CA2979123A1 - Production de synthons glycosyles par voie enzymatique - Google Patents
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Abstract
La présente invention est relative à un procédé de fabrication d'un synthon glycosylé, ou monomère, comprenant au moins une étape de mise en présence d'au moins une glycane-saccharase avec au moins un synthon hydroxylé et au moins un saccharose. Elle concerne également un procédé de fabrication d'un glyco(co)polymère comprenant la polymérisation d'au moins 2 monomères obtenus, indépendamment, à l'issue du procédé de glycosylation enzymatique selon l'invention ainsi qu'un procédé de fabrication d'un glyco(co)polymère, de préférence à blocs, comprenant le couplage d'au moins 2 monomères obtenus, indépendamment, à l'issue du procédé de glycosylation enzymatique selon l'invention.
Description
PRODUCTION DE SYNTHONS GLYCOSYLES PAR VOIE ENZYMATIQUE
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte au domaine de la glycosylation par voie enzymatique de synthons hydroxylés afin d'obtenir des monomères glycosylés.
La présente invention se rapporte également à de nouvelles voies de synthèse chimio-enzymatiques de glyco(co)polymères fondées sur la polymérisation chimique ou sur une réaction de couplage chimique des monomères glycosylés obtenus par voie enzymatique.
ART ANTERIEUR
Les glyco(co)polymères suscitent un intérêt croissant ces dernières années de par leur large potentiel dans de nombreux secteurs biotechnologiques et industriels.
L'introduction d'unités glucidiques dans des macromolécules synthétiques peut conférer aux polymères de nouvelles propriétés physico-chimiques, par exemple accroître leurs solubilités, modifier leurs caractères hydrophobes, et ouvrir ainsi la voie à de nouvelles applications industrielles. Dans les secteurs biomédicaux, ces glyco(co)polymères suscitent un vif intérêt pour la fabrication de biomatériaux destinés à la réparation de lésions, à
l'ingénierie tissulaire (Cho et al., Biomaterials. 2006 Feb;27(4):576-85. Epub 2005 Aug 8), à la vectorisation de principes actifs (Ahmes et Narain, Biomaterials. 2011 Aug;32(22):5279-90), ou encore pour modifier et rendre biocompatible une surface hydrophobe. De même, les glyco(co)polymères sont particulièrement intéressants dans le domaine du diagnostic biologique (Abraham et al., Biomaterials. 2005 Aug;26(23):4767-78), comme support pour le couplage covalent de biomolécules, ou comme architectures multivalentes favorisant les processus de reconnaissance avec certaines protéines (Spain et al., Polym. Chem., 2011,2, 60-68 ; Vasquez-Dorbatt et al., Chembiochem. 2012 Nov 26;13(17):2478-87).
Au vu du large panel d'utilisation de cette classe de macromolécules, le développement de voies de synthèse efficaces permettant d'accéder à des glyco(co)polymères de structures et fonctionnalités contrôlées ainsi qu' à des architectures macromoléculaires complexes et inédites est un enjeu majeur.
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte au domaine de la glycosylation par voie enzymatique de synthons hydroxylés afin d'obtenir des monomères glycosylés.
La présente invention se rapporte également à de nouvelles voies de synthèse chimio-enzymatiques de glyco(co)polymères fondées sur la polymérisation chimique ou sur une réaction de couplage chimique des monomères glycosylés obtenus par voie enzymatique.
ART ANTERIEUR
Les glyco(co)polymères suscitent un intérêt croissant ces dernières années de par leur large potentiel dans de nombreux secteurs biotechnologiques et industriels.
L'introduction d'unités glucidiques dans des macromolécules synthétiques peut conférer aux polymères de nouvelles propriétés physico-chimiques, par exemple accroître leurs solubilités, modifier leurs caractères hydrophobes, et ouvrir ainsi la voie à de nouvelles applications industrielles. Dans les secteurs biomédicaux, ces glyco(co)polymères suscitent un vif intérêt pour la fabrication de biomatériaux destinés à la réparation de lésions, à
l'ingénierie tissulaire (Cho et al., Biomaterials. 2006 Feb;27(4):576-85. Epub 2005 Aug 8), à la vectorisation de principes actifs (Ahmes et Narain, Biomaterials. 2011 Aug;32(22):5279-90), ou encore pour modifier et rendre biocompatible une surface hydrophobe. De même, les glyco(co)polymères sont particulièrement intéressants dans le domaine du diagnostic biologique (Abraham et al., Biomaterials. 2005 Aug;26(23):4767-78), comme support pour le couplage covalent de biomolécules, ou comme architectures multivalentes favorisant les processus de reconnaissance avec certaines protéines (Spain et al., Polym. Chem., 2011,2, 60-68 ; Vasquez-Dorbatt et al., Chembiochem. 2012 Nov 26;13(17):2478-87).
Au vu du large panel d'utilisation de cette classe de macromolécules, le développement de voies de synthèse efficaces permettant d'accéder à des glyco(co)polymères de structures et fonctionnalités contrôlées ainsi qu' à des architectures macromoléculaires complexes et inédites est un enjeu majeur.
2 PCT/EP2016/055843 Ces dernières années, des efforts notables ont été consacrés au développement de voies chimiques de synthèse de plus en plus sophistiquées permettant de mieux contrôler la glycosylation des polymères synthétiques.
En effet, un intérêt croissant est exprimé pour des glycopolymères hybrides, différant des polysaccharides naturels, et formés d'une partie synthétique, de type (méth)acrylate, (méth)acrylamide, styrène, norbornényle, acétate de vinyle, peptide,... et d'une partie glucidique.
Différentes méthodes de synthèse de glyco(co)polymères comprenant un squelette synthétique décoré par des groupements glucidiques ont été explorées par le passé
(Ladmiral et al., Eur Polym J, 2004, 40, 431-449 ; Spain et al., J. Polym.
Sci. Part. A-Polym.
Chem, 2007,45, 2059-2072) qui consistent en:
- la glycosylation chimique de polymères synthétiques.
Toutefois, cette méthode présente l'inconvénient de conduire souvent à de faibles degrés de fonctionnalisation liés à des problèmes d'encombrement stérique.
Pour contourner ce problème, les fonctions réactives portées par le polymère doivent être éloignées du squelette du polymère afin d'augmenter la réactivité
tout en diminuant l'encombrement stérique généré par le greffage des séquences saccharidiques pendantes.
Là encore, cela nécessite la production de synthons réactifs et la polymérisation de monomères non conventionnels (Slavin et al., Eur Polym J, 2011, 47, 435-446).
- la polymérisation (anionique, radicalaire ou par ouverture de cycles) de monomères glycosylés, obtenus principalement par voie chimique, après plusieurs étapes et en particulier des étapes de protection/déprotection sélectives des fonctions hydroxyle des sucres.
La glycosylation des synthons est aujourd'hui principalement effectuée par voie chimique, requérant donc des procédés multi-étapes fastidieux et difficilement contrôlables.
Cette voie d'obtention est la plus répandue.
De façon générale, la synthèse des glycomonomères se révèle souvent très pénible, nécessitant des étapes de protection et déprotection coûteuses en temps ainsi que l'emploi de catalyseurs métalliques ou solvants toxiques. De plus, la diversité des structures saccharidiques accessibles par ces voies reste encore limitée. Enfin, dans certains cas, des
En effet, un intérêt croissant est exprimé pour des glycopolymères hybrides, différant des polysaccharides naturels, et formés d'une partie synthétique, de type (méth)acrylate, (méth)acrylamide, styrène, norbornényle, acétate de vinyle, peptide,... et d'une partie glucidique.
Différentes méthodes de synthèse de glyco(co)polymères comprenant un squelette synthétique décoré par des groupements glucidiques ont été explorées par le passé
(Ladmiral et al., Eur Polym J, 2004, 40, 431-449 ; Spain et al., J. Polym.
Sci. Part. A-Polym.
Chem, 2007,45, 2059-2072) qui consistent en:
- la glycosylation chimique de polymères synthétiques.
Toutefois, cette méthode présente l'inconvénient de conduire souvent à de faibles degrés de fonctionnalisation liés à des problèmes d'encombrement stérique.
Pour contourner ce problème, les fonctions réactives portées par le polymère doivent être éloignées du squelette du polymère afin d'augmenter la réactivité
tout en diminuant l'encombrement stérique généré par le greffage des séquences saccharidiques pendantes.
Là encore, cela nécessite la production de synthons réactifs et la polymérisation de monomères non conventionnels (Slavin et al., Eur Polym J, 2011, 47, 435-446).
- la polymérisation (anionique, radicalaire ou par ouverture de cycles) de monomères glycosylés, obtenus principalement par voie chimique, après plusieurs étapes et en particulier des étapes de protection/déprotection sélectives des fonctions hydroxyle des sucres.
La glycosylation des synthons est aujourd'hui principalement effectuée par voie chimique, requérant donc des procédés multi-étapes fastidieux et difficilement contrôlables.
Cette voie d'obtention est la plus répandue.
De façon générale, la synthèse des glycomonomères se révèle souvent très pénible, nécessitant des étapes de protection et déprotection coûteuses en temps ainsi que l'emploi de catalyseurs métalliques ou solvants toxiques. De plus, la diversité des structures saccharidiques accessibles par ces voies reste encore limitée. Enfin, dans certains cas, des
3 PCT/EP2016/055843 mélanges de structures indésirables sont obtenus et rendent difficile le contrôle de la réaction de polymérisation et par la suite de la structure et des propriétés des polymères.
Par exemple, la synthèse du 2-(hydroxy)ethyl methacrylate (HEMA) glucosylé, le 2-methacryloyloxyethyl-a-D-glucopyranoside (MEG1c), concerné par la présente invention, n'a jusqu'à présent été réalisée que par voie chimique.
En particulier, Kitazawa (Kitazawa et al., Chem Lett, 1990, 19, No. 9, 1733-1736) ont proposé une synthèse basée sur l'utilisation de donneur de glucose comme le méthylglucoside, de l'acide pho sp homo lyb digue comme catalyseur et du 2,4-dinitrochlorobenzène comme inhibiteur. Cependant, la stéréosélectivité de cette méthode est faible.
De même, Nakaya (Nakaya et al., Makromol. Chem., Rapid. Commun., 1993, 14, 77-83) ont, en 1993, synthétisé un autre glucopolymère en faisant réagir le HEMA avec du bromure de 2,3,4,6-tetra-0-acetyl-a-D-glucopyranose en présence d'oxyde d'argent ou de cyanure de mercure, selon la méthode de Helferich (Helferich et Weis, Chem.
Ber., 1956, 89, 314-321).
Afin d'améliorer les rendements et d'éviter l'utilisation des sels de mercure, toxiques, une autre voie chimique a été proposée par Ambrosi en 2002 (Ambrosi et al.
J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 2002, 45-52). La glucosylation était alors faite en couplant le donneur de glucose, le bromure de 2,3,4,6-tetra-0-acetyl-a-D-glucopyranose à
l'accepteur, le HEMA, dans du dichlorométhane anhydre, en utilisant du trifluorométhanesulfonate d'argent comme catalyseur. La réaction dure toutefois 6 jours et le rendement est de 80 %.
Le polymère est ensuite obtenu par polymérisation radicalaire.
Face aux divers problèmes précédemment énoncés, les procédés enzymatiques se positionnent très favorablement en raison de la spécificité et sélectivité
d'action des enzymes pour contourner les difficultés de la synthèse chimique et proposer une alternative éco-compatible , diminuant non seulement l'utilisation de produits nocifs (catalyseurs métalliques, solvants organiques) mais également les coûts et les temps de production des monomères glycosylés.
Un grand nombre d'enzymes responsables de la synthèse, la dégradation et la modification des glucides sont aujourd'hui répertoriées dans la nature. De surcroît, cette diversité peut être étendue de façon considérable à l'aide de techniques d'ingénierie enzymatique permettant de concevoir à façon ou d'améliorer les biocatalyseurs.
Par exemple, la synthèse du 2-(hydroxy)ethyl methacrylate (HEMA) glucosylé, le 2-methacryloyloxyethyl-a-D-glucopyranoside (MEG1c), concerné par la présente invention, n'a jusqu'à présent été réalisée que par voie chimique.
En particulier, Kitazawa (Kitazawa et al., Chem Lett, 1990, 19, No. 9, 1733-1736) ont proposé une synthèse basée sur l'utilisation de donneur de glucose comme le méthylglucoside, de l'acide pho sp homo lyb digue comme catalyseur et du 2,4-dinitrochlorobenzène comme inhibiteur. Cependant, la stéréosélectivité de cette méthode est faible.
De même, Nakaya (Nakaya et al., Makromol. Chem., Rapid. Commun., 1993, 14, 77-83) ont, en 1993, synthétisé un autre glucopolymère en faisant réagir le HEMA avec du bromure de 2,3,4,6-tetra-0-acetyl-a-D-glucopyranose en présence d'oxyde d'argent ou de cyanure de mercure, selon la méthode de Helferich (Helferich et Weis, Chem.
Ber., 1956, 89, 314-321).
Afin d'améliorer les rendements et d'éviter l'utilisation des sels de mercure, toxiques, une autre voie chimique a été proposée par Ambrosi en 2002 (Ambrosi et al.
J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 2002, 45-52). La glucosylation était alors faite en couplant le donneur de glucose, le bromure de 2,3,4,6-tetra-0-acetyl-a-D-glucopyranose à
l'accepteur, le HEMA, dans du dichlorométhane anhydre, en utilisant du trifluorométhanesulfonate d'argent comme catalyseur. La réaction dure toutefois 6 jours et le rendement est de 80 %.
Le polymère est ensuite obtenu par polymérisation radicalaire.
Face aux divers problèmes précédemment énoncés, les procédés enzymatiques se positionnent très favorablement en raison de la spécificité et sélectivité
d'action des enzymes pour contourner les difficultés de la synthèse chimique et proposer une alternative éco-compatible , diminuant non seulement l'utilisation de produits nocifs (catalyseurs métalliques, solvants organiques) mais également les coûts et les temps de production des monomères glycosylés.
Un grand nombre d'enzymes responsables de la synthèse, la dégradation et la modification des glucides sont aujourd'hui répertoriées dans la nature. De surcroît, cette diversité peut être étendue de façon considérable à l'aide de techniques d'ingénierie enzymatique permettant de concevoir à façon ou d'améliorer les biocatalyseurs.
4 PCT/EP2016/055843 Pourtant, malgré un fort potentiel d'innovation, les voies de production enzymatique de synthons glycosylés n'ont été que peu explorées à ce jour.
Dans les années 90, Kobayashi a décrit l'utilisation d'une 13-galactosidase avec comme substrats le 4-nitrophenyl N-acety1-13-Dglucosaminide et du lactose pour conduire à
la p-Nitrophenyl N-acetyl-f3-lactosaminide (Kobayashi et al., J Carbohydr Chem, 1994, 13, 753-766). Cette étape enzymatique est suivie d'une réduction de la fonction nitro en fonction amine pour ensuite accrocher une fonction acrylate.
Dans les années 2000, des lipases ont été utilisées pour l'estérification de différents sucres avec des (méth)acrylates, avec toutefois des rendements et des sélectivités limitées (Albertin et al., Macromolecules, 2004, 37 (20), pp 7530-7537 ; Miura et al., J
Polym Sci Part A-Polym Chem, 2004, 42, 4598-4606; Park et al., J Biomed Mater Res A.
2004 Dec 1;71(3):497-507 ; Kulshrestha et al., ACS Symp Ser, 2005, vol. 900, pp. 327-342;
Tsukamoto et al., J Chem Technol Biotechnol, 2008, 83, 1486-1492).
Très récemment, il a été proposé des voies de production enzymatique de glycosides insaturés de type vinyle à l'aide de glycoside-hydrolases utilisées en synthèse soit en réaction d'hydrolyse inverse par contrôle thermodynamique, soit en réaction de transglycosylation par contrôle cinétique (Kloosterman et al., Green Chem., 2014,16, 203-210; Kloosterman et al., Green Chem., 2014,16, 1837-1846; Kloosterman et al., Macromol Biosci, 2014, 14 (9), 1268-1279; US2012/0028308 ; US2012/0028307 ;
Mazzocchetti et al., Macromol Biosci. 2014 Feb;14(2):186-94).
Toutefois, l'ensemble de ces procédés présentent un rendement, une vitesse de réaction ainsi qu'une sélectivité insuffisants. La diversité ainsi que la taille des sucres pouvant être obtenus à l'issus de ces procédés sont également limitées.
Il existe en conséquence un besoin, dans l'état de la technique, pour un procédé
enzymatique permettant la glycosylation de synthons hydroxylés structurellement très variables.
Il existe un besoin pour un procédé de glycosylation de synthons hydroxylés qui permette d'économiser du temps et des coûts dans la production de synthons glycosylés, ou monomères.
Il existe également un besoin pour un procédé permettant de mieux contrôler les degrés de glycosylation des synthons et les structures ainsi que leur distribution.
Dans les années 90, Kobayashi a décrit l'utilisation d'une 13-galactosidase avec comme substrats le 4-nitrophenyl N-acety1-13-Dglucosaminide et du lactose pour conduire à
la p-Nitrophenyl N-acetyl-f3-lactosaminide (Kobayashi et al., J Carbohydr Chem, 1994, 13, 753-766). Cette étape enzymatique est suivie d'une réduction de la fonction nitro en fonction amine pour ensuite accrocher une fonction acrylate.
Dans les années 2000, des lipases ont été utilisées pour l'estérification de différents sucres avec des (méth)acrylates, avec toutefois des rendements et des sélectivités limitées (Albertin et al., Macromolecules, 2004, 37 (20), pp 7530-7537 ; Miura et al., J
Polym Sci Part A-Polym Chem, 2004, 42, 4598-4606; Park et al., J Biomed Mater Res A.
2004 Dec 1;71(3):497-507 ; Kulshrestha et al., ACS Symp Ser, 2005, vol. 900, pp. 327-342;
Tsukamoto et al., J Chem Technol Biotechnol, 2008, 83, 1486-1492).
Très récemment, il a été proposé des voies de production enzymatique de glycosides insaturés de type vinyle à l'aide de glycoside-hydrolases utilisées en synthèse soit en réaction d'hydrolyse inverse par contrôle thermodynamique, soit en réaction de transglycosylation par contrôle cinétique (Kloosterman et al., Green Chem., 2014,16, 203-210; Kloosterman et al., Green Chem., 2014,16, 1837-1846; Kloosterman et al., Macromol Biosci, 2014, 14 (9), 1268-1279; US2012/0028308 ; US2012/0028307 ;
Mazzocchetti et al., Macromol Biosci. 2014 Feb;14(2):186-94).
Toutefois, l'ensemble de ces procédés présentent un rendement, une vitesse de réaction ainsi qu'une sélectivité insuffisants. La diversité ainsi que la taille des sucres pouvant être obtenus à l'issus de ces procédés sont également limitées.
Il existe en conséquence un besoin, dans l'état de la technique, pour un procédé
enzymatique permettant la glycosylation de synthons hydroxylés structurellement très variables.
Il existe un besoin pour un procédé de glycosylation de synthons hydroxylés qui permette d'économiser du temps et des coûts dans la production de synthons glycosylés, ou monomères.
Il existe également un besoin pour un procédé permettant de mieux contrôler les degrés de glycosylation des synthons et les structures ainsi que leur distribution.
5 PCT/EP2016/055843 Il existe ainsi en outre un besoin pour des enzymes aptes à glycosyler des synthons hydroxylés de différentes natures, permettant ainsi d'aboutir à une grande diversité
de synthons glycosylés, ou monomères, polymérisables ou pouvant être couplés par réaction de couplage.
Il existe de plus un besoin pour un procédé de synthèse de glyco(co)polymères, permettant avantageusement d'accéder à une plus grande diversité
d'architectures macromoléculaires pour différents domaines d'applications (biomatériaux, matériel d'implant, ingénierie tissulaire, diagnostic biologique, délivrance de principes actifs, ...).
Il existe un besoin pour un procédé de synthèse de glyco(co)polymères qui permette d'économiser du temps et des coûts dans la production de glyco(co)polymères.
Il existe en outre un besoin pour des procédés limitant l'utilisation de produits jugés toxiques.
La présente invention permet avantageusement de répondre à l'ensemble de ces besoins.
RESUME DE L'INVENTION
Ainsi, la présente invention fournit un procédé de fabrication d'un synthon glycosylé, ou monomère, comprenant au moins une étape de mise en présence d'au moins une glycane-saccharase avec au moins un synthon hydroxylé et au moins un saccharose, dans lequel :
(A) ledit synthon hydroxylé est choisi dans le groupe constitué :
(i) des synthons (méth)acrylates/(méth)acrylamides de formule (I) :
Ri Xi \
R, / -HO (I) dans laquelle :
R1 représente un atome d'hydrogène ou un alkyle en C1-C3;
de synthons glycosylés, ou monomères, polymérisables ou pouvant être couplés par réaction de couplage.
Il existe de plus un besoin pour un procédé de synthèse de glyco(co)polymères, permettant avantageusement d'accéder à une plus grande diversité
d'architectures macromoléculaires pour différents domaines d'applications (biomatériaux, matériel d'implant, ingénierie tissulaire, diagnostic biologique, délivrance de principes actifs, ...).
Il existe un besoin pour un procédé de synthèse de glyco(co)polymères qui permette d'économiser du temps et des coûts dans la production de glyco(co)polymères.
Il existe en outre un besoin pour des procédés limitant l'utilisation de produits jugés toxiques.
La présente invention permet avantageusement de répondre à l'ensemble de ces besoins.
RESUME DE L'INVENTION
Ainsi, la présente invention fournit un procédé de fabrication d'un synthon glycosylé, ou monomère, comprenant au moins une étape de mise en présence d'au moins une glycane-saccharase avec au moins un synthon hydroxylé et au moins un saccharose, dans lequel :
(A) ledit synthon hydroxylé est choisi dans le groupe constitué :
(i) des synthons (méth)acrylates/(méth)acrylamides de formule (I) :
Ri Xi \
R, / -HO (I) dans laquelle :
R1 représente un atome d'hydrogène ou un alkyle en C1-C3;
6 PCT/EP2016/055843 R2 représente un groupement alkylène en C1-C20; ou un groupement (C2H40)., avec n étant un entier compris entre 1 et 10 ; et X1 représente ¨(0)¨, ¨(NH)¨, -(S)- ou ¨(NR'2(OH))¨, de préférence ¨(0)¨, ¨(NH)¨, ou ¨(NR'2(OH))¨, avec R'2 représentant un groupement alkylène en Ci-C20 ; ou un groupement ¨(C2H40).,¨, avec m étant un entier compris entre 1 et 10;
(ii) des synthons styréniques de formule (II) :
HO (II) dans laquelle R3 représente une liaison covalente ; un groupement alkylène en C1-C20; ou un groupement (C2H40)õ, avec n étant un entier compris entre 1 et 10;
(iii) des synthons N-Carboxyanhydride (NCA) de formule (III) :
H R7 H (III) dans laquelle R4 représente une liaison covalente ; un groupement alkylène en C1-C20; ou un groupement (C2H40)õ, avec n étant un entier compris entre 1 et 10;
(iv) des synthons lactones/lactames/thiolactones de formule (IV) :
/OH
RÃ ________________________________________ R5 (IV) dans laquelle :
R5 représente une liaison covalente ; un groupement alkylène en Ci-C20 ; ou un groupement (C2H40)õõ avec m étant un entier compris entre 1 et 10 ;
n représente un entier compris entre 1 et 20 ;
(ii) des synthons styréniques de formule (II) :
HO (II) dans laquelle R3 représente une liaison covalente ; un groupement alkylène en C1-C20; ou un groupement (C2H40)õ, avec n étant un entier compris entre 1 et 10;
(iii) des synthons N-Carboxyanhydride (NCA) de formule (III) :
H R7 H (III) dans laquelle R4 représente une liaison covalente ; un groupement alkylène en C1-C20; ou un groupement (C2H40)õ, avec n étant un entier compris entre 1 et 10;
(iv) des synthons lactones/lactames/thiolactones de formule (IV) :
/OH
RÃ ________________________________________ R5 (IV) dans laquelle :
R5 représente une liaison covalente ; un groupement alkylène en Ci-C20 ; ou un groupement (C2H40)õõ avec m étant un entier compris entre 1 et 10 ;
n représente un entier compris entre 1 et 20 ;
7 PCT/EP2016/055843 X2 représente -(0)-, -(NH)- ou -(S)- ; et R6 représente un hydrogène ou un groupement alkyle en C1-C20;
(v) des synthons de formule (V) :
H S OH (v) dans laquelle R7 représente un groupement alkylène en C1-C20 ; et (vi) des synthons de formule (VI) :
OH
(VI) dans laquelle R8 représente un groupement alkylène en C1-C20.
Selon un mode de réalisation particulier, le synthon hydroxylé est choisi dans le groupe constitué :
(i) des synthons (méth)acrylates/(méth)acrylamides de formule (I) :
Ri Xi R, HO (I) dans laquelle :
R1 représente un atome d'hydrogène ou un alkyle en C1-C3;
R2 représente un groupement alkylène en C1-C20; ou un groupement (C2H40)., avec n étant un entier compris entre 1 et 10 ; et Xi représente ¨(0)¨, ¨(NH)¨, -(S)- ou ¨(NR'2(OH))¨, de préférence ¨(0)¨, ¨
(NH)¨, ou ¨(NR'2(OH))¨, avec R'2 représentant un groupement alkylène en Ci-C20 ; ou un groupement ¨(C2H40),,,,¨, avec m étant un entier compris entre 1 et 10;
(v) des synthons de formule (V) :
H S OH (v) dans laquelle R7 représente un groupement alkylène en C1-C20 ; et (vi) des synthons de formule (VI) :
OH
(VI) dans laquelle R8 représente un groupement alkylène en C1-C20.
Selon un mode de réalisation particulier, le synthon hydroxylé est choisi dans le groupe constitué :
(i) des synthons (méth)acrylates/(méth)acrylamides de formule (I) :
Ri Xi R, HO (I) dans laquelle :
R1 représente un atome d'hydrogène ou un alkyle en C1-C3;
R2 représente un groupement alkylène en C1-C20; ou un groupement (C2H40)., avec n étant un entier compris entre 1 et 10 ; et Xi représente ¨(0)¨, ¨(NH)¨, -(S)- ou ¨(NR'2(OH))¨, de préférence ¨(0)¨, ¨
(NH)¨, ou ¨(NR'2(OH))¨, avec R'2 représentant un groupement alkylène en Ci-C20 ; ou un groupement ¨(C2H40),,,,¨, avec m étant un entier compris entre 1 et 10;
8 PCT/EP2016/055843 (ii) des synthons styréniques de formule (II) :
,R.
H 0 - (II) dans laquelle R3 représente une liaison covalente ; un groupement alkylène en C1-C20; ou un groupement (C2H40)õ, avec n étant un entier compris entre 1 et 10;
(iii) des synthons N-Carboxyanhydride (NCA) de formule (III) :
H R70H (III) dans laquelle R4 représente une liaison covalente ; un groupement alkylène en C1-C20; ou un groupement (C2H40)õ, avec n étant un entier compris entre 1 et 10;
(iv) des synthons lactones/lactames/thiolactones de formule (IV) :
OH
Re _____________________________________ Fe5 (IV) dans laquelle :
R5 représente une liaison covalente ; un groupement alkylène en C1-C20 ; ou un groupement (C2H40)õõ avec m étant un entier compris entre 1 et 10;
n représente un entier compris entre 1 et 20 ;
X2 représente -(0)-, -(NH)- ou -(S)- ; et R6 représente un hydrogène ou un groupement alkyle en C1-C20 ; et (vi) des synthons de formule (VI) :
OH
(VI)
,R.
H 0 - (II) dans laquelle R3 représente une liaison covalente ; un groupement alkylène en C1-C20; ou un groupement (C2H40)õ, avec n étant un entier compris entre 1 et 10;
(iii) des synthons N-Carboxyanhydride (NCA) de formule (III) :
H R70H (III) dans laquelle R4 représente une liaison covalente ; un groupement alkylène en C1-C20; ou un groupement (C2H40)õ, avec n étant un entier compris entre 1 et 10;
(iv) des synthons lactones/lactames/thiolactones de formule (IV) :
OH
Re _____________________________________ Fe5 (IV) dans laquelle :
R5 représente une liaison covalente ; un groupement alkylène en C1-C20 ; ou un groupement (C2H40)õõ avec m étant un entier compris entre 1 et 10;
n représente un entier compris entre 1 et 20 ;
X2 représente -(0)-, -(NH)- ou -(S)- ; et R6 représente un hydrogène ou un groupement alkyle en C1-C20 ; et (vi) des synthons de formule (VI) :
OH
(VI)
9 PCT/EP2016/055843 dans laquelle R8 représente un groupement alkylène en C1-C20.
Selon un mode de réalisation préféré, la glycane-saccharase est choisie dans le groupe comprenant :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNp WT) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 1 mutée une seule fois à l'une quelconque des positions R226, 1228, F229, A289, F290, 1330, V331, D394 et R446;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 11 (DSR-S
yardelA4N ¨ S512C);
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 12 (alpha-1,2 BrS) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 13 (AN123-GBD-CD2) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 14 (ASDg) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 15 (DSR-S-OK) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASR-C-del-bis) ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 18 (fructosyltransférase de Bacillus subtilis).
Plus particulièrement, une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 1 mutée une seule fois à l'une quelconque des positions R226, 1228, F229, A289, F290, 1330, V331, D394 et R446 pouvant être choisie parmi :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 2 (ASNP
R226X1), ladite séquence ayant un acide aminé X1 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W et Y.
Selon un mode de réalisation préféré, la glycane-saccharase est choisie dans le groupe comprenant :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNp WT) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 1 mutée une seule fois à l'une quelconque des positions R226, 1228, F229, A289, F290, 1330, V331, D394 et R446;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 11 (DSR-S
yardelA4N ¨ S512C);
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 12 (alpha-1,2 BrS) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 13 (AN123-GBD-CD2) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 14 (ASDg) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 15 (DSR-S-OK) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASR-C-del-bis) ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 18 (fructosyltransférase de Bacillus subtilis).
Plus particulièrement, une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 1 mutée une seule fois à l'une quelconque des positions R226, 1228, F229, A289, F290, 1330, V331, D394 et R446 pouvant être choisie parmi :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 2 (ASNP
R226X1), ladite séquence ayant un acide aminé X1 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W et Y.
10 PCT/EP2016/055843 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP
1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V, W et Y.
En particulier, une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 1 mutée une seule fois à l'une quelconque des positions R226, 1228, F229, A289, F290, 1330, V331, D394 et R446 peut être choisie parmi :
1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V, W et Y.
En particulier, une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 1 mutée une seule fois à l'une quelconque des positions R226, 1228, F229, A289, F290, 1330, V331, D394 et R446 peut être choisie parmi :
11 PCT/EP2016/055843 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 2 (ASNP
R226X1), ladite séquence ayant un acide aminé X1 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, H, K, M, N, Q, S, T et V;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP
I228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de H, L, T, V, W et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, D, E, G, H, I, K, M, N, P, Q, V, W et Y, en particulier de C, D, E, G, I, K, M, N, P, V, W et Y, et plus préférentiellement de M et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, M, N, P, Q, S, T, V
et W et plus particulièrement choisi dans le groupe constitué de F, M, N, P, Q, S et T;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, P, Q, S, T, V et W, plus préférentiellement de A, C, D, H, I, K, L, M, Q, S, T, V et W, en particulier de A, C, I, L, V, S, T et W;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, Q, S, V et Y, en particulier de A et C, plus préférentiellement de A;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, W et Y, plus préférentiellement de C, D, E, F, G, N, R, S ,T, W et Y, en particulier de E, T et W;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, E, F, G, H, I, K et L, en particulier de A et E;
R226X1), ladite séquence ayant un acide aminé X1 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, H, K, M, N, Q, S, T et V;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP
I228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de H, L, T, V, W et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, D, E, G, H, I, K, M, N, P, Q, V, W et Y, en particulier de C, D, E, G, I, K, M, N, P, V, W et Y, et plus préférentiellement de M et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, M, N, P, Q, S, T, V
et W et plus particulièrement choisi dans le groupe constitué de F, M, N, P, Q, S et T;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, P, Q, S, T, V et W, plus préférentiellement de A, C, D, H, I, K, L, M, Q, S, T, V et W, en particulier de A, C, I, L, V, S, T et W;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, Q, S, V et Y, en particulier de A et C, plus préférentiellement de A;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, W et Y, plus préférentiellement de C, D, E, F, G, N, R, S ,T, W et Y, en particulier de E, T et W;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, E, F, G, H, I, K et L, en particulier de A et E;
12 PCT/EP2016/055843 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, G, K, L, M, N, et S, en particulier de A, N et M.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le synthon hydroxylé mis en oeuvre est plus particulièrement choisi dans le groupe constitué du HEMA, du NHAM, du HEAA, du VP, du VBA, du HMNCA, du AHMCL, du MVL, du BME, de l'alcool allylique et du NNHEA.
Selon ce mode de réalisation, il est de préférence choisi parmi le HEMA, le NHAM, le HEAA, l'alcool allylique, le NNHEA et le BME, en particulier le HEMA
et le NHAM.
Selon un mode de réalisation, un synthon hydroxylé selon l'invention mis en oeuvre dans un procédé de glycosylation enzymatique de l'invention est glucosylé ou fructosylé à l'issu de ce procédé, de préférence glucosylé.
L'invention a également pour objet un procédé de fabrication d'un glyco(co)polymère comprenant la polymérisation d'au moins 2 monomères obtenus, indépendamment, à l'issue du procédé de glycosylation enzymatique selon l'invention.
Selon un mode de réalisation, le procédé de fabrication d'un glyco(co)polymère selon l'invention comprend, dans l'ordre, les étapes suivantes :
a) la polymérisation de deux monomères obtenus, indépendamment l'un de l'autre, à l'issue du procédé de glycosylation enzymatique selon l'invention, permettant d'aboutir à une chaîne de 2 monomères ;
b) la polymérisation de la chaîne de monomères obtenue à l'issue de l'étape précédente avec un monomère obtenu à l'issue du procédé de glycosylation enzymatique selon l'invention ; puis c) une ou plusieurs étapes successives, et indépendantes, consistant à
polymériser la chaîne de monomères obtenue à l'issue de l'étape précédente avec un monomère obtenu à l'issue du procédé de glycosylation enzymatique selon l'invention.
Le procédé de fabrication d'un glyco(co)polymère selon ce mode de réalisation peut en outre également comprendre, indépendamment :
- au moins une étape a') entre les étapes a) et b) ;
- au moins une étape b') entre les étapes b) et c) ; et/ou
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, G, K, L, M, N, et S, en particulier de A, N et M.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le synthon hydroxylé mis en oeuvre est plus particulièrement choisi dans le groupe constitué du HEMA, du NHAM, du HEAA, du VP, du VBA, du HMNCA, du AHMCL, du MVL, du BME, de l'alcool allylique et du NNHEA.
Selon ce mode de réalisation, il est de préférence choisi parmi le HEMA, le NHAM, le HEAA, l'alcool allylique, le NNHEA et le BME, en particulier le HEMA
et le NHAM.
Selon un mode de réalisation, un synthon hydroxylé selon l'invention mis en oeuvre dans un procédé de glycosylation enzymatique de l'invention est glucosylé ou fructosylé à l'issu de ce procédé, de préférence glucosylé.
L'invention a également pour objet un procédé de fabrication d'un glyco(co)polymère comprenant la polymérisation d'au moins 2 monomères obtenus, indépendamment, à l'issue du procédé de glycosylation enzymatique selon l'invention.
Selon un mode de réalisation, le procédé de fabrication d'un glyco(co)polymère selon l'invention comprend, dans l'ordre, les étapes suivantes :
a) la polymérisation de deux monomères obtenus, indépendamment l'un de l'autre, à l'issue du procédé de glycosylation enzymatique selon l'invention, permettant d'aboutir à une chaîne de 2 monomères ;
b) la polymérisation de la chaîne de monomères obtenue à l'issue de l'étape précédente avec un monomère obtenu à l'issue du procédé de glycosylation enzymatique selon l'invention ; puis c) une ou plusieurs étapes successives, et indépendantes, consistant à
polymériser la chaîne de monomères obtenue à l'issue de l'étape précédente avec un monomère obtenu à l'issue du procédé de glycosylation enzymatique selon l'invention.
Le procédé de fabrication d'un glyco(co)polymère selon ce mode de réalisation peut en outre également comprendre, indépendamment :
- au moins une étape a') entre les étapes a) et b) ;
- au moins une étape b') entre les étapes b) et c) ; et/ou
13 PCT/EP2016/055843 - au moins une étape c') après l'une quelconque des étapes c), dans lesquelles la chaîne de monomères obtenue à l'issue de l'étape précédente est polymérisée avec au moins un synthon non-glycosylé.
L'invention a également pour objet un procédé de fabrication d'un glyco(co)polymère, de préférence à blocs, comprenant le couplage d'au moins 2 monomères obtenus, indépendamment, à l'issue du procédé de glycosylation enzymatique selon l'invention, de préférence de monomères obtenus à partir des synthons de formule (V) et/ou (VI) selon l'invention.
Dans le cadre de la présente invention, et sauf mention différente dans le texte, on entend par:
- alkyle: un groupe aliphatique hydrocarboné saturé, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 20, notamment de 1 à 10, de préférence de 1 à 6 atomes de carbone ; et - alkylène : un groupe alkylène divalent, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à
20, notamment de 1 à 10, de préférence de 1 à 6, atomes de carbone ;
Les motifs glycoside sont connus de l'homme du métier.
Dans la mesure où le saccharose est mis en oeuvre dans les procédés de glycosylation selon l'invention, un motif glycoside selon l'invention est choisi parmi un ou plusieurs glucose(s), un ou plusieurs fructose(s) ou un mélange de glucose(s) et de fructose(s).
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Les inventeurs ont mis au point un procédé enzymatique de glycosylation de synthons hydroxylés mettant en oeuvre des glycane-saccharases spécifiques identifiées par le demandeur, aptes à effectuer une telle glycosylation, en particulier glucosylation ou fructosylation.
Ces enzymes spécifiques ne nécessitent pour cela que la présence de saccharose, une agro-ressource renouvelable et bon marché. A ce titre, un procédé selon l'invention est avantageusement peu couteux.
L'invention a également pour objet un procédé de fabrication d'un glyco(co)polymère, de préférence à blocs, comprenant le couplage d'au moins 2 monomères obtenus, indépendamment, à l'issue du procédé de glycosylation enzymatique selon l'invention, de préférence de monomères obtenus à partir des synthons de formule (V) et/ou (VI) selon l'invention.
Dans le cadre de la présente invention, et sauf mention différente dans le texte, on entend par:
- alkyle: un groupe aliphatique hydrocarboné saturé, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à 20, notamment de 1 à 10, de préférence de 1 à 6 atomes de carbone ; et - alkylène : un groupe alkylène divalent, linéaire ou ramifié, comprenant de 1 à
20, notamment de 1 à 10, de préférence de 1 à 6, atomes de carbone ;
Les motifs glycoside sont connus de l'homme du métier.
Dans la mesure où le saccharose est mis en oeuvre dans les procédés de glycosylation selon l'invention, un motif glycoside selon l'invention est choisi parmi un ou plusieurs glucose(s), un ou plusieurs fructose(s) ou un mélange de glucose(s) et de fructose(s).
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Les inventeurs ont mis au point un procédé enzymatique de glycosylation de synthons hydroxylés mettant en oeuvre des glycane-saccharases spécifiques identifiées par le demandeur, aptes à effectuer une telle glycosylation, en particulier glucosylation ou fructosylation.
Ces enzymes spécifiques ne nécessitent pour cela que la présence de saccharose, une agro-ressource renouvelable et bon marché. A ce titre, un procédé selon l'invention est avantageusement peu couteux.
14 PCT/EP2016/055843 Ces synthons glycosylés, ou monomères, sont avantageusement mis en oeuvre dans un procédé chimique de préparation de glyco(co)polymères de structures et fonctionnalités contrôlées.
Ainsi, les inventeurs ont mis au point un procédé de synthèse chimio-enzymatique de glyco(co)polymères fondé sur la polymérisation chimique ou une réaction de couplage des monomères glycosylés obtenus par voie enzymatique.
Les procédés selon la présente invention permettent avantageusement de mieux contrôler les degrés de glycosylation des synthons et les structures ainsi que leur distribution.
Ils permettent en outre de contourner les difficultés liées à la chimie des sucres et de limiter l'utilisation de produits toxiques.
Ils s'avèrent également avantageux en termes de diminution des coûts et temps de production des synthons glycosylés.
Enfin, ces procédés permettent avantageusement d'accéder à une plus grande diversité d'architectures macromoléculaires pour différents domaines d'applications, tels que les biomatériaux, le matériel d'implant, l'ingénierie tissulaire, le diagnostic biologique et la délivrance de principes actifs.
Glycane-saccharases de l'invention La présente invention concerne en premier lieu un procédé de fabrication d'un synthon glycosylé, ou monomère, comprenant au moins une étape de mise en présence d'au moins une glycane-saccharase de l'invention avec au moins un synthon hydroxylé
selon l'invention et au moins un saccharose.
Comme indiqué précédemment, les enzymes de l'invention sont avantageusement aptes à glycosyler des synthons au niveau de leur fonction hydroxyle.
En particulier, les enzymes selon l'invention sont aptes à glucosyler ou à
fructosyler les synthons de l'invention.
Ainsi, certaines de ces enzymes consistent plus particulièrement en des glycoside-hydrolases appartenant aux familles 13 et 70 des glycoside-hydrolases (GH13 et GH70).
Ainsi, les inventeurs ont mis au point un procédé de synthèse chimio-enzymatique de glyco(co)polymères fondé sur la polymérisation chimique ou une réaction de couplage des monomères glycosylés obtenus par voie enzymatique.
Les procédés selon la présente invention permettent avantageusement de mieux contrôler les degrés de glycosylation des synthons et les structures ainsi que leur distribution.
Ils permettent en outre de contourner les difficultés liées à la chimie des sucres et de limiter l'utilisation de produits toxiques.
Ils s'avèrent également avantageux en termes de diminution des coûts et temps de production des synthons glycosylés.
Enfin, ces procédés permettent avantageusement d'accéder à une plus grande diversité d'architectures macromoléculaires pour différents domaines d'applications, tels que les biomatériaux, le matériel d'implant, l'ingénierie tissulaire, le diagnostic biologique et la délivrance de principes actifs.
Glycane-saccharases de l'invention La présente invention concerne en premier lieu un procédé de fabrication d'un synthon glycosylé, ou monomère, comprenant au moins une étape de mise en présence d'au moins une glycane-saccharase de l'invention avec au moins un synthon hydroxylé
selon l'invention et au moins un saccharose.
Comme indiqué précédemment, les enzymes de l'invention sont avantageusement aptes à glycosyler des synthons au niveau de leur fonction hydroxyle.
En particulier, les enzymes selon l'invention sont aptes à glucosyler ou à
fructosyler les synthons de l'invention.
Ainsi, certaines de ces enzymes consistent plus particulièrement en des glycoside-hydrolases appartenant aux familles 13 et 70 des glycoside-hydrolases (GH13 et GH70).
15 PCT/EP2016/055843 Notamment, selon un mode de réalisation préféré, une glycane-saccharase selon l'invention est choisi dans le groupe constitué des glycoside-hydrolases appartenant aux familles 13, 68 et 70 des glycoside-hydrolases (GH13, GH68 et GH70).
Les glycoside-hydrolases appartenant à la famille 13 sont des amylosaccharases naturellement produites par les bactéries des genres Deinococcus, Neisseria ou Alteromonas.
Les glycoside-hydrolases appartenant à la famille 70 sont quant à elles des glucane-saccharases naturellement produites par des bactéries lactiques des genres Leuconostoc, Lactobacillus, Streptococcus ou Weissela sp ..
En outre, la fructosyltransférase de Bacillus subtilis est également mise en oeuvre dans un procédé de glycosylation selon l'invention et appartient à la famille 68 des glycoside-hydro lases.
Les enzymes de l'invention sont toutes capables de transférer le glucose ou le fructose provenant du saccharose sur les synthons hydroxylés de l'invention.
L'ensemble des enzymes sauvages ou mutées décrites dans la présente demande, connues de l'homme du métier, n'avait à ce jour jamais été mises en oeuvre afin de glucosyler des synthons hydroxylés de l'invention.
La séquence nucléotidique de la forme sauvage de l'enzyme ASNp (AmyloSaccharase de Neisseria polysaccharea) (famille GH13) a pour référence GenBank AJ011781.1 tandis que sa séquence polypeptidique a pour référence Uniprot (SEQ ID NO: 1).
La séquence nucléotidique de la forme sauvage de l'enzyme DSR-S (issue de la souche Leuconostoc mesenteroides B-512F) a pour référence GenBank 109598.
La séquence nucléotidique de la forme sauvage de l'enzyme DSR-E (issue de la souche Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1299) a pour référence GenBank AJ430204.1 et la référence Uniprot Q8G9Q2.
L'enzyme GBD-CD2 (séquence SEQ ID NO: 13) est une forme tronquée de l'enzyme DSR-E susmentionnée, comme décrit dans Brison et al., J. Biol. Chem., 2012, 287, 7915-24.
Des références bibliographiques décrivant les enzymes sauvages et mutées selon la présente invention sont indiquées dans le Tableau 1. En outre, la méthode d'obtention des enzymes mutées est décrite dans les demandes de brevet européen EP 2 100 966 et EP 2 100 965.
Les glycoside-hydrolases appartenant à la famille 13 sont des amylosaccharases naturellement produites par les bactéries des genres Deinococcus, Neisseria ou Alteromonas.
Les glycoside-hydrolases appartenant à la famille 70 sont quant à elles des glucane-saccharases naturellement produites par des bactéries lactiques des genres Leuconostoc, Lactobacillus, Streptococcus ou Weissela sp ..
En outre, la fructosyltransférase de Bacillus subtilis est également mise en oeuvre dans un procédé de glycosylation selon l'invention et appartient à la famille 68 des glycoside-hydro lases.
Les enzymes de l'invention sont toutes capables de transférer le glucose ou le fructose provenant du saccharose sur les synthons hydroxylés de l'invention.
L'ensemble des enzymes sauvages ou mutées décrites dans la présente demande, connues de l'homme du métier, n'avait à ce jour jamais été mises en oeuvre afin de glucosyler des synthons hydroxylés de l'invention.
La séquence nucléotidique de la forme sauvage de l'enzyme ASNp (AmyloSaccharase de Neisseria polysaccharea) (famille GH13) a pour référence GenBank AJ011781.1 tandis que sa séquence polypeptidique a pour référence Uniprot (SEQ ID NO: 1).
La séquence nucléotidique de la forme sauvage de l'enzyme DSR-S (issue de la souche Leuconostoc mesenteroides B-512F) a pour référence GenBank 109598.
La séquence nucléotidique de la forme sauvage de l'enzyme DSR-E (issue de la souche Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1299) a pour référence GenBank AJ430204.1 et la référence Uniprot Q8G9Q2.
L'enzyme GBD-CD2 (séquence SEQ ID NO: 13) est une forme tronquée de l'enzyme DSR-E susmentionnée, comme décrit dans Brison et al., J. Biol. Chem., 2012, 287, 7915-24.
Des références bibliographiques décrivant les enzymes sauvages et mutées selon la présente invention sont indiquées dans le Tableau 1. En outre, la méthode d'obtention des enzymes mutées est décrite dans les demandes de brevet européen EP 2 100 966 et EP 2 100 965.
16 PCT/EP2016/055843 Les séquences peptides des différentes enzymes sauvages ou mutées selon l'invention sont indiquées dans la présente demande.
Ainsi, une enzyme selon l'invention peut être synthétisée par des méthodes classiques de chimie de synthèse, soit des synthèses chimiques homogènes en solution ou en phase solide. A titre illustratif, l'homme de l'art peut utiliser les techniques de synthèse de polypeptide en solution décrite par HOUBEN WEIL (1974, In methode der Organischen Chemie, E. Wunsh ed., volume 154 et 15-II, Thieme, Stuttgart.). Une enzyme selon l'invention peut être également synthétisée chimiquement en phase liquide ou solide par des couplages successifs des différents résidus d'acides aminés (de l'extrémité N-terminale vers l'extrémité C-terminale en phase liquide, ou de l'extrémité C-terminale vers l'extrémité N-terminale en phase solide). L'homme de l'art peut notamment utiliser la technique de synthèse peptidique en phase solide décrite par Merrifield (MERRIFIELD RB, (1965a), Nature, vol.207 (996): 522-523; MERRIFIELD RB, (1965b), Science, vol.150 (693):178-185.) Selon un autre aspect, une enzyme selon l'invention peut être synthétisée par recombinaison génétique, par exemple selon un procédé de production comprenant les étapes suivantes :
(a) préparer un vecteur d'expression dans lequel a été inséré un acide nucléique codant la séquence peptidique d'une enzyme de l'invention, ledit vecteur comprenant également les séquences régulatrices nécessaires à l'expression dudit acide nucléique dans une cellule hôte choisie ;
(b) transfecter une cellule hôte avec le vecteur recombinant obtenu à l'étape (a) ;
(c) cultiver la cellule hôte transfectée à l'étape b) dans un milieu de culture approprié;
(d) récupérer le surnageant de culture des cellules transfectées ou le lysat cellulaire desdites cellules, par exemple par sonication ou par choc osmotique ; et (e) séparer ou purifier, à partir dudit milieu de culture, ou à partir du culot de lysat cellulaire, l'enzyme de l'invention ainsi obtenue.
Pour purifier une enzyme selon l'invention qui a été produite par des cellules hôtes transfectées ou infectées par un vecteur recombinant codant ladite enzyme, l'homme de l'art peut avantageusement mettre en oeuvre des techniques de purification décrites par
Ainsi, une enzyme selon l'invention peut être synthétisée par des méthodes classiques de chimie de synthèse, soit des synthèses chimiques homogènes en solution ou en phase solide. A titre illustratif, l'homme de l'art peut utiliser les techniques de synthèse de polypeptide en solution décrite par HOUBEN WEIL (1974, In methode der Organischen Chemie, E. Wunsh ed., volume 154 et 15-II, Thieme, Stuttgart.). Une enzyme selon l'invention peut être également synthétisée chimiquement en phase liquide ou solide par des couplages successifs des différents résidus d'acides aminés (de l'extrémité N-terminale vers l'extrémité C-terminale en phase liquide, ou de l'extrémité C-terminale vers l'extrémité N-terminale en phase solide). L'homme de l'art peut notamment utiliser la technique de synthèse peptidique en phase solide décrite par Merrifield (MERRIFIELD RB, (1965a), Nature, vol.207 (996): 522-523; MERRIFIELD RB, (1965b), Science, vol.150 (693):178-185.) Selon un autre aspect, une enzyme selon l'invention peut être synthétisée par recombinaison génétique, par exemple selon un procédé de production comprenant les étapes suivantes :
(a) préparer un vecteur d'expression dans lequel a été inséré un acide nucléique codant la séquence peptidique d'une enzyme de l'invention, ledit vecteur comprenant également les séquences régulatrices nécessaires à l'expression dudit acide nucléique dans une cellule hôte choisie ;
(b) transfecter une cellule hôte avec le vecteur recombinant obtenu à l'étape (a) ;
(c) cultiver la cellule hôte transfectée à l'étape b) dans un milieu de culture approprié;
(d) récupérer le surnageant de culture des cellules transfectées ou le lysat cellulaire desdites cellules, par exemple par sonication ou par choc osmotique ; et (e) séparer ou purifier, à partir dudit milieu de culture, ou à partir du culot de lysat cellulaire, l'enzyme de l'invention ainsi obtenue.
Pour purifier une enzyme selon l'invention qui a été produite par des cellules hôtes transfectées ou infectées par un vecteur recombinant codant ladite enzyme, l'homme de l'art peut avantageusement mettre en oeuvre des techniques de purification décrites par
17 PCT/EP2016/055843 Molinier-Frenkel (2002, J. Viral. 76, 127-135), par Karayan et al. (1994, Virology 782-795) ou par Novelli et al. (1991, Virology 185, 365-376).
Ainsi, les glycane-saccharase utilisables dans un procédé de l'invention sont choisies dans un groupe comprenant :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP
WT) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 1 mutée une seule fois à l'une quelconque des positions R226, 1228, F229, A289, F290, 1330, V331, D394 et R446 ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 11 (DSR-S
yardelA4N ¨ S512C) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 12 (alpha-1,2 BrS) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 13 (AN123-GBD-CD2) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 14 (ASDg) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 15 (DSR-S-OK) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASR-C-del-bis) ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 18 (fructosyltransférase de Bacillus subtilis).
Selon un mode de réalisation particulier, la mutation d'une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 en position R226, 1228, F229, A289, F290, 1330, V331, D394 ou R446 est une mutation par substitution.
Selon un mode de réalisation, lorsqu'une séquence ayant au moins 80 %
d'identité avec la SEQ ID NO : 1 est mutée une seule fois en position R226, elle est choisie parmi une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 2 (ASNP
Ainsi, les glycane-saccharase utilisables dans un procédé de l'invention sont choisies dans un groupe comprenant :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP
WT) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 1 mutée une seule fois à l'une quelconque des positions R226, 1228, F229, A289, F290, 1330, V331, D394 et R446 ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 11 (DSR-S
yardelA4N ¨ S512C) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 12 (alpha-1,2 BrS) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 13 (AN123-GBD-CD2) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 14 (ASDg) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 15 (DSR-S-OK) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASR-C-del-bis) ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 18 (fructosyltransférase de Bacillus subtilis).
Selon un mode de réalisation particulier, la mutation d'une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 en position R226, 1228, F229, A289, F290, 1330, V331, D394 ou R446 est une mutation par substitution.
Selon un mode de réalisation, lorsqu'une séquence ayant au moins 80 %
d'identité avec la SEQ ID NO : 1 est mutée une seule fois en position R226, elle est choisie parmi une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 2 (ASNP
18 PCT/EP2016/055843 R226X1), ladite séquence ayant un acide aminé X1 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W et Y.
Selon ce mode de réalisation, X1 représente de préférence un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, H, K, M, N, Q, S, T et V.
Selon un mode de réalisation, lorsqu'une séquence ayant au moins 80 %
d'identité avec la SEQ ID NO : 1 est mutée une seule fois en position 1228, elle est choisie parmi une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 3 (ASNP
1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y.
Selon ce mode de réalisation, X2 représente de préférence un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de H, L, T, V, W et Y.
Selon un mode de réalisation, lorsqu'une séquence ayant au moins 80 %
d'identité avec la SEQ ID NO : 1 est mutée une seule fois en position F229, elle est choisie parmi une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y.
Selon ce mode de réalisation, X3 représente de préférence un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, D, E, G, H, I, K, M, N, P, Q, V, W et Y, en particulier de C, D, E, G, I, K, M, N, P, V, W et Y, et plus préférentiellement de M et Y.
Selon un mode de réalisation, lorsqu'une séquence ayant au moins 80 %
d'identité avec la SEQ ID NO : 1 est mutée une seule fois en position A289, elle est choisie parmi une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO :
(ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y.
Selon ce mode de réalisation, X4 représente de préférence un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, M, N P, Q, S, T, V et W, et plus particulièrement choisi dans le groupe constitué de F, M, N, P, Q, S et T.
Selon un mode de réalisation, lorsqu'une séquence ayant au moins 80 %
d'identité avec la SEQ ID NO : 1 est mutée une seule fois en position F290, elle est choisie parmi une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO :
(ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y.
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W et Y.
Selon ce mode de réalisation, X1 représente de préférence un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, H, K, M, N, Q, S, T et V.
Selon un mode de réalisation, lorsqu'une séquence ayant au moins 80 %
d'identité avec la SEQ ID NO : 1 est mutée une seule fois en position 1228, elle est choisie parmi une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 3 (ASNP
1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y.
Selon ce mode de réalisation, X2 représente de préférence un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de H, L, T, V, W et Y.
Selon un mode de réalisation, lorsqu'une séquence ayant au moins 80 %
d'identité avec la SEQ ID NO : 1 est mutée une seule fois en position F229, elle est choisie parmi une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y.
Selon ce mode de réalisation, X3 représente de préférence un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, D, E, G, H, I, K, M, N, P, Q, V, W et Y, en particulier de C, D, E, G, I, K, M, N, P, V, W et Y, et plus préférentiellement de M et Y.
Selon un mode de réalisation, lorsqu'une séquence ayant au moins 80 %
d'identité avec la SEQ ID NO : 1 est mutée une seule fois en position A289, elle est choisie parmi une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO :
(ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y.
Selon ce mode de réalisation, X4 représente de préférence un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, M, N P, Q, S, T, V et W, et plus particulièrement choisi dans le groupe constitué de F, M, N, P, Q, S et T.
Selon un mode de réalisation, lorsqu'une séquence ayant au moins 80 %
d'identité avec la SEQ ID NO : 1 est mutée une seule fois en position F290, elle est choisie parmi une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO :
(ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y.
19 PCT/EP2016/055843 Selon ce mode de réalisation, X5 représente de préférence un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, P, Q, S, T, V
et W, plus préférentiellement de A, C, D, H, I, K, L, M, Q, S, T, V et W, en particulier de A, C, I, L, V, S, T et W.
Selon un mode de réalisation, lorsqu'une séquence ayant au moins 80 %
d'identité avec la SEQ ID NO : 1 est mutée une seule fois en position 1330, elle est choisie parmi une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO :
(ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y.
Selon ce mode de réalisation, X6 représente de préférence un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, Q, S, V et Y, en particulier de A et C, plus préférentiellement de A.
Selon un mode de réalisation, lorsqu'une séquence ayant au moins 80 %
d'identité avec la SEQ ID NO : 1 est mutée une seule fois en position V331, elle est choisie parmi une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W et Y.
Selon ce mode de réalisation, X7 représente de préférence un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, W et Y, plus préférentiellement de C, D, E, F, G, N, R, S ,T, W et Y, en particulier de E, T et W;
Selon un mode de réalisation, lorsqu'une séquence ayant au moins 80 %
d'identité avec la SEQ ID NO : 1 est mutée une seule fois en position D394, elle est choisie parmi une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y.
Selon ce mode de réalisation, X8 représente de préférence un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, E, F, G, H, I, K et L, en particulier de A et E.
Selon un mode de réalisation, lorsqu'une séquence ayant au moins 80 %
d'identité avec la SEQ ID NO : 1 est mutée une seule fois en position R446, elle est choisie parmi une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V, W et Y.
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, P, Q, S, T, V
et W, plus préférentiellement de A, C, D, H, I, K, L, M, Q, S, T, V et W, en particulier de A, C, I, L, V, S, T et W.
Selon un mode de réalisation, lorsqu'une séquence ayant au moins 80 %
d'identité avec la SEQ ID NO : 1 est mutée une seule fois en position 1330, elle est choisie parmi une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO :
(ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y.
Selon ce mode de réalisation, X6 représente de préférence un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, Q, S, V et Y, en particulier de A et C, plus préférentiellement de A.
Selon un mode de réalisation, lorsqu'une séquence ayant au moins 80 %
d'identité avec la SEQ ID NO : 1 est mutée une seule fois en position V331, elle est choisie parmi une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W et Y.
Selon ce mode de réalisation, X7 représente de préférence un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, W et Y, plus préférentiellement de C, D, E, F, G, N, R, S ,T, W et Y, en particulier de E, T et W;
Selon un mode de réalisation, lorsqu'une séquence ayant au moins 80 %
d'identité avec la SEQ ID NO : 1 est mutée une seule fois en position D394, elle est choisie parmi une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y.
Selon ce mode de réalisation, X8 représente de préférence un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, E, F, G, H, I, K et L, en particulier de A et E.
Selon un mode de réalisation, lorsqu'une séquence ayant au moins 80 %
d'identité avec la SEQ ID NO : 1 est mutée une seule fois en position R446, elle est choisie parmi une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V, W et Y.
20 PCT/EP2016/055843 Selon ce mode de réalisation, X9 représente de préférence un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, G, K, L, M, N, et S, en particulier de A, N
et M.
Selon un mode de réalisation, une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 mutée une seule fois à l'une quelconque des positions R226, 1228, F229, A289, F290, 1330, V331, D394 et R446 est choisie parmi l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 2 à 10 définies ci-dessus.
Selon un mode de réalisation particulier, une séquence ayant au moins 80 %
d'identité avec la SEQ ID NO : 1 mutée une seule fois à l'une quelconque des positions R226, 1228, F229, A289, F290, 1330, V331, D394 et R446 est choisie parmi :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 2 (ASNP
R226X1), ladite séquence ayant un acide aminé X1 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W et Y.
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP
1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y ;
choisi dans le groupe constitué de A, C, G, K, L, M, N, et S, en particulier de A, N
et M.
Selon un mode de réalisation, une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 mutée une seule fois à l'une quelconque des positions R226, 1228, F229, A289, F290, 1330, V331, D394 et R446 est choisie parmi l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 2 à 10 définies ci-dessus.
Selon un mode de réalisation particulier, une séquence ayant au moins 80 %
d'identité avec la SEQ ID NO : 1 mutée une seule fois à l'une quelconque des positions R226, 1228, F229, A289, F290, 1330, V331, D394 et R446 est choisie parmi :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 2 (ASNP
R226X1), ladite séquence ayant un acide aminé X1 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W et Y.
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP
1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y ;
21 PCT/EP2016/055843 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V, W et Y.
Selon un mode de réalisation particulier, une séquence ayant au moins 80 %
d'identité avec la SEQ ID NO : 1 mutée une seule fois à l'une quelconque des positions R226, 1228, F229, A289, F290, 1330, V331, D394 et R446 est choisie parmi :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 2 (ASNP
R226X1), ladite séquence ayant un acide aminé X1 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, H, K, M, N, Q, S, T et V;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP
1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de H, L, T, V, W et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, D, E, G, H, I, K, M, N, P, Q, V, W et Y, en particulier de C, D, E, G, I, K, M, N, P, V, W et Y, et plus préférentiellement de M et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, M, N P, Q, S, T, V
et W, et plus particulièrement choisi dans le groupe constitué de F, M, N, P, Q, S et T ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, P, Q, S, T, V et W, plus préférentiellement de A, C, D, H, I, K, L, M, Q, S, T, V et W, en particulier de A, C, I, L, V, S, T et W;
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V, W et Y.
Selon un mode de réalisation particulier, une séquence ayant au moins 80 %
d'identité avec la SEQ ID NO : 1 mutée une seule fois à l'une quelconque des positions R226, 1228, F229, A289, F290, 1330, V331, D394 et R446 est choisie parmi :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 2 (ASNP
R226X1), ladite séquence ayant un acide aminé X1 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, H, K, M, N, Q, S, T et V;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP
1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de H, L, T, V, W et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, D, E, G, H, I, K, M, N, P, Q, V, W et Y, en particulier de C, D, E, G, I, K, M, N, P, V, W et Y, et plus préférentiellement de M et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, M, N P, Q, S, T, V
et W, et plus particulièrement choisi dans le groupe constitué de F, M, N, P, Q, S et T ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, P, Q, S, T, V et W, plus préférentiellement de A, C, D, H, I, K, L, M, Q, S, T, V et W, en particulier de A, C, I, L, V, S, T et W;
22 PCT/EP2016/055843 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, Q, S, V et Y, en particulier de A et C, plus préférentiellement de A;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, W et Y, plus préférentiellement de C, D, E, G, F, N, R, S ,T, W et Y, en particulier de E, T et W;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, E, F, G, H, I, K et L, en particulier de A et E ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, G, K, L, M, N, et S, en particulier de A, N et M.
Comme montré dans les exemples, toutes les enzymes possédant l'une de ces séquences peptidiques présentent une capacité statistiquement supérieure, voire très supérieure, à celle de l'enzyme sauvage à glucosyler les synthons hydroxylés de l'invention.
En outre, il peut être avantageux d'utiliser certaines des enzymes sauvages et/ou mutantes selon l'invention selon la nature du synthon hydroxylé mis en oeuvre dans un procédé de l'invention.
Ainsi, dans le cas où le synthon hydroxylé mis en oeuvre dans un procédé de l'invention est le HEMA, certaines enzymes permettent avantageusement de n'obtenir que des HEMA mono-glucosylés, telles que par exemple une enzyme de séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 13 (AN123-GBD-CD2).
De plus, dans le cas où le synthon hydroxylé mis en oeuvre dans un procédé de l'invention est le HEMA, certaines enzymes permettent avantageusement de n'obtenir que des HEMA mono-glucosylés et des HEMA di-glucosylés, telles que par exemple les enzymes choisies dans le groupe :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant W;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, W et Y, plus préférentiellement de C, D, E, G, F, N, R, S ,T, W et Y, en particulier de E, T et W;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, E, F, G, H, I, K et L, en particulier de A et E ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, G, K, L, M, N, et S, en particulier de A, N et M.
Comme montré dans les exemples, toutes les enzymes possédant l'une de ces séquences peptidiques présentent une capacité statistiquement supérieure, voire très supérieure, à celle de l'enzyme sauvage à glucosyler les synthons hydroxylés de l'invention.
En outre, il peut être avantageux d'utiliser certaines des enzymes sauvages et/ou mutantes selon l'invention selon la nature du synthon hydroxylé mis en oeuvre dans un procédé de l'invention.
Ainsi, dans le cas où le synthon hydroxylé mis en oeuvre dans un procédé de l'invention est le HEMA, certaines enzymes permettent avantageusement de n'obtenir que des HEMA mono-glucosylés, telles que par exemple une enzyme de séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 13 (AN123-GBD-CD2).
De plus, dans le cas où le synthon hydroxylé mis en oeuvre dans un procédé de l'invention est le HEMA, certaines enzymes permettent avantageusement de n'obtenir que des HEMA mono-glucosylés et des HEMA di-glucosylés, telles que par exemple les enzymes choisies dans le groupe :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant W;
23 PCT/EP2016/055843 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant A;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant E;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant A;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 14 (ASDg) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 12 (alpha-1,2 BrS) ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS).
Enfin, dans le cas où le synthon hydroxylé mis en oeuvre dans un procédé de l'invention est le HEMA, certaines enzymes permettent avantageusement d'obtenir un mélange de HEMA mono-glucosylés, di-glucosylés et tri-glucosylés, telles que par exemple les enzymes choisies dans le groupe :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP
WT), - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, I, K, L, M et V;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant G ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASR-C-del-bis).
En particulier, les enzymes choisies dans le groupe :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant A;
et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASR-C-del-bis) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant E;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant A;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 14 (ASDg) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 12 (alpha-1,2 BrS) ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS).
Enfin, dans le cas où le synthon hydroxylé mis en oeuvre dans un procédé de l'invention est le HEMA, certaines enzymes permettent avantageusement d'obtenir un mélange de HEMA mono-glucosylés, di-glucosylés et tri-glucosylés, telles que par exemple les enzymes choisies dans le groupe :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP
WT), - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, I, K, L, M et V;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant G ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASR-C-del-bis).
En particulier, les enzymes choisies dans le groupe :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant A;
et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASR-C-del-bis) ;
24 PCT/EP2016/055843 permettent avantageusement d'obtenir une proportion très proche de HEMA
mono-glucosylés et de HEMA tri-glucosylés.
De même, dans le cas où le synthon hydroxylé mis en oeuvre dans un procédé de l'invention est le NHAM, certaines enzymes permettent avantageusement de n'obtenir que des NHAM mono-glucosylés, telles que par exemple les enzymes choisies dans le groupe :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 14 (ASDg) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 11 (DSR-S
vardelA4N ¨ S512C); et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 15 (DSR-S-OK).
De plus, dans le cas où le synthon hydroxylé mis en oeuvre dans un procédé de l'invention est le NHAM, certaines enzymes permettent avantageusement de n'obtenir que des NHAM mono-glucosylés et des NHAM di-glucosylés, telles que par exemple les enzymes choisies dans le groupe :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP
WT), - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant N;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de N, P et Q;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant N;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant T;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant E;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASR-C-del-bis) ;
mono-glucosylés et de HEMA tri-glucosylés.
De même, dans le cas où le synthon hydroxylé mis en oeuvre dans un procédé de l'invention est le NHAM, certaines enzymes permettent avantageusement de n'obtenir que des NHAM mono-glucosylés, telles que par exemple les enzymes choisies dans le groupe :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 14 (ASDg) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 11 (DSR-S
vardelA4N ¨ S512C); et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 15 (DSR-S-OK).
De plus, dans le cas où le synthon hydroxylé mis en oeuvre dans un procédé de l'invention est le NHAM, certaines enzymes permettent avantageusement de n'obtenir que des NHAM mono-glucosylés et des NHAM di-glucosylés, telles que par exemple les enzymes choisies dans le groupe :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP
WT), - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant N;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de N, P et Q;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant N;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant T;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant E;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASR-C-del-bis) ;
25 PCT/EP2016/055843 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 13 (AN123-GBD-CD2) ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS).
Enfin, dans le cas où le synthon hydroxylé mis en oeuvre dans un procédé de l'invention est le NHAM, certaines enzymes permettent avantageusement d'obtenir un mélange de NHAM mono-glucosylés, di-glucosylés et tri-glucosylés, telles que par exemple les enzymes choisies dans le groupe :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant M;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, D et E ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 12 (alpha-1,2 BrS).
En outre, dans le cas où le synthon hydroxylé mis en oeuvre dans un procédé de l'invention est le NNHEA, certaines enzymes permettent avantageusement de n'obtenir que des NNHEA mono-glucosylés, telles que par exemple les enzymes choisies dans le groupe :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASR-C-del-bis) ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS).
Lorsque le synthon hydroxylé mis en oeuvre dans un procédé de l'invention est le NNHEA, d'autres enzymes permettent également de n'obtenir avantageusement que des NNHEA mono-glucosylés, à savoir :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP
WT), - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant Q;
Enfin, dans le cas où le synthon hydroxylé mis en oeuvre dans un procédé de l'invention est le NHAM, certaines enzymes permettent avantageusement d'obtenir un mélange de NHAM mono-glucosylés, di-glucosylés et tri-glucosylés, telles que par exemple les enzymes choisies dans le groupe :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant M;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, D et E ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 12 (alpha-1,2 BrS).
En outre, dans le cas où le synthon hydroxylé mis en oeuvre dans un procédé de l'invention est le NNHEA, certaines enzymes permettent avantageusement de n'obtenir que des NNHEA mono-glucosylés, telles que par exemple les enzymes choisies dans le groupe :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASR-C-del-bis) ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS).
Lorsque le synthon hydroxylé mis en oeuvre dans un procédé de l'invention est le NNHEA, d'autres enzymes permettent également de n'obtenir avantageusement que des NNHEA mono-glucosylés, à savoir :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP
WT), - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant Q;
26 PCT/EP2016/055843 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de représentant C, L et V ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 12 (alpha-1,2 BrS).
Il doit être compris de ces formulations que les acides aminés définis comme étant respectivement Xi, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8 et X9 sont présents et tels que définis ci-dessus dans les glucane-saccharases de l'invention ayant au moins 80 %
d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 1.
La présente invention englobe également les séquences dont la séquence d'acides aminés a au moins 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité
en acides aminés avec l'une des séquences SEQ ID NO : 1 à 18 telles que définies précédemment et une activité biologique de même nature.
Par activité biologique de même nature en ce qui concerne les séquences peptidiques 1 à 18, on entend une même capacité à glycosyler les synthons hydroxylés de l'invention.
Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés, au sens de la présente invention, est déterminé en comparant les deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison.
La partie de la séquence nucléotidique dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des gaps ) par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à
obtenir un alignement optimal entre les deux séquences.
Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles une base nucléique identique (ou un acide aminé identique) est observé pour les deux séquences comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité
entre les deux bases nucléiques (ou entre les deux acides aminés) par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité en nucléotides (ou en acides aminés) des deux séquences entre elles.
Il doit être compris de ces formulations que les acides aminés définis comme étant respectivement Xi, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8 et X9 sont présents et tels que définis ci-dessus dans les glucane-saccharases de l'invention ayant au moins 80 %
d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 1.
La présente invention englobe également les séquences dont la séquence d'acides aminés a au moins 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité
en acides aminés avec l'une des séquences SEQ ID NO : 1 à 18 telles que définies précédemment et une activité biologique de même nature.
Par activité biologique de même nature en ce qui concerne les séquences peptidiques 1 à 18, on entend une même capacité à glycosyler les synthons hydroxylés de l'invention.
Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés, au sens de la présente invention, est déterminé en comparant les deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison.
La partie de la séquence nucléotidique dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des gaps ) par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à
obtenir un alignement optimal entre les deux séquences.
Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles une base nucléique identique (ou un acide aminé identique) est observé pour les deux séquences comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité
entre les deux bases nucléiques (ou entre les deux acides aminés) par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité en nucléotides (ou en acides aminés) des deux séquences entre elles.
27 PCT/EP2016/055843 L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus.
De manière tout à fait préférée, le pourcentage d'identité de séquence est déterminé à l'aide du logiciel CLUSTAL W (version 1.82) les paramètres étant fixés comme suit : (1) CPU MODE = ClustalW mp ; (2) ALIGNMENT = full ; (3) OUTPUT
FORMAT = aln w/numbers ; (4) OUTPUT ORDER = aligned ; (5) COLOR
ALIGNMENT = no ; (6) KTUP (word size) = default ; (7) WINDOW LENGTH =
default ; (8) SCORE TYPE = percent ; (9) TOPDIAG = default ; (10) PAIRGAP
= default ; (11) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = none ; (12) MATRIX =
default ; (13) GAP OPEN = default ; (14) END GAPS = default ; (15) GAP
EXTENSION = default ; (16) GAP DISTANCES = default ; (17) TREE TYPE =
cladogram et (18) TREE GRAP DISTANCES = hide .
Plus particulièrement, la présente invention concerne également les séquences dont la séquence d'acides aminés a 100 % d'identité en acides aminés avec les acides aminés 225 à450 des séquences SEQ ID NO : 2 à 10 et au moins 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité en acides aminés avec le reste des séquences SEQ ID NO : 2 à 10 telles que définies précédemment, et une activité biologique de même nature.
Les enzymes selon l'invention permettent d'aboutir à des synthons glycosylés, ou monomères, pouvant être mono- ou poly-glycosylés.
Ainsi, comme illustré dans les exemples de la présente demande, les spécificités des différentes enzymes de l'invention permettent avantageusement d'aboutir à
façon à des monomères de structure donnée.
A titre d'exemple, et comme illustré dans les exemples, et en particulier dans le Tableau 3, lorsque le HEMA est glucosylé à l'aide de l'enzyme GBD-CD2, la totalité des monomères obtenus sont mono-glucosylés. Au contraire, la mise en oeuvre de l'enzyme ASR en présence de HEMA permet d'aboutir à une répartition homogène de HEMA
mono-, di- et tri-glucosylés.
De manière tout à fait préférée, le pourcentage d'identité de séquence est déterminé à l'aide du logiciel CLUSTAL W (version 1.82) les paramètres étant fixés comme suit : (1) CPU MODE = ClustalW mp ; (2) ALIGNMENT = full ; (3) OUTPUT
FORMAT = aln w/numbers ; (4) OUTPUT ORDER = aligned ; (5) COLOR
ALIGNMENT = no ; (6) KTUP (word size) = default ; (7) WINDOW LENGTH =
default ; (8) SCORE TYPE = percent ; (9) TOPDIAG = default ; (10) PAIRGAP
= default ; (11) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = none ; (12) MATRIX =
default ; (13) GAP OPEN = default ; (14) END GAPS = default ; (15) GAP
EXTENSION = default ; (16) GAP DISTANCES = default ; (17) TREE TYPE =
cladogram et (18) TREE GRAP DISTANCES = hide .
Plus particulièrement, la présente invention concerne également les séquences dont la séquence d'acides aminés a 100 % d'identité en acides aminés avec les acides aminés 225 à450 des séquences SEQ ID NO : 2 à 10 et au moins 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99 % ou 100 % d'identité en acides aminés avec le reste des séquences SEQ ID NO : 2 à 10 telles que définies précédemment, et une activité biologique de même nature.
Les enzymes selon l'invention permettent d'aboutir à des synthons glycosylés, ou monomères, pouvant être mono- ou poly-glycosylés.
Ainsi, comme illustré dans les exemples de la présente demande, les spécificités des différentes enzymes de l'invention permettent avantageusement d'aboutir à
façon à des monomères de structure donnée.
A titre d'exemple, et comme illustré dans les exemples, et en particulier dans le Tableau 3, lorsque le HEMA est glucosylé à l'aide de l'enzyme GBD-CD2, la totalité des monomères obtenus sont mono-glucosylés. Au contraire, la mise en oeuvre de l'enzyme ASR en présence de HEMA permet d'aboutir à une répartition homogène de HEMA
mono-, di- et tri-glucosylés.
28 PCT/EP2016/055843 Synthons hydroxylés et mises en oeuvre a) Synthons hydroxylés mis en oeuvre dans un procédé enzymatique de glycosylation de l'invention Les synthons hydroxylés spécifiquement mis en oeuvre dans un procédé
enzymatique de fabrication de monomères de l'invention sont choisis parmi les composés de formules (I) à (VI).
Ainsi, selon un premier aspect, les synthons hydroxylés de l'invention peuvent être des composés de formule (I) :
(i) des synthons (méth)acrylates/(méth)acrylamides de formule (I) :
Ri X i \
R, / ' HO (I) dans laquelle :
R1 représente un atome d'hydrogène ou un alkyle en C1-C3;
R2 représente un groupement alkylène en C1-C20; ou un groupement (C2H40)., avec n étant un entier compris entre 1 et 10 ; et X1 représente ¨(0)¨, ¨(NH)¨, -(S)- ou ¨(NR'2(OH))¨, de préférence ¨(0)¨, ¨
(NH)¨, ou ¨(NR'2(OH))¨, avec R'2 représentant un groupement alkylène en C1-C20 ; ou un groupement ¨(C2H40).,¨, avec m étant un entier compris entre 1 et 10 ;
Selon un mode de réalisation, R1 représente un atome d'hydrogène.
Selon un autre mode de réalisation, R1 représente un alkyle en Ci-C3, de préférence un méthyle.
Selon un mode de réalisation, R2 représente un groupement alkylène en Ci-C20, en particulier en Ci-Cio, notamment de Ci à C5. Plus particulièrement, R2 peut être choisi dans le groupe constitué d'un méthylène, un éthylène, un propylène, un butylène et un pentylène, et représente de préférence un méthylène ou un éthylène.
Selon un mode de réalisation, X1 représente ¨(0)¨, ¨(NH)¨ ou ¨(NR'2(OH))¨, de préférence ¨(0)¨ ou ¨(NH)¨.
enzymatique de fabrication de monomères de l'invention sont choisis parmi les composés de formules (I) à (VI).
Ainsi, selon un premier aspect, les synthons hydroxylés de l'invention peuvent être des composés de formule (I) :
(i) des synthons (méth)acrylates/(méth)acrylamides de formule (I) :
Ri X i \
R, / ' HO (I) dans laquelle :
R1 représente un atome d'hydrogène ou un alkyle en C1-C3;
R2 représente un groupement alkylène en C1-C20; ou un groupement (C2H40)., avec n étant un entier compris entre 1 et 10 ; et X1 représente ¨(0)¨, ¨(NH)¨, -(S)- ou ¨(NR'2(OH))¨, de préférence ¨(0)¨, ¨
(NH)¨, ou ¨(NR'2(OH))¨, avec R'2 représentant un groupement alkylène en C1-C20 ; ou un groupement ¨(C2H40).,¨, avec m étant un entier compris entre 1 et 10 ;
Selon un mode de réalisation, R1 représente un atome d'hydrogène.
Selon un autre mode de réalisation, R1 représente un alkyle en Ci-C3, de préférence un méthyle.
Selon un mode de réalisation, R2 représente un groupement alkylène en Ci-C20, en particulier en Ci-Cio, notamment de Ci à C5. Plus particulièrement, R2 peut être choisi dans le groupe constitué d'un méthylène, un éthylène, un propylène, un butylène et un pentylène, et représente de préférence un méthylène ou un éthylène.
Selon un mode de réalisation, X1 représente ¨(0)¨, ¨(NH)¨ ou ¨(NR'2(OH))¨, de préférence ¨(0)¨ ou ¨(NH)¨.
29 PCT/EP2016/055843 Selon un mode de réalisation, R'2 représente un groupement alkylène en C1-C20, en particulier en Ci-Cio, notamment de Ci à C5. Plus particulièrement, R'2 peut être choisi dans le groupe constitué d'un méthylène, un éthylène, un propylène, un butylène et un pentylène, et représente de préférence un méthylène ou un éthylène.
Selon un mode de réalisation particulier, un synthon de formule (I) de l'invention est tel que :
Ri représente un atome d'hydrogène ou un alkyle en Ci-C3, de préférence un hydrogène ou un méthyle ;
R2 représente un groupement alkyle en C1-C20, de préférence un alkylène en C1-C10, en particulier en C1-05, plus particulièrement un méthylène ou un éthylène ; et X1 représente ¨(0)¨, ¨(NH)¨ ou ¨(NR'2(OH))¨, de préférence ¨(0)¨ ou ¨(NH)¨.
Selon un mode de réalisation préféré, un synthon de formule (I) de l'invention est tel que :
Xi représente ¨(0)¨;
Ri représente un atome d'hydrogène ou un alkyle en C1-C3, de préférence un alkyle en C1-C3, en particulier un méthyle ; et R2 représente un groupement alkyle en C1-C20, de préférence un alkylène en C1-C10, en particulier en C1-05, plus particulièrement un méthylène ou un éthylène, préférentiellement un éthylène.
Un tel synthon de formule (I) peut en particulier être un 2-(hydroxy)ethyl methacrylate (HEMA) :
OH
Selon un autre mode de réalisation préféré, un synthon de formule (I) de l'invention est tel que :
Xi représente ¨(NH)¨;
Ri représente un atome d'hydrogène ou un alkyle en C1-C3, de préférence un hydrogène ou un méthyl ; et R2 représente un groupement alkyle en C1-C20, de préférence un alkylène en C1-C10, en particulier en C1-05, plus particulièrement un méthylène ou un éthylène.
Selon un mode de réalisation particulier, un synthon de formule (I) de l'invention est tel que :
Ri représente un atome d'hydrogène ou un alkyle en Ci-C3, de préférence un hydrogène ou un méthyle ;
R2 représente un groupement alkyle en C1-C20, de préférence un alkylène en C1-C10, en particulier en C1-05, plus particulièrement un méthylène ou un éthylène ; et X1 représente ¨(0)¨, ¨(NH)¨ ou ¨(NR'2(OH))¨, de préférence ¨(0)¨ ou ¨(NH)¨.
Selon un mode de réalisation préféré, un synthon de formule (I) de l'invention est tel que :
Xi représente ¨(0)¨;
Ri représente un atome d'hydrogène ou un alkyle en C1-C3, de préférence un alkyle en C1-C3, en particulier un méthyle ; et R2 représente un groupement alkyle en C1-C20, de préférence un alkylène en C1-C10, en particulier en C1-05, plus particulièrement un méthylène ou un éthylène, préférentiellement un éthylène.
Un tel synthon de formule (I) peut en particulier être un 2-(hydroxy)ethyl methacrylate (HEMA) :
OH
Selon un autre mode de réalisation préféré, un synthon de formule (I) de l'invention est tel que :
Xi représente ¨(NH)¨;
Ri représente un atome d'hydrogène ou un alkyle en C1-C3, de préférence un hydrogène ou un méthyl ; et R2 représente un groupement alkyle en C1-C20, de préférence un alkylène en C1-C10, en particulier en C1-05, plus particulièrement un méthylène ou un éthylène.
30 PCT/EP2016/055843 Un tel synthon de formule (I) peut en particulier être un N-(hydroxy)methyl acrylamide (NHAM) ou un N-(hydroxy)ethyl acrylamide (HEAA) :
,rH C - ,() H
HO N N
H (NHAM) h (HEAA) Selon un autre mode de réalisation préféré, un synthon de formule (I) de l'invention est tel que :
X1 représente ¨(NR'2(OH))¨, dans lequel R'2 représente un groupement alkylène en Ci-C20, en particulier en Ci-Cio, notamment de C1 à C5, plus particulièrement un méthylène, un éthylène, un propylène, un butylène ou un pentylène, de préférence un méthylène ou un éthylène, plus préférentiellement un éthylène ;
R1 représente un atome d'hydrogène ; et R2 représente un groupement alkyle en Ci-C20, de préférence un alkylène en C1-Cio, en particulier en C1-05, plus particulièrement un méthylène ou un éthylène, notamment un éthylène.
Un tel synthon de formule (I) peut en particulier être un N,N-bis(2-hydroxyethyl)acrylamide (NNHEA) :
HO
HO
Selon un mode de réalisation particulier, un synthon de l'invention de formule (I) est choisi parmi le 2-(hydroxy)ethylmethacrylate (HEMA), le N-(hydroxy)methyl acrylamide (NHAM), le N-(hydroxy)ethylacrylamide (HEAA) et le N,N-bis(2-hydroxyethyl)acrylamide (NNHEA), de préférence parmi le HEMA, LE NHAM et le HEAA.
,rH C - ,() H
HO N N
H (NHAM) h (HEAA) Selon un autre mode de réalisation préféré, un synthon de formule (I) de l'invention est tel que :
X1 représente ¨(NR'2(OH))¨, dans lequel R'2 représente un groupement alkylène en Ci-C20, en particulier en Ci-Cio, notamment de C1 à C5, plus particulièrement un méthylène, un éthylène, un propylène, un butylène ou un pentylène, de préférence un méthylène ou un éthylène, plus préférentiellement un éthylène ;
R1 représente un atome d'hydrogène ; et R2 représente un groupement alkyle en Ci-C20, de préférence un alkylène en C1-Cio, en particulier en C1-05, plus particulièrement un méthylène ou un éthylène, notamment un éthylène.
Un tel synthon de formule (I) peut en particulier être un N,N-bis(2-hydroxyethyl)acrylamide (NNHEA) :
HO
HO
Selon un mode de réalisation particulier, un synthon de l'invention de formule (I) est choisi parmi le 2-(hydroxy)ethylmethacrylate (HEMA), le N-(hydroxy)methyl acrylamide (NHAM), le N-(hydroxy)ethylacrylamide (HEAA) et le N,N-bis(2-hydroxyethyl)acrylamide (NNHEA), de préférence parmi le HEMA, LE NHAM et le HEAA.
31 PCT/EP2016/055843 Selon un autre aspect, les synthons hydroxylés de l'invention peuvent être des composés de formule (II) :
HO (II) dans laquelle R3 représente une liaison covalente ; un groupement alkylène en Ci-C20; ou un groupement (C2H40)õ, avec n étant un entier compris entre 1 et 10.
De préférence, R3 représente une liaison covalente ou un groupement alkylène en Cl-C20.
Un tel groupement alkylène peut en particulier être en Ci-Cio, notamment en C1-05. Plus particulièrement, R3 peut être choisi dans le groupe constitué
d'un méthylène, un éthylène, un propylène, un butylène et un pentylène, et est de préférence un méthylène ou un éthylène.
Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, R3 représente une liaison covalente, un méthylène ou un éthylène.
Un synthon de formule (II) peut en particulier être un 4-vinylphenol (VP) ou un 4-vinyl benzylalcool (VBA) :
OH
\-f (VP) (VBA) Selon un autre aspect, les synthons hydroxylés de l'invention peuvent être des composés de formule (III) :
oot H R4¨QH (III) dans laquelle R4 représente une liaison covalente ; un groupement alkylène en Ci-C20; ou un groupement (C2H40)õ, avec n étant un entier compris entre 1 et 10.
HO (II) dans laquelle R3 représente une liaison covalente ; un groupement alkylène en Ci-C20; ou un groupement (C2H40)õ, avec n étant un entier compris entre 1 et 10.
De préférence, R3 représente une liaison covalente ou un groupement alkylène en Cl-C20.
Un tel groupement alkylène peut en particulier être en Ci-Cio, notamment en C1-05. Plus particulièrement, R3 peut être choisi dans le groupe constitué
d'un méthylène, un éthylène, un propylène, un butylène et un pentylène, et est de préférence un méthylène ou un éthylène.
Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, R3 représente une liaison covalente, un méthylène ou un éthylène.
Un synthon de formule (II) peut en particulier être un 4-vinylphenol (VP) ou un 4-vinyl benzylalcool (VBA) :
OH
\-f (VP) (VBA) Selon un autre aspect, les synthons hydroxylés de l'invention peuvent être des composés de formule (III) :
oot H R4¨QH (III) dans laquelle R4 représente une liaison covalente ; un groupement alkylène en Ci-C20; ou un groupement (C2H40)õ, avec n étant un entier compris entre 1 et 10.
32 PCT/EP2016/055843 De préférence, R4 représente un groupement alkylène en Ci-C20, en particulier en Ci-Cio, notamment en C1-05. Plus particulièrement, R4 peut être choisi dans le groupe constitué d'un méthylène, un éthylène, un propylène, un butylène et un pentylène, et est de préférence un méthylène ou un éthylène, plus particulièrement un méthylène.
Un synthon de formule (III) peut en particulier être un 4-(hydroxy)methyl oxazolidine-2,5-dione (HMNCA) :
1-10µõ,k-Selon un autre aspect, les synthons hydroxylés de l'invention peuvent être des composés de formule (IV) :
OH
R6 _________________________________ (IV) dans laquelle :
R5 représente une liaison covalente ; un groupement alkylène en Ci-C20 ; ou un groupement (C2H40)õõ avec m étant un entier compris entre 1 et 10 ;
n représente un entier compris entre 1 et 20;
X2 représente -(0)-, -(NH)- ou -(S)- ; et R6 représente un hydrogène ou un groupement alkyle en C1-C20.
Selon un mode de réalisation préféré, X2 représente ¨(0)¨.
Selon un mode de réalisation, n est compris entre 1 et 10, notamment entre 1 et 5. n est en particulier choisi parmi 1, 2, 3, 4 et 5, et représente de préférence la valeur 1 ou 2.
De préférence, R5 représente une liaison covalente ou un groupement alkylène en Ci-Cio, notamment en Ci-05. Plus particulièrement, le groupement alkylène peut être choisi dans le groupe constitué d'un méthylène, d'un éthylène, d'un propylène, d'un butylène et d'un pentylène, de préférence un méthylène ou un éthylène, plus particulièrement un méthylène.
Ainsi, de façon particulièrement préférée, R5 représente une liaison covalente ou un méthylène.
Un synthon de formule (III) peut en particulier être un 4-(hydroxy)methyl oxazolidine-2,5-dione (HMNCA) :
1-10µõ,k-Selon un autre aspect, les synthons hydroxylés de l'invention peuvent être des composés de formule (IV) :
OH
R6 _________________________________ (IV) dans laquelle :
R5 représente une liaison covalente ; un groupement alkylène en Ci-C20 ; ou un groupement (C2H40)õõ avec m étant un entier compris entre 1 et 10 ;
n représente un entier compris entre 1 et 20;
X2 représente -(0)-, -(NH)- ou -(S)- ; et R6 représente un hydrogène ou un groupement alkyle en C1-C20.
Selon un mode de réalisation préféré, X2 représente ¨(0)¨.
Selon un mode de réalisation, n est compris entre 1 et 10, notamment entre 1 et 5. n est en particulier choisi parmi 1, 2, 3, 4 et 5, et représente de préférence la valeur 1 ou 2.
De préférence, R5 représente une liaison covalente ou un groupement alkylène en Ci-Cio, notamment en Ci-05. Plus particulièrement, le groupement alkylène peut être choisi dans le groupe constitué d'un méthylène, d'un éthylène, d'un propylène, d'un butylène et d'un pentylène, de préférence un méthylène ou un éthylène, plus particulièrement un méthylène.
Ainsi, de façon particulièrement préférée, R5 représente une liaison covalente ou un méthylène.
33 PCT/EP2016/055843 Selon un mode de réalisation, R6 représente un hydrogène ou un groupement alkyle en C1-C10, notamment en C1-05. Plus particulièrement, le groupement alkyle peut être choisi dans le groupe constitué d'un méthyle, d'un éthyle, d'un propyle, d'un butyle et d'un pentyle, de préférence un méthyle ou un éthyle, plus particulièrement un méthyle.
Ainsi, de façon particulièrement préférée, R6 représente un hydrogène ou un méthyle.
Selon un mode de réalisation particulier, un composé de formule (IV) est tel que:
R5 représente un groupement alkylène en Ci-Cio, notamment en C1-05, et est en particulier un méthylène ;
n représente un entier compris entre 1 et 5 ; et représente de préférence la valeur 1 ou 2, en particulier la valeur 2;
X2 représente ¨(0)¨; et R6 représente un hydrogène.
Un tel synthon de formule (IV) peut en particulier être un a-(hydroxy)methyl caprolactone (AHMCL) :
HO
Selon un autre mode de réalisation particulier, un composé de formule (IV) est tel que:
R5 représente une liaison covalente ;
n représente un entier compris entre 1 et 5 ; et représente de préférence la valeur 1 ou 2, en particulier la valeur 1 ;
X2 représente ¨(0)¨; et R6 représente un groupement alkyle en C1-C10, notamment en Ci-05 et est en particulier un méthyle.
Ainsi, de façon particulièrement préférée, R6 représente un hydrogène ou un méthyle.
Selon un mode de réalisation particulier, un composé de formule (IV) est tel que:
R5 représente un groupement alkylène en Ci-Cio, notamment en C1-05, et est en particulier un méthylène ;
n représente un entier compris entre 1 et 5 ; et représente de préférence la valeur 1 ou 2, en particulier la valeur 2;
X2 représente ¨(0)¨; et R6 représente un hydrogène.
Un tel synthon de formule (IV) peut en particulier être un a-(hydroxy)methyl caprolactone (AHMCL) :
HO
Selon un autre mode de réalisation particulier, un composé de formule (IV) est tel que:
R5 représente une liaison covalente ;
n représente un entier compris entre 1 et 5 ; et représente de préférence la valeur 1 ou 2, en particulier la valeur 1 ;
X2 représente ¨(0)¨; et R6 représente un groupement alkyle en C1-C10, notamment en Ci-05 et est en particulier un méthyle.
34 PCT/EP2016/055843 Un tel synthon de formule (IV) peut en particulier être un ( )-mevalonolactone (MVL) :
/ 10 / C,11, -7`.
Selon un mode de réalisation particulier, un synthon de l'invention de formule (IV) est choisi parmi l'a-(hydroxy)methyl caprolactone (AHMCL) et le ( )- mevalonolactone (MVL).
Selon un autre aspect, les synthons hydroxylés de l'invention peuvent être des composés de formule (V) :
FIS OH (v) dans laquelle R7 représente un groupement alkylène en Ci-C20.
De préférence, R7 représente un groupement alkylène en Ci-Cio, notamment en C1-05. Plus particulièrement, R7 peut être choisi dans le groupe constitué
d'un méthylène, d'un éthylène, d'un propylène, d'un butylène et d'un pentylène, de préférence un méthylène ou un éthylène, plus particulièrement un éthylène.
Un tel synthon de formule (V) peut en particulier être un 2-mercaptoéthanol (BME) :
HSõ-----.OH
Selon un autre aspect, les synthons hydroxylés de l'invention peuvent être des composés de formule (VI) :
OH
.-------7-R--- (VI) dans laquelle R8 représente un groupement alkylène en C1-C20.
De préférence, R8 représente un groupement alkylène en Ci-C10, notamment en C1-05. Plus particulièrement, R8 peut être choisi dans le groupe constitué
d'un méthylène,
/ 10 / C,11, -7`.
Selon un mode de réalisation particulier, un synthon de l'invention de formule (IV) est choisi parmi l'a-(hydroxy)methyl caprolactone (AHMCL) et le ( )- mevalonolactone (MVL).
Selon un autre aspect, les synthons hydroxylés de l'invention peuvent être des composés de formule (V) :
FIS OH (v) dans laquelle R7 représente un groupement alkylène en Ci-C20.
De préférence, R7 représente un groupement alkylène en Ci-Cio, notamment en C1-05. Plus particulièrement, R7 peut être choisi dans le groupe constitué
d'un méthylène, d'un éthylène, d'un propylène, d'un butylène et d'un pentylène, de préférence un méthylène ou un éthylène, plus particulièrement un éthylène.
Un tel synthon de formule (V) peut en particulier être un 2-mercaptoéthanol (BME) :
HSõ-----.OH
Selon un autre aspect, les synthons hydroxylés de l'invention peuvent être des composés de formule (VI) :
OH
.-------7-R--- (VI) dans laquelle R8 représente un groupement alkylène en C1-C20.
De préférence, R8 représente un groupement alkylène en Ci-C10, notamment en C1-05. Plus particulièrement, R8 peut être choisi dans le groupe constitué
d'un méthylène,
35 PCT/EP2016/055843 d'un éthylène, d'un propylène, d'un butylène et d'un pentylène, de préférence un méthylène ou un éthylène, plus particulièrement un méthylène.
Un tel synthon de formule (VI) peut en particulier être un 2-propène-1 -ol (alcool allylique) :
O H.
Selon un mode de réalisation, un synthon de l'invention peut être choisi dans le groupe constitué du 2(hydroxy)ethylmethacrylate (HEMA), du N-(hydroxy)methyl acrylamide (NHAM), du N-(hydroxy)ethylacrylamide (HEAA), du 4-vinylphenol (VP), du 4-vinyl benzylalcool (VBA), du 4-(hydroxy)methyl oxazolidine-2,5-dione (HMNCA), du a-(hydroxy)methyl caprolactone (AHMCL), du ( )- mevalonolactone (MVL), du 2-mercapto éthanol (BME), du 2 propène-1 -ol (alcool allylique) et du N,N-bis(2-hydroxyethyl)acrylamide (NNHEA).
Un synthon selon l'invention est en particulier choisi dans le groupe constitué du 2(hydroxy)ethylmethacrylate (HEMA), du N-(hydroxy)methyl acrylamide (NHAM), du N-(hydroxy)ethylacrylamide (HEAA), du 4-vinyl benzylalcool (VBA), du 2 propène-1 -ol (alcool allylique) et du 2-mercaptoéthanol (BME).
b) Synthons glycosylés ou monomères La glycosylation enzymatique des synthons hydroxylés, et en particulier mono-hydroxylés, de l'invention se fait en présence de saccharose.
Dans la présente demande, les termes synthons glycosylés et monomères sont utilisés de manière interchangeable pour désigner les synthons glycosylés obtenus à
l'issu du procédé enzymatique selon l'invention de glycosylation des synthons hydroxylés.
Ainsi, les synthons de l'invention sont plus particulièrement glucosylés ou fructosylés durant le procédé de glycosylation enzymatique selon l'invention.
Le procédé selon l'invention de fabrication d'un synthon glycosylé, ou monomère, de l'invention peut notamment être mis en oeuvre dans les conditions énoncées à
l'exemple 1, point 1.3 ci-après.
Les monomères de l'invention peuvent être mono- ou pluri-glycosylés, comme illustré dans les exemples de la présente demande.
Un tel synthon de formule (VI) peut en particulier être un 2-propène-1 -ol (alcool allylique) :
O H.
Selon un mode de réalisation, un synthon de l'invention peut être choisi dans le groupe constitué du 2(hydroxy)ethylmethacrylate (HEMA), du N-(hydroxy)methyl acrylamide (NHAM), du N-(hydroxy)ethylacrylamide (HEAA), du 4-vinylphenol (VP), du 4-vinyl benzylalcool (VBA), du 4-(hydroxy)methyl oxazolidine-2,5-dione (HMNCA), du a-(hydroxy)methyl caprolactone (AHMCL), du ( )- mevalonolactone (MVL), du 2-mercapto éthanol (BME), du 2 propène-1 -ol (alcool allylique) et du N,N-bis(2-hydroxyethyl)acrylamide (NNHEA).
Un synthon selon l'invention est en particulier choisi dans le groupe constitué du 2(hydroxy)ethylmethacrylate (HEMA), du N-(hydroxy)methyl acrylamide (NHAM), du N-(hydroxy)ethylacrylamide (HEAA), du 4-vinyl benzylalcool (VBA), du 2 propène-1 -ol (alcool allylique) et du 2-mercaptoéthanol (BME).
b) Synthons glycosylés ou monomères La glycosylation enzymatique des synthons hydroxylés, et en particulier mono-hydroxylés, de l'invention se fait en présence de saccharose.
Dans la présente demande, les termes synthons glycosylés et monomères sont utilisés de manière interchangeable pour désigner les synthons glycosylés obtenus à
l'issu du procédé enzymatique selon l'invention de glycosylation des synthons hydroxylés.
Ainsi, les synthons de l'invention sont plus particulièrement glucosylés ou fructosylés durant le procédé de glycosylation enzymatique selon l'invention.
Le procédé selon l'invention de fabrication d'un synthon glycosylé, ou monomère, de l'invention peut notamment être mis en oeuvre dans les conditions énoncées à
l'exemple 1, point 1.3 ci-après.
Les monomères de l'invention peuvent être mono- ou pluri-glycosylés, comme illustré dans les exemples de la présente demande.
36 PCT/EP2016/055843 A l'issue de cette glycosylation des synthons de l'invention, l'enzyme peut avantageusement être inactivée. Cette inactivation peut à titre illustratif être réalisée en par inactivation thermique, par exemple à une température supérieure à 60 C, notamment supérieure à 80 C, de préférence supérieure à 90 C.
Selon un mode de réalisation particulier, le milieu réactionnel contenant les synthons glycosylés selon l'invention est concentré par lyophilisation, notamment en prévision d'une étape de purification ultérieure.
Selon un autre mode de réalisation, le milieu réactionnel contenant les synthons glycosylés selon l'invention n'est pas concentré par lyophilisation.
Selon un mode de réalisation, les synthons glycosylés selon l'invention sont purifiés après leur préparation. Cette étape de purification, lorsqu'elle est réalisée, peut intervenir après une étape d'inactivation de l'enzyme mise en oeuvre et/ou après une étape de lyophilisation. De préférence, une telle étape de purification intervient après une étape d'inactivation de l'enzyme, en l'absence d'une étape de lyophilisation.
Cette étape de purification peut avantageusement également comprendre une étape d'extraction liquide/liquide afin d'éliminer le synthon résiduel.
Modes de réalisation préférés Dans le cas où le synthon hydroxylé mis en oeuvre dans un procédé de l'invention est le HEMA, la glycane-saccharase mise en oeuvre peut avantageusement être choisie dans le groupe comprenant :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP
WT), - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 2 (ASNP
R226X1), ladite séquence ayant un acide aminé Xi représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, N, P, S et T, de préférence C ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP
1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de P, T et V, de préférence T ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant W;
Selon un mode de réalisation particulier, le milieu réactionnel contenant les synthons glycosylés selon l'invention est concentré par lyophilisation, notamment en prévision d'une étape de purification ultérieure.
Selon un autre mode de réalisation, le milieu réactionnel contenant les synthons glycosylés selon l'invention n'est pas concentré par lyophilisation.
Selon un mode de réalisation, les synthons glycosylés selon l'invention sont purifiés après leur préparation. Cette étape de purification, lorsqu'elle est réalisée, peut intervenir après une étape d'inactivation de l'enzyme mise en oeuvre et/ou après une étape de lyophilisation. De préférence, une telle étape de purification intervient après une étape d'inactivation de l'enzyme, en l'absence d'une étape de lyophilisation.
Cette étape de purification peut avantageusement également comprendre une étape d'extraction liquide/liquide afin d'éliminer le synthon résiduel.
Modes de réalisation préférés Dans le cas où le synthon hydroxylé mis en oeuvre dans un procédé de l'invention est le HEMA, la glycane-saccharase mise en oeuvre peut avantageusement être choisie dans le groupe comprenant :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP
WT), - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 2 (ASNP
R226X1), ladite séquence ayant un acide aminé Xi représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, N, P, S et T, de préférence C ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP
1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de P, T et V, de préférence T ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant W;
37 PCT/EP2016/055843 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant H, I, K, L, M et W, de préférence H et L;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, H, I, K, L, M, N, P, Q, V
et W, de préférence A, C, I, K, L, M, P et V, en particulier A, C, I, K, L, M et V, et notamment A, C, I, L et V ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant A, C, E, F, G, H, K, L, M et N, de préférence A ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, en particulier C, D, E, G, H, et notamment E;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant A, C, E, G, H, I, L, M et N, en particulier A;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M et N, de préférence C, G, K, L et N, notamment N;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 12 (alpha-1,2 BrS) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 13 (AN123-GBD-CD2) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 14 (ASDg) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASR-C-del-bis) ; et
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, H, I, K, L, M, N, P, Q, V
et W, de préférence A, C, I, K, L, M, P et V, en particulier A, C, I, K, L, M et V, et notamment A, C, I, L et V ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant A, C, E, F, G, H, K, L, M et N, de préférence A ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, en particulier C, D, E, G, H, et notamment E;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant A, C, E, G, H, I, L, M et N, en particulier A;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M et N, de préférence C, G, K, L et N, notamment N;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 12 (alpha-1,2 BrS) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 13 (AN123-GBD-CD2) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 14 (ASDg) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASR-C-del-bis) ; et
38 PCT/EP2016/055843 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 18 (fructosyltransférase de Bacillus subtilis).
En outre, dans le cas où le synthon hydroxylé mis en oeuvre est le NHAM, la glycane-saccharase mise en oeuvre dans un procédé de l'invention peut être choisie dans le groupe comprenant :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP
WT), - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 2 (ASNP
R226X1), ladite séquence ayant un acide aminé X1 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V, W et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP
1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, E, L, M, N, P, Q, R, T, V et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, I, L, M, N, P, Q, V, W et Y, de préférence M ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, S, T et V, de préférence N, P, Q, S, et V, notamment N, P et Q;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, G, L, M, N, P, Q, V, W et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, M, N et V, de préférence N ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T et Y, de préférence C, D, E, N, et T, notamment E;
En outre, dans le cas où le synthon hydroxylé mis en oeuvre est le NHAM, la glycane-saccharase mise en oeuvre dans un procédé de l'invention peut être choisie dans le groupe comprenant :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP
WT), - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 2 (ASNP
R226X1), ladite séquence ayant un acide aminé X1 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V, W et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP
1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, E, L, M, N, P, Q, R, T, V et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, I, L, M, N, P, Q, V, W et Y, de préférence M ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, S, T et V, de préférence N, P, Q, S, et V, notamment N, P et Q;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, G, L, M, N, P, Q, V, W et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, M, N et V, de préférence N ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T et Y, de préférence C, D, E, N, et T, notamment E;
39 PCT/EP2016/055843 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, E, G et N, de préférence E;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, F, G, K, L, M, N, Q, S, T et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 11 (DSR-S
yardelA4N ¨ S512C);
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 12 (alpha-1,2 BrS) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 13 (AN123-GBD-CD2) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 14 (ASDg) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 15 (DSR-S-OK) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASR-C-del-bis) ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 18 (fructosyltransférase de Bacillus subtilis).
Selon un mode de réalisation particulier, un procédé de fabrication d'un synthon glycosylé, ou monomère comprend au moins une étape de mise en présence d'au moins une glycane-saccharase avec au moins du 2-mercaptoéthanol (BME) à titre de synthon hydroxylé et au moins un saccharose, dans lequel la glycane-saccharase est choisie dans le groupe comprenant :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP
WT) ;
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, E, G et N, de préférence E;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, F, G, K, L, M, N, Q, S, T et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 11 (DSR-S
yardelA4N ¨ S512C);
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 12 (alpha-1,2 BrS) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 13 (AN123-GBD-CD2) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 14 (ASDg) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 15 (DSR-S-OK) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASR-C-del-bis) ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 18 (fructosyltransférase de Bacillus subtilis).
Selon un mode de réalisation particulier, un procédé de fabrication d'un synthon glycosylé, ou monomère comprend au moins une étape de mise en présence d'au moins une glycane-saccharase avec au moins du 2-mercaptoéthanol (BME) à titre de synthon hydroxylé et au moins un saccharose, dans lequel la glycane-saccharase est choisie dans le groupe comprenant :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP
WT) ;
40 PCT/EP2016/055843 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP
1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, E, F, H, L, M, N, Q, R, V, W et Y, de préférence L, V, W et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, I, L, M, P, Q, R, V, W et Y, de préférence C, M, P, Q, V, W et Y, en particulier C, M, P, V et Y, notamment Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, G, H, I, M, N, P, Q, R, S, T, V et W, de préférence C, D, E, F, M, N, P, Q, S, T, V et W, et notamment F, M, N, P, Q, S et T;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W et Y, de préférence A, C, D, E, G, I, M, P, Q, S, T, V et W, en particulier D, Q, S, T et W, et notamment S, T et W;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, N, Q, S, T, V et W, de préférence Q et V;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, W et Y, de préférence A, C, D, E, F, G, H, I, N, Q, R, S, T, W et Y, en particulier C, D, E, F, N, R, S, T, W et Y, et notamment E, T, et W;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, E et S, de préférence E ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, Q, S et T, de préférence S ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 12 (alpha-1,2 BrS) ;
1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, E, F, H, L, M, N, Q, R, V, W et Y, de préférence L, V, W et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, I, L, M, P, Q, R, V, W et Y, de préférence C, M, P, Q, V, W et Y, en particulier C, M, P, V et Y, notamment Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, G, H, I, M, N, P, Q, R, S, T, V et W, de préférence C, D, E, F, M, N, P, Q, S, T, V et W, et notamment F, M, N, P, Q, S et T;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W et Y, de préférence A, C, D, E, G, I, M, P, Q, S, T, V et W, en particulier D, Q, S, T et W, et notamment S, T et W;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, N, Q, S, T, V et W, de préférence Q et V;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, W et Y, de préférence A, C, D, E, F, G, H, I, N, Q, R, S, T, W et Y, en particulier C, D, E, F, N, R, S, T, W et Y, et notamment E, T, et W;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, E et S, de préférence E ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, Q, S et T, de préférence S ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 12 (alpha-1,2 BrS) ;
41 PCT/EP2016/055843 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 13 (AN123-GBD-CD2) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 14 (ASDg) ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS).
Selon un mode de réalisation particulier, un procédé de fabrication d'un synthon glycosylé, ou monomère comprend au moins une étape de mise en présence d'au moins une glycane-saccharase avec au moins du propèn-l-ol (alcool allylique) à titre de synthon hydroxylé et au moins un saccharose, dans lequel la glycane-saccharase est choisie dans le groupe comprenant :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP
WT), - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 2 (ASNP
R226X1), ladite séquence ayant un acide aminé X1 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP
1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de D, E, F, G, H, P, Q, R, S, T, V, W et Y, de préférence H;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, D, E, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W et Y, de préférence D, E, G, H, I, K et M, en particulier D, E, G, I, K et M;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W et Y, de préférence C, D, E, F, G, H, I, K, L, M W et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W et Y, de préférence C, D, E, G, H, I, K, L, M et W, en particulier C et H;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 14 (ASDg) ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS).
Selon un mode de réalisation particulier, un procédé de fabrication d'un synthon glycosylé, ou monomère comprend au moins une étape de mise en présence d'au moins une glycane-saccharase avec au moins du propèn-l-ol (alcool allylique) à titre de synthon hydroxylé et au moins un saccharose, dans lequel la glycane-saccharase est choisie dans le groupe comprenant :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP
WT), - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 2 (ASNP
R226X1), ladite séquence ayant un acide aminé X1 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP
1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de D, E, F, G, H, P, Q, R, S, T, V, W et Y, de préférence H;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, D, E, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W et Y, de préférence D, E, G, H, I, K et M, en particulier D, E, G, I, K et M;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W et Y, de préférence C, D, E, F, G, H, I, K, L, M W et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W et Y, de préférence C, D, E, G, H, I, K, L, M et W, en particulier C et H;
42 PCT/EP2016/055843 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y, de préférence C, D, E, F, G, H, K, L, M, S et Y, en particulier C;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W et Y, de préférence C, D, E, F, G, H, I, K, L, N et W;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W et Y, de préférence E, F, G, H, I, K et L, en particulier E;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 10 (ASNP
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, Q, S, T, V, W et Y, de préférence M;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 12 (alpha-1,2 BrS) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 13 (AN123-GBD-CD2) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 14 (ASDg) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS) ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 18 (fructosyltransférase de Bacillus subtilis).
Selon un mode de réalisation particulier, un procédé de fabrication d'un synthon glycosylé, ou monomère comprend au moins une étape de mise en présence d'au moins une glycane-saccharase avec au moins du VBA à titre de synthon hydroxylé et au moins un saccharose, dans lequel la glycane-saccharase est choisie dans le groupe comprenant :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP
WT),
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W et Y, de préférence C, D, E, F, G, H, I, K, L, N et W;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W et Y, de préférence E, F, G, H, I, K et L, en particulier E;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 10 (ASNP
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, Q, S, T, V, W et Y, de préférence M;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 12 (alpha-1,2 BrS) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 13 (AN123-GBD-CD2) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 14 (ASDg) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS) ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 18 (fructosyltransférase de Bacillus subtilis).
Selon un mode de réalisation particulier, un procédé de fabrication d'un synthon glycosylé, ou monomère comprend au moins une étape de mise en présence d'au moins une glycane-saccharase avec au moins du VBA à titre de synthon hydroxylé et au moins un saccharose, dans lequel la glycane-saccharase est choisie dans le groupe comprenant :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP
WT),
43 PCT/EP2016/055843 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 2 (ASNP
R226X1), ladite séquence ayant un acide aminé X1 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de H, K, M, N, Q, S, T, V et Y, en particulier H, K, M, N, Q, S, T et V, de préférence H, K, M, N, Q, T et V ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP
1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de V;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de M, N, P, Q, S, T et V, de préférence M, N, P, Q, S et T, et notamment P, Q et S;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de V et W;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, D, G, S, T et Y, de préférence C, G, S, T et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant l'acide aminé A;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 12 (alpha-1,2 BrS) ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASR-C-del-bis).
Selon un mode de réalisation particulier, un procédé de fabrication d'un synthon glycosylé, ou monomère comprend au moins une étape de mise en présence d'au moins une glycane-saccharase avec au moins du NNHEA à titre de synthon hydroxylé et au moins un saccharose, dans lequel la glycane-saccharase est choisie dans le groupe comprenant :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP
WT),
R226X1), ladite séquence ayant un acide aminé X1 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de H, K, M, N, Q, S, T, V et Y, en particulier H, K, M, N, Q, S, T et V, de préférence H, K, M, N, Q, T et V ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP
1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de V;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de M, N, P, Q, S, T et V, de préférence M, N, P, Q, S et T, et notamment P, Q et S;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de V et W;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, D, G, S, T et Y, de préférence C, G, S, T et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant l'acide aminé A;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 12 (alpha-1,2 BrS) ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASR-C-del-bis).
Selon un mode de réalisation particulier, un procédé de fabrication d'un synthon glycosylé, ou monomère comprend au moins une étape de mise en présence d'au moins une glycane-saccharase avec au moins du NNHEA à titre de synthon hydroxylé et au moins un saccharose, dans lequel la glycane-saccharase est choisie dans le groupe comprenant :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP
WT),
44 PCT/EP2016/055843 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 2 (ASNP
R226X1), ladite séquence ayant un acide aminé X1 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, D, E, I, K, L, M, N, Q, S, T, V, W et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP
I228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, E, F, H, L, M, N, P, Q, S, T, V, W et Y, de préférence V;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, I, L, M, N, Q, R, V, W et Y, de préférence M ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V et W, de préférence C, G, M, N, Q, S, T et V, en particulier Q;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W et Y, de préférence A, C, G, I, K, L, M, Q, S, T, V et W, en particulier C, L, V et W;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, K, M, Q, T, V et Y, de préférence V;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, R, S, T, W et Y, de préférence D, E, G, N, S, T et Y ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de E, G, R et S ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, F, G, K, L, M, N, Q, S, T et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS) ; et
R226X1), ladite séquence ayant un acide aminé X1 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, D, E, I, K, L, M, N, Q, S, T, V, W et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP
I228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, E, F, H, L, M, N, P, Q, S, T, V, W et Y, de préférence V;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, I, L, M, N, Q, R, V, W et Y, de préférence M ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V et W, de préférence C, G, M, N, Q, S, T et V, en particulier Q;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W et Y, de préférence A, C, G, I, K, L, M, Q, S, T, V et W, en particulier C, L, V et W;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, K, M, Q, T, V et Y, de préférence V;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, R, S, T, W et Y, de préférence D, E, G, N, S, T et Y ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de E, G, R et S ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, F, G, K, L, M, N, Q, S, T et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS) ; et
45 PCT/EP2016/055843 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASR-C-del-bis).
Une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 12 (alpha-1,2 BrS) peut également être utilisée dans un procédé de fabrication de synthon glycosylé
selon l'invention lorsque NNHEA est le synthon hydroxylé à glycosyler, en particulier à
glucosyler.
Selon un mode de réalisation particulier, un procédé de fabrication d'un synthon glycosylé, ou monomère comprend au moins une étape de mise en présence d'au moins une glycane-saccharase avec au moins du HEAA à titre de synthon hydroxylé et au moins un saccharose, dans lequel la glycane-saccharase est choisie dans le groupe comprenant :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant E;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASR-C-del-bis) ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 18 (fructosyltransférase de Bacillus subtilis).
Ainsi, la présente invention concerne plus préférentiellement un procédé de fabrication d'un synthon glycosylé, ou monomère, comprenant au moins une étape de mise en présence d'au moins une glycane-saccharase avec au moins un synthon hydroxylé et au moins un saccharose, dans lequel :
(i) le synthon glycosylé est le HEMA et la glycane-saccharase mise en oeuvre est choisie dans le groupe comprenant :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP
WT), - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 2 (ASNP
R226X1), ladite séquence ayant un acide aminé X1 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, N, P, S et T, de préférence C ;
Une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 12 (alpha-1,2 BrS) peut également être utilisée dans un procédé de fabrication de synthon glycosylé
selon l'invention lorsque NNHEA est le synthon hydroxylé à glycosyler, en particulier à
glucosyler.
Selon un mode de réalisation particulier, un procédé de fabrication d'un synthon glycosylé, ou monomère comprend au moins une étape de mise en présence d'au moins une glycane-saccharase avec au moins du HEAA à titre de synthon hydroxylé et au moins un saccharose, dans lequel la glycane-saccharase est choisie dans le groupe comprenant :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant E;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASR-C-del-bis) ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 18 (fructosyltransférase de Bacillus subtilis).
Ainsi, la présente invention concerne plus préférentiellement un procédé de fabrication d'un synthon glycosylé, ou monomère, comprenant au moins une étape de mise en présence d'au moins une glycane-saccharase avec au moins un synthon hydroxylé et au moins un saccharose, dans lequel :
(i) le synthon glycosylé est le HEMA et la glycane-saccharase mise en oeuvre est choisie dans le groupe comprenant :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP
WT), - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 2 (ASNP
R226X1), ladite séquence ayant un acide aminé X1 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, N, P, S et T, de préférence C ;
46 PCT/EP2016/055843 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP
1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de P, T et V, de préférence T;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant W;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant H, I, K, L, M et W, de préférence H et L;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, H, I, K, L, M, N, P, Q, V
et W, de préférence A, C, I, K, L, M, P et V, en particulier A, C, I, K, L, M et V, et notamment A, C, I, L et V ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant A, C, E, F, G, H, K, L, M et N, de préférence A ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, en particulier C, D, E, G, H, et notamment E;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant A, C, E, G, H, I, L, M et N, en particulier A;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M et N, de préférence C, G, K, L et N, notamment N;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 12 (alpha-1,2 BrS) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 13 (AN123-GBD-CD2) ;
1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de P, T et V, de préférence T;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant W;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant H, I, K, L, M et W, de préférence H et L;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, H, I, K, L, M, N, P, Q, V
et W, de préférence A, C, I, K, L, M, P et V, en particulier A, C, I, K, L, M et V, et notamment A, C, I, L et V ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant A, C, E, F, G, H, K, L, M et N, de préférence A ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, en particulier C, D, E, G, H, et notamment E;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant A, C, E, G, H, I, L, M et N, en particulier A;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M et N, de préférence C, G, K, L et N, notamment N;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 12 (alpha-1,2 BrS) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 13 (AN123-GBD-CD2) ;
47 PCT/EP2016/055843 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 14 (ASDg) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASR-C-del-bis) ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 18 (fructosyltransférase de Bacillus subtilis) ;
(ii) le synthon hydroxylé est le NHAM et la glycane-saccharase mise en oeuvre dans un procédé de l'invention est choisie dans le groupe comprenant :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP
WT), - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 2 (ASNP
R226X1), ladite séquence ayant un acide aminé X1 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V, W et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP
1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, E, L, M, N, P, Q, R, T, V et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, I, L, M, N, P, Q, V, W et Y, de préférence M ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, S, T et V, de préférence N, P, Q, S, et V, notamment N, P et Q;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, G, L, M, N, P, Q, V, W et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, M, N et V, de préférence N ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASR-C-del-bis) ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 18 (fructosyltransférase de Bacillus subtilis) ;
(ii) le synthon hydroxylé est le NHAM et la glycane-saccharase mise en oeuvre dans un procédé de l'invention est choisie dans le groupe comprenant :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP
WT), - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 2 (ASNP
R226X1), ladite séquence ayant un acide aminé X1 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V, W et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP
1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, E, L, M, N, P, Q, R, T, V et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, I, L, M, N, P, Q, V, W et Y, de préférence M ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, S, T et V, de préférence N, P, Q, S, et V, notamment N, P et Q;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, G, L, M, N, P, Q, V, W et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, M, N et V, de préférence N ;
48 PCT/EP2016/055843 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T et Y, de préférence C, D, E, N, et T, notamment E;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, E, G et N, de préférence E ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, F, G, K, L, M, N, Q, S, T et Y ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 11 (DSR-S
yardelA4N ¨ S512C);
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 12 (alpha-1,2 BrS) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 13 (AN123-GBD-CD2) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 14 (ASDg) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 15 (DSR-S-OK) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASR-C-del-bis) ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 18 (fructosyltransférase de Bacillus subtilis) ;
(iii) le synthon glycosylé est le 2-mercaptoéthanol (BME) et la glycane-saccharase est choisie dans le groupe comprenant :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP
WT) ;
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T et Y, de préférence C, D, E, N, et T, notamment E;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, E, G et N, de préférence E ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, F, G, K, L, M, N, Q, S, T et Y ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 11 (DSR-S
yardelA4N ¨ S512C);
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 12 (alpha-1,2 BrS) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 13 (AN123-GBD-CD2) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 14 (ASDg) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 15 (DSR-S-OK) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASR-C-del-bis) ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 18 (fructosyltransférase de Bacillus subtilis) ;
(iii) le synthon glycosylé est le 2-mercaptoéthanol (BME) et la glycane-saccharase est choisie dans le groupe comprenant :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP
WT) ;
49 PCT/EP2016/055843 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP
1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, E, F, H, L, M, N, Q, R, V, W et Y, de préférence L, V, W et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, I, L, M, P, Q, R, V, W et Y, de préférence C, M, P, Q, V, W et Y, en particulier C, M, P, V et Y, notamment Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, G, H, I, M, N, P, Q, R, S, T, V et W, de préférence C, D, E, F, M, N, P, Q, S, T, V et W, et notamment F, M, N, P, Q, S et T;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W et Y, de préférence A, C, D, E, G, I, M, P, Q, S, T, V et W, en particulier D, Q, S, T et W, et notamment S, T et W;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, N, Q, S, T, V et W, de préférence Q et V;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, W et Y, de préférence A, C, D, E, F, G, H, I, N, Q, R, S, T, W et Y, en particulier C, D, E, F, N, R, S, T, W et Y, et notamment E, T, et W;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, E et S, de préférence E ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, Q, S et T, de préférence S ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 12 (alpha-1,2 BrS) ;
1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, E, F, H, L, M, N, Q, R, V, W et Y, de préférence L, V, W et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, I, L, M, P, Q, R, V, W et Y, de préférence C, M, P, Q, V, W et Y, en particulier C, M, P, V et Y, notamment Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, G, H, I, M, N, P, Q, R, S, T, V et W, de préférence C, D, E, F, M, N, P, Q, S, T, V et W, et notamment F, M, N, P, Q, S et T;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W et Y, de préférence A, C, D, E, G, I, M, P, Q, S, T, V et W, en particulier D, Q, S, T et W, et notamment S, T et W;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, N, Q, S, T, V et W, de préférence Q et V;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, W et Y, de préférence A, C, D, E, F, G, H, I, N, Q, R, S, T, W et Y, en particulier C, D, E, F, N, R, S, T, W et Y, et notamment E, T, et W;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, E et S, de préférence E ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, Q, S et T, de préférence S ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 12 (alpha-1,2 BrS) ;
50 PCT/EP2016/055843 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 13 (AN123-GBD-CD2) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 14 (ASDg) ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS) ;
(iv) le synthon hydroxylé est le propèn-l-ol (alcool allylique) et la glycane-saccharase est choisie dans le groupe comprenant :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP
WT), - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 2 (ASNP
R226X1), ladite séquence ayant un acide aminé X1 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP
1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de D, E, F, G, H, P, Q, R, S, T, V, W et Y, de préférence H;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, D, E, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W et Y, de préférence D, E, G, H, I, K et M, en particulier D, E, G, I, K et M;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W et Y, de préférence C, D, E, F, G, H, I, K, L, M W et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W et Y, de préférence C, D, E, G, H, I, K, L, M et W, en particulier C et H;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y, de préférence C, D, E, F, G, H, K, L, M, S et Y, en particulier C;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 14 (ASDg) ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS) ;
(iv) le synthon hydroxylé est le propèn-l-ol (alcool allylique) et la glycane-saccharase est choisie dans le groupe comprenant :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP
WT), - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 2 (ASNP
R226X1), ladite séquence ayant un acide aminé X1 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP
1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de D, E, F, G, H, P, Q, R, S, T, V, W et Y, de préférence H;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, D, E, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W et Y, de préférence D, E, G, H, I, K et M, en particulier D, E, G, I, K et M;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W et Y, de préférence C, D, E, F, G, H, I, K, L, M W et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W et Y, de préférence C, D, E, G, H, I, K, L, M et W, en particulier C et H;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y, de préférence C, D, E, F, G, H, K, L, M, S et Y, en particulier C;
51 PCT/EP2016/055843 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W et Y, de préférence C, D, E, F, G, H, I, K, L, N et W;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W et Y, de préférence E, F, G, H, I, K et L, en particulier E;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 10 (ASNP
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, Q, S, T, V, W et Y, de préférence M ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 12 (alpha-1,2 BrS) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 13 (AN123-GBD-CD2) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 14 (ASDg) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS) ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 18 (fructosyltransférase de Bacillus subtilis) ;
(v) le synthon glycosylé est le VBA et la glycane-saccharase est choisie dans le groupe comprenant :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP
WT), - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 2 (ASNP
R226X1), ladite séquence ayant un acide aminé X1 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de H, K, M, N, Q, S, T, V et Y, en particulier H, K, M, N, Q, S, T et V, de préférence H, K, M, N, Q, T et V;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP
1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de V;
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W et Y, de préférence C, D, E, F, G, H, I, K, L, N et W;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W et Y, de préférence E, F, G, H, I, K et L, en particulier E;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 10 (ASNP
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, Q, S, T, V, W et Y, de préférence M ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 12 (alpha-1,2 BrS) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 13 (AN123-GBD-CD2) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 14 (ASDg) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS) ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 18 (fructosyltransférase de Bacillus subtilis) ;
(v) le synthon glycosylé est le VBA et la glycane-saccharase est choisie dans le groupe comprenant :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP
WT), - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 2 (ASNP
R226X1), ladite séquence ayant un acide aminé X1 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de H, K, M, N, Q, S, T, V et Y, en particulier H, K, M, N, Q, S, T et V, de préférence H, K, M, N, Q, T et V;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP
1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de V;
52 PCT/EP2016/055843 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de M, N, P, Q, S, T et V, de préférence M, N, P, Q, S et T, et notamment P, Q et S;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de V et W;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, D, G, S, T et Y, de préférence C, G, S, T et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant l'acide aminé A;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 12 (alpha-1,2 BrS) ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASR-C-del-bis) ;
(vi) le synthon glycosylé est le NNHEA et la glycane-saccharase est choisie dans le groupe comprenant :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP
WT), - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 2 (ASNP
R226X1), ladite séquence ayant un acide aminé X1 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, D, E, I, K, L, M, N, Q, S, T, V, W et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP
1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, E, F, H, L, M, N, P, Q, S, T, V, W et Y, de préférence V;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, I, L, M, N, Q, R, V, W et Y, de préférence M ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de V et W;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, D, G, S, T et Y, de préférence C, G, S, T et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant l'acide aminé A;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 12 (alpha-1,2 BrS) ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASR-C-del-bis) ;
(vi) le synthon glycosylé est le NNHEA et la glycane-saccharase est choisie dans le groupe comprenant :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP
WT), - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 2 (ASNP
R226X1), ladite séquence ayant un acide aminé X1 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, D, E, I, K, L, M, N, Q, S, T, V, W et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 3 (ASNP
1228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, E, F, H, L, M, N, P, Q, S, T, V, W et Y, de préférence V;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, I, L, M, N, Q, R, V, W et Y, de préférence M ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un
53 PCT/EP2016/055843 acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V et W, de préférence C, G, M, N, Q, S, T et V, en particulier Q;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W et Y, de préférence A, C, G, I, K, L, M, Q, S, T, V et W, en particulier C, L, V et W;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, K, M, Q, T, V et Y, de préférence V;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, R, S, T, W et Y, de préférence D, E, G, N, S, T et Y ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de E, G, R et S ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, F, G, K, L, M, N, Q, S, T et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 12 (alpha-1,2 BrS) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS) ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASR-C-del-bis) ; ou (vii) le synthon glycosylé est le HEAA et la glycane-saccharase est choisie dans le groupe comprenant :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant E;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W et Y, de préférence A, C, G, I, K, L, M, Q, S, T, V et W, en particulier C, L, V et W;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP 1330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, K, M, Q, T, V et Y, de préférence V;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V33 1X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, R, S, T, W et Y, de préférence D, E, G, N, S, T et Y ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de E, G, R et S ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, F, G, K, L, M, N, Q, S, T et Y;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 12 (alpha-1,2 BrS) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS) ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASR-C-del-bis) ; ou (vii) le synthon glycosylé est le HEAA et la glycane-saccharase est choisie dans le groupe comprenant :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant E;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 16 (alpha-1,3 BrS) ;
54 PCT/EP2016/055843 - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 17 (ASR-C-del-bis) ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO: 18 (fructosyltransférase de Bacillus subtilis).
c) Mise en oeuvre des monomères de l'invention Les monomères de l'invention sont polymérisables et/ou peuvent être couplés par réaction de couplage, et peuvent être mis en oeuvre dans un procédé de fabrication d'un glyco(co)polymère selon l'invention, comprenant la polymérisation et/ou une réaction de couplage d'au moins deux de ces monomères.
Un procédé chimio-enzymatique selon l'invention est avantageux au regard de nombreux aspects, tel notamment le temps de réaction très court permettant, en l'espace de quelques heures, notamment en l'espace de 24 heures, de passer des synthons hydroxylés au glyco(co)polymères d'intérêt.
En outre, la détermination par les inventeurs (i) de synthons de structures variables aptes à être glycosylé dans un procédé selon l'invention et (ii) d'enzymes de spécificités différentes, permet la production à façon de glyco(co)polymères d'une grande variabilité.
La polymérisation et la réaction de couplage selon l'invention permettent en outre d'accéder à des architectures moléculaires originales, telles que des (co)polymères en peigne ou à bloc, qui pourront être évalués pour le développement de nouveaux matériaux de balance hydrophile/hydrophobe modulable.
Un tel procédé peut notamment être mis en oeuvre dans les conditions énoncées à
l'exemple 6 ci-après.
Selon un mode de réalisation, un procédé de fabrication par polymérisation d'un glyco(co)polymère selon l'invention comprend dans l'ordre, les étapes suivantes :
a) la polymérisation de deux monomères de l'invention, permettant d'aboutir à
une chaîne de 2 monomères ;
b) la polymérisation de la chaîne de monomères obtenue à l'issue de l'étape précédente avec un monomère de l'invention ; puis
c) Mise en oeuvre des monomères de l'invention Les monomères de l'invention sont polymérisables et/ou peuvent être couplés par réaction de couplage, et peuvent être mis en oeuvre dans un procédé de fabrication d'un glyco(co)polymère selon l'invention, comprenant la polymérisation et/ou une réaction de couplage d'au moins deux de ces monomères.
Un procédé chimio-enzymatique selon l'invention est avantageux au regard de nombreux aspects, tel notamment le temps de réaction très court permettant, en l'espace de quelques heures, notamment en l'espace de 24 heures, de passer des synthons hydroxylés au glyco(co)polymères d'intérêt.
En outre, la détermination par les inventeurs (i) de synthons de structures variables aptes à être glycosylé dans un procédé selon l'invention et (ii) d'enzymes de spécificités différentes, permet la production à façon de glyco(co)polymères d'une grande variabilité.
La polymérisation et la réaction de couplage selon l'invention permettent en outre d'accéder à des architectures moléculaires originales, telles que des (co)polymères en peigne ou à bloc, qui pourront être évalués pour le développement de nouveaux matériaux de balance hydrophile/hydrophobe modulable.
Un tel procédé peut notamment être mis en oeuvre dans les conditions énoncées à
l'exemple 6 ci-après.
Selon un mode de réalisation, un procédé de fabrication par polymérisation d'un glyco(co)polymère selon l'invention comprend dans l'ordre, les étapes suivantes :
a) la polymérisation de deux monomères de l'invention, permettant d'aboutir à
une chaîne de 2 monomères ;
b) la polymérisation de la chaîne de monomères obtenue à l'issue de l'étape précédente avec un monomère de l'invention ; puis
55 PCT/EP2016/055843 c) une ou plusieurs étapes successives, et indépendantes, consistant à
polymériser la chaîne de monomères obtenue à l'issue de l'étape précédente avec un monomère de l'invention.
Selon un mode de réalisation, un tel procédé de polymérisation peut en outre comprendre, indépendamment :
- au moins une étape a') entre les étapes a) et b) ;
- au moins une étape b') entre les étapes b) et c) ; et/ou - au moins une étape c') après l'une quelconque des étapes c), dans lesquelles la chaîne de monomères obtenue à l'issue de l'étape précédente est polymérisée avec au moins un synthon non-glycosylé.
polymériser la chaîne de monomères obtenue à l'issue de l'étape précédente avec un monomère de l'invention.
Selon un mode de réalisation, un tel procédé de polymérisation peut en outre comprendre, indépendamment :
- au moins une étape a') entre les étapes a) et b) ;
- au moins une étape b') entre les étapes b) et c) ; et/ou - au moins une étape c') après l'une quelconque des étapes c), dans lesquelles la chaîne de monomères obtenue à l'issue de l'étape précédente est polymérisée avec au moins un synthon non-glycosylé.
56 PCT/EP2016/055843 EXEMPLES
Exemple 1: Production et mise en oeuvre de glucane-saccharases pour la glucosylation du 2-(hydroxy)ethyl methacrylate (HE1VIA) et du N-(hydroxy)methyl acrylamide (NHA1VI) Une librairie comprenant 8 enzymes sauvages (appartenant aux familles GH70 et 13 des glycoside-hydrolases) et 171 mutants simples (positions 226, 228, 229, 289, 290, 330, 331, 394 et 446) construits à partir de l'amylosaccharase de Neisseria polysaccharea (ASNp) (famille GH13) ont été testés pour leur aptitude à glucosyler l'HEMA, et le NHAM.
Les glucane-saccharases sélectionnées pour l'étude, ainsi que leur origine, sont indiquées dans le Tableau 1.
Le Tableau 1 illustre en effet un certain nombre des glucane-saccharases testées dans les exemples du présent texte et précise : colonne 1 : l'organisme dont l'enzyme est originaire ; colonne 2 : les différentes enzymes sauvages testées ainsi que les positions mutées du site actif de ces enzymes sauvages dans les glucane-saccharases mutées également testées ; colonne 3 : les références bibliographiques dans lesquelles ces enzymes, aussi bien sous formes sauvages que mutées, ont été décrites dans l'état de la technique.
Ces enzymes ont été utilisées sous forme recombinante et sont exprimées chez Escherichia coll.
/./. Production des enzymes en microplaques L'ensemble des souches d'Escherichia cou, surexprimant les glucane-saccharases hétérologues des familles GH13 et GH70, sauvages ou leurs mutants (Tableau 1), sont stockées au format microplaque 96 puits afin de faciliter les futures étapes de criblage de glucosylation des synthons hydroxylés.
A partir des microplaques sources, une pré-culture de ces souches d'E. cou i est menée pendant 22 h à 30 C, 700 rpm dans des microplaques 96 puits, dans 200 iaL de milieu de culture Luria-Bertani supplémenté avec 100 ng/mL d'ampicilline.
Ces précultures sont utilisées à leur tour pour ensemencer les microplaques deep-well dont chaque puits contient 1 mL par puits de milieu auto-inductible ZYM5052 contenant notamment 0,2 % (p/v) d' a-lactose, 0,05 % (p/v) de D-glucose, 0,5 %
Exemple 1: Production et mise en oeuvre de glucane-saccharases pour la glucosylation du 2-(hydroxy)ethyl methacrylate (HE1VIA) et du N-(hydroxy)methyl acrylamide (NHA1VI) Une librairie comprenant 8 enzymes sauvages (appartenant aux familles GH70 et 13 des glycoside-hydrolases) et 171 mutants simples (positions 226, 228, 229, 289, 290, 330, 331, 394 et 446) construits à partir de l'amylosaccharase de Neisseria polysaccharea (ASNp) (famille GH13) ont été testés pour leur aptitude à glucosyler l'HEMA, et le NHAM.
Les glucane-saccharases sélectionnées pour l'étude, ainsi que leur origine, sont indiquées dans le Tableau 1.
Le Tableau 1 illustre en effet un certain nombre des glucane-saccharases testées dans les exemples du présent texte et précise : colonne 1 : l'organisme dont l'enzyme est originaire ; colonne 2 : les différentes enzymes sauvages testées ainsi que les positions mutées du site actif de ces enzymes sauvages dans les glucane-saccharases mutées également testées ; colonne 3 : les références bibliographiques dans lesquelles ces enzymes, aussi bien sous formes sauvages que mutées, ont été décrites dans l'état de la technique.
Ces enzymes ont été utilisées sous forme recombinante et sont exprimées chez Escherichia coll.
/./. Production des enzymes en microplaques L'ensemble des souches d'Escherichia cou, surexprimant les glucane-saccharases hétérologues des familles GH13 et GH70, sauvages ou leurs mutants (Tableau 1), sont stockées au format microplaque 96 puits afin de faciliter les futures étapes de criblage de glucosylation des synthons hydroxylés.
A partir des microplaques sources, une pré-culture de ces souches d'E. cou i est menée pendant 22 h à 30 C, 700 rpm dans des microplaques 96 puits, dans 200 iaL de milieu de culture Luria-Bertani supplémenté avec 100 ng/mL d'ampicilline.
Ces précultures sont utilisées à leur tour pour ensemencer les microplaques deep-well dont chaque puits contient 1 mL par puits de milieu auto-inductible ZYM5052 contenant notamment 0,2 % (p/v) d' a-lactose, 0,05 % (p/v) de D-glucose, 0,5 %
57 PCT/EP2016/055843 (p/v) de glycérol et 0,05 % (p/v) de L-arabinose (Studier et al., Protein Expr Purif. 2005 May;41(1) :207-34 .).
Après 22 h de culture à 30 C et à 700 rpm, la suspension cellulaire est centrifugée pendant 20 min à 3 000 g à 4 C. Les culots cellulaires sont re-suspendus dans les microplaques deep-well 96 puits, avec 300 iaL de tampon phosphate salin (24 mM
phosphate de sodium/potassium et 274 mM NaC1) contenant 0,5 g/L de lysozyme et 5 mg/L de RNAse pancréatique bovine.
S'en suit une incubation de 30 min à 30 C sous agitation, ces microplaques sont ensuite stockées une nuit à -80 C. Après décongélation, les microplaques sont vigoureusement agitées puis centrifugées pendant 20 min à 3 000 g à 4 C.
Les surnageants centrifugés contenant les enzymes recombinantes sont transférés dans des microplaques 96 puits deep-well propres pour réaliser la mise en oeuvre des réactions d'accepteur.
1.2. Test d'activité enzymatique sur saccharose Avant de réaliser les réactions de criblage enzymatique de glucosylation, 50 iaL
des surnageants sont utilisés pour réaliser un test d'activité enzymatique sur saccharose.
L'activité enzymatique est évaluée au format microplaque en point final après 30 minutes d'incubation de 146 mM final de saccharose par dosage des sucres réducteurs par l'acide 3,5-dinitrosalicylique (DNS).
Après dilution au demi dans de l'eau, l'absorbance est lue à 540 nm.
1.3. Conditions de mise en oeuvre des tests d'activité enzymatique sur les accepteurs Pour le criblage de la banque de mutants de l'amylosaccharase de Neisseria polysaccharea, les réactions d'accepteur sont réalisées en microplaques deep-well dans un volume de 300 iaL, en présence de 73 mM de saccharose, de 73 mM d'accepteur (HEMA, NHAM, ou autre ...) en concentrations finales et de 150 iaL de lysat cellulaire centrifugé.
Les microplaques sont incubées à 30 C et à 700 rpm.
Après 24h de réaction, les enzymes sont dénaturées à 95 C pendant 10 minutes.
Ces microplaques sont stockées à -20 C en vue d'une analyse rapide de la glucosylation par HPLC/MS.
Après 22 h de culture à 30 C et à 700 rpm, la suspension cellulaire est centrifugée pendant 20 min à 3 000 g à 4 C. Les culots cellulaires sont re-suspendus dans les microplaques deep-well 96 puits, avec 300 iaL de tampon phosphate salin (24 mM
phosphate de sodium/potassium et 274 mM NaC1) contenant 0,5 g/L de lysozyme et 5 mg/L de RNAse pancréatique bovine.
S'en suit une incubation de 30 min à 30 C sous agitation, ces microplaques sont ensuite stockées une nuit à -80 C. Après décongélation, les microplaques sont vigoureusement agitées puis centrifugées pendant 20 min à 3 000 g à 4 C.
Les surnageants centrifugés contenant les enzymes recombinantes sont transférés dans des microplaques 96 puits deep-well propres pour réaliser la mise en oeuvre des réactions d'accepteur.
1.2. Test d'activité enzymatique sur saccharose Avant de réaliser les réactions de criblage enzymatique de glucosylation, 50 iaL
des surnageants sont utilisés pour réaliser un test d'activité enzymatique sur saccharose.
L'activité enzymatique est évaluée au format microplaque en point final après 30 minutes d'incubation de 146 mM final de saccharose par dosage des sucres réducteurs par l'acide 3,5-dinitrosalicylique (DNS).
Après dilution au demi dans de l'eau, l'absorbance est lue à 540 nm.
1.3. Conditions de mise en oeuvre des tests d'activité enzymatique sur les accepteurs Pour le criblage de la banque de mutants de l'amylosaccharase de Neisseria polysaccharea, les réactions d'accepteur sont réalisées en microplaques deep-well dans un volume de 300 iaL, en présence de 73 mM de saccharose, de 73 mM d'accepteur (HEMA, NHAM, ou autre ...) en concentrations finales et de 150 iaL de lysat cellulaire centrifugé.
Les microplaques sont incubées à 30 C et à 700 rpm.
Après 24h de réaction, les enzymes sont dénaturées à 95 C pendant 10 minutes.
Ces microplaques sont stockées à -20 C en vue d'une analyse rapide de la glucosylation par HPLC/MS.
58 PCT/EP2016/055843 Pour le criblage des enzymes sauvages, les réactions d'accepteur sont réalisées en tube dans un volume de 1 mL, en présence de 146 mM de saccharose, de 438 mM
d'accepteur (HEMA ou NHAM) en concentrations finales de 1 U/mL d'activité
enzymatique.
Les tubes sont incubés à 30 C et agité à 500 rpm.
Après 24h de réaction, les enzymes sont dénaturées à 95 C pendant 10 minutes, les milieux réactionnels sont centrifugés, filtrés, dilués et analysées par LC/MS.
1.4. Méthodes analytiques LC et LC/MS des produits de réaction d'accepteurs L'analyse des réactions d'accepteurs est réalisée en deux temps.
Une première analyse HPLC courte sur colonne hypercarb (6 minutes) est réalisée pour identifier la présence ou non de produits de glucosylation.
La deuxième analyse HPLC sur colonne Hypercarb ou Amino (30 minutes) permet une séparation et une identification de tous les constituants du mélange réactionnel.
Dans le cas d'une analyse LC-MS, le système HPLC Dionex est couplé à un spectromètre de masse, simple quadrupole MSQP1us, ThermoScientific.
Les conditions utilisées sont résumées dans le Tableau 2.
La quantité des produits de glycosylation (en g/L) a été estimée sur la base du coefficient de réponse de l'accepteur en détection UV.
Exemple 2: Détermination des efficacités de glucosylation du HEMA et du NHAM par les enzymes de l'Exemple 1 Les réactions en présence d'accepteur ont été mises en oeuvre en appliquant les conditions décrites dans l'exemple 1.
Dans un premier temps, ces réactions d'accepteurs ont été mises en oeuvre avec un panel de 7 Glycane-saccharases sauvages de spécificités distinctes, ces enzymes étant indiquées dans le Tableau 1, à savoir : ASDg, ASR, GBD-CD2, DSR-S-A4N, DSR-OK, a-1,2-BrS et a-1,3-BrS.
Après 24h de réaction, le milieu réactionnel est analysé par HPLC-MS sur colonne Hypercarb (30 min) pour identifier les produits de glucosylation.
d'accepteur (HEMA ou NHAM) en concentrations finales de 1 U/mL d'activité
enzymatique.
Les tubes sont incubés à 30 C et agité à 500 rpm.
Après 24h de réaction, les enzymes sont dénaturées à 95 C pendant 10 minutes, les milieux réactionnels sont centrifugés, filtrés, dilués et analysées par LC/MS.
1.4. Méthodes analytiques LC et LC/MS des produits de réaction d'accepteurs L'analyse des réactions d'accepteurs est réalisée en deux temps.
Une première analyse HPLC courte sur colonne hypercarb (6 minutes) est réalisée pour identifier la présence ou non de produits de glucosylation.
La deuxième analyse HPLC sur colonne Hypercarb ou Amino (30 minutes) permet une séparation et une identification de tous les constituants du mélange réactionnel.
Dans le cas d'une analyse LC-MS, le système HPLC Dionex est couplé à un spectromètre de masse, simple quadrupole MSQP1us, ThermoScientific.
Les conditions utilisées sont résumées dans le Tableau 2.
La quantité des produits de glycosylation (en g/L) a été estimée sur la base du coefficient de réponse de l'accepteur en détection UV.
Exemple 2: Détermination des efficacités de glucosylation du HEMA et du NHAM par les enzymes de l'Exemple 1 Les réactions en présence d'accepteur ont été mises en oeuvre en appliquant les conditions décrites dans l'exemple 1.
Dans un premier temps, ces réactions d'accepteurs ont été mises en oeuvre avec un panel de 7 Glycane-saccharases sauvages de spécificités distinctes, ces enzymes étant indiquées dans le Tableau 1, à savoir : ASDg, ASR, GBD-CD2, DSR-S-A4N, DSR-OK, a-1,2-BrS et a-1,3-BrS.
Après 24h de réaction, le milieu réactionnel est analysé par HPLC-MS sur colonne Hypercarb (30 min) pour identifier les produits de glucosylation.
59 PCT/EP2016/055843 Les Tableaux 3 et 4 présentent le taux de conversion du saccharose et les trois principaux produits de glucosylation obtenus en présence, respectivement, du HEMA et du NHAM en g/L, caractérisés par MS et correspondant respectivement à l'accepteur mono-glucosylé (Accepteur-G1c1), di-glucosylé (Accepteur-G1c2) et tri-glucosylé
(Accepteur-G1c3). Des produits en plus faibles quantités sont également détectés, correspondant à des formes tetra-, penta-, hexa- et heptaglucosylées.
Etant donnée la présence d'un seul groupe hydroxyle réactif sur la molécule, un seul type de mono-glycosylation de la molécule est attendu, et donc le même produit mono-glucosylé quelle que soit l'enzyme.
En revanche, la structure des produits di- et tri-glucosylés peut différer en fonction de la spécificité de l'enzyme et la structure des produits ne pourra être déterminée sans ambiguïté que par analyse RMN.
Résultats de glucosylation A l'exception de DSR-S-A4N et DSR-OK, qui ne reconnaissent pas le HEMA, toutes les glycane-saccharases sauvages testées glucosylent les accepteurs HEMA et NHAM
avec des efficacités variables et des tailles de produits de glucosylation variables.
Résultats de glucosylation du HEMA
Les réactions réalisées en présence des enzymes ASR et ASDg ont conduit à des taux de conversion du saccharose particulièrement élevés (95 %) accompagnés de production de produits d'accepteurs glucosylés variant de 2,7 à 21 g/L.
Parmi ces enzymes, l'ASR synthétise un taux significativement plus élevé de HEMA glucosylé (21 g/L). Avec l'ASR, les produits formés se répartissent dans des proportions équivalentes entre les formes mono-, di- et tri-glucosylées du HEMA.
Il est en outre observé que l'utilisation de l'enzyme GBD-CD2 ne conduit qu'à
des HEMA mono-glucosylés. Ainsi, l'utilisation de cette enzyme permet avantageusement de n'obtenir que des HEMA mono-glucosylés.
En ce sens, on observe que l'utilisation des enzymes a-1,2-BrS et a-1,3-BrS, démontrent un taux de conversion du saccharose également très élevé
(respectivement 93 %
et 84 %) conduit majoritairement à la production de HEMA mono-glucosylés.
(Accepteur-G1c3). Des produits en plus faibles quantités sont également détectés, correspondant à des formes tetra-, penta-, hexa- et heptaglucosylées.
Etant donnée la présence d'un seul groupe hydroxyle réactif sur la molécule, un seul type de mono-glycosylation de la molécule est attendu, et donc le même produit mono-glucosylé quelle que soit l'enzyme.
En revanche, la structure des produits di- et tri-glucosylés peut différer en fonction de la spécificité de l'enzyme et la structure des produits ne pourra être déterminée sans ambiguïté que par analyse RMN.
Résultats de glucosylation A l'exception de DSR-S-A4N et DSR-OK, qui ne reconnaissent pas le HEMA, toutes les glycane-saccharases sauvages testées glucosylent les accepteurs HEMA et NHAM
avec des efficacités variables et des tailles de produits de glucosylation variables.
Résultats de glucosylation du HEMA
Les réactions réalisées en présence des enzymes ASR et ASDg ont conduit à des taux de conversion du saccharose particulièrement élevés (95 %) accompagnés de production de produits d'accepteurs glucosylés variant de 2,7 à 21 g/L.
Parmi ces enzymes, l'ASR synthétise un taux significativement plus élevé de HEMA glucosylé (21 g/L). Avec l'ASR, les produits formés se répartissent dans des proportions équivalentes entre les formes mono-, di- et tri-glucosylées du HEMA.
Il est en outre observé que l'utilisation de l'enzyme GBD-CD2 ne conduit qu'à
des HEMA mono-glucosylés. Ainsi, l'utilisation de cette enzyme permet avantageusement de n'obtenir que des HEMA mono-glucosylés.
En ce sens, on observe que l'utilisation des enzymes a-1,2-BrS et a-1,3-BrS, démontrent un taux de conversion du saccharose également très élevé
(respectivement 93 %
et 84 %) conduit majoritairement à la production de HEMA mono-glucosylés.
60 PCT/EP2016/055843 Résultats de glucosylation du NHAM
Toutes les glycane-saccharases s'avèrent capables de reconnaitre le NHAM et de le glucosyler, mais dans des proportions 2,5 à 5 fois inférieures aux taux observés pour le HEMA.
Les enzymes GBD-CD2, a-1,2-BrS et a-1,3-BrS sont les plus productrices de NHAM glucosylé avec des taux de l'ordre de 2 g/L.
La forme mono-glucosylée du NHAM demeure le produit observé en plus large quantité.
Exemple 3: Détermination des efficacités de glucosylation du HEMA et du NHAM par l'amylosaccharase de N. polysaccharea (ASNp) et par ses mutants Le HEMA et le NHAM ont ensuite été testés en réaction d'accepteur à l'aide de l'amylosaccharase de Neisseria polysaccharea (ASNP) et de sa banque de mono-mutants identifiés dans le Tableau 1.
Les réactions de glucosylation mises en oeuvre en présence d'accepteur ont été
analysées dans un premier temps en utilisant une méthode HPLC courte (6 min) dans l'objectif d'identifier rapidement les enzymes efficaces en glucosylation de l'accepteur.
Les résultats obtenus pour le HEMA sont résumés dans le Tableau 5. Les valeurs données représentent les productions en g/L calculées à partir des aires relatives issues de la détection par DEDL des produits de glucosylation du HEMA par rapport à
l'enzyme sauvage (dont l'aire relative est de 1).
Les résultats obtenus pour le NHAM sont résumés dans le Tableau 6. La quantité des produits de glycosylation (en g/L) a été estimée sur la base du coefficient de réponse de l'accepteur en détection UV.
Résultats de glucosylation du HEMA
L'enzyme sauvage ASNp ainsi que 69 enzymes mono-mutées se sont avérés aptes à glucosyler le HEMA, comme représenté dans le Tableau 5.
Plus particulièrement, 25 mutants sont apparus glucosyler le HEMA plus efficacement que l'enzyme sauvage parentale, à savoir R226C, I228T, F229W, A289H, A289L, F290A, F290C, F290I, F290K, F290L, F290M, F290P, F290V, 1330A, V331C, V331D, V331E, V331G, V331H, D394A, R446C, R446G, R446K, R446L et R446N, et
Toutes les glycane-saccharases s'avèrent capables de reconnaitre le NHAM et de le glucosyler, mais dans des proportions 2,5 à 5 fois inférieures aux taux observés pour le HEMA.
Les enzymes GBD-CD2, a-1,2-BrS et a-1,3-BrS sont les plus productrices de NHAM glucosylé avec des taux de l'ordre de 2 g/L.
La forme mono-glucosylée du NHAM demeure le produit observé en plus large quantité.
Exemple 3: Détermination des efficacités de glucosylation du HEMA et du NHAM par l'amylosaccharase de N. polysaccharea (ASNp) et par ses mutants Le HEMA et le NHAM ont ensuite été testés en réaction d'accepteur à l'aide de l'amylosaccharase de Neisseria polysaccharea (ASNP) et de sa banque de mono-mutants identifiés dans le Tableau 1.
Les réactions de glucosylation mises en oeuvre en présence d'accepteur ont été
analysées dans un premier temps en utilisant une méthode HPLC courte (6 min) dans l'objectif d'identifier rapidement les enzymes efficaces en glucosylation de l'accepteur.
Les résultats obtenus pour le HEMA sont résumés dans le Tableau 5. Les valeurs données représentent les productions en g/L calculées à partir des aires relatives issues de la détection par DEDL des produits de glucosylation du HEMA par rapport à
l'enzyme sauvage (dont l'aire relative est de 1).
Les résultats obtenus pour le NHAM sont résumés dans le Tableau 6. La quantité des produits de glycosylation (en g/L) a été estimée sur la base du coefficient de réponse de l'accepteur en détection UV.
Résultats de glucosylation du HEMA
L'enzyme sauvage ASNp ainsi que 69 enzymes mono-mutées se sont avérés aptes à glucosyler le HEMA, comme représenté dans le Tableau 5.
Plus particulièrement, 25 mutants sont apparus glucosyler le HEMA plus efficacement que l'enzyme sauvage parentale, à savoir R226C, I228T, F229W, A289H, A289L, F290A, F290C, F290I, F290K, F290L, F290M, F290P, F290V, 1330A, V331C, V331D, V331E, V331G, V331H, D394A, R446C, R446G, R446K, R446L et R446N, et
61 PCT/EP2016/055843 notamment les mutants F290A, F290C, F290I, F290K, F290L, F290M, F290V, 1330A, V331E, D394A et R446N, en particulier F290A, F290C, F290I, F290L, F290V et 1330A.
Parmi ces mutants, ceux ciblant la position 290 se sont avérés être les plus performants en termes de glucosylation du HEMA.
Résultats de glucosylation du NHAM
L'enzyme sauvage ASNp ainsi que 103 enzymes mono-mutées se sont avérées aptes à glucosyler le NHAM, comme représenté dans le Tableau 6.
Plus particulièrement, 13 mutants sont apparus glucosyler le NHAM au moins aussi efficacement que l'enzyme sauvage parentale, à savoir F229M, A289N, A289P, A289Q, A289S, A289V, 1330N, V331C, V331D, V331E, V331N, V331T et D394E.
En particulier, 11 d'entre eux sont apparus glucosyler le NHAM plus efficacement que l'enzyme sauvage parentale, à savoir F229M, A289N, A289P, A289Q, 1330N, V331C, V331D, V331E, V331N, V331T et D394E, et notamment les mutants F229M, V331E et D394E.
Exemple 4 : Etude des produits de glucosylation du HEMA et du NHAM de l'exemple 3 A la suite du criblage, un certain nombre de mutants testés à l'Exemple 3 ont été
analysés plus finement par LC-MS (détection UV210 pour le HEMA, détection UV215 pour le NHAM), selon le protocole indiqué à l'exemple 1 afin d'analyser les produits de glucosylation obtenus.
Ainsi, le HEMA a été glucosylé par les enzymes décrites dans le Tableau 7, résultant du criblage présenté à l'exemple 3. Des composés HEMA mono-, di-et/ou tri-glucosylés ont ainsi été obtenus.
Dans d'autres essais similaires, des composés HEMA tetra-glucosylés, voire des composés HEMA glucosylés jusqu'à 10 fois, ont également été obtenus.
Le NHAM a quant à lui été glucosylé par les enzymes décrites dans le Tableau 8, résultant du criblage présenté à l'exemple 3. Des composés NHAM
mono-, di-et/ou tri-glucosylés ont ainsi été obtenus.
Parmi ces mutants, ceux ciblant la position 290 se sont avérés être les plus performants en termes de glucosylation du HEMA.
Résultats de glucosylation du NHAM
L'enzyme sauvage ASNp ainsi que 103 enzymes mono-mutées se sont avérées aptes à glucosyler le NHAM, comme représenté dans le Tableau 6.
Plus particulièrement, 13 mutants sont apparus glucosyler le NHAM au moins aussi efficacement que l'enzyme sauvage parentale, à savoir F229M, A289N, A289P, A289Q, A289S, A289V, 1330N, V331C, V331D, V331E, V331N, V331T et D394E.
En particulier, 11 d'entre eux sont apparus glucosyler le NHAM plus efficacement que l'enzyme sauvage parentale, à savoir F229M, A289N, A289P, A289Q, 1330N, V331C, V331D, V331E, V331N, V331T et D394E, et notamment les mutants F229M, V331E et D394E.
Exemple 4 : Etude des produits de glucosylation du HEMA et du NHAM de l'exemple 3 A la suite du criblage, un certain nombre de mutants testés à l'Exemple 3 ont été
analysés plus finement par LC-MS (détection UV210 pour le HEMA, détection UV215 pour le NHAM), selon le protocole indiqué à l'exemple 1 afin d'analyser les produits de glucosylation obtenus.
Ainsi, le HEMA a été glucosylé par les enzymes décrites dans le Tableau 7, résultant du criblage présenté à l'exemple 3. Des composés HEMA mono-, di-et/ou tri-glucosylés ont ainsi été obtenus.
Dans d'autres essais similaires, des composés HEMA tetra-glucosylés, voire des composés HEMA glucosylés jusqu'à 10 fois, ont également été obtenus.
Le NHAM a quant à lui été glucosylé par les enzymes décrites dans le Tableau 8, résultant du criblage présenté à l'exemple 3. Des composés NHAM
mono-, di-et/ou tri-glucosylés ont ainsi été obtenus.
62 PCT/EP2016/055843 Exemple 5 : Production à l'échelle du gramme de produits de glucosylation du HE1VIA et du NHA1VI à l'aide des enzymes sélectionnées 1. Production à l'échelle du gramme A partir des glycane-saccharases les plus efficaces identifiées, l'ASR et l'a-1,3-BrS, ainsi que les mono-mutants F290C et D394E de l'ASNp, des lots de HEMA-glucosylé et de NHAM-glucosylé ont été produits à l'échelle du gramme afin de réaliser les tests de polymérisation.
Les réactions sont réalisées dans un volume final de 500 mL, en présence de 143 mM de saccharose, de 438 mM d'accepteurs et d'l U/mL d'enzyme. Après consommation totale du saccharose, l'enzyme est désactivée à 95 C et le milieu réactionnel est concentré par lyophilisation pour une étape de purification ultérieure.
Les niveaux de production estimés sont donnés en Tableau 9.
2. Purification des produits de glucosylation La purification a pour objectif d'éliminer les sucres résiduels.
La purification est réalisée par flash chromatographie sur une colonne C18 Reveleris de 80 g à 120 g (Alltech, Epernon, France) utilisant un gradient eau/acétonitrile.
Exemple 6: Mise en oeuvre des réactions de polymérisation à partir des HEMA glucosylés Des mélanges de monomères glycosylés ont été polymérisés. Typiquement, la polymérisation radicalaire d'un mélange molaire HEMA-G1c/HEMA-(G1c)2/HEMA-(G1c)3 61/18/21 a été réalisée.
Les techniques de polymérisation radicalaire contrôlée de type ATRP (Atom Transfer Radical Polymerization) et RAFT (Reversible Addition Fragmentation Transfer) ont été privilégiées.
Une polymérisation typique par ATRP se déroule comme suit.
L'acide 4-(bromométhyl) benzoïque (amorceur de la polymérisation, 10,7 mg, 50 iamol., 1 éq.) est versée dans 10 mL d'eau (milliQ) et une solution de NaOH
aqueuse (0,5 mL, 0,1 M) est ajoutée. L'ensemble est agité jusqu'à dissolution complète.
La solution est ensuite dégazée par bullage d'argon et la bipyridine (ligand, 15,7 mg, 100 !mol., 2 éq.) et CuIBr (catalyseur, 7,1 mg, 50 !mol., 1 éq.) sont ajoutés dans
Les réactions sont réalisées dans un volume final de 500 mL, en présence de 143 mM de saccharose, de 438 mM d'accepteurs et d'l U/mL d'enzyme. Après consommation totale du saccharose, l'enzyme est désactivée à 95 C et le milieu réactionnel est concentré par lyophilisation pour une étape de purification ultérieure.
Les niveaux de production estimés sont donnés en Tableau 9.
2. Purification des produits de glucosylation La purification a pour objectif d'éliminer les sucres résiduels.
La purification est réalisée par flash chromatographie sur une colonne C18 Reveleris de 80 g à 120 g (Alltech, Epernon, France) utilisant un gradient eau/acétonitrile.
Exemple 6: Mise en oeuvre des réactions de polymérisation à partir des HEMA glucosylés Des mélanges de monomères glycosylés ont été polymérisés. Typiquement, la polymérisation radicalaire d'un mélange molaire HEMA-G1c/HEMA-(G1c)2/HEMA-(G1c)3 61/18/21 a été réalisée.
Les techniques de polymérisation radicalaire contrôlée de type ATRP (Atom Transfer Radical Polymerization) et RAFT (Reversible Addition Fragmentation Transfer) ont été privilégiées.
Une polymérisation typique par ATRP se déroule comme suit.
L'acide 4-(bromométhyl) benzoïque (amorceur de la polymérisation, 10,7 mg, 50 iamol., 1 éq.) est versée dans 10 mL d'eau (milliQ) et une solution de NaOH
aqueuse (0,5 mL, 0,1 M) est ajoutée. L'ensemble est agité jusqu'à dissolution complète.
La solution est ensuite dégazée par bullage d'argon et la bipyridine (ligand, 15,7 mg, 100 !mol., 2 éq.) et CuIBr (catalyseur, 7,1 mg, 50 !mol., 1 éq.) sont ajoutés dans
63 PCT/EP2016/055843 cet ordre. 20 mL d'une solution dégazée du mélange de monomères glucosylés-HEMA sont ajoutés (0.78 g, 2.0 mmol., 40 éq.).
La polymérisation se déroule alors pendant 8h à température ambiante.
La réaction est arrêtée par oxydation à l'air du Cul en CuII (la solution passe de marron à bleu). La solution est ensuite passée sur une colonne de silice pour se débarrasser du CuII. Le milieu réactionnel est alors lyophilisé pour récupérer le polymère sous la forme d'une poudre blanche.
Le rendement de polymérisation est généralement supérieur à 90 %.
Exemple 7: Mise en oeuvre de la méthode de glucosylation sur le 2-propènol (alcool allylique) et sur le 2-mercaptoéthanol (BME) Glucosylation de l'alcool allylique et du BME
Le procédé décrit dans les exemples précédents a été utilisé afin de glucosyler d'autres synthons hydroxylés convenant à l'invention en vue de réaliser des réactions de couplage.
Ainsi, le 2-propènol (alcool allylique) et le 2-mercaptoéthanol (BME), ont été
testés en suivant le même protocole décrit ci-avant à l'aide des glycane-saccharases sauvages et mutées précédemment mises en oeuvre avec le HEMA et le NHAM.
Résultats Les résultats relatifs à l'alcool allylique sont présentés dans les Tableaux 10 et 12. Les résultats relatifs au BME sont présentés dans les Tableaux 11 et 13.
Les résultats indiquent que 4 des enzymes sauvages testées sont capables de glucosyler les molécules acceptrices, à savoir l'ASDg, la GBD-CD2, l'a-1,2-BrS
et l'a-1,3-BrS.
A l'instar de ce qui a été observé pour le HEMA et le NHAM, nous observons que les a-1,2-BrS et a-1,3-BrS sont les enzymes les plus efficaces pour réaliser la glucosylation de ces deux accepteurs.
En outre, l'ASNp sauvage ainsi que la très grande majorité des mutants testés s'avèrent aptes à glucosyler le 2-propènol, comme illustré dans le Tableau 12.
Plus particulièrement, 60 mutants sont apparus glucosyler l'alcool allylique au moins aussi efficacement que l'enzyme sauvage parentale, à savoir I228H, F229D, F229E,
La polymérisation se déroule alors pendant 8h à température ambiante.
La réaction est arrêtée par oxydation à l'air du Cul en CuII (la solution passe de marron à bleu). La solution est ensuite passée sur une colonne de silice pour se débarrasser du CuII. Le milieu réactionnel est alors lyophilisé pour récupérer le polymère sous la forme d'une poudre blanche.
Le rendement de polymérisation est généralement supérieur à 90 %.
Exemple 7: Mise en oeuvre de la méthode de glucosylation sur le 2-propènol (alcool allylique) et sur le 2-mercaptoéthanol (BME) Glucosylation de l'alcool allylique et du BME
Le procédé décrit dans les exemples précédents a été utilisé afin de glucosyler d'autres synthons hydroxylés convenant à l'invention en vue de réaliser des réactions de couplage.
Ainsi, le 2-propènol (alcool allylique) et le 2-mercaptoéthanol (BME), ont été
testés en suivant le même protocole décrit ci-avant à l'aide des glycane-saccharases sauvages et mutées précédemment mises en oeuvre avec le HEMA et le NHAM.
Résultats Les résultats relatifs à l'alcool allylique sont présentés dans les Tableaux 10 et 12. Les résultats relatifs au BME sont présentés dans les Tableaux 11 et 13.
Les résultats indiquent que 4 des enzymes sauvages testées sont capables de glucosyler les molécules acceptrices, à savoir l'ASDg, la GBD-CD2, l'a-1,2-BrS
et l'a-1,3-BrS.
A l'instar de ce qui a été observé pour le HEMA et le NHAM, nous observons que les a-1,2-BrS et a-1,3-BrS sont les enzymes les plus efficaces pour réaliser la glucosylation de ces deux accepteurs.
En outre, l'ASNp sauvage ainsi que la très grande majorité des mutants testés s'avèrent aptes à glucosyler le 2-propènol, comme illustré dans le Tableau 12.
Plus particulièrement, 60 mutants sont apparus glucosyler l'alcool allylique au moins aussi efficacement que l'enzyme sauvage parentale, à savoir I228H, F229D, F229E,
64 PCT/EP2016/055843 F229G, F229H, F229I, F229K, F229M, A289C, A289D, A289E, A289F, A289G, A289H, A289I, A289K, A289L, A289M, A289W, A289Y, F290C, F290D, F290E, F290G, F290H, F2901, F290K, F290L, F290M, F290W, 1330C, 1330D, 1330E, 1330F, 1330G, 1330H, 1330K, 1330L, 1330M, 1330S, 1330Y, V331C, V331D, V331E, V331F, V331G, V331H, V331I, V331K, V331L, V331N, V331W, D394E, D394F, D394G, D394H, D394I, D394K, D394L
et R446M.
En particulier, à l'exception de F229H, tous ces mono-mutants sont apparus glucosyler l'alcool allylique plus efficacement que l'enzyme sauvage parentale, et notamment F290C, F290H, 1330C, D394E et R446M.
L'ASNp sauvage ainsi que 89 mono-mutants s'avèrent également apte à
glucosyler le BME, comme illustré dans le Tableau 13.
Plus particulièrement, 59 mutants sont apparus glucosyler le BME au moins aussi efficacement que l'enzyme sauvage parentale, à savoir :
I228L, I228V, I228W, I228Y, F229C, F229M, F229P, F229Q, F229V, F229Y, A289C, A289D, A289E, A289F, A289G, A289H, A289I, A289M, A289N, A289P, A289Q, A289R, A289S, A289T, A289V, A289W, F290A, F290C, F290D, F290E, F290G, F290I, F290K, F290M, F290P, F290Q, F290S, F290T, F290V, F290W, I330Q, 1330V, V331A, V331C, V331D, V331E, V331F, V331G, V331H, V331I, V331N, V331Q, V331R, V331S, V331T, V331W, V331Y, D394E et R446S.
En particulier, 57 d'entre eux sont apparus glucosyler le BME plus efficacement que l'enzyme sauvage parentale, à savoir :
I228L, I228V, I228W, I228Y, F229C, F229M, F229P, F229V, F229Y, A289C, A289D, A289E, A289F, A289G, A289H, A289I, A289M, A289N, A289P, A289Q, A289R, A289S, A289T, A289V, A289W, F290A, F290C, F290D, F290E, F290G, F290I, F290M, F290P, F290Q, F290S, F290T, F290V, F290W, I330Q, 1330V, V331A, V331C, V331D, V331E, V331F, V331G, V331H, V331I, V331N, V331Q, V331R, V331S, V331T, V331W, V331Y, D394E et R446S, et en particulier F229Y, A289C, A289D, A289E, A289F, A289M, A289N, A289P, A289Q, A289S, A289T, A289V, A289W, F290D, F290Q, F290S, F290T, F290W, V331C, V331D, V331E, V331F, V331N, V331R, V331S, V331T, V331W
et V331Y, et notamment A289F, A289M, A289N, A289P, A289Q, A289S, A289T, F290S, F290T, F290W, V331E, V331T et V331W.
et R446M.
En particulier, à l'exception de F229H, tous ces mono-mutants sont apparus glucosyler l'alcool allylique plus efficacement que l'enzyme sauvage parentale, et notamment F290C, F290H, 1330C, D394E et R446M.
L'ASNp sauvage ainsi que 89 mono-mutants s'avèrent également apte à
glucosyler le BME, comme illustré dans le Tableau 13.
Plus particulièrement, 59 mutants sont apparus glucosyler le BME au moins aussi efficacement que l'enzyme sauvage parentale, à savoir :
I228L, I228V, I228W, I228Y, F229C, F229M, F229P, F229Q, F229V, F229Y, A289C, A289D, A289E, A289F, A289G, A289H, A289I, A289M, A289N, A289P, A289Q, A289R, A289S, A289T, A289V, A289W, F290A, F290C, F290D, F290E, F290G, F290I, F290K, F290M, F290P, F290Q, F290S, F290T, F290V, F290W, I330Q, 1330V, V331A, V331C, V331D, V331E, V331F, V331G, V331H, V331I, V331N, V331Q, V331R, V331S, V331T, V331W, V331Y, D394E et R446S.
En particulier, 57 d'entre eux sont apparus glucosyler le BME plus efficacement que l'enzyme sauvage parentale, à savoir :
I228L, I228V, I228W, I228Y, F229C, F229M, F229P, F229V, F229Y, A289C, A289D, A289E, A289F, A289G, A289H, A289I, A289M, A289N, A289P, A289Q, A289R, A289S, A289T, A289V, A289W, F290A, F290C, F290D, F290E, F290G, F290I, F290M, F290P, F290Q, F290S, F290T, F290V, F290W, I330Q, 1330V, V331A, V331C, V331D, V331E, V331F, V331G, V331H, V331I, V331N, V331Q, V331R, V331S, V331T, V331W, V331Y, D394E et R446S, et en particulier F229Y, A289C, A289D, A289E, A289F, A289M, A289N, A289P, A289Q, A289S, A289T, A289V, A289W, F290D, F290Q, F290S, F290T, F290W, V331C, V331D, V331E, V331F, V331N, V331R, V331S, V331T, V331W
et V331Y, et notamment A289F, A289M, A289N, A289P, A289Q, A289S, A289T, F290S, F290T, F290W, V331E, V331T et V331W.
65 PCT/EP2016/055843 Exemple 8 : Détermination des efficacités de glucosylation du 4-vinyl benzylalcool (VBA) par l'amylosaccharase de N. polysaccharea (ASNp), par ses mutants et par certaines enzymes de l'exemple 1 Le VBA a été testé en réaction d'accepteur à l'aide de l'amylosaccharase de Neisseria polysaccharea (ASNp), de sa banque de mono-mutants identifiés dans le Tableau 1, comme décrit dans l'exemple 3, et également à l'aide de l'a-1,2-BrS
et de l'ASR.
Les résultats obtenus pour le VBA avec les enzymes a-1,2-BrS et ASR sont représentés dans le Tableau 14, tandis que les résultats obtenus pour le VBA
avec l'ASNP et ses mono-mutants sont résumés dans le Tableau 15.
Résultats de glucosylation du VBA
Tout d'abord, il est observé que les enzymes a-1,2-BrS et ASR peuvent glucosyler le VBA.
En outre, le VBA peut être glucosylé par l'ASNp sauvage, ainsi que par 26 de ses mono-mutants testés, à savoir : R226H, R226K, R226M, R226N, R226Q, R226S, R226T, R226V, R226Y, 1228V, A289M, A289N, A289P, A289Q, A289S, A289T, A289V, F290V, F290W, V331C, V331D, V331G, V331S, V331T, V331Y et R446A.
En particulier, tous ces mono-mutants à l'exception du R226S, sont apparus glucosyler le VBA plus efficacement que l'enzyme sauvage parentale, et notamment A289M, A289N, A289P, A289Q, A289S, A289T, V331C, V331G, V331S, V331T, V331Y
et R446A, en particulier A289P, A289Q, A289S et R446A.
Exemple 9 : Détermination des efficacités de glucosylation du N,N-bis(2-hydroxyethyfiacrylamide (NNHEA) par l'amylosaccharase de N. polysaccharea (ASNp), par ses mutants et par certaines enzymes de l'exemple 1 Le NNHEA a été testé en réaction d'accepteur à l'aide de l'amylosaccharase de Neisseria polysaccharea (ASNp), de sa banque de mono-mutants identifiés dans le Tableau 1, comme décrit dans l'exemple 3, et également à l'aide de l'a-1,2-BrS, l'a-1,3-BrS
et de l'ASR.
et de l'ASR.
Les résultats obtenus pour le VBA avec les enzymes a-1,2-BrS et ASR sont représentés dans le Tableau 14, tandis que les résultats obtenus pour le VBA
avec l'ASNP et ses mono-mutants sont résumés dans le Tableau 15.
Résultats de glucosylation du VBA
Tout d'abord, il est observé que les enzymes a-1,2-BrS et ASR peuvent glucosyler le VBA.
En outre, le VBA peut être glucosylé par l'ASNp sauvage, ainsi que par 26 de ses mono-mutants testés, à savoir : R226H, R226K, R226M, R226N, R226Q, R226S, R226T, R226V, R226Y, 1228V, A289M, A289N, A289P, A289Q, A289S, A289T, A289V, F290V, F290W, V331C, V331D, V331G, V331S, V331T, V331Y et R446A.
En particulier, tous ces mono-mutants à l'exception du R226S, sont apparus glucosyler le VBA plus efficacement que l'enzyme sauvage parentale, et notamment A289M, A289N, A289P, A289Q, A289S, A289T, V331C, V331G, V331S, V331T, V331Y
et R446A, en particulier A289P, A289Q, A289S et R446A.
Exemple 9 : Détermination des efficacités de glucosylation du N,N-bis(2-hydroxyethyfiacrylamide (NNHEA) par l'amylosaccharase de N. polysaccharea (ASNp), par ses mutants et par certaines enzymes de l'exemple 1 Le NNHEA a été testé en réaction d'accepteur à l'aide de l'amylosaccharase de Neisseria polysaccharea (ASNp), de sa banque de mono-mutants identifiés dans le Tableau 1, comme décrit dans l'exemple 3, et également à l'aide de l'a-1,2-BrS, l'a-1,3-BrS
et de l'ASR.
66 PCT/EP2016/055843 Les résultats obtenus pour le NNHEA avec les enzymes a-1,2-BrS, a-1,3-BrS et ASR sont représentés dans le Tableau 16, tandis que les résultats obtenus pour le NNHEA
avec l'ASNp et ses mono-mutants sont résumés dans le Tableau 17.
Résultats de glucosylation du NNHEA
Tout d'abord, il est observé que les enzymes a-1,2-BrS, a-1,3-BrS et ASR
peuvent glucosyler le NNHEA et conduisent uniquement à la production de NNHEA
mono-glucosylés. Des traces de NNHEA di-glucosylé ont également été détectées.
Par traces d'un composé, on entend au sens de l'invention que ce composé est présent dans un échantillon dans une quantité suffisante pour être détectée par une méthode de mesure telle que celle mise en oeuvre dans les présents exemples, mais en une quantité
trop faible pour pouvoir être mesurée.
De même, la valeur de 0 indiquée dans les tableaux du présent document signifie que le composé concerné est soit absent, soit présent en une quantité
tellement faible qu'elle n'est pas détectable par une méthode de mesure telle que celle mise en oeuvre dans les présents exemples.
En outre, le NNHEA peut être glucosylé par l'ASNp sauvage, ainsi que par 113 de ses mono-mutants testés, comme illustré dans le Tableau 17.
En particulier, 30 d'entre eux sont apparus glucosyler le NNHEA plus efficacement que l'enzyme sauvage parentale, à savoir :
I228V, F229M, A289C, A289G, A289M, A289N, A289Q, A289S, A289T, A289V, F290A, F290C, F290G, F290I, F290K, F290L, F290M, F290Q, F290S, F290T, F290V, F290W, 1330V, V331D, V331E, V331G, V331N, V331S, V331T et V331Y.
Exemple 10: Glycosylation d'accepteurs catalysée par une fructosyltransférase Afin de varier la nature du sucre transféré sur les accepteurs, le potentiel d'une fructosyltransferase commercial a été évalué sur le HEMA, le NHAM et le HEAA
(N-(hydro)ethyl acrylamide), dans des conditions similaires à celles mises en oeuvre précédemment avec les glucane-saccharases.
Ces accepteurs ont ainsi été fructosylés par la fructosyltransférase de Bacillus subtilis (voir Tableau 1).
avec l'ASNp et ses mono-mutants sont résumés dans le Tableau 17.
Résultats de glucosylation du NNHEA
Tout d'abord, il est observé que les enzymes a-1,2-BrS, a-1,3-BrS et ASR
peuvent glucosyler le NNHEA et conduisent uniquement à la production de NNHEA
mono-glucosylés. Des traces de NNHEA di-glucosylé ont également été détectées.
Par traces d'un composé, on entend au sens de l'invention que ce composé est présent dans un échantillon dans une quantité suffisante pour être détectée par une méthode de mesure telle que celle mise en oeuvre dans les présents exemples, mais en une quantité
trop faible pour pouvoir être mesurée.
De même, la valeur de 0 indiquée dans les tableaux du présent document signifie que le composé concerné est soit absent, soit présent en une quantité
tellement faible qu'elle n'est pas détectable par une méthode de mesure telle que celle mise en oeuvre dans les présents exemples.
En outre, le NNHEA peut être glucosylé par l'ASNp sauvage, ainsi que par 113 de ses mono-mutants testés, comme illustré dans le Tableau 17.
En particulier, 30 d'entre eux sont apparus glucosyler le NNHEA plus efficacement que l'enzyme sauvage parentale, à savoir :
I228V, F229M, A289C, A289G, A289M, A289N, A289Q, A289S, A289T, A289V, F290A, F290C, F290G, F290I, F290K, F290L, F290M, F290Q, F290S, F290T, F290V, F290W, 1330V, V331D, V331E, V331G, V331N, V331S, V331T et V331Y.
Exemple 10: Glycosylation d'accepteurs catalysée par une fructosyltransférase Afin de varier la nature du sucre transféré sur les accepteurs, le potentiel d'une fructosyltransferase commercial a été évalué sur le HEMA, le NHAM et le HEAA
(N-(hydro)ethyl acrylamide), dans des conditions similaires à celles mises en oeuvre précédemment avec les glucane-saccharases.
Ces accepteurs ont ainsi été fructosylés par la fructosyltransférase de Bacillus subtilis (voir Tableau 1).
67 PCT/EP2016/055843 Résultats Les chromatogrammes obtenus sur colonne Hypercarb et amino, comme décrit précédemment, après réaction de fructosylation à partir de la fructosyltransférase de B. subtilis, ont permis d'observer une fructosylation de l'ensemble des accepteurs testés.
Plus particulièrement, la fructosylation totale observée pour le HEMA est de 32,5 mg/L, pour le HEAA de 84,8 mg/L et pour le NHAM de 21,1 mg/L.
Plus particulièrement, tandis que seuls des HEMA et NHAM mono-fructosylés ont été obtenus, le HEAA a été fructosylés, 1, 4, 5, 6 et même 7 fois. Dans la mesure où ces accepteurs ne possèdent qu'un seul groupe hydroxyle réactif, un seul type de chaque niveau de fructosylation de ces molécules est obtenu.
En outre, la consommation de saccharose de la fructosyltransférase mise en oeuvre et les taux de production (en g/L) des accepteurs testés fructosylés ont été mesurés.
On observe que dans tous les cas, plus de 98 % du saccharose a été consommé
par l'enzyme. En outre, on observe une production de HEAA fructosylés 3 à 4 fois supérieure à celle observée avec le NHAM et le HEMA.
Exemple 11: Etude des produits de glucosylation du NNHEA de l'exemple 9 Les produits de glucosylation obtenus à l'exemple 9 avec certaines des enzymes testées ont été analysés plus finement par LC-MS (détection UV204 pour le NNHEA), selon le protocole indiqué à l'exemple 1.
Les résultats ainsi obtenus sont représentés dans le Tableau 18.
Ainsi, le NNHEA a très majoritairement été uniquement mono-glucosylé par les enzymes testées, en particulier par l'ASNp sauvage et ses mutants A289Q, F290C, F290L, et F290V. Des traces de NNHEA di-glucosylé ont également été détectées avec les mono-mutants F290C, F290L et F290V.
Le mutant F290W a quant à lui permis d'obtenir à la fois des NNHEA
mono-glucosylés et des NNHEA di-glucosylés.
Plus particulièrement, la fructosylation totale observée pour le HEMA est de 32,5 mg/L, pour le HEAA de 84,8 mg/L et pour le NHAM de 21,1 mg/L.
Plus particulièrement, tandis que seuls des HEMA et NHAM mono-fructosylés ont été obtenus, le HEAA a été fructosylés, 1, 4, 5, 6 et même 7 fois. Dans la mesure où ces accepteurs ne possèdent qu'un seul groupe hydroxyle réactif, un seul type de chaque niveau de fructosylation de ces molécules est obtenu.
En outre, la consommation de saccharose de la fructosyltransférase mise en oeuvre et les taux de production (en g/L) des accepteurs testés fructosylés ont été mesurés.
On observe que dans tous les cas, plus de 98 % du saccharose a été consommé
par l'enzyme. En outre, on observe une production de HEAA fructosylés 3 à 4 fois supérieure à celle observée avec le NHAM et le HEMA.
Exemple 11: Etude des produits de glucosylation du NNHEA de l'exemple 9 Les produits de glucosylation obtenus à l'exemple 9 avec certaines des enzymes testées ont été analysés plus finement par LC-MS (détection UV204 pour le NNHEA), selon le protocole indiqué à l'exemple 1.
Les résultats ainsi obtenus sont représentés dans le Tableau 18.
Ainsi, le NNHEA a très majoritairement été uniquement mono-glucosylé par les enzymes testées, en particulier par l'ASNp sauvage et ses mutants A289Q, F290C, F290L, et F290V. Des traces de NNHEA di-glucosylé ont également été détectées avec les mono-mutants F290C, F290L et F290V.
Le mutant F290W a quant à lui permis d'obtenir à la fois des NNHEA
mono-glucosylés et des NNHEA di-glucosylés.
68 PCT/EP2016/055843 Exemple 12: Détermination des efficacités de glucosylation du HEAA par certaines enzymes de l'Exemple 1 Les réactions en présence de HEAA ont été mises en oeuvre en appliquant les conditions décrites dans l'exemple 1.
Ces réactions d'accepteurs ont été mises en oeuvre avec un panel de 3 Glycane-saccharases sauvages, à savoir : ASR, a-1,3-BrS et la fructosyltransférase de Bacillus subtilis indiquée dans le Tableau I.
L'un des mono-mutants de l'ASNp sauvage, le mono-mutant D394E, a également été testé.
Après 24h de réaction, le milieu réactionnel est analysé par HPLC-MS sur colonne Hypercarb (30 min) pour identifier les produits de glucosylation.
Le Tableau 19 présente le taux de conversion du saccharose et la glucosylation totale de chacune de ces enzymes.
En outre, les produits de glucosylation obtenus avec l'ASR, l'a-1,3-BrS et le mono-mutant D394E de l'ASNp ont été analysés plus finement par LC-MS
(détection UV215 pour le HEAA), selon le protocole indiqué dans les exemples précédents. Les résultats obtenus sont indiqués dans le Tableau 20.
Ainsi, l'ASR permet d'obtenir des HEAA mono-glycosylés, des HEAA
di-glucosylés et des HEAA tri-glucosylés.
Dans d'autres expériences similaires réalisées par les inventeurs, des HEAA
glucosylés 4, 5, 6, 7 ou 8 fois ont également pu être observés.
A l'inverse, l'a-1,3-BrS et le mono-mutant D394E de l'ASNp sauvage ne permettent d'obtenir que des HEAA mono-glucosylés. Seules des traces de HEAA
di-glucosylés sont observées avec ces deux enzymes.
Ces réactions d'accepteurs ont été mises en oeuvre avec un panel de 3 Glycane-saccharases sauvages, à savoir : ASR, a-1,3-BrS et la fructosyltransférase de Bacillus subtilis indiquée dans le Tableau I.
L'un des mono-mutants de l'ASNp sauvage, le mono-mutant D394E, a également été testé.
Après 24h de réaction, le milieu réactionnel est analysé par HPLC-MS sur colonne Hypercarb (30 min) pour identifier les produits de glucosylation.
Le Tableau 19 présente le taux de conversion du saccharose et la glucosylation totale de chacune de ces enzymes.
En outre, les produits de glucosylation obtenus avec l'ASR, l'a-1,3-BrS et le mono-mutant D394E de l'ASNp ont été analysés plus finement par LC-MS
(détection UV215 pour le HEAA), selon le protocole indiqué dans les exemples précédents. Les résultats obtenus sont indiqués dans le Tableau 20.
Ainsi, l'ASR permet d'obtenir des HEAA mono-glycosylés, des HEAA
di-glucosylés et des HEAA tri-glucosylés.
Dans d'autres expériences similaires réalisées par les inventeurs, des HEAA
glucosylés 4, 5, 6, 7 ou 8 fois ont également pu être observés.
A l'inverse, l'a-1,3-BrS et le mono-mutant D394E de l'ASNp sauvage ne permettent d'obtenir que des HEAA mono-glucosylés. Seules des traces de HEAA
di-glucosylés sont observées avec ces deux enzymes.
69 Organisme Glycane-saccharase Références Potocki de Montalk et al., J.
of Bacteriology. 1999, 181, ASNp WT et 171 mutants Champion E., 2008. Thèse de Neisseria polysaccharea simples du site actif doctorat, INSA, Toulouse (Positions 226, 228, 229, 289, (EC 2.4.1.4) 290, 330, 331, 394, 446) Champion C. et al., J. Am.
Glucane-saccharases Chem.
Soc., 2009, 131, 7379-Cambon E. et al., Biotechnol Bioeng. 2014 Sep;111(9):1719-28 ASDg WT Emond et al., FEMS Microbiol Deinococcus geothermalis Glucane-saccharase Lett.
2008 Aug;285(1):25-32 Alternane-saccharase Joucla.
G., 2003. Thèse de Leuconostoc mesesnteroides tronquée (ASR-C-del-bis ou doctorat, INSA, Toulouse NRRL B-1355 ASR) Joucla et al., FEBS Lett. 2006 Glucane-saccharase Feb 6;580(3):763-8 o, M ulis C., 2006. Thèse de Dextrane-saccharase tronquée doctorat, INSA, Toulouse Leuconostoc mesesnteroides DSR-S vardel 44N (DSR-S-Moulis C. et al., FEMS
B-512F 44N) Micro biol. Lett., 2006 Glucane-saccharase Dextrane-sucrase tronquée Leuconostoc mesesnteroides Brison et al., J. Biol. Chem., DSR-E (GBD-CD2) NRRL B-1299 2012, 287, 7915-24 Glucane-saccharase Dextrane-saccharase Oenococcus kitaharae (DSR-S-OK) FR1301402 Glucane-saccharase Leuconostoc citreum a-1,3 BrS
NRRL B-742 Glucane-saccharase Leuconostoc citreum a-1,2 BrS FR1301402 NRRL B-1299 Glucane-saccharase Cheetham et al. Enzyme Microb. Technol. 1989, 11, Bacillus subtilis 212-219;
Fructosyltransferase NCIMB11871 Baciu et al. Journal of Biotechnology, Volume 116, Issue 4, 6 April 2005, Pages Tableau 1
of Bacteriology. 1999, 181, ASNp WT et 171 mutants Champion E., 2008. Thèse de Neisseria polysaccharea simples du site actif doctorat, INSA, Toulouse (Positions 226, 228, 229, 289, (EC 2.4.1.4) 290, 330, 331, 394, 446) Champion C. et al., J. Am.
Glucane-saccharases Chem.
Soc., 2009, 131, 7379-Cambon E. et al., Biotechnol Bioeng. 2014 Sep;111(9):1719-28 ASDg WT Emond et al., FEMS Microbiol Deinococcus geothermalis Glucane-saccharase Lett.
2008 Aug;285(1):25-32 Alternane-saccharase Joucla.
G., 2003. Thèse de Leuconostoc mesesnteroides tronquée (ASR-C-del-bis ou doctorat, INSA, Toulouse NRRL B-1355 ASR) Joucla et al., FEBS Lett. 2006 Glucane-saccharase Feb 6;580(3):763-8 o, M ulis C., 2006. Thèse de Dextrane-saccharase tronquée doctorat, INSA, Toulouse Leuconostoc mesesnteroides DSR-S vardel 44N (DSR-S-Moulis C. et al., FEMS
B-512F 44N) Micro biol. Lett., 2006 Glucane-saccharase Dextrane-sucrase tronquée Leuconostoc mesesnteroides Brison et al., J. Biol. Chem., DSR-E (GBD-CD2) NRRL B-1299 2012, 287, 7915-24 Glucane-saccharase Dextrane-saccharase Oenococcus kitaharae (DSR-S-OK) FR1301402 Glucane-saccharase Leuconostoc citreum a-1,3 BrS
NRRL B-742 Glucane-saccharase Leuconostoc citreum a-1,2 BrS FR1301402 NRRL B-1299 Glucane-saccharase Cheetham et al. Enzyme Microb. Technol. 1989, 11, Bacillus subtilis 212-219;
Fructosyltransferase NCIMB11871 Baciu et al. Journal of Biotechnology, Volume 116, Issue 4, 6 April 2005, Pages Tableau 1
70 HPLC Dionex U3000 Hypercarb (Thermo scientific) Hypercarb (6 min.) (30 min.) Amino (30 min) C18 Hypercarb 51,tm Hypercarb 51,tm Sperisorb Amino, 5i,tm C18 SB ZORBAX, Colonne (100x2,1mm) - (100x2.1mm) -Eluent Thermo Thermo (250x4.0mm) -51,tm Débit / ACN 10 % / H20 90 Gradient H20-Bischoff (250x4.6mm) -Température ACN
ACN 80 % / H20 20 % Agilent %
0,5 mi/min; 8 C 0,5 mi/min; 8 C ml/min; 30 C
Gradient H20-ACN
1 ml/min; 30 C
DEDL
(Détecteur Détection LC Evaporatif à
Diffusion de UV210/215 nm DEDL UV204nm DEDL
Lumière) Détection LC-MS -Ionisation Electrospray positif (ESI+) ; source à
450 C. Tension capillaire : 3kV ; Tension cône : 50 V
Tableau 2
ACN 80 % / H20 20 % Agilent %
0,5 mi/min; 8 C 0,5 mi/min; 8 C ml/min; 30 C
Gradient H20-ACN
1 ml/min; 30 C
DEDL
(Détecteur Détection LC Evaporatif à
Diffusion de UV210/215 nm DEDL UV204nm DEDL
Lumière) Détection LC-MS -Ionisation Electrospray positif (ESI+) ; source à
450 C. Tension capillaire : 3kV ; Tension cône : 50 V
Tableau 2
71 PCT/EP2016/055843 Ratio : saccharose 143 mM / HEMA
Glucosylation du HEMA (g/L) 438 mM
Conversion du Glucosylation Enzymes HEMA-Glcl HEMA-G1c2 HEMA-G1c3 saccharose (%) totale ASDg 95,0 2,709 1,306 1,403 0 ASR 95,0 21,030 6,745 7,046 7,240 GBD-CD2 23,7 2,168 2,168 0 0 DSR-S-A4N 39,0 0 0 0 0 DSR-OK 29,0 0 0 0 0 oc-1,2-BrS 93,2 10,635 10,421 0,215 0 oc-1,3-BrS 84,4 13,486 12,628 0,858 0 Tableau 3
Glucosylation du HEMA (g/L) 438 mM
Conversion du Glucosylation Enzymes HEMA-Glcl HEMA-G1c2 HEMA-G1c3 saccharose (%) totale ASDg 95,0 2,709 1,306 1,403 0 ASR 95,0 21,030 6,745 7,046 7,240 GBD-CD2 23,7 2,168 2,168 0 0 DSR-S-A4N 39,0 0 0 0 0 DSR-OK 29,0 0 0 0 0 oc-1,2-BrS 93,2 10,635 10,421 0,215 0 oc-1,3-BrS 84,4 13,486 12,628 0,858 0 Tableau 3
72 Ratio : saccharose 143 mM / NHAM
Glucosylation du NHA1VI (g/L) 438 mM
Conversion du Glucosylation Enzymes NHAM-Glcl NHAM-G1c2 NHAM-G1c3 saccharose (%) totale ASDg 12 0,136 0,136 0 0 ASR >95 0,340 0,135 0,205 0 GBD-CD2 42 2,201 1,517 0,684 0 DSR-S-A4N 60 0,062 0,062 0 0 DSR-OK >95 0,149 0,149 0 0 oc-1,2-BrS >95 1,886 1,781 0,054 0,050 oc-1,3-BrS >95 2,078 1,918 0,160 0 Tableau 4 CD
1,..) --, Cl --, =P
Cl ---.1 Cl =P
e.:,..,,,.::,.'...,..)4É: , c C79 g _ Mutants positifs -..:.:-....
,.: ,1,_-'._ c:=c:.-, HEMA A C D E F G H I K L 1,1 N p Q R S T V IN Y
r R226 0,076 0,101 0 G G a 0 G 0 G 0 0,008 0,00e G :::::::::: 0,009 ...
G P
::::::::::::::::::, , .
r., 0,041 0 0 0 0,099 0,014 0 0 ....]
' ,--µ
r., 0 0 0 0 0,121 0 A289 ::::::::::::::::: 0 0 0 0 0 0,127 0,039 0,045 0,139 0,007 0 0 0 0 0 0 0 0,015 C ....]
E
.
, in F290 4,532 8,966 0 0 :::::::::::::::: 0 0,013 3,134 0,795 2,152 0,793 0,014 0,139 0,075 G 0 0 5,938 0,004 C 0 o .._ -,_ 1330 0,287 0,022 0 0,014 0,042 0,040 0,011 ::::::::::::: 0,0G8 0,008 0,033 0,052 0 0 G
Lel o V331 0,010 0,103 0.234 0,444 0,026 0,098 0,108 0 0,046 0,023 0,023 0 0 G
D394 0,236 0,049 :::::::::::::: 0,012 0 0,065 0,019 0,024 0 0,030 0,030 0,038 R446 0,019 0,157 0,007 0,019 0,021 0,136 0,013 0,029 0,089 0.118 0,039 0.257 0 G :::::::::::::::::: G 0 G 0 0 md n .3 m Tableau 5 so I.) o ,-, o u, u, =P
r.d.) ne o i-i o i-i .w o -a o .w -$,'',41-c =:µ,/"T = 0,026 g/L Mutants positifs production eshinée en git NHAM ACD E F GH 1K LMNPOR S 1* VW r - -,µ 1 - - P
R226 0,003 0,003 0.003 0,004 0,004 0,003 0,004 0,003 0,003 0,003 0,001 0.004 0 0,003 .:.
=:;: 0,002 0,003 0,002 0,003 C, [
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0 0,019 0020 0.014 0,003 0,009 0,001 0 0,001 0,016 0 c .
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F229 Lou 0,010 o o ._....:.: 0 o 0,004 0 0,007 0,130 0,051 0,002 0,003 0 _ 0,012 0,003 0,011 L
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A289 ":::::.* ' ' 1021 0.005 0,004 0.0C2 0,019 0,022 0008 C 0,002 0,019 0,126 0,032 0,037 0 0,026 c -7c 0,026 0 ?
F290 0,002 0,003 0 0 0,002 0 0 0 0,002 0,006 0,009 0,002 0,003 0 0 _ 0,007 0,015 0019 0 c .
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CL V331 0,024 0,031 c 0271, -,,' 0 c,-" :7,1 0,025 0,008 0 002 0 0014 0,005 0,028 0,001 0.025 0,001 0 t` i q n - '1 o cola 1)394 0 0,001 _ i _ = , 0,009 0 0 0 0 0 0,004 0 0 0 0 C 2 0 0 te R446 0.004 0,013 0 0 0,0C 1 0,012 0 0 0,007 0,001 0,002 0.013 0 0,006 ---=:::=::.---:::::. 0,012 0.007 0 0 0,001 ,.
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o Tableau 6 .
0, --e ee.
ee.
ce 4.
c..) Ratio : saccharose 73 mM / HEMA 73 mM Glucosylation du HEMA (g/L) Conversion du Glucosylation Enzymes HEMA-Glcl HEMA-G1c2 HEMA-G1c3 saccharose (%) totale ASNp sauvage 87 0,141 0,079 0,062 Traces F229W 92,5 0,121 0,069 0,052 0 F290A 73,5 4,532 1,961 0,486 2,084 F290C 83 8,966 6,064 1,734 1,167 F2901 69 3,134 2,377 0,420 0,337 F290K 57 0,795 0,616 0,179 Traces F290L 92 2,197 1,531 0,621 0,045 F290M 92 0,793 0,544 0,249 Traces F290V 40 5,938 4,535 0,704 0,699 1330A 4 0,287 0,188 0,099 0 V331E 88 0,444 0,299 0,145 0 D394A 23 0,236 0,149 0,087 0 R446G 14,5 0,191 0,094 0,041 0,055 Tableau 7 Ratio : saccharose 73 mM / NHAM 73 Glucosylation du NHAM (g/L) mM
Conversion du Glucosylation Enzymes NHAM-Glcl NHAM-G1c2 NHAM-G1c3 saccharose (%) totale ASNp sauvage 76,5 0,101 0,025 0,076 0 F229M 73,7 0,169 0,130 0,033 0,007 F229N 2,5 0,100 0,051 0,049 0 A289N 90,8 0,211 0,126 0,084 0 A289P 81,0 0,127 0,032 0,096 0 A289Q 52,1 0,083 0,037 0,045 0 1330N 0,6 0,096 0,033 0,063 0 V331C 75,0 0,065 0,031 0,029 0,004 V331D 17,7 0,077 0,039 0,032 0,007 V331E 64,2 0,145 0,097 0,038 0,010 V331T 86,9 0,100 0,031 0,069 0 D394E 86,6 0,187 0,137 0,050 0 Tableau 8 Production Accepteur Enzyme Volume Lyophilisé g/L
estimée (g) F290C 500 oui 38,8 19,4 HEMA ASR 500 oui 29,7 14,8 a-1,3-BrS 500 oui 15,1 7,5 D394E 500 oui 1 0,5 NHAM ASR 500 non 1 0,5 a-1,3-BrS 500 oui 2,5 1,25 Tableau 9 Ratio : saccharose 143 mM / 2-Glucosylation de l'alcool allylique (g/L) propèn-ol 438 mM
Conversion du Glucosylation Enzymes saccharose (%) totale ASDg 82,6 0,166 ASR 91,5 0 GBD-CD2 46,3 1,225 DSR-S-A4N 76,1 0 DSR-OK 97,4 0 oc-1,2-BrS 88,8 1,908 oc-1,3-BrS 76,6 1,207 Tableau 10 Ratio : saccharose 143 mM /
Glucosylation du BME (g/L) BME 438 mM
Conversion du Glucosylation Enzymes saccharose (%) totale ASDg 80,4 1,849 ASR 91,3 0 GBD-CD2 3,0 1,674 DSR-S-A4N 5,5 0 DSR-OK 97,2 0 oc-1,2-BrS 89,1 2,848 oc-1,3-BrS 81,9 2,736 Tableau 11 4à.
o 4à.
= h.H ,g/L Mutants positifs E.'-=
Alcool .A.11,licue A C D E F G H I K L M N
P Q R S T V Vil Y
R226 0,313 0,252 0,127 0,207 0,184 0,065 0.061 0,356 0,154 0,13 0,042 0,16 0,19 0.15 0,092 0,197 0,117 0,177 ..=.=.=.=.=.=.=. 0 = = = = = = = = =
1228 0 0 035 0,352 0,279 0,57 0,888 ::=:=:=:=:=:=:=:=:0 0 0 0 0,274 0,366 0,421 0,383 0,277 0,312 0,404 0,53 F229 0 0,408 0,649 0,966 0,684 0,619 0,851 0,799 0,6 0.626 0 0,338 0,413 0,45 0,412 0,511 0,571 0524 0,545 0 1.1 0.852 0,697 0,816 0,783 0,785 0.881 0,77 0,763 0,6-61 0,803 0 0,517 0,499 0.54 0,432 0.591 0,409 0.654 0,648 .=.=.=.=.=..=
F290 0,538 1,052 0,825 0.89 0,8E2 1,105 0.763 0,82 0,787 0,999 0 0.37 0,442 0,525 0,437 0,5 0,573 0,649 0,572 .=.=.=.=.=.=.=.=.=
1330 0,568 1,004 0,929 0,792 0,352 0,994 0,858 0,707 0,73 0,734 0,495 0,326 0,509 0,598. 0.799 0,463 0.593 0,467 0,701 o .
.......
V331 0,413 0,707 0,778 0,728 0,772 0,703 c1,* 0,778 0,737 0,705 0,578 0,647 0.265 0.385 0,467 0,598 0519 0,626 0,486 :=:.:.:=:.:.:=:.:=
D394 002 0,455 1,018 0.707 0,806 0,686 0,756 0,777 0,659 0,497 0 0,155 0.327 0,462 0,51 0,417 0,277 0,478 0,411 .=.=.=.=.=.=.=.=.=
P,446 0,37 0,36 0,394 0,477 0,47 0,548 0,451 0,508 0,371 0,394 1,112 0 0 0,477 Ma 0,205 0,32E 0,292 0,315 0,313 =Id Tableau 12 4à.
Co.) t.) o = 0,021 &IL Mutants positifs production estimée en BME ACD EF GH I K LMNPQRS T VWY
R226 o e o 0 O 00000 o o o o o o o o 1228 3304 C 0 6,011 0,0161 0 14006 0 0,027 0,018 0,004 0 C012 0,009 0 0 0,036 0,045 0,023 F229 3009 DCf = 0 0 0 0 0,012 0 0,014 0,050 0 0 024 CO21 0,010 0 0 0,068 0,005 0,104 G) 4289 1 0,174 0,102 1217 0,081 CL
3,026 0 0 0,461 0,376 0,343 0,757 0040 use 0220 0,180 0,100 F290 0 085 u031 0,158 0.045 0.030 0,011 ';,027 0.021 0,014 0,037 0 0030 0284 0,010 0.420 0472 0,062 0,491 0.009 0 0 0 : = : 0 0 0 0,012 0 0,058 0 0,012 0,020 0,032 0,012 0 V331 I c 0299 0,191 0,367 0265 0,072 0,069 0,026 0,010 0,014 0 0,142 0 0,042 0237 0248 0 458 :L,L-r =:: 0 366 0255 I
0.025 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,005 0 0 0 0 =
R446 0 0'2 0 004 o 0 0,016 0,030 0,005 0 0 1 0 r) t=-) Tableau 13 oe Ratio : saccharose 73 mM / VBA
Glucosylation du VBA
Glucosylation du NHA1VI (g/L) 438 mM
Conversion du Glucosylation Enzymes NHAM-Glcl NHAM-G1c2 NHAM-G1c3 saccharose (%) totale ASDg 12 0,136 0,136 0 0 ASR >95 0,340 0,135 0,205 0 GBD-CD2 42 2,201 1,517 0,684 0 DSR-S-A4N 60 0,062 0,062 0 0 DSR-OK >95 0,149 0,149 0 0 oc-1,2-BrS >95 1,886 1,781 0,054 0,050 oc-1,3-BrS >95 2,078 1,918 0,160 0 Tableau 4 CD
1,..) --, Cl --, =P
Cl ---.1 Cl =P
e.:,..,,,.::,.'...,..)4É: , c C79 g _ Mutants positifs -..:.:-....
,.: ,1,_-'._ c:=c:.-, HEMA A C D E F G H I K L 1,1 N p Q R S T V IN Y
r R226 0,076 0,101 0 G G a 0 G 0 G 0 0,008 0,00e G :::::::::: 0,009 ...
G P
::::::::::::::::::, , .
r., 0,041 0 0 0 0,099 0,014 0 0 ....]
' ,--µ
r., 0 0 0 0 0,121 0 A289 ::::::::::::::::: 0 0 0 0 0 0,127 0,039 0,045 0,139 0,007 0 0 0 0 0 0 0 0,015 C ....]
E
.
, in F290 4,532 8,966 0 0 :::::::::::::::: 0 0,013 3,134 0,795 2,152 0,793 0,014 0,139 0,075 G 0 0 5,938 0,004 C 0 o .._ -,_ 1330 0,287 0,022 0 0,014 0,042 0,040 0,011 ::::::::::::: 0,0G8 0,008 0,033 0,052 0 0 G
Lel o V331 0,010 0,103 0.234 0,444 0,026 0,098 0,108 0 0,046 0,023 0,023 0 0 G
D394 0,236 0,049 :::::::::::::: 0,012 0 0,065 0,019 0,024 0 0,030 0,030 0,038 R446 0,019 0,157 0,007 0,019 0,021 0,136 0,013 0,029 0,089 0.118 0,039 0.257 0 G :::::::::::::::::: G 0 G 0 0 md n .3 m Tableau 5 so I.) o ,-, o u, u, =P
r.d.) ne o i-i o i-i .w o -a o .w -$,'',41-c =:µ,/"T = 0,026 g/L Mutants positifs production eshinée en git NHAM ACD E F GH 1K LMNPOR S 1* VW r - -,µ 1 - - P
R226 0,003 0,003 0.003 0,004 0,004 0,003 0,004 0,003 0,003 0,003 0,001 0.004 0 0,003 .:.
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0 0.008 0 0,003 0 0 0 ::, ==:
0 0,019 0020 0.014 0,003 0,009 0,001 0 0,001 0,016 0 c .
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F229 Lou 0,010 o o ._....:.: 0 o 0,004 0 0,007 0,130 0,051 0,002 0,003 0 _ 0,012 0,003 0,011 L
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A289 ":::::.* ' ' 1021 0.005 0,004 0.0C2 0,019 0,022 0008 C 0,002 0,019 0,126 0,032 0,037 0 0,026 c -7c 0,026 0 ?
F290 0,002 0,003 0 0 0,002 0 0 0 0,002 0,006 0,009 0,002 0,003 0 0 _ 0,007 0,015 0019 0 c .
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_ 1330 0.001 0 0 0 L 0 0 C 0 0,0060,033 0 0 0 0 . L :16 0 0 ...., _ v-, 0 -4 .
CL V331 0,024 0,031 c 0271, -,,' 0 c,-" :7,1 0,025 0,008 0 002 0 0014 0,005 0,028 0,001 0.025 0,001 0 t` i q n - '1 o cola 1)394 0 0,001 _ i _ = , 0,009 0 0 0 0 0 0,004 0 0 0 0 C 2 0 0 te R446 0.004 0,013 0 0 0,0C 1 0,012 0 0 0,007 0,001 0,002 0.013 0 0,006 ---=:::=::.---:::::. 0,012 0.007 0 0 0,001 ,.
ni r) -i rm ni t..>
o Tableau 6 .
0, --e ee.
ee.
ce 4.
c..) Ratio : saccharose 73 mM / HEMA 73 mM Glucosylation du HEMA (g/L) Conversion du Glucosylation Enzymes HEMA-Glcl HEMA-G1c2 HEMA-G1c3 saccharose (%) totale ASNp sauvage 87 0,141 0,079 0,062 Traces F229W 92,5 0,121 0,069 0,052 0 F290A 73,5 4,532 1,961 0,486 2,084 F290C 83 8,966 6,064 1,734 1,167 F2901 69 3,134 2,377 0,420 0,337 F290K 57 0,795 0,616 0,179 Traces F290L 92 2,197 1,531 0,621 0,045 F290M 92 0,793 0,544 0,249 Traces F290V 40 5,938 4,535 0,704 0,699 1330A 4 0,287 0,188 0,099 0 V331E 88 0,444 0,299 0,145 0 D394A 23 0,236 0,149 0,087 0 R446G 14,5 0,191 0,094 0,041 0,055 Tableau 7 Ratio : saccharose 73 mM / NHAM 73 Glucosylation du NHAM (g/L) mM
Conversion du Glucosylation Enzymes NHAM-Glcl NHAM-G1c2 NHAM-G1c3 saccharose (%) totale ASNp sauvage 76,5 0,101 0,025 0,076 0 F229M 73,7 0,169 0,130 0,033 0,007 F229N 2,5 0,100 0,051 0,049 0 A289N 90,8 0,211 0,126 0,084 0 A289P 81,0 0,127 0,032 0,096 0 A289Q 52,1 0,083 0,037 0,045 0 1330N 0,6 0,096 0,033 0,063 0 V331C 75,0 0,065 0,031 0,029 0,004 V331D 17,7 0,077 0,039 0,032 0,007 V331E 64,2 0,145 0,097 0,038 0,010 V331T 86,9 0,100 0,031 0,069 0 D394E 86,6 0,187 0,137 0,050 0 Tableau 8 Production Accepteur Enzyme Volume Lyophilisé g/L
estimée (g) F290C 500 oui 38,8 19,4 HEMA ASR 500 oui 29,7 14,8 a-1,3-BrS 500 oui 15,1 7,5 D394E 500 oui 1 0,5 NHAM ASR 500 non 1 0,5 a-1,3-BrS 500 oui 2,5 1,25 Tableau 9 Ratio : saccharose 143 mM / 2-Glucosylation de l'alcool allylique (g/L) propèn-ol 438 mM
Conversion du Glucosylation Enzymes saccharose (%) totale ASDg 82,6 0,166 ASR 91,5 0 GBD-CD2 46,3 1,225 DSR-S-A4N 76,1 0 DSR-OK 97,4 0 oc-1,2-BrS 88,8 1,908 oc-1,3-BrS 76,6 1,207 Tableau 10 Ratio : saccharose 143 mM /
Glucosylation du BME (g/L) BME 438 mM
Conversion du Glucosylation Enzymes saccharose (%) totale ASDg 80,4 1,849 ASR 91,3 0 GBD-CD2 3,0 1,674 DSR-S-A4N 5,5 0 DSR-OK 97,2 0 oc-1,2-BrS 89,1 2,848 oc-1,3-BrS 81,9 2,736 Tableau 11 4à.
o 4à.
= h.H ,g/L Mutants positifs E.'-=
Alcool .A.11,licue A C D E F G H I K L M N
P Q R S T V Vil Y
R226 0,313 0,252 0,127 0,207 0,184 0,065 0.061 0,356 0,154 0,13 0,042 0,16 0,19 0.15 0,092 0,197 0,117 0,177 ..=.=.=.=.=.=.=. 0 = = = = = = = = =
1228 0 0 035 0,352 0,279 0,57 0,888 ::=:=:=:=:=:=:=:=:0 0 0 0 0,274 0,366 0,421 0,383 0,277 0,312 0,404 0,53 F229 0 0,408 0,649 0,966 0,684 0,619 0,851 0,799 0,6 0.626 0 0,338 0,413 0,45 0,412 0,511 0,571 0524 0,545 0 1.1 0.852 0,697 0,816 0,783 0,785 0.881 0,77 0,763 0,6-61 0,803 0 0,517 0,499 0.54 0,432 0.591 0,409 0.654 0,648 .=.=.=.=.=..=
F290 0,538 1,052 0,825 0.89 0,8E2 1,105 0.763 0,82 0,787 0,999 0 0.37 0,442 0,525 0,437 0,5 0,573 0,649 0,572 .=.=.=.=.=.=.=.=.=
1330 0,568 1,004 0,929 0,792 0,352 0,994 0,858 0,707 0,73 0,734 0,495 0,326 0,509 0,598. 0.799 0,463 0.593 0,467 0,701 o .
.......
V331 0,413 0,707 0,778 0,728 0,772 0,703 c1,* 0,778 0,737 0,705 0,578 0,647 0.265 0.385 0,467 0,598 0519 0,626 0,486 :=:.:.:=:.:.:=:.:=
D394 002 0,455 1,018 0.707 0,806 0,686 0,756 0,777 0,659 0,497 0 0,155 0.327 0,462 0,51 0,417 0,277 0,478 0,411 .=.=.=.=.=.=.=.=.=
P,446 0,37 0,36 0,394 0,477 0,47 0,548 0,451 0,508 0,371 0,394 1,112 0 0 0,477 Ma 0,205 0,32E 0,292 0,315 0,313 =Id Tableau 12 4à.
Co.) t.) o = 0,021 &IL Mutants positifs production estimée en BME ACD EF GH I K LMNPQRS T VWY
R226 o e o 0 O 00000 o o o o o o o o 1228 3304 C 0 6,011 0,0161 0 14006 0 0,027 0,018 0,004 0 C012 0,009 0 0 0,036 0,045 0,023 F229 3009 DCf = 0 0 0 0 0,012 0 0,014 0,050 0 0 024 CO21 0,010 0 0 0,068 0,005 0,104 G) 4289 1 0,174 0,102 1217 0,081 CL
3,026 0 0 0,461 0,376 0,343 0,757 0040 use 0220 0,180 0,100 F290 0 085 u031 0,158 0.045 0.030 0,011 ';,027 0.021 0,014 0,037 0 0030 0284 0,010 0.420 0472 0,062 0,491 0.009 0 0 0 : = : 0 0 0 0,012 0 0,058 0 0,012 0,020 0,032 0,012 0 V331 I c 0299 0,191 0,367 0265 0,072 0,069 0,026 0,010 0,014 0 0,142 0 0,042 0237 0248 0 458 :L,L-r =:: 0 366 0255 I
0.025 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,005 0 0 0 0 =
R446 0 0'2 0 004 o 0 0,016 0,030 0,005 0 0 1 0 r) t=-) Tableau 13 oe Ratio : saccharose 73 mM / VBA
Glucosylation du VBA
73 mM
Conversion du Glucosylation Enzymes saccharose (%) totale (g/L) oc-1,2-BrS 63,1 7,9 ASR 95,3 2,5 Tableau 14 Q 0 0 0 0 0> 0 0 0 0 ore ,n > . 0 0 0 0 Ziet 0 0 t 0 0 (f) 0.Q Ze e c:r rit e tx 0 a..õ7õ, z, E
- 0 0 0.
' F
a, , :=8Q Q Q 0 ità
I e, = - O. CU
SZ
= 0 0, 0 0 0 0 0 0 n a , 0, o.
W 0 0. 0, 0 0 .0 0 0- 0 , =
O 4> Ot ,000 rQ
eõ.) 0,0.00000 40 r,i A 1 Ar < 0, 0 0 .17 r= g suo!lr3od Ratio : saccharose 73 mM / NNHEA
Glucosylation du NNHEA (g/L) 73 mM
Conversion du Glucosylation Enzymes NNHEA-Glcl NNHEA-G1c2 NNHEA-G1c3 saccharose (%) totale ASR >98 0,86 0,86 Traces 0 a-1,2-BrS 90 1,76 1,76 Traces 0 a-1,3-BrS >98 1,47 1,47 Traces 0 Tableau 16 CD
I-, I-, =P
--I
=P
1S4 goel- Mutants positifs .. .... _ . . :. =r= 2: ,r,',;.7 r.' '...' i:
, S T V iN Y
P
P226 0.6 0 0,07 0,89 0 0 0 0,81 0,59 0,62 0,65 0,78 0 0,29 :H:=:=:=:-0,73 0,77 0,6Ã 0,49 0,56 0 .., ....]
1228 0,49 0,75 0 0,05 0,07 0 0,96 :::::::::::::=:- 00,71 1,02 0,31 0,61 0,63 0 0,07 0,61 199 0,08 0,6 .=.=.=.=.=.=.=.=
-.., I, VI F 2 2 9 0 0.3 0 0 :::::::=:=:=:=:- 0 -:=:=:=:=:-:=:=: 0 0,51 0 0.52 1,66 0.2 0 0,02 0,04 0 0 0,51 0,67 1,5 ai A 2 8 9 ================ 2,311,2 0,66 0,13 1.77 0.34 1,46 0,09 0.25 2,88 2,61 0,85 5,11 0,18 2,59 2.49 2,06 1,19 0 :=:=:-:=:=:=:=:-....]
' F290 2,03 7,17 0,41 1,46 :.:.:-:.:.:.:.:: 2,41 0,4 2,73 1,91 6,58 2,85 0 0,84 1,81 1,54 2,34 2,55 8,99 5,28 0,62 LA .:.:.:.:.:.:.:....
=
CI
z 0, 0 0 0.07 1,66 0 0.04 = 1330 0 0,08 0 0 0 0 0 :::=:-: :=:
=:=::- 0,05 0 1,1 0 0 .=.=.=.=.=.=.=.=
vi .2. V331 0 0.4 2,05 2,33 0,46 1,88 1,44 0,74 0,06 0.88 0,66 1,93 0 0 0,14 2,15 2.37 :::::-:=:=:=:=:-0,38 2,04 .=.=.=.=.=.=.=.=
D394 0 :=:-:=:=:=:=:-=
0 =============-: 0,31 0 0,3 0 =:=:=:=:-:=:=:= 0 0 0 0 0 0 0 0,02 0,16 0 0 0 0 -:=:=:=:=:-:=:=
P. =12=' 5 0 0,59 0 0 0.11 0,31 0 0 0.4 0,13 0,28 0,37 0 0,36 :=:=:-:=:=:=:=:: 0,25 0.49 0 0 024 -:=:=:=:=:-:=:=
md n ,-q m Tableau 17 so I-, ui ui ce =P
Co.) Ratio : saccharose 73 mM / NNHEA
Glucosylation du NNHEA (g/L) 73 mM
Conversion du Glucosylation Enzymes NNHEA-Glcl NNHEA-G1c2 NNHEA-G1c3 saccharose (%) totale ASNp sauvage 98 1,7 1,7 0 0 A289Q 99 5,1 5,1 0 0 F290C 69 7,2 7,2 Traces 0 F290L 89 6,6 6,6 Traces 0 F290V 99 9,0 9,0 Traces 0 F290W 68 5,3 3,0 2,3 0 Tableau 18 Ratio : saccharose 146 mM /
Glucosylation du HEAA (g/L) HEAA 438 mM
Conversion du Glucosylation Enzymes saccharose (%) totale ASR 92 2,8 oc-1,3-BrS 97 2,4 D394E 81 3,9 Fructosyltransférase de Bacillus subtilis du 99,2 0,08 Tableau I
Tableau 19 Ratio : saccharose 146 mM / HEAA
Glucosylation du HEAA (g/L) 348 mM
Conversion du Glucosylation Enzymes HEAA-Glcl HEAA-G1c2 HEAA-G1c3 saccharose (%) totale ASR 92 2,823 0,851 1,54 0,431 oc-1,3-BrS 97 2,441 2,441 Traces 0 D394E 81 3,883 3,883 Traces 0 Tableau 20 SEQUENCES :
Série SEQ ID NO: 1 : (Protéine = séquence de la glucane-saccharase ASNp sauvage (Amylosucrase Neisseria polysaccharea)) SPNS QYLKTRILDIYTPEQRAGIEKSEDWRQF SRRMDTHFPKLMNELD SV
YGNNEALLPMLEMLLAQAWQ SYS QRNS SLKDIDIARENNPDWIL SNKQVGGVCYV
DLFAGDLKGLKDKIPYF QEL GL TYLHLMPLFKC PE GKS D GGYAV S SYRDVNPAL GT
I GDLREVIAALHEAGI SAVVDFIFNHT SNEHEWAQRCAAGDPLFDNFYYIFPDRRMP
D QYDRTLREIFPD QHP GGF S QLED GRWVWTTFNSFQWDLNYSNPWVFRAMAGEM
LFLANLGVDILRMDAVAFIWKQMGT S CENLPQAHALIRAFNAVMRIAAPAVFFKSE
AIVHPD QVVQYI GQDE C QI GYNPL QMALLWNTLATREVNLLHQALTYRHNLPEHT
AWVNYVRS HDDI GWTFADEDAAYL GI S GYD HRQFLNRFFVNRFD G S FARGVPF QY
NP STGDCRVS GTAAALVGLAQDDPHAVDRIKLLYSIALSTGGLPLIYLGDEVGTLND
DDWS QD SNKSDD SRWAHRPRYNEALYAQRNDP STAAGQIYQDLRHMIAVRQ SNP
RFDGGRLVTFNTNNKHIIGYIRNNALLAFGNF SEYPQTVTAHTLQAMPFKAHDLIGG
KTVSLNQDLTLQPYQVMWLEIA
Série SEQ ID NO : 2 : (Protéines = séquences mutées de la glucane-saccharase ASNp (Amylosucrase Neisseria polysaccharea) R226X1) SPNS QYLKTRILDIYTPEQRAGIEKSEDWRQF SRRMDTHFPKLMNELD SV
YGNNEALLPMLEMLLAQAWQ SYS QRNS SLKDIDIARENNPDWIL SNKQVGGVCYV
DLFAGDLKGLKDKIPYF QEL GL TYLHLMPLFKC PE GKS D GGYAV S SYRDVNPAL GT
I GDLREVIAALHEAGI SAVVDFIFNHT SNEHEWAQRCAAGDPLFDNFYYIFPDRRMP
LFLANLGVDILRMDAVAFIWKQMGT S CENLPQAHALIRAFNAVMRIAAPAVFFKSE
AIVHPD QVVQYI GQDE C QI GYNPL QMALLWNTLATREVNLLHQALTYRHNLPEHT
AWVNYVRS HDDI GWTFADEDAAYL GI S GYD HRQFLNRFFVNRFD G S FARGVPF QY
NP STGDCRVS GTAAALVGLAQDDPHAVDRIKLLYSIALSTGGLPLIYLGDEVGTLND
DDWS QD SNKSDD SRWAHRPRYNEALYAQRNDP STAAGQIYQDLRHMIAVRQ SNP
RFDGGRLVTFNTNNKHIIGYIRNNALLAFGNF SEYPQTVTAHTLQAMPFKAHDLIGG
KTVSLNQDLTLQPYQVMWLEIA
Série SEQ ID NO : 3 : (Protéines = séquences mutées de la glucane-saccharase ASNp (Amylosucrase Neisseria polysaccharea) 1228X2) SPNSQYLKTRILDIYTPEQRAGIEKSEDWRQFSRRMDTHFPKLMNELDSV
YGNNEALLPMLEMLLAQAWQ SYS QRNS SLKDIDIARENNPDWIL SNKQVGGVCYV
DLFAGDLKGLKDKIPYF QELGLTYLHLMPLFKC PE GKS D GGYAV S SYRDVNPAL GT
I GDLREVIAALHEAGI SAVVDFIFNHT SNEHEWAQRCAAGDPLFDNFYYIFPDRRMP
MLFLANLGVDILRMDAVAFIWKQMGT S CENLPQAHALIRAFNAVMRIAAPAVFFKS
EAIVHPDQVVQYIGQDEC QIGYNPLQMALLWNTLATREVNLLHQALTYRHNLPEH
TAWVNYVRS HDDI GWTFADEDAAYLGI S GYDHRQFLNRFFVNRFD G S FARGVPF Q
YNP STGDCRVSGTAAALVGLAQDDPHAVDRIKLLYSIALSTGGLPLIYLGDEVGTLN
DDDWS QDSNKSDDSRWAHRPRYNEALYAQRNDP STAAGQIYQDLRHMIAVRQ SN
PRFDGGRLVTFNTNNKHIIGYIRNNALLAFGNF S EYPQ TVTAHTL QAMPFKAHDLI G
GKTVSLNQDLTLQPYQVMWLEIA
Série SEQ ID NO : 4 : (Protéines = séquences mutées de la glucane-saccharase ASNp (Amylosucrase Neisseria polysaccharea) F229X3) SPNS QYLKTRILDIYTPEQRAGIEKSEDWRQF S RRMDTHFPKLMNELD SV
YGNNEALLPMLEMLLAQAWQ SYS QRNS SLKDIDIARENNPDWIL SNKQVGGVCYV
DLFAGDLKGLKDKIPYF QELGLTYLHLMPLFKC PE GKS D GGYAV S SYRDVNPAL GT
I GDLREVIAALHEAGI SAVVDFIFNHT SNEHEWAQRCAAGDPLFDNFYYIFPDRRMP
MLFLANLGVDILRMDAVAFIWKQMGT S CENLPQAHALIRAFNAVMRIAAPAVFFKS
EAIVHPDQVVQYIGQDEC QIGYNPLQMALLWNTLATREVNLLHQALTYRHNLPEH
TAWVNYVRS HDDI GWTFADEDAAYLGI S GYDHRQFLNRFFVNRFD G S FARGVPF Q
YNP STGDCRVSGTAAALVGLAQDDPHAVDRIKLLYSIALSTGGLPLIYLGDEVGTLN
DDDWS QD SNKS DD S RWAHRPRYNEALYAQRNDP S TAAGQIYQDLRHMIAVRQ SN
PRFDGGRLVTFNTNNKHIIGYIRNNALLAFGNF S EYPQ TVTAHTL QAMPFKAHDLI G
GKTVSLNQDLTLQPYQVMWLEIA
SEQ ID NO: 5 : (Protéine = séquence mutée de la glucane-saccharase ASNp (Amylosucrase Neisseria polysaccharea) A289X4) SPNSQYLKTRILDIYTPEQRAGIEKSEDWRQF S RRMDTHFPKLMNELD SV
YGNNEALLPMLEMLLAQAWQ SYS QRNS SLKDIDIARENNPDWIL SNKQVGGVCYV
DLFAGDLKGLKDKIPYF QELGLTYLHLMPLFKC PE GKS D GGYAV S SYRDVNPAL GT
I GDLREVIAALHEAGI SAVVDFIFNHT SNEHEWAQRCAAGDPLFDNFYYIFPDRRMP
D QYDRTLREIFPD QHP GGF S QLEDGRWVWTTFNSFQWDLNYSNPWVFRAMAGEM
EAIVHPDQVVQYIGQDEC QIGYNPLQMALLWNTLATREVNLLHQALTYRHNLPEH
TAWVNYVRSHDDIGWTFADEDAAYLGIS GYDHRQFLNRFFVNRFD G S FARGVPF Q
YNP STGDCRVS GTAAALVGLAQDDPHAVDRIKLLYSIALSTGGLPLIYLGDEVGTLN
DDDWS QDSNKSDDSRWAHRPRYNEALYAQRNDP STAAGQIYQDLRHMIAVRQ SN
PRFDGGRLVTFNTNNKHIIGYIRNNALLAFGNF S EYPQ TVTAHTL QAMPFKAHDLI G
GKTVSLNQDLTLQPYQVMWLEIA
Série SEQ ID NO : 6 : (Protéines = séquences mutées de la glucane-saccharase ASNp (Amylosucrase Neisseria polysaccharea) F290X5) SPNSQYLKTRILDIYTPEQRAGIEKSEDWRQFSRRMDTHFPKLMNELDSV
YGNNEALLPMLEMLLAQAWQ SYS QRNS SLKDIDIARENNPDWIL SNKQVGGVCYV
DLFAGDLKGLKDKIPYF QELGLTYLHLMPLFKC PE GKS D GGYAV S SYRDVNPAL GT
I GDLREVIAALHEAGI SAVVDFIFNHT SNEHEWAQRCAAGDPLFDNFYYIFPDRRMP
D QYDRTLREIFPD QHP GGF S QLEDGRWVWTTFNSFQWDLNYSNPWVFRAMAGEM
EAIVHPDQVVQYIGQDEC QIGYNPLQMALLWNTLATREVNLLHQALTYRHNLPEH
TAWVNYVRSHDDIGWTFADEDAAYLGIS GYDHRQFLNRFFVNRFD G S FARGVPF Q
YNP STGDCRVS GTAAALVGLAQDDPHAVDRIKLLYSIALSTGGLPLIYLGDEVGTLN
DDDWS QDSNKSDDSRWAHRPRYNEALYAQRNDP STAAGQIYQDLRHMIAVRQ SN
PRFDGGRLVTFNTNNKHIIGYIRNNALLAFGNF SEYPQTVTAHTLQAMPFKAHDLIG
GKTVSLNQDLTLQPYQVMWLEIA
Série SEQ ID NO : 7 : (Protéines = séquences mutées de la glucane-saccharase ASNp (Amylosucrase Neisseria polysaccharea) 1330X6) SPNSQYLKTRILDIYTPEQRAGIEKSEDWRQF SRRMD THFPKLMNELD SV
YGNNEALLPMLEMLLAQAWQ SYS QRNS SLKDIDIARENNPDWILSNKQVGGVCYV
DLFAGDLKGLKDKIPYF QELGLTYLHLMPLFKC PE GKS D GGYAV S SYRDVNPAL GT
I GDLREVIAALHEAGI SAVVDFIFNHT SNEHEWAQRCAAGDPLFDNFYYIFPDRRMP
D QYDRTLREIFPD QHP GGF S QLEDGRWVWTTFNSFQWDLNYSNPWVFRAMAGEM
LFLANLGVDILRMDAVAFIWKQMGT S CENLPQAHALIRAFNAVMRIAAPAVFFKSE
TAWVNYVRSHDDIGWTFADEDAAYLGIS GYDHRQFLNRFFVNRFD G S FARGVPF Q
YNP STGDCRVS GTAAALVGLAQDDPHAVDRIKLLYSIALSTGGLPLIYLGDEVGTLN
DDDWS QDSNKSDDSRWAHRPRYNEALYAQRNDP STAAGQIYQDLRHMIAVRQ SN
PRFDGGRLVTFNTNNKHIIGYIRNNALLAFGNF S EYP QTVTAHTL QAMPFKAHDLI G
GKTVSLNQDLTLQPYQVMWLEIA
Série SEQ ID NO : 8 : (Protéines = séquences mutées de la glucane-saccharase ASNp (Amylosucrase Neisseria polysaccharea) V33 1X7) SPNSQYLKTRILDIYTPEQRAGIEKSEDWRQF SRRMD THFPKLMNELD SV
YGNNEALLPMLEMLLAQAWQ SYS QRNS SLKDIDIARENNPDWIL SNKQVGGVCYV
DLFAGDLKGLKDKIPYF QELGLTYLHLMPLFKC PE GKS D GGYAV S SYRDVNPAL GT
I GDLREVIAALHEAGI SAVVDFIFNHT SNEHEWAQRCAAGDPLFDNFYYIFPDRRMP
D QYDRTLREIFPD QHP GGF S QLEDGRWVWTTFNSFQWDLNYSNPWVFRAMAGEM
LFLANL GVDILRMDAVAFIWKQM GT S CENLPQAHALIRAFNAVMRIAAPAVFFKSE
AWVNYVRS HDDI GWTFADEDAAYL GI S GYD HRQFLNRFFVNRFD G S FARGVPF QY
NP STGDCRVS GTAAALVGLAQDDPHAVDRIKLLYSIALSTGGLPLIYLGDEVGTLND
DDWS QDSNKSDDSRWAHRPRYNEALYAQRNDPSTAAGQIYQDLRHMIAVRQ SNP
RFDGGRLVTFNTNNKHIIGYIRNNALLAFGNF S EYPQTVTAHTL QAMPFKAHD LI GG
KTVSLNQDLTLQPYQVMWLEIA
Série SEQ ID NO : 9 : (Protéines = séquences mutées de la glucane-saccharase ASNp (Amylosucrase Neisseria polysaccharea) D394X8) SPNSQYLKTRILDIYTPEQRAGIEKSEDWRQF SRRMD THFPKLMNELD SV
YGNNEALLPMLEMLLAQAWQ SYS QRNS SLKDIDIARENNPDWILSNKQVGGVCYV
DLFAGDLKGLKDKIPYF QELGLTYLHLMPLFKC PE GKS D GGYAV S SYRDVNPAL GT
I GDLREVIAALHEAGI SAVVDFIFNHT SNEHEWAQRCAAGDPLFDNFYYIFPDRRMP
D QYDRTLREIFPD QHP GGF S QLEDGRWVWTTFNSFQWDLNYSNPWVFRAMAGEM
LFLANL GVDILRMDAVAFIWKQM GT S CENLPQAHALIRAFNAVMRIAAPAVFFKSE
AIVHPD QVVQYI GQDE C QI GYNPL QMALLWNTLATREVNLLHQALTYRHNLPEHT
NP STGDCRVSGTAAALVGLAQDDPHAVDRIKLLYSIALSTGGLPLIYLGDEVGTLND
DDWS QDSNKSDDSRWAHRPRYNEALYAQRNDPSTAAGQIYQDLRHMIAVRQ SNP
RFDGGRLVTFNTNNKHIIGYIRNNALLAFGNF SEYPQTVTAHTLQAMPFKAHDLIGG
KTVSLNQDLTLQPYQVMWLEIA
SEQ ID NO: 10 : (Protéine = séquence mutée de la glucane-saccharase ASNp (Amylosucrase Neisseria polysaccharea) R446X9) SPNSQYLKTRILDIYTPEQRAGIEKSEDWRQF SRRMD THFPKLMNELD SV
YGNNEALLPMLEMLLAQAWQ SY SQRNS SLKDIDIARENNPDWILSNKQVGGVCYV
DLFAGDLKGLKDKIPYF QELGLTYLHLMPLFKC PE GKS D GGYAV S SYRDVNPAL GT
I GDLREVIAALHEAGI SAVVDFIFNHT SNEHEWAQRCAAGDPLFDNFYYIFPDRRMP
D QYDRTLREIFPD QHP GGF S QLEDGRWVWTTFNSFQWDLNYSNPWVFRAMAGEM
LFLANLGVDILRMDAVAFIWKQMGT S CENLPQAHALIRAFNAVMRIAAPAVFFKSE
AIVHPD QVVQYI GQDE C QI GYNPL QMALLWNTLATREVNLLHQALTYRHNLPEHT
AWVNYVRS HDDI GWTFADEDAAYL GI S GYD HRQFLNRFFVNRFD G S FARGVPF QY
DDDWS QDSNKSDDSRWAHRPRYNEALYAQRNDP STAAGQIYQDLRHMIAVRQ SN
PRFDGGRLVTFNTNNKHIIGYIRNNALLAFGNF S EYP QTVTAHTL QAMPFKAHD LI G
GKTVSLNQDLTLQPYQVMWLEIA
Série SEQ ID NO: 11: (Protéine = séquence de la DSR-S-A4N (Dextrane-saccharase tronquée DSR-S vardel A4N de Leuconostoc mesenteroides B-512F)) T Q QV S GKYVEKD G S WYYYFDD GKNAKGL S TIDNNIQYFYE S GKQAKG
QYVTIDNQTYYFDKG S GD ELTGL Q S ID GNIVAFNDE GQ QIFNQYYQ S EN GTTYYFD
DKGHAATGIKNIEGKNYYFDNLGQLKKGFSGVIDGQIMTFDQETGQEVSNTTSEIKE
GLTTQNTDYSEHNAAHGTDAEDFENIDGYLTAS SWYRPTGILRNGTDWEP STDTDF
RPIL SVWWPDKNTQVNYLNYMADLGFI SNAD S FET GD S Q SLLNEASNYVQKSIEMK
I SAQ Q STEWLKDAMAAFIVAQP QWNET S ED M SNDHL QNGALTYVN S PLTPDAN SN
FRLLNRTPTNQTGEQAYNLDNSKGGFELLLANQEDNSNVVVEAEQLNWLYYLMNF
GTITANDADANFD GIRVDAVDNVDADLLQ IAADYFKLAYGVD QNDATANQ HL S IL
EDWSHNDPLYVTDQGSNQLTMDDYVHTQLIWSLTKS SDIRGTMQRFVDYYMVDR
SNDSTENEAIPNYSFVRAHDSEVQTVIAQIVSDLYPDVENSLAPTTEQLAAAFKVYN
EDEKLADKKYTQYNMASAYAMLLTNKDTVPRVYYGDLYTDDGQYMATKSPYYD
AINTLLKARVQYVAGGQ S M SVD SNDVLT SVRYGKDAMTAS DT GT S ETRTE GI GVIV
SNNAELQLEDGHTVTLHMGAAHKNQAYRALL STTADGLAYYDTDENAPVAYTDA
NGDLIFTNE S IYGVQNP QV S GYLAVWVPVGAQ QD QDARTAS DTTTNT S DKVFH SN
AALDS QVIYEGF SNFQAFATDS SEYTNVVIAQNADQFKQWGVT SFQLAPQYRSSTD
T SFLDSIIQNGYAFTDRYDLGYGTPTKYGTADQLRDAIKALHASGIQAIADWVPDQI
YNLPEQELATVTRTNSFGDDDTDSDIDNALYVVQSRGGGQYQEMYGGAFLEELQA
LYP S LFKVNQI S TGVPID G SVKITEWAAKYFNG SNI Q GKGAGYVLKDM G SNKYFKV
V SNTED GDYLPKQLTNDL S ETGFTHDDKGIIYYTL S GYRAQNAFIQD DDNNYYYFD
KT GHLVT GL QKINNHTYFFLPNGIELVKS FL QNED GTIVYFDKKGHQVFD QYITD QN
GNAYYFDDAGVMLKSGLATIDGHQ QYFD QNGVQVKDKFVI GTD GYKYYFEP G S G
NLAILRYVQNSKNQWFYFDGNGHAVTGFQTINGKKQYFYNDGHQ S KGEFIDAD GD
TFYT SATDGRLVTGVQKINGITYAFDNTGNLITNQYYQLADGKYMLLDDSGRAKT
GFVLQDGVLRYFDQNGEQVKDAIIVDPDTNL S
Série SEQ ID NO : 12: (Protéine = séquence de la glucane-saccharase a-1,2 BrS (a-1,2 BrS de Leuconostoc citreum NRRL B-1299)) MRQKETITRKKLYKSGKSWVAAATAFAVMGVSAVTTVSADTQTPVGT
TQSQQDLTGQRGQDKPTTKEVIDKKEPVPQVSAQNAGDLSADAKTTKADDKQDTQ
PTNAQLPDQGNKQTNSNSDKGVKESTTAPVKTTDVPSKSVTPETNTSINGGQYVEK
DGQFVYIDQSGKQVSGLQNIEGHTQYFDPKTGYQTKGELKNIDDNAYYFDKNSGN
GRTFTKISNGSYSEKDGMWQYVDSHDKQPVKGLYDVEGNLQYFDLSTGNQAKHQI
RSVDGVTYYFDADSGNATAFKAVTNGRYAEQTTKDKDGNETSYWAYLDNQGNAI
KGLNDVNGEIQYFDEHTGEQLKGHTATLDGTTYYFEGNKGNLVSVVNTAPTGQYK
INGDNVYYLDNNNEAIKGLYGINGNLNYFDLATGIQLKGQAKNIDGIGYYFDKDTG
NGSYQYTLMAPSNKNDYTQHNVVNNLSESNFKNLVDGFLTAETWYRPAQILSHGT
DWVASTDKDFRPLITVWWPNKDIQVNYLRLMQNEGVLNQSAVYDLNTDQLLLNE
AAQQAQIGIEKKISQTGNTDWLNNVLFTTHDGQPSFIKQQYLWNSDSEYHTGPFQG
GYLKYQNSDLTPNVNSKYRNADNSLDFLLANDVDNSNPIVQAEDLNWLYYLLNFG
SITTQGKENNSNFDSIRIDAVDFVSNDLIQRTYDYLRAAYGVDKNDKEANAHLSLVE
AGLDAGTTTIHQDALIESDIREAMKKSLTNGPGSNISLSNLIQDKEGDKLIADRANNS
TENVAIPNYSIIHAHDKDIQDKVGAAITDATGADWTNFTPEQLQKGLSLYYEDQRKI
EKKYNQYNIPSAYALLLTNKDTVPRVYYGDMYQDDGQYMQKQSLYFDTITALME
ARKQFVAGGQTINVDDNGVLTSVRFGKGAMTANDIGTNETRTQGIGVVIANDPSLK
LSKDSKVTLHMGAAHRNQNYRALLLTTDNGIDSYSSSKNAPVIKTDDNGDLVFSNQ
DINDQLNTKVHGFLNSEVSGYLSAWVPLDATEQQDARTLPSEKSVNDGKVLHSNA
ALDSNLIYEAFSNFQPMPTNRNEYTNVVIADKADTFKSWGITSFEMAPQYRSSQDKT
FLDSTIDNGYAFTDRYDLGFEKPTKYGNDEDLRQAIKQLHSSGMQVMADVVANQI
YNLPGKEVASTNRVDWNGNNLSTPFGTQMYVVNTVGGGKYQNKYGGEFLDKLK
AAYPDIFRSKNYEYDVKNYGGNGTGSVYYTVDSKTRAELDTDTKIKEWSAKYMN
GTNVLGLGMGYVLKDWQTGQYFNVSNQNMKFLLPSDLISNDITVQLGVPVTDKKII
FDPASAYNMYSNLPEDMQVMDYQDDKKSTPSIKPLSSYNNKQVQVTRQYTDSKGV
SWNLITFAGGDLQGQKLWVDSRALTMTPFKTMNQISFISYANRNDGLFLNAPYQVK
GYQLAGMSNQYKGQQVTIAGVANVSGKDWSLISFNGTQYWIDSQALNTNFTHDM
NQKVFVNTTSNLDGLFLNAPYRQPGYKLAGLAKNYNNQTVTVSQQYFDDQGTVW
SQVVLGGQTVWVDNHALAQMQVRDTNQQLYVNSNGRNDGLFLNAPYRGQGSQLI
GMTADYNGQHVQVTKQGQDAYGAQWRLITLNNQQVWVDSRALSTTIMQAMNDD
MYVNSSQRTDGLWLNAPYTMSGAKWAGDTRSANGRYVHISKAYSNEVGNTYYLT
NLNGQSTWIDKRAFTATFDQVVALNATIVARQRPDGMFKTAPYGEAGAQFVDYVT
NYNQQTVPVTKQHSDAQGNQWYLATVNGTQYWIDQRSFSPVVTKVVDYQAKIVP
RTTRDGVFSGAPYGEVNAKLVNMATAYQNQVVHATGEYTNASGITWSQFALSGQ
EDKLWIDKRALQA
Série SEQ ID NO : 13 : (Protéine = séquence de la glucane-saccharase GBD-CD2 (Dextrane-sucrase tronquée DSR-E de Leuconostoc mesenteroides NRRL
B-1299)) MAHHHHHHVTSLYKKAGSAAAPFTMAQAGHYITKNGNDWQYDTNGE
LAKGLRQDSNGKLRYFDLTTGIQAKGQFVTIGQETYYF SKDHGDAQLLPMVTEGH
YGTITLKQGQDTKTAWVYRDQNNTILKGLQNINGTLQFFDPYTGEQLKGGVAKYD
DKLFYFESGKGNLVSTVAGDYQDGHYIS QDGQTRYADKQNQLVKGLVTVNGALQ
YFDNATGNQIKNQQVIVDGKTYYFDDKGNGEYLFTNTLDMSTNAFSTKNVAFNHD
S S SFDHTVD GFLTADTWYRPKS ILANGTTWRD STDKDMRPLITVWWPNKNVQVNY
LNFMKANGLLTTAAQYTLH SD QYDLNQAAQDVQVAIERRIAS EHGTDWL QKLLFE
S QNNNP S FVKQ QFIWNKD S EYHG GGDAWFQ GGYLKYGNNPLTPTTN S DYRQP GN
AFDFLLANDVDNSNPVVQAENLNWLHYLMNFGTITAGQDDANFDSIRIDAVDFIHN
DTIQRTYDYLRDAYQVQQ SEAKANQHISLVEAGLDAGT STIHNDALIESNLREAATL
SLTNEPGKNKPLTNMLQDVDGGTLITDHTQNSTENQATPNY SIIHAHDKGVQEKVG
AAITDATGADWTNFTDEQLKAGLELFYKDQRATNKKYNSYNIP SIYALMLTNKDT
VPRMYYGDMYQDDGQYMANKSIYYDALVSLMTARKSYVSGGQTMSVDNHGLLK
SVRF GKDAMTANDL GT SATRTEGLGVIIGNDPKLQLNDSDKVTLDMGAAHKNQKY
RAVILTTRD GLATFN S D QAPTAWTND Q GTLTF SNQEINGQDNTQ IRGVANP QV S GY
LAVWVPVGASDNQDARTAATTTENHDGKVLHSNAALDSNLIYEGF SNFQPKATTH
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NTPTKYGTDGDLRATIQALHHANMQVMADVVDNQVYNLPGKEVVSATRAGVYG
NDDATGFGTQLYVTNSVGGGQYQEKYAGQYLEALKAKYPDLFEGKAYDYWYKN
YAND G SNPYYTL SHGDRESIPADVAIKQWSAKYMNGTNVLGNGMGYVLKDWHN
GQYFKLDGDKSTLPKGGRADPAFLYKVVSAWSHPQFEK
Série SEQ ID NO: 14: (Protéine = séquence de la glucane-saccharase ASDg (Amylosaccharase de Deinococcus geothermalis)) MLKDVLTSELAAQVRDAFDDDRDAETFLLRLERYGEDLWESLRAVYGD
QVRALPGRLLEVMLHAYHARPAELRRLDEARLLRPDWLQRPEMVGYVAYTDRFA
GTLKGVEERLDYLEGLGVKYLHLMPLLRPREGENDGGYAVQDYRAVRPDLGTMD
DL SALARALRGRGISLVLDLVLNHVAREHAWAQKARAGDPKYRAYFHLFPDRRGP
DAFEATLPEIFPDFAPGNF SWDEEIGEGEGGWVWTTFNSYQWDLNWANPDVFLEFV
DIILYLANRGVEVFRLDAIAFIWKRLGTDCQNQPEVHHLTRALRAAARIVAPAVAFK
AEAIVAPADLIHYLGTRAHHGKVSDMAYHNSLMVQLWSSLASRNTRLFEEALRAFP
PKPTSTTWGLYVRCHDDIGWAISDEDAARAGLNGAAHRHFLSDFYSGQFPGSFARG
LVFQYNPVNGDRRISGSAASLAGLEAALETGDPGRIEDAVRRLLLLHTVILGFGGVP
LLYMGDELALLNDYAFEDVPEHAPDNRWVHRPQMDWALAERVRQEPSSPAGRVN
TGLRHLLRVRRDTPQLHASIESQVLPSPDSRALLLRRDHPLGGMVQVYNFSEETVM
LPSHVLRDVLGDHVQDRLSGSAFRLDRPTVRLEGYRALWLTAGEAPA
Série SEQ ID NO : 15 : (Protéine = séquence de la glucane-saccharase DSR-S-OK (Dextrane-saccharase de Oenococcus kitaharae DSM17330)) MMATGSNLITAQADDLNQEGTAAQSVSPSTAAANQ SES SAQSTEQSATQ
AATDGEASTVSTAVTTITPHYVQQAGKWLYMGSDGEFVKGPQTIDGNLQFFDEQGI
QIKGSFETVDGS SYYFDSQSGNAVTGFKIINNDLHYFEEDGKETVNNYATDKQGNIF
YFDENGQMATGVKTIQGQSYYFDQDGHMRKGYSGVFDNQVLYFDKTTGALANTN
VSSIKEGLTAQNDDFTAHNAVYSTKSESFTNIDGYLTAEAWYRPADILENGTDWRA
SRADEFRPILTTWWPDKQTEVNYLNYMKTQGFITNDQDFKLSDDQLLLNHAAQSV
QGEIEKKISQQGSTDWLKTLLQTFINQQPSWNGESEDPGSDHLQGGALTFVNSPLTP
DSNSNFRLLNRTPTNQTGTPQYDTDASLGGFELLLANDVDNSNPVVQAEQLNWLY
YLLNFGSITADDPNANFDGIRIDAVDNVDADLLQIAAAYFKDAFKSGSNDQTTNQH
LSILEDWSHNDPEYMKAQGYPQLTMDDYMHTQLIWSLTKPDNIRGTMQRFMDYY
LVNRANDSTNNEAVANYSFVRAHDSEVQTVIAQIISDLYPNSGSGLIPTTDQLQAAF
EVYNADMKSDVKKYTQYNIPSAYAMLLTNKDTVPRVYYGDMYTDDGDYMANKS
PYFDAISTLLKARVKYAAGGQSMAVDKNDILTSVRFGQNAMLASDSGDNQTRQEG
IGVIVSNNSHLKLAENDQVVLHMGAAHKNQAFRALLLTIESGLENFDTDLQAPVKY
TDANGDLIFTAAELAGYLNPEVSGYLSAWVPVGAADNQDARTAADSATSTDGNVF
HSNAALDSNVIFEGFSNFQSIPTAEQHDDFTNVKIAENAGLFKDWGITSFQLAPQYRS
STDSTFLDSIIQNGYAFTDRYDLGFDTPTKYGDVDDLRAAIKALHANNIQVMADWV
PDQIYNLQNPEIITVNRTDSYGQPIAGSDLQNDLYLAYTNGGGQYQTKFGGAFLEKL
QQLYPDLFTKTQISTGQTIDPSQKITEWSAKYFNGSNIQGRGAYYVLRDSGTDQYFK
VISNDENEAFLPKQLTNQPGETGFSQDDQGIIFFSTSGYQAKNAFVQGDDGNYYYFD
NTGHMVTGPQTINGRHYLFFPNGVEAQNVFVQNDRGETYYYDQRGRQVANQYVT
DTNGNSFRFDENGIMLANQLAQVDGHWQFFKS SGVQAKDAFILGSDGKLRYFESG
GNISAIOIdIS AôDaNGIIHIAODNINA1G)11AADIAIDAôdIKSOKIANVSMaNDIIS 1 GDIODNISGITIOdAINSIIGIAaDDANVOAGOODASNAAIIAIOIDA?IdGAAINIGO
KINAHOVSAAaNGVHIDAIONIVAIGVIAIASIAIDVOHMIaIVMFIGOGIDANIdINID O
IGA?IGSIDADNIOAISGIDIGIIGNOGS PlAôdlnadLIOMSNIIGINNIIAANIVAO
NIMILdIAINOINISIDamNINSGIVVI\IIHIANDGINNOKIIADIVGONIGNIVOAdAA1 AVIADVAMNIIADNAVIGSODKIIAIOKIIIIGOHGKIMVIdVNINGOGANAIONGNI
IIIAIIVUAV ONINHVIDIAIHIII S G S NINITIO S SNISAIADIDONI?1SavioôDOVGIAIIGN
D DIAS IlAaD SNI\ILD GNKID GNINDIIAVIAIIODDVAANMIVNIAIIAIO aIVNAAI SN IV SZ
IAIAODOGIGGDAGOMAIGDAIA?IdAIGNI\IITTIVAVS dINAONA)DIAS OHOCRAIV
NIONIOIOOIALLIGSIAISIMININNADIIAIIHIAIGOIGNGHVHAISANIcIIIS S GNGS S ô PI
NAIGGVAINT1S KIVds3 dOEIN GlIVNIN SI S ONIAI?IfflIMNIS aiviv S ôNaAIIdIaDN d vaniSIHONIVAVaNIGIIDAIAINGTIGAV)DIVIOdGAISIVGDIIAISGINIVNISGNIVIIOO
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DOOIA(199dAaSGANAVIAOONIIS dôNIONIdVITHNIIMGINIDIaS ANNa ID' OVS av ONKIAIO GNIMIGIAAS I\IGIIDIO ô IAFINIANAO IGNI\IdMMAIMPLIGNGI SVAA1G
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NAODIdVINAASAINIONNIDadAAIIDGAIVIHONIôaDIHaGIAOHONAGKION S I
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IDAdIOIGVSAIIAVSADINAVIVIVVVAA1SNOSNAI)DPIniaxwaw ((ztc-a rnniN uinallp doisouodna7 ap per F'[-v) per Fel--27 aszumpans-aunang ni ap aauanbas = auyiaid) : 91 : OK ai ôas 09.?s IIODNIDINGGIAAIONIAdGIOSDONIOIDGOGIAOAODNIIOID S
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KIAIVGNIAIOODHGGIAIOWKW:YIDSAVODGVOIAAA?IDNIaSONdaNAVIAINIONI
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PET QI GE SVNYKYFI GN S DATYNMYHNLPNTV S LIN S QEGQIKTQQ SGVT SDYEGQQ
VQVTRQYTDSKGVSWNLITFAGGDLQGQKLWVDSRALTMTPFKTMNQISFISYAN
RNDGLFLNAPYQVKGYQLAGMSNQYKGQQVTIAGVANVSGKDWSLISFNGTQYW
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RAL STTIVQAMNDDMYVNSNQRTDGLWLNAPYTMSGAKWAGDTRSANGRYVHIS
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PYGEAGAQFVDYVTNYNQQTVPVTKQHSDAQGNQWYLATVNGTQYWIDQRSFSP
VVTKVVDYQAKIVPRTTRDGVF SGAPYGEVNAKLVNMATAYQNQVVHATGEYTN
ASGITWSQFALSGQEDKLWIDKRALQA
Série SEQ ID NO : 17: (Protéine = séquence de la glucane-saccharase ASR-C-del-bis (Alternane-saccharase tronquée de Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1355)) ME Q QETVTRKKLYKS GKVWVAAATAFAVLGV STVTTVHADTN SNVAV
KQINNTGTNDSGEKKVPVP STNND S LKQ GTD GFWYD S D GNRVD QKTNQILLTAE Q
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KAS SNVDIVNGKAQGYDAQGNQLKKSYVADS SGQTYYFDGNGQPLIGLQTIDGNL
QYFNQQGVQIKGGFQDVNNKRIYFAPNTGNAVANTEIINGKLQGRDANGNQVKNA
F S KDVAGNTFYFDANGVMLTGL QTI S GKTYYLDEQ GHLRKNYAGTFNNQFMYFDA
DT GAGKTAIEYQFD Q GLV S Q SNENTPHNAAKSYDKSSFENVDGYLTADTWYRPTDI
LKNGDTWTASTETDMRPLLMTWWPDKQTQANYLNFMS SKGLGITTTYTAATS QK
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LPSAYAMLLTNKDTVPRVYYGDMYLEGGQYMEKGTIYNPVISALLKARIKYVSGG
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LIFHKTNTFVKQDGTIINYEMKGSLNALISGYLGVWVPVGASDSQDARTVATESSSS
NDGSVFHSNAALDSNVIYEGF SNFQAMPTSPEQSTNVVIATKANLFKELGITSFELAP
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IEALHKNGMQAIADWVPDQIYALPGKEVVTATRVDERGNQLKDTDFVNLLYVANT
KSSGVDYQAKYGGEFLDKLREEYPSLFKQNQVSTGQPIDASTKIKQWSAKYMNGT
NILHRGAYYVLKDWATNQYFNIAKTNEVFLPLQLQNKDAQTGFISDASGVKYYSIS
GYQAKDTFIEDGNGNWYYFDKDGYMVRSQQGENPIRTVETSVNTRNGNYYFMPN
GVELRKGFGTDNSGNVYYFDDQGKMVRDKYINDDANNFYHLNVDGTMSRG
Série SEQ ID NO : 18 : (Protéine = séquence de la fructosyltransferase de Bacillus subtilis NCIMB 11871) MNIKKFAKQATVLTFTTALLAGGATQAFAKETNQKPYKETYGISHITRH
DMLQIPEQQKNEKYQVPEFDSSTIKNISSAKGLDVWDSWPLQNADGTVANYHGYHI
VFALAGDPKNADDTSIYMFYQKVGETSIDSWKNAGRVFKDSDKFDANDSILKDQT
QEWSGSATFTSDGKIRLFYTDFSGKHYGKQTLTTAQVNVSASDS SLNINGVEDYKSI
FDGDGKTYQNVQQFIDEGNYS SGDNHTLRDPHYVEDKGHKYLVFEANTGTEDGYQ
GEESLFNKAYYGKSTSFFRQESQKLLQSDKKRTAELANGALGMIELNDDYTLKKV
MKPLIASNTVTDEIERANVFKMNGKWYLFTDSRGSKMTIDGITSNDIYMLGYVSNS
LTGPYKPLNKTGLVLKMDLDPNDVTFTYSHFAVPQAKGNNVVITSYMTNRGFYAD
KQSTFAPSFLLNIKGKKTSVVKDSILEQGQLTVNK
Conversion du Glucosylation Enzymes saccharose (%) totale (g/L) oc-1,2-BrS 63,1 7,9 ASR 95,3 2,5 Tableau 14 Q 0 0 0 0 0> 0 0 0 0 ore ,n > . 0 0 0 0 Ziet 0 0 t 0 0 (f) 0.Q Ze e c:r rit e tx 0 a..õ7õ, z, E
- 0 0 0.
' F
a, , :=8Q Q Q 0 ità
I e, = - O. CU
SZ
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W 0 0. 0, 0 0 .0 0 0- 0 , =
O 4> Ot ,000 rQ
eõ.) 0,0.00000 40 r,i A 1 Ar < 0, 0 0 .17 r= g suo!lr3od Ratio : saccharose 73 mM / NNHEA
Glucosylation du NNHEA (g/L) 73 mM
Conversion du Glucosylation Enzymes NNHEA-Glcl NNHEA-G1c2 NNHEA-G1c3 saccharose (%) totale ASR >98 0,86 0,86 Traces 0 a-1,2-BrS 90 1,76 1,76 Traces 0 a-1,3-BrS >98 1,47 1,47 Traces 0 Tableau 16 CD
I-, I-, =P
--I
=P
1S4 goel- Mutants positifs .. .... _ . . :. =r= 2: ,r,',;.7 r.' '...' i:
, S T V iN Y
P
P226 0.6 0 0,07 0,89 0 0 0 0,81 0,59 0,62 0,65 0,78 0 0,29 :H:=:=:=:-0,73 0,77 0,6Ã 0,49 0,56 0 .., ....]
1228 0,49 0,75 0 0,05 0,07 0 0,96 :::::::::::::=:- 00,71 1,02 0,31 0,61 0,63 0 0,07 0,61 199 0,08 0,6 .=.=.=.=.=.=.=.=
-.., I, VI F 2 2 9 0 0.3 0 0 :::::::=:=:=:=:- 0 -:=:=:=:=:-:=:=: 0 0,51 0 0.52 1,66 0.2 0 0,02 0,04 0 0 0,51 0,67 1,5 ai A 2 8 9 ================ 2,311,2 0,66 0,13 1.77 0.34 1,46 0,09 0.25 2,88 2,61 0,85 5,11 0,18 2,59 2.49 2,06 1,19 0 :=:=:-:=:=:=:=:-....]
' F290 2,03 7,17 0,41 1,46 :.:.:-:.:.:.:.:: 2,41 0,4 2,73 1,91 6,58 2,85 0 0,84 1,81 1,54 2,34 2,55 8,99 5,28 0,62 LA .:.:.:.:.:.:.:....
=
CI
z 0, 0 0 0.07 1,66 0 0.04 = 1330 0 0,08 0 0 0 0 0 :::=:-: :=:
=:=::- 0,05 0 1,1 0 0 .=.=.=.=.=.=.=.=
vi .2. V331 0 0.4 2,05 2,33 0,46 1,88 1,44 0,74 0,06 0.88 0,66 1,93 0 0 0,14 2,15 2.37 :::::-:=:=:=:=:-0,38 2,04 .=.=.=.=.=.=.=.=
D394 0 :=:-:=:=:=:=:-=
0 =============-: 0,31 0 0,3 0 =:=:=:=:-:=:=:= 0 0 0 0 0 0 0 0,02 0,16 0 0 0 0 -:=:=:=:=:-:=:=
P. =12=' 5 0 0,59 0 0 0.11 0,31 0 0 0.4 0,13 0,28 0,37 0 0,36 :=:=:-:=:=:=:=:: 0,25 0.49 0 0 024 -:=:=:=:=:-:=:=
md n ,-q m Tableau 17 so I-, ui ui ce =P
Co.) Ratio : saccharose 73 mM / NNHEA
Glucosylation du NNHEA (g/L) 73 mM
Conversion du Glucosylation Enzymes NNHEA-Glcl NNHEA-G1c2 NNHEA-G1c3 saccharose (%) totale ASNp sauvage 98 1,7 1,7 0 0 A289Q 99 5,1 5,1 0 0 F290C 69 7,2 7,2 Traces 0 F290L 89 6,6 6,6 Traces 0 F290V 99 9,0 9,0 Traces 0 F290W 68 5,3 3,0 2,3 0 Tableau 18 Ratio : saccharose 146 mM /
Glucosylation du HEAA (g/L) HEAA 438 mM
Conversion du Glucosylation Enzymes saccharose (%) totale ASR 92 2,8 oc-1,3-BrS 97 2,4 D394E 81 3,9 Fructosyltransférase de Bacillus subtilis du 99,2 0,08 Tableau I
Tableau 19 Ratio : saccharose 146 mM / HEAA
Glucosylation du HEAA (g/L) 348 mM
Conversion du Glucosylation Enzymes HEAA-Glcl HEAA-G1c2 HEAA-G1c3 saccharose (%) totale ASR 92 2,823 0,851 1,54 0,431 oc-1,3-BrS 97 2,441 2,441 Traces 0 D394E 81 3,883 3,883 Traces 0 Tableau 20 SEQUENCES :
Série SEQ ID NO: 1 : (Protéine = séquence de la glucane-saccharase ASNp sauvage (Amylosucrase Neisseria polysaccharea)) SPNS QYLKTRILDIYTPEQRAGIEKSEDWRQF SRRMDTHFPKLMNELD SV
YGNNEALLPMLEMLLAQAWQ SYS QRNS SLKDIDIARENNPDWIL SNKQVGGVCYV
DLFAGDLKGLKDKIPYF QEL GL TYLHLMPLFKC PE GKS D GGYAV S SYRDVNPAL GT
I GDLREVIAALHEAGI SAVVDFIFNHT SNEHEWAQRCAAGDPLFDNFYYIFPDRRMP
D QYDRTLREIFPD QHP GGF S QLED GRWVWTTFNSFQWDLNYSNPWVFRAMAGEM
LFLANLGVDILRMDAVAFIWKQMGT S CENLPQAHALIRAFNAVMRIAAPAVFFKSE
AIVHPD QVVQYI GQDE C QI GYNPL QMALLWNTLATREVNLLHQALTYRHNLPEHT
AWVNYVRS HDDI GWTFADEDAAYL GI S GYD HRQFLNRFFVNRFD G S FARGVPF QY
NP STGDCRVS GTAAALVGLAQDDPHAVDRIKLLYSIALSTGGLPLIYLGDEVGTLND
DDWS QD SNKSDD SRWAHRPRYNEALYAQRNDP STAAGQIYQDLRHMIAVRQ SNP
RFDGGRLVTFNTNNKHIIGYIRNNALLAFGNF SEYPQTVTAHTLQAMPFKAHDLIGG
KTVSLNQDLTLQPYQVMWLEIA
Série SEQ ID NO : 2 : (Protéines = séquences mutées de la glucane-saccharase ASNp (Amylosucrase Neisseria polysaccharea) R226X1) SPNS QYLKTRILDIYTPEQRAGIEKSEDWRQF SRRMDTHFPKLMNELD SV
YGNNEALLPMLEMLLAQAWQ SYS QRNS SLKDIDIARENNPDWIL SNKQVGGVCYV
DLFAGDLKGLKDKIPYF QEL GL TYLHLMPLFKC PE GKS D GGYAV S SYRDVNPAL GT
I GDLREVIAALHEAGI SAVVDFIFNHT SNEHEWAQRCAAGDPLFDNFYYIFPDRRMP
LFLANLGVDILRMDAVAFIWKQMGT S CENLPQAHALIRAFNAVMRIAAPAVFFKSE
AIVHPD QVVQYI GQDE C QI GYNPL QMALLWNTLATREVNLLHQALTYRHNLPEHT
AWVNYVRS HDDI GWTFADEDAAYL GI S GYD HRQFLNRFFVNRFD G S FARGVPF QY
NP STGDCRVS GTAAALVGLAQDDPHAVDRIKLLYSIALSTGGLPLIYLGDEVGTLND
DDWS QD SNKSDD SRWAHRPRYNEALYAQRNDP STAAGQIYQDLRHMIAVRQ SNP
RFDGGRLVTFNTNNKHIIGYIRNNALLAFGNF SEYPQTVTAHTLQAMPFKAHDLIGG
KTVSLNQDLTLQPYQVMWLEIA
Série SEQ ID NO : 3 : (Protéines = séquences mutées de la glucane-saccharase ASNp (Amylosucrase Neisseria polysaccharea) 1228X2) SPNSQYLKTRILDIYTPEQRAGIEKSEDWRQFSRRMDTHFPKLMNELDSV
YGNNEALLPMLEMLLAQAWQ SYS QRNS SLKDIDIARENNPDWIL SNKQVGGVCYV
DLFAGDLKGLKDKIPYF QELGLTYLHLMPLFKC PE GKS D GGYAV S SYRDVNPAL GT
I GDLREVIAALHEAGI SAVVDFIFNHT SNEHEWAQRCAAGDPLFDNFYYIFPDRRMP
MLFLANLGVDILRMDAVAFIWKQMGT S CENLPQAHALIRAFNAVMRIAAPAVFFKS
EAIVHPDQVVQYIGQDEC QIGYNPLQMALLWNTLATREVNLLHQALTYRHNLPEH
TAWVNYVRS HDDI GWTFADEDAAYLGI S GYDHRQFLNRFFVNRFD G S FARGVPF Q
YNP STGDCRVSGTAAALVGLAQDDPHAVDRIKLLYSIALSTGGLPLIYLGDEVGTLN
DDDWS QDSNKSDDSRWAHRPRYNEALYAQRNDP STAAGQIYQDLRHMIAVRQ SN
PRFDGGRLVTFNTNNKHIIGYIRNNALLAFGNF S EYPQ TVTAHTL QAMPFKAHDLI G
GKTVSLNQDLTLQPYQVMWLEIA
Série SEQ ID NO : 4 : (Protéines = séquences mutées de la glucane-saccharase ASNp (Amylosucrase Neisseria polysaccharea) F229X3) SPNS QYLKTRILDIYTPEQRAGIEKSEDWRQF S RRMDTHFPKLMNELD SV
YGNNEALLPMLEMLLAQAWQ SYS QRNS SLKDIDIARENNPDWIL SNKQVGGVCYV
DLFAGDLKGLKDKIPYF QELGLTYLHLMPLFKC PE GKS D GGYAV S SYRDVNPAL GT
I GDLREVIAALHEAGI SAVVDFIFNHT SNEHEWAQRCAAGDPLFDNFYYIFPDRRMP
MLFLANLGVDILRMDAVAFIWKQMGT S CENLPQAHALIRAFNAVMRIAAPAVFFKS
EAIVHPDQVVQYIGQDEC QIGYNPLQMALLWNTLATREVNLLHQALTYRHNLPEH
TAWVNYVRS HDDI GWTFADEDAAYLGI S GYDHRQFLNRFFVNRFD G S FARGVPF Q
YNP STGDCRVSGTAAALVGLAQDDPHAVDRIKLLYSIALSTGGLPLIYLGDEVGTLN
DDDWS QD SNKS DD S RWAHRPRYNEALYAQRNDP S TAAGQIYQDLRHMIAVRQ SN
PRFDGGRLVTFNTNNKHIIGYIRNNALLAFGNF S EYPQ TVTAHTL QAMPFKAHDLI G
GKTVSLNQDLTLQPYQVMWLEIA
SEQ ID NO: 5 : (Protéine = séquence mutée de la glucane-saccharase ASNp (Amylosucrase Neisseria polysaccharea) A289X4) SPNSQYLKTRILDIYTPEQRAGIEKSEDWRQF S RRMDTHFPKLMNELD SV
YGNNEALLPMLEMLLAQAWQ SYS QRNS SLKDIDIARENNPDWIL SNKQVGGVCYV
DLFAGDLKGLKDKIPYF QELGLTYLHLMPLFKC PE GKS D GGYAV S SYRDVNPAL GT
I GDLREVIAALHEAGI SAVVDFIFNHT SNEHEWAQRCAAGDPLFDNFYYIFPDRRMP
D QYDRTLREIFPD QHP GGF S QLEDGRWVWTTFNSFQWDLNYSNPWVFRAMAGEM
EAIVHPDQVVQYIGQDEC QIGYNPLQMALLWNTLATREVNLLHQALTYRHNLPEH
TAWVNYVRSHDDIGWTFADEDAAYLGIS GYDHRQFLNRFFVNRFD G S FARGVPF Q
YNP STGDCRVS GTAAALVGLAQDDPHAVDRIKLLYSIALSTGGLPLIYLGDEVGTLN
DDDWS QDSNKSDDSRWAHRPRYNEALYAQRNDP STAAGQIYQDLRHMIAVRQ SN
PRFDGGRLVTFNTNNKHIIGYIRNNALLAFGNF S EYPQ TVTAHTL QAMPFKAHDLI G
GKTVSLNQDLTLQPYQVMWLEIA
Série SEQ ID NO : 6 : (Protéines = séquences mutées de la glucane-saccharase ASNp (Amylosucrase Neisseria polysaccharea) F290X5) SPNSQYLKTRILDIYTPEQRAGIEKSEDWRQFSRRMDTHFPKLMNELDSV
YGNNEALLPMLEMLLAQAWQ SYS QRNS SLKDIDIARENNPDWIL SNKQVGGVCYV
DLFAGDLKGLKDKIPYF QELGLTYLHLMPLFKC PE GKS D GGYAV S SYRDVNPAL GT
I GDLREVIAALHEAGI SAVVDFIFNHT SNEHEWAQRCAAGDPLFDNFYYIFPDRRMP
D QYDRTLREIFPD QHP GGF S QLEDGRWVWTTFNSFQWDLNYSNPWVFRAMAGEM
EAIVHPDQVVQYIGQDEC QIGYNPLQMALLWNTLATREVNLLHQALTYRHNLPEH
TAWVNYVRSHDDIGWTFADEDAAYLGIS GYDHRQFLNRFFVNRFD G S FARGVPF Q
YNP STGDCRVS GTAAALVGLAQDDPHAVDRIKLLYSIALSTGGLPLIYLGDEVGTLN
DDDWS QDSNKSDDSRWAHRPRYNEALYAQRNDP STAAGQIYQDLRHMIAVRQ SN
PRFDGGRLVTFNTNNKHIIGYIRNNALLAFGNF SEYPQTVTAHTLQAMPFKAHDLIG
GKTVSLNQDLTLQPYQVMWLEIA
Série SEQ ID NO : 7 : (Protéines = séquences mutées de la glucane-saccharase ASNp (Amylosucrase Neisseria polysaccharea) 1330X6) SPNSQYLKTRILDIYTPEQRAGIEKSEDWRQF SRRMD THFPKLMNELD SV
YGNNEALLPMLEMLLAQAWQ SYS QRNS SLKDIDIARENNPDWILSNKQVGGVCYV
DLFAGDLKGLKDKIPYF QELGLTYLHLMPLFKC PE GKS D GGYAV S SYRDVNPAL GT
I GDLREVIAALHEAGI SAVVDFIFNHT SNEHEWAQRCAAGDPLFDNFYYIFPDRRMP
D QYDRTLREIFPD QHP GGF S QLEDGRWVWTTFNSFQWDLNYSNPWVFRAMAGEM
LFLANLGVDILRMDAVAFIWKQMGT S CENLPQAHALIRAFNAVMRIAAPAVFFKSE
TAWVNYVRSHDDIGWTFADEDAAYLGIS GYDHRQFLNRFFVNRFD G S FARGVPF Q
YNP STGDCRVS GTAAALVGLAQDDPHAVDRIKLLYSIALSTGGLPLIYLGDEVGTLN
DDDWS QDSNKSDDSRWAHRPRYNEALYAQRNDP STAAGQIYQDLRHMIAVRQ SN
PRFDGGRLVTFNTNNKHIIGYIRNNALLAFGNF S EYP QTVTAHTL QAMPFKAHDLI G
GKTVSLNQDLTLQPYQVMWLEIA
Série SEQ ID NO : 8 : (Protéines = séquences mutées de la glucane-saccharase ASNp (Amylosucrase Neisseria polysaccharea) V33 1X7) SPNSQYLKTRILDIYTPEQRAGIEKSEDWRQF SRRMD THFPKLMNELD SV
YGNNEALLPMLEMLLAQAWQ SYS QRNS SLKDIDIARENNPDWIL SNKQVGGVCYV
DLFAGDLKGLKDKIPYF QELGLTYLHLMPLFKC PE GKS D GGYAV S SYRDVNPAL GT
I GDLREVIAALHEAGI SAVVDFIFNHT SNEHEWAQRCAAGDPLFDNFYYIFPDRRMP
D QYDRTLREIFPD QHP GGF S QLEDGRWVWTTFNSFQWDLNYSNPWVFRAMAGEM
LFLANL GVDILRMDAVAFIWKQM GT S CENLPQAHALIRAFNAVMRIAAPAVFFKSE
AWVNYVRS HDDI GWTFADEDAAYL GI S GYD HRQFLNRFFVNRFD G S FARGVPF QY
NP STGDCRVS GTAAALVGLAQDDPHAVDRIKLLYSIALSTGGLPLIYLGDEVGTLND
DDWS QDSNKSDDSRWAHRPRYNEALYAQRNDPSTAAGQIYQDLRHMIAVRQ SNP
RFDGGRLVTFNTNNKHIIGYIRNNALLAFGNF S EYPQTVTAHTL QAMPFKAHD LI GG
KTVSLNQDLTLQPYQVMWLEIA
Série SEQ ID NO : 9 : (Protéines = séquences mutées de la glucane-saccharase ASNp (Amylosucrase Neisseria polysaccharea) D394X8) SPNSQYLKTRILDIYTPEQRAGIEKSEDWRQF SRRMD THFPKLMNELD SV
YGNNEALLPMLEMLLAQAWQ SYS QRNS SLKDIDIARENNPDWILSNKQVGGVCYV
DLFAGDLKGLKDKIPYF QELGLTYLHLMPLFKC PE GKS D GGYAV S SYRDVNPAL GT
I GDLREVIAALHEAGI SAVVDFIFNHT SNEHEWAQRCAAGDPLFDNFYYIFPDRRMP
D QYDRTLREIFPD QHP GGF S QLEDGRWVWTTFNSFQWDLNYSNPWVFRAMAGEM
LFLANL GVDILRMDAVAFIWKQM GT S CENLPQAHALIRAFNAVMRIAAPAVFFKSE
AIVHPD QVVQYI GQDE C QI GYNPL QMALLWNTLATREVNLLHQALTYRHNLPEHT
NP STGDCRVSGTAAALVGLAQDDPHAVDRIKLLYSIALSTGGLPLIYLGDEVGTLND
DDWS QDSNKSDDSRWAHRPRYNEALYAQRNDPSTAAGQIYQDLRHMIAVRQ SNP
RFDGGRLVTFNTNNKHIIGYIRNNALLAFGNF SEYPQTVTAHTLQAMPFKAHDLIGG
KTVSLNQDLTLQPYQVMWLEIA
SEQ ID NO: 10 : (Protéine = séquence mutée de la glucane-saccharase ASNp (Amylosucrase Neisseria polysaccharea) R446X9) SPNSQYLKTRILDIYTPEQRAGIEKSEDWRQF SRRMD THFPKLMNELD SV
YGNNEALLPMLEMLLAQAWQ SY SQRNS SLKDIDIARENNPDWILSNKQVGGVCYV
DLFAGDLKGLKDKIPYF QELGLTYLHLMPLFKC PE GKS D GGYAV S SYRDVNPAL GT
I GDLREVIAALHEAGI SAVVDFIFNHT SNEHEWAQRCAAGDPLFDNFYYIFPDRRMP
D QYDRTLREIFPD QHP GGF S QLEDGRWVWTTFNSFQWDLNYSNPWVFRAMAGEM
LFLANLGVDILRMDAVAFIWKQMGT S CENLPQAHALIRAFNAVMRIAAPAVFFKSE
AIVHPD QVVQYI GQDE C QI GYNPL QMALLWNTLATREVNLLHQALTYRHNLPEHT
AWVNYVRS HDDI GWTFADEDAAYL GI S GYD HRQFLNRFFVNRFD G S FARGVPF QY
DDDWS QDSNKSDDSRWAHRPRYNEALYAQRNDP STAAGQIYQDLRHMIAVRQ SN
PRFDGGRLVTFNTNNKHIIGYIRNNALLAFGNF S EYP QTVTAHTL QAMPFKAHD LI G
GKTVSLNQDLTLQPYQVMWLEIA
Série SEQ ID NO: 11: (Protéine = séquence de la DSR-S-A4N (Dextrane-saccharase tronquée DSR-S vardel A4N de Leuconostoc mesenteroides B-512F)) T Q QV S GKYVEKD G S WYYYFDD GKNAKGL S TIDNNIQYFYE S GKQAKG
QYVTIDNQTYYFDKG S GD ELTGL Q S ID GNIVAFNDE GQ QIFNQYYQ S EN GTTYYFD
DKGHAATGIKNIEGKNYYFDNLGQLKKGFSGVIDGQIMTFDQETGQEVSNTTSEIKE
GLTTQNTDYSEHNAAHGTDAEDFENIDGYLTAS SWYRPTGILRNGTDWEP STDTDF
RPIL SVWWPDKNTQVNYLNYMADLGFI SNAD S FET GD S Q SLLNEASNYVQKSIEMK
I SAQ Q STEWLKDAMAAFIVAQP QWNET S ED M SNDHL QNGALTYVN S PLTPDAN SN
FRLLNRTPTNQTGEQAYNLDNSKGGFELLLANQEDNSNVVVEAEQLNWLYYLMNF
GTITANDADANFD GIRVDAVDNVDADLLQ IAADYFKLAYGVD QNDATANQ HL S IL
EDWSHNDPLYVTDQGSNQLTMDDYVHTQLIWSLTKS SDIRGTMQRFVDYYMVDR
SNDSTENEAIPNYSFVRAHDSEVQTVIAQIVSDLYPDVENSLAPTTEQLAAAFKVYN
EDEKLADKKYTQYNMASAYAMLLTNKDTVPRVYYGDLYTDDGQYMATKSPYYD
AINTLLKARVQYVAGGQ S M SVD SNDVLT SVRYGKDAMTAS DT GT S ETRTE GI GVIV
SNNAELQLEDGHTVTLHMGAAHKNQAYRALL STTADGLAYYDTDENAPVAYTDA
NGDLIFTNE S IYGVQNP QV S GYLAVWVPVGAQ QD QDARTAS DTTTNT S DKVFH SN
AALDS QVIYEGF SNFQAFATDS SEYTNVVIAQNADQFKQWGVT SFQLAPQYRSSTD
T SFLDSIIQNGYAFTDRYDLGYGTPTKYGTADQLRDAIKALHASGIQAIADWVPDQI
YNLPEQELATVTRTNSFGDDDTDSDIDNALYVVQSRGGGQYQEMYGGAFLEELQA
LYP S LFKVNQI S TGVPID G SVKITEWAAKYFNG SNI Q GKGAGYVLKDM G SNKYFKV
V SNTED GDYLPKQLTNDL S ETGFTHDDKGIIYYTL S GYRAQNAFIQD DDNNYYYFD
KT GHLVT GL QKINNHTYFFLPNGIELVKS FL QNED GTIVYFDKKGHQVFD QYITD QN
GNAYYFDDAGVMLKSGLATIDGHQ QYFD QNGVQVKDKFVI GTD GYKYYFEP G S G
NLAILRYVQNSKNQWFYFDGNGHAVTGFQTINGKKQYFYNDGHQ S KGEFIDAD GD
TFYT SATDGRLVTGVQKINGITYAFDNTGNLITNQYYQLADGKYMLLDDSGRAKT
GFVLQDGVLRYFDQNGEQVKDAIIVDPDTNL S
Série SEQ ID NO : 12: (Protéine = séquence de la glucane-saccharase a-1,2 BrS (a-1,2 BrS de Leuconostoc citreum NRRL B-1299)) MRQKETITRKKLYKSGKSWVAAATAFAVMGVSAVTTVSADTQTPVGT
TQSQQDLTGQRGQDKPTTKEVIDKKEPVPQVSAQNAGDLSADAKTTKADDKQDTQ
PTNAQLPDQGNKQTNSNSDKGVKESTTAPVKTTDVPSKSVTPETNTSINGGQYVEK
DGQFVYIDQSGKQVSGLQNIEGHTQYFDPKTGYQTKGELKNIDDNAYYFDKNSGN
GRTFTKISNGSYSEKDGMWQYVDSHDKQPVKGLYDVEGNLQYFDLSTGNQAKHQI
RSVDGVTYYFDADSGNATAFKAVTNGRYAEQTTKDKDGNETSYWAYLDNQGNAI
KGLNDVNGEIQYFDEHTGEQLKGHTATLDGTTYYFEGNKGNLVSVVNTAPTGQYK
INGDNVYYLDNNNEAIKGLYGINGNLNYFDLATGIQLKGQAKNIDGIGYYFDKDTG
NGSYQYTLMAPSNKNDYTQHNVVNNLSESNFKNLVDGFLTAETWYRPAQILSHGT
DWVASTDKDFRPLITVWWPNKDIQVNYLRLMQNEGVLNQSAVYDLNTDQLLLNE
AAQQAQIGIEKKISQTGNTDWLNNVLFTTHDGQPSFIKQQYLWNSDSEYHTGPFQG
GYLKYQNSDLTPNVNSKYRNADNSLDFLLANDVDNSNPIVQAEDLNWLYYLLNFG
SITTQGKENNSNFDSIRIDAVDFVSNDLIQRTYDYLRAAYGVDKNDKEANAHLSLVE
AGLDAGTTTIHQDALIESDIREAMKKSLTNGPGSNISLSNLIQDKEGDKLIADRANNS
TENVAIPNYSIIHAHDKDIQDKVGAAITDATGADWTNFTPEQLQKGLSLYYEDQRKI
EKKYNQYNIPSAYALLLTNKDTVPRVYYGDMYQDDGQYMQKQSLYFDTITALME
ARKQFVAGGQTINVDDNGVLTSVRFGKGAMTANDIGTNETRTQGIGVVIANDPSLK
LSKDSKVTLHMGAAHRNQNYRALLLTTDNGIDSYSSSKNAPVIKTDDNGDLVFSNQ
DINDQLNTKVHGFLNSEVSGYLSAWVPLDATEQQDARTLPSEKSVNDGKVLHSNA
ALDSNLIYEAFSNFQPMPTNRNEYTNVVIADKADTFKSWGITSFEMAPQYRSSQDKT
FLDSTIDNGYAFTDRYDLGFEKPTKYGNDEDLRQAIKQLHSSGMQVMADVVANQI
YNLPGKEVASTNRVDWNGNNLSTPFGTQMYVVNTVGGGKYQNKYGGEFLDKLK
AAYPDIFRSKNYEYDVKNYGGNGTGSVYYTVDSKTRAELDTDTKIKEWSAKYMN
GTNVLGLGMGYVLKDWQTGQYFNVSNQNMKFLLPSDLISNDITVQLGVPVTDKKII
FDPASAYNMYSNLPEDMQVMDYQDDKKSTPSIKPLSSYNNKQVQVTRQYTDSKGV
SWNLITFAGGDLQGQKLWVDSRALTMTPFKTMNQISFISYANRNDGLFLNAPYQVK
GYQLAGMSNQYKGQQVTIAGVANVSGKDWSLISFNGTQYWIDSQALNTNFTHDM
NQKVFVNTTSNLDGLFLNAPYRQPGYKLAGLAKNYNNQTVTVSQQYFDDQGTVW
SQVVLGGQTVWVDNHALAQMQVRDTNQQLYVNSNGRNDGLFLNAPYRGQGSQLI
GMTADYNGQHVQVTKQGQDAYGAQWRLITLNNQQVWVDSRALSTTIMQAMNDD
MYVNSSQRTDGLWLNAPYTMSGAKWAGDTRSANGRYVHISKAYSNEVGNTYYLT
NLNGQSTWIDKRAFTATFDQVVALNATIVARQRPDGMFKTAPYGEAGAQFVDYVT
NYNQQTVPVTKQHSDAQGNQWYLATVNGTQYWIDQRSFSPVVTKVVDYQAKIVP
RTTRDGVFSGAPYGEVNAKLVNMATAYQNQVVHATGEYTNASGITWSQFALSGQ
EDKLWIDKRALQA
Série SEQ ID NO : 13 : (Protéine = séquence de la glucane-saccharase GBD-CD2 (Dextrane-sucrase tronquée DSR-E de Leuconostoc mesenteroides NRRL
B-1299)) MAHHHHHHVTSLYKKAGSAAAPFTMAQAGHYITKNGNDWQYDTNGE
LAKGLRQDSNGKLRYFDLTTGIQAKGQFVTIGQETYYF SKDHGDAQLLPMVTEGH
YGTITLKQGQDTKTAWVYRDQNNTILKGLQNINGTLQFFDPYTGEQLKGGVAKYD
DKLFYFESGKGNLVSTVAGDYQDGHYIS QDGQTRYADKQNQLVKGLVTVNGALQ
YFDNATGNQIKNQQVIVDGKTYYFDDKGNGEYLFTNTLDMSTNAFSTKNVAFNHD
S S SFDHTVD GFLTADTWYRPKS ILANGTTWRD STDKDMRPLITVWWPNKNVQVNY
LNFMKANGLLTTAAQYTLH SD QYDLNQAAQDVQVAIERRIAS EHGTDWL QKLLFE
S QNNNP S FVKQ QFIWNKD S EYHG GGDAWFQ GGYLKYGNNPLTPTTN S DYRQP GN
AFDFLLANDVDNSNPVVQAENLNWLHYLMNFGTITAGQDDANFDSIRIDAVDFIHN
DTIQRTYDYLRDAYQVQQ SEAKANQHISLVEAGLDAGT STIHNDALIESNLREAATL
SLTNEPGKNKPLTNMLQDVDGGTLITDHTQNSTENQATPNY SIIHAHDKGVQEKVG
AAITDATGADWTNFTDEQLKAGLELFYKDQRATNKKYNSYNIP SIYALMLTNKDT
VPRMYYGDMYQDDGQYMANKSIYYDALVSLMTARKSYVSGGQTMSVDNHGLLK
SVRF GKDAMTANDL GT SATRTEGLGVIIGNDPKLQLNDSDKVTLDMGAAHKNQKY
RAVILTTRD GLATFN S D QAPTAWTND Q GTLTF SNQEINGQDNTQ IRGVANP QV S GY
LAVWVPVGASDNQDARTAATTTENHDGKVLHSNAALDSNLIYEGF SNFQPKATTH
DELTNVVIAKNADVFNNWGIT SFEMAPQYRS S GD HTFLD STIDNGYAFTD RYDL GF
NTPTKYGTDGDLRATIQALHHANMQVMADVVDNQVYNLPGKEVVSATRAGVYG
NDDATGFGTQLYVTNSVGGGQYQEKYAGQYLEALKAKYPDLFEGKAYDYWYKN
YAND G SNPYYTL SHGDRESIPADVAIKQWSAKYMNGTNVLGNGMGYVLKDWHN
GQYFKLDGDKSTLPKGGRADPAFLYKVVSAWSHPQFEK
Série SEQ ID NO: 14: (Protéine = séquence de la glucane-saccharase ASDg (Amylosaccharase de Deinococcus geothermalis)) MLKDVLTSELAAQVRDAFDDDRDAETFLLRLERYGEDLWESLRAVYGD
QVRALPGRLLEVMLHAYHARPAELRRLDEARLLRPDWLQRPEMVGYVAYTDRFA
GTLKGVEERLDYLEGLGVKYLHLMPLLRPREGENDGGYAVQDYRAVRPDLGTMD
DL SALARALRGRGISLVLDLVLNHVAREHAWAQKARAGDPKYRAYFHLFPDRRGP
DAFEATLPEIFPDFAPGNF SWDEEIGEGEGGWVWTTFNSYQWDLNWANPDVFLEFV
DIILYLANRGVEVFRLDAIAFIWKRLGTDCQNQPEVHHLTRALRAAARIVAPAVAFK
AEAIVAPADLIHYLGTRAHHGKVSDMAYHNSLMVQLWSSLASRNTRLFEEALRAFP
PKPTSTTWGLYVRCHDDIGWAISDEDAARAGLNGAAHRHFLSDFYSGQFPGSFARG
LVFQYNPVNGDRRISGSAASLAGLEAALETGDPGRIEDAVRRLLLLHTVILGFGGVP
LLYMGDELALLNDYAFEDVPEHAPDNRWVHRPQMDWALAERVRQEPSSPAGRVN
TGLRHLLRVRRDTPQLHASIESQVLPSPDSRALLLRRDHPLGGMVQVYNFSEETVM
LPSHVLRDVLGDHVQDRLSGSAFRLDRPTVRLEGYRALWLTAGEAPA
Série SEQ ID NO : 15 : (Protéine = séquence de la glucane-saccharase DSR-S-OK (Dextrane-saccharase de Oenococcus kitaharae DSM17330)) MMATGSNLITAQADDLNQEGTAAQSVSPSTAAANQ SES SAQSTEQSATQ
AATDGEASTVSTAVTTITPHYVQQAGKWLYMGSDGEFVKGPQTIDGNLQFFDEQGI
QIKGSFETVDGS SYYFDSQSGNAVTGFKIINNDLHYFEEDGKETVNNYATDKQGNIF
YFDENGQMATGVKTIQGQSYYFDQDGHMRKGYSGVFDNQVLYFDKTTGALANTN
VSSIKEGLTAQNDDFTAHNAVYSTKSESFTNIDGYLTAEAWYRPADILENGTDWRA
SRADEFRPILTTWWPDKQTEVNYLNYMKTQGFITNDQDFKLSDDQLLLNHAAQSV
QGEIEKKISQQGSTDWLKTLLQTFINQQPSWNGESEDPGSDHLQGGALTFVNSPLTP
DSNSNFRLLNRTPTNQTGTPQYDTDASLGGFELLLANDVDNSNPVVQAEQLNWLY
YLLNFGSITADDPNANFDGIRIDAVDNVDADLLQIAAAYFKDAFKSGSNDQTTNQH
LSILEDWSHNDPEYMKAQGYPQLTMDDYMHTQLIWSLTKPDNIRGTMQRFMDYY
LVNRANDSTNNEAVANYSFVRAHDSEVQTVIAQIISDLYPNSGSGLIPTTDQLQAAF
EVYNADMKSDVKKYTQYNIPSAYAMLLTNKDTVPRVYYGDMYTDDGDYMANKS
PYFDAISTLLKARVKYAAGGQSMAVDKNDILTSVRFGQNAMLASDSGDNQTRQEG
IGVIVSNNSHLKLAENDQVVLHMGAAHKNQAFRALLLTIESGLENFDTDLQAPVKY
TDANGDLIFTAAELAGYLNPEVSGYLSAWVPVGAADNQDARTAADSATSTDGNVF
HSNAALDSNVIFEGFSNFQSIPTAEQHDDFTNVKIAENAGLFKDWGITSFQLAPQYRS
STDSTFLDSIIQNGYAFTDRYDLGFDTPTKYGDVDDLRAAIKALHANNIQVMADWV
PDQIYNLQNPEIITVNRTDSYGQPIAGSDLQNDLYLAYTNGGGQYQTKFGGAFLEKL
QQLYPDLFTKTQISTGQTIDPSQKITEWSAKYFNGSNIQGRGAYYVLRDSGTDQYFK
VISNDENEAFLPKQLTNQPGETGFSQDDQGIIFFSTSGYQAKNAFVQGDDGNYYYFD
NTGHMVTGPQTINGRHYLFFPNGVEAQNVFVQNDRGETYYYDQRGRQVANQYVT
DTNGNSFRFDENGIMLANQLAQVDGHWQFFKS SGVQAKDAFILGSDGKLRYFESG
GNISAIOIdIS AôDaNGIIHIAODNINA1G)11AADIAIDAôdIKSOKIANVSMaNDIIS 1 GDIODNISGITIOdAINSIIGIAaDDANVOAGOODASNAAIIAIOIDA?IdGAAINIGO
KINAHOVSAAaNGVHIDAIONIVAIGVIAIASIAIDVOHMIaIVMFIGOGIDANIdINID O
IGA?IGSIDADNIOAISGIDIGIIGNOGS PlAôdlnadLIOMSNIIGINNIIAANIVAO
NIMILdIAINOINISIDamNINSGIVVI\IIHIANDGINNOKIIADIVGONIGNIVOAdAA1 AVIADVAMNIIADNAVIGSODKIIAIOKIIIIGOHGKIMVIdVNINGOGANAIONGNI
IIIAIIVUAV ONINHVIDIAIHIII S G S NINITIO S SNISAIADIDONI?1SavioôDOVGIAIIGN
D DIAS IlAaD SNI\ILD GNKID GNINDIIAVIAIIODDVAANMIVNIAIIAIO aIVNAAI SN IV SZ
IAIAODOGIGGDAGOMAIGDAIA?IdAIGNI\IITTIVAVS dINAONA)DIAS OHOCRAIV
NIONIOIOOIALLIGSIAISIMININNADIIAIIHIAIGOIGNGHVHAISANIcIIIS S GNGS S ô PI
NAIGGVAINT1S KIVds3 dOEIN GlIVNIN SI S ONIAI?IfflIMNIS aiviv S ôNaAIIdIaDN d vaniSIHONIVAVaNIGIIDAIAINGTIGAV)DIVIOdGAISIVGDIIAISGINIVNISGNIVIIOO
INIIAIIAKIMNIIOqVOAAdNISNIGAGNIVTLITIONIRDIAGdKINIVAdrIGSKOAVIA OZ
DOOIA(199dAaSGANAVIAOONIIS dôNIONIdVITHNIIMGINIDIaS ANNa ID' OVS av ONKIAIO GNIMIGIAAS I\IGIIDIO ô IAFINIANAO IGNI\IdMMAIMPLIGNGI SVAA1G
ID HS IIOVcDIAM iavild9 GAINNINIMVS ININAVKH ô S AAGNAAdDil S A?1/109I\I
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NAODIdVINAASAINIONNIDadAAIIDGAIVIHONIôaDIHaGIAOHONAGKION S I
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NaAAO DOMS INILadVASNS dAGIINAdVIIS aNADNGSKS NILONNIDOGdIOVNIL d OIGONGGVNdINVGVSIGOAKOVSAôdAda)DIGIAaNIIdNGODIODEIGOOSOI 0 I
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RNDGLFLNAPYQVKGYQLAGMSNQYKGQQVTIAGVANVSGKDWSLISFNGTQYW
ID S QALNTNFTHDMNQKVFVNTTSNLDGLFLNAPYRQPGYKLAGLAKNYNNQTVT
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KAYSNEVGNTYYLTNLNGQ STWIDKRAFTATFDQVVALNATIVARQRPDGMFKTA
PYGEAGAQFVDYVTNYNQQTVPVTKQHSDAQGNQWYLATVNGTQYWIDQRSFSP
VVTKVVDYQAKIVPRTTRDGVF SGAPYGEVNAKLVNMATAYQNQVVHATGEYTN
ASGITWSQFALSGQEDKLWIDKRALQA
Série SEQ ID NO : 17: (Protéine = séquence de la glucane-saccharase ASR-C-del-bis (Alternane-saccharase tronquée de Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1355)) ME Q QETVTRKKLYKS GKVWVAAATAFAVLGV STVTTVHADTN SNVAV
KQINNTGTNDSGEKKVPVP STNND S LKQ GTD GFWYD S D GNRVD QKTNQILLTAE Q
LKKNNEKNLSVISDDTSKKDDENISKQTKIANQQTVDTAKGLTTSNLSDPITGGHYE
NHNGYFVYIDAS GKQVT GL QNID GNLQYFDDN GYQVKG S FRDVNGKHIYFD SVT G
KAS SNVDIVNGKAQGYDAQGNQLKKSYVADS SGQTYYFDGNGQPLIGLQTIDGNL
QYFNQQGVQIKGGFQDVNNKRIYFAPNTGNAVANTEIINGKLQGRDANGNQVKNA
F S KDVAGNTFYFDANGVMLTGL QTI S GKTYYLDEQ GHLRKNYAGTFNNQFMYFDA
DT GAGKTAIEYQFD Q GLV S Q SNENTPHNAAKSYDKSSFENVDGYLTADTWYRPTDI
LKNGDTWTASTETDMRPLLMTWWPDKQTQANYLNFMS SKGLGITTTYTAATS QK
TLNDAAFVI QTAIE Q QI SLKKS TEWLRDAID S FVKTQANWNKQTEDEAFD GL QWL Q
GGFLAYQDDSHRTPNTDSGNNRKLGRQPINIDGSKDTTDGKGSEFLLANDIDNSNPI
VQAEQLNWLHYLMNFGSITGNNDNANFDGIRVDAVDNVDADLLKIAGDYFKALY
GTDKSDANANKHL SILEDWNGKDPQYVNQQGNAQLTMDYTVT S QFGNSLTHGAN
NRSNMWYFLDTGYYLNGDLNKKIVDKNRPNSGTLVNRIANSGDTKVIPNYSFVRA
HDYDAQDPIRKAMIDHGIIKNMQDTFTFDQLAQGMEFYYKDQENP SGFKKYNDYN
LPSAYAMLLTNKDTVPRVYYGDMYLEGGQYMEKGTIYNPVISALLKARIKYVSGG
QTMATDS SGKDLKDGETDLLTSVRFGKGIMTSDQTTTQDNSQDYKNQGIGVIVGN
NPDLKLNNDKTITLHMGKAHKNQLYRALVLSNDSGIDVYDSDDKAPTLRTNDNGD
LIFHKTNTFVKQDGTIINYEMKGSLNALISGYLGVWVPVGASDSQDARTVATESSSS
NDGSVFHSNAALDSNVIYEGF SNFQAMPTSPEQSTNVVIATKANLFKELGITSFELAP
QYRSSGDTNYGGMSFLDSFLNNGYAFTDRYDLGFNKADGNPNPTKYGTDQDLRNA
IEALHKNGMQAIADWVPDQIYALPGKEVVTATRVDERGNQLKDTDFVNLLYVANT
KSSGVDYQAKYGGEFLDKLREEYPSLFKQNQVSTGQPIDASTKIKQWSAKYMNGT
NILHRGAYYVLKDWATNQYFNIAKTNEVFLPLQLQNKDAQTGFISDASGVKYYSIS
GYQAKDTFIEDGNGNWYYFDKDGYMVRSQQGENPIRTVETSVNTRNGNYYFMPN
GVELRKGFGTDNSGNVYYFDDQGKMVRDKYINDDANNFYHLNVDGTMSRG
Série SEQ ID NO : 18 : (Protéine = séquence de la fructosyltransferase de Bacillus subtilis NCIMB 11871) MNIKKFAKQATVLTFTTALLAGGATQAFAKETNQKPYKETYGISHITRH
DMLQIPEQQKNEKYQVPEFDSSTIKNISSAKGLDVWDSWPLQNADGTVANYHGYHI
VFALAGDPKNADDTSIYMFYQKVGETSIDSWKNAGRVFKDSDKFDANDSILKDQT
QEWSGSATFTSDGKIRLFYTDFSGKHYGKQTLTTAQVNVSASDS SLNINGVEDYKSI
FDGDGKTYQNVQQFIDEGNYS SGDNHTLRDPHYVEDKGHKYLVFEANTGTEDGYQ
GEESLFNKAYYGKSTSFFRQESQKLLQSDKKRTAELANGALGMIELNDDYTLKKV
MKPLIASNTVTDEIERANVFKMNGKWYLFTDSRGSKMTIDGITSNDIYMLGYVSNS
LTGPYKPLNKTGLVLKMDLDPNDVTFTYSHFAVPQAKGNNVVITSYMTNRGFYAD
KQSTFAPSFLLNIKGKKTSVVKDSILEQGQLTVNK
Claims (11)
1. Procédé de fabrication d'un synthon glycosylé, ou monomère, comprenant au moins une étape de mise en présence d'au moins une glycane-saccharase avec au moins un synthon hydroxylé et au moins un saccharose, dans lequel :
(A) ledit synthon hydroxylé est choisi dans le groupe constitué :
(i) des synthons (méth)acrylates/(méth)acrylamides de formule (I) :
dans laquelle :
R1 représente un atome d'hydrogène ou un alkyle en C1-C3 ;
R2 représente un groupement alkylène en C1-C20 ; ou un groupement (C2H4O)n, avec n étant un entier compris entre 1 et 10 ; et X1 représente ¨(O)¨, ¨(NH)¨, -(S)- ou ¨(NR'2(OH))¨, de préférence ¨(O)¨, ¨(NH)¨ ou ¨(NR' 2 (OH))¨, avec R' 2 représentant un groupement alkylène en C1-C20 ; ou un groupement ¨(C2H4O)m¨, avec m étant un entier compris entre 1 et 10 ;
(ii) des synthons styréniques de formule (II) :
dans laquelle R3 représente une liaison covalente ; un groupement alkylène en C1-C20 ; ou un groupement (C2H40)n, avec n étant un entier compris entre 1 et 10 ;
(iii) des synthons N-Carboxyanhydride (NCA) de formule (III) :
dans laquelle R4 représente une liaison covalente ; un groupement alkylène en C1-C20; ou un groupement (C2H40)n, avec n étant un entier compris entre 1 et 10 ;
(iv) des synthons lactones/lactames/thiolactones de formule (IV) :
dans laquelle :
R5 représente une liaison covalente ; un groupement alkylène en C1-C20 ; ou un groupement (C2H40)m, avec m étant un entier compris entre 1 et 10 ;
n représente un entier compris entre 1 et 20 ;
X2 représente -(O)-, -(NH)- ou -(S)- ; et R6 représente un hydrogène ou un groupement alkyle en C1-C20 ;
(v) des synthons de formule (V) :
dans laquelle R7 représente un groupement alkylène en C1-C20 ; et (vi) des synthons de formule (VI) :
dans laquelle R8 représente un groupement alkylène en C1-C20; et (B) ladite glycane-saccharase est choisi dans le groupe constitué des glycoside-hydrolases appartenant aux familles 13, 68 et 70 des glycoside-hydrolases.
(A) ledit synthon hydroxylé est choisi dans le groupe constitué :
(i) des synthons (méth)acrylates/(méth)acrylamides de formule (I) :
dans laquelle :
R1 représente un atome d'hydrogène ou un alkyle en C1-C3 ;
R2 représente un groupement alkylène en C1-C20 ; ou un groupement (C2H4O)n, avec n étant un entier compris entre 1 et 10 ; et X1 représente ¨(O)¨, ¨(NH)¨, -(S)- ou ¨(NR'2(OH))¨, de préférence ¨(O)¨, ¨(NH)¨ ou ¨(NR' 2 (OH))¨, avec R' 2 représentant un groupement alkylène en C1-C20 ; ou un groupement ¨(C2H4O)m¨, avec m étant un entier compris entre 1 et 10 ;
(ii) des synthons styréniques de formule (II) :
dans laquelle R3 représente une liaison covalente ; un groupement alkylène en C1-C20 ; ou un groupement (C2H40)n, avec n étant un entier compris entre 1 et 10 ;
(iii) des synthons N-Carboxyanhydride (NCA) de formule (III) :
dans laquelle R4 représente une liaison covalente ; un groupement alkylène en C1-C20; ou un groupement (C2H40)n, avec n étant un entier compris entre 1 et 10 ;
(iv) des synthons lactones/lactames/thiolactones de formule (IV) :
dans laquelle :
R5 représente une liaison covalente ; un groupement alkylène en C1-C20 ; ou un groupement (C2H40)m, avec m étant un entier compris entre 1 et 10 ;
n représente un entier compris entre 1 et 20 ;
X2 représente -(O)-, -(NH)- ou -(S)- ; et R6 représente un hydrogène ou un groupement alkyle en C1-C20 ;
(v) des synthons de formule (V) :
dans laquelle R7 représente un groupement alkylène en C1-C20 ; et (vi) des synthons de formule (VI) :
dans laquelle R8 représente un groupement alkylène en C1-C20; et (B) ladite glycane-saccharase est choisi dans le groupe constitué des glycoside-hydrolases appartenant aux familles 13, 68 et 70 des glycoside-hydrolases.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la glycane saccharase est choisie dans le groupe comprenant :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP
WT), - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 mutée une seule fois à l'une quelconque des positions R226, 1228, F229, A289, F290, 1330, V331, D394 et R446 ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 11 (DSR-S
vardel.DELTA.4N ¨ S512C);
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 12 (alpha-1,2 BrS) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 13 (.DELTA.N123-GBD-CD2) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 14 (ASDg) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 15 (DSR-S-OK) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 16 (alpha-1,3 BrS) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 17 (ASR-C-del-bis) ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 18 (fructosyltransférase de Bacillus subtilis).
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 (ASNP
WT), - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 mutée une seule fois à l'une quelconque des positions R226, 1228, F229, A289, F290, 1330, V331, D394 et R446 ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 11 (DSR-S
vardel.DELTA.4N ¨ S512C);
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 12 (alpha-1,2 BrS) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 13 (.DELTA.N123-GBD-CD2) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 14 (ASDg) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 15 (DSR-S-OK) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 16 (alpha-1,3 BrS) ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 17 (ASR-C-del-bis) ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 18 (fructosyltransférase de Bacillus subtilis).
3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel la séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 mutée une seule fois à l'une quelconque des positions R226, 1228, F229, A289, F290, 1330, V331, D394 et R446 est choisie parmi :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 2 (ASNP
R226X1), ladite séquence ayant un acide aminé X1 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W et Y.
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 3 (ASNP
I228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP I330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V331X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W et Y ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V, W et Y.
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 2 (ASNP
R226X1), ladite séquence ayant un acide aminé X1 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W et Y.
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 3 (ASNP
I228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP I330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V331X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W et Y ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W et Y ; et - une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V, W et Y.
4. Procédé selon la revendication 2 ou 3, dans lequel la séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 1 mutée une seule fois à l'une quelconque des positions R226, I228, F229, A289, F290, I330, V331, D394 et R446 est choisie parmi :
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 2 (ASNP
R226X1), ladite séquence ayant un acide aminé X1 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, H, K, M, N, Q, S, T et V ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 3 (ASNP
I228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de H, L, T, V, W et Y ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, D, E, G, H, I, K, M, N, P, Q, V, W et Y, en particulier de C, D, E, G, I, K, M, N, P, V, W et Y, et plus préférentiellement de M et Y ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, M, N, P, Q, S, T, V
et W, et plus particulièrement choisi dans le groupe constitué de F, M, N, P, Q, S et T ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, P, Q, S, T, V et W, plus préférentiellement de A, C, D, H, I, K, L, M, Q, S, T, V et W, en particulier de A, C, I, L, V, S, T et W ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP I330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, Q, S, V et Y, en particulier de A et C, plus préférentiellement de A ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V331X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, W et Y, plus préférentiellement de C, D, E, F, G, N, R, S ,T, W et Y, en particulier de E, T et W ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, E, F, G, H, I, K et L, en particulier de A et E ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, G, K, L, M, N, et S, en particulier de A, N et M.
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 2 (ASNP
R226X1), ladite séquence ayant un acide aminé X1 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, H, K, M, N, Q, S, T et V ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 3 (ASNP
I228X2), ladite séquence ayant un acide aminé X2 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de H, L, T, V, W et Y ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 4 (ASNP
F229X3), ladite séquence ayant un acide aminé X3 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de C, D, E, G, H, I, K, M, N, P, Q, V, W et Y, en particulier de C, D, E, G, I, K, M, N, P, V, W et Y, et plus préférentiellement de M et Y ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5 (ASNP A289X4), ladite séquence ayant un acide aminé X4 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de C, D, E, F, M, N, P, Q, S, T, V
et W, et plus particulièrement choisi dans le groupe constitué de F, M, N, P, Q, S et T ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 6 (ASNP F290X5), ladite séquence ayant un acide aminé X5 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, P, Q, S, T, V et W, plus préférentiellement de A, C, D, H, I, K, L, M, Q, S, T, V et W, en particulier de A, C, I, L, V, S, T et W ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 (ASNP I330X6), ladite séquence ayant un acide aminé X6 représentant un acide aminé choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, Q, S, V et Y, en particulier de A et C, plus préférentiellement de A ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 8 (ASNP
V331X7), ladite séquence ayant un acide aminé X7 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, W et Y, plus préférentiellement de C, D, E, F, G, N, R, S ,T, W et Y, en particulier de E, T et W ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 9 (ASNP
D394X8), ladite séquence ayant un acide aminé X8 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, E, F, G, H, I, K et L, en particulier de A et E ;
- une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la SEQ ID NO : 10 (ASNP
R446X9), ladite séquence ayant un acide aminé X9 représentant un acide aminé
choisi dans le groupe constitué de A, C, G, K, L, M, N, et S, en particulier de A, N et M.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le synthon hydroxylé est choisi dans le groupe constitué du 2(hydroxy)ethylmethacrylate (HEMA), du N-(hydroxy)methyl acrylamide (NHAM), du N-(hydroxy)ethylacrylamide (HEAA), du 4-vinylphenol (VP), du 4-vinylbenzyl alcohol (VBA), du 4-(hydroxy)methyl oxazolidine-2,5-dione (HMNCA), du a-(hydroxy)methyl caprolactone (AHMCL), du ( )- mevalonolactone (MVL), du 2-mercaptoéthanol (BME), du 2 propène- 1 -ol (alcool allylique) et du N,N-bis(2-hydroxyethyl)acrylamide (NNHEA).
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le synthons hydroxylé est choisi dans le groupe constitué du 2(hydroxy)ethylmethacrylate (HEMA), du N-(hydroxy)methyl acrylamide (NHAM), du N-(hydroxy)ethylacrylamide (HEAA), du 4-vinyl benzylalcool (VBA), du 2 propène-1 -ol (alcool allylique) et du 2-mercaptoéthanol (BME) et du N,N-bis(2-hydroxyethyl)acrylamide (NNHEA).
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le synthon hydroxylé est glucosylé ou fructosylé à l'issu du procédé.
8. Procédé de fabrication d'un glyco(co)polymère comprenant la polymérisation d'au moins 2 monomères obtenus, indépendamment, à l'issue du procédé tel que revendiqué dans l'une quelconque des revendications 1 à 7.
9. Procédé selon la revendication 8, comprenant, dans l'ordre, les étapes suivantes :
a) la polymérisation de deux monomères obtenus, indépendamment l'un de l'autre, à l'issue du procédé tel que revendiqué dans l'une quelconque des revendications 1 à
8, permettant d'aboutir à une chaîne de 2 monomères ;
b) la polymérisation de la chaîne de monomères obtenue à l'issue de l'étape précédente avec un monomère obtenu à l'issue du procédé tel que revendiqué
dans l'une quelconque des revendications 1 à 7 ; puis c) une ou plusieurs étapes successives, et indépendantes, consistant à
polymériser la chaîne de monomères obtenue à l'issue de l'étape précédente avec un monomère obtenu à l'issue du procédé tel que revendiqué dans l'une quelconque des revendications 1 à 7.
a) la polymérisation de deux monomères obtenus, indépendamment l'un de l'autre, à l'issue du procédé tel que revendiqué dans l'une quelconque des revendications 1 à
8, permettant d'aboutir à une chaîne de 2 monomères ;
b) la polymérisation de la chaîne de monomères obtenue à l'issue de l'étape précédente avec un monomère obtenu à l'issue du procédé tel que revendiqué
dans l'une quelconque des revendications 1 à 7 ; puis c) une ou plusieurs étapes successives, et indépendantes, consistant à
polymériser la chaîne de monomères obtenue à l'issue de l'étape précédente avec un monomère obtenu à l'issue du procédé tel que revendiqué dans l'une quelconque des revendications 1 à 7.
10. Procédé selon la revendication 9, comprenant, indépendamment :
- au moins une étape a') entre les étapes a) et b) ;
- au moins une étape b') entre les étapes b) et c) ; et/ou - au moins une étape c') après l'une quelconque des étapes c), dans lesquelles la chaîne de monomères obtenue à l'issue de l'étape précédente est polymérisée avec au moins un synthon non-glycosylé.
- au moins une étape a') entre les étapes a) et b) ;
- au moins une étape b') entre les étapes b) et c) ; et/ou - au moins une étape c') après l'une quelconque des étapes c), dans lesquelles la chaîne de monomères obtenue à l'issue de l'étape précédente est polymérisée avec au moins un synthon non-glycosylé.
11. Procédé de fabrication d'un glyco(co)polymère, de préférence à blocs, comprenant le couplage d'au moins 2 monomères obtenus, indépendamment, à
l'issue du procédé tel que revendiqué dans l'une quelconque des revendications 1 à 7, de préférence de monomères obtenus à partir des synthons de formule (V) et/ou (VI) tels que définies en revendication 1.
l'issue du procédé tel que revendiqué dans l'une quelconque des revendications 1 à 7, de préférence de monomères obtenus à partir des synthons de formule (V) et/ou (VI) tels que définies en revendication 1.
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