WO2019025449A1 - Procedes de defibrillation de substrats cellulosiques et de fabrication de celluloses utilisant une nouvelle famille de lytic polysaccharide monooxygenases (lpmo) fongiques - Google Patents

Procedes de defibrillation de substrats cellulosiques et de fabrication de celluloses utilisant une nouvelle famille de lytic polysaccharide monooxygenases (lpmo) fongiques Download PDF

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cellulosic
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enzyme
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Bernard Cathala
Jean-Guy BERRIN
Ana VILLARES
Céline MOREAU
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Institut National De La Recherche Agronomique (Inra)
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Definitions

  • the present invention generally relates to the field of celluloses, especially nanocelluloses, and more particularly to processes for the manufacture of cellulosic fibers and defibrillation of cellulosic substrates.
  • Cellulose is one of the most important natural polymers, a virtually inexhaustible raw material, and an important source of sustainable materials on an industrial scale.
  • nanocelluloses have been identified with a dimension of the order of a nanometer, referred to as the generic name of "nanocelluloses”.
  • nanocelluloses in particular their mechanical properties, their ability to form films and their viscosity, give them a major interest in many industrial fields.
  • Nanocelluloses are thus used for example as a dispersant or stabilizer additive in the paper, pharmaceutical, cosmetic or agri-food industries. They are also used in the composition of paints and varnishes.
  • Nanocelluloses are also used in many devices requiring control of nanoscale porosity because of their high surface area.
  • nanocomposite materials based on nanocelluloses are currently being developed. Indeed, the remarkable mechanical properties of nanocelluloses, their nanoscale dispersion as well as their hydrophilic nature, give them excellent gas barrier properties. These characteristics are of particular interest for the manufacture of barrier packaging.
  • the nanocelluloses can be classified mainly in two families: cellulose fibrils and cellulose nanocrystals.
  • Cellulose nanocrystals also known as “crystalline nanocelluloses” or NCCs for “nanocrystalline cellulose" are generally obtained by hydrolysis with a strong acid under strictly controlled conditions of temperature, duration and agitation. Such a treatment makes it possible to attack the amorphous regions of the fibers while leaving the crystalline regions, which are more resistant and intact. The suspension obtained is then washed by successive centrifugations and dialyses in distilled water.
  • NCCs have a length from a few tens of nanometers to approximately 1 ⁇ (in particular from 40 nm to 1 ⁇ and preferably from 40 nm to 500 nm), and a diameter ranging from 5 to 70 nm, preferably less than at 15 nm (typically 5 to 10 nm).
  • Cellulose fibrils commonly referred to as microfibrillated cellulose (or microfibrillated cellulose) or nano fibrils of cellulose (NFC) are typically isolated from cellulosic mass, by mechanical methods to delaminate the cellulose fibers and release the cellulose fibrils.
  • US 4,483,743 discloses a process for producing microfibrillated cellulose, which involves the passage of a liquid suspension of cellulose through a homogenizer type Gaulin high pressure. Repeated passages of the cellulose suspension make it possible to obtain microfibrils typically having a width ranging from 25 to 100 nm and a much longer length.
  • a first pretreatment strategy consists in pretreating the cellulose fibers with cellulases in order to destructure the fiber before the application of the mechanical homogenization treatment.
  • the quality of the nanocelluloses obtained (in particular the state of dispersion and in particular the lateral size of the nanofibrils which conditions the properties of use and the energy yields are very variable.
  • a second pretreatment strategy is based on a chemical oxidation step of the cellulose fibers (for example Saito et al., Biomacromolecules, Vol.8, No. 8, 2007, pp. 2485-2491).
  • the fibers are oxidized with an oxidant such as sodium hypochlorite catalyzed by the 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl radical ("TEMPO") before undergoing the aforementioned mechanical treatment.
  • an oxidant such as sodium hypochlorite catalyzed by the 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl radical ("TEMPO")
  • the oxidative treatment converts the primary alcohol function at the C 6 position of the glucose unit of the cellulose into a carboxylate function, which leads to the introduction of fillers on the surface of the cellulose fibers. These charges create electrostatic repulsions that facilitate delamination and increase its efficiency.
  • nanocellulose production costs remain high, yields uncertain, and quality and properties are variable.
  • WO 2016/193617 teaches processes for manufacturing nanocelluloses, comprising a step of enzymatic treatment of said substrates by a cleavage enzyme belonging to the family of lyophilic monooxygenases of polysaccharides (LPMOs), capable of ensuring an oxidative cleavage said cellulosic fibers.
  • a cleavage enzyme belonging to the family of lyophilic monooxygenases of polysaccharides (LPMOs), capable of ensuring an oxidative cleavage said cellulosic fibers.
  • the present invention aims to provide a method at least partially meeting these expectations.
  • the invention relates to a process for preparing a cellulosic substrate for the manufacture of cellulose fibers, which process comprises at least the following steps:
  • LPMOs polysaccharides
  • said enzyme is a polysaccharide oxidase having an amino acid sequence identity of at least 20% with a reference polypeptide of SEQ ID NO. 1, 2 or 3, from the BLAST-P comparison method, said BLAST-P comparison method resulting in an E-value (E-value) of 10 e- 3 or less.
  • the invention relates to the use of a cellulosic substrate obtained according to the preceding method as a cellulosic raw material for preparing cellulose fibers, in particular nanocellulose, in particular cellulose fibrils and / or cellulose nanocrystals via a defibrillation process, especially mechanical.
  • the invention relates to a method for defibrillation of a cellulosic substrate, which method comprises at least the following steps:
  • the invention relates to a process for producing cellulose fibers, which process comprises at least the following steps:
  • LPMOs polysaccharide lyophilic monooxygenases
  • said enzyme is a polysaccharide oxidase having an amino acid sequence identity of at least 20% with a reference polypeptide of SEQ ID NO. 1, 2 or 3, from the BLAST-P comparison method, said BLAST-P comparison method resulting in an E-value (E-value) of 10 e "3 or less.
  • the invention relates to cellulosic fibers derived from an extraction process, and / or a manufacturing method, as defined above.
  • the cellulose fibers which are particularly considered by the invention are cellulose nanofibers, or nanocelluloses.
  • Figure 1 Phylogenetic tree of the AAxx family demonstrating that members of the AAxx family strongly cluster together and are very distant from the sequences relating to the families AA9, AA10, AA11 and AA13 respectively.
  • Figure 2 Online diagram of the active site of LPMOs of type PcAAxx
  • FIG. 3A-3B consensus sequence based on an alignment of 283 sequences belonging to the catalytic module of AAxx families revealing a first histidine conserved in the family
  • Figure 4 Morphology of cellulosic fibers of birch (A and B) and resinous (C and D) under the action of polysaccharides monooxygenases.
  • Figure 5 Defibrillation state of cellulosic fibers under the action of a polysaccharide monooxygenase (PcAAxxA / SEQ ID No. 1).
  • TEM A and C
  • AFM B and D
  • the object of the invention is to meet these needs.
  • the present invention proposes a process for manufacturing nanocelluloses based on a pretreatment step of cellulose fibers with at least one enzyme belonging to the family of lytic monooxygenases.
  • polysaccharides commonly referred to as "LPMOs” for “Lytic Polysaccharide Monooxygenases”.
  • LPMOs are enzymes whose oxidative function has recently been demonstrated (Vaaje-Kolstad, 2010, Quinlan et al., 2011, Westereng et al., 2011, Horn et al, 2012, Bey et al, 2013). These enzymes, which improve the degradation of lignocellulose (Harris et al., 2010) are found in the latest generation of industrial enzyme cocktails (e.g. Cellic CTec3). These are copper-dependent enzymes that catalyze the oxidative cleavage of cellulose. These enzymes formerly classified in CAZy's GH61 family (“Glycoside Hydrolase”) (www.cazy.org) have been reclassified to the AA9 ("Auxiliary Activity" enzymes) family.
  • This new family of enzymes capable of oxidizing polysaccharides is also referred to herein as a "AAxx" protein family.
  • the inventors characterized structurally the reference protein PcAAxxB (Genbank # KY769370) of P. coccineus by solving the crystallographic structure of its catalytic module at a resolution of 3 ⁇ . They provided a structural model for the identification of all relevant members of this AAxx family of proteins, in addition to the sequence alignment analysis of more than 300 proteins with significant similarities to PcAAxxB.
  • the present invention therefore takes advantage of the particular enzymatic properties of a new class of enzyme with polysaccharide oxidase activity, characterized in that: said enzyme with polysaccharide oxidase activity has an amino acid sequence identity of at least 30% with a reference polypeptide of SEQ ID NO. 1, 2 or 3, from the BLAST-P comparison method, said BLAST-P comparison method resulting in an E-value (E-value) of 10 e -3 or less
  • the inventors have identified a crystallographic structure of the polypeptide of sequence SEQ ID NO 2.
  • the enzymes with polysaccharide oxidase activity according to the invention are characterized by the presence of a conserved active site fixing the copper, also referred to herein as an active site fixing the copper of the "histidine brace” type, formed by two residues Histidine and a Tyrosine one of the two histidine residues being N-terminal histidine after cleavage of the signal peptide.
  • the inventors have shown here that the plurality of proteins belonging to this new AAxx family can be differentiated from other lytic oxygenases of the polysaccharides in that this new AAxx family does not, necessarily, have a module which fixes the carbohydrates (CBM).
  • CBM carbohydrates
  • a polysaccharide oxidizing enzyme such as those identified in the present application can act in synergy with other previously known polysaccharide oxidizing enzymes such as the lytic oxygenases of polysaccharides (generally called LPMOs). to improve the hydrolysis of these polysaccharides.
  • LPMOs polysaccharide oxidizing enzymes
  • the experimental data described here show that the polysaccharide oxidizing enzymes identified by the inventors can target distinct sugar units constituting a polysaccharide (for example cellulose, hemicellulose or lignocellulose), or else can target distinct sugar unit chemical groups. from these targeted by already known LPMOs, such as AA9 (also called GH61), AA10, AAl l and AA13.
  • a polysaccharide for example cellulose, hemicellulose or lignocellulose
  • LPMOs such as AA9 (also called GH61), AA10, AAl l and AA13.
  • the inventors have unexpectedly discovered that the polysaccharide oxidizing enzymes considered according to the invention can act synergistically with cellulases to degrade polysaccharide-containing materials, such as cellulose-containing and lignocellulose-like materials.
  • polysaccharide oxidizing enzymes identified herein can also act synergistically with LPMOs to degrade polysaccharide-containing materials, such as cellulose-containing and lignocellulose-like materials.
  • the polysaccharide oxidizing enzymes of the present invention can be considered either separately or in combination with other enzymes capable of oxidizing or degrading polysaccharides, as well as mixtures thereof.
  • the inventors have identified a new class of polysaccharide oxidizing enzymes that can be used in a variety of processes to degrade polysaccharide-containing materials, and more particularly in a wide variety of processes to degrade lignocellulosic materials.
  • the inventors are of the opinion that the AAxx enzymes of the invention are capable of acting preferentially on the xylans bound to cellulose and more specifically on the xylans having a rigidity and a conformation. similar to the underlying cellulosic chains.
  • the invention thus relates to (i) an original process for preparing a cellulosic substrate; (ii) using the cellulosic substrate thus obtained as a raw material for forming cellulose fibers, especially nanocelluloses; (iii) a method for defibrillating a cellulosic substrate; and (iv) a process for making cellulose fibers.
  • a process for producing cellulose fibers as defined herein may thus consist of the combined implementation of a process for preparing a cellulosic substrate and then a defibrillation process on said prepared substrate.
  • nanocelluloses are aimed at applications in 3 major areas:
  • the nanocrystals are usually stabilized in colloidal suspensions by electrostatic repulsions induced by the presence of surface charges. They can serve as stabilizer of hydrophobic phases and thus enter the composition of paints, varnishes, cosmetics, etc. They can also make it possible to disperse functional agents such as opacifiers for applications (titanium dioxide, for example in paper mills), or reinforcers (clays).
  • Porous materials (foams, aerogels, membranes, etc.):
  • the very large surface area of the nanocelluloses makes it possible to access a control of the porosity of the materials at the nanometric level after drying. This control gives access to various types of applications where porosity or a large specific surface area are key features: filtration membrane, catalytic support, thermal superinsurance.
  • Nanocelluloses have quite remarkable mechanical properties. On the other hand, dispersion at the nanoscale and their hydrophilic nature gives them gas barrier properties. These characteristics pave the way for their use particularly in the field of packaging.
  • the present invention relates to a method for producing nanocelluloses, in particular cellulose fibrils and / or cellulose nanocrystals, from a cellulosic substrate.
  • Cellulose means a linear homopolysaccharide derived from biomass (including organic matter of plant origin, including algae, cellulose of animal origin and cellulose of bacterial origin) and consisting of units (or cycles ) of glucose (D-Anhydroglucopyranose - AGU for "Anhydro glucose unit”) interconnected by glycoside bonds ⁇ - (1-4).
  • the repetition pattern is a glucose dimer also called cellobiose dimer.
  • AGUs have 3 hydroxyl functions: 2 secondary alcohols (on carbons in positions 2 and 3 of the glucose cycle) and a primary alcohol (on carbon in position 6 of the glucose cycle).
  • the combination of the cellobiose dimeric chains forms a nano elemental fibrillar of cellulose (the diameter of which is about 5 nm).
  • the combination of elemental nanofibrials forms a nano-fibril (generally ranging in diameter from 50 to 500 nm, which includes 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 and 500 nm).
  • the arrangement of several of these nanofibrials then forms what is generally called a cellulose fiber.
  • cellulose fiber refers to all of the forms of cellulose that can be obtained after a defibrillation process, or delamination of a cellulosic substrate; which includes cellulose forms having a nanometer dimension, as well as cellulose forms having a larger dimension.
  • nanocellulose refers to the various forms of cellulose having a dimension of the order of one nanometer. This term particularly encompasses according to the invention, two families of nanocelluloses: cellulose nanocrystals and cellulose fibrils.
  • cellulose fibrils are synonymous.
  • Each nano fibril of cellulose contains crystalline parts stabilized by a solid network of inter- and intra-chain hydrogen bonds. These crystalline regions are separated by amorphous regions.
  • NCCs cellulose nanocrystals
  • the NCCs advantageously comprise at least 50% of crystalline part, more preferably at least 55% of crystalline part. They generally have a diameter ranging from 5 to 70 nm (preferably less than 15 nm) and a length ranging from 40 nm to approximately 1 ⁇ m, preferably ranging from 40 nm to 500 nm; which includes 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 and 500 nm.
  • cellulose nanocrystals are synonymous.
  • cellulose whiskers are synonymous.
  • microcrystals or “nanocrystal cellulose” are synonymous.
  • NCCs cellulose nanocrystals
  • polysaccharide-containing material includes a substance or composition comprising polysaccharides.
  • polysaccharide is used in its conventional sense and refers to polymeric carbohydrates composed of long chains of monosaccharides held together by glycosidic linkages. During their hydrolysis, the polysaccharides release the monosaccharides or oligosaccharides constituting them.
  • lignocellulose-containing material refers to a material initially consisting of cellulose, hemicellulose and lignin. This term is synonymous with “lignocellulosic material”. Such material is often referred to as “biomass”.
  • a material containing lignocellulose is an example of a cellulosic substrate capable of forming cellulose fibers, within the meaning of the invention.
  • a "polysaccharide oxidizing enzyme” encompasses polypeptides with the following properties:
  • said polypeptide produces hydrogen peroxide in the presence of oxygen and an electron donor compound, such as ascorbates,
  • said polypeptide increases in a dose-dependent manner, in the absence or in the presence of an electron donor compound, the degradation of a material containing polysaccharides such as lignocellulose, caused by cellulases and / or xylanases,
  • said polypeptide increases in a dose-dependent manner, in the absence or in the presence of an electron donor compound, the degradation of a material containing polysaccharides such as lignocellulose, caused by cellulases, in the presence of a or more LPMOs, such as LPMOs separated into a group comprising AA9, AA10, AA1 1 and AA13.
  • a "polysaccharide oxidizing enzyme” according to the invention has been demonstrated to be particularly effective for oxidizing xylan, and especially xylan absorbed on cellulose.
  • the term "electron donor compound” is used herein in its usual sense for a person skilled in the art.
  • an electron donor compound is a chemical entity capable of donating electrons to another compound.
  • An electron donor compound is a reducing agent because of its ability to donate electrons and is itself oxidized when it gives electrons to another chemical entity.
  • An electron donor compound as specified above for the oxidation properties of polysaccharides includes, but is not limited to, ascorbates and cellobiose dehydrogenases (CDHs).
  • the reducing agent may advantageously be provided by biomass (lignin) which can act as an electron donor.
  • BLAST-P method also called Protein Basic Local Alignment Search Tool method
  • the BLAST-P method has in particular been described in Altschul et al. (1990, Mol Mol, Vol 215 (No. 3): 403-410), Altschul et al. (1997, Nucleic Acids Res, Vol 25: 3389-3402) and Altschul et al. (2005, FEBS J. Vol 272: 5101-5109).
  • the BLAST-P method is preferably used according to the following parameters: (i) Expected threshold: 10; (ii) Word Size: 6; (iii) Max Matches in a Query range: 0; (iv) Matrix: BLOSSUM62; (v) Gap costs: Existence 11, Extension 1; (vi) Compositional Adjustments: Conditional compositional score matrix adjustment, (vii) No f ⁇ lter; (viii) No mask.
  • the score of an alignment, S is calculated as the sum of the substitution and gap scores. Substitution scores are given in a table (see PAM, BLOSUM below).
  • the gap scores are usually calculated as the sum of the G, the opening gap penalty and L, the extension penalty of a gap. For a gap of length n, the cost of a gap would be G + Ln.
  • the choice of gap costs, G and L are empirical, but it is usual to choose a high value for G (10-15) and a low value for L (1-2).
  • Optimal alignment means aligning two sequences with the highest score possible.
  • Amino acid identity represents the extent to which two amino acid sequences have the same residues at the same positions in an alignment, and is often expressed as a percentage.
  • BLOSUM (Blocks Substitution Matrix) matrices are surrogate scoring matrices in which the scores for each position are derived from the observation of the substitution frequency of blocks in local alignments for related proteins. Each matrix is drawn for a particular evolution distance.
  • the alignment from which the scores were derived was created from sequences sharing no more than 62% identity. Sequences that have more than 62% identity are represented by a single sequence in alignment so as not to overrepresent members close to the same family.
  • an E-value (also called Expect Value) is a calculated parameter when the BLAST-P method is used, said parameter representing the number of different alignments with equivalent scores or with better than S of which the appearance is expected during a search in the database by chance.
  • E value also called Expect Value
  • the "percentage identity" between two polypeptides means that the percentage of identical amino acids between the two polypeptide sequences to be compared, obtained after optimal alignment, this percentage being entirely statistical and the differences between the two polypeptide sequences being distributed randomly along their length.
  • the comparison of two polypeptide sequences is traditionally carried out by comparing the sequences after optimally aligning them, the said comparison must be able to be conducted by segment or by using an "alignment window".
  • the optimal alignment of the sequences for their comparison is achieved using the BLAST-P comparison software.
  • the percentage identity between two amino acid sequences is determined by comparing the two optimally aligned sequences within which the nucleic acid sequences to be compared may contain additions or deletions with respect to the sequence of amino acids. reference of the optimal alignment between the two polypeptide sequences.
  • the percentage of identity is calculated by determining the number of positions in which an amino acid is identical between the two sequences, preferably between two complete sequences, and then dividing this number of identical positions by the total number of positions in the window. alignment and multiplying the result by 100 to obtain the percentage identity between the two sequences.
  • polypeptide sequences having at least 20% amino acid identity with a reference sequence include those having at least 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26 %, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 28, 59% , 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76 %, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% and 99% of amino acid identity with said reference sequence.
  • the "percentage identity" between two nucleic acid sequences represents the percentage of identical nucleotide residues between two nucleic acid sequences to be compared, obtained after optimal alignment, this percentage being purely statistical and the differences between the two sequences being distributed randomly over the length of the sequences.
  • the comparison of two nucleic acid sequences is traditionally performed by comparing the sequences after optimally aligning them, said comparison being segmentable or using an "alignment window”. Optimal alignment of the sequences for comparison is performed using the BLAST-N comparison software.
  • the percentage identity between two nucleic acid sequences is determined by comparing the two optimally aligned sequences in which the nucleic acid sequences to be compared may contain additions or deletions with respect to the reference sequence. the optimal alignment between the two sequences
  • the percentage of identity is calculated according to the number of positions at which the nucleotide residues are identical between the two sequences, preferably between the two complete sequences, and then by dividing this number of identical positions by the total number of positions in the alignment window and multiplying the result by 100 to obtain the percentage identity between the two sequences.
  • nucleotide sequences having at least 20% identity with the reference sequence include those having at least 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28 %, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 28%, 59%, 60%, 61% 62% 63% 64% 65% 66% 67% 68% 69% 70% 71% 72% 73% 74% 75% 76% 77% 78 %, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, and 99% nucleotide identity with the reference sequence.
  • an E value of 10 e “3 or less includes the E-value of 1 e “ 3 or less, 1 e “4 or less, 1 e “ 5 or less, 1 e “6 or less, 1 e “7 or less, 1 " 8 or less, 1 "9 or less, 1 " 10 or less, 1 "20 or less, 1 " 30 or less, 1 "40 or less, 1 " 50 or less, 1 "60 or less, 1 " 70 or less, 1 "80 or less, 1 " 90 or less and 1 "100 or less.
  • chemical treatment refers to all chemical pretreatments that allow the separation and / or release of cellulose, hemicellulose and / or lignin.
  • suitable chemical pretreatments include, for example, dilute acids, lime, bases, organic solvents, ammonia, sulfur dioxide, carbon dioxide.
  • wet oxidation and controlled pH hydrothermolysis are also considered chemical pretreatments.
  • the pretreatment methods using ammonia are in particular described in PCT applications WO 2006/110891, WO 2006/110899, WO 2006/110900, and WO 2006/110901.
  • mechanical pretreatment refers to all mechanical (or physical) treatments that allow the separation and / or release of cellulose, hemicellulose and / or lignin from a material containing lignocellulose .
  • mechanical pretreatments include different types of grinding, irradiation, steam explosion and hydrothermolysis.
  • Mechanical pretreatment includes fragmentation of a solid (comminution or mechanical size reduction). Solid fragmentation includes dry milling, wet milling and vibratory milling techniques. Mechanical pretreatment may also include high pressures and / or high temperatures (steam explosion). In some representations of the pretreatment step, said step may combine mechanical and chemical pretreatment.
  • biological pretreatment refers to all biological treatments that allow the separation and / or release of cellulose, hemicellulose and / or lignin from a material containing lignocellulose.
  • Biological pretreatments may involve the application of microorganisms capable of solubilizing lignin (see, for example, Hsu, 1996, Pretreatment of Biomass, in Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212, Ghosh and Singh, 1993, Physicochemical and biological treatments for enzymatic / microbial conversion of lignocellulosic biomass, Adv ApplMicrobiol 39: 295-333, McMillan, 1994, Pretreating lignocellulosic biomass: a review, in Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, Himmel, Baker, and Overend, eds., ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Washington,
  • the invention relates to a process for preparing a cellulosic substrate for the manufacture of cellulose fibers, which process comprises at least the following steps:
  • LPMOs polysaccharides
  • said enzyme has an amino acid sequence identity of at least 20% with a reference polypeptide of SEQ ID NO. 1, 2 or 3, from the BLAST-P comparison method, said BLAST-P comparison method resulting in an E-value (E-value) of 10 e "3 or less.
  • the invention relates to the use of a cellulosic substrate prepared according to the preceding method, as cellulosic raw material for preparing cellulose fibers, in particular nanocellulose, in particular cellulose fibrils and / or of cellulose nanocrystals via a defibrillation process, especially mechanical.
  • the invention relates to a process for extracting cellulose fibers, which process comprises at least the following steps:
  • the invention relates to a process for manufacturing cellulose fibers, which process comprises at least the following steps:
  • LPMOs polysaccharide lyophilic monooxygenases
  • polysaccharide oxidase active enzyme has an amino acid sequence identity of at least 20% with a SEQ reference polypeptide
  • Said enzyme with polysaccharide oxidase activity is mixed with the cellulosic substrate, so as to allow contact between said at least one enzyme and the cellulose fibers.
  • the enzymatic treatment step is preferably carried out with gentle stirring, so as to ensure good dispersion of the enzymes within the fibers.
  • This enzymatic treatment step is for example carried out for a period ranging from 24 to 72 hours (preferably 48 hours).
  • the enzymatic treatment step is carried out at a temperature ranging from 30 to 50 ° C, in particular from 30 to 45 ° C.
  • the pH of the reaction conditions of the enzyme in contact with the cellulosic substrate is generally between 3 and 7, which includes between 4 and 7, and especially between 4 and 6.
  • said at least one LPMO enzyme can be added to the cellulosic substrate in a ratio (or ratio) enzyme / cellulose ranging from 1: 1000 to 1: 50, in particular from 1: 500 to 1: 50 or 1: 100. at 1:50 or from 1: 1000 to 1: 500, from 1: 500 at 1: 100.
  • said at least one LPMO enzyme is used at a concentration ranging from 0.001 to 10 g / l, in particular from 0.1 to 5 g / l, and more preferably from 0.5 to 5 g / l.
  • the cellulosic substrate is subjected to at least two (or only two) successive enzymatic treatment steps (in series, advantageously separated by a rinsing step).
  • the LPMO or LPMOs implemented during each of these enzymatic treatment steps are identical or different; the conditions (in particular the enzyme / substrate ratio) are identical or different between these successive steps.
  • tests for cleavage of the cellulose with an LPMO enzyme according to the invention can be carried out according to the following protocol:
  • a cleavage test can be performed in a volume of 300 ⁇ l of liquid containing 4.4 ⁇ l of LPMO enzyme and 1 mM of ascorbate and 0.1% (weight / volume) of cellulose powder swollen with phosphoric acid (PASC phosphoric acid-swollen cellulose - prepared as described in Wood TM, Methods Enzym 1988, 160: 19-25) in 50 mM of sodium acetate buffer at pH 4.8 or 5 ⁇ l of cello-oligosaccharides ( Megazyme, Wicklow, Ireland) in 10 mM sodium acetate buffer at pH 4.8.
  • PASC phosphoric acid-swollen cellulose - prepared as described in Wood TM, Methods Enzym 1988, 160: 19-25 in 50 mM of sodium acetate buffer at pH 4.8 or 5 ⁇ l of cello-oligosaccharides ( Megazyme, Wicklow, Ireland) in 10 mM sodium acetate buffer at pH 4.8.
  • the enzymatic reaction can be carried out in a 2 ml tube incubated in a thermomixer (Eppendorf, Montesson, France) at 50 ° C. and 580 rpm (rotation per minute).
  • the fibers are contacted with enzymes (at a concentration of between 1 and 5 g / L and at ratios of enzyme / cellulose of 1: 50, 1: 100, 1: 500 and 1: 1000) and ascorbate (2 mM) and then gently stirred for 48 hours at 40 ° C.
  • enzymes at a concentration of between 1 and 5 g / L and at ratios of enzyme / cellulose of 1: 50, 1: 100, 1: 500 and 1: 1000
  • ascorbate 2 mM
  • the sample After 16 hours of incubation, the sample is heated at 100 ° C. for 10 minutes in order to stop the enzymatic reaction, and then centrifuged at 16,000 rpm for 15 minutes at 4 ° C. in order to separate the solution fraction. of the remaining insoluble fraction.
  • the treated fibers are then subjected to a mechanical action with a homogenizer-disperser (Ultra-Turrax power 500 W, maximum speed during 3 minutes), followed by sonication for 3 minutes.
  • a homogenizer-disperser Ultra-Turrax power 500 W, maximum speed during 3 minutes
  • the said processes are characterized in that the cellulose fibers obtained at the end of the process are cellulose nanofibers.
  • said methods are characterized in that the electron donor is selected from ascorbate, gallate, catechol, reduced glutathione, lignin fragments and fungal carbohydrate dehydrogenases; and preferably ascorbate.
  • the said processes are characterized in that the cellulosic substrate is obtained from wood, a fibrous plant rich in cellulose, beetroot, citrus fruits, annual straw plants, animals marine, algae, fungi or bacteria.
  • the said processes are characterized in that the cellulosic substrate is chosen from chemical papermaking pastes, preferably chemical wood papermaking pastes, and preferably at least one of the following papermaking pastes: pasta bleached, semi-bleached pasta, unbleached pasta, sulphite pulp, sulphate dough, soda dough, kraft pulp.
  • chemical papermaking pastes preferably chemical wood papermaking pastes, and preferably at least one of the following papermaking pastes: pasta bleached, semi-bleached pasta, unbleached pasta, sulphite pulp, sulphate dough, soda dough, kraft pulp.
  • the said processes are characterized in that the cellulosic substrate is a paper pulp derived from wood, annual plants or fiber plants.
  • the said methods are characterized in that the said at least one mechanical treatment step comprises at least one of the following mechanical treatments:
  • the said methods are characterized in that, following said mechanical treatment step, said method comprises a post-treatment step chosen from: an acid treatment, an enzymatic treatment, an oxidation, an acetylation, a silylation or a derivatization of chemical groups carried by said cellulose fibers.
  • a post-treatment step chosen from: an acid treatment, an enzymatic treatment, an oxidation, an acetylation, a silylation or a derivatization of chemical groups carried by said cellulose fibers.
  • the invention relates to cellulosic fibers resulting from a defibrillation process and / or a process for producing cellulose fibers as defined above.
  • Said cellulosic fibers can be characterized in that said cellulose fibers, preferably nanocellulose, comprise glucose rings of which at least one carbon atom is oxidized in position (s) Ci and / or C 4 , or even C 6 .
  • the cellulosic fibers are nano fibrils of cellulose. Mechanical treatment step (s)
  • the cellulosic substrate brought into contact with said enzyme is then subjected to at least one mechanical treatment step which is intended to delaminate the cellulose fibers to obtain the nanocelluloses.
  • Delamination also called “fibrillation” or “defibrillation” consists in separating, by a mechanical phenomenon, the cellulose fibers within the cellulosic substrate, in particular for the manufacture of nanocelluloses.
  • the oxidative cleavage of the cellulose fibers catalyzed by the at least one LPMO facilitates the delamination of these cellulose fibers during the mechanical treatment step.
  • This mechanical delamination step of the cellulose fibers can then be carried out under less stringent conditions and therefore less expensive in terms of energy.
  • the use of LPMOs according to the invention makes it possible to introduce into the cellulose fibers charged groups inducing electrostatic repulsions, without contamination with treatment reagents, as when using TEMPO reagents.
  • a mechanical treatment may be chosen from mechanical treatments for homogenization, microfluidization, abrasion, or cryomilling.
  • the homogenization treatment involves the passage of the pretreated cellulosic substrate, typically a cellulose pulp or a liquid suspension of cellulose, through a narrow space under high pressure (as described for example in US Pat. No. 4,486,743).
  • the pretreated cellulosic substrate typically a cellulose pulp or a liquid suspension of cellulose
  • This homogenization treatment is preferably carried out using a Gaulin type homogenizer.
  • the pretreated cellulosic substrate typically in the form of a cellulose suspension
  • the pretreated cellulosic substrate is pumped at high pressure and dispensed through a small orifice automatic valve.
  • a rapid succession of valve openings and closures subject the fibers to a large pressure drop (typically at least 20 MPa) and high speed shear action followed by high velocity deceleration impact.
  • the passage of the substrate into the orifice is repeated (generally 8 to 10 times) until the cellulose suspension becomes stable.
  • cooling water is generally used.
  • This homogenization treatment can also be implemented using a micro-fluidizer type device (see, for example, Sisqueira et al., Polymer 2010 2 (4): 728-65).
  • a micro-fluidizer type device see, for example, Sisqueira et al., Polymer 2010 2 (4): 728-65.
  • the cellulose suspension passes through a thin chamber typically shaped "z" (whose channel dimensions are generally between 200 and 400 ⁇ ) under high pressure (about 2070 bar).
  • the high shear that is applied generally greater than 10 7 .s _1) allows to obtain very fine nanofibrils.
  • a variable number of passages for example from 2 to 30, in particular from 10 to 30 or from 5 to 25, and in particular from 5 to 20
  • chambers of different sizes may be used to increase the degree of fibrillation.
  • Applied Physics A89 (2): 461-66) is based on the use of a grinding device capable of exerting shear forces provided by grinding stones.
  • the pretreated cellulosic substrate generally in the form of a cellulose pulp, is passed between a static grinding stone and a rotating grinding stone, typically at a rate in the order of 1500 rotations per minute (rpm). Several passes (usually between 2 and 5) may be necessary to obtain nano-sized fibrils.
  • a mixer-type device (for example as described in Unetani K et al., Bio Macromolecules 2011, 12 (2), pp.348-53) can also be used to produce microfibrils from the pretreated cellulosic substrate, for example from a suspension of wood fibers.
  • the method of defibrillating and / or fabricating cellulose fibers comprises at least one post-treatment step of the cellulosic substrate, carried out after said substrate has been mechanically processed.
  • said at least one post-treatment step aims to increase the degree of fibrillation of the celluloses (in particular nanocelluloses) obtained and / or to confer on said nanocelluloses new mechanical properties, depending on the intended applications.
  • Said at least one post-treatment step can in particular be chosen from an acid treatment, an enzymatic treatment, an oxidation, an acetylation, a silylation, or a derivatization of certain chemical groups carried by the micro-fibrils.
  • the cellulosic substrate can be obtained according to the invention from any biomass material (including organic matter of plant origin, including algae, animal or fungal) comprising cellulosic fibers (ie cellulose fibers). ).
  • biomass material including organic matter of plant origin, including algae, animal or fungal
  • cellulosic fibers ie cellulose fibers.
  • the cellulosic substrate is advantageously obtained from wood (of which cellulose is the main component), but also from any fibrous plant rich in cellulose, such as, for example, cotton, flax, hemp, bamboo, kapok, coconut fiber (coir), ramie, jute, sisal, raffia, papyrus and certain reeds, sugarcane bagasse, beetroot (including beet pulp), citrus fruits, stems maize or sorghum, or annual straw plants.
  • wood of which cellulose is the main component
  • any fibrous plant rich in cellulose such as, for example, cotton, flax, hemp, bamboo, kapok, coconut fiber (coir), ramie, jute, sisal, raffia, papyrus and certain reeds, sugarcane bagasse, beetroot (including beet pulp), citrus fruits, stems maize or sorghum, or annual straw plants.
  • the cellulosic substrates can also be obtained from marine animals (such as tunicate for example), algae (such as for example Valonia or Cladophora) or bacteria for bacterial cellulose (for example bacterial strains of Gluconacetobacter types). .
  • marine animals such as tunicate for example
  • algae such as for example Valonia or Cladophora
  • bacteria for bacterial cellulose for example bacterial strains of Gluconacetobacter types.
  • cellulose from primary walls such as the parenchyma of fruits (for example beetroot, citrus fruits, etc.) or secondary walls, such as wood, will be chosen.
  • the cellulosic substrate advantageously consists of a cellulosic material prepared by chemical or mechanical means, from any cellulosic source as mentioned above (and in particular from wood).
  • the cellulosic substrate is advantageously in the form of a suspension of cellulose fibers in a liquid medium (preferably an aqueous medium), or a cellulose pulp.
  • the cellulose pulps may be packaged in the "dry" state, ie typically in a state of dryness greater than or equal to 80%, especially greater than or equal to 90%).
  • the cellulose pulp can then be redispersed in an aqueous medium by mechanical treatment.
  • the cellulosic substrate contains at least 90%, especially at least 95% and preferably 100% of cellulosic fibers.
  • the cellulosic substrate is suitable for the manufacture of paper or of a cellulosic product.
  • the cellulosic substrate is thus preferably chosen from papermaking pulps (or paper pulp), and in particular chemical pulps.
  • the cellulose pulp may contain, in association with the cellulose fibers, hemicellulose and lignin.
  • the cellulose pulp contains less than 10% and especially less than 5% of lignin and / or hemicellulose.
  • the chemical papermaking pulps contain almost exclusively or exclusively cellulose fibers.
  • the paper pulp may be chosen from at least one of the following paper pulps: blanched pastes, semi-bleached pastes, unbleached pastes, sulphite pastes (unbleached or bleached), sulphate pastes (unbleached or bleached) , pasta with soda (unbleached or blanched) and kraft pasta.
  • dissolving pastes having a low proportion of hemicellulose, preferably less than 10% and in particular less than or equal to 5%.
  • the paper pulps used in a process of the invention are wood pulps, in particular chemical wood pulp.
  • the cellulosic substrate is a paper pulp derived from wood, annual plants or fiber plants.
  • a material containing lignocellulose, as defined below, is an example of a cellulosic substrate particularly considered according to the invention.
  • the material containing lignocellulose contains at least 30%> wt. %, preferably at least 50 wt. %, even more preferably, at least 70% wt. %, and even more preferably at least 90%) wt. % lignocellulose. It is noted that lignocellulose-containing material may also contain other components such as protein material, starch, sugars, such as fermentable sugars and / or non-fermentable sugars.
  • Materials containing lignocellulose may be any material containing lignocellulose.
  • the material containing lignocellulose contains at least 30% wt. %, preferably at least 50 wt. %, even more preferably, at least 70% wt. %, and even more preferably at least 90% wt. % lignocellulose. It is important to understand that material containing the lignocellulose may also contain other components such as protein material, starch, sugars, such as fermentable sugars and / or sugars that can not ferment.
  • the material containing lignocellulose is usually present, for example, in stems, leaves, bran, envelopes and spines of plants or leaves, branches, and wood of trees.
  • the material containing the lignocellulose may also be herbaceous material, agricultural and forestry residues, municipal solid waste, paper waste, and pulp and paper mill residues.
  • lignocellulose-containing material may be in the form of plant cell wall material containing lignin, cellulose, and hemicellulose in a mixed matrix.
  • the lignocellulose-containing material is a lignocellulosic biomass selected from the group consisting of: grass, switchgrass, spartin, ryegrass, false bald beech, miscanthus, moss residues. sugar processing, sugarcane bagasse, agricultural waste, rice straw, rice husk, barley straw, corn cob, cereal straw, wheat straw, straw, canola, oat straw, oat hull, corn stover, soy flour, corn flour, forestry waste, recycled wood pulp fiber, paper sludge, sawdust , hardwood, softwood, agave and its combinations.
  • the lignocellulose-containing material is selected from the group consisting of: corn meal, corn fiber, rice straw, pine wood, wood chips, poplar, bagasse , paper and waste processing pulp.
  • the material containing the lignocellulose is a lignocellulosic biomass based on wood.
  • material containing lignocellulose include hardwood such as poplar and birch, softwood, cereal straw such as wheat straw, perennial millet, municipal solid waste, organic industrial waste, office papers and a mixture of these.
  • the material containing lignocellulose is selected from pine, poplar and wheat straw.
  • LPMO type enzyme according to the invention (AAxx family)
  • An enzyme according to the invention is defined as an enzyme with polysaccharide oxidase activity, said enzyme having an amino acid sequence identity of at least 20% with a reference polypeptide of SEQ ID NO. 1, 2 or 3, from the BLAST-P comparison method, said BLAST-P comparison method resulting in an E-value (E-value) of 10 e ⁇ 3 or less.
  • said polysaccharide oxidase activity enzyme has an amino acid sequence identity of at least 30% with a reference polypeptide of SEQ ID NO. 1, 2 or 3, from the BLAST-P comparison method, said BLAST-P comparison method resulting in an E-value (E-value) of 10 e- 3 or less.
  • said polysaccharide oxidase active enzyme has an amino acid sequence identity of at least 60% with a reference polypeptide of SEQ ID NO. 1, 2 or 3, from the BLAST-P comparison method, said BLAST-P comparison method resulting in an E-value (E-value) of 10 e- 3 or less.
  • said polysaccharide oxidase active enzyme has an amino acid sequence identity of at least 90% with a reference polypeptide of SEQ ID NO. 1, 2 or 3, from the BLAST-P comparison method, said BLAST-P comparison method resulting in an E-value (E-value) of 10 e- 3 or less.
  • said polysaccharide oxidase-active enzyme has an amino acid sequence identity of at least 90%> with a reference polypeptide of SEQ ID NO 1, from the BLAST-P comparison method. , said BLAST-P comparison method resulting in an E-value (E-value) of 10 e "3 or less.
  • said polysaccharide oxidase active enzyme has an amino acid sequence identity of at least 90%> with a reference polypeptide of SEQ ID NO 2, from the BLAST-P comparison method. , said BLAST-P comparison method resulting in an E-value (E-value) of 10 e "3 or less.
  • said enzyme with polysaccharide oxidase activity has an amino acid sequence identity of at least 90% with a reference polypeptide of SEQ ID NO 3, from the BLAST-P comparison method, said BLAST-P comparison method resulting in an E-value (E-value) of 10 e- 3 or less.
  • said polysaccharide oxidase active enzyme is encoded by a nucleic acid having at least 90% sequence identity with a nucleic acid selected from the group consisting of SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. And SEQ ID NO. 6.
  • said enzyme with polysaccharide oxidase activity is chosen from the group comprising polypeptides having one of the following GenBank references: ALO60293.1; CCA68158.1; CCA68159.1; CCA68161.1; CCA71530.1; CCA72554.1; CCA72555.1; CCO30796.1; CCT73728.1; CDM26384.1; CD076981.1; CD076983.1; CDO76990.1; CDR41535.1; CDZ98469.1; CDZ98532.1; CDZ98792.1; CDZ98793.1; CEJ62913.1; CEJ80690.1; CEL55274.1; CEL55761.1; CEN61973.1; CEQ41736.1; CRL20539.1; CUA74138.1; CUA75968.1; EEB87294.1; EEB88604.1; EEB93106.1; EGU12035.1; EGU79270.1; EJU02917.1; EJU04796.1; EJU04797.1
  • KIJ93961.1 KIKO 1335.1; KIKO 1364.1; KIK03019.1; KIK24220.1; KIK24223.1; KIK45012.1; KIK47453.1; KIK58046.1; KIK60325.1; KIK64405.1; KIK64418.1;
  • said enzyme with polysaccharide oxidase activity consists of a recombinant protein.
  • said recombinant protein is produced in a yeast which has been genetically transformed to produce said recombinant enzyme with polysaccharide oxidase activity.
  • said polysaccharide oxidase active enzyme having an amino acid sequence comprising, or even consisting of in, SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO. 3, and / or at least one of the enzymes identified by their GenBank number above.
  • said polysaccharide oxidase active enzyme is encoded by a nucleic acid having a nucleic acid sequence selected from a group comprising SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. And SEQ ID NO. 6.
  • the cellulosic support in question can be put into contact with a plurality of enzymes with polysaccharide oxidase activity according to the invention, and more particularly a plurality of enzymes with polysaccharide oxidase activity comprising a sequence amino acid comprising, or even consisting of, SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO. 3, and / or at least one of the enzymes identified by their GenBank number above.
  • the cellulosic support considered can be put into contact with a plurality of enzymes with polysaccharide oxidase activity according to the invention, and more particularly a plurality of enzymes with polysaccharide oxidase activity coded by a nucleic acid selected from a group of SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, and SEQ ID NO. 6, and / or at least one of the enzymes identified by their GenBank number above.
  • said enzyme with polysaccharide oxidase activity is used in a composition with polysaccharide oxidase activity.
  • said plurality of polysaccharide-oxidase active enzymes comprises between 2 and 10 distinct polysaccharide oxidase enzymes, which includes 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 , 10, enzymes with distinct polysaccharide oxidase activity.
  • a polysaccharide oxidase-active composition is capable of comprising one or more other polysaccharide oxidase activity enzymes selected from LPMOs, including enzymes selected from a group consisting of: AA9, AA10, AA11 and AA13 LPMOs Methods for identifying polypeptides belonging to the AAxx family
  • the inventors describe here the crystallographic structure of the catalytic modulus PcAAxxB (JGI ID 1372210, GenBank ID # KY769370) belonging to an enzyme with polysaccharide oxidase activity. Also disclosed are nearly 300 enzymes with polysaccharide oxidase activity according to the invention, which belong to the same enzymatic family, including the polypeptides of sequence SEQ ID No. 1, SEQ ID NO.
  • sequence SEQ ID No. 3 corresponds to the polypeptide SEQ ID No. 3
  • bioinformatic methods exist for identifying new variants forming part of the so-called new family of LPMOs, by implementing, on the one hand, in silico modeling based on the said crystallographic structure, and on the other hand apart from said sequence alignments.
  • programs capable of producing such three-dimensional models include:
  • SWISS-MODEL homology-modeling server see Biasini M, Bienert S, Waterhouse A, Arnold K, Studer G, Schmidt T, Kiefer F, Cassarino TG, Bertoni M, Bordoli L, Schwede T (2014) SWISS-MODEL: modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information (Nucleic Acids Research 2014 (1 July 2014) 42 (W1): W252-W258).
  • enzymes with polysaccharide oxidase activity according to a method comprising the following steps: al) identifying one or more polypeptides that may have polysaccharide oxidase activity;
  • a2 identifying experimental coordinates of a main chain of a reference polypeptide, including or not the positions of the side chains, said main chain and / or said side chains being included in a polypeptide of sequence SEQ ID NO. 2 or SEQ ID NO. 7, or a fragment thereof with polysaccharide oxidase activity;
  • a3) identifying a sequence alignment of one or more of said candidate polypeptides with a reference polypeptide having a sequence identity of 20% or more with SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO 3 or SEQ ID No. 7 according to the BLAST-P comparison method, characterized in that said one or more candidate polypeptides have an E-value of 10 e -3 or less;
  • the nucleotide sequence was synthesized by codon optimization from P. pastoris (GenScript, Piscataway, USA, and ensuie inserted with the native signal sequence into a pPICZaA vector (Invitrogen, Cergy-Pontoise, France) using the BstBl and Xbal restriction, in phase with the C-terminal (His) 6 tag sequence
  • P. pastoris X33 strain and the pPICZaA vector are components of the Easy Select Expression System (Invitrogen), and all media and protocols are described in the manufacturer's manual (Invitrogen).
  • the cells are then transferred to 400 ml of BMMY containing 1 ml.l -1 of PTM4 salts at 20 ° C. with shaking (200 rpm) for 3 days, supplemented with 3% (v / v) of methanol each day.
  • the transformant producing the greatest amount of protein was selected for the bioreactor culture. This is carried out in fermenters of the New type Brunswick BioFlo 115 containing 1.3L (Eppendorf, Hamburg, Germany) according to the fermentation protocol of P. pastoris (Invitrogen) containing some modifications.
  • P. pastoris is cultivated in solid YPD agar medium (20 ⁇ l-1 peptone, 10 ⁇ l-1 yeast extract, 20 ⁇ l-1 glucose, 20 ⁇ l-1 agar). 100 ml of BMGY medium contained in a flask of 500 ml were inoculated from an isolated colony of P. pastoris and incubated at 30 ° C.
  • the first step of the batch culture is in 400 mL of minimum medium containing 40 ⁇ L-1 glycerol; 26.7 ml.L-1 H 3 P04; 14.9 ⁇ L-1 MgSO 4 .7H 2 O; 0.93 ⁇ L-1 CaSO 4 .2H 2 O; 7.7 gL-1 KCl; 4.13 ⁇ L-1 KOH; 4.35 mL.L-1 TMP 1 solution (6 gL-1 CuSO 4 .5H 2 O, 0.08 gL-1 Nal, 3 gL-1MnSO 4 .H 2 O, 0.2 gL-1 Na 2 MoO 4 .2H 2 O, 0.02 gL-1 H 3 BO 3 0.5 ⁇ L-1 CoCl 2, 20 ⁇ L-1 ZnCl 2 .7H 2
  • the second phase begins with the simultaneous addition of 50 g of sorbitol and 0.5%) of methanol (v / v) to the bioreactor so that the yeasts switch on metabolism of methanol (about 5 hours).
  • stirring is increased to 500 rpm and the pH is gradually increased to pH6 by adding ammonium hydroxide (28% ov / v).
  • the induction phase begins with the addition of a methanol solution containing 12 ml.L-1 of PTM1 salts (containing copper) in a "fed-batch" mode.
  • the initial flow rate is 1.47 mL.h-1 and is increased after about 14 hours of incubation at 2.94mL.hl.
  • the induction phase is carried out at 20 ° C. and the dissolved oxygen concentration is maintained at 20% by stirring (800 rpm), gas flow (0.2-1 vvm) and the oxigen (0-50%) cascade. ). The induction phase is continued for 144h.
  • the supernatants of the culture are recovered after centrifugation at 2700 g for 5 min at 4 ° C. and are passed through 0.45 ⁇ filters (Millipore, Molsheim, France) in order to remove the remaining cells.
  • the pH is adjusted to 7.8 and the supernatants are filtered a second time through filters of 0.2 ⁇ before being deposited in an HP His Trap column of 5 mL (GE healthcare, Bue, France) connected to the Akta system Xpress (GE Healthcare).
  • the column is equilibrated in a buffer containing 50 mM Tris HCl pH 7.8 and 150 mM NaCl (buffer A) before charging.
  • the column is washed with 5 column volumes (CV) of buffer A containing 10 mM of imidazole. The elution is then carried out by the passage of 5 CV of buffer A containing 150 mM of imidazole.
  • the fractions containing the purified protein are assembled and concentrated using a 3kDa vivaspin concentrator (Sartorius, Palaiseau, France) before being loaded into a HiLoad 16/600 Superdex 75 Prep Grade column (GE Helthcare) for separation in 50 mM buffer acetate at pH 5.2. Gel filtration analysis showed that PcAAxx proteins are monomeric in solution even after addition of copper.
  • the salts contained in the culture medium are diluted 10 times in 20 mM Tris-HCl pH 8 and the proteins are then concentrated using a Pellicon-2 cassette with an off of lOkDa ( Millipore) to a volume of approximately 200 mL that will be loaded into a DEAE High Prep 20 mL column (GE Healthcare).
  • the proteins are then eluted from the column in a linear gradient of 1M NaCl (0 to 700mM in 200mL).
  • the fractions are then analyzed by SDS-PAGE for the presence of the recombinant protein and the fractions containing the protein are collected in the same sample and concentrated.
  • the concentrated proteins are finally incubated overnight in a solution containing their molar equivalent of copper before another separation step using a HiLoad 16/600 Superdex 75 Prep Grade column in 50 mM acetate buffer pH 5.2. Finally the fractions containing the purified proteins are collected in the same sample and concentrated with a 3kDa vivaspin concentration column (Sartorius).
  • the purified PcAAxxB proteins (JGI ID 1372210, GenBank ID # KY769370) are concentrated with a Vivaspin 10kDa concentrator in polyethersulfone (Sartorius). Protein concentration is determined by measuring ⁇ 280 nm of the solution with a Nanodrop ND-2000 (Wilmington, Delaware, USA). All the crystallization experiments were carried out at 20 ° C. by the seated droplet technique (diffusion by steam) in a 96-well crystallization plate (Swissci) with a crystallization robot mosquito® Crystal (TTP labtech).
  • the reservoirs contain 40 ⁇ l of commercial screening solution and the crystallization drops are prepared by mixing 100 ⁇ l of reservoir solution with 100, 200 and 300 ⁇ l of solution containing the protein to be crystallized.
  • a first result was obtained after one week from one of the conditions prepared with Screen AmSO 4 solution (Qiagen) containing 2.4 M (NH 4) 2 SO 4 and 0.1 M citric acid pH 4.
  • this crystallization condition was optimized by mixing the protein solution at 28 mg.mL-1 with a precipitation solution composed of 2.4 M (NH 4) 2 S 04 and 0.1 M citric acid at pH 4.4 in a volume ratio of 3: 1.
  • the crystals of PcAAxxB are generated in one week at the dimension of 0.15x0.15x0.05 mm.
  • the crystals belong to the P41212 space group and have 204x204x 110 ⁇ axes and 2 molecules per asymmetric unit.
  • AT 5 Data collection, structure determination and refinement
  • the crystals of PcAAxx are incubated for 5 min in a solution of 2.4M Li 2 SO 4 to replace the 2.4M of (NH 4) 2 SO 4 in the stock solution prior to instant cooling in liquid nitrogen.
  • a derived crystal is obtained by introducing a heavy atom by incubating the crystals in the reservoir solution supplemented with 55 mM gadoteridol-gadolinium complex (Gd) before cooling.
  • the initial diffraction data were collected with a beamline light line ID23-1, while the MAD data was collected with a beamline ID30B light line at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF), Grenoble, France.
  • ESRF European Synchrotron Radiation Facility
  • the data was then indexed and integrated into the P41212 space group using XDS.
  • the necessary data processing was carried out with the CCP4 program suite.
  • the determination of the GD3 + substructure and the subsequent phasing combined with solvent flattening was done with SHELXC / D / E, and using the S AD data collected on the edge of the Gd which allowed obtain a correlation coefficient of 71.8%.
  • the P. coccineus AAxx sequences (Genbank ID KY769369 and KY769370) were compared to the non-redundant sequence database of NCBI with BlastP (29) in February 2016. Blast analyzes from AAxx have not been performed. allowed to find AA9s, AAlOs, AAl ls, or AA13s with significant scores, and vice versa. MUSCLE has been used to achieve multiple alignments. In order to avoid interference due to the presence or absence of additional residues, signal peptides and C-terminal extensions have been removed. Bioinformatic analyzes were performed from 286 fungal genomes previously sequenced and shared by JGI collaborators.
  • Protein clusters are available through JGI (https://goo.gl/ZAa2NX) for each variety of fungi. 100 protein alignments from selected protein clusters were previously cleaned and merged to generate a phylogenetic tree. These clusters are present in one copy, as far as possible, in one copy in all varieties of fungi to improve the score / l / n (n represents the number of copies in the genome). Sequences from the clusters were mafft aligned and cleaned with Gblocks, and the phylogenetic tree was generated by concatenating alignments with Fasttree. The tree is visualized with Dendroscope and Bio :: phylo.
  • AAxx enzymes were loaded with copper from copper salts (sulfate or acetate) during or after purification. Proteins were incubated with 10 molar equivalents of copper salts between 2h and overnight at 4 ° C. Excess copper was then removed by diafiltration with 3kDa centricons or by gel filtration chromatography. The presence of copper can be determined by Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (ICP-MS), as described below.
  • ICP-MS Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry
  • the samples Prior to analysis, the samples are mineralized in a mixture containing 2/3 nitric acid (Sigma-Aldrich, 65% purissime) and 1/3 hydrochloric acid (Fluka, 37%, Trace Select) at 120 ° C. .
  • Residues are diluted in ultrapure water (2 mL) prior to ICP-MS analysis.
  • the instrument for ICP-MS analysis is ICAP Q (ThermoElectron, Les Ullis, France), equipped with a collision chamber.
  • the calibration curve is obtained by diluting a certified multi-element solution (Sigma-Aldrich).
  • Aqueous dispersions of Kraft cellulose fibers are adjusted to pH 5.2 in acetate buffer (50 mM) in a final reaction volume of 5 mL.
  • the polypeptide of sequence SEQ ID No. 1 (LPMO AAxx) is added to the fibers at a final concentration of 20 mg.g- 1 in the presence of 1 mM ascorbic acid.
  • Enzyme is performed at 40 ° C with gentle stirring for 48 hours.
  • the samples are then dispersed by a Polytron PT2100 Kinematica AG homogenizer, Germany) for 3 minutes, and then sonicated with a QSonica Q700-type sonicator (20 kHz, QSonica LLC, Newtown, USA) at 350 W ultrasonic power.
  • the reference sample is subjected to the same treatment, in the absence of enzyme.
  • the cellulose fibers (reference and treated with PcAAxx) are deposited on a glass slide and observed by polarizing microscope BX51 (Olympus France SAS) with a 4x objective. Images are taken with a U-CMAD3 type camera (Olympus Japan).
  • AFM atomic force microscopy
  • TEM transmission electron microscopy
  • Example 1 Crystallographic Structure of the Catalytic Module of PcAAxxB (JGI ID 1372210; GenBank ID # KY769370) to 3.0 A
  • the crystallographic structure of the catalytic modulus of PcAAxxB (JGI ID 1372210, GenBank ID # KY769370), refined to a resolution of 3.0 ⁇ , reveals a structured core and a catalytic site formed according to a canonical coordination mode of histidine brace ", exposed on the surface.
  • PcAAxxB (# KY769370) was produced in large quantities in Pichia pastoris and purified to homogeneity.
  • PcAAxxB The structure of PcAAxxB was resolved by the MAD technique (multiple wave length anomalous dispersion) from the gadolinium signal, then refined to 3.0 ⁇ resolution.
  • the core of the protein is structured into a large antiparallel ⁇ sandwich, a folding that is broadly similar to that already identified for other families.
  • the active site of PcAAxxB consists of Hisl, His99 and Tyrl76, which form a canonical coordination mode of the "histidine brace" type (see FIG. 2).
  • the surface of PcAAxxB has a rippled shape with a clamp formed by two protruding loops, visible from the pdb format (Protein Data Bank). Five N-glycans are attached to the crystallographic structure of PcAAxxB through the following Asparagine residues: Asn13, Asn76, Asn133, Asn183 and Asn217.
  • the crystallographic structure further indicates the presence of 10 Cysteine residues involved in five disulfide bridges at the following positions: Cys67 &Cys90; Cys109 &Cys136; Cys133 &Cys158; Cysl60 &Cysl82; Cys202 & Cys218.
  • the crystallized structure includes two molecules per asymmetric unit.
  • the coordinates of the channel A are here presented in pdb format.
  • Chain B which is also part of the asymmetric unit, is not shown here.
  • sequence SEQ ID No. 7 corresponds to the minimal fragment of sequence SEQ ID No. 2 comprising the three amino acids involved in the catalytic triad fixing the copper, including the residue Histidine in the N-terminal position, and further comprising the sandwich- ⁇ antiparallel to the Thr185 residue.
  • SEQ ID No. 2 may be furthermore positioned relative to a consensus sequence derived from FIG. 3, as follows: Table 1A: Consensus Sequence and Position on SEQ ID No. 2
  • the fibers are brought into contact with an enzyme with polysaccharide oxidase activity according to the invention, of sequence SEQ ID No. 1, and ascorbate then subjected to gentle stirring for 48 hours. In the absence of enzyme, the fibers remain intact and no modification is observed.
  • the dispersions were then analyzed by light microscopy, transmission electron microscopy (TEM) and atomic force microscopy (AFM).
  • TEM transmission electron microscopy
  • AFM atomic force microscopy
  • the degradation of ligocellulosic biomass by polypeptides of SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2 and a T.reesei cellulase cocktail was tested by sequential reactions.
  • Cellulosic carriers of the "poplar" type were first incubated with 2.2 ⁇ l (equivalent to 70 ⁇ g) of polypeptide of sequence SEQ ID NO. 1 or 2.2 ⁇ (equivalent to 70 ⁇ g) of polypeptide of sequence SEQ ID NO.2 for 48 hours; following which 10 ⁇ g of T. reesei TR3012 cellulase cocktail were added. The reactions were incubated for 24 hours.
  • Example 5 Polysaccharide Degradation Activity of Polypeptides of Sequence SEQ ID NO. 1, and SEQ ID NO. 2 in a sequential degradation test of lignocellulose, in the presence of LPMO type AA9
  • SEQ ID NO. 1 in combination with LPMOs type AA9, was tested by sequential reactions.
  • Cellulosic carriers of the "poplar" type were first incubated with (i) a control medium, (ii) 2.2 ⁇ (equivalent to 35 ⁇ g) of polypeptide SEQ ID NO. 1, (iii) 2.2. ⁇ of LPMO type AA9 and (iv) 1.1 ⁇ of polypeptide SEQ ID NO. 1 and 1.1. ⁇ of LPMO type AA9, for 48 hours; following which 10 ⁇ g of T. reesei TR3012 cellulase cocktail were added. The reactions were incubated for 24 hours.
  • the analysis of the soluble sugars released was done according to several methodologies (DNS assay, RTU assay and HPAEC), which showed an improvement in the release of glucose and cello-oligosaccharides.

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Abstract

La présente invention concerne de manière générale le domaine des celluloses, notamment de nanocelluloses, et plus particulièrement des procédés pour la fabrication de fibres de celluloses et de défïbrillation de substrats cellulosiques. Tout particulièrement, l'invention concerne des procédés de défïbrillation de substrats cellulosiques et de fabrication de celluloses, en particulier de nanocelluloses (NC), utilisant une nouvelle famille de Lytic polysaccharide monooxygenases (LPMO) fongiques.

Description

TITRE DE L'INVENTION
PROCEDES DE DEFIBRILLATION DE SUBSTRATS CELLULOSIQUES ET DE FABRICATION DE CELLULOSES UTILISANT UNE NOUVELLE FAMILLE DE LYTIC POLYSACCHARIDE MONOOXYGENASES (LPMO) FONGIQUES
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne de manière générale le domaine des celluloses, notamment de nanocelluloses, et plus particulièrement des procédés pour la fabrication de fibres de celluloses et de défïbrillation de substrats cellulosiques.
ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE
La cellulose est un des polymères naturels les plus importants, une matière première quasi inépuisable, et une source importante de matériaux durables à l'échelle industrielle.
A ce jour, différentes formes de cellulose ont été identifiées avec une dimension de l'ordre du nanomètre, désignées sous le nom générique de « nanocelluloses ».
Les propriétés de ces nanocelluloses, notamment leurs propriétés mécaniques, leur capacité à former des films et leur viscosité, leur confèrent un intérêt majeur dans de nombreux domaines industriels.
Les nanocelluloses sont ainsi utilisées par exemple en tant qu'additif dispersant ou stabilisant dans les industries papetière, pharmaceutique, cosmétique ou agroalimentaire. Elles entrent également dans la composition de peintures et de vernis.
Les nanocelluloses sont également employées dans de nombreux dispositifs nécessitant un contrôle de la porosité nanométrique, en raison de leur surface spécifique élevée.
Enfin, de nombreux matériaux nanocomposites à base de nanocelluloses sont actuellement développés. En effet, les propriétés mécaniques remarquables des nanocelluloses, leur dispersion à l'échelle nanométrique ainsi que leur caractère hydrophile, leur confèrent des propriétés barrières au gaz excellentes. Ces caractéristiques suscitent notamment un intérêt important pour la fabrication d'emballages barrières.
Sur la base de leurs dimensions, fonctions et méthodes de préparation, qui elles-mêmes dépendent principalement de la source cellulosique et des conditions de traitement, les nanocelluloses peuvent être classées principalement dans deux familles : les fibrilles de cellulose et les nanocristaux de cellulose.
Les nanocristaux de cellulose (dits encore « nanocelluloses cristallines » ou NCCs pour « nanocrystalline cellulose ») sont en général obtenus par une hydrolyse avec un acide fort dans des conditions strictement contrôlées de température, de durée et d'agitation. Un tel traitement permet d'attaquer les régions amorphes des fibres tout en laissant les régions cristallines, plus résistantes, intactes. La suspension obtenue est ensuite lavée par des centrifugations et des dialyses successives dans l'eau distillée. Les NCCs les plus classiquement obtenus ont une longueur de quelques dizaines de nanomètres à environ 1 μιη (notamment de 40 nm à 1 μιη et de préférence de 40 nm à 500 nm), et un diamètre allant de 5 à 70 nm, de préférence inférieur à 15 nm (typiquement de 5 à 10 nm).
Les fibrilles de cellulose, couramment désignées microfibrilles de cellulose (dites encore « cellulose microfibrillée » ou MFC pour « microfibrillated cellulose ») ou nano fibrilles de cellulose (NFC pour « nanofïbrillated cellulose ») sont typiquement isolées à partir de matériaux cellulosiques issus de la bio masse, par des procédés mécaniques permettant de délaminer les fibres de cellulose et de libérer les fibrilles de cellulose.
Bien que connues depuis les années 50, les nanocelluloses font l'objet d'une littérature intense depuis une dizaine d'années.
Par exemple, le document US 4 483 743 décrit un procédé de fabrication de cellulose microfibrillée, qui implique le passage d'une suspension liquide de cellulose au travers d'un homogénéiseur type Gaulin à haute pression. Des passages répétés de la suspension de cellulose permettent d'obtenir des microfibrilles ayant typiquement une largeur allant de 25 à 100 nm et une longueur bien plus importante.
De manière générale, les procédés mécaniques d'obtention de fibrilles de cellulose ont l'inconvénient de consommer d'importantes quantités d'énergie. A titre d'exemple, il a été évalué que l'utilisation d'un homogénéiseur entraîne une consommation d'énergie de l'ordre de 70000 kWh/t. Cette consommation énergétique importante, et en corollaire les coûts élevés de la production de nanocelluloses, restent donc un frein considérable à leur développement industriel.
Différentes stratégies de prétraitements des fibres de cellulose ont ainsi été développées afin de réduire la consommation d'énergie requise pour leur délamination mécanique.
Une première stratégie de prétraitement, décrite par exemple dans la demande WO 2007/091942, consiste à prétraiter les fibres de cellulose par des cellulases de manière à déstructurer la fibre avant l'application du traitement mécanique par homogénéisation.
Cependant, ce prétraitement enzymatique est extrêmement versatile en fonction de l'état de la fibre et notamment en fonction de l'histoire thermochimique préalable de la fibre.
De plus, la qualité des nanocelluloses obtenues (en particulier l'état de dispersion et notamment la taille latérale des nanofibrilles qui conditionne les propriétés d'usage et les rendements énergétiques sont très variables.
Une seconde stratégie de prétraitement s'appuie sur une étape chimique d'oxydation des fibres de cellulose (par exemple Saito et al., Biomacromolecules, Vol. 8, No. 8, 2007, pp. 2485-2491).
Typiquement, les fibres sont oxydées avec un oxydant tel que hypochlorite de sodium catalysé par le radical 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-l-oxyl (« TEMPO ») avant de subir le traitement mécanique précité.
Le traitement oxydatif convertit la fonction alcool primaire en position C6 de l'unité de glucose de la cellulose en une fonction carboxylate, ce qui conduit à l'introduction de charges à la surface des fibres de cellulose. Ces charges créent des répulsions électrostatiques qui facilitent la délamination et qui augmentent son efficacité.
Toutefois, l'élimination des produits de réaction conduit à de grandes quantités d'effluents fortement pollués. En outre, des résidus de réactifs persistent au sein du produit final et continuent à réagir, altérant in fine les propriétés des fibres de celluloses produites par ces procédés.
Ainsi, malgré les nouvelles stratégies de prétraitement développées, les coûts de production des nanocelluloses restent élevés, les rendements incertains, et la qualité et les propriétés sont variables.
Plus récemment, WO 2016/193617 enseigne des procédés de fabrication de nanocelluloses, comprenant une étape de traitement enzymatique du dit substrats par une enzyme de clivage appartenant à la famille des mono-oxygénases lytiques de polysaccharides (LPMOs), aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de celluloses.
Pour des raisons évidentes, la mise à disposition de nouveaux procédés optimisés pour obtenir des nanocelluloses, relève d'une préoccupation constante. Les voies d'optimisation visent notamment à réduire la consommation énergétique, privilégier une procédure simplifiée et reproductible, et de toxicité réduite voire nulle.
La présente invention vise précisément à proposer un procédé répondant au moins en partie à ces attentes.
RESUME DE L'INVENTION
Selon un premier objet, l'invention concerne un procédé de préparation d'un substrat cellulosique pour la fabrication de fibres de cellulose, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes consistant à:
a) disposer d'un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose ; b) mettre en contact le dit substrat, en présence d'un donneur d'électron, avec au moins une enzyme appartenant à la famille des mono-oxygénases lytiques de polysaccharides (LPMOs) dans des conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose;
caractérisé en ce que ladite enzyme est une polysaccharide-oxydase possédant une identité de séquences en acides aminés d'au moins 20% avec un polypeptide de référence de SEQ ID NO. 1, 2 ou 3, à partir de la méthode de comparaison BLAST-P, ladite méthode de comparaison BLAST-P résultant en une valeur-E (E-value) de 10 e"3 ou moins.
Selon un autre objet, l'invention concerne l'utilisation d'un substrat cellulosique obtenu selon le procédé précédent à titre de matière première cellulosique pour préparer des fibres de cellulose, en particulier de la nanocellulose, notamment de fibrilles de cellulose et/ou de nanocristaux de cellulose via un procédé de défibrillation, notamment mécanique.
Plus précisément, selon un autre objet, l'invention concerne un procédé de défibrillation d'un substrat cellulosique, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes :
a) disposer d'un substrat cellulosique obtenu selon le procédé tel que défini précédemment et
b) traiter mécaniquement ledit substrat cellulosique, afin d'extraire lesdites fibres de cellulose du dit subtrat. Selon encore un autre de ses objets, l'invention concerne un procédé de fabrication de fibres de cellulose, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes :
a) disposer d'un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose ; b) mettre en contact ledit substrat cellulosique avec au moins une enzyme appartenant à la famille des mono-oxygénases lyriques de polysaccharides (LPMOs) dans des conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose en présence d'un donneur d'électron;
c) traiter mécaniquement ledit substrat cellulosique, afin de fabriquer lesdites fibres de cellulose à partir du dit substrat cellulosique,
caractérisé en ce que ladite enzyme est une polysaccharide-oxydase possédant une identité de séquences en acides aminés d'au moins 20% avec un polypeptide de référence de SEQ ID NO. 1, 2 ou 3, à partir de la méthode de comparaison BLAST-P, ladite méthode de comparaison BLAST-P résultant en une valeur-E (E -value) de 10 e"3 ou moins.
Selon encore un autre de ses objets, l'invention concerne des fibres de celluloses issues d'un procédé d'extraction, et/ou d'un procédé de fabrication, tels que définis ci-dessus.
Les fibres de cellulose qui sont tout particulièrement considérées par l'invention sont des nanofibres de cellulose, ou nanocelluloses.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1: Arbre phylogénétique de la famille AAxx démontrant que les membres de la famille AAxx clusterisent fortement ensemble et sont très distants des séquences relatives aux familles AA9, AA10, AA11 et AA13 respectivement.
Figure 2: diagramme en ligne du site actif des LPMOs de type PcAAxx
Figure 3A-3B: séquence consensus basée sur un alignement de 283 séquences appartenant au module catalytique des familles AAxx révélant une première histidine conservée dans la famille
Figure 4: Morphologie de fibres cellulosiques de bouleau (A et B) et résineux (C et D) sous l'action des polysaccharides monooxygenases. Images de microscopie optique des fibres témoin (A et C) et des fibres soumises au traitement par une LPMO de type PcAAxxA correpondant à un polypeptide de séquence SEQ ID N°l (B et D)
Figure 5 : Etat de défibrillation des fibres cellulosiques sous l'action d'une polysaccharide monooxygenase (PcAAxxA/ SEQ ID N°l). Images de TEM (A et C) et d'AFM (B et D).
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
L'invention a pour objet de répondre à ces besoins.
Afin de remédier aux inconvénients précités de l'état de la technique, la présente invention propose un procédé de fabrication de nanocelluloses s'appuyant sur une étape de prétraitement de fibres de cellulose avec au moins une enzyme appartenant à la famille des mono-oxygénases lytiques de polysaccharides, couramment désignés « LPMOs » pour « Lytic Polysaccharide MonoOxygenases ».
Les inventeurs sont ainsi d'avis que l'utilisation de LPMOs permet de proposer un procédé innovant pour la fabrication de fibres de celluloses, dont les nanocelluloses. En effet, les LPMOs sont des enzymes dont la fonction oxydative a récemment été mise en évidence (Vaaje-Kolstad, 2010 ; Quinlan et al. 2011; Westereng et al. 2011 ; Horn et al, 2012 ; Bey et al, 2013). Ces enzymes qui améliorent la dégradation de la lignocellulose (Harris et al., 2010) sont retrouvées dans la dernière génération de cocktails enzymatiques industriels (e.g. Cellic CTec3). Ce sont des enzymes cuivre-dépendantes qui catalysent le clivage oxydatif de la cellulose. Ces enzymes anciennement classées dans la famille GH61 (« Glycoside Hydrolase ») de CAZy (www.cazy.org) ont été reclassées dans la famille AA9 (« Auxiliary Activity » enzymes).
Les travaux menés lors d'essais préliminaires ont eu pour objectif d'apporter la preuve de concept de la fabrication de nanocellulose suite à l'action de LPMO fongiques.
De manière surprenante, il a désormais été démontré sur une fibre papetière qu'une enzyme appartenant à une nouvelle famille produite en système hétérologue chez la levure Pichia pastoris pouvait être avantageusement mise en oeuvre dans des procédés de dé-fïbrillation de fibres cellulosiques, ainsi que dans des procédés de fabrication de fibres de celluloses, notamment de nanocelluloses.
Cette nouvelle famille d'enzymes capable d'oxyder les polysaccharides est aussi référencée ici en tant que famille de protéines « AAxx ». Les inventeurs ont caractérisé structurellement la protéine de référence PcAAxxB (Genbank #KY769370) de P. coccineus, en résolvant la structure cristallographique de son module catalytique à une résolution de 3 Â. Ils ont ainsi fourni un modèle structurel pour l'identification de tous les membres pertinents appartenant à cette famille de protéines AAxx, en complément de l'analyse par alignement de séquence de plus de 300 protéines possédant des similarités significatives à PcAAxxB.
La présente invention tire donc partie des propriétés enzymatiques particulières d'une nouvelle classe d'enzyme à activité polysaccharide oxydase, caractérisée en ce que : la dite enzyme à activité polysaccharide-oxydase possède une identité de séquences en acides aminés d'au moins 30% avec un polypeptide de référence de SEQ ID NO. 1, 2 ou 3, à partir de la méthode de comparaison BLAST-P, ladite méthode de comparaison BLAST-P résultant en une valeur-E (E -value) de 10 e-3 ou moins
En particulier, les inventeurs ont identifié une structure cristallographique du polypeptide de séquence SEQ ID NO 2.
Les enzymes à activité polysaccharide oxydase selon l'invention sont caractérisées par la présence d'un site actif conservé fixant le cuivre, aussi référencé ici comme un site actif fixant le cuivre de type "histidine brace", formée par deux résidus Histidine et une Tyrosine, un des deux résidus histidine étant l'histidine N-terminale après le clivage du peptide signal.
Plus spécifiquement, les inventeurs ont montré ici que la pluralité des protéines appartenant à cette nouvelle famille AAxx peut être différenciée d'autres mono- oxygénases lytique des polysaccharides en ce que cette nouvelle famille AAxx ne possède pas, de manière obligatoire, de module fixant les carbohydrates (CBM).
Plus précisément, les inventeurs ont démontré qu'une enzyme oxydant les polysaccharides telle que celles identifiées dans la présente demande peut agir en synergie avec d'autres enzymes oxydant les polysaccharides déjà connues telle que les mono- oxygénases lytiques des polysaccharides (généralement appelées LPMO) afin d'améliorer l'hydrolyse de ces polysaccharides.
Les données expérimentales décrites ici montrent que les enzymes oxydant les polysaccharides identifiés par les inventeurs peuvent cibler des unités de sucres distinctes constituant un polysaccharide (par exemple la cellulose, hémicellulose ou lignocellulose), ou encore peuvent cibler des groupes chimiques d'unité de sucre distinctes de celles ciblées par les LPMO déjà connues, telle que AA9 (aussi appelée GH61), AA10, AAl l et AA13.
Ainsi, les inventeurs ont découvert de façon inattendue que les enzymes oxydant les polysaccharides considérées selon l'invention peuvent agir en synergie avec des cellulases afin de dégrader des matériaux contenant des polysaccharides, tels que des matériaux contenant de la cellulose et semblables à la lignocellulose.
Il a aussi été constaté que les enzymes oxydant les polysaccharides identifiés ici peuvent aussi agir en synergie avec des LPMO afin de dégrader des matériaux contenant des polysaccharides, tels que des matériaux contenant de la cellulose et semblables à la lignocellulose.
En conséquence, les enzymes oxydant les polysaccharides, de la présente invention, peuvent être considérées soit séparément, soit en combinaison avec d'autres enzymes capables d'oxyder ou de dégrader les polysaccharides, ainsi que les mélanges de celles-ci. Ainsi, les inventeurs ont identifié une nouvelle classe d'enzymes oxydant les polysaccharides qui peut être utilisée dans une variété de processus pour dégrader des matériaux contenant des polysaccharides, et plus particulièrement dans une large variété de processus pour dégrader les matériaux lignocellulosiques.
Ces propriétés sont donc avantageuses pour la préparation de supports cellulosiques pour la fabrication de fibres de cellulose.
Sans vouloir être limité par un quelconque mécanisme d'action, les inventeurs sont d'avis que les propriétés polysaccharide-oxydases de ces nouvelles LPMOs peuvent faciliter la fabrication de fibres de cellulose depuis un substrat cellulosique comme suit:
- le clivage des chaînes (hémi)cellulosiques peut provoquer des fragilités au sein des fibres facilitant la délamination mécanique indispensable à la nanofibrillation sur le même schéma que les endoglucanases utilisées actuellement ; et d'autre part
- la formation de produits d'oxydation permettrait d'introduire des fonctions chimiques chargées sur la surface des fibres en induisant des répulsions électrostatiques.
De plus, sans forcément être lié par la théorie, les inventeurs sont d'avis que les enzymes AAxx de l'invention sont capables d'agir préférentiellement sur les xylanes liés à la cellulose et plus spécifiquement sur les xylanes ayant une rigidité et une conformation similaire à celles des chaînes cellulosiques sous-jacentes. Ces modifications structurales combinées ont pour conséquence la facilitation de la séparation des fibres jusqu'à dispersion nanométrique et la formation de fibres de cellulose, en particulier de nanofïbriUes de cellulose, possédant des caractéristiques et fonctionnalités nouvelles et avantageuses.
L'invention concerne donc (i) un procédé original de préparation d'un substrat cellulosique; (ii) l'utilisation du substrat cellulosique ainsi obtenu à titre de matière première pour former des fibres de cellulose, notamment des nanocelluloses (iii) un procédé de défibrillation d'un substrat cellulosique ; et (iv) un procédé de fabrication de fibres de cellulose.
Un procédé de fabrication de fibres de cellulose tel que défini ici peut ainsi consister en la mise en oeuvre combinée d'un procédé de préparation d'un substrat cellulosique, puis d'un procédé de défibrillation sur le dit substrat préparé.
Les domaines d'application des fibres de cellulose, en particulier de nanocelluloses, obtenues par les dits procédés sont extrêmement variés. De façon générique les nanocelluloses visent des applications dans 3 grands domaines :
- Systèmes dispersés hydratés: Les nanocristaux sont habituellement stabilisés en suspensions colloïdales par des répulsions électrostatiques induites par la présence de charges de surface. Ils peuvent servir de stabilisant de phases hydrophobes et donc entrer dans la composition de peintures, vernis, cosmétique, etc. Ils peuvent également permettre de disperser des agents fonctionnels tels que des opacifiants pour des applications (dioxyde de titane par exemple en papèterie), ou des renforçants (argiles)
- Matériaux poreux (mousses, aérogels, membranes, .. etc) : La très grande surface spécifique des nanocelluloses permet d'accéder un contrôle de la porosité des matériaux au niveau nanométrique après séchage. Ce contrôle donne accès à différents types d'applications où la porosité ou une grande surface spécifique sont des caractéristiques clefs: membrane de fïltration, support de catalyse, superisolants thermiques.
- Nanocomposites : Les nanocelluloses ont des propriétés mécaniques tout à fait remarquables. D'autre part la dispersion à l'échelle nanométrique ainsi que leur caractère hydrophile leur confère des propriétés barrière au gaz. Ces caractéristiques ouvrent la voie à leur utilisation notamment dans le domaine des emballages. Définitions générales
De manière générale, et tout au long du présent texte, les termes de type "comprendre" ou "inclure", ainsi que leurs variations, sont susceptibles d'inclure d'autres éléments que ceux explicitement mentionnés. Ces termes peuvent, le cas échéant, être replacés par "consister en". Les articles "un" et "une" incluent également "plus d'un" ou "plus d'une", ce qui inclut "une pluralité", ou encore "deux ou plus".
La présente invention concerne un procédé pour la fabrication de nanocelluloses, en particulier de fibrilles de cellulose et/ou de nanocristaux de cellulose, à partir d'un substrat cellulosique.
Par « cellulose », on entend un homopolysaccharide linéaire issu de la biomasse (englobant les matières organiques d'origine végétale, algues incluses, la cellulose d'origine animale ainsi que la cellulose d'origine bactérienne) et constitué d'unités (ou cycles) de glucose (D-Anhydroglucopyranose - AGU pour « Anhydro glucose unit ») reliées entre elles par des liaisons glycosidiques β-(1-4). Le motif de répétition est un dimère de glucose également appelé dimère de cellobiose.
Les AGU possèdent 3 fonctions hydroxyles : 2 alcools secondaires (sur les carbones en positions 2 et 3 du cycle de glucose) et un alcool primaire (sur le carbone en position 6 du cycle de glucose).
Ces polymères s'associent par des liaisons intermoléculaires de type liaison hydrogène, conférant ainsi une structure fibreuse à la cellulose. En particulier, l'association des chaînes formées de dimères de cellobiose forme une nano fibrille élémentaire de cellulose (dont le diamètre est d'environ 5 nm). L'association de nanofibriUes élémentaires forme une nano fibrille (dont le diamètre varie généralement de 50 à 500 nm ; ce qui inclut 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 et 500 nm). L'agencement de plusieurs de ces nanofibriUes forme ensuite ce qui est généralement appelé une fibre de cellulose.
Le terme « fibre de cellulose » désigne l'ensemble des formes de cellulose susceptibles d'être obtenues à l'issue d'un procédé de défibrillation, ou délamination d'un substrat cellulosique ; ce qui inclut les formes de cellulose ayant une dimension de l'ordre du nanomètre, ainsi que les formes de cellulose ayant une dimension supérieure.
Le terme « nanocelluloses » désigne les différentes formes de cellulose ayant une dimension de l'ordre du nanomètre. Ce terme englobe en particulier selon l'invention, deux familles de nanocelluloses : les nanocristaux de cellulose et les fibrilles de cellulose.
Les termes « fibrilles de cellulose », « nanofibrilles (de cellulose) », « nanofibres (de cellulose) », « cellulose nanofibrillée », « microfibrilles (de cellulose) », « cellulose microfibrillée », « microfibrillated cellulose », « cellulose nanofibrils » sont synonymes.
Chaque nano fibrille de cellulose contient des parties cristallines stabilisées par un solide réseau de liaisons hydrogènes inter- et intra-chaines. Ces régions cristallines sont séparées par des régions amorphes.
L'élimination des parties amorphes des nanofibrilles de cellulose, permet d'obtenir des nanocristaux de cellulose (NCCs).
Les NCCs comportent avantageusement au moins 50% de partie cristalline, de préférence encore au moins 55% de partie cristalline. Ils ont généralement un diamètre allant de 5 à 70 nm (de préférence inférieur à 15 nm) et une longueur allant de 40 nm à environ 1 μιη, de préférence allant de 40 nm à 500 nm ; ce qui inclut 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 et 500 nm.
Les termes « nanocristaux de cellulose », « cellulose nanocristalline », « cellulose whiskers », « microcristaux » ou « cellulose nanocrystal » sont synonymes. Dans la suite de la présente demande, le terme « nanocristaux de cellulose » (NCCs) sera utilisé de manière générique.
Comme utilisé ici, un matériel contenant des polysaccharides englobe une substance ou une composition comprenant des polysaccharides.
Le terme « polysaccharide » est utilisé dans son sens conventionnel et désigne des carbohydrates polymériques composés de longues chaînes de monosaccharides maintenus ensemble par des liaisons glycosidiques. Lors de leur hydrolyse, les polysaccharides libèrent les monosaccharides ou oligosaccharides les constituant.
Le terme « matériel contenant de la lignocellulose » utilisé ici fait référence à un matériel consistant initialement de cellulose, hémicellulose et lignine. Ce terme est synonyme de « matériel lignocellulosique ». Un tel matériel est souvent référencé comme « biomasse ».
Selon cette définition, un matériel contenant de la lignocellulose est un exemple de substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose, au sens de l'invention. Comme utilisé dans la présente demande, une « enzyme oxydant les polysaccharides » englobe les polypeptides avec les propriétés suivantes :
- le dit polypeptide produit du peroxyde d'hydrogène en présence d'oxygène et d'un composé donneur d'électrons, tel que les ascorbates,
- le dit polypeptide augmente de manière dose dépendante, en l'absence ou en présence d'un composé donneur d'électrons, la dégradation d'un matériel contenant des polysaccharides tel que la lignocellulose, causée par des cellulases et/ou des xylanases,
- le dit polypeptide augmente de manière dose dépendante, en l'absence ou en présence d'un composé donneur d'électrons, la dégradation d'un matériel contenant des polysaccharides tel que la lignocellulose, causé par des cellulases, en présence d'une ou plus LPMO, tel que les LPMO sectrionnées dans un group comprenant AA9, AA10, AA1 1 et AA13.
Une « enzyme oxydant des polysaccharides » selon l'invention a été démontrée comme particulièrement efficace pour oxyder les xylanes, et notamment les xylanes absorbés sur de la cellulose. Le terme « composé donneur d'électron » est utilisé ici dans son sens habituel pour un homme du métier. Ainsi, un composé donneur d'électron est une entité chimique capable de donner des électrons à un autre composé. Un composé donneur d'électron est un agent réducteur grâce à sa capacité à donner des électrons et est lui-même oxydé quand il donne des électrons à une autre entité chimique. Un composé donneur d'électrons comme spécifié plus haut pour les propriétés d'oxydation des polysaccharides, englobe, de manière non exhaustive, des ascorbates et des cellobiose déshydrogénases (CDH).
En l'absence d'un réducteur, tel que l'ascorbate, l'agent réducteur peut de façon avantageuse être fourni par la biomasse (la lignine) qui peut agir en tant que donneur d'électron.
Comme utilisé dans la demande, une « méthode BLAST-P » (appelée aussi Protein Basic Local Alignement Search Tool method) est une méthode d'analyse bien connue pour l'homme du métier. La méthode BLAST-P a notamment été décrite dans Altschul et al. (1990, J Mol Biol, Vol. 215 (n°3) :403-410), Altschul et al. (1997, Nucleic Acids Res. Vol. 25:3389-3402) et Altschul et al. (2005, FEBS J. Vol. 272:5101-5109). La méthode BLAST-P peut être réalisée en utilisant l'outil de NCBI disponible en ligne (adresse internet : http://blast.ncbi.nlm.nih.gOv/B last.cgi?PAGE= Proteins).
Quand la méthode BLAST-P est utilisée dans la présente demande, elle est utilisée de préférence selon les paramètres suivants : : (i) Expected threshold : 10; (ii) Word Size : 6; (iii) Max Matches in a Query range : 0; (iv) Matrix : BLOSSUM62; (v) Gap costs : Existence 11, Extension 1; (vi) Compositional Adjustments : Conditional compositional score matrix adjustment, (vii) No fïlter; (viii) No mask.
Comme cela est bien connu, le score d'un alignement, S, est calculé comme la somme des scores de substitution et de gap. Les scores de substitution sont donnés dans une table (voir PAM, BLOSUM ci-dessous). Les scores de gap sont généralement calculés comme la somme des G, la pénalité d'ouverture d'un gap et L, la pénalité d'extension d'un gap. Pour un gap d'une longueur n, le coût d'un gap serait de G+Ln. Le choix des coûts des gaps, G et L sont empiriques, mais il est habituel de choisir une valeur élevée pour G (10-15) et une faible valeur pour L (1-2).
Un alignement optimal signifie l'alignement de deux séquences avec le score le plus haut possible.
L'identité en acides aminés représente la mesure dans laquelle deux séquences en acides aminés ont les mêmes résidus aux mêmes positions dans un alignement, et est souvent exprimée en pourcentage.
Les matrices BLOSUM (Blocks Substitution Matrix) sont des matrices de score de substitution dans lesquelles les scores pour chaque position sont dérivées de l'observation de la fréquence de substitution des blocks dans des alignement locaux pour des protéines apparentées. Chaque matrice est dessinée pour une distance d'évolution particulière. Dans la matrice BLOSUM62, par exemple, l'alignement à partir duquel les scores ont été dérivés a été créé à partir de séquences ne partageant pas plus de 62% d'identité. Les séquences qui possèdent plus de 62% d'identité sont représentées par une séquence unique dans l'alignement afin de ne pas surreprésenter des membres proches d'une même famille.
Comme utilisé ici, une E-valeur (aussi appelé Expect Value) est un paramètre calculé quand la méthode BLAST-P est utilisée, le dit paramètre représentant le nombre d'alignements différents avec des scores équivalents ou avec meilleur que S dont l'apparition est attendue lors d'une recherche dans la base de données par hasard. Ainsi, plus la E valeur sera basse, et plus le score et l'alignement seront significatifs.
Dans le cadre de la présente invention, le « pourcentage d'identité » entre deux polypeptides signifie que le pourcentage d'acides aminés identiques entre les deux séquences polypeptidiques à comparer, obtenu après un alignement optimal, ce pourcentage étant entièrement statistique et les différences entre les deux séquences polypeptidiques étant distribués aléatoirement sur leur longueur. La comparaison de deux séquences polypeptidiques est traditionnellement réalisée en comparant les séquences après les avoir alignées de façon optimale, la dite comparaison doit pouvoir être conduite par segment ou en utilisant une « fenêtre d'alignement ». L'alignement optimal des séquences pour leur comparaison est réalisé en utilisant le software de comparaison BLAST-P.
Dans son principe, le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides aminés est déterminé en comparant les deux séquences alignées de façon optimale au sein desquelles les séquences d'acides nucléiques à comparer peuvent contenir des additions ou délétions par rapport à la séquence de référence de l'alignement optimal entre les deux séquences polypeptidiques. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant du nombre de positions dans lesquelles un acide aminé est identique entre les deux séquences, de préférence entre deux séquences complètes, puis en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre d'alignement et en multipliant le résultat par 100 afin d'obtenir le pourcentage d'identité entre les deux séquences.
Comme il est entendu dans la présente demande, des séquences polypeptidiques ayant au moins 20% d'identité en acides aminés avec une séquence de référence comprennent celles qui ont au moins 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 28%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% et 99% d'identité en acides aminés avec ladite séquence de référence.
De manière similaire, le «pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acides nucléiques représente le pourcentage de résidus nucléotidique identiques entre les deux séquences d'acides nucléiques à comparer, obtenus après un alignement optimal, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant distribuées de façon aléatoire sur la longueur des séquences. La comparaison de deux séquences d'acides nucléiques est traditionnellement réalisée en comparant les séquences après les avoir alignées de façon optimale, la dite comparaison pouvant être conduite par segment ou en utilisant une « fenêtre d'alignement ». L'alignement optimal des séquences en vue de leur comparaison est réalisé en utilisant le software de comparaison BLAST-N.
En principe, le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques est déterminé en comparant les deux séquences alignées de façon optimale dans lesquelles les séquences d'acides nucléiques à comparer peuvent contenir des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence de l'alignement optimal entre les deux séquences Le pourcentage d'identité est calculé selon le nombre de positions auxquels les résidus nucléotidiques sont identiques entre les deux séquences, de préférence entre les deux séquences complètes, puis en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre d'alignement et en multipliant le résultat par 100 afin d'obtenir le pourcentage d'identité entre les deux séquences.
Comme il est entendu ici, les séquences nucléotidiques ayant au moins 20% d'identité avec la séquence de référence incluent celles ayant au moins least 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 28%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%o et 99% d'identité en nucléotides avec la séquence de référence.
Comme indiqué ici, une E valeur de 10 e"3 ou moins englobe les E-valeur de 1 e"3 ou moins, 1 e"4 ou moins, 1 e"5 ou moins, 1 e"6 ou moins, 1 e"7 ou moins, 1 e"8 ou moins, 1 e"9 ou moins, 1 e"10 ou moins, 1 e"20 ou moins, 1 e"30 ou moins, 1 e"40 ou moins, 1 e"50 ou moins, 1 e"60 ou moins, 1 e"70 ou moins, 1 e"80 ou moins, 1 e"90 ou moins et 1 e"100 ou moins.
Le terme "traitement chimique" fait référence à tous les prétraitements chimiques qui permettent la séparation et/ou la libération de la cellulose, hémicellulose et/ou lignine. Des exemples de ces prétraitements chimiques adéquats incluent, par exemple des acides dilués, de la chaux, des bases, des solvants organiques, de l'ammoniaque, du dioxyde de soufre, du dioxyde de carbone. De plus l'oxydation humide et l'hydrothermolyse à pH contrôlé sont aussi considérées comme des prétraitements chimiques. Les méthodes de prétraitements utilisant de l'ammoniaque sont notamment décrites dans les demandes PCT WO 2006/110891, WO 2006/110899, WO 2006/110900, et WO 2006/110901.
D'autres exemples de prétraitement adéquat sont décrits par Schell et al, 2003, Appl. Biochem and Biotechn. Vol. 105-108: 69-85, et Mosier et al, 2005, Bioresource Technology 96: 673-686, et U.S. Publication No. 2002/0164730.
Le terme « prétraitement mécanique » fait référence à tous les traitements mécaniques (ou physiques) qui permettent la séparation et/ou la libération de la cellulose, de l'hémicellulose et/ou de la lignine à partir d'un matériel contenant de la lignocellulose. Par exemple, les prétraitements mécaniques incluent différents types de broyage, irradiation, explosion à la vapeur et l'hydrothermolyse.
Le prétraitement mécanique inclut la fragmentation d'un solide (comminution ou réduction mécanique de la taille). La fragmentation d'un solide inclut les techniques de broyages en milieu sec, de broyage en milieu humide et de broyage par balles vibrantes. Le prétraitement mécanique peut aussi inclure des fortes pressions et/ou des températures élevées (explosion à la vapeur). Dans certaines représentations de l'étape de prétraitement, la dite étape peut combiner un prétraitement mécanique et chimique.
Comme il a été utilisé dans la présente invention, le terme « prétraitement biologique » fait référence à tous les traitements biologiques qui permettent la séparation et/ou la libération de la cellulose, hémicellulose et/ou lignine à partir d'un matériel contenant de la lignocellulose. Les prétraitements biologiques peuvent impliquer l'application de microorganismes capables de solubiliser la lignine (voir, par exemple, Hsu, 1996, Pretreatment of biomass, dans le Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, éd., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212; Ghosh et Singh, 1993, Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass, Adv. Appl. Microbiol. 39: 295-333; McMillan, 1994, Pretreating lignocellulosic biomass: une revue, dans Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, Himmel, Baker, and Overend, eds., ACS Symposium Séries 566, American Chemical Society, Washington, DC, chapter 15; Gong, Cao, Du, et Tsao, 1999, Ethanol production from renewable resources, dans Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, éd., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65: 207-241 ; Olsson et Hahn-Hagerdal, 1996, Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production, Enz. Microb. Tech. 18: 312-331 ; et Vallander et Eriksson, 1990, Production of ethanol from lignocellulosic materials: State of the art, Adv. Biochem. Eng J Biotechnol. 42: 63-95).
Procédés selon l'invention
Selon un premier objet, l'invention concerne un procédé de préparation d'un substrat cellulosique pour la fabrication de fibres de cellulose, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes:
a) disposer d'un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose ; b) mettre en contact le dit substrat, en présence d'un donneur d'électrons, avec au moins une enzyme appartenant à la famille des mono-oxygénases lytiques de polysaccharides (LPMOs) dans des conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose, afin de défïbriller le dit substrat cellulosique ;
caractérisé en ce que ladite enzyme possède une identité de séquences en acides aminés d'au moins 20% avec un polypeptide de référence de SEQ ID NO. 1, 2 ou 3, à partir de la méthode de comparaison BLAST-P, ladite méthode de comparaison BLAST-P résultant en une valeur-E (E -value) de 10 e"3 ou moins.
Selon un autre objet, l'invention concerne l'utilisation d'un substrat cellulosique préparé selon le procédé précédent, à titre de matière première cellulosique pour préparer des fibres de cellulose, en particulier de la nanocellulose, notamment de fibrilles de cellulose et/ou de nanocristaux de cellulose via un procédé de défïbrillation, notamment mécanique.
Selon un second objet, l'invention concerne un procédé d'extraction de fibres de cellulose, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes :
a) disposer d'un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose mis en contact avec un donneur d'électrons et une enzyme à activité polysaccharide-oxydase, dans des conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose en présence d'un donneur d'électron, caractérisé en ce que la dite enzyme à activité polysaccharide-oxydase étant caractérisée en ce qu'elle possède une identité de séquences en acides aminés d'au moins 20% avec un polypeptide de référence de SEQ ID NO. 1, 2 ou 3, à partir de la méthode de comparaison BLAST-P, ladite méthode de comparaison BLAST-P résultant en une valeur-E (E -value) de 10 e"3 ou moins ; et
b) traiter mécaniquement ledit substrat cellulosique, afin d'extraire lesdites fibres de cellulose du dit subtrat.
Selon un troisième objet, l'invention concerne un procédé de fabrication de fibres de cellulose, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes :
a) disposer d'un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose ; b) mettre en contact ledit substrat cellulosique avec au moins une enzyme appartenant à la famille des mono-oxygénases lyriques de polysaccharides (LPMOs) dans des conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose en présence d'un donneur d'électron;
c) traiter mécaniquement ledit substrat cellulosique, afin de fabriquer lesdites fibres de cellulose à partir du dit substrat cellulosique,
caractérisé en ce que ladite enzyme à activité polysaccharide-oxydase possède une identité de séquences en acides aminés d'au moins 20% avec un polypeptide de référence de SEQ
ID NO. 1, 2 ou 3, à partir de la méthode de comparaison BLAST-P, ladite méthode de comparaison BLAST-P résultant en une valeur-E (E -value) de 10 e"3 ou moins.
Ladite enzyme à activité polysaccharide-oxydase est mélangée avec le substrat cellulosique, de manière à permettre la mise en contact entre ladite au moins une enzyme et les fibres de cellulose.
L'étape de traitement enzymatique est de préférence réalisée sous agitation douce, de façon à assurer une bonne dispersion des enzymes au sein des fibres. Cette étape de traitement enzymatique est par exemple mise en œuvre pendant une durée allant de 24h à 72h (de préférence 48h).
De préférence, l'étape de traitement enzymatique est mise en œuvre à une température allant de 30 à 50 °C, notamment de 30 à 45 °C.
Le pH des conditions réactionnelles de l'enzyme au contact du substrat cellulosique est généralement compris entre 3 et 7, ce qui inclut entre 4 et 7, et notamment entre 4 et 6.
Selon l'invention ladite au moins une enzyme LPMO peut être ajoutée au substrat cellulosique selon un rapport (ou ratio) enzyme/cellulose allant de 1 : 1000 à 1 :50, notamment de 1 :500 à 1 :50 ou de 1 : 100 à 1 :50 ou encore de 1 : 1000 à 1 :500, de 1 : 500 à 1 : 100.
De préférence, ladite au moins une enzyme LPMO est utilisée à une concentration allant de 0,001 à 10 g/L, notamment de 0,1 à 5 g/L, et de préférence encore de 0,5 à 5 g/L.
Selon un mode de réalisation particulier, le substrat cellulosique est soumis à au moins deux (voire seulement à deux) étapes de traitement enzymatique successives (en série, avantageusement séparées par une étape de rinçage).
La ou les LPMOs mises en œuvre au cours de chacune de ces étapes de traitement enzymatique sont identiques ou différentes ; les conditions (notamment le ratio enzyme/substrat) sont identiques ou différentes entre ces étapes successives.
Dans ce cas, les Exemples démontrent que les fibres sont entièrement déstructurées.
De manière non-exclusive, des tests de clivage de la cellulose par une enzyme LPMO selon l'invention peuvent être menés selon le protocole suivant :
Par exemple un test de clivage peut être réalisé dans un volume de 300 μΐ de liquide contenant 4,4 μΜ d'enzyme LPMO et 1 mM d'ascorbate et 0,1 % (poids/volume) de poudre de cellulose gonflée à l'acide phosphorique (PASC phosphoric acid-swoller cellulose - préparée comme décrit dans Wood TM, Methods Enzym 1988, 160 : 19-25) dans 50 mM d'un tampon acétate de sodium à pH 4,8 ou 5 μΜ de cello-oligosaccharides (Megazyme, Wicklow, Ireland) dans 10 mM de tampon acétate de sodium à pH 4,8.
La réaction enzymatique peut être mise en œuvre dans un tube de 2 ml incubé dans un thermomixer (Eppendorf, Montesson, France) à 50°C et 580 rpm (rotation par minute).
Les fibres sont mises en contact des enzymes (à une concentration comprise entre 1 et 5 g/L et selon des rapports enzyme/cellulose de 1 :50, 1 : 100, 1 :500 et 1 : 1000) et d'ascorbate (2 mM) puis soumises à une agitation douce pendant 48 heures à 40 °C.
Après 16 h d'incubation, l'échantillon est porté à 100°C pendant 10 minutes afin de stopper la réaction enzymatique, puis centrifugé à 16 000 tours par minutes (rpm) pendant 15 minutes à 4°C afin de séparer la fraction solution de la fraction insoluble restante.
Les fibres traitées sont ensuite soumises à une action mécanique avec un homogénéiseur-disperseur (Ultra-Turrax puissance 500 W, vitesse maximum pendant 3 minutes), suivie d'un traitement aux ultrasons pendant 3 minutes.
Selon un mode de réalisation, les dits procédés sont caractérisés, en ce que les fibres de cellulose obtenues à l'issue du procédé sont des nanofîbrilles de cellulose.
Selon un mode de réalisation, les dits procédés sont caractérisés, en ce que le donneur d'électron est choisi parmi l'ascorbate, le gallate, le catéchol, le glutathion réduit, les fragments de lignine et les carbohydrates déshydrogénases fongiques ; et de préférence l'ascorbate.
Selon un mode de réalisation, les dits procédés sont caractérisés, en ce que le substrat cellulosique est obtenu à partir de bois, d'un végétal fibreux riche en cellulose, de betterave, d'agrumes, de plantes annuelles à paille, d'animaux marins, d'algues, de champignons ou de bactéries.
Selon un mode de réalisation, les dits procédés sont caractérisés, en ce que le substrat cellulosique est choisi parmi les pâtes papetières chimiques, de préférence les pâtes papetières de bois chimiques, de préférence encore l'une au moins des pâtes papetières suivantes : les pâtes blanchies, les pâtes semi-blanchies, les pâtes écrues, les pâtes au bisulfite, les pâtes au sulfate, les pâtes à la soude, les pâtes kraft.
Selon un mode de réalisation, les dits procédés sont caractérisés, en ce que le substrat cellulosique est une pâte papetière dérivée du bois, de plantes annuelles ou de plantes à fibres.
Selon un mode de réalisation, les dits procédés sont caractérisés, en ce que ladite au moins une étape de traitement mécanique comprend l'un au moins des traitements mécaniques suivants :
- un traitement d'homogénéisation,
- un traitement de micro fluidisation,
- un traitement d'abrasion, et/ou
- un traitement de cryobroyage.
Selon un mode de réalisation, les dits procédés sont caractérisés, en ce que, suite à ladite étape de traitement mécanique, ledit procédé comprend une étape de posttraitement choisie parmi : un traitement acide, un traitement enzymatique, une oxydation, une acétylation, une silylation, ou encore une dérivatisation de groupements chimiques portés par les dites fibres de cellulose. Selon un autre objet, l'invention concerne des fibres de celluloses issues d'un procédé de défïbrillation et/ou d'un procédé de fabrication de fibres de cellulose tels que définis ci-dessus.
Les dites fibres de celluloses peuvent être caractérisées en ce que lesdites fibres de cellulose, de préférence de nanocellulose, comportent des cycles de glucose dont au moins un atome de carbone est oxydé en position(s) Ci et/ou C4, voire également C6.
Selon un mode de réalisation préféré, les fibres de celluloses sont des nano fibrilles de cellulose. Etape(s) de traitement(s) mécanique(s)
Le substrat cellulosique mis en contact avec la dite enzyme est ensuite soumis à au moins une étape de traitement mécanique qui est destinée à délaminer les fibres de cellulose pour l'obtention des nanocelluloses.
La délamination (dite encore « fibrillation » ou « défibrillation ») consiste à séparer, par un phénomène mécanique, les fibres de cellulose au sein du substrat cellulosique, notamment pour la fabrication de nanocelluloses.
Comme démontré, le clivage oxydatif des fibres de cellulose, catalysé par ladite au moins une LPMO, facilite la délamination de ces fibres de cellulose lors de l'étape de traitement mécanique.
Cette étape de délamination mécanique des fibres de cellulose peut alors être réalisée dans des conditions moins drastiques et donc moins coûteuses en énergie. Par ailleurs, l'utilisation de LPMOs selon l'invention permet d'introduire dans les fibres de cellulose des groupements chargés induisant des répulsions électrostatiques, sans contamination avec des réactifs de traitement, comme lors de l'utilisation de réactifs TEMPO.
Les traitements mécaniques visant à délaminer les fibres de cellulose sont connus de l'homme du métier et peuvent être mis en œuvre dans le(s) procédé(s) de l'invention.
De manière générale, on peut citer les traitements mécaniques faibles avec un homogénéiseur-disperseur (par exemple du type d'Ultra-Turrax) et/ou les traitements ultrasons.
On peut encore par exemple se référer au document de Lavoine N et al (Carbohydrate Polymers, 2012, (92) :735-64) qui décrit notamment (pages 740 à 744) des traitements mécaniques pour la préparation de cellulose micro fibrillée (par exemple des nanofïbrilles de cellulose).
Typiquement, un traitement mécanique peut être choisi parmi des traitements mécaniques d'homogénéisation, de micro fluidisation, d'abrasion, ou de cryobroyage.
Le traitement d'homogénéisation implique le passage du substrat cellulosique prétraité, typiquement une pâte de cellulose ou une suspension liquide de cellulose, au travers d'un espace étroit sous pression élevée (tel que décrit par exemple dans le brevet US 4,486,743).
Ce traitement d'homogénéisation est de préférence effectué au moyen d'un homogénéiseur de type Gaulin. Dans un tel dispositif, le substrat cellulosique prétraité, typiquement sous forme d'une suspension de cellulose, est pompé à haute pression et distribué au travers d'une valve automatique de faible orifice. Une succession rapide d'ouvertures et de fermetures de la valve soumet les fibres à une importante chute de pression (généralement d'au moins 20 MPa) et à une action de cisaillement à vitesse élevée suivie d'un impact de décélération à vitesse élevée. Le passage du substrat dans l'orifice est répété (généralement de 8 à 10 fois) jusqu'à ce que la suspension de cellulose devienne stable. Afin de maintenir une température du produit dans une gamme allant de 70 à 80°C durant le traitement d'homogénéisation, de l'eau de refroidissement est généralement utilisée.
Ce traitement d'homogénéisation peut également être mis en œuvre à l'aide d'un dispositif de type micro fluidiseur (voir par exemple Sisqueira et al. Polymer 2010 2(4) :728-65). Dans un tel dispositif, la suspension de cellulose passe au travers d'une fine chambre typiquement en forme de « z » (dont les dimensions du canal sont généralement comprises entre 200 et 400 μιη) sous pression élevée (environ 2070 bars). Le taux de cisaillement élevé qui est appliqué (généralement supérieur à 107.s_1) permet d'obtenir des nanofïbrilles très fines. Un nombre variable de passages (par exemple de 2 à 30, notamment de 10 à 30 ou de 5 à 25, et en particulier de 5 à 20) avec des chambres de tailles différentes peut être utilisé, pour augmenter le degré de fîbrillation.
Le traitement d'abrasion ou de meulage (voir par exemple Iwamoto Set al, 2007
Applied Physics A89(2) :461-66) est basé sur l'utilisation d'un dispositif de meulage apte à exercer des forces de cisaillement fournies par des pierres de meulage. Le substrat cellulosique prétraité, généralement sous forme d'une pâte de cellulose, est passé entre une pierre de meulage statique et une pierre de meulage en rotation, typiquement à une vitesse de l'ordre de 1500 rotations par minute (rpm). Plusieurs passages (généralement entre 2 et 5) peuvent être nécessaires pour obtenir des fibrilles de taille nanométrique.
Un dispositif de type mixeur (par exemple tel que décrit dans Unetani K et al, Bio macro molécules 2011, 12(2), pp.348-53) peut également être utilisé pour produire des microfibrilles à partir du substrat cellulosique prétraité, par exemple à partir d'une suspension de fibres de bois.
Le traitement de cryobroyage (ou cryoconcassage) (Dufresne et al, 1997,
Journal of Applied Polymer Science, 64(6) : 1185-94) consiste à broyer une suspension de substrat cellulosique prétraité préalablement congelée avec de l'azote liquide. Les cristaux de glace formés à l'intérieur des cellules font exploser les membranes cellulaires et libèrent des fragments de parois. Ces procédés sont généralement utilisés pour la production de microfibrilles de cellulose à partir de produits, ou de résidus, de l'agriculture.
Etape (s) de post-traitement du substrat cellulosique
Dans certains modes de réalisation, le procédé de défïbrillation et/ou de fabrication de fibres de cellulose comprend au moins une étape de post-traitement du substrat cellulosique, mise en œuvre après que ledit substrat ait été soumis au traitement mécanique.
Généralement, ladite au moins une étape de post-traitement vise à augmenter le degré de fïbrillation des celluloses (notamment des nanocelluloses) obtenues et/ou à conférer auxdites nanocelluloses de nouvelles propriétés mécaniques, en fonction des applications envisagées.
Ladite au moins une étape de post-traitement peut notamment être choisie parmi un traitement acide, un traitement enzymatique, une oxydation, une acétylation, une silylation, ou encore une dérivatisation de certains groupements chimiques portés par les micro fibrilles. On peut également se référer par exemple au document de Lavoine N et al (Carbohydrate Polymers, 2012, (92) :735-64) qui décrit notamment (point 2.3, pages 747 à 748) des post-traitements qui peuvent être combinés à différents prétraitements et traitements mécaniques des fibres de celluloses. Substrat cellulosique
Le substrat cellulosique peut être obtenu selon l'invention à partir de toute matière de la biomasse (englobant les matières organiques d'origine végétale, algues incluses, animale ou fongique) comprenant des fibres cellulosiques (c.à.d. des fibres de cellulose).
Le substrat cellulosique est obtenu avantageusement à partir de bois (dont la cellulose est le composant principal), mais aussi de tout végétal fibreux riche en cellulose, comme par exemple, le coton, le lin, le chanvre, le bambou, le kapok, les fibre de noix de coco (coir), la ramie, la jute, le sisal, le raphia, le papyrus et certains roseaux, la bagasse de canne à sucre, la betterave (et notamment la pulpe de betterave), les agrumes, les tiges de maïs ou de sorgho, ou encore les plantes annuelles à paille.
Les substrats cellulosiques peuvent également être obtenus à partir d'animaux marins (comme le tunicier par exemple), d'algues (comme par exemple Valonia ou Cladophora) ou de bactéries pour la cellulose bactérienne (comme par exemple les souches bactériennes de types Gluconacetobacter).
On choisira, selon les applications, de la cellulose issue de parois primaires comme le parenchyme des fruits (par exemple les betteraves, les agrumes etc.) ou de parois secondaires, comme le bois.
Le substrat cellulosique consiste avantageusement en un matériau cellulosique préparé par des moyens chimiques ou mécaniques, à partir de toute source cellulosique telle que mentionnée ci-dessus (et notamment à partir du bois).
Le substrat cellulosique se présente avantageusement sous la forme d'une suspension de fibres de cellulose dans un milieu liquide (de préférence un milieu aqueux), ou d'une pâte de cellulose.
Les pâtes de cellulose peuvent être conditionnées à l'état « sec », soit typiquement dans un état de siccité supérieur ou égal à 80%, notamment supérieur ou égal à 90%). La pâte de cellulose peut ensuite être redispersée dans un milieu aqueux par un traitement mécanique.
De préférence, le substrat cellulosique contient au moins 90%>, notamment au moins 95% et de préférence 100% de fibres de celluloses.
De préférence, le substrat cellulosique est adapté à la fabrication de papier ou d'un produit cellulosique. Le substrat cellulosique est ainsi de préférence choisi parmi les pâtes papetières (ou pâte à papier), et en particulier les pâtes papetières chimiques.
De manière générale, la pâte de cellulose et notamment la pâte papetière peut contenir, en association avec les fibres de cellulose, de l'hémicellulose et de la lignine. De préférence, la pâte de cellulose contient moins de 10% et notamment moins de 5% de lignine et/ou d'hémicellulose.
De préférence, les pâtes papetières chimiques contiennent quasiment exclusivement, voire exclusivement des fibres de cellulose.
La pâte papetière peut être choisie parmi l'une au moins des pâtes papetières suivantes : les pâtes blanchies, les pâtes semi-blanchies, les pâtes écrues, les pâtes au bisulfite (écrues ou blanchies), les pâtes au sulfate (écrues ou blanchies), les pâtes à la soude (écrues ou blanchies) et les pâtes kraft.
Il est également possible d'utiliser des pâtes à dissoudre ayant une faible proportion d'hémicellulose, de préférence inférieure à 10% et notamment inférieure ou égale à 5%.
De préférence, les pâtes papetières utilisées dans un procédé de l'invention sont des pâtes de bois, notamment des pâtes papetières chimiques de bois.
Selon un mode de réalisation, le substrat cellulosique est une pâte papetière dérivée du bois, de plantes annuelles ou de plantes à fibres.
Un matériel contenant de la lignocellulose, tel que défini ci-après, est un exemple de substrat cellulosique particulièrement considéré selon l'invention.
Dans un mode de réalisation préféré, le matériel contenant de la lignocellulose contient au moins 30%> wt. %, de préférence au moins 50 wt. %, encore plus préférentiellement, au moins 70% wt. %, et encore plus préférentiellement au moins 90%) wt. % de lignocellulose. Il est noté que le matériel contenant la lignocellulose peut aussi contenir d'autres composants tels que du matériel proteique, amidon, sucres, tels que des sucres pouvant fermenter et /ou des sucres ne pouvant fermenter.
Un matériel contenant de la lignocellulose peut être tout matériel contenant de la lignocellulose. Dans une représentation préférée le matériel contenant de la lignocellulose contient au moins 30% wt. %, de préférence au moins 50 wt. %, encore plus préférentiellement, au moins 70% wt. %, et encore plus préférentiellement au moins 90% wt. % de lignocellulose. Il est important de comprendre que le matériel contenant la lignocellulose peut aussi contenir d'autres composants tels que du matériel protéique, amidon, sucres, tels que des sucres pouvant fermenter et /ou des sucres ne pouvant fermenter.
Le matériel contenant la lignocellulose est généralement présent, par exemple, dans les tiges, les feuilles, le son, les enveloppes et les rachis des plantes ou feuilles, branches, et le bois des arbres. De manière non-limitative, le matériel contenant la lignocellulose peut aussi être du matériel herbacé, des restes de l'agriculture et de la sylviculture, des déchets municipaux solides, des déchets papier, et des restes de broyage de pulpe et de papier. Il faut comprendre ici que le matériel contenant la lignocellulose peut se trouver sous la forme de matériel de la paroi cellulaire de la plante contenant de la lignine, cellulose, et hémicellulose dans une matrice mixte.
Selon certains modes de réalisation particuliers, le matériel contenant de la lignocellulose est une biomasse lignocellulosique choisie dans le group consistant en : l'herbe, le switchgrass, la spartine, l'ivraie, la baldingère faux-roseau, le miscanthus, les résidus de transformation du sucre, la bagasse de canne à sucre, les déchets agricoles, la paille de riz, la balle de riz, la paille d'orge, l'épi de maïs, la paille de céréales, la paille de blé, la paille de canola, la paille d'avoine, la coque d'avoine, la canne de maïs, la farine de soja, la farine de maïs, les déchets forestiers, la fibre de pâte de bois recyclée, la boue de papier, la sciure de bois, le bois dur, le bois résineux, l'agave et ses combinaisons. Dans un mode de réalisation préféré, le matériel contenant de la lignocellulose est choisi dans un groupe comprenant : la farine de maïs, la fibre de maïs, la paille de riz, le bois de pin, les copeaux de bois, le peuplier, la bagasse, le papier et les déchets de traitement de la pâte.
De préférence, le matériel contenant la lignocellulose est une biomasse lignocellulosique à base de bois. D'autres exemples de matériel contenant de la lignocellulose incluent du bois dur comme le peuplier et le bouleau, le bois tendre, la paille des céréales telle que la paille de blé, le millet vivace, les déchets municipaux solides, les déchets industriels organiques, les papiers de bureau et un mélange de ces derniers.
Selon des modes de réalisation exemplifîés, le matériel contenant de la lignocellulose est sélectionné à partir de pin, de peuplier et de paille de blé. Enzyme de type LPMO selon l'invention (famille AAxx)
Une enzyme selon l'invention est définie en tant qu'enzyme à activité polysaccharide-oxydase, ladite enzyme possédant une identité de séquences en acides aminés d'au moins 20% avec un polypeptide de référence de SEQ ID NO. 1, 2 ou 3, à partir de la méthode de comparaison BLAST-P, ladite méthode de comparaison BLAST-P résultant en une valeur-E (E- value) de 10 e~3 ou moins.
Selon certains modes de réalisations, la dite enzyme à activité polysaccharide- oxydase possède une identité de séquences en acides aminés d'au moins 30% avec un polypeptide de référence de SEQ ID NO. 1, 2 ou 3, à partir de la méthode de comparaison BLAST-P, ladite méthode de comparaison BLAST-P résultant en une valeur-E (E-value) de 10 e"3 ou moins.
Selon certains modes de réalisations, la dite enzyme à activité polysaccharide- oxydase possède une identité de séquences en acides aminés d'au moins 60%> avec un polypeptide de référence de SEQ ID NO. 1, 2 ou 3, à partir de la méthode de comparaison BLAST-P, ladite méthode de comparaison BLAST-P résultant en une valeur-E (E-value) de 10 e"3 ou moins.
Selon certains modes de réalisations, la dite enzyme à activité polysaccharide- oxydase possède une identité de séquences en acides aminés d'au moins 90%> avec un polypeptide de référence de SEQ ID NO. 1, 2 ou 3, à partir de la méthode de comparaison BLAST-P, ladite méthode de comparaison BLAST-P résultant en une valeur-E (E-value) de 10 e"3 ou moins.
Selon certains modes de réalisation, la dite enzyme à activité polysaccharide- oxydase possède une identité de séquences en acides aminés d'au moins 90%> avec un polypeptide de référence de SEQ ID NO 1, à partir de la méthode de comparaison BLAST-P, ladite méthode de comparaison BLAST-P résultant en une valeur-E (E-value) de 10 e"3 ou moins.
Selon certains modes de réalisation, la dite enzyme à activité polysaccharide- oxydase possède une identité de séquences en acides aminés d'au moins 90%> avec un polypeptide de référence de SEQ ID NO 2, à partir de la méthode de comparaison BLAST-P, ladite méthode de comparaison BLAST-P résultant en une valeur-E (E-value) de 10 e"3 ou moins. Selon certains modes de réalisation, la dite enzyme à activité polysaccharide- oxydase possède une identité de séquences en acides aminés d'au moins 90% avec un polypeptide de référence de SEQ ID NO 3, à partir de la méthode de comparaison BLAST-P, ladite méthode de comparaison BLAST-P résultant en une valeur-E (E-value) de 10 e"3 ou moins.
Selon certains modes de réalisations, la dite enzyme à activité polysaccharide- oxydase est codée par un acide nucléique ayant au moins 90% d'identité de séquence avec un acide nucléique choisi dans le groupe consistant en SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 et SEQ ID NO. 6.
A titre illustratif, lorsqu'une enzyme à activité polysaccharide-oxydase de séquence SEQ ID NO. 2 est comparée au polypeptide de référence SEQ ID NO. 1 selon la méthode de comparaison BLAST-P, (i) la dite enzyme à activité polysaccharide-oxydase de SEQ ID NO. 2 possède une identité de séquences en acides aminés de 66% par référence au polypeptide de séquence SEQ ID NO.l et (ii) la méthode de comparaison BLAST-P résulte en une E-value de 4 e-133.
Egalement à titre illustratif, lorsqu'une enzyme à activité polysaccharide- oxydase de séquence SEQ ID NO. 3 est comparée au polypeptide de référence SEQ ID NO. 1 selon la méthode de comparaison BLAST-P, (i) la dite enzyme à activité polysaccharide-oxydase de SEQ ID NO. 2 possède une identité de séquences en acides aminés de 34% par référence au polypeptide de séquence SEQ ID NO.l et (ii) la méthode de comparaison BLAST-P résulte en une E-value de 2 e"40.
Selon des modes de réalisation préférés, la dite enzyme à activité polysaccharide-oxydase est choisie dans le groupe comprenant des polypeptides ayant l'une des références GenBank suivantes: ALO60293.1; CCA68158.1; CCA68159.1; CCA68161.1; CCA71530.1; CCA72554.1; CCA72555.1; CCO30796.1; CCT73728.1; CDM26384.1; CD076981.1; CD076983.1; CDO76990.1; CDR41535.1; CDZ98469.1; CDZ98532.1; CDZ98792.1; CDZ98793.1; CEJ62913.1; CEJ80690.1; CEL55274.1; CEL55761.1; CEN61973.1; CEQ41736.1; CRL20539.1; CUA74138.1; CUA75968.1; EEB87294.1; EEB88604.1; EEB93106.1; EGU12035.1; EGU79270.1; EJU02917.1; EJU04796.1; EJU04797.1; EKC98083.1; EKD01731.1; EKD04876.1; EKG10038.1; ELU37011.1; ELU44209.1; EMD31282.1; EMD34047.1; EMT65805.1; ENH74989.1; EPT05587.1; EPT05590.1; EPT05591.1; EUC56978.1; EUC64931.1; EWG51104.1; EWY85510.1; EXK29887.1; EXU99300.1; GA089447.1; GAQ 10202.1; GAT49547.1;
GAT49548.1; GAT52486.1; GAT61130.1; GAT61131.1; KDE05902.1; KDE09071.1;
KDN48575.1; KDN50638.1; KDQ07356.1; KDQ08649.1; KDQ08700.1; KDQ08703.1;
KDQ11515.1; KDQ12702.1; KDQ15932.1; KDQ19064.1; KDQ25667.1; KDQ34148.1; KDQ59091.1; KDQ59092.1; KDR69809.1; KDR78641.1; KDR82083.1; KEP48245.1;
KEY82804.1; KFG85718.1; KFH41721.1; KFY94807.1; KFZ00858.1; KFZ20368.1;
KGB74552.1; KID86720.1; KII89650.1; KII89670.1; KIJ14235.1; KIJ14422.1;
KIJ36788.1; KIJ36789.1; KIJ36910.1; KIJ36911.1; KIJ59037.1; KIJ62866.1; KIJ66712.1;
KIJ93961.1; KIKO 1335.1; KIKO 1364.1; KIK03019.1; KIK24220.1; KIK24223.1; KIK45012.1; KIK47453.1; KIK58046.1; KIK60325.1; KIK64405.1; KIK64418.1;
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KIL68458.1; KIL88744.1; KIM29500.1; KIM34148.1; KIM35038.1; KIM39331.1;
KIM49751.1; KIM57407.1; KIM60439.1; KIM60441.1; KIM60443.1; KIM60444.1;
KIM84967.1; KIM93034.1; KIM95301.1; KIM95307.1; KIN08100.1; KIN97734.1; KIN97736.1; KIN97737.1; KIO31600.1; KIP08019.1; KIP08026.1; KIP10435.1;
KIR25380.1; KIR50229.1; KIR55806.1; KIR67208.1; KIW62805.1; KIY36322.1;
KIY46248.1; KIY46262.1; KIY46497.1; KIY46927.1; KIY47293.1; KIY51548.1;
KIY64670.1; KIY68736.1; KIY71843.1; KJA14486.1; KJA19114.1; KJA20550.1;
KJA20613.1; KJK82496.1; K 098459.1; KKP01653.1; KLT38889.1; KLT39034.1; KLT43002.1; KLT43602.1; KLT43893.1; KLT46239.1; KMK54965.1; K Z77897.1;
K Z78922.1; KPA38710.1; KPI34779.1; KPM37038.1; KPV71930.1; KPV77521.1;
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KWU44477.1; KXH42132.1; KXH43636.1; KXH51881.1; KXN82218.1; KXN84873.1;
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KZT07581.1; KZT07590.1; KZT20429.1; KZT29895.1; KZT40257.1; KZT57664.1;
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XP 007337360.1; XP 007343208.1; XP 007346002.1; XP 007349200.1;
XP 007349275.1; XP 007351346.1; XP 007351348.1; XP 007351349.1;
XP 007351518.1; XP 007352398.1; XP 007353707.1; XP 007359130.1;
XP 007362490.1; XP 007362492.1; XP 007362499.1; XP 007362779.1;
XP 007388801.1; XP 007388810.1; XP 007393138.1; XP 007393767.1;
XP 007581903.1; XP 007600909.1; XP 007746185.1; XP 007765609.1;
XP 007768205.1; XP 007792087.1; XP 007792157.1; XP 007826256.1;
XP 007849383.1; XP 007867180.1; XP 007867564.1; XP 008039133.1;
XP 008039347.1; XP 008039803.1; XP 008039807.1; XP 008718658.1;
XP 008731148.1; XP 009256644.1; XP 009545121.1; XP 009545122.1;
XP 011321625.1; XP 012046198.1; XP 012181508.1; XP 012183613.1;
XP 013257070.1; XP 013271081.1; XP 013277879.1; XP 013332110.1;
XP 013943298.1; XP 013944931.1; XP 013954691.1; XP 013960458.1;
XP 014176455.1; XP 014180074.1; XP 014180075.1; XP 014181917.1;
XP 014543483.1; XP 014573268.1; XP 016242373.1; XP 016271225.1;
XP 016275235.1; XP 016275300.1; XP 016610141.1; XP 016620042.1; XP_016630521.1; XP_567250.1; XP_753127.1 et XP_778151.1.
Selon des modes de réalisation préférés, la dite enzyme à activité polysaccharide-oxydase consiste en une protéine recombinante. Selon certains de ces modes de réalisation préférés, la dite protéine recombinante est produite dans une levure qui a été génétiquement transformée pour produire la dite enzyme recombinante à activité polysaccharide-oxydase.
Selon certains modes de réalisation préférés, la dite enzyme à activité polysaccharide-oxydase ayant une séquence en acides aminés comprenant, voire consistant en, SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO. 3, et/ou au moins l'une des enzymes identifiées par leur numéro GenBank ci-dessus.
Selon certains modes de réalisation, la dite enzyme à activité polysaccharide- oxydase est codée par un acide nucléique ayant une séquence en acides nucléiques choisie dans un groupe comprenant SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 et SEQ ID NO. 6.
Selon certains modes de réalisation préférés, plusieurs enzymes à activité polysaccharide-oxydase peuvent être mises en oeuvre au sein d'un même procédé. En particulier, le support cellulosique considéré peut être mis (ou avoir été mis) en contact avec une pluralité d'enzymes à activité polysaccharide-oxydase selon l'invention, et tout particulièrement une pluralité d'enzymes à activité polysaccharide-oxydase comprenant une séquence en acides aminés comprenant, voire consistant en, SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO. 3, et/ou au moins l'une des enzymes identifiées par leur numéro GenBank ci-dessus.
Selon certains modes de réalisation préférés, plusieurs enzymes à activité polysaccharide-oxydase peuvent être mises en oeuvre au sein d'un même procédé. En particulier, le support cellulosique considéré peut être mis (ou avoir été mis) en contact avec une pluralité d'enzymes à activité polysaccharide-oxydase selon l'invention, et tout particulièrement une pluralité d'enzymes à activité polysaccharide-oxydase codées par un acide nucléique choisi dans un groupe parmi SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, et SEQ ID NO. 6, et/ou au moins l'une des enzymes identifiées par leur numéro GenBank ci-dessus.
Selon certains de ces modes de réalisation, la dite enzyme à activité polysaccharide-oxydase, ou la dite pluralité d'enzymes, est mise en oeuvre dans une composition à activité polysaccharide-oxydase.
Ainsi, selon ces modes de réalisation, la dite pluralité d'enzymes à activité polysaccharide-oxydase comprend entre 2 et 10 enzymes à activité polysaccharide-oxydase distinctes, ce qui inclut 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, enzymes à activité polysaccharide-oxydase distinctes.
Selon certains modes de réalisation encore plus particuliers, une composition à activité polysaccharide-oxydase est susceptible de comprendre une ou plusieurs autres enzymes activité polysaccharide-oxydase choisies parmi les LPMOs, ce qui inclut les enzymes choisies dans un groupe comprenant: AA9, AA10, AA11 et AA13 LPMOs Méthodes pour identifier les polypeptides appartenant à la famille AAxx
Les inventeurs décrivent ici la structure cristallographique du module catalytique PcAAxxB (JGI ID 1372210; GenBank ID #KY769370) appartenant à une enzyme à activité polysaccharide-oxydase. Sont également divulguées près de 300 enzymes à activité polysaccharide-oxydase selon l'invention, lesquelles appartiennent à la même famille enzymatique, incluant les polypeptides de séquence SEQ ID N°l, SEQ ID
N°2 et SEQ ID N°3.
Pour référence, la séquence SEQ ID N°3, correspond au polypeptide SEQ ID
N°9 après clivage du peptide signal; et la séquence SEQ ID N°8 correspond au peptide signal clivé.
Ainsi, en combinant ces données structural et les séquences consensus dérivables de cette sélection d'enzymes à activité polysaccharide-oxydase, il est possible de déterminer n'importe quel variant ayant l'activité polysaccharide-oxydase considérée.
De manière non-limitative, des méthodes bio-informatiques existent pour identifier de nouveaux variants faisant partie de la dite nouvelle famille de LPMO, en mettant en oeuvre d'une part une modélisation in silico basée sur la diste structure cristallographique, et d'autre part les dits alignements de séquence. Des exemples de tels programmes aptes à réaliser de tels modèles tridimensionels (homology & comparative modeling) incluent:
- MODELLER© V.9.18 (see B. Webb, A. Sali. Comparative Protein Structure
Modeling Using Modeller. Current Protocols in Bioinformatics, John Wiley & Sons, Inc., 5.6.1-5.6.32, 2014) ;
- I-TASSER V.5.1 (See J Yang, R Yan, A Roy, D Xu, J Poisson, Y Zhang. The I-TASSER Suite: Protein structure and function prédiction. Nature Methods, 12: 7-8 (2015)) and
- SWISS-MODEL homology-modelling server (see Biasini M, Bienert S, Waterhouse A, Arnold K, Studer G, Schmidt T, Kiefer F, Cassarino TG, Bertoni M, Bordoli L, Schwede T (2014). SWISS-MODEL: modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information (Nucleic Acids Research 2014 (1 July 2014) 42 (Wl): W252-W258).
Ainsi, selon un mode de réalisation, il est possible d'identifier des enzymes à activité polysaccharide oxydases, selon une méthode comprenant les étapes suivantes: al) identifier un ou plusieurs polypeptides susceptibles d'avoir une activité polysaccharide-oxydase;
a2) identifier des coordonnées expérimentales d'une chaîne principale d'un polypeptide de référence, incluant ou non les positions des chaînes latérales, la dite chaîne principale et/ou les dites chaînes latérales étant comprises dans un polypeptide de séquence SEQ ID NO. 2 ou SEQ ID NO. 7, ou un de leurs fragments à activité polysaccharide- oxydase;
a3) identifier un alignement de séquence d'un ou plusieurs des dits polypeptides candidats avec un polypeptide de référence possédant une identité de séquence de 20 % ou plus avec SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO 3 ou SEQ ID NO 7 selon la méthode de comparaison BLAST-P, caractérisés en ce que les dits un ou plus polypeptides candidats possèdent une E-value de 10 e-3 ou moins;
b) déterminer à partir de al), a2), et a3), les coordonnées théoriques des dits un ou plusieurs polypeptides candidats;
c) déterminer la déviation RMSD (root-mean-square déviation) desdites coordonnées théoriques avec les coordonnées expérimentales du dit polypeptide référence;
étant entendu qu'un RMSD augmenté des dites coordonnées théoriques par rapport aux coordonnées expérimentales au delà d'un seuil de référence, indique une plus faible probabilité d'avoir une activité polysaccharide-oxydase;
étant entendu qu'un RMSD diminué des dites coordonnées théoriques par rapport aux coordonnées expérimentales au delà d'un seuil de référence, indique une plus forte probabilité d'avoir une activité polysaccharide-oxydase;
d) optionnellement, choisir les un ou plus polypeptides candidats dont les coordonnées théoriques définissent un site d'interaction au cuivre de type "histidine brace active site", formé par deux résidus Histidine et une tyrosine, l'un des deux résidus Histidine étant une Histidine N-terminale. EXEMPLES
MATERIEL & METHODES A.1. clonage et production des gènes
La séquence de nucléotides a été synthétisée par optimisation de codons à partir de P. pastoris (GenScript, Piscataway, USA, et ensuie insérée avec la séquence signal native dans un vecteur pPICZaA (Invitrogen, Cergy-Pontoise, France) en utilisant les sites de restriction BstBl and Xbal, en phase avec la séquence (His)6 tag en C-terminal. La souche P. pastoris X33 et le vecteur pPICZaA sont des composants du système Easy Select Expression System (Invitrogen), et tous les milieux et protocoles sont décrits dans e manuel du fabricant (Invitrogen).
La transformation des colonies compétentes P. pastoris X33 a été réalisée par électroporation à partir d'un plasmide recombinant pPICZaA linéarisé par Pmel tel que décrit dans Bennati-Granier et al (Biotechnol. Bio fuels 8, 90 (2015)).
Les transformants résistants à la Zeocine ont été ensuite testés (criblés) en fonction de leur production de protéine. Les meilleurs transformants ont été cultivés dans 2 litres de BMGYcontenant 1 ml.l -1 de sels minéraux Pichia (PTM4) comme suit: (2 g.l -1 CuS04.5H20, 3 g.l -1 MnS04.H20, 0.2 g.l -1 Na2Mo04.2H20, 0.02 g.l -1 H3BO3, 0.5 g.l -1 CaS04.2H20, 0.5 g.l -1 CaCl2, 12.5 g.l -1 ZnS04.7H20, 22 g.l -1 FeS04.7H20, biotin 0.2 g.l -1, H2S04 1 ml.l -1); sous agitation à 30°C (200 rpm) jusqu'à une OD6oo comprise entre 2 et 6.
Les cellules sont ensuite transférées dans 400 mL de BMMY contenant 1 ml.l -1 de sels PTM4 à 20 °C sous agitation (200 rpm) pendant 3 jours, supplémentés avec 3 % (v/v) de méthanol chaque jour.
La purification a été réalisée comme déjà décrit dans Bennati-Granier et al (2015) et la protéine concentrée est dialysée dans un tampon sodium acétate, pH 5.2 et stockée à 4°C. A.2. Production des LPMO de type AAxx par P. coccineus
Le transformant produisant la plus grande quantité de protéine a été sélectionné pour la culture en bioréacteur. Celle-ci est réalisée dans des fermenteurs de type New Brunswick BioFlo 115 contenant 1,3L (Eppendorf, Hamburg, Germany) selon le protocole de fermentation de P. pastoris (Invitrogen) contenant quelques modifications. P. pastoris est cultivé en milieu solide YPD agar (20 g.L-1 peptone, 10 g.L-1 yeast extract, 20 g.L-1 glucose, 20 g.L-1 agar). lOOmL de milieu BMGY contenu dans une flasque de 500mL sont inoculés à partir d'une colonie isolée de P. pastoris et incubé à 30°C dans un incubateur rotatif sous agitation (200 rpm) pendant 16 à 18h jusqu'à l'obtention d'une DO 600 comprise entre 4 et 6. Un inoculum de 10% (v/v) provenant de cette préculture servira à ensemencer le bioréacteur. La première étape de la culture en batch se fait dans 400 mL de milieu minimum contenant 40 g.L-1 glycerol; 26.7 mL.L-1 H 3 P04 ; 14.9 g.L-1 MgS04 .7H20; 0.93 g.L-1 CaS04 .2H20; 7.7 g.L-1 KC1; 4.13 g.L-1 KOH; 4.35 mL.L-1 PTM 1 sait solution (6 g.L-1 CuS04 .5H 2 O, 0.08 g.L-1 Nal, 3 g.L-lMnS04 .H 2 O, 0.2 g.L-1 Na2Mo04 .2H20, 0.02 g.L-1 H3BO 3 , 0.5 g.L-1 CoC12 , 20 g.L-1 ZnCl 2 .7H20, 0.2 g.L-lbiotin, 5 mL.L-1 H2SO 4 , 65 g.L-1 FeS04 .7H 2 O). Cette étape est réalisée à 30°C, sous agitation à 400 rpm et à pH maintenu à 5 par ajout d'hydroxyde d'ammonium (28% v/v). L'oxygénation du milieu est contrôlée à 20% par un enrichissement en oxygène par cascade (0-50%>) selon débit gazeux de 0.5 v.v.m. 200 mL de Pluriol 8100 (BASF, Ludwigshafen, Germany) sont ajoutés à la culture en tant qu'agent antimoussant. Après 20 à 24h de culture, la seconde phase débute par l'ajout simultané de 50 g de sorbitol et de 0.5%) de méthanol (v /v) au bioréacteur afin que les levures basculent sur le métabolisme du méthanol (environ 5h). Pendant cette phase, l'agitation est augmentée jusqu'à 500 rpm et le pH est progressivement augmenté jusqu'à pH6 par ajout d'hydroxyde d'ammonium (28%o v/v). La phase d'induction (phase 3) débute par l'ajout d'une solution de méthanol contenant 12 mL.L-1 de sels PTM1 (contenant du cuivre) selon un mode « fed-batch ». Le débit initial est de 1.47 mL.h-1 et est augmenté après environ 14h d'incubation à 2.94mL.h-l . La phase d'induction est réalisée à 20°C et la concentration d'oxygène dissous est maintenu à 20%> par agitation (800rpm), débit gaz (0.2-1 v.v.m.) et la cascade d'oxigéne (0-50%>). La phase d'induction est poursuivie pendant 144h.
A3. Purification des LPMOs de type AAxx de P. pastoris
Les surnageants de la culture sont récupérés après centrifugation à 2700 g pendant 5 min à 4 °C et sont passés à travers des filtres de 0.45 μιτι (Millipore, Molsheim, France) afin d'enlever les cellules restantes. Pour les enzymes présentant un tag 6xhis, le pH est ajusté à 7.8 et les surnageants sont filtrés une seconde fois à travers des filtres de 0.2 μηι avant d'être déposé dans une colonne His Trap HP de 5 mL (GE healthcare, Bue, France) connecté au système Akta Xpress (GE healthcare). La colonne est équilibrée dans un tampon contenant 50 mM de Tris HC1 pH 7.8 et 150 mM de NaCl (buffer A) avant la charge. Après le dépôt des surnageants, la colonne est lavée avec 5 volumes de colonnes (CV) de buffer A contenant lOmM d'imidazole. L'élution est ensuite réalisée par le passage de 5 CV de buffer A contenant 150 mM d'imidazole. Les fractions contenant la protéine purifiée sont assemblées et concentrées en utilisant un concentrateur vivaspin 3kDa (Sartorius, Palaiseau, France) avant d'être chargé dans une colonne HiLoad 16/600 Superdex 75 Prep Grade (GE Helthcare) pour séparation dans 50 mM de tampon acétate à pH 5.2. L'analyse de la fïltration par gel a montré que les protéines PcAAxx sont monomériques en solution même après addition de cuivre. Pour les enzymes ne contenant de tag 6xhis, les sels contenus dans le milieu de culture sont dilués 10 fois dans 20 mM de Tris-HCl pH 8 et les protéines sont ensuite concentrées en utilisant une cassette Pellicon-2 avec un eut off de lOkDa (Millipore) jusqu'à obtenir un volume d'environ 200 mL qui sera chargé dans une colonne High Prep DEAE de 20 mL (GE Healthcare). Les protéines sont ensuite éluées de la colonne selon un gradient linéaire de 1M de NaCl (0 à 700mM dans 200mL). Les fractions sont ensuite analysées par SDS-PAGE pour vérifier la présence de la protéine recombinante et les fractions contenant la protéine sont rassemblées dans un même échantillon et concentrées. Les protéines concentrées sont enfin incubées pendant une nuit dans une solution contenant leur équivalent molaire de cuivre avant une autre étape de séparation utilisant une colonne HiLoad 16/600 Superdex 75 Prep Grade dans 50 mM de tampon acétate à pH 5.2. Enfin les fractions contenant les protéines purifiées sont rassemblées dans un même échantillon et concentrées avec une colonne de concentration vivaspin 3kDa (Sartorius).
A.4. Cristallisation des protéines PcAAxxB purifiées
Les protéines purifiées PcAAxxB (JGI ID 1372210; GenBank ID #KY769370) sont concentrées avec un concentrateur Vivaspin lOkDa en polyethersulfone (Sartorius). La concentration des protéines est déterminée en mesurant ΓΑ280 nm de la solution avec un Nanodrop ND-2000 (Wilmington, Delaware, USA). Toutes les expériences de cristallisation ont été réalisées à 20 °C par la technique de gouttes assises (diffusion par vapeur) en plaque de cristallisation à 96 puits (Swissci) avec un robot de cristallisation mosquito® Crystal (TTP labtech). Les réservoirs contiennent 40 μΐ, de solution de criblage commerciale et les gouttes de cristallisation sont préparées en mélangeant 100 nL de solution réservoir avec 100, 200 et 300 nL de solution contenant la protéine à cristalliser. Un premier résultat a été obtenu au bout d'une semaine à partir d'une des conditions préparée avec la solution screen AmSO 4 (Qiagen) contenant 2.4 M (NH4) 2 S04 et 0.1M d'acide citrique pH4. Afin d'obtenir des cristaux capable de générer un signal de diffraction, cette condition de cristallisation a été optimisée en mélangeant la solution protéique à 28 mg.mL-1 avec une solution de précipitation composée de 2.4 M (NH4)2 S 04 et de 0.1 M d'acide citrique à pH 4.4 selon un ratio en volume de 3: 1. Les cristaux de PcAAxxB sont générés en une semaine à la dimension de 0.15x0.15x0.05 mm. Les cristaux appartiennent au groupe d'espace P41212 et possèdent des axes de 204x204x 110 Â et 2 molécules par unité asymétrique. A.5. Collecte des données, détermination de la structure et affinement
A des fins de cryoprotection, les cristaux de PcAAxx sont incubés pendant 5 min dans une solution de 2.4M Li2SO4 pour remplacer les 2.4M de (NH4)2 S04 de la solution mère avant un refroidissement instantané dans de l'azote liquide. Comme les premières tentatives de scan de fluorescence par rayon X sur les crystaux natifs n'a pas révélés la présence significative d'atome de cuivre au sein des cristaux, un cristal dérivé est obtenu par introduction d'un atome lourd en incubant les cristaux dans la solution réservoir supplémentée avec 55 mM du complexe gadoteridol- gadolinium (Gd) avant le refroidissement. Les données de la diffraction initiale ont été collectées avec une ligne de lumière beamline ID23-1, tandis que les données MAD ont été collectées avec une ligne de lumière beamline ID30B au laboratoire European Synchrotron Radiation Facility (ESRF), Grenoble, France. Les données ont ensuite été indexées et intégrées dans le groupe d'espace P41212 un utilisant XDS. Le traitement des données nécessaire a été réalisé avec la suite de programme CCP4. La détermination de la sous structure de GD3+ et le phasage subséquent combiné à l'aplanissement du solvant (solvent flattening) a été réalisé avec SHELXC/D/E, et en utilisant les données S AD collectées sur le bord du Gd qui ont permis d'obtenir un coefficient de corrélation de 71.8%. A partir des phases expérimentales, un modèle initial contenant 526 résidus (sur 584) a été automatiquement construit avec Buccaneer et ensuite manuellement complété avec Coot (44). Ce modèle initial a été utilisé pour raffinement corps rigide (rigid body) suivi de raffinement restreint contre les données natives avec le programme Refrnac. Un jeu aléatoire de 5% de réflexions a été mis en oeuvre pour permettre la validation du modèle. La qualité du modèle a été déterminée avec les modules internes de Coot et en utilisant le serveur Molprobity. Les données collectées et les statistiques d'affïnement sont résumées ci- dessous :
Tableau 1 : Statistiques d'affïnement
Figure imgf000039_0001
A.6. Analyse bioinformatique des LPMOs AAxx
Les séquences des AAxx de P. coccineus (Genbank ID KY769369 and KY769370) ont été comparées à la base de données de séquences non redondantes de NCBI avec BlastP (29) en février 2016. Les analyses par blast à partir de AAxx n'ont pas permis de retrouver AA9s, AAlOs, AAl ls, ou AA13s avec des scores significatifs, et inversement. MUSCLE a été utilisé pour réaliser les alignements multiples. Afin d'éviter les interférences dues à la présence ou à l'absence de résidus additionnels, les peptides signaux et les extensions C-terminal ont été retirées. Les analyses bio informatiques ont été réalisées à partir de 286 génomes fongiques préalablement séquencés et partagés par des collaborateurs du JGI. Les clusters protéiques sont disponibles grâce au JGI (https ://goo . gl/Z Aa2NX) pour chacune des variétés de champignons. 100 alignements de protéines provenant de clusters de protéines sélectionnés ont préalablement été nettoyés et fusionnés afin de générer un arbre phylogénétique. Ces clusters sont présents en une copie », autant que possible, en une copie dans toutes les variétés de champignons pour améliorer le score∑l/n (n représente le nombre de copie dans le génome). Les séquences provenant des clusters ont été alignées avec Mafft et nettoyées avec Gblocks, et l'arbre phylogénétique a été généré par concaténation des alignements avec Fasttree. L'arbre est visualisé avec Dendroscope et Bio::phylo.
Voir figure 1 pour l'arbre phylogénétique et les figures 3A et 3B correspondant à la séquence consensus du module catalytique. A.7. protocole de charge du cuivre
Les enzymes AAxx ont été chargées en cuivre à partir de sels de cuivre (sulfate ou acétate) pendant ou après la purification. Les protéines ont été incubées avec 10 équivalent molaire de sels de cuivre entre 2h et une nuit à 4°C. L'excès de cuivre a ensuite été retiré par diafiltration avec des centricons de 3kDa ou par chromatographie par filtration sur gel. La présence de cuivre peut être déterminée par spectrométrie de masse couplée à un plasma inductif (ICP-MS), comme décrit ci-dessous.
A.8. Analyse ICP-MS
Avant l'analyse, les échantillons sont minéralisés dans un mélange contenant 2/3 d'acide nitrique (Sigma-Aldrich, 65 % Purissime) et 1/3 d'acide hydrochlorique (Fluka, 37%, Trace Select) à 120°C. Les résidus sont dilués dans de l'eau ultrapure (2 mL) avant l'analyse par ICP-MS. L'instrument permettant l'analyse ICP-MS est un ICAP Q (ThermoElectron, Les Ullis, France), équipé d'une chambre de collision. La courbe de calibration est obtenue par la dilution d'une solution certifiée multi-éléments (Sigma- Aldrich). Les concentrations en cuivre sont déterminées avec le programme Plasmalab (Thermo-Electron), à une masse d'intérêt de m/z=63.
A.9. Tests de défibrillation
Des dispersions aqueuses de fibres de cellulose Kraft sont ajustées à pH 5.2 dans un tampon acétate (50 mM), dans un volume réactionnel final de 5 mL. Le polypeptide de séquence SEQ ID N°l (LPMO AAxx) est ajouté aux fibres à une concentration finale de 20 mg.g"1 en présence d'acide ascorbique à 1 mM. L'incubation enzymatique est réalisée à 40°C sous agitation légère pendant 48 heures. Les échantillons sont ensuite dispersés par un homogénéiseur Polytron PT2100 Kinematica AG, Allemagne) pendant 3 minutes, puis soumis à ultrasonication avec un sonicateur de type QSonica Q700 (20 kHz, QSonica LLC, Newtown, USA) à une puissance d'ultrasons de 350 W pendant 3 minutes comme décrit précédemment {Villares et al, Sci Rep. 2017 Jan 10; 7:40262. doi: 10.1038/srep40262) . L'échantillon de référence est soumis au même traitement, en l'absence d'enzyme. Les fibres de cellulose (référence et traité par PcAAxx) sont déposées sur une lamelle de verre et observées par microscope polarisant BX51 (Olympus France S.A.S.) avec un objectif 4x. Les images sont prises avec une caméra de type U-CMAD3 (Olympus Japon).
Les images en microscopie optique ainsi qu'en microscopie de force atomique (AFM) et microscopie électronique à transmission (TEM) ont été prises après le dépôt des fibres à une concentration 0.1 g/L sur des substrats solides, après séchage par courant d'azote.
RESULTATS
Exemple 1: structure cristallographique du module catalytique de PcAAxxB (JGI ID 1372210; GenBank ID #KY769370) à 3.0 À
La structure cristallographique du module catalytique de PcAAxxB (JGI ID 1372210; GenBank ID #KY769370), affiné à une résolution de 3.0 Â, révèle un noyau ("core") structuré et un site catalytique formé selon un mode de coordination canonique de type "histidine brace", exposé à la surface.
PcAAxxB (#KY769370) a été produit en grandes quantités chez Pichia pastoris et purifié jusqu'à homogénéité.
La structure de PcAAxxB a été résolue par la technique MAD (multiple- wave length anomalous dispersion) à partir du signal du gadolinium, puis affinée à 3.0 Â de résolution. Le noyau de la protéine se structure en un large sandwich β antiparallèle, un repliement qui est globalement similaire à celui déjà identifié pour d'autres familles.
Le site actif de PcAAxxB est constitué par Hisl, His99 et Tyrl76, qui forment un mode de coordination canonique de type "histidine brace" (voir figure 2). Par contraste avec les surfaces planes d'interaction avec le ligand qui sont ordinairement observables chez les LPMOs de type AA9, la surface de PcAAxxB a une forme ridée ("rippled shape") présentant un clamp formé par deux boucles proéminentes, visible à partir du format pdb (Protein Data Bank). Cinq N-glycanes sont attachés à la structure cristallographique de PcAAxxB, à travers les résidus Asparagine suivants: Asnl3, Asn76, Asnl33, Asnl83 et Asn217.
La structure cristallographique indique en outre la présence de 10 résidus Cystéine impliqués dans cinq ponts disulfure, aux positions suivantes: Cys67 & Cys90; Cysl09 & Cysl36; Cysl53 & Cysl58; Cysl60 & Cysl82; Cys202 & Cys218.
La structure cristallisée inclut deux molécules par unité asymétrique. Les coordonnées de la chaîne A sont ici présentées au format pdb. La chaîne B, qui fait également partie de l'unité asymétrique, n'est pas représentée ici.
Lorsqu'elle est visualisée par le logiciel PyMOL© Viewer 1.7.4.5 Edu (Schrodinger, LLC), la structure est caractérisée par 6 feuillets β formant un coeur de type sandwich-β antiparallèle, dont les limites (par référence à la séquence SEQ ID N°2) sont définies comme suit:
- du résidu Phe53 à Glu64;
- du résidu Cysl09 à Alal 14;
- du résidu Thrl28 à Asnl33;
- du résidu Phel41 à Vall46;
- du résidu Cysl58 à Trpl64;
- du résidu Metl77 à Thrl85.
La séquence SEQ ID N°7 correspond au fragment minimal de séquence SEQ ID N°2 comprenant les trois acides aminés impliqués dans la triade catalytique fixant le cuivre, incluant le résidu Histidine en position N-terminale, et comprenant en outre le sandwich-β antiparallèle, jusqu'au résidu Thrl85.
Les résidus suivants compris dans la séquence SEQ ID N°2 peuvent être en outre positionnés par rapport à une séquence consensus dérivée de la figure 3, comme suit: Tableau 1A: Séquence Consensus et position sur SEQ ID N°2
Figure imgf000043_0001
Tableau 1B: Séquence Consensus et position sur SEQ ID N°2 (Résidus Cystéine)
Figure imgf000043_0002
Exemple 2: Défibrillation de supports cellulosiques issus de bouleau et résineux sous l'action des mono-oxvgénases lytiques de polysaccharides (LPMO)
Les fibres sont mises en contact d'une enzyme à activité polysaccharide oxydase selon l'invention, de séquence SEQ ID N°l, et d'ascorbate puis soumises à une agitation douce pendant 48 heures. En absence d'enzyme les fibres restent intactes et aucune modification n'est constatée.
Après 48 heures de traitement en présence de l'enzyme, un début de défibrillation est constaté après la dispersion mécanique des fibres.
Les dispersions ont été ensuite analysées par microscopie optique, microscopie électronique en transmission (TEM) et microscopie à force atomique (AFM). Les images montrent des structures de dimensions nano métriques. Les fibres sont entièrement déstructurées laissant apparaître les zones cristallines de la fibre (figures 4 et 5).
Exemple 3 : Production de peroxide d'oxygène par les polypeptides de séquences SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2 et SEQ ID NO.3
Afin de déterminer la fonction des polypeptides de séquence SEQ ID N°l, SEQ ID N°2 et SEQ ID N°3, leur capacité à produire du peroxide d'hydrogène ( H202) a été évaluée, en présence d'oxygène et d'un donneur d'électrons (ascorbate). Une production significative d' H202 a été détectée. Cette production est similaire en amplitude à celle observée pour les LPMOs d'autres familles décrites dans la littérature, telles que les LPMOs AA9 de P. anserina (Bennati-Granier et al., 2015, Biotechnol. Bio fuels 8, 90). Exemple 4 : Activité de dégradation de polysaccharides de polypeptides de séquences SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2 et SEQ ID NO.3, dans un test de dégradation séquencielle de lignocellulose
La dégradation de biomasse ligocellulosique par des polypeptides de séquences SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2 et d'un cocktail de cellulase de T.reesei a été testé par réactions séquentielles. Des supports cellulosiques de type "peuplier" ont d'abord été incubés avec 2.2 μΜ (équivalent à 70 μg) de polypeptide de séquence SEQ ID NO. 1 ou 2.2 μΜ (équivalent à 70 μg) de polypeptide de séquence SEQ ID NO.2 pendant 48 heures; suite auxquelles 10 μg de cocktail de cellulases T. reesei TR3012 ont été rajoutés. Les réactions ont été incubées pendant 24 heures.
L'analyse des sucres solubles libérés a été faite selon plusieurs méthodologies (DNS assay, RTU assay et HPAEC), lesquelles ont montré une amélioration de la libération de glucose et de cello-oligosaccharides. L'addition de quantités supplémentaires de polypeptides de séquences SEQ ID NO. 1 ou SEQ ID NO.2 a résulté en une augmentation proportionnelle de la libération de glucose.
Exemple 5 : Activité de dégradation de polysaccharides de polypeptides de séquences SEQ ID NO. 1, et SEQ ID NO. 2 dans un test de dégradation séquencielle de lignocellulose, en présence de LPMO de type AA9
La dégradation de biomasse ligocellulosique par des polypeptides de séquences
SEQ ID NO. 1, en combinaison avec des LPMOs de type AA9, a été testé par réactions séquentielles.
Des supports cellulosiques de type "peuplier" ont d'abord été incubés avec (i) un milieu de contrôle, (ii) 2.2 μΜ (équivalent to 35 μg) de polypeptide SEQ ID NO. 1 , (iii) 2.2. μΜ de LPMO de type AA9 et (iv) 1.1 μΜ de polypeptide SEQ ID NO. 1 et 1.1. μΜ de LPMO de type AA9, pendant 48 heures; suite auxquelles 10 μg de cocktail de cellulases T. reesei TR3012 ont été rajoutés. Les réactions ont été incubées pendant 24 heures.
L'analyse des sucres solubles libérés a été faite selon plusieurs méthodologies (DNS assay, RTU assay et HPAEC), lesquelles ont montré une amélioration de la libération de glucose et de cello-oligosaccharides.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d'un substrat cellulosique pour la fabrication de fibres de cellulose, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes consistant à :
a) disposer d'un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose ; b) mettre en contact, en présence d'un donneur d'électron, le dit substrat avec au moins une enzyme appartenant à la famille des mono-oxygénases lytiques de polysaccharides (LPMOs) dans des conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose;
caractérisé en ce que ladite enzyme est une polysaccharide-oxydase possédant une identité de séquences en acides aminés d'au moins 20% avec un polypeptide de référence de SEQ ID NO. 1, 2 ou 3, à partir de la méthode de comparaison BLAST-P, ladite méthode de comparaison BLAST-P résultant en une valeur-E (E-value) de 10 e-3 ou moins.
2. Procédé de préparation d'un substrat cellulosique selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite enzyme possède une identité de séquences en acides aminés d'au moins 90% avec un polypeptide de référence de SEQ ID NO. 1, 2 ou 3.
3. Procédé de préparation d'un substrat cellulosique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le donneur d'électron est choisi parmi l'ascorbate, le gallate, le catéchol, le glutathion réduit, les fragments de lignine et les carbohydrates déshydrogénases fongiques ; et de préférence l'ascorbate.
4. Procédé de préparation d'un substrat cellulosique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le substrat cellulosique est obtenu à partir de bois, d'un végétal fibreux riche en cellulose, de betterave, d'agrumes, de plantes annuelles à paille, d'animaux marins, d'algues, de champignons ou de bactéries.
5. Procédé de préparation d'un substrat cellulosique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le substrat cellulosique est choisi parmi les pâtes papetières chimiques, de préférence les pâtes papetières de bois chimiques, de préférence encore l'une au moins des pâtes papetières suivantes :
- les pâtes blanchies,
- les pâtes semi-blanchies, - les pâtes écrues,
- les pâtes au bisulfite,
- les pâtes au sulfate,
- les pâtes à la soude,
- les pâtes kraft.
6. Procédé de préparation d'un substrat cellulosique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le substrat cellulosique est une pâte papetière dérivée du bois, de plantes annuelles ou de plantes à fibres.
7. Utilisation d'un substrat cellulosique préparé selon l'une quelconque des revendications précédentes, à titre de matière première cellulosique, pour fabriquer des fibres de cellulose, via un procédé de défibrillation.
8. Procédé de défibrillation d'un substrat cellulosique, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes consistant à :
a) disposer d'un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose, lequel a été préalablement mis en contact avec un donneur d'électrons et une enzyme à activité polysaccharide-oxydase, dans des conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose en présence d'un donneur d'électron, caractérisé en ce que la dite enzyme à activité polysaccharide-oxydase possède une identité de séquences en acides aminés d'au moins 20% avec un polypeptide de référence de SEQ ID NO. 1, 2 ou 3, à partir de la méthode de comparaison BLAST-P, ladite méthode de comparaison BLAST-P résultant en une valeur-E (E-value) de 10 e"3 ou moins ; et
b) traiter mécaniquement ledit substrat cellulosique, afin de défibriller le dit substrat.
9. Procédé de défibrillation d'un substrat cellulosique selon la revendication précédente, caractérisé en ce que ladite au moins une étape de traitement mécanique comprend l'un au moins des traitements mécaniques suivants :
- un traitement d'homogénéisation,
- un traitement de micro fluidisation,
- un traitement d'abrasion, et/ou
- un traitement de cryobroyage.
10. Procédé de défibrillation d'un substrat cellulosique selon l'une quelconque des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce que, suite à ladite étape de traitement mécanique, ledit procédé comprend une étape de post-traitement choisie parmi : un traitement acide, un traitement enzymatique, une oxydation, une acétylation, une silylation, ou encore une dérivatisation de groupements chimiques portés par les dites fibres de cellulose.
11. Procédé de fabrication de fibres de cellulose, lequel procédé comprend au moins les étapes suivantes consistant à:
a) disposer d'un substrat cellulosique apte à former des fibres de cellulose ; b) mettre en contact, en présence d'un donneur d'électron, ledit substrat cellulosique avec au moins une enzyme appartenant à la famille des mono-oxygénases lytiques de polysaccharides (LPMOs) dans des conditions aptes à assurer un clivage oxydatif desdites fibres de cellulose;
c) traiter mécaniquement ledit substrat cellulosique, afin de fabriquer lesdites fibres de cellulose à partir du dit substrat cellulosique,
caractérisé en ce que ladite enzyme est une polysaccharide-oxydase possédant une identité de séquences en acides aminés d'au moins 20% avec un polypeptide de référence de SEQ ID NO. 1, 2 ou 3, à partir de la méthode de comparaison BLAST-P, ladite méthode de comparaison BLAST-P résultant en une valeur-E (E -value) de 10 e-3 ou moins.
12. Procédé de fabrication de fibres de cellulose, selon la revendication précédente, caractérisé en ce que les dites fibres de cellulose sont des nano fibrilles de cellulose.
13. Fibres de celluloses issues d'un procédé de défibrillation selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, et/ou d'un procédé de fabrication de fibres de cellulose selon l'une quelconque des revendications 11 ou 12.
14. Fibres de celluloses selon la revendication précédente, caractérisées en ce que lesdites fibres comportent des cycles de glucose dont au moins un atome de carbone est oxydé en position(s) Ci et/ou C4, voire également C6.
15. Fibres de celluloses selon l'une quelconque des revendications 13 ou 14, caractérisées en ce que les dites fibres sont des nanofibrilles de cellulose.
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