Sordaria macrospora CAQ58424.1 C1 KU36 k-hell
lytic polysaccharide mono-oxygenase Thermoascus ABW56451 .1
active on cellulose aurantiacus ACS05720.1
copper-dependent polysaccharide Thermoascus CCP37673.1
monooxygenases (Gh61 ) (fragment) aurantiacus CBS
891.70
ORF Thermoascus AG068294.1
aurantiacus var.
levisporus
copper-dependent polysaccharide Thermomyces CCP37672.1
monooxygenases (Gh61 ) (fragment) dupontii CBS 236.58
copper-dependent polysaccharide Thermomyces CCP37678.1
monooxygenases (Gh61 ) (fragment) lanuginosus CBS
632.91
unnamed protein product Thielavia terrestris CAG27576.1
THITE_2106556 Thielavia terrestris AE062422.1
NRRL 8126
THITE_21 16536 Thielavia terrestris AE067662.1
NRRL 8126
THITE_2040127 Thielavia terrestris AEO64605.1
NRRL 8126
THITE_21 19040 Thielavia terrestris AEO69044.1
NRRL 8126
THITEJ 15795 Thielavia terrestris AE064177.1
NRRL 8126 Nom Organisme Réf. GenBank Réf.
Uniprot
THITE_21 10890 Thielavia terrestris AE064593.1
NRRL 8126
THITE_21 12626 Thielavia terrestris AE065532.1
NRRL 8126
THITE_2076863 Thielavia terrestris AEO65580.1
NRRL 8126
THITE 170174 Thielavia terrestris AE066274.1
NRRL 8126
THITE_2044372 Thielavia terrestris AE067396.1
NRRL 8126
THITE_2170662 Thielavia terrestris AEO68023.1
NRRL 8126
THITE 128130 Thielavia terrestris AE068157.1
NRRL 8126
THITE_2145386 Thielavia terrestris AE068577.1
NRRL 8126
THITE_2054543 Thielavia terrestris AE068763.1
NRRL 8126
THITE_2059487 Thielavia terrestris AE071031 .1
NRRL 8126
THITE_2142696 Thielavia terrestris AE067395.1
NRRL 8126
THITE_43665 Thielavia terrestris AEO69043.1
NRRL 8126
THITE_2085430 (fragment) Thielavia terrestris AE063926.1
NRRL 8126
THITE_2122979 Thielavia terrestris XP_003657366.1
NRRL 8126
cellulase-enhancing factor (GH61 B) Thielavia terrestris ACE10231 .1
NRRL 8126
Séquence 4 from patent US Thielavia terrestris ACE10232.1
7361495 (GH61 C) NRRL 8126
Séquence 4 from patent US Thielavia terrestris ACE10232.1
7361495 (GH61 C) NRRL 8126
Séquence 6 from patent US Thielavia terrestris ACE10233.1
7361495 (GH61 D) NRRL 8126
Séquence 6 from patent US Thielavia terrestris ACE10233.1
7361495 (GH61 D) NRRL 8126
lytic polysaccharide mono-oxygenase Thielavia terrestris AE071030.1
active on cellulose NRRL 8126 ACE10234.1
(131562;TtGH61 E)(GH61 E)
Séquence 10 from patent US Thielavia terrestris ACE10235.1
7361495 (GH61 G) NRRL 8126
Figure imgf000036_0001
Tableau 2 :
LPMOs (familles AA9, AA10 et AA11 de la classification CAZy).
Par « spécificité de substrat », on entend le type de substrat clivé (clivage oxydatif) par l'enzyme LPMO correspondante.
Par « sélectivité connue », on entend le carbone du cycle de glucose oxydé par l'enzyme LPMO correspondante
Par « Modularité », on entend la classe CAZy (AA9, 10 ou 1 1 ) de l'enzyme et la présence connue d'un domaine conservé (CBM ou X278).
Spécificité
Réf. Réf. Sélectivité
Organisme Autres noms de Modularité
Uniprot GenBank connue
substrat
champignons
A. oryzae Q2UA85 BAE61530 AolkkA 1 chitine C1 AA1 1 -X278
A. nidulan EAA AA13- s C8VGF8 62623.1 AnAA13 amidon C1 CBM20
M. MYCTH 1 120
thermophila G2QI82 AEO60271 89 cellulose C1 AA9
M. MYCTH 9266
thermophila G2QAB5 AE056665 8 cellulose C1 AA9
Q7RWN
N. crassa 7 EAA26873 A/CLPM09E cellulose C1 AA9-CBM1
Q1 K8B6
Q8WZQ EAA32426
N. crassa 2 CAD21296 A/CLPM09D cellulose C4 AA9
N. crassa Q7SA19 EAA33178 A/CLPM09M cellulose C1 , C4 AA9
cellulose
hemicellu-
N. crassa Q7SHI8 EAA36362 A/CLPM09C lose C4 AA9-CBM1
EAA26656
N. crassa Q1 K4Q1 CAD70347 A/CLPM09F cellulose C1 AA9
N. crassa Q7SCJ5 EAA34466 NcU00836 cellulose C1 AA9-CBM1
EAA AA13-
N. crassa Q7SCE9 34371 .2 NcAA13 amidon C1 CBM20
N. crassa Q7S439 EAA30263 NcU02240 cellulose C4 AA9-CBM1
N. crassa Q7S1 1 1 EAA29018 NcU07760 cellulose C1 , C4 AA9-CBM1
P.
chrysosporium H1 AE14 BAL43430 PcLPM09D cellulose C1 AA9
PaGH61 A
P. anserina B2B629 CAP73254 PaLMPOB cellulose C1 a, C4a AA9-CBM1
PaGH61 B
P. anserina B2AVF1 CAP68375 PaLMP09A cellulose C1 , C4 AA9-CBM1
AA9
P. anserina B2ARG6 CAP66744 PaLPM09D cellulose C1 CBM1 Spécificité
Réf. Réf. Sélectivité
Organisme Autres noms de Modularité
Uniprot GenBank connue
substrat
AA9 CBM1
P. anserina B2ATL7 CAP67740 PaLPM09E cellulose C1
AA9 CBM1
P. anserina B2B403 CAP71839 PaLPM09F cellulose n.d
AA9 CBM1
P. anserina B2B5J7 CAP73072 PaLPM09G cellulose n.d
AA9 CBM1
P. anserina B2ADG1 CAP64476 PaLPM09H cellulose C1 , C4
T. ABW5645
aurantiacus G3XAP7 1 7aGH61 A cellulose C1 AA9
T. terrestris G2RGE5 AEO71030 cellulose n.d. AA9
T. reesei Q7Z9M7 AAP57753 cellulose n.d. AA9
T. reesei 014405 CAA71999 Cel61 A cellulose n.d. AA9
Bacteria
Bacillus
amyloliquefa- ciens E1 UUV3 CBI42985 n.d. n.d. AA10
Burkholderia BURPS1710b
pseudomallei 01 14
1710b Q3JY22 ABA49030 (BpAAI OA) n.d. n.d. AA10
Bacillus
licheniformes Q62YN7 AAU22121 chitine C1 AA10 β-1 ,4-
Caldibacillus mannanase
cellulovorans Q9RFX5 AAF22274 (ManA) n.d. n.d. AA10
Enterococcus
faecalis Q838S1 AAO80225 E LPMO10A chitine C1 AA10
LPMO
(HcAAI O-
Hahella 2;HCH 00807
chejuensis Q2SNS3 ABC27701 ) cellulose nd AA10
Serratia
marcescens 083009 AAU88202 SmLPMOI OA chitine C1 AA10
Streptomyces cellulose
coelicolor Q9RJC1 CAB61 160 ScLPMOl OB chitine C1 , C4 AA10
Streptomyces AA10- coelicolor Q9RJY2 CAB61600 ScLPMOI OC cellulose C1 CBM2 Spécificité
Réf. Réf. Sélectivité
Organisme Autres noms de Modularité
Uniprot GenBank connue
substrat
Thermobifida cellulose
fusca Q47QG3 AAZ55306 77LPMO10A chitine 01 , 04 AA10
Thermobifida AA10- fusca Q47PB9 AAZ55700 77LPMO10B cellulose 01 CBM2
V.
cholerae O'l Q9KLD5 AAF96709 I/CLPMO10B n.d. n.d. AA10

Claims

REVENDICATIONS
1 . Procédé pour la fabrication de nanocelluloses à partir d'un substrat cellulosique comprenant des fibres de cellulose,
lequel procédé comprend les étapes successives suivantes :
- au moins une étape de traitement enzymatique dudit substrat cellulosique, par la mise en contact avec au moins une enzyme de clivage, puis
- au moins une étape de traitement mécanique dudit substrat cellulosique soumis à ladite au moins une étape de traitement enzymatique, pour délaminer lesdites fibres de cellulose et pour obtenir lesdites nanocelluloses,
caractérisé en ce que ladite au moins une enzyme de clivage est choisie parmi les enzymes appartenant à la famille des mono-oxygénases lytiques de polysaccharides (LPMOs) aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose en présence d'un donneur d'électron.
2. Procédé pour la fabrication de nanocelluloses selon la revendication 1 , caractérisé en ce que les LPMOs sont choisies parmi les enzymes aptes à réaliser un clivage de la cellulose par oxydation de l'un au moins des atomes de carbone en positions Ci , C4 et C6 du cycle de glucose.
3. Procédé pour la fabrication de nanocelluloses selon la revendication 2, caractérisé en ce que les LPMOs sont choisies parmi les familles AA9 et AA1 0 de la classification CAZy.
4. Procédé pour la fabrication de nanocelluloses selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les LMPOs sont choisies parmi les LPMOs issues de Podospora anserina, de préférence parmi PaLPM09A (Genbank CAP68375), PaLPM09B (Genbank CAP73254), PaLPM09D (Genbank CAP66744) PaLPM09E (Genbank CAP67740), PaLPM09F (Genbank CAP71 839), PaLPM09G (Genbank CAP73072), PaLPM09H (Genbank CAP61476).
5. Procédé pour la fabrication de nanocelluloses selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le donneur d'électron est choisi parmi l'ascorbate, le gallate, le catéchol, le glutathion réduit, les fragments de lignine et les carbohydrates déshydrogénases fongiques.
6. Procédé pour la fabrication de nanocelluloses selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le substrat cellulosique est obtenu à partir de bois, d'un végétal fibreux riche en cellulose, de betterave, d'agrumes, de plantes annuelles à paille, d'animaux marins, d'algues, de champignons ou de bactéries.
7. Procédé pour la fabrication de nanocelluloses selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le substrat cellulosique est choisi parmi les pâtes papetières chimiques, de préférence les pâtes papetières de bois chimiques, de préférence encore l'une au moins des pâtes papetières suivantes :
- les pâtes blanchies,
- les pâtes semi-blanchies,
- les pâtes écrues,
- les pâtes au bisulfite,
- les pâtes au sulfate,
- les pâtes à la soude,
- les pâtes kraft.
8. Procédé pour la fabrication de nanocelluloses selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que ladite au moins une étape de traitement mécanique comprend l'un au moins des traitements mécaniques suivants :
- un traitement d'homogénéisation,
- un traitement de microfluidisation,
- un traitement d'abrasion,
- un traitement de cryobroyage.
9. Procédé pour la fabrication de nanocelluloses selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que, suite à ladite au moins une étape de traitement mécanique, ledit procédé comprend une étape de post-traitement, par exemple un traitement acide, un traitement enzymatique, une oxydation, une acétylation, une silylation, ou encore une dérivatisation de certains groupements chimiques portés par les nanocelluloses.
10. Procédé pour la fabrication de nanocelluloses selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que les nanocelluloses obtenues consistent en des nanofibrilles de cellulose et/ou en des nanocristaux de cellulose.
1 1 . Nanocelluloses issues d'un procédé de fabrication selon l'une quelconque des revendications 1 à 10.
12. Nanocelluloses selon la revendication 1 1 , caractérisées en ce que lesdits nanocelluloses comportent des cycles de glucose dont au moins un atome de carbone est oxydé en position(s) Ci et/ou C4, voire également C6.
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