FR3092339A1 - Cellule, notamment levure, resistante au phloroglucinol - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne une cellule vivante, de préférence une cellule hôte, résistante au phloroglucinol, ladite cellule hôte étant caractérisée en ce qu’elle surexprime un polypeptide sélectionné parmi (i) des transporteurs transmembranaires de la famille ABC, en particulier des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR, (ii) des facteurs de transcription contrôlant l’expression des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR, et (iii) des transporteurs transmembranaires de la famille MFS ; de préférence un polypeptide choisi parmi SNQ2, STE6, PDR3, AQR1, DTR1, FLR1, QDR1, YHK8 et ATR1 ; et de préférence encore le transporteur SNQ2. La présente invention concerne également un procédé de production d’une cellule hôte recombinante résistante au phloroglucinol. La présente invention concerne en outre une méthode de production de phloroglucinol.
Description
La présente invention se situe dans les domaines de la biochimie cellulaire et plus particulièrement dans le domaine de la synthèse du phloroglucinol par des cellules vivantes, de préférence des cellules hôtes recombinantes. Elle concerne l’utilisation (i) des transporteurs transmembranaires de la famille ABC, en particulier des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR, ou (ii) des facteurs de transcription contrôlant l’expression des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR, ou encore (iii) des transporteurs transmembranaires de la famille MFS, notamment l’utilisation de tels transporteurs ou facteurs de transcription issus de levures, plus particulièrement de levuresSaccharomyces, pour conférer une résistance au phloroglucinol.
Le phloroglucinol ou benzène-1,3,5-triol est un composé organique aromatique, utilisé dans la synthèse de nombreux produits pharmaceutiques ou encore d'explosifs. Compte tenu du large champ d’application du phloroglucinol, les industriels sont toujours à la recherche de moyens et d’outils permettant de produire ce composé en grande quantité dans un système économiquement rentable. A cet effet, certains défis restent à relever, notamment parce que l’une des principales difficultés à surmonter réside dans le fait que le phloroglucinol possède des propriétés antibiotiques et qu’il est ainsi compliqué de mettre en place un système de productionin vivoindustriel à fort rendement.
De façon intéressante, Cao et al. ont montré chez les bactéries de typeEscherichia c olique la surexpression du gènemarA, un activateur transcriptionnel de gènes impliqués dans la résistance à de multiples antibiotiques, permettait d’augmenter leur résistance au phloroglucinol (Cao et al., 2011). Toutefois, ces effets toxiques du phloroglucinol restent à ce jour peu étudiés dans la littérature.
Ainsi, il subsiste aujourd’hui le besoin d’identifier de nouveaux moyens et outils capables de fournir une résistance accrue vis-à-vis de la toxicité conférée par le phloroglucinol.
Tous les organismes ont développé des mécanismes de transport par lesquels les substances toxiques endogènes et exogènes peuvent être sécrétées. Les deux principales classes de protéines de transport sont les transporteurs ABC (Decottignies, 1997) et les transporteurs MFS (« major facilitator superfamily ») (Del Sorbo, 2000). Les membres des deux classes présentent une spécificité large de substrats.
ChezS. cerevisiae, une trentaine de protéines ABC a été identifiée et classée en cinq sous-familles phylogénétiques (Decottignies, 1997). Ces protéines présentent une organisation structurale très conservée incluant deux domaines transmembranaires et deux domaines cytoplasmiques délivrant l’énergie nécessaire au transport. L’organisation structurale est à la base de la classification des protéines en familles notées ABC-A à ABC-G. La surexpression des PDR («pleiotropic drug resistance») est fréquemment corrélée à la multirésistance (Holland, 2003). ChezS. cerevisiae, les protéines PDR constituent une sous-famille de transporteurs ABC, impliqués dans la résistance aux xénobiotiques (E. Balzi, 1995 ; Kolaczkowski, 1998). Les PDR les plus importants sont Pdr5 et Yor1, affichant une large spécificité de substrats (Mahé, 1996). Certains membres de la sous-famille PDR comme Pdr10p et Pdr15p sont également liés à la réponse générale au stress (Wolfger, 2004). Pdr12p joue un rôle essentiel dans la réponse et l’adaptation à des conditions défavorables (stress) (Piper, 1998).
Les MFS sont également des protéines transmembranaires impliquées dans le transport de molécules (oligosaccharides, xénobiotiques, acides aminés) utilisant les gradients de concentration chimiosmotique (Marger, 1993). Les transporteurs MFS peuvent être divisés en trois groupes principaux, en fonction du mode de transport : les transporteurs uniport qui permettent le déplacement dans une direction d’une seule molécule ou d’un seul ion à travers la membrane ; les transporteurs symport qui permettent le déplacement dans une même direction de deux molécules différentes ou d’une molécule et d’un ion de couplage (typiquement des protons) à travers la membrane; et les transporteurs antiport qui permettent le déplacement dans une direction opposée de deux molécules ou d’une molécule et d’un ion à travers la membrane, de telle sorte que la liaison de l’un dépend de la libération préalable de l’autre (Forrest, 2011). Les MFS sont classés en 74 sous-familles fondées sur l'analyse phylogénétique, la spécificité de substrat, et le mode de transport. La spécificité au substrat est déterminée essentiellement par les chaînes latérales des résidus d'acides aminés tapissant la cavité centrale creusée par le transporteur dans la bicouche lipidique de la membrane (Yan, 2013).
Les Inventeurs ont cherché des moyens et outils permettant d’augmenter la tolérance des levures au phloroglucinol. Dans le contexte de leurs travaux, ils ont étudié la surexpression de protéines appartenant à la sous-famille de transporteurs PDR. Ils ont notamment étudié les douze transporteurs présents sur la membrane cytoplasmique de la levure (Yor1p, Pdr5p, Pdr10p, Pdr12p, Pdr15p, Snq2, Pdr11p, Pdr18p, Aus1p, Adp1p, Yol075cp et Ste6p), ainsi que deux facteurs de transcription (Pdr1p et Pdr3p). Dix des douze transporteurs sélectionnés appartiennent à la famille G, dont le chef de file est BCRP (« breast cancer resistance protein ») ; les deux autres protéines appartiennent aux familles ABC-B et ABC-C, dont les chefs de file sont respectivement MDR1 et MRP1, largement impliqués dans la résistance aux anticancéreux chez l’homme. Les Inventeurs ont également étudié 19 séquences de transporteurs de la famille MFS situés à la membrane cytoplasmique.
De manière inattendue, les Inventeurs ont mis en évidence l’effet (i) des transporteurs transmembranaires de la famille ABC, en particulier des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR, ou (ii) des facteurs de transcription contrôlant l’expression des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR, ou encore (iii) des transporteurs transmembranaires de la famille MFS, en particulier des protéines SNQ2, STE6, PDR3, AQR1, DTR1, FLR1, QDR1, YHK8 ou ATR1 et notamment du transporteur membranaire SNQ2, sur la résistance au phloroglucinol des levures, en particulier des levures de typeSaccharomyces ,en particulier des levures de typeSaccharomyces cerevisiae.
Les Inventeurs ont mis en évidence de manière tout à fait surprenante, que la surexpression (i) des transporteurs transmembranaires de la famille ABC, en particulier des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR, ou (ii) des facteurs de transcription contrôlant l’expression des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR, ou encore (iii) des transporteurs transmembranaires de la famille MFS, dans une cellule vivante, permettait d’augmenter sa résistance au phloroglucinol.
Le premier objet de l’invention porte donc sur une cellule vivante, de préférence une cellule hôte, résistante au phloroglucinol caractérisée en ce qu’elle résiste à une concentration de phloroglucinol, dans son milieu de culture, supérieure ou égale à 1 g.L-1.
Selon la présente invention, ladite cellule vivante, de préférence ladite cellule hôte, surexprime au moins un transporteur membranaire, ou au moins un facteur de transcription contrôlant l’expression dudit transporteur membranaire, notamment choisi parmi SNQ2, STE6, PDR3, AQR1, DTR1, FLR1, QDR1, YHK8 et ATR1 et de préférence le transporteur SNQ2.
L’invention porte encore sur un procédé d’obtention d’une cellule hôte recombinante résistante au phloroglucinol comprenant au moins les étapes de :
i. fourniture d’une molécule d’acides nucléiques comprenant au moins une séquence d’acides nucléiques codant pour un polypeptide choisi parmi les transporteurs membranaires de la famille ABC, de préférence de la sous-famille PDR, et les transporteurs membranaires de la famille MFS, ou comprend une séquence d’acides nucléiques codant pour un facteur de transcription contrôlant l’expression d’un transporteur membranaire de la sous-famille PDR,
ii. clonage de ladite molécule d’acides nucléiques fournie à l’étape (i) dans un vecteur apte à permettre son intégration et/ou son expression dans ladite cellule hôte, et
iii. mise en contact de ladite cellule hôte et dudit vecteur obtenu à l’étape (ii) afin que cette dernière soit transfectée par ledit vecteur et que ladite cellule hôte exprime ladite molécule d’acides nucléiques, ladite cellule hôte étant ainsi résistante au phloroglucinol.
La présente invention porte encore sur une méthode de production de phloroglucinol comprenant au moins les étapes :
i. d’obtention d’une cellule hôte par la mise en œuvre d’un procédé selon l’invention,
ii. de mise en contact de ladite cellule hôte avec un substrat approprié,
iii. d’incubation du mélange obtenu à l’étape (ii) dans des conditions adaptées pour produire du phloroglucinol, et
iv. optionnellement, de récupération du milieu réactionnel comprenant le phloroglucinol obtenu après l’étape (iii) et de purification du phloroglucinol.
LEGENDE DES FIGURES
DESCRIPTION DETAILLEEE DE L’INVENTION
Définitions
Par «phloroglucinol», on entend un composé organique aromatique benzène-1,3,5-triol présentant la formule chimique suivante (Formule I) :
Formule I
Par «phloroglucinol synthase», on entend une enzyme multifonctionnelle ou un complexe enzymatique appartenant à la famille des polykétide synthases de type III et catalysant la synthèse du phloroglucinol. Une phloroglucinol synthase catalyse la condensation de trois molécules de malonyl-CoA pour former une molécule de phloroglucinol.
Par «polykétide synthase de type III», on entend une enzyme multifonctionnelle ou un complexe enzymatique produisant des polykétides et qui n’utilise pas de domaine de protéine porteuse d'acyle (ou ACP, pour « acyl carrier protein »).
Par «polykétide», on entend une grande famille de métabolites secondaires chez les bactéries, les mycètes, les plantes et certaines lignées d'animaux qui proviennent de la condensation itérative de sous-unités acétyle ou malonyle par des enzymes polykétide-synthases. Les polykétides servent également de matières premières pour la fabrication d'un éventail large de produits naturels et semi-synthétiques.
Par «activité enzymatique» ou «activité catalytique» ou encore «activité» d’une enzyme, on entend l’efficacité d’une enzyme à convertir un substrat en produit dans un environnement donné. L’efficacité de l’enzyme prend en compte ici la vitesse de conversion du substrat en produit par l’enzyme et le taux de conversion du substrat en produit par l’enzyme. Par «taux de conversion du substrat en produit par l’enzyme» on entend ici le ratio entre la quantité de produit final obtenu par rapport à la quantité initiale de substrat pour une quantité définie d’enzyme. Par exemple, une activité enzymatique au sens de l’invention peut être exprimée en quantité de phloroglucinol produit dans un volume donné (en g/L ou g.L-1).
Par «bactérie», on entend un organisme microscopique et procaryote présent dans un milieu donné.
Par «levure» on entend un organisme microscopique et eucaryote dont certaines espèces sont aptes à provoquer la fermentation des matières organiques.
Par «molécule d’acides nucléiques», on entend un polymère de n'importe quelle longueur d’acide désoxyribonucléique (ADN), ou polydésoxyribonucléotides, incluant notamment les ADN complémentaires ou ADNc, les ADN génomiques, les plasmides, les vecteurs, les génomes viraux, l'ADN isolé, les sondes, les amorces et tout mélange de ceux-ci ; ou un polymère de n'importe quelle longueur d’acide ribonucléique (ARN), ou polyribonucléotides, incluant notamment les ARN messagers ou ARNm, ARN antisens ; ou des polyribo-polydésoxyribonucléotides mélangés. Ils englobent des polynucléotides simples ou à double brins, linéaires ou circulaires, naturels ou synthétiques. En outre, un polynucléotide peut comprendre des nucléotides non naturels et peut être interrompu par des composants non nucléotidiques.
Dans le cadre de la présente invention, les termes «acide nucléique», «molécule d'acides nucléiques», «polynucléotide» et «séquence nucléotidique» sont utilisés de manière interchangeable.
Par «isolé ou isolé e», on entend une molécule, notamment une protéine, un polypeptide, un peptide, une molécule d’acides nucléiques, un vecteur plasmidique, un vecteur viral ou une cellule hôte, qui est extrait de son environnement naturel (c'est-à-dire séparé d'au moins un autre composant auquel il est naturellement associé).
Par «polypeptide», «protéine» et «peptide», on entend des polymères de résidus d'acides aminés qui comprennent au moins neuf acides aminés liés par des liaisons peptidiques. Le polymère peut être linéaire, ramifié ou cyclique. Le polymère peut comprendre des acides aminés naturels et/ou analogues d’acides aminés et il peut être interrompu par des résidus non-acides aminés. Comme indication générale et sans y être cependant lié dans la présente demande, si le polymère d'acides aminés contient plus de 50 résidus d'acides aminés, il est de préférence appelé un polypeptide ou une protéine, alors que si le polymère est constitué de 50 acides aminés ou moins, il est de préférence appelé peptide.
Par «vecteur», on entend un véhicule, de préférence une molécule d'acides nucléiques ou une particule virale, qui contient les éléments nécessaires pour permettre l'administration, la propagation et/ou l'expression d'une ou plusieurs molécule(s) d'acides nucléiques dans une cellule hôte ou un organisme.
D’un point de vue fonctionnel, ce terme englobe des vecteurs pour la maintenance (vecteurs de clonage), des vecteurs pour l'expression dans diverses cellules ou organismes hôtes (vecteurs d'expression), des vecteurs extrachromosomiques (par exemple des plasmides multicopie) ou des vecteurs d'intégration (par exemple conçus pour s'intégrer dans le génome d’une cellule hôte et produire des copies supplémentaires de la molécule d'acides nucléiques qu’il contient lorsque la cellule hôte se réplique). Ce terme englobe également des vecteurs navettes (par exemple, fonctionnant à la fois dans des hôtes procaryotes et/ou eucaryotes) et des vecteurs de transfert (par exemple pour le transfert de molécule(s) d'acides nucléiques dans le génome d’une cellule hôte).
D’un point de vue structurel, les vecteurs peuvent être des sources génétiques naturelles, synthétiques ou artificielles, ou une combinaison d'éléments génétiques naturels et artificiels.
Ainsi, dans le contexte de l'invention, le terme «vecteur» doit être compris de manière large en incluant des vecteurs plasmidiques (ou plasmides) et viraux.
Un «plasmide» tel qu'utilisé ici désigne une construction d'ADN réplicable. Habituellement, les vecteurs plasmidiques contiennent des gènes marqueurs de sélection qui permettent aux cellules hôtes portant le plasmide d'être identifiées et/ou sélectionnées de manière positive ou négative en présence du composé correspondant au marqueur de sélection. Une variété de gènes marqueurs de sélection positifs et négatifs sont connus dans la technique. À titre d'illustration, un gène de résistance aux antibiotiques peut être utilisé comme un gène marqueur de sélection positif permettant de sélectionner une cellule hôte en présence de l'antibiotique correspondant.
Le terme «vecteur viral» tel qu'utilisé ici se réfère à un vecteur d'acides nucléiques qui comprend au moins un élément d'un génome du virus et peut être conditionné dans une particule virale. Les vecteurs viraux peuvent être compétents pour la réplication ou sélectifs (par exemple, conçus pour se répliquer mieux ou sélectivement dans des cellules hôtes spécifiques), ou peuvent être génétiquement désactivés de manière à être défectueux ou déficients pour la réplication.
Par «cellule vivante», on entend une cellule de type sauvage, c’est-à-dire une cellule existant à l’état naturel et non modifiée génétiquement par l’Homme, ou une cellule de type recombinante, c’est-à-dire génétiquement modifiée par l’Homme. Dans ce dernier cas on parlera préférentiellement de cellule hôte.
La cellule vivante peut être constituée d'un type unique de cellules ou d'un groupe de différents types de cellules.
La cellule vivante peut appartenir à des lignées cellulaires cultivées, à des cellules primaires, à des cellules souches ou à des cellules prolifératives. Dans le cadre de l'invention, le terme « cellules vivantes » comprend des cellules procaryotes, bactéries ou cyanobactéries, des cellules eucaryotes telles que des cellules de levures, des cellules de champignons, des cellules d’algues, des cellules d'insectes, des plantes et des cellules de mammifères (par exemple humaines ou non humaines, de préférence non humaines).
Par «cellule hôte», on entend une cellule contenant au moins une molécule d’acides nucléiques exogène. Avantageusement, la cellule hôte a une résistance vis-à-vis de la toxicité induite par le phloroglucinol.
En particulier, la cellule hôte est capable d’exprimer ou de surexprimer un polypeptide codant pour une enzyme impliquée dans la biosynthèse du phloroglucinol, de préférence un polypeptide à activité de phloroglucinol synthase, plus préférentiellement un polypeptide codant pour une polykétide synthase de type III et est ainsi capable de synthétiser du phloroglucinol.
Le terme «cellule hôte» comprend plus largement des cellules qui contiennent ou ont contenu la molécule d’acides nucléiques, ainsi que la descendance de telles cellules.
La cellule hôte peut par exemple être isolée ou organisée en tissu, en organe ou encore être au sein d’un organisme complet. Dans le cas où la cellule hôte est au sein d’un organisme complet, ledit organisme n’est pas humain.
Il est ainsi clair qu’une «cellule hôte» selon la présente invention est une cellule hôte recombinante, i.e., une cellule hébergeant un matériel génétique exogène. Ainsi, une cellule hôte n’est pas une cellule qui existe à l’état naturel mais est un outil de biologie moléculaire obtenu par les techniques de manipulations génétiques.
Par matériel génétique ou séquence «exogène», on entend que ledit matériel génétique ou ladite séquence provient d’un autre organisme, appartenant ou non à la même lignée cellulaire.
Par «transfecté» ou «transfection», on entend l'introduction de matériel génétique exogène dans des cellules eucaryotes, notamment celles de l’invention. Par «transformé» ou «transformation», on entend l'introduction de matériel génétique exogène dans des cellules procaryotes, notamment celles de l’invention. Néanmoins, dans le cadre de la présente invention, les termes « transfection » et « transformation » sont équivalents et peuvent être employés de manière interchangeable.
Par «identité», on entend une correspondance exacte de séquence entre deux polypeptides, entre deux protéines, entre deux peptides ou deux molécules d’acides aminés. Le « pourcentage d'identité » entre deux séquences est fonction du nombre de résidus identiques communs aux deux séquences, et prend en compte le nombre d'intervalles qui doivent être introduits pour un alignement optimal et la longueur de chaque intervalle. Divers programmes informatiques et algorithmes mathématiques sont disponibles dans l’état de l’art pour déterminer le pourcentage d'identité entre les séquences d'acides aminés, comme par exemple le programme Blast disponible sur la base NCBI ou ALIGN (Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhoff (ed.), 1981, Suppl. 3 482-489). Des programmes pour déterminer l'homologie entre les séquences nucléotidiques sont également disponibles dans une base de données spécialisée (par exemple Genbank, le Wisconsin Sequence Analysis Package, les programmes BESTFIT, FASTA et GAP). À titre illustratif, « au moins 80% d'identité de séquence », tel qu'utilisé ici, représente 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.
Dans la description détaillée qui suit, les modes de réalisation pourront être pris seuls ou combinés de manière appropriée par l’homme du métier.
Cellule vivante résistante au phloroglucinol
Le premier objet de l’invention porte donc sur une cellule vivante, de préférence une cellule hôte, résistante au phloroglucinol caractérisée en ce qu’elle résiste à une concentration de phloroglucinol, dans son milieu de culture, supérieure ou égale à 1 g.L-1.
Par «résistant e au phloroglucinol» on entend une cellule vivante, de préférence une cellule hôte, qui n’est pas sensible à la toxicité induite par le phloroglucinol. Cette cellule vivante, de préférence cette cellule hôte, est ainsi capable de vivre, croître et se multiplier malgré la présence de phloroglucinol dans son milieu de culture, notamment malgré une concentration de phloroglucinol d’au moins 1 g.L-1dans son milieu de culture.
Dans un mode de réalisation particulier, ladite cellule vivante, et de préférence ladite cellule hôte, est résistante au phloroglucinol si elle est capable de vivre, croître et se multiplier en présence d’une concentration en phloroglucinol dans son milieu de culture supérieure ou égale à 1 g.L-1, de préférence supérieure ou égale à 2.5 g.L-1, de préférence supérieure ou égale à 5 g.L-1, de préférence supérieure ou égale à 7.5 g.L-1, de préférence supérieure ou égale à 10 g.L-1, et de façon encore préférée supérieure ou égale à 15 g.L-1.
Dans un mode de réalisation préféré, ladite cellule vivante, de préférence ladite cellule hôte, est résistante au phloroglucinol si elle est capable de vivre, croître et se multiplier en présence d’une concentration en phloroglucinol dans son milieu de culture supérieure ou égale à 20 g.L-1.
En pratique, la résistance au phloroglucinol d’une cellule vivante, de préférence d’une cellule hôte, peut être mesurée par toute méthode appropriée connue de l’Homme du métier, notamment par la méthode décrite dans l’Exemple 1.
Dans un mode de réalisation préféré, ladite cellule vivante, de préférence ladite cellule hôte, est un microorganisme sélectionné parmi les bactéries, levures, champignons, algues, cyanobactéries, de préférence une levure, ladite levure étant en particulier sélectionnée parmi les genresSaccharomyces, Candida, Ashbya , Dekkera , Pichia ( Hansenula ), Debaryomyces , Clavispora , Lodderomyces , Yarrowia , Zigosaccharomyces , Schizosaccharomyces , Torulaspora , Kluyveromyces , Brettanomycces , CryptococcusetMalassezia; de manière plus particulière parmi les espècesSaccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii , Saccharomyces douglasii , Saccharomyces bayanus , Zigosaccharomyces bailii , Schizosaccharomyces pombe, Dekkera brucelensis , Dekkera intermedia , Brettanomycces custersii , Brettanomycces intermedius , Kluyveromyces themotolerens , Torulaspora globosaetTorulaspora glabrata; encore plus particulièrement, la levure étant du genreSaccharomyces, de préférence de l’espèceSaccharomyces cerevisiae.
De façon surprenante, les Inventeurs ont pu mettre en évidence que certains des transporteurs de la famille ABC, et notamment certains transporteurs de la sous-famille PDR, de même que certains transporteurs de la famille MFS, sont capables de conférer une résistance à la cellule vivante vis-à-vis de la toxicité induite par le phloroglucinol. Par ailleurs, certains facteurs de transcription impliqués dans la régulation desdits transporteurs sont également capables de conférer une résistance à la cellule vivante vis-à-vis de la toxicité induite par le phloroglucinol.
Ainsi, la présente invention porte sur une cellule hôte caractérisée en ce qu’elle surexprime au moins un transporteur membranaire, ou au moins un facteur de transcription contrôlant l’expression dudit transporteur membranaire.
Parmi les transporteurs d’intérêt identifiés dans le cadre de la présente invention, on peut notamment citer les transporteurs de la sous-famille PDR : PDR5, SNQ2, PDR10, PDR11, PDR12, PDR15, PDR18, ADP1, AUS1, STE6, YOL075C et YOR1. Parmi les facteurs de transcription d’intérêt identifiés dans le cadre de la présente invention, on peut notamment citer PDR1 et PDR3 qui sont impliqués dans la régulation de l’expression des transporteurs de la sous-famille PDR.
Ainsi, dans un mode réalisation particulier, ladite cellule hôte est caractérisée en ce que ledit transporteur membranaire ou ledit facteur de transcription contrôlant son expression appartient à la famille des transporteurs ABC et de préférence à la sous-famille PDR.
Parmi les transporteurs d’intérêt identifiés dans le cadre de la présente invention, on peut également citer les transporteurs de la sous famille MFS, notamment AQR1, DTR1, FLR1, HOL1, QDR1, QDR2, QDR3, TPO1, TPO2, TPO3, TPO4, YHK8, ATR1, GEX1, AZR1, SGE1, SIT1, ENB1 et GEX2.
Ainsi, dans un mode réalisation particulier, ladite cellule hôte est caractérisée en ce que ledit transporteur membranaire appartient à la famille des transporteurs MFS.
L’invention porte donc également sur une cellule hôte résistante au phloroglucinol caractérisée en ce qu’elle surexprime au moins un transporteur ou un facteur de transcription choisi parmi SNQ2, STE6, PDR3, AQR1, DTR1, FLR1, QDR1, YHK8 et ATR1.
Dans un mode de réalisation préféré, ladite cellule hôte est caractérisée en ce qu’elle surexprime le transporteur SNQ2.
Ainsi, les transporteurs PDR, les facteurs de transcription régulant l’expression des transporteurs PDR, et les transporteurs MFS, en particulier SNQ2, peuvent être issus de tout organisme possédant une séquence codant pour lesdits transporteurs ou facteurs de transcription.
Dans un mode de réalisation, les transporteurs PDR, les facteurs de transcription régulant l’expression des transporteurs PDR, et les transporteurs MFS sont issus de levures, lesquelles levures sont en particulier sélectionnées parmi les levures du genreSaccharomyces, et de manière plus particulière parmi les espècesSaccharomyces cerevisiae,Saccharomyces boulardii,Saccharomyces douglasii , Saccharomyces bayanus , Zigosaccharomyces bailii , Schizosaccharomyces pombe, Dekkera brucelensis , Dekkera intermedia , Brettanomycces custersii , Brettanomycces intermedius , Kluyveromyces themotolerens , Torulaspora globosaetTorulaspora glabrata; encore plus particulièrement, lesdites levures étant de l’espèceSaccharomyces cerevisiae.
Dans un autre mode de réalisation, ladite cellule hôte résistante au phloroglucinol est une levure, de préférence de l’espèceSaccharomyces cerevisiae, caractérisée en ce qu’elle surexprime le transporteur SNQ2.
Dans un mode de réalisation préféré, ladite cellule hôte résistante au phloroglucinol est une levure, de préférence de l’espèceSaccharomyces cerevisiaecaractérisée en ce qu’elle surexprime un polypeptide comprenant au moins une séquence d’acides aminés ayant au moins 70%, de préférence au moins 80% d’identité avec SEQ ID NO 2.
Dans un mode de réalisation préféré entre tous, ladite cellule hôte résistante au phloroglucinol est une levure, de préférence de l’espèceSaccharomyces cerevisiae, caractérisée en ce qu’elle surexprime le transporteur SNQ2 deSaccharomyces cerevisiaede séquence SEQ ID NO 2.
Polypeptides
La présente invention utilise des polypeptides isolés choisis parmi (i) des transporteurs transmembranaires de la famille ABC, en particulier des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR, ou (ii) des facteurs de transcription contrôlant l’expression des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR, ou encore (iii) des transporteurs transmembranaires de la famille MFS ; notamment parmi (i) des transporteurs transmembranaires de la famille ABC de levures, en particulier des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR de levures, ou (ii) des facteurs de transcription contrôlant l’expression des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR de levures, ou encore (iii) des transporteurs transmembranaires de la famille MFS de levures, en particulier ceux de levuresSaccharomyces ,plus particulièrement encore de l’espèceSaccharomyces cerevisiae.
La présente invention utilise des polypeptides isolés choisis parmi (i) des transporteurs transmembranaires de la famille ABC, en particulier des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR, ou (ii) des facteurs de transcription contrôlant l’expression des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR, ou encore (iii) des transporteurs transmembranaires de la famille MFS ; notamment parmi (i) des transporteurs transmembranaires de la famille ABC de levures, en particulier des transporteurs transmembranaires la sous-famille PDR de levures, ou (ii) des facteurs de transcription contrôlant l’expression des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR de levures, ou encore (iii) des transporteurs transmembranaires de la famille MFS de levures, en particulier ceux de levuresSaccharomyces, plus particulièrement encore de l’espèceSaccharomyces cerevisiae,comme moyens pour réduire la toxicitéin vivodu phloroglucinol.
De manière avantageuse, ledit polypeptide comprend au moins une séquence d’acides aminés ayant au moins 70% d’identité avec une séquence choisie parmi SEQID NO 1, SEQID NO 2, SEQID NO 3, SEQID NO 4, SEQID NO 5, SEQID NO 6, SEQID NO 7, SEQID NO 8, SEQID NO 9, SEQID NO 10, SEQID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQID NO 15, SEQID NO 16, SEQID NO 17, SEQID NO 18, SEQID NO 19, SEQID NO 20, SEQID NO 21, SEQID NO 22, SEQID NO 23, SEQID NO 24, SEQID NO 25, SEQID NO 26, SEQID NO 27, SEQID NO 28, SEQID NO 29, SEQID NO 30, SEQID NO 31, SEQID NO 32 et SEQID NO 33.
Avantageusement, ledit polypeptide est choisi parmi les transporteurs PDR de levure, les facteurs de transcription régulant l’expression des transporteurs PDR de levure, et les transporteurs MFS de levure, ladite levure étant en particulier sélectionnée parmi les levures du genreSaccharomyces, et de manière plus particulière parmi les espècesSaccharomyces cerevisiae,Saccharomyces boulardii,Saccharomyces douglasii , Saccharomyces bayanus , Zigosaccharomyces bailii , Schizosaccharomyces pombe, Dekkera brucelensis , Dekkera intermedia , Brettanomycces custersii , Brettanomycces intermedius , Kluyveromyces themotolerens , Torulaspora globosaetTorulaspora glabrata; encore plus particulièrement, ladite levure étant de l’espèceSaccharomyces cerevisiae.
Selon un mode de réalisation, ledit polypeptide comprend au moins une séquence d’acides aminés ayant de préférence au moins 70% d’identité, de préférence encore au moins 75% d’identité, de manière encore préférée au moins 80% d’identité, de manière encore plus préférée au moins 85% d’identité, de manière toujours plus préférée au moins 90% d’identité, de manière plus préférentielle encore au moins 95% d’identité, de manière encore plus préférentielle au moins 96% d’identité, de manière davantage préférée au moins 97% d’identité, de manière encore préférée au moins 98% d’identité, de manière encore plus préférée au moins 99% d’identité, de manière préférée entre toutes 100% d’identité avec une séquence choisie parmi SEQID NO 1, SEQID NO 2, SEQID NO 3, SEQID NO 4, SEQID NO 5, SEQID NO 6, SEQID NO 7, SEQID NO 8, SEQID NO 9, SEQID NO 10, SEQID NO 11,SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14 , SEQID NO 15, SEQID NO 16, SEQID NO 17, SEQID NO 18, SEQID NO 19, SEQID NO 20, SEQID NO 21, SEQID NO 22, SEQID NO 23, SEQID NO 24, SEQID NO 25, SEQID NO 26, SEQID NO 27, SEQID NO 28, SEQID NO 29, SEQID NO 30, SEQID NO 31, SEQID NO 32 et SEQID NO 33.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, ledit polypeptide comprend au moins une séquence d’acides aminés choisie parmi SEQID NO 2, SEQID NO 10, SEQ ID NO 14, SEQID NO 15, SEQID NO 16, SEQID NO 17, SEQID NO 19, SEQID NO 26 et SEQID NO 27.
Dans un mode de réalisation préféré, le polypeptide isolé capable de conférer une résistance à la cellule vivante vis-à-vis de la toxicité induite par le phloroglucinol possède une séquence d’acides aminés ayant de préférence au moins 70% d’identité, de préférence encore au moins 75% d’identité, de manière encore préférée au moins 80% d’identité, de manière encore plus préférée au moins 85% d’identité, de manière toujours plus préférée au moins 90% d’identité, de manière plus préférentielle encore au moins 95% d’identité, de manière encore plus préférentielle au moins 96% d’identité, de manière davantage préférée au moins 97% d’identité, de manière encore préférée au moins 98% d’identité, de manière encore plus préférée au moins 99% d’identité, de manière préférée entre toutes 100% d’identité avec SEQID NO 2, SEQID NO 10, SEQ ID NO 14, SEQID NO 15, SEQID NO 16, SEQID NO 17, SEQID NO 19, SEQID NO 26 ou SEQID NO 27.
Dans un mode de réalisation encore préféré, le polypeptide isolé capable de conférer une résistance à la cellule vivante vis-à-vis de la toxicité induite par le phloroglucinol possède une séquence d’acides aminés ayant de préférence au moins 70% d’identité, de préférence encore au moins 75% d’identité, de manière encore préférée au moins 80% d’identité, de manière encore plus préférée au moins 85% d’identité, de manière toujours plus préférée au moins 90% d’identité, de manière plus préférentielle encore au moins 95% d’identité, de manière encore plus préférentielle au moins 96% d’identité, de manière davantage préférée au moins 97% d’identité, de manière encore préférée au moins 98% d’identité, de manière encore plus préférée au moins 99% d’identité, de manière préférée entre toutes 100% d’identité avec SEQ ID NO 2.
Acides nucléiques isolés
La présente invention utilise des molécules d’acides nucléiques isolées codant au moins un polypeptide choisi parmi les transporteurs de la sous-famille PDR, les facteurs de transcription contrôlant l’expression des transporteurs de la sous-famille PDR, et les transporteurs de la famille MFS, notamment ceux de levures, en particulier ceux de levuresSaccharomyces, plus particulièrement ceux deSaccharomyces cerevisiae.
De manière avantageuse, ledit polypeptide est tel que défini ci-dessus.
Ainsi, la présente invention utilise des molécules d’acides nucléiques isolées codant au moins un polypeptide isolé choisi parmi SNQ2, STE6, PDR3, AQR1, DTR1, FLR1, QDR1, YHK8 et ATR1, et de préférence SNQ2.
La présente invention utilise donc des molécules d’acides nucléiques isolées codant au moins un polypeptide isolé ayant une séquence d’acides aminés choisie parmi SEQID NO 2, SEQID NO 10, SEQ ID NO 14, SEQID NO 15, SEQID NO 16, SEQID NO 17, SEQID NO 19, SEQID NO 26 et SEQID NO 27, de préférence SEQID NO 2.
Dans un mode de réalisation, la présente invention utilise des molécules d’acides nucléiques isolées codant au moins un polypeptide isolé dont la séquence d’acides aminés a de préférence au moins 70% d’identité, de préférence encore au moins 75% d’identité, de manière encore préférée au moins 80% d’identité, de manière encore plus préférée au moins 85% d’identité, de manière toujours plus préférée au moins 90% d’identité, de manière plus préférentielle encore au moins 95% d’identité, de manière encore plus préférentielle au moins 96% d’identité, de manière davantage préférée au moins 97% d’identité, de manière encore préférée au moins 98% d’identité, de manière encore plus préférée au moins 99% d’identité, de manière préférée entre toutes 100% d’identité avec SEQID NO 2, SEQID NO 10, SEQ ID NO 14, SEQID NO 15, SEQID NO 16, SEQID NO 17, SEQID NO 19, SEQID NO 26 ou SEQID NO 27, de préférence SEQID NO 2.
Selon un mode de réalisation, la molécule d’acides nucléiques isolée comprend un promoteur contrôlant l’expression d’au moins une séquence d’acides nucléiques codant un polypeptide tel que défini ci-dessus. Ainsi, selon un mode de réalisation, la molécule d’acides nucléiques isolée comprend au moins une séquence d’acides nucléiques codant un polypeptide choisi parmi (i) des transporteurs transmembranaires de la famille ABC, en particulier des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR, (ii) des facteurs de transcription contrôlant l’expression des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR, et (iii) des transporteurs transmembranaires de la famille MFS, tel que défini ci-dessus et comprend en outre un promoteur contrôlant l’expression d’au moins une, de préférence de ladite, séquence d’acides nucléiques.
Selon un mode de réalisation préféré, la molécule d’acides nucléiques isolée comprend au moins une séquence d’acides nucléiques codant un polypeptide choisi parmi SNQ2, STE6, PDR3, AQR1, DTR1, FLR1, QDR1, YHK8 et ATR1, de préférence SNQ2, et comprend en outre un promoteur contrôlant l’expression d’au moins une, de préférence de ladite, séquence d’acides nucléiques.
De manière avantageuse, le promoteur est un promoteur exogène, en particulier un promoteur de levure, de préférence un promoteur choisi parmi ADH2 (pADH2) et CCW12 (pCCW12), de préférence encore un promoteur choisi parmi ADH2 (pADH2) deSaccharomyces cerevisiae(S. cerevisiae) et CCW12 (pCCW12) deS. cerevisiae, de préférence encore le promoteur CCW12 de SEQ ID NO 34.
Selon un mode de réalisation, la molécule d’acides nucléiques isolée comprend un terminateur de transcription d’au moins une séquence d’acides nucléiques codant un polypeptide tel que défini ci-dessus. Ainsi, selon un mode de réalisation, la molécule d’acides nucléiques isolée comprend au moins une séquence d’acides nucléiques codant un polypeptide choisi parmi (i) des transporteurs transmembranaires de la famille ABC, en particulier des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR, (ii) des facteurs de transcription contrôlant l’expression des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR, et (iii) des transporteurs transmembranaires de la famille MFS, tel que défini ci-dessus et comprend en outre un terminateur contrôlant l’expression d’au moins une, de préférence de ladite, séquence d’acides nucléiques.
Selon un mode de réalisation préféré, la molécule d’acides nucléiques isolée comprend au moins une séquence d’acides nucléiques codant un polypeptide choisi parmi SNQ2, STE6, PDR3, AQR1, DTR1, FLR1, QDR1, YHK8 et ATR1, de préférence SNQ2, et comprend en outre un terminateur contrôlant l’expression d’au moins une, de préférence de ladite, séquence d’acides nucléiques.
De manière avantageuse, le terminateur est un terminateur exogène, en particulier un terminateur de levure, de préférence le terminateur RPL3 (tRPL15A), de préférence encore le terminateur RPL15A deS. cerevisiae, de préférence encore le terminateur RPL15A de SEQ ID NO 35.
Selon un mode de réalisation, la molécule d’acides nucléiques isolée comprend à la fois un promoteur et un terminateur qui sont tels que définis ci-dessus. Ainsi, selon un mode de réalisation, la molécule d’acides nucléiques isolée comprend au moins une séquence d’acides nucléiques codant un polypeptide choisi parmi (i) des transporteurs transmembranaires de la famille ABC, en particulier des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR, (ii) des facteurs de transcription contrôlant l’expression des transporteurs transmembranaires de la sous-famille PDR, et (iii) des transporteurs transmembranaires de la famille MFS, tel que défini ci-dessus et comprend en outre un promoteur et un terminateur contrôlant l’expression d’au moins une, de préférence de ladite, séquence d’acides nucléiques.
Selon un mode de réalisation préféré, la molécule d’acides nucléiques isolée comprend au moins une séquence d’acides nucléiques codant un polypeptide choisi parmi SNQ2, STE6, PDR3, AQR1, DTR1, FLR1, QDR1, YHK8 et ATR1, de préférence SNQ2, et comprend en outre un promoteur et un terminateur contrôlant l’expression de ladite au moins une séquence d’acides nucléiques.
Selon un mode de réalisation, la molécule d’acides nucléiques est isolée à partir de souches homologues, en culture, notamment de souches sélectionnées parmi les levures du genreSaccharomyces, de préférence choisies parmiSaccharomyces cerevisiae,Saccharomyces boulardii,Saccharomyces douglasii , Saccharomyces bayanus , Zigosaccharomyces bailii , Schizosaccharomyces pombe, Dekkera brucelensis , Dekkera intermedia , Brettanomycces custersii , Brettanomycces intermedius , Kluyveromyces themotolerens , Torulaspora globosa et Torulaspora glabrata; encore plus particulièrement, la levure de l’espèceSaccharomyces cerevisiae.
Selon un mode de réalisation, la molécule d’acides nucléiques est isolée à partir d’un vecteur ou d’une cellule hôte comprenant ladite molécule, ledit vecteur ou ladite cellule hôte étant tel(le) que défini(e) plus haut et que décrit(e) ci-après dans les sections « Cellules hôtes » ou « Vecteurs ».
Selon un mode de réalisation, la molécule d’acides nucléiques isolée est synthétiséein - vitropar des techniques de synthèse nucléique que l’homme du métier connaît parfaitement ou saura déterminer sans difficultés à partir de ses connaissances générales.
Selon un mode de réalisation, la molécule d’acides nucléiques isolée est recombinante.
Vecteurs
La présente invention utilise des vecteurs comprenant au moins une molécule d’acides nucléiques telle que définie ci-dessus.
Avantageusement, le vecteur est un plasmide.
Les vecteurs appropriés dans le cadre de la présente invention comprennent, sans limitation, des vecteurs bactériophages, plasmides ou cosmides pour l'expression dans des cellules hôtes procaryotes telles que des bactéries (par exempleE. coli, ou des bactéries du genrePseudomonas); des vecteurs pour l'expression chez la levure (par exempleSaccharomyces cerevisiae,Schyzosaccharomyces pombe, Pichia pastoris); des vecteurs de baculovirus pour l'expression dans des systèmes de cellules d'insectes (par exemple, des cellules de Sf 9); des vecteurs viraux et plasmidiques pour l'expression dans des systèmes de cellules végétales (par exemple le plasmide Ti, le virus de la mosaïque du chou-fleur, CaMV, le virus de la mosaïque du tabac TMV); ainsi que des vecteurs viraux et plasmidiques pour l'expression dans des cellules ou des organismes eucaryotes supérieurs.
Les vecteurs appropriés dans le cadre de la présente invention peuvent être de type intégratif ou de type réplicatif. Les vecteurs de type intégratif ne possèdent pas de séquence dite « origine de réplication » et doivent ainsi être intégrés directement dans le génome de la cellule hôte pour être exprimés. Cette intégration peut se faire au moyen d’outils génétiques dédiés et bien connus de l’Homme du métier. A titre d’exemple non limitatif, cette intégration peut se faire par recombinaison homologue ou encore via le système de recombinaison CRE-LOX. Les vecteurs de type réplicatif possèdent une origine de réplication autonome. Ces vecteurs se répliquent donc de façon indépendante par rapport au génome de la cellule hôte. Ainsi, contrairement aux vecteurs intégratifs, les vecteurs réplicatifs n’ont pas besoin d’être intégrés au génome de la cellule hôte.
Ces vecteurs sont généralement disponibles dans le commerce (par exemple, auprès des fournisseurs tels Invitrogen, Stratagene, Amersham Biosciences, Promega, etc.), disponibles auprès d'institutions de dépôt telles que American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Md.), ou ont fait l'objet de nombreuses publications décrivant leur séquence, leurs structures et leurs méthodes de production, de sorte que l'homme du métier peut les appliquer sans difficultés.
Des exemples représentatifs de vecteurs plasmidiques appropriés comprennent, sans limitation, pREP4, pCEP4, (Invitrogen), pCI (Promega), pYES2 (ThermoFisher) et pgWiz (Gene Therapy System Inc).
Cellules
hôtes
La présente invention concerne des cellules hôtes résistantes au phloroglucinol parce qu’elles comprennent au moins une molécule d’acides nucléiques ou au moins un vecteur tel(le) que défini(e) ci-dessus.
Selon divers modes de réalisation, ladite cellule hôte peut être une cellule procaryote, une cellule eucaryote inférieure telle qu’une cellule de levures, et une autre cellule eucaryote telle qu’une cellule d'insecte, de plante et une cellule de mammifère (par exemple humaine ou non humaine, de préférence non humaine).
De manière avantageuse, la cellule hôte est un microorganisme sélectionné parmi les bactéries, les levures, les champignons, les algues et les cyanobactéries.
La cellule hôte est de préférence une levure, ladite levure étant en particulier sélectionnée parmi les genresSaccharomyces, Candida, Ashbya , Dekkera , Pichia ( Hansenula ), Debaryomyces , Clavispora , Lodderomyces , Yarrowia , Zigosaccharomyces , Schizosaccharomyces , Torulaspora , Kluyveromyces , Brettanomycces , CryptococcusetMalassezia.
De manière encore plus particulière, la levure est sélectionnée parmi les espècesSaccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii , Saccharomyces douglasii , Saccharomyces bayanus , Zigosaccharomyces bailii , Schizosaccharomyces pombe, Dekkera brucelensis , Dekkera intermedia , Brettanomycces custersii , Brettanomycces intermedius , Kluyveromyces themotolerens , Torulaspora globosaetTorulaspora glabrata.
Encore plus particulièrement, la levure est du genreSaccharomyces, de préférence de l’espèceSaccharomyces cerevisiae.
Selon un mode de réalisation, la cellule hôte comprend au moins une copie de la molécule d’acides nucléiques telle que définie ci-dessus intégrée dans son génome.
Selon un mode de réalisation, la cellule hôte comprend une copie unique de la molécule d’acides nucléiques telle que définie ci-dessus intégrée dans son génome.
Ainsi, la présente invention concerne une cellule hôte comprenant au moins une copie d’une molécule d’acides nucléiques codant pour un polypeptide choisi parmi SNQ2, STE6, PDR3, AQR1, DTR1, FLR1, QDR1, YHK8 et ATR1, et de préférence SNQ2.
La présente invention concerne une cellule hôte comprenant au moins une copie d’une molécule d’acides nucléiques codant pour un polypeptide ayant une séquence d’acides aminés choisie parmi SEQID NO 2, SEQID NO 10, SEQ ID NO 14, SEQID NO 15, SEQID NO 16, SEQID NO 17, SEQID NO 19, SEQID NO 26 et SEQID NO 27, de préférence SEQID NO 2.
Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne une cellule hôte comprenant au moins une copie d’une molécule d’acides nucléiques codant pour un polypeptide ayant une séquence d’acides aminés ayant de préférence au moins 70% d’identité, de préférence encore au moins 75% d’identité, de manière encore préférée au moins 80% d’identité, de manière encore plus préférée au moins 85% d’identité, de manière toujours plus préférée au moins 90% d’identité, de manière plus préférentielle encore au moins 95% d’identité, de manière encore plus préférentielle au moins 96% d’identité, de manière davantage préférée au moins 97% d’identité, de manière encore préférée au moins 98% d’identité, de manière encore plus préférée au moins 99% d’identité, de manière préférée entre toutes 100% d’identité avec SEQID NO 2, SEQID NO 10, SEQ ID NO 14, SEQID NO 15, SEQID NO 16, SEQID NO 17, SEQID NO 19, SEQID NO 26 ou SEQID NO 27, de préférence SEQID NO 2.
Lorsque la cellule hôte est une cellule de levure, la ou les copies de la molécule d’acides nucléiques peu(ven)t être intégrée(s) à différents loci, préférentiellement au locus URA3, au locus JLP1, au locus LEU2, au locus SAM2, au locus MET14, et/ou au locus TRP1 du génome de ladite cellule de levure. Lorsque la cellule hôte est une cellule de levure et que plusieurs copies de la molécule d’acides nucléiques sont intégrées, les différentes copies peuvent être intégrées au même locus, ou encore à différents loci, préférentiellement à l’une quelconque des combinaisons des loci URA3, JLP1, LEU2, SAM2, MET14 et/ou TRP1.
De préférence, la ou les copies de la molécule d’acides nucléiques est(sont) intégrée(s) au locus JLP1
Avantageusement, les codons utilisés dans la molécule d’acides nucléiques ont été adaptés pour une expression optimale dans la cellule hôte sélectionnée.
Une expression optimale peut notamment être obtenue lorsque les codons choisis sont ceux utilisés de manière préférentielle par l’organisme d’origine de la cellule hôte. Les codons utilisés de manière préférentielle sont connus pour la plupart des organismes couramment utilisés dans le domaine. L’homme du métier pourra aisément déterminer les codons les plus avantageux à utiliser en fonction de la cellule hôte choisie.
A cet effet, l’homme du métier sait quelle technique utiliser pour modifier les codons de la molécule d’acides nucléiques. Les codons peuvent être par exemple modifiés par mutagénèse dirigéein vitroà partir d’un échantillon de la molécule d’acides nucléiques dont les codons sont à adapter, à l’aide d’une amplification par réaction en chaine par polymérase (PCR). Alternativement, la molécule d’acides nucléiques peut être synthétiséein vitrodirectement avec les codons optimisés.
Les cellules hôtes peuvent être cultivées dans des bioréacteurs aérobie ou anaérobie, à petite et grande échelle, dans des flacons ou des boites de Petri. La culture peut être effectuée à une température, un pH, un milieu de culture et une teneur en oxygène appropriés pour une cellule hôte donnée.
Avantageusement, les cellules hôtes telles que décrites ci-dessus peuvent être cultivées dans des milieux comprenant de fortes concentrations en phloroglucinol, notamment des concentrations supérieures ou égale à 1 g.L-1, de préférence supérieure ou égale à 2.5 g.L-1, de préférence supérieure ou égale à 5 g.L-1, de préférence supérieure ou égale à 7.5 g.L-1, de préférence supérieure ou égale à 10 g.L-1, de préférence supérieure ou égale à 15 g.L-1, et de façon encore préférée supérieure ou égale à 20 g.L-1.
Ainsi, dans un mode de réalisation avantageux, la cellule hôte comprend au moins une copie d’une molécule d’acides nucléiques codant pour un polypeptide dont une séquence d’acides aminés a au moins 70% d’identité, de préférence encore au moins 75% d’identité, de manière encore préférée au moins 80% d’identité, de manière encore plus préférée au moins 85% d’identité, de manière toujours plus préférée au moins 90% d’identité, de manière plus préférentielle encore au moins 95% d’identité, de manière encore plus préférentielle au moins 96% d’identité, de manière davantage préférée au moins 97% d’identité, de manière encore préférée au moins 98% d’identité, de manière encore plus préférée au moins 99% d’identité, de manière préférée entre toutes 100% d’identité avec SEQID NO 2. Cette cellule hôte présente une résistance au phloroglucinol ; elle peut notamment être cultivée dans des milieux comprenant de fortes concentrations en phloroglucinol, en particulier une concentration en phloroglucinol supérieure ou égale à 20 g.L-1.
Ainsi, dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, la cellule hôte comprend au moins une copie d’une molécule d’acides nucléiques codant pour un polypeptide ayant la séquence d’acides aminés du transporteur membranaire de la sous-famille PDR : SNQ2. Cette cellule hôte présente une résistance au phloroglucinol ; elle peut notamment être cultivée dans des milieux comprenant de fortes concentrations en phloroglucinol, en particulier une concentration en phloroglucinol supérieure ou égale à 20 g.L-1.
Dans un mode de réalisation particulier, l’invention concerne une cellule vivante, ou respectivement une cellule hôte telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce qu’elle exprime, respectivement surexprime, au moins une enzyme impliquée dans la biosynthèse du phloroglucinol, de préférence au moins une polykétide synthase de type III, plus préférentiellement au moins une phloroglucinol synthase.
A cette fin, on pourra notamment utiliser toute séquence connue codant pour une polykétide synthase de type III, de préférence toute séquence connue codant pour une phloroglucinol synthase, notamment celle codée par le gènePHLDchezPseudomonas fluorescens(Achkar et al., 2005 ; Zha et al., 2006) ou encore celle codée par le gènePKS1chezEctocarpus siliculosus(Meslet-Cladière et al., 2013). On pourra également utiliser les séquences décrites dans les demandes de brevets internationales WO 2019/002798 et WO 2019/002799.
L’homme du métier saura adapter les moyens et méthodes développés ci-dessus aux fins de d’exprimer ou de surexprimer ladite au moins une enzyme impliquée dans la biosynthèse du phloroglucinol et de préférence une phloroglucinol synthase.
Procédé
d’obtention
d’un
e cellule hôte
résistant
e
au
phloroglucinol
et utilisation
La présente invention concerne en outre un procédé d’obtention d’une cellule hôte résistante au phloroglucinol.
Selon un mode de réalisation, le procédé d’obtention une cellule hôte recombinante résistante au phloroglucinol comprenant au moins les étapes de :
i. fourniture d’une molécule d’acides nucléiques comprenant au moins une séquence d’acides nucléiques codant pour un polypeptide choisi parmi les transporteurs membranaires de la famille ABC, de préférence de la sous-famille PDR, et les transporteurs membranaires de la famille MFS, ou comprenant au moins une séquence d’acides nucléiques codant pour un facteur de transcription contrôlant l’expression d’un transporteur membranaire de la sous-famille PDR,
ii. clonage de ladite molécule d’acides nucléiques fournie à l’étape (i) dans un vecteur apte à permettre l’intégration et/ou l’expression de ladite molécule dans ladite cellule hôte, et
iii. mise en contact de ladite cellule hôte et dudit vecteur obtenu à l’étape (ii) afin que cette dernière soit transfectée par ledit vecteur et que ladite cellule hôte exprime ladite molécule d’acides nucléiques, ladite cellule hôte étant ainsi résistante au phloroglucinol.
Selon un mode de réalisation préféré, ledit polypeptide fourni à l’étape (i) est choisi parmi SNQ2, STE6, PDR3, AQR1, DTR1, FLR1, QDR1, YHK8 et ATR1.
Selon un mode de réalisation encore préféré, ledit polypeptide fourni à l’étape (i) est SNQ2.
Selon un mode de réalisation avantageux, ledit polypeptide fourni à l’étape (i) comprend au moins une séquence d’acides aminés ayant au moins 70% d’identité, de préférence encore au moins 75% d’identité, de manière encore préférée au moins 80% d’identité, de manière encore plus préférée au moins 85% d’identité, de manière toujours plus préférée au moins 90% d’identité, de manière plus préférentielle encore au moins 95% d’identité, de manière encore plus préférentielle au moins 96% d’identité, de manière davantage préférée au moins 97% d’identité, de manière encore préférée au moins 98% d’identité, de manière encore plus préférée au moins 99% d’identité, de manière préférée entre toutes 100% d’identité avec SEQ ID NO 2.
Dans un mode de réalisation, ladite molécule d’acides nucléiques n’est pas intégrée à l’étape (iii) dans le génome de ladite cellule hôte.
Dans un mode de réalisation alternatif et préféré, ladite molécule d’acides nucléiques est intégrée à l’étape (iii) dans le génome de ladite cellule hôte.
Selon un mode de réalisation particulier, le procédé pour obtenir une cellule hôte recombinante résistante au phloroglucinol est caractérisé en ce que ladite cellule hôte surexprime en outre au moins une enzyme impliquée dans la biosynthèse du phloroglucinol, de préférence une polykétide synthase de type III, plus préférentiellement encore au moins une phloroglucinol synthase.
Ainsi, le procédé pour obtenir une cellule hôte recombinante résistante au phloroglucinol comprenant au moins les étapes de :
i. fourniture d’une molécule d’acides nucléiques comprenant au moins une séquence d’acides nucléiques codant pour un polypeptide choisi parmi les transporteurs membranaires de la famille ABC, de préférence de la sous-famille PDR, et les transporteurs membranaires de la famille MFS, ou comprend au moins une séquence d’acides nucléiques codant pour un facteur de transcription contrôlant l’expression d’un transporteur membranaire de la sous-famille PDR,
ii. fourniture d’une molécule d’acides nucléiques comprenant au moins une séquence d’acides nucléiques codant pour une polykétide synthase de type III, notamment une polykétide synthase de type III ayant une activité phloroglucinol synthase,
iii. clonage desdites molécules d’acides nucléiques fournies aux étapes (i) et (ii) dans au moins un vecteur apte à permettre l’intégration et/ou l’expression desdites molécules dans ladite cellule hôte, et
iv. mise en contact de ladite cellule hôte et dudit au moins un vecteur obtenu à l’étape (iii) afin que cette dernière soit transfectée par le(s)dit(s) vecteur(s) et que ladite cellule hôte exprime lesdites molécules d’acides nucléiques, ladite cellule hôte étant ainsi résistante au phloroglucinol.
Selon un mode de réalisation préféré, ledit polypeptide fourni à l’étape (i) est choisi parmi SNQ2, STE6, PDR3, AQR1, DTR1, FLR1, QDR1, YHK8 et ATR1.
Selon un mode de réalisation encore préféré, ledit polypeptide fourni à l’étape (i) est SNQ2.
Selon un mode de réalisation avantageux, ledit polypeptide fourni à l’étape (i) comprend au moins une séquence d’acides aminés ayant au moins 70% d’identité, de préférence encore au moins 75% d’identité, de manière encore préférée au moins 80% d’identité, de manière encore plus préférée au moins 85% d’identité, de manière toujours plus préférée au moins 90% d’identité, de manière plus préférentielle encore au moins 95% d’identité, de manière encore plus préférentielle au moins 96% d’identité, de manière davantage préférée au moins 97% d’identité, de manière encore préférée au moins 98% d’identité, de manière encore plus préférée au moins 99% d’identité, de manière préférée entre toutes 100% d’identité avec SEQ ID NO 2.
Dans un mode de réalisation, les molécules d’acides nucléiques fournies aux étapes (i) et (ii) sont clonées à l’étape (iii) dans un seul et même vecteur.
Dans un mode de réalisation distinct et alternatif, les molécules d’acides nucléiques fournies aux étapes (i) et (ii) sont clonées à l’étape (iii) dans deux vecteurs différents.
Dans un mode de réalisation, lesdites molécules d’acides nucléiques ne sont pas intégrées à l’étape (iv) dans le génome de ladite cellule hôte.
Dans un mode de réalisation, une au moins desdites molécules d’acides nucléiques est intégrée à l’étape (iv) dans le génome de ladite cellule hôte.
Dans un mode de réalisation alternatif et préféré, lesdites molécules d’acides nucléiques sont intégrées à l’étape (iv) dans le génome de ladite cellule hôte.
De manière avantageuse, la cellule hôte est un microorganisme sélectionné parmi les bactéries, les levures, les champignons, les algues et les cyanobactéries.
La cellule hôte est de préférence une levure, ladite levure étant en particulier sélectionnée parmi les genresSaccharomyces, Candida, Ashbya , Dekkera , Pichia ( Hansenula ), Debaryomyces , Clavispora , Lodderomyces , Yarrowia , Zigosaccharomyces , Schizosaccharomyces , Torulaspora , Kluyveromyces , Brettanomycces , CryptococcusetMalassezia.
De manière encore plus particulière, la levure est sélectionnée parmi les espècesSaccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii , Saccharomyces douglasii , Saccharomyces bayanus , Zigosaccharomyces bailii , Schizosaccharomyces pombe, Dekkera brucelensis , Dekkera intermedia , Brettanomycces custersii , Brettanomycces intermedius , Kluyveromyces themotolerens , Torulaspora globosaetTorulaspora glabrata.
Encore plus particulièrement, la levure est du genreSaccharomyces, de préférence de l’espèceSaccharomyces cerevisiae.
Il est également décrit ici l’utilisation d’une cellule vivante, de préférence d’une cellule hôte telle que définie ci-dessus ou d’une cellule hôte issue du procédé d’obtention décrit ci-dessus, pour la production de phloroglucinol.
De manière avantageuse, la cellule hôte est un microorganisme sélectionné parmi les bactéries, les levures, les champignons, les algues et les cyanobactéries.
La cellule hôte est de préférence une levure, ladite levure étant en particulier sélectionnée parmi les genresSaccharomyces, Candida, Ashbya , Dekkera , Pichia ( Hansenula ), Debaryomyces , Clavispora , Lodderomyces , Yarrowia , Zigosaccharomyces , Schizosaccharomyces , Torulaspora , Kluyveromyces , Brettanomycces , CryptococcusetMalassezia.
De manière encore plus particulière, la levure est sélectionnée parmi les espècesSaccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii , Saccharomyces douglasii , Saccharomyces bayanus , Zigosaccharomyces bailii , Schizosaccharomyces pombe, Dekkera brucelensis , Dekkera intermedia , Brettanomycces custersii , Brettanomycces intermedius , Kluyveromyces themotolerens , Torulaspora globosaetTorulaspora glabrata.
Encore plus particulièrement, la levure est du genreSaccharomyces, de préférence de l’espèceSaccharomyces cerevisiae.
Méthode de production de phloroglucinol
Un autre objet de l’invention porte sur une méthode de production de phloroglucinol comprenant au moins les étapes :
i. d’obtention d’une cellule hôte par la mise en œuvre d’un procédé de production tel que défini ci-dessus,
ii. de la mise en contact de ladite cellule hôte avec un substrat approprié,
iii. d’incubation du mélange obtenu à l’étape (ii) dans des conditions adaptées pour produire du phloroglucinol ; et
iv. optionnellement, de la récupération du milieu réactionnel comprenant le phloroglucinol obtenu après l’étape (iii) et de la purification du phloroglucinol.
De manière avantageuse, la cellule hôte est telle que décrite ci-dessus. Il s’agit notamment dans un mode de réalisation préféré d’une cellule de levure, en particulier du genreSaccharomyceset de préférence de l’espèceSaccharomyces cerevisiae.
L’Homme du métier, grâce à ses connaissances générales, saura identifier les conditions de culture adaptées pour produire du phloroglucinol selon l’étape (iii). Il saura notamment ajuster la température, le pH, les quantités de O2et de CO2et autres paramètres, en fonction du type cellulaire employé dans la mise en œuvre de la méthode de production décrite ci-dessus.
En particulier, aux fins de la méthode de production décrite ci-dessus, le substrat est une source de carbone. Avantageusement, la source de carbone est une source de carbone pure ou un coproduit industriel (tel que la mélasse ou les égouts pauvres, par exemple issus de l’industrie sucrière). De préférence, le substrat dans la source de carbone pure ou le coproduit industriel est un sucre simple, tel que le glucose (ou dextrose), le fructose, le galactose, le mannose, le saccharose, le lactose, ou le maltose ; un sucre complexe, tel qu’un monosaccharide, un disaccharide ou un trisaccharide, ou encore un polysaccharide comme l’amidon ; un alcool, tel que l’éthanol ; un acide ; un acide gras et leur dérivé d’ester ; ou un mélange de sucres, d’alcools, d’acides et/ou d’acides gras ou leurs dérivés d’ester.
De préférence, le substrat est le glucose ou le saccharose. Alternativement, le substrat est l’éthanol.
Les exemples qui suivent visent à illustrer la présente invention sans aucune limitation.
EXEMPLES
Exemple 1 : Méthode de dosage du phloroglucinol
La méthode de dosage du phloroglucinol a été mise au point comme détaillé ci-dessous. Elle comprend notamment une étape d’extraction du phloroglucinol suivie d’une étape de dosage par chromatographie.
1.1
Extraction du
phloroglucinol
La méthode a été développée en employant le résorcinol comme étalon interne (EI). Différents tests ont conduit au développement d’une méthode d’extraction liquide-liquide réalisée à pH 4.0 en présence d’acétate d’éthyle comme solvant, et en saturant la phase aqueuse en NaCl. L’extraction est réalisée pendant 30 min sous agitation circulaire. La phase organique est prélevée et le solvant acétate d’éthyle est évaporé sous un flux d’azote N2à 30°C. L’extrait sec obtenu après évaporation complète est alors repris dans un volume déterminé d’un mélange 50 % -50 % éthanol/H20.
Le rendement d’extraction (RDT) a été mesuré par spectroscopie de masse après chromatographie haute pression sur une colonne C18 (dimensions : 100 mm*2.1 mm ; granulométrie : 1.7 µm) en employant un gradient 0.03% acide méthanoïque (HCOOH)/ acétonitrile (ACN).
Les RDTs ont été déterminés en utilisant des solutions de phloroglucinol et résorcinol, préparées dans le milieu de culture utilisé pour la croissance des levures. Les concentrations de phloroglucinol correspondent aux points bas (20 µg.mL-1) et haut (200 µg.mL-1) de la gamme de dosage. La concentration du résorcinol correspond à la concentration ajoutée en tant qu’étalon interne lors des dosages (200 µg.mL-1). Les résultats sont présentés dans le Tableau 1.
Tableau 1: Rendement d’extraction (RDT) du phloroglucinol (20 et 200 µg.mL-1) et du résorcinol (200 µg.mL-1), extraits par l’acétate d’éthyle, selon la méthode décrite.
| Produit | Phloroglucinol | Résorcinol (EI) | |
| Concentration de phloroglucinol ou de résorcinol dans le milieu de culture (µg.mL-1) | 20 | 200 | 200 |
| RDT (%) | 76 | 89 | 82 |
1.2
Méthode de mesure par chromatographie : une méthode d’analyse UPLC/UV et UPLC/MS
Une méthode d’analyse par chromatographie UPLC et mesure d’absorbance en UV (rayonnement ultraviolet) a été développée. L’extrait est chromatographié sur une colonne propyl-pentafluorophenyl (PFP) de dimensions 100mm*2.1 mm ; granulométrie :1.8 µm selon un gradient de 0.1% HCOOH/ACN - 0.1% HCOOH. Le phloroglucinol est détecté en UV à 230 nm. Une méthode UPLC couplée à un spectromètre de masse (UPLC/Mass) a également été développée.
La quantification est réalisée en employant une gamme de 20 à 200 µg.mL-1de phloroglucinol dilué dans du milieu de culture de levure (Yeast Extract 1%, BactoPeptone 2 %) en présence d’une quantité fixe de résorcinol, employé comme témoin interne. La quantité de phloroglucinol est déterminée en calculant les rapports de surface des pics de chromatographie phloroglucinol / résorcinol.
Cette méthode de dosage permet donc de mesurer qualitativement et quantitativement, de manière fiable, le phloroglucinol présent dans un milieu de culture.
Exemple
2
: Evaluation de la toxicité du
phloroglucinol
sur les cellules de
bactérie
ou de levure
Afin de connaitre le seuil de tolérance de bactéries ou de levures au phloroglucinol, des cinétiques de croissance ont été réalisées en présence de différentes concentrations de phloroglucinol. Ces expériences préliminaires visant à évaluer leur EC50.
L’expérience a été conduite de la manière suivante. Le phloroglucinol a été dissous à la concentration de 15 g.L-1dans du milieu complet (Yeast Extract 1% + Bacto-Peptone 2%) contenant du glucose 2% comme source carbonée (milieu YPD). Les milieux de cultures contenant des concentrations inférieures de phloroglucinol ont été obtenus par dilution de ce premier milieu dans le même milieu YPD contenant 2% de glucose.
Pour réaliser l’expérience, les cellules de levure ou de bactérie sauvages ont été ensemencées à une D.O600nmde 0,05 dans les différents milieux, donc contenant, dès le démarrage des cultures, soit 0 (témoin positif de croissance indiqué T+), 1, 2.5, 5, 7.5, 10, ou 15 g.L-1de phloroglucinol. Les cultures ont été réalisées en microplaques 48 puits, à 28°C pour les levures, à 37°C pour la souche bactérienne, sous une forte agitation pendant 24h. Deux souches de levure (Saccharomyces cerevisiae) et une souche bactérienne (Escherichia coli) ont été testées. Les résultats obtenus sont présentés ci-dessous.
2
.1
Résultats chez la bactérie
Les résultats démontrent que l’EC50du phloroglucinol sur une souche bactérienne d’Escherichia colise situe aux alentours de 0.75 g.L-1, une inhibition très importante de la croissance étant observée dès la concentration de 1 g.L-1, une inhibition totale de la croissance étant mesurée pour toutes les concentrations supérieures ou égales à 2,5 g.L-1(Figure 1).
2
.2
Résultats chez la levure
Les résultats démontrent que l’EC50du phloroglucinol sur la souche de levure CC787-1B est supérieur à 10 g.L-1, une inhibition significative de la croissance des cellules de levure étant observée uniquement dans le milieu contenant 15 g.L-1de phloroglucinol (Figure 2).
2
.3
Poursuite des études de toxicité en présence d’éthanol
Lors du procédé de production du phloroglucinol par la levure, il est possible que l’éthanol soit co-produit selon le régime fermentaire choisi pour ce procédé. L’éthanol est susceptible d’augmenter fraction soluble du phloroglucinol dans le milieu de croissance et est donc susceptible d’accroitre la toxicité du phloroglucinol vis-à-vis des cellules de levures. La toxicité du phloroglucinol en présence d’éthanol ajouté après 20h de culture a été testée.
Les expériences ont été conduites en erlen à forte agitation en milieu complet contenant du glucose 2% comme source de carbone. Les cellules de levure ont été ensemencées à une DO600n mde 0,05 à partir de pré-cultures en milieu complet. Les cultures sont complétées avec des concentrations croissantes de phloroglucinol (0 ; 1 ; 5 ; 10 ; 15 ; 20 g/L) et incubées pendant 48h. Deux séries d’erlens ont été réalisées. Dans la seconde série, 50 g.L-1d’éthanol sont ajoutés à 20 h. La croissance est suivie par prélèvement à 18h, 20h, 22h, 24h, 42h et 48h et mesure de la DO600nm. Les résultats obtenus sont présentés ci-dessous.
Dans ces conditions, on observe deux effets (figure 3A et 3B) :
a. Dans la culture YPDA sans phloroglucinol, l’ajout d’éthanol à 20h induit une cassure dans la courbe de croissance liée au changement du régime métabolique, puis l’éthanol consommé est utilisé comme source de carbone se traduisant par une DO600nmà 48h supérieure à celle sans éthanol.
b. En présence d’éthanol, l’inhibition du phloroglucinol est légèrement plus forte à 48h, en présence de 20 g/L de phloroglucinol.
Exemple
3
: Surexpression des PDR et mesure de l’effet sur la tolérance des levures au
phloroglucinol
3
.1
Intégration des gènes codant pour les différents PDR dans la levure Saccharomyces cerevisiae
Les gènes codant pour les protéines PDR ont été amplifiés à partir d’ADN génomique de levure (W303-1A) par PCR (« polymerase chain reaction ») et clonés en plasmides. L’exactitude de la séquence a été vérifiée par séquençage. Les différents gènes codant pour les PDR ont été intégrés au génome au locus JLP1 selon la structure décrite en Figure 4A. Chaque souche construite porte un numéro YA, et une banque de 28 souches de levures surexprimant un transporteur PDR a été ainsi créée, à raison de deux clones par transporteur.
Tableau 2 :Séquences protéiques des transporteurs membranaires et facteurs de transcription PDR clonés
| Protéine | Réf. NCBI | SEQ ID NO |
| PDR5 | NP_014796.3 | SEQ ID NO : 1 |
| SNQ2 | NP_010294.1 | SEQ ID NO : 2 |
| PDR10 | PTN22535.1 | SEQ ID NO : 3 |
| PDR11 | NP_012252.1 | SEQ ID NO : 4 |
| PDR 12 | NP_015267.1 | SEQ ID NO : 5 |
| PDR15 | NP_010694.1 | SEQ ID NO : 6 |
| PDR18 | NP_014468.3 | SEQ ID NO : 7 |
| ADP1 | NP_009937.2 | SEQ ID NO : 8 |
| AUS1 | NP_014654.1 | SEQ ID NO : 9 |
| STE6 | NP_012713.1 | SEQ ID NO : 10 |
| YOL075C | NP_014567.2 | SEQ ID NO : 11 |
| YOR1 | NP_011797.3 | SEQ ID NO : 12 |
| PDR1 | NP_011502.1 | SEQ ID NO : 13 |
| PDR3 | NP_009548.1 | SEQ ID NO : 14 |
Tableau 3 :Séquences nucléotidiques des promoteurs et terminateurs utilisés pour les clonages
| Nom | SEQ ID NO |
| pCCW12 | SEQ ID NO : 34 |
| tRPL15A | SEQ ID NO : 35 |
3
.2
Effet de la surexpression des PDR sur la tolérance des souches au
phloroglucinol
Afin de tester l’impact de la surexpression des PDR sur la tolérance au phloroglucinol à haute concentration de phloroglucinol (>15 g.L-1), les souches ont été cultivées comme suit.
Le phloroglucinol a été dissous à la concentration de 20 g.L-1dans du milieu YPD contenant du glucose 2% comme source carbonée. Pour réaliser l’expérience, les levures exprimant chaque PDR ont été ensemencées à une DO600nmde 0,05. Les cultures ont été réalisées en microplaques 48 puits, incubées sous agitation à 28°C pendant 24h. Après 24h, la DO600nmest mesurée. La Figure 5 représente les DO600nmobtenues à l’issue de la culture.
Les résultats montrent clairement que parmi tous les PDR testés, seule la surexpression de SNQ2 permet de lever la toxicité du phloroglucinol lorsqu’il est présent dans le milieu à hauteur de 20 g.L-1. Les résultats sont confirmés dans les deux clones isolés YA2786-1 et YA2786-2. Par ailleurs, la surexpression de PDR3 ainsi que de STE6 permet, pour au moins un des deux clones de chaque lignée transgénique, d’augmenter la résistance des levures au phloroglucinol par rapport à la lignée non transgénique correspondante. Concernant les autres membres de la sous-famille PDR ici testés, on remarque que leur surexpression n’a pas d’impact sur la croissance de la levure.
Ainsi, les résultats indiquent que le phloroglucinol est un substrat de SNQ2. Dans la littérature, peu de données sont disponibles sur le spectre de molécules transportées par SNQ2.
Les expériences ont été refaites selon le même protocole en présence de 40 g.L-1d’éthanol. Les résultats obtenus ont été comparables à ceux présentés en Figure 5. L’ajout d’éthanol (40 g.L-1) qui augmente la fraction soluble du phloroglucinol dans le milieu n’impacte pas la résistance au phloroglucinol conférée par la surexpression de SNQ2.
Exemple
4
: Surexpression des MFS et mesure de l’effet sur la tolérance des levures au
phloroglucinol
4
.1
Intégration des gènes codant pour les différents MFS dans la levure Saccharomyces cerevisiae
Les gènes codant pour les protéines MFS ont été amplifiés à partir d’ADN génomique de levure (W303-1A) par PCR (« polymerase chain reaction ») et clonés en plasmides. L’exactitude de la séquence a été vérifiée par séquençage. Les différents gènes codant pour les MFS ont été intégrés au génome au locus JLP1 selon la structure décrite en Figure 6A. Chaque souche construite porte un numéro YA, et une banque de 38 souches de levures surexprimant un transporteur MFS a été ainsi créée, à raison de deux clones par transporteur.
Tableau 4 :Séquences protéiques des transporteurs membranaires MFS clonés
| Protéine | Réf. NCBI | SEQ ID NO |
| AQR1 | NP_014334.3 | SEQ ID NO : 15 |
| DTR1 | NP_009739.1 | SEQ ID NO : 16 |
| FLR1 | NP_009562.1 | SEQ ID NO : 17 |
| HOL1 | NP_014453.3 | SEQ ID NO : 18 |
| QDR1 | KZV10493.1 | SEQ ID NO : 19 |
| QDR2 | EGA61893.1 | SEQ ID NO : 20 |
| QDR3 | NP_009599.2 | SEQ ID NO : 21 |
| TPO1 | NP_013072.1 | SEQ ID NO : 22 |
| TPO2 | AJS07311.1 | SEQ ID NO : 23 |
| TPO3 | NP_015482.1 | SEQ ID NO : 24 |
| TPO4 | NP_014916.1 | SEQ ID NO : 25 |
| YHK8 | NP_011914.1 | SEQ ID NO : 26 |
| ATR1 | NP_013591.1 | SEQ ID NO : 27 |
| GEX1 | NP_009863.2 | SEQ ID NO : 28 |
| AZR1 | NP_011740.3 | SEQ ID NO : 29 |
| SGE1 | NP_015524.1 | SEQ ID NO : 30 |
| SIT1 | NP_010849.3 | SEQ ID NO : 31 |
| ENB1 | NP_014484.1 | SEQ ID NO : 32 |
| GEX2 | NP_013032.1 | SEQ ID NO : 33 |
4
.2
Effet de la surexpression des
MFS
sur la tolérance des souches au
phloroglucinol
Afin de tester l’impact de la surexpression des MFS sur la tolérance au phloroglucinol à haute concentration de phloroglucinol (> 15 g.L-1), les souches ont été cultivées comme suit.
Le phloroglucinol a été dissous à la concentration de 20 g.L-1dans du milieu YPD contenant du glucose 2% comme source carbonée. Pour réaliser l’expérience, les levures exprimant chaque MFS ont été ensemencées à une DO600nmde 0,05. Les cultures ont été réalisées en microplaques 48 puits, incubées sous agitation à 28°C pendant 24h. Après 24h, la DO600nmest mesurée. La Figure 7 représente les DO600nmobtenues à l’issue de la culture.
Les résultats montrent clairement que parmi tous les transporteurs MFS testés, la surexpression de AQR1, DTR1, FLR1, QDR1, YHK8 ainsi que ATR1 permet, pour chacun des deux clones de chaque lignée transgénique, d’augmenter de façon importante la résistance des levures au phloroglucinol par rapport à la lignée non transgénique correspondante. Concernant les autres membres de la sous-famille PDR ici testés, on remarque que leur surexpression n’a pas d’impact sur la croissance de la levure.
Contrairement à ce qui a été observé pour les transporteurs PDR, aucun des transporteurs MFS testé ne permet de lever totalement la toxicité du phloroglucinol.
Conclusion
Les résultats obtenus démontrent que le phloroglucinol est toxique chez la bactérie comme chez la levure. La toxicité du phloroglucinol sur des cellules de levure étant apparente à partir d’une concentration en phloroglucinol de 15 g.L-1.
Deux banques, contenant respectivement 28 et 38 souches de levures transgéniques, ont été créées et les résultats de l’étude de toxicité du phloroglucinol montrent que la surexpression du facteur de transcription PDR3, ainsi que des transporteurs STE6, AQR1, DTR1, FLR1, QDR1, YHK8 et ATR1 permet d’augmenter la résistance des levures au phloroglucinol. De manière intéressante, la surexpression du transporteur SNQ2 confère la résistance au phloroglucinol à hauteur de 20 g.L-1dans le milieu et ce même en présence de 40 g.L-1d’éthanol, ce dernier augmentant la fraction soluble dans le milieu du phloroglucinol et donc sa toxicité.
Claims (15)
- Cellule vivante, de préférence cellule hôte, résistante au phloroglucinol caractérisée en ce qu’elle résiste à une concentration de phloroglucinol, dans son milieu de culture, supérieure ou égale à 1 g.L-1.
- 2. Cellule hôte selon la revendication 1 caractérisée en ce qu’elle surexprime au moins un transporteur membranaire, ou au moins un facteur de transcription contrôlant l’expression dudit transporteur membranaire.
- Cellule hôte selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2 caractérisée en ce que ledit transporteur membranaire appartient à la famille des transporteurs ABC, de préférence à la sous-famille PDR, ou à la famille des transporteurs MFS.
- 4. Cellule hôte selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que ledit transporteur ou ledit facteur de transcription est choisi parmi SNQ2, STE6, PDR3, AQR1, DTR1, FLR1, QDR1, YHK8 et ATR1.
- Cellule hôte selon l’une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisée en ce qu’elle résiste à une concentration de phloroglucinol, dans son milieu de culture, supérieure ou égale à 20 g.L-1.
- 6. Cellule hôte selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisée en ce que ledit transporteur est SNQ2.
- 7. Cellule hôte selon l’une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisée en ce qu’elle surexprime un polypeptide comprenant au moins une séquence d’acides aminés ayant au moins 70%, de préférence au moins 80% d’identité avec SEQ ID NO 2.
- 8. Cellule vivante, ou respectivement cellule hôte, selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu’elle exprime, ou respectivement surexprime, au moins une enzyme impliquée dans la biosynthèse du phloroglucinol, de préférence au moins une phloroglucinol synthase.
- 9. Cellule hôte selon l’une quelconque des revendications 1 à 8 caractérisée en ce que ladite cellule hôte est un microorganisme sélectionné parmi les bactéries, levures, champignons, algues, cyanobactéries, de préférence une levure, ladite levure étant en particulier sélectionnée parmi les genresSaccharomyces, Candida, Ashbya , Dekkera , Pichia ( Hansenula ), Debaryomyces , Clavispora , Lodderomyces , Yarrowia , Zigosaccharomyces , Schizosaccharomyces , Torulaspora , Kluyveromyces , Brettanomycces , CryptococcusetMalassezia; de manière plus particulière parmi les espècesSaccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii , Saccharomyces douglasii , Saccharomyces bayanus , Zigosaccharomyces bailii , Schizosaccharomyces pombe, Dekkera brucelensis , Dekkera intermedia , Brettanomycces custersii , Brettanomycces intermedius , Kluyveromyces themotolerens , Torulaspora globosaetTorulaspora glabrata; encore plus particulièrement, la levure est du genreSaccharomyces, de préférence de l’espèceSaccharomyces cerevisiae.
- 10. Procédé d’obtention d’une cellule hôte recombinante résistante au phloroglucinol comprenant au moins les étapes de :
i. fourniture d’une molécule d’acides nucléiques comprenant au moins une séquence d’acides nucléiques codant pour un polypeptide choisi parmi les transporteurs membranaires de la famille ABC, de préférence de la sous-famille PDR, et les transporteurs membranaires de la famille MFS, ou comprenant au moins une séquence d’acides nucléiques codant pour un facteur de transcription contrôlant l’expression d’un transporteur membranaire de la sous-famille PDR,
ii. clonage de ladite molécule d’acides nucléiques fournie à l’étape (i) dans un vecteur apte à permettre l’intégration et/ou l’expression de ladite molécule dans ladite cellule hôte,
iii. mise en contact de ladite cellule hôte et dudit vecteur obtenu à l’étape (ii) afin que cette dernière soit transfectée par ledit vecteur et que ladite cellule hôte exprime ladite molécule d’acides nucléiques, ladite cellule hôte étant ainsi résistante au phloroglucinol. - 11. Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce que ladite molécule d’acides nucléiques code pour un polypeptide choisi parmi SNQ2, STE6, PDR3, AQR1, DTR1, FLR1, QDR1, YHK8 et ATR1, de préférence SNQ2.
- Procédé selon l’une quelconque des revendications 10 ou 11 caractérisé en ce que ledit polypeptide comprend au moins une séquence d’acides aminés ayant au moins 70% d’identité, de préférence au moins 80% avec SEQ ID NO 2.
- 13. Procédé selon l’une quelconque des revendications 10 à 12 caractérisé en ce que ladite cellule hôte surexprime en outre au moins une enzyme impliquée dans la biosynthèse du phloroglucinol, de préférence au moins une polykétide synthase de type III, plus préférentiellement une phloroglucinol synthase.
- 14. Méthode de production de phloroglucinol comprenant au moins les étapes :
i. d’obtention d’une cellule hôte par la mise en œuvre d’un procédé selon l’une quelconque des revendications 10 à 13,
ii. de la mise en contact de ladite cellule hôte avec un substrat approprié,
iii. d’incubation du mélange obtenu à l’étape (ii) dans des conditions adaptées pour produire du phloroglucinol ; et
iv. optionnellement, de la récupération du milieu réactionnel comprenant le phloroglucinol obtenu après l’étape (iii) et de la purification du phloroglucinol. - 15. Procédé selon l’une quelconque des revendications 10 à 13, ou méthode de production selon la revendication 14, caractérisé(e) en ce que ladite cellule vivante, de préférence ladite cellule hôte, est une cellule de levure, en particulier du genreSaccharomyceset de préférence de l’espèceSaccharomyces cerevisiae.
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| EP20709646.2A EP3921407A1 (fr) | 2019-02-05 | 2020-02-05 | Cellule, notamment levure, résistante au phloroglucinol |
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Citations (5)
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