CA2934558A1 - Proteines recombinantes possedant une activite de facteur h - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne une protéine recombinante possédant une activité de facteur H.
Description
PROTEINES RECOMBINANTES POSSEDANT UNE ACTIVITE DE FACTEUR H
L'invention concerne une protéine recombinante possédant une activité de facteur H.
Arrière plan de l'invention:
Le facteur H est une protéine plasmatique de 155 kDa dont la fonction principale est la régulation de l'activité du complément induite par la voie alterne. Le facteur H est constitué de 20 domaines répétés SCR (Short Consensus Repeats) (également appelés CCP ou SHUSHI) d'environ 60 acides aminés liés entre eux par une courte séquence linker de 3 à 8 acides aminés. Les domaines SCR1-4 portent l'activité d'accélération de la dissociation des C3 et C5 convertases et l'activité de régulation du facteur I qui permet l'inactivation de la protéine C3b.
Ces domaines N-terminaux sont suffisants pour réguler l'activité de la C3 convertase en phase liquide, mais les domaines SCR19-20 sont nécessaires à l'activité du facteur H
à la surface des cellules. Les autres domaines SCR du Facteur H peuvent également contribuer plus ou moins directement à l'activité du facteur H, certains contenants des sites de liaisons pour d'autres molécules telles que les héparanes sulfates et les glycosaminoglycannes, les pentraxines (CRP, PTX3), la fibromoduline ou le malondialdéhyde. Certains de ces domaines contiennent également des sites de glycosylations qui peuvent contribuer à la demi-vie de la molécule et à
l'efficacité de sa production sous forme recombinante, d'autres pourraient avoir un rôle important pour la conformation tridimensionnelle du facteur H, comme par exemple les domaines SCR12, SCR13, SCR14 qui confèrent au facteur H un repliement particulier en forme d'épingle à cheveux (hairpin) (Schmidt et al, J Mol Biol. 2010 January 08; 395(1):
105-122).
Le facteur H est un facteur thérapeutique prometteur pour le traitement de nombreuses maladies liées à des dépôts dense de C3 ou à une activation du complément ou une inflammation incontrôlée. Cependant, dans certaines indications telles que la DMLA
(Dégénérescence Maculaire Liée à l'Age), la GNMP de type 2 (GloméruloNéphrite Membrano-Proliférative), le SHU atypique (Syndrome Hémorragique Urémique) ou certaines maladies auto-immunes, l'utilisation du facteur H pourrait être limitée en raison de certains inconvénients: biodisponibilité, pharmacocinétique et pharmacodynamie, pouvoir immunogène, liaison aux héparanes sulfates, liaison à des ligands non identifiés, liaisons à des pathogènes permettant leur échappement immunitaire (S.pneumoniae, N.meningitidis,...) et auto-association du facteur H. Ces inconvénients sont liés aux propriétés moléculaires du facteur H et donc à l'organisation des domaines SCR du facteur H.
Un dérivé du facteur H combinant les domaines SCR1 à SCR4 aux domaines SCR19 et SCR20 du facteur H (Hebecker et al, Journal of Immunology 2013, June 10, publié en ligne) a été proposé. Dans ce dérivé du facteur H construit pour diriger l'activité du facteur H à la surface des cellules, les deux domaines de régulation du complément et de reconnaissance de surfaces sont liés entre eux par les 6 acides aminés naturels trouvés entre la quatrième cystéine du domaine SCR4 et la première cystéine du domaine SCR19.
Cependant d'autres domaines du facteur H pourraient être également nécessaire pour obtenir une efficacité thérapeutique supérieure à celle du facteur H, tel par exemple pour obtenir une meilleure liaison aux cellules, pour préserver ou augmenter la demi-vie du FH
ou pour conserver ou favoriser le repliement caractéristique du FH en épingle à
cheveu. Il existe donc un besoin de molécules dérivées du facteur H, lesdites molécules dérivées du facteur H
présentant une activité de facteur H, présentant un avantage par rapport au facteur H ou ne présentant pas les inconvénients du facteur H, et dont l'activité serait de préférence conservée ou améliorée par rapport à celle du facteur H.
Résumé de l'invention:
La demanderesse répond ici à ce besoin en proposant des protéines recombinantes dérivées du facteur H présentant un réarrangement du nombre et de l'organisation des domaines SCR du facteur H qui conservent une activité de facteur H. Les protéines recombinantes selon l'invention comprennent à minima les domaines SCR1-4 (SCR1, SCR2, SCR3 et SCR4, dans cet ordre), SCR19 et SCR20 du facteur H.
Un objet de l'invention concerne donc une protéine recombinante possédant une activité de facteur H, comprenant, de l'extrémité N-terminale à l'extrémité C-terminale, une première séquence d'acides aminés comprenant au moins les domaines SCR1 à SCR4 du facteur H, et une deuxième séquence d'acides aminés comprenant au moins les domaines SCR19 et SCR20 du facteur H, ladite protéine recombinante n'étant pas un facteur H naturel, et sous réserve que si la première séquence est constituée des domaines SCR1 à SCR4 et la deuxième séquence est constituée des domaines SCR19 et SCR20, le linker soit un linker synthétique.
L'invention a également pour objet un acide nucléique codant une protéine recombinante selon l'invention, un vecteur comprenant un tel acide nucléique, une cellule hôte comprenant
L'invention concerne une protéine recombinante possédant une activité de facteur H.
Arrière plan de l'invention:
Le facteur H est une protéine plasmatique de 155 kDa dont la fonction principale est la régulation de l'activité du complément induite par la voie alterne. Le facteur H est constitué de 20 domaines répétés SCR (Short Consensus Repeats) (également appelés CCP ou SHUSHI) d'environ 60 acides aminés liés entre eux par une courte séquence linker de 3 à 8 acides aminés. Les domaines SCR1-4 portent l'activité d'accélération de la dissociation des C3 et C5 convertases et l'activité de régulation du facteur I qui permet l'inactivation de la protéine C3b.
Ces domaines N-terminaux sont suffisants pour réguler l'activité de la C3 convertase en phase liquide, mais les domaines SCR19-20 sont nécessaires à l'activité du facteur H
à la surface des cellules. Les autres domaines SCR du Facteur H peuvent également contribuer plus ou moins directement à l'activité du facteur H, certains contenants des sites de liaisons pour d'autres molécules telles que les héparanes sulfates et les glycosaminoglycannes, les pentraxines (CRP, PTX3), la fibromoduline ou le malondialdéhyde. Certains de ces domaines contiennent également des sites de glycosylations qui peuvent contribuer à la demi-vie de la molécule et à
l'efficacité de sa production sous forme recombinante, d'autres pourraient avoir un rôle important pour la conformation tridimensionnelle du facteur H, comme par exemple les domaines SCR12, SCR13, SCR14 qui confèrent au facteur H un repliement particulier en forme d'épingle à cheveux (hairpin) (Schmidt et al, J Mol Biol. 2010 January 08; 395(1):
105-122).
Le facteur H est un facteur thérapeutique prometteur pour le traitement de nombreuses maladies liées à des dépôts dense de C3 ou à une activation du complément ou une inflammation incontrôlée. Cependant, dans certaines indications telles que la DMLA
(Dégénérescence Maculaire Liée à l'Age), la GNMP de type 2 (GloméruloNéphrite Membrano-Proliférative), le SHU atypique (Syndrome Hémorragique Urémique) ou certaines maladies auto-immunes, l'utilisation du facteur H pourrait être limitée en raison de certains inconvénients: biodisponibilité, pharmacocinétique et pharmacodynamie, pouvoir immunogène, liaison aux héparanes sulfates, liaison à des ligands non identifiés, liaisons à des pathogènes permettant leur échappement immunitaire (S.pneumoniae, N.meningitidis,...) et auto-association du facteur H. Ces inconvénients sont liés aux propriétés moléculaires du facteur H et donc à l'organisation des domaines SCR du facteur H.
Un dérivé du facteur H combinant les domaines SCR1 à SCR4 aux domaines SCR19 et SCR20 du facteur H (Hebecker et al, Journal of Immunology 2013, June 10, publié en ligne) a été proposé. Dans ce dérivé du facteur H construit pour diriger l'activité du facteur H à la surface des cellules, les deux domaines de régulation du complément et de reconnaissance de surfaces sont liés entre eux par les 6 acides aminés naturels trouvés entre la quatrième cystéine du domaine SCR4 et la première cystéine du domaine SCR19.
Cependant d'autres domaines du facteur H pourraient être également nécessaire pour obtenir une efficacité thérapeutique supérieure à celle du facteur H, tel par exemple pour obtenir une meilleure liaison aux cellules, pour préserver ou augmenter la demi-vie du FH
ou pour conserver ou favoriser le repliement caractéristique du FH en épingle à
cheveu. Il existe donc un besoin de molécules dérivées du facteur H, lesdites molécules dérivées du facteur H
présentant une activité de facteur H, présentant un avantage par rapport au facteur H ou ne présentant pas les inconvénients du facteur H, et dont l'activité serait de préférence conservée ou améliorée par rapport à celle du facteur H.
Résumé de l'invention:
La demanderesse répond ici à ce besoin en proposant des protéines recombinantes dérivées du facteur H présentant un réarrangement du nombre et de l'organisation des domaines SCR du facteur H qui conservent une activité de facteur H. Les protéines recombinantes selon l'invention comprennent à minima les domaines SCR1-4 (SCR1, SCR2, SCR3 et SCR4, dans cet ordre), SCR19 et SCR20 du facteur H.
Un objet de l'invention concerne donc une protéine recombinante possédant une activité de facteur H, comprenant, de l'extrémité N-terminale à l'extrémité C-terminale, une première séquence d'acides aminés comprenant au moins les domaines SCR1 à SCR4 du facteur H, et une deuxième séquence d'acides aminés comprenant au moins les domaines SCR19 et SCR20 du facteur H, ladite protéine recombinante n'étant pas un facteur H naturel, et sous réserve que si la première séquence est constituée des domaines SCR1 à SCR4 et la deuxième séquence est constituée des domaines SCR19 et SCR20, le linker soit un linker synthétique.
L'invention a également pour objet un acide nucléique codant une protéine recombinante selon l'invention, un vecteur comprenant un tel acide nucléique, une cellule hôte comprenant
2 un tel acide nucléique ou un tel vecteur et un animal transgénique dont le génome comprend un tel acide nucléique.
L'invention a également pour objet une protéine recombinante selon l'invention, pour le traitement de maladies dues à une inflammation incontrôlée ou un dépôt de C3 convertase incontrôlé. Plus généralement la protéine recombinante selon l'invention peut-être utile pour le traitement de toute maladie pour laquelle une activité anti-complément du facteur H est bénéfique.
Description détaillée de l'invention:
Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne une protéine recombinante dérivée du facteur H présentant un réarrangement des domaines SCR, tant sur le plan de leur nombre que de leur organisation, ladite protéine recombinante comprenant, dans cet ordre, une première séquence en acides aminés comprenant les domaines SCR1-4 du facteur H et une deuxième séquence en acides aminés comprenant les domaines SCR19 et SCR20 du facteur H. La première et/ou la deuxième séquence en acides aminés peuvent en outre comprendre un ou plusieurs autres domaines SCR de facteur H réarrangés Dans un mode de réalisation, un ou plusieurs domaines SCR du facteur H peut être présent en plusieurs exemplaires. Par exemple, une protéine recombinante selon l'invention peut inclure un, deux, trois, ou plus de trois exemplaires d'un même SCR, par exemple un, deux, trois ou plus de trois exemplaires du domaine SCR1, SCR2, SCR3, SCR4, SCR5, SCR6, SCR7, SCR8, SCR9, SCR10, SCR11, SCR12, SCR13, SCR14, SCR15, SCR16, SCR17, SCR18, SCR19 et/SCR20 du facteur H. Selon un mode particulier de réalisation, la protéine recombinante selon l'invention comprend un, deux, trois ou plus de trois exemplaires du domaine SCR7 du facteur H, en particulier du domaine SCR7 du variant Y402 du facteur H.
Une autre variante inclut une protéine recombinante comprenant de multiples exemplaires d'un ensemble de domaines SCR. Par exemple, la protéine recombinante selon l'invention peut comprendre un, deux, trois ou plus de trois répétitions des domaines SCR1 à SCR4, c'est-à-dire que la protéine comprend le motif (SCR1-SCR4)õ, n étant un entier égal à 1, 2, 3 ou supérieur à 3, en particulier n étant égal à 1, 2 ou 3. Dans un autre mode de réalisation, le domaine ou l'ensemble de domaines présents en plusieurs exemplaires ne sont pas des répétitions des domaines ou ensemble de domaines, mais peuvent être présents dans la protéine recombinante séparés par d'autres domaines SCR. En d'autres termes, l'invention concerne notamment des protéines recombinantes comprenant, dans cet ordre, les domaines
L'invention a également pour objet une protéine recombinante selon l'invention, pour le traitement de maladies dues à une inflammation incontrôlée ou un dépôt de C3 convertase incontrôlé. Plus généralement la protéine recombinante selon l'invention peut-être utile pour le traitement de toute maladie pour laquelle une activité anti-complément du facteur H est bénéfique.
Description détaillée de l'invention:
Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne une protéine recombinante dérivée du facteur H présentant un réarrangement des domaines SCR, tant sur le plan de leur nombre que de leur organisation, ladite protéine recombinante comprenant, dans cet ordre, une première séquence en acides aminés comprenant les domaines SCR1-4 du facteur H et une deuxième séquence en acides aminés comprenant les domaines SCR19 et SCR20 du facteur H. La première et/ou la deuxième séquence en acides aminés peuvent en outre comprendre un ou plusieurs autres domaines SCR de facteur H réarrangés Dans un mode de réalisation, un ou plusieurs domaines SCR du facteur H peut être présent en plusieurs exemplaires. Par exemple, une protéine recombinante selon l'invention peut inclure un, deux, trois, ou plus de trois exemplaires d'un même SCR, par exemple un, deux, trois ou plus de trois exemplaires du domaine SCR1, SCR2, SCR3, SCR4, SCR5, SCR6, SCR7, SCR8, SCR9, SCR10, SCR11, SCR12, SCR13, SCR14, SCR15, SCR16, SCR17, SCR18, SCR19 et/SCR20 du facteur H. Selon un mode particulier de réalisation, la protéine recombinante selon l'invention comprend un, deux, trois ou plus de trois exemplaires du domaine SCR7 du facteur H, en particulier du domaine SCR7 du variant Y402 du facteur H.
Une autre variante inclut une protéine recombinante comprenant de multiples exemplaires d'un ensemble de domaines SCR. Par exemple, la protéine recombinante selon l'invention peut comprendre un, deux, trois ou plus de trois répétitions des domaines SCR1 à SCR4, c'est-à-dire que la protéine comprend le motif (SCR1-SCR4)õ, n étant un entier égal à 1, 2, 3 ou supérieur à 3, en particulier n étant égal à 1, 2 ou 3. Dans un autre mode de réalisation, le domaine ou l'ensemble de domaines présents en plusieurs exemplaires ne sont pas des répétitions des domaines ou ensemble de domaines, mais peuvent être présents dans la protéine recombinante séparés par d'autres domaines SCR. En d'autres termes, l'invention concerne notamment des protéines recombinantes comprenant, dans cet ordre, les domaines
3 SCR1-SCR4, SCR7, SCR7 et SCR19-SCR20, ou encore les domaines SCR1-SCR4, SCR7, SCR1-SCR4, et SCR19-20, ou toute autre combinaison possible de ces domaines.
Le facteur H dont est dérivée la protéine selon l'invention peut être tout facteur H dont l'activité est celle du facteur H naturel. En particulier, par "facteur H" on entend ici toute protéine ayant la séquence en acides aminés du facteur H natif humain ou provenant d'une autre espèce (par exemple bovin, porcin, canin, murin). Préférentiellement, la protéine recombinante est dérivée du facteur H humain. Le terme comprend également tout recombinant, dérivé ou mutant ayant une séquence substantiellement homologue au facteur H
natif. L'expression "séquence substantiellement homologue" comprend toute séquence soumise à une ou plusieurs substitutions, additions et/ou délétions, de préférence conservatives. Les expressions "substitutions, additions et/ou délétions conservatives"
expriment tout remplacement, ajout ou suppression de résidu acide aminé par un autre, sans altération majeure de la conformation générale et/ou de l'activité biologique du facteur H. La substitution conservative inclut, sans s'y limiter, le remplacement par un acide aminé ayant des propriétés similaires (comme par exemple la forme, la polarité, le potentiel de liaison hydrogène, l'acidité, la basicité, l'hydrophobicité et autres). Les acides aminés ayant des propriétés similaires sont bien connus dans l'art. Le terme "facteur H"
comprend en outre les variations alléliques naturelles et/ou les isoformes du facteur H trouvées naturellement chez les individus d'une même espèce, et toute forme ou degré de glycosylation ou autre modification post-traductionnelle. Sont aussi compris dans le terme "facteur H" les homologues ou dérivés du facteur H qui présentent la même activité, ou une activité
biologique supérieure par rapport a l'activité de la forme sauvage et/ou qui présentent une identité de séquence d'au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence encore d'au moins 90 %, de préférence encore au moins 95 %, de préférence encore au moins 98 %, de préférence encore au moins 99 %.
Le variant du facteur H utilisé pour concevoir la protéine recombinante de la présente invention peut notamment être un variant mentionné dans le site internet http ://www. uniprot. org/uniprot/P 08603 .
L'activité anti-complément du facteur H se traduit par la régulation de la voie alterne du complément en maintenant un niveau basal de molécule C3b. Le facteur H compète avec le facteur B pour la liaison au C3b et accélère la dissociation de la C3 convertase (C3bBb) alterne déjà formée. Il agit comme cofacteur du Facteur I dans la protéolyse du C3b, libre ou lié à la surface des cellules, qui conduit à la forme inactive C3bi. Ainsi, les complexes immuns composés d'un complexe antigène-anticorps associé au composant du complément
Le facteur H dont est dérivée la protéine selon l'invention peut être tout facteur H dont l'activité est celle du facteur H naturel. En particulier, par "facteur H" on entend ici toute protéine ayant la séquence en acides aminés du facteur H natif humain ou provenant d'une autre espèce (par exemple bovin, porcin, canin, murin). Préférentiellement, la protéine recombinante est dérivée du facteur H humain. Le terme comprend également tout recombinant, dérivé ou mutant ayant une séquence substantiellement homologue au facteur H
natif. L'expression "séquence substantiellement homologue" comprend toute séquence soumise à une ou plusieurs substitutions, additions et/ou délétions, de préférence conservatives. Les expressions "substitutions, additions et/ou délétions conservatives"
expriment tout remplacement, ajout ou suppression de résidu acide aminé par un autre, sans altération majeure de la conformation générale et/ou de l'activité biologique du facteur H. La substitution conservative inclut, sans s'y limiter, le remplacement par un acide aminé ayant des propriétés similaires (comme par exemple la forme, la polarité, le potentiel de liaison hydrogène, l'acidité, la basicité, l'hydrophobicité et autres). Les acides aminés ayant des propriétés similaires sont bien connus dans l'art. Le terme "facteur H"
comprend en outre les variations alléliques naturelles et/ou les isoformes du facteur H trouvées naturellement chez les individus d'une même espèce, et toute forme ou degré de glycosylation ou autre modification post-traductionnelle. Sont aussi compris dans le terme "facteur H" les homologues ou dérivés du facteur H qui présentent la même activité, ou une activité
biologique supérieure par rapport a l'activité de la forme sauvage et/ou qui présentent une identité de séquence d'au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence encore d'au moins 90 %, de préférence encore au moins 95 %, de préférence encore au moins 98 %, de préférence encore au moins 99 %.
Le variant du facteur H utilisé pour concevoir la protéine recombinante de la présente invention peut notamment être un variant mentionné dans le site internet http ://www. uniprot. org/uniprot/P 08603 .
L'activité anti-complément du facteur H se traduit par la régulation de la voie alterne du complément en maintenant un niveau basal de molécule C3b. Le facteur H compète avec le facteur B pour la liaison au C3b et accélère la dissociation de la C3 convertase (C3bBb) alterne déjà formée. Il agit comme cofacteur du Facteur I dans la protéolyse du C3b, libre ou lié à la surface des cellules, qui conduit à la forme inactive C3bi. Ainsi, les complexes immuns composés d'un complexe antigène-anticorps associé au composant du complément
4
5 PCT/FR2014/053484 C3b ou les facteurs activateurs de la voie alterne du complément (surfaces bactériennes, cellules infectées, levures, parasites, lipopolysaccharides, endotoxines) ne peuvent plus activer la cascade subséquente du complément (composants C5-C9). Le terme "activité
biologique" du facteur H inclut donc ici la capacité à inhiber la C3 convertase et/ou à servir de co-facteur du Facteur I, résultant en l'inhibition de l'activation de la cascade du complément.
Dans un mode de réalisation particulier, la protéine recombinante conserve l'activité
biologique d'un facteur H humain plasmatique.
L'activité biologique du facteur H humain plasmatique comprend la régulation de l'activité du facteur I, l'inhibition de la formation de la C3 convertase alterne et l'accélération de la dissociation de la C3 convertase.
Les méthodes pour déterminer les activités biologiques ci-dessus sont connues de l'homme du métier.
Dans un mode de réalisation plus particulier, ladite protéine recombinante conserve l'activité
biologique d'un facteur H humain plasmatique pour accélérer la dissociation de la C3 convertase. La quantité de C3 convertase dissociée peut être déterminée en fonction de la concentration de protéine recombinante ajoutée. L'IC50 est déterminée à partir de l'équation calculée pour une sigmoïde à pente variable.
Dans un autre mode de réalisation plus particulier, ladite protéine recombinante conserve l'activité biologique d'un facteur H plasmatique pour réguler l'activité du facteur I.
Par ailleurs, l'activité biologique de facteur H peut être évaluée en mesurant l'activité de protection des globules rouges contre la lyse par le complément selon des procédures bien connues dans l'état de la technique.
La séquence SEQ ID NO:1 représente la séquence en acides aminés du variant Y402 du facteur H humain dans lequel l'acide aminé en position 402 est une tyrosine.
Cette séquence ne comprend pas de peptide signal. La séquence SEQ ID NO:2 représente la séquence en acides aminés du variant H402 du facteur H humain dans lequel l'acide aminé en position 402 est une histidine. Cette séquence ne comprend pas de peptide signal. Dans un mode de réalisation, un ou plusieurs domaines SCR de la protéine recombinante selon l'invention sont dérivés de l'un ou l'autre de ces deux variants. Selon un mode particulier de réalisation, la protéine recombinante comprend le domaine SCR7 du variant Y402 du facteur H.
Selon des variantes de ce mode de réalisation, la première séquence de la protéine recombinante comprend les domaines SCR1 à SCR7, les domaines SCR1 à SCR8 ou les domaines SCR1 à
SCR9 du facteur H, le domaine SCR7 dans cette première séquence étant le domaine SCR7 du variant Y402 du facteur H. Dans ces variantes de réalisation, les autres domaines SCR
peuvent être dérivés du variant Y402 du facteur H ou d'un autre variant du facteur H. Par ailleurs, la première séquence peut notamment être combinée à une deuxième séquence en acides aminés comprenant les domaines SCR19 et SCR20, SCR18 à SCR20, SCR17 à
ou SCR16 à SCR20 du facteur H, la seconde séquence en acides aminés étant en particulier dérivée du variant Y402 ou du variant H402 du facteur H. Ces protéines recombinantes incluent le polymorphisme Y402 présent dans le SCR7.
Dans un mode de réalisation, la protéine recombinante selon l'invention comprend, dans cet ordre, les domaines SCR1, SCR2, SCR3, SCR4, SCR19 et SCR20 du facteur H. Dans ce mode de réalisation, les domaines SCR4 et SCR19 sont liés entre eux par un linker non naturel (ou synthétique) constitué d'une séquence comprenant entre 2 et 20 acides aminés. Par linker non naturel (ou synthétique) on désigne notamment un linker qui ne correspond pas à la séquence trouvée entre la quatrième cystéine du domaine SCR4 et la première cystéine du domaine SCR19. En particulier, la séquence en acide aminés du linker est choisie de telle manière qu'elle soit codée par un acide nucléique qui, lorsqu'il est introduit dans un vecteur de clonage et/ou d'expression, comprend un site unique de restriction (voir ci-dessous). Par exemple, le linker peut être de séquence GASG (SEQ ID NO:3).
Selon un mode de réalisation, la première ou la deuxième séquence en acides aminés de la protéine recombinante selon l'invention comprend un ou plusieurs domaines SCR
du facteur H supplémentaires choisi(s) parmi les domaines SCR5, SCR6, SCR7, SCR8, SCR9, SCR10, SCR11, SCR12, SCR13, SCR14, SCR15, SCR16, SCR17 et SCR18. L'ordre de ces domaines dans la protéine recombinante peut correspondre à l'ordre des mêmes domaines dans le facteur H naturel. Alternativement, l'ordre des domaines peut être différent de celui du facteur H naturel.
La séquence en acides aminés du domaine SCR1 (acides aminés 21 à 80) du variant Y402 du facteur H humain est représentée par la séquence SEQ ID NO: 4 (CNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNVIMVCRKGEWVALNPL
RKC). La séquence du domaine SCR1 introduit dans la protéine selon l'invention a au moins 85 %, notamment au moins 90 %, notamment au moins 95 %, notamment au moins 99 %
d'identité avec la séquence SEQ ID NO:4. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR1 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ ID NO: 4.
La séquence en acides aminés du domaine SCR2 (acides aminés 85 à 141) du variant Y402 du facteur H humain est représentée par la séquence SEQ ID NO: 5 (CGHPGDTPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPIC
biologique" du facteur H inclut donc ici la capacité à inhiber la C3 convertase et/ou à servir de co-facteur du Facteur I, résultant en l'inhibition de l'activation de la cascade du complément.
Dans un mode de réalisation particulier, la protéine recombinante conserve l'activité
biologique d'un facteur H humain plasmatique.
L'activité biologique du facteur H humain plasmatique comprend la régulation de l'activité du facteur I, l'inhibition de la formation de la C3 convertase alterne et l'accélération de la dissociation de la C3 convertase.
Les méthodes pour déterminer les activités biologiques ci-dessus sont connues de l'homme du métier.
Dans un mode de réalisation plus particulier, ladite protéine recombinante conserve l'activité
biologique d'un facteur H humain plasmatique pour accélérer la dissociation de la C3 convertase. La quantité de C3 convertase dissociée peut être déterminée en fonction de la concentration de protéine recombinante ajoutée. L'IC50 est déterminée à partir de l'équation calculée pour une sigmoïde à pente variable.
Dans un autre mode de réalisation plus particulier, ladite protéine recombinante conserve l'activité biologique d'un facteur H plasmatique pour réguler l'activité du facteur I.
Par ailleurs, l'activité biologique de facteur H peut être évaluée en mesurant l'activité de protection des globules rouges contre la lyse par le complément selon des procédures bien connues dans l'état de la technique.
La séquence SEQ ID NO:1 représente la séquence en acides aminés du variant Y402 du facteur H humain dans lequel l'acide aminé en position 402 est une tyrosine.
Cette séquence ne comprend pas de peptide signal. La séquence SEQ ID NO:2 représente la séquence en acides aminés du variant H402 du facteur H humain dans lequel l'acide aminé en position 402 est une histidine. Cette séquence ne comprend pas de peptide signal. Dans un mode de réalisation, un ou plusieurs domaines SCR de la protéine recombinante selon l'invention sont dérivés de l'un ou l'autre de ces deux variants. Selon un mode particulier de réalisation, la protéine recombinante comprend le domaine SCR7 du variant Y402 du facteur H.
Selon des variantes de ce mode de réalisation, la première séquence de la protéine recombinante comprend les domaines SCR1 à SCR7, les domaines SCR1 à SCR8 ou les domaines SCR1 à
SCR9 du facteur H, le domaine SCR7 dans cette première séquence étant le domaine SCR7 du variant Y402 du facteur H. Dans ces variantes de réalisation, les autres domaines SCR
peuvent être dérivés du variant Y402 du facteur H ou d'un autre variant du facteur H. Par ailleurs, la première séquence peut notamment être combinée à une deuxième séquence en acides aminés comprenant les domaines SCR19 et SCR20, SCR18 à SCR20, SCR17 à
ou SCR16 à SCR20 du facteur H, la seconde séquence en acides aminés étant en particulier dérivée du variant Y402 ou du variant H402 du facteur H. Ces protéines recombinantes incluent le polymorphisme Y402 présent dans le SCR7.
Dans un mode de réalisation, la protéine recombinante selon l'invention comprend, dans cet ordre, les domaines SCR1, SCR2, SCR3, SCR4, SCR19 et SCR20 du facteur H. Dans ce mode de réalisation, les domaines SCR4 et SCR19 sont liés entre eux par un linker non naturel (ou synthétique) constitué d'une séquence comprenant entre 2 et 20 acides aminés. Par linker non naturel (ou synthétique) on désigne notamment un linker qui ne correspond pas à la séquence trouvée entre la quatrième cystéine du domaine SCR4 et la première cystéine du domaine SCR19. En particulier, la séquence en acide aminés du linker est choisie de telle manière qu'elle soit codée par un acide nucléique qui, lorsqu'il est introduit dans un vecteur de clonage et/ou d'expression, comprend un site unique de restriction (voir ci-dessous). Par exemple, le linker peut être de séquence GASG (SEQ ID NO:3).
Selon un mode de réalisation, la première ou la deuxième séquence en acides aminés de la protéine recombinante selon l'invention comprend un ou plusieurs domaines SCR
du facteur H supplémentaires choisi(s) parmi les domaines SCR5, SCR6, SCR7, SCR8, SCR9, SCR10, SCR11, SCR12, SCR13, SCR14, SCR15, SCR16, SCR17 et SCR18. L'ordre de ces domaines dans la protéine recombinante peut correspondre à l'ordre des mêmes domaines dans le facteur H naturel. Alternativement, l'ordre des domaines peut être différent de celui du facteur H naturel.
La séquence en acides aminés du domaine SCR1 (acides aminés 21 à 80) du variant Y402 du facteur H humain est représentée par la séquence SEQ ID NO: 4 (CNELPPRRNTEILTGSWSDQTYPEGTQAIYKCRPGYRSLGNVIMVCRKGEWVALNPL
RKC). La séquence du domaine SCR1 introduit dans la protéine selon l'invention a au moins 85 %, notamment au moins 90 %, notamment au moins 95 %, notamment au moins 99 %
d'identité avec la séquence SEQ ID NO:4. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR1 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ ID NO: 4.
La séquence en acides aminés du domaine SCR2 (acides aminés 85 à 141) du variant Y402 du facteur H humain est représentée par la séquence SEQ ID NO: 5 (CGHPGDTPFGTFTLTGGNVFEYGVKAVYTCNEGYQLLGEINYRECDTDGWTNDIPIC
6 ). La séquence du domaine SCR2 introduit dans la protéine selon l'invention a au moins 85 %, notamment au moins 90 %, notamment au moins 95 %, notamment au moins 99 %
d'identité
avec la séquence SEQ ID NO:5. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR2 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ ID NO:
5.
La séquence en acides aminés du domaine SCR3 (acides aminés 146 à 205) du variant Y402 du facteur H humain est représentée par la séquence SEQ ID NO: 6 (CLPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIEGDEEMHCSDDGFWSKE
KPKC). La séquence du domaine SCR3 introduit dans la protéine selon l'invention a au moins 85 %, notamment au moins 90 %, notamment au moins 95 %, notamment au moins 99 %
d'identité avec la séquence SEQ ID NO:6. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR3 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ ID NO: 6.
La séquence en acides aminés du domaine SCR4 (acides aminés 210 à 262) du variant Y402 du facteur H humain est représentée par la séquence SEQ ID NO: 7 (CKS PDVIN G SPI S QKIIYKENERF QYKCNMGYEY S ERGDAVCTE S GWRPLP S C) . La séquence du domaine SCR4 introduit dans la protéine selon l'invention a au moins 85 %, notamment au moins 90 %, notamment au moins 95 %, notamment au moins 99 %
d'identité
avec la séquence SEQ ID NO:7. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR4 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ ID NO:
d'identité
avec la séquence SEQ ID NO:5. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR2 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ ID NO:
5.
La séquence en acides aminés du domaine SCR3 (acides aminés 146 à 205) du variant Y402 du facteur H humain est représentée par la séquence SEQ ID NO: 6 (CLPVTAPENGKIVSSAMEPDREYHFGQAVRFVCNSGYKIEGDEEMHCSDDGFWSKE
KPKC). La séquence du domaine SCR3 introduit dans la protéine selon l'invention a au moins 85 %, notamment au moins 90 %, notamment au moins 95 %, notamment au moins 99 %
d'identité avec la séquence SEQ ID NO:6. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR3 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ ID NO: 6.
La séquence en acides aminés du domaine SCR4 (acides aminés 210 à 262) du variant Y402 du facteur H humain est représentée par la séquence SEQ ID NO: 7 (CKS PDVIN G SPI S QKIIYKENERF QYKCNMGYEY S ERGDAVCTE S GWRPLP S C) . La séquence du domaine SCR4 introduit dans la protéine selon l'invention a au moins 85 %, notamment au moins 90 %, notamment au moins 95 %, notamment au moins 99 %
d'identité
avec la séquence SEQ ID NO:7. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR4 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ ID NO:
7.
La séquence en acides aminés du domaine SCR5 (acides aminés 266 à 320) du variant Y402 du facteur H humain est représentée par la séquence SEQ ID NO: 8 (CDNPYIPNGDYSPLRIKHRTGDEITYQCRNGFYPATRGNTAKCTSTGWIPAPRC). La séquence du domaine SCR5 introduit dans la protéine selon l'invention a au moins 85 %, notamment au moins 90 %, notamment au moins 95 %, notamment au moins 99 %
d'identité
avec la séquence SEQ ID NO:8. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR5 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ ID NO:
La séquence en acides aminés du domaine SCR5 (acides aminés 266 à 320) du variant Y402 du facteur H humain est représentée par la séquence SEQ ID NO: 8 (CDNPYIPNGDYSPLRIKHRTGDEITYQCRNGFYPATRGNTAKCTSTGWIPAPRC). La séquence du domaine SCR5 introduit dans la protéine selon l'invention a au moins 85 %, notamment au moins 90 %, notamment au moins 95 %, notamment au moins 99 %
d'identité
avec la séquence SEQ ID NO:8. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR5 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ ID NO:
8.
La séquence en acides aminés du domaine SCR6 (acides aminés 325 à 385) du variant Y402 du facteur H humain est représentée par la séquence SEQ ID NO: 9 (CDYPDIKHGGLYHENMRRPYFPVAVGKYYSYYCDEHFETPSGSYWDHIHCTQDGW
SPAVPC). La séquence du domaine SCR6 introduit dans la protéine selon l'invention a au moins 85 %, notamment au moins 90 %, notamment au moins 95 %, notamment au moins 99 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO:9. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR6 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ ID NO: 9.
La séquence en acides aminés du domaine SCR7 (acides aminés 389 à 442) du variant Y402 du facteur H humain est représentée par la séquence SEQ ID NO: 10 (CYFPYLENGYNQNYGRKFVQGKSIDVACHPGYALPKAQTTVTCMENGWSPTPRC).
La séquence du domaine SCR7 introduit dans la protéine selon l'invention a au moins 85 %, notamment au moins 90 %, notamment au moins 95 %, notamment au moins 99 %
d'identité
avec la séquence SEQ ID NO:10. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR7 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ ID NO:
10.
La séquence en acides aminés du domaine SCR8 (acides aminés 448 à 505) du variant Y402 du facteur H humain est représentée par la séquence SEQ ID NO: 11 (C SKS SIDIENGFI SES QYTYALKEKAKYQCKLGYVTADGETS GSITC GKDGWSAQPTC
). La séquence du domaine SCR8 introduit dans la protéine selon l'invention a au moins 85 %, notamment au moins 90 %, notamment au moins 95 %, notamment au moins 99 %
d'identité
avec la séquence SEQ ID NO:11. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR8 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ ID NO:
11.
La séquence en acides aminés du domaine SCR9 (acides aminés 509 à 564) du variant Y402 du facteur H humain est représentée par la séquence SEQ ID NO: 12 (CDIPVFMNARTKNDFTWFKLNDTLDYECHDGYESNTGSTTGSIVCGYNGWSDLPIC) . La séquence du domaine SCR9 introduit dans la protéine selon l'invention a au moins 85 %, notamment au moins 90 %, notamment au moins 95 %, notamment au moins 99 %
d'identité
avec la séquence SEQ ID NO:12. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR9 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ ID NO:
12.
La séquence en acides aminés du domaine SCR10 (acides aminés 569 à 623) du variant Y402 du facteur H humain est représentée par la séquence SEQ ID NO: 13 (CELPKIDVHLVPDRKKD QYKVGEVLKF S CKP GFTIVGPN SVQ CYHFGL S PD LPIC) . La séquence du domaine SCR10 introduit dans la protéine selon l'invention a au moins 85 %, notamment au moins 90 %, notamment au moins 95 %, notamment au moins 99 %
d'identité
avec la séquence SEQ ID NO:13. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR10 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ
ID NO: 13.
La séquence en acides aminés du domaine SCR11 (acides aminés 630 à 674) du variant Y402 du facteur H humain est représentée par la séquence SEQ ID NO: 14 (CGPPPELLNGNVKEKTKEEYGHSEVVEYYCNPRFLMKGPNKIQCVDGEWTTLPVC).
La séquence du domaine SCR11 introduit dans la protéine selon l'invention a au moins 85 %, notamment au moins 90 %, notamment au moins 95 %, notamment au moins 99 %
d'identité
avec la séquence SEQ ID NO:14. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR11 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ
ID NO: 14.
La séquence en acides aminés du domaine SCR12 (acides aminés 691 à 744) du variant Y402 du facteur H humain est représentée par la séquence SEQ ID NO: 15 (CGDIPELEHGWAQLS SPPYYYGD SVEFNC SESFTMIGHRSITCIHGVWTQLPQC). La séquence du domaine SCR12 introduit dans la protéine selon l'invention a au moins 85 %, notamment au moins 90 %, notamment au moins 95 %, notamment au moins 99 %
d'identité
avec la séquence SEQ ID NO:15. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR12 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ
ID NO: 15.
La séquence en acides aminés du domaine SCR13 (acides aminés 753 à 803) du variant Y402 du facteur H humain est représentée par la séquence SEQ ID NO: 16 (CKSSNLIILEEHLKNKKEFDHNSNIRYRCRGKEGWIHTVCINGRWDPEVNC). La séquence du domaine SCR13 introduit dans la protéine selon l'invention a au moins 85 %, notamment au moins 90 %, notamment au moins 95 %, notamment au moins 99 %
d'identité
avec la séquence SEQ ID NO:16. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR13 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ
ID NO: 16.
La séquence en acides aminés du domaine SCR14 (acides aminés 811 à 864) du variant Y402 du facteur H humain est représentée par la séquence SEQ ID NO: 17 (CPPPPQIPNSHNMTTTLNYRDGEKVSVLCQENYLIQEGEEITCKDGRWQSIPLC). La séquence du domaine SCR14 introduit dans la protéine selon l'invention a au moins 85 %, notamment au moins 90 %, notamment au moins 95 %, notamment au moins 99 %
d'identité
avec la séquence SEQ ID NO:17. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR14 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ
ID NO: 17.
La séquence en acides aminés du domaine SCR6 (acides aminés 325 à 385) du variant Y402 du facteur H humain est représentée par la séquence SEQ ID NO: 9 (CDYPDIKHGGLYHENMRRPYFPVAVGKYYSYYCDEHFETPSGSYWDHIHCTQDGW
SPAVPC). La séquence du domaine SCR6 introduit dans la protéine selon l'invention a au moins 85 %, notamment au moins 90 %, notamment au moins 95 %, notamment au moins 99 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO:9. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR6 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ ID NO: 9.
La séquence en acides aminés du domaine SCR7 (acides aminés 389 à 442) du variant Y402 du facteur H humain est représentée par la séquence SEQ ID NO: 10 (CYFPYLENGYNQNYGRKFVQGKSIDVACHPGYALPKAQTTVTCMENGWSPTPRC).
La séquence du domaine SCR7 introduit dans la protéine selon l'invention a au moins 85 %, notamment au moins 90 %, notamment au moins 95 %, notamment au moins 99 %
d'identité
avec la séquence SEQ ID NO:10. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR7 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ ID NO:
10.
La séquence en acides aminés du domaine SCR8 (acides aminés 448 à 505) du variant Y402 du facteur H humain est représentée par la séquence SEQ ID NO: 11 (C SKS SIDIENGFI SES QYTYALKEKAKYQCKLGYVTADGETS GSITC GKDGWSAQPTC
). La séquence du domaine SCR8 introduit dans la protéine selon l'invention a au moins 85 %, notamment au moins 90 %, notamment au moins 95 %, notamment au moins 99 %
d'identité
avec la séquence SEQ ID NO:11. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR8 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ ID NO:
11.
La séquence en acides aminés du domaine SCR9 (acides aminés 509 à 564) du variant Y402 du facteur H humain est représentée par la séquence SEQ ID NO: 12 (CDIPVFMNARTKNDFTWFKLNDTLDYECHDGYESNTGSTTGSIVCGYNGWSDLPIC) . La séquence du domaine SCR9 introduit dans la protéine selon l'invention a au moins 85 %, notamment au moins 90 %, notamment au moins 95 %, notamment au moins 99 %
d'identité
avec la séquence SEQ ID NO:12. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR9 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ ID NO:
12.
La séquence en acides aminés du domaine SCR10 (acides aminés 569 à 623) du variant Y402 du facteur H humain est représentée par la séquence SEQ ID NO: 13 (CELPKIDVHLVPDRKKD QYKVGEVLKF S CKP GFTIVGPN SVQ CYHFGL S PD LPIC) . La séquence du domaine SCR10 introduit dans la protéine selon l'invention a au moins 85 %, notamment au moins 90 %, notamment au moins 95 %, notamment au moins 99 %
d'identité
avec la séquence SEQ ID NO:13. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR10 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ
ID NO: 13.
La séquence en acides aminés du domaine SCR11 (acides aminés 630 à 674) du variant Y402 du facteur H humain est représentée par la séquence SEQ ID NO: 14 (CGPPPELLNGNVKEKTKEEYGHSEVVEYYCNPRFLMKGPNKIQCVDGEWTTLPVC).
La séquence du domaine SCR11 introduit dans la protéine selon l'invention a au moins 85 %, notamment au moins 90 %, notamment au moins 95 %, notamment au moins 99 %
d'identité
avec la séquence SEQ ID NO:14. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR11 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ
ID NO: 14.
La séquence en acides aminés du domaine SCR12 (acides aminés 691 à 744) du variant Y402 du facteur H humain est représentée par la séquence SEQ ID NO: 15 (CGDIPELEHGWAQLS SPPYYYGD SVEFNC SESFTMIGHRSITCIHGVWTQLPQC). La séquence du domaine SCR12 introduit dans la protéine selon l'invention a au moins 85 %, notamment au moins 90 %, notamment au moins 95 %, notamment au moins 99 %
d'identité
avec la séquence SEQ ID NO:15. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR12 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ
ID NO: 15.
La séquence en acides aminés du domaine SCR13 (acides aminés 753 à 803) du variant Y402 du facteur H humain est représentée par la séquence SEQ ID NO: 16 (CKSSNLIILEEHLKNKKEFDHNSNIRYRCRGKEGWIHTVCINGRWDPEVNC). La séquence du domaine SCR13 introduit dans la protéine selon l'invention a au moins 85 %, notamment au moins 90 %, notamment au moins 95 %, notamment au moins 99 %
d'identité
avec la séquence SEQ ID NO:16. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR13 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ
ID NO: 16.
La séquence en acides aminés du domaine SCR14 (acides aminés 811 à 864) du variant Y402 du facteur H humain est représentée par la séquence SEQ ID NO: 17 (CPPPPQIPNSHNMTTTLNYRDGEKVSVLCQENYLIQEGEEITCKDGRWQSIPLC). La séquence du domaine SCR14 introduit dans la protéine selon l'invention a au moins 85 %, notamment au moins 90 %, notamment au moins 95 %, notamment au moins 99 %
d'identité
avec la séquence SEQ ID NO:17. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR14 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ
ID NO: 17.
9 La séquence en acides aminés du domaine SCR15 (acides aminés 869 à 926) du variant Y402 du facteur H humain est représentée par la séquence SEQ ID NO: 18 (C S QPPQIEHGTINS SRS S QESYAHGTKL SYTCEGGFRISEENETTCYMGKWSSPPQC).
La séquence du domaine SCR15 introduit dans la protéine selon l'invention a au moins 85 %, notamment au moins 90 %, notamment au moins 95 %, notamment au moins 99 %
d'identité
avec la séquence SEQ ID NO:18. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR15 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ
ID NO: 18.
La séquence en acides aminés du domaine SCR16 (acides aminés 931 à 984) du variant Y402 du facteur H humain est représentée par la séquence SEQ ID NO: 19 (CKSPPEISHGVVAHMSDSYQYGEEVTYKCFEGFGIDGPAIAKCLGEKWSHPPSC). La séquence du domaine SCR16 introduit dans la protéine selon l'invention a au moins 85 %, notamment au moins 90 %, notamment au moins 95 %, notamment au moins 99 %
d'identité
avec la séquence SEQ ID NO:19. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR16 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ
ID NO: 19.
La séquence en acides aminés du domaine SCR17 (acides aminés 989 à 1043) du variant Y402 du facteur H humain est représentée par la séquence SEQ ID NO: 20 (CLSLPSFENAIPMGEKKDVYKAGEQVTYTCATYYKMDGASNVTCINSRWTGRPTC).
La séquence du domaine SCR17 introduit dans la protéine selon l'invention a au moins 85 %, notamment au moins 90 %, notamment au moins 95 %, notamment au moins 99 %
d'identité
avec la séquence SEQ ID NO:20. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR17 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ
ID NO: 20.
La séquence en acides aminés du domaine SCR18 (acides aminés 1048 à 1102) du variant Y402 du facteur H humain est représentée par la séquence SEQ ID NO: 21 (CVNPPTVQNAYIVSRQMSKYPSGERVRYQCRSPYEMFGDEEVMCLNGNWTEPPQC) . La séquence du domaine SCR18 introduit dans la protéine selon l'invention a au moins 85 %, notamment au moins 90 %, notamment au moins 95 %, notamment au moins 99 %
d'identité avec la séquence SEQ ID NO:21. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR18 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ ID NO: 21.
La séquence en acides aminés du domaine SCR19 (acides aminés 1109 à 1163) du variant Y402 du facteur H humain est représentée par la séquence SEQ ID NO: 22 (CGPPPPIDNGDITSFPLSVYAPASSVEYQCQNLYQLEGNKRITCRNGQWSEPPKC). La séquence du domaine SCR19 introduit dans la protéine selon l'invention a au moins 85 %, notamment au moins 90 %, notamment au moins 95 %, notamment au moins 99 %
d'identité
avec la séquence SEQ ID NO:22. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR18 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ
ID NO: 22.
La séquence en acides aminés du domaine SCR20 (acides aminés 1167 à 1231) du variant Y402 du facteur H humain est représentée par la séquence SEQ ID NO: 23 (CVISREIMENYNIALRWTAKQKLYSRTGESVEFVCKRGYRLSSRSHTLRTTCWDGKL
EYPTCAKR). La séquence du domaine SCR18 introduit dans la protéine selon l'invention a au moins 85 %, notamment au moins 90 %, notamment au moins 95 %, notamment au moins 99 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO:23. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR20 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ ID NO: 23.
Dans un mode de réalisation, la première ou la deuxième séquence en acides aminés comprend au moins les domaines SCR12, SCR13 et SCR14 du facteur H. Dans un autre mode de réalisation, aucun des domaines SCR12, SCR13 et SCR14 n'est présent dans la protéine recombinante selon l'invention. Une variante de réalisation de la présente invention concerne une protéine recombinante dont les domaines SCR sont constitués, dans cet ordre, des domaines SCR1, SCR2, SCR3, SCR4, SCR12, SCR13, SCR14, SCR19 et SCR20. Une telle protéine est représentée dans la séquence SEQ ID NO : 142.
Chaque domaine SCR inclus dans la première ou la deuxième séquence en acides aminés peut être lié au(x) SCR contigu(s) au moyen du linker naturel trouvé entre lesdits domaines SCR, le cas échéant. Alternativement, le linker entre chaque domaine SCR de la protéine recombinante peut être un linker non naturel. Le linker non naturel peut être constitué d'une séquence comprenant entre 2 et 20 acides aminés, notamment entre 3 et 8 acides aminés.
Par ailleurs, la liaison entre la première et la deuxième séquence en acides aminés peut être réalisée au moyen d'un linker naturel ou synthétique présent en position C-terminale de la première séquence en acides aminées ou en position N-terminale de la deuxième séquence en acides aminés. Par exemple, le premier et le deuxième polypeptide peuvent être liés par un linker de séquence GASG (SEQ ID NO:3). Par ailleurs, la première et la deuxième séquences en acides aminés peuvent être liées entre elles par un linker combinant la séquence linker naturelle suivant le dernier domaine de la première séquence (i.e. le domaine en position C-terminale de la première séquence) et un linker synthétique tel que le linker GASG. Les linkers naturels trouvés en position C-terminale de chacun des domaines SCR du facteur H
sont par exemple: QKRP (SEQ ID NO:143) pour le domaine SCR1; EVVK (SEQ ID
NO:144) pour le domaine SCR2; VEIS (SEQ ID NO:145) pour le domaine SCR3; EEKS
(SEQ ID NO:146) pour le domaine SCR4; TLKP (SEQ ID NO:147) pour le domaine SCR5;
LRK pour le domaine SCR6; IRVKT (SEQ ID NO:148) pour le domaine SCR7; IKS pour le domaine SCR8; YERE (SEQ ID NO:149) pour le domaine SCR9; KEQVQS (SEQ ID
NO:150) pour le domaine SCR10; IVEEST (SEQ ID NO:151) pour le domaine SCR11;
VAIDKLKK (SEQ ID NO:152) pour le domaine SCR12; SMAQIQL (SEQ ID NO:153) pour le domaine SCR13; VEKIP (SEQ ID NO:154) pour le domaine SCR14; EGLP (SEQ ID
NO:155) pour le domaine SCR15; IKTD (SEQ ID NO:156) pour le domaine SCR16;
RDTS
(SEQ ID NO:157) pour le domaine SCR17; KDSTGK (SEQ ID NO:158) pour le domaine SCR18; LHP pour le domaine SCR19.
Selon un mode de réalisation, la première séquence en acides aminés comprend les domaines SCR1, SCR2, SCR3 et SCR4 du facteur H.
Selon un mode de réalisation, la première séquence en acides aminés comprend les domaines SCR1, SCR2, SCR3, SCR4 et SCR5 du facteur H.
Selon un autre mode de réalisation, la première séquence en acides aminés comprend les domaines SCR1, SCR2, SCR3, SCR4, SCR5 et SCR6 du facteur H.
Selon un autre mode de réalisation, la première séquence en acides aminés comprend les domaines SCR1, SCR2, SCR3, SCR4, SCR5, SCR6 et SCR7 du facteur H.
Selon un autre mode de réalisation, la première séquence en acides aminés comprend les domaines SCR1, SCR2, SCR3, SCR4, SCR5, SCR6, SCR7 et SCR8 du facteur H.
Selon un autre mode de réalisation, la première séquence en acides aminés comprend les domaines SCR1, SCR2, SCR3, SCR4, SCR5, SCR6, SCR7, SCR8 et SCR9 du facteur H.
Selon un autre mode de réalisation, la première séquence en acides aminés comprend les domaines SCR1, SCR2, SCR3, SCR4, SCR5, SCR6, SCR7, SCR8, SCR9 et SCR10 du facteur H.
Selon un autre mode de réalisation, la première séquence en acides aminés comprend les domaines SCR1, SCR2, SCR3, SCR4, SCR5, SCR6, SCR7, SCR8, SCR9, SCR10 et SCR11 facteur H.
Selon un autre mode de réalisation, la première séquence en acides aminés comprend les domaines SCR1, SCR2, SCR3, SCR4, SCR5, SCR6, SCR7, SCR8, SCR9, SCR10, SCR11 et SCR12 facteur H.
Selon un autre mode de réalisation, la première séquence en acides aminés comprend les domaines SCR1, SCR2, SCR3, SCR4, SCR5, SCR6, SCR7, SCR8, SCR9, SCR10, SCR11, SCR12 et SCR13 facteur H.
Selon un mode de réalisation, la deuxième séquence en acides aminés comprend les domaines SCR19 et SCR20 du facteur H.
Selon un mode de réalisation, la deuxième séquence en acides aminés comprend les domaines SCR18, SCR19 et SCR20 du facteur H.
Selon un mode de réalisation, la deuxième séquence en acides aminés comprend les domaines SCR17, SCR18, SCR19 et SCR20 du facteur H.
Selon un mode de réalisation, la deuxième séquence en acides aminés comprend les domaines SCR16, SCR17, SCR18, SCR19 et SCR20 du facteur H.
Selon un mode de réalisation, la deuxième séquence en acides aminés comprend les domaines SCR15, SCR16, SCR17, SCR18, SCR19 et SCR20 du facteur H.
Selon un mode de réalisation, la deuxième séquence en acides aminés comprend les domaines SCR14, SCR15, SCR16, SCR17, SCR18, SCR19 et SCR20 du facteur H.
Selon un mode de réalisation, la deuxième séquence en acides aminés comprend les domaines SCR13, SCR14, SCR15, SCR16, SCR17, SCR18, SCR19 et SCR20 du facteur H.
Selon un mode de réalisation, la deuxième séquence en acides aminés comprend les domaines SCR12, SCR13, SCR14, SCR15, SCR16, SCR17, SCR18, SCR19 et SCR20 du facteur H.
Selon un mode de réalisation, la deuxième séquence en acides aminés comprend les domaines SCR11, SCR12, SCR13, SCR14, SCR15, SCR16, SCR17, SCR18, SCR19 et SCR20 du facteur H.
Selon un mode de réalisation, la deuxième séquence en acides aminés comprend les domaines SCR10, SCR11, SCR12, SCR13, SCR14, SCR15, SCR16, SCR17, SCR18, SCR19 et SCR20 du facteur H.
Selon un mode de réalisation, la deuxième séquence en acides aminés comprend les domaines SCR9, SCR10, SCR11, SCR12, SCR13, SCR14, SCR15, SCR16, SCR17, SCR18, SCR19 et SCR20 du facteur H.
Selon un mode de réalisation, la deuxième séquence en acides aminés comprend les domaines SCR8, SCR9, SCR10, SCR11, SCR12, SCR13, SCR14, SCR15, SCR16, SCR17, SCR18, SCR19 et SCR20 du facteur H.
Selon un autre mode de réalisation, la protéine recombinante possédant une activité de facteur H comprend les première et deuxième séquences en acides aminés listées dans le tableau 1 ci-dessous, ces séquences étant séparées par un linker, notamment un linker artificiel, en particulier le linker GASG (SEQ ID NO:3).
Tableau 1 Première séquence Deuxième séquence Première séquence Deuxième séquence SCR1 à SCR4 SCR19 à SCR20 SCR1 à SCR8 SCR14 à SCR20 SCR1 à SCR4 SCR18 à SCR20 SCR1 à SCR8 SCR13 à SCR20 SCR1 à SCR4 SCR17 à SCR20 SCR1 à SCR8 SCR12 à SCR20 SCR1 à SCR4 SCR16 à SCR20 SCR1 à SCR8 SCR11 à SCR20 SCR1 à SCR4 SCR15 à SCR20 SCR1 à SCR8 SCR10 à SCR20 SCR1 à SCR4 SCR14 à SCR20 SCR1 à SCR8 SCR9 à SCR20 SCR1 à SCR4 SCR13 à SCR20 SCR1 à SCR9 SCR19 à SCR20 SCR1 à SCR4 SCR12 à SCR20 SCR1 à SCR9 SCR18 à SCR20 SCR1 à SCR4 SCR11 à SCR20 SCR1 à SCR9 SCR17 à SCR20 SCR1 à SCR4 SCR10 à SCR20 SCR1 à SCR9 SCR16 à SCR20 SCR1 à SCR4 SCR9 à SCR20 SCR1 à SCR9 SCR15 à SCR20 SCR1 à SCR4 SCR8 à SCR20 SCR1 à SCR9 SCR14 à SCR20 SCR1 à SCR7 SCR19 à SCR20 SCR1 à SCR9 SCR13 à SCR20 SCR1 à SCR7 SCR18 à SCR20 SCR1 à SCR9 SCR12 à SCR20 SCR1 à SCR7 SCR17 à SCR20 SCR1 à SCR9 SCR11 à SCR20 SCR1 à SCR7 SCR16 à SCR20 SCR1 à SCR9 SCR10 à SCR20 SCR1 à SCR7 SCR15 à SCR20 SCR1 à SCR10 SCR19 à SCR20 SCR1 à SCR7 SCR14 à SCR20 SCR1 à SCR10 SCR18 à SCR20 SCR1 à SCR7 SCR13 à SCR20 SCR1 à SCR10 SCR17 à SCR20 SCR1 à SCR7 SCR12 à SCR20 SCR1 à SCR10 SCR16 à SCR20 SCR1 à SCR7 SCR11 à SCR20 SCR1 à SCR10 SCR15 à SCR20 SCR1 à SCR7 SCR10 à SCR20 SCR1 à SCR10 SCR14 à SCR20 SCR1 à SCR7 SCR9 à SCR20 SCR1 à SCR10 SCR13 à SCR20 SCR1 à SCR7 SCR8 à SCR20 SCR1 à SCR10 SCR12 à SCR20 SCR1 à SCR8 SCR19 à SCR20 SCR1 à SCR10 SCR11 à SCR20 SCR1 à SCR8 SCR18 à SCR20 SCR1 à SCR11 SCR19 à SCR20 SCR1 à SCR8 SCR17 à SCR20 SCR1 à SCR11 SCR18 à SCR20 SCR1 à SCR8 SCR16 à SCR20 SCR1 à SCR11 SCR17 à SCR20 SCR1 à SCR8 SCR15 à SCR20 SCR1 à SCR11 SCR16 à SCR20 Première séquence Deuxième séquence Première séquence Deuxième séquence SCR1 à SCR11 SCR15 à SCR20 SCR1 à SCR12 SCR14 à SCR20 SCR1 à SCR11 SCR14 à SCR20 SCR1 à SCR12 SCR13 à SCR20 SCR1 à SCR11 SCR13 à SCR20 SCR1 à SCR13 SCR19 à SCR20 SCR1 à SCR11 SCR12 à SCR20 SCR1 à SCR13 SCR18 à SCR20 SCR1 à SCR12 SCR19 à SCR20 SCR1 à SCR13 SCR17 à SCR20 SCR1 à SCR12 SCR18 à SCR20 SCR1 à SCR13 SCR16 à SCR20 SCR1 à SCR12 SCR17 à SCR20 SCR1 à SCR13 SCR15 à SCR20 SCR1 à SCR12 SCR16 à SCR20 SCR1 à SCR13 SCR14 à SCR20 SCR1 à SCR12 SCR15 à SCR20 Selon un mode particulier de réalisation, la protéine recombinante possédant une activité de facteur H comprend les première et deuxième séquences en acides aminés listées dans le tableau 2 ci-dessous, ces séquences étant séparées par un linker, notamment un linker artificiel, en particulier le linker GASG (SEQ ID NO:3).
Tableau 2 Première séquence Deuxième séquence Première séquence Deuxième séquence SCR1 à SCR4 SCR19 à SCR20 SCR1 à SCR8 SCR15 à SCR20 SCR1 à SCR4 SCR16 à SCR20 SCR1 à SCR8 SCR14 à SCR20 SCR1 à SCR4 SCR15 à SCR20 SCR1 à SCR8 SCR13 à SCR20 SCR1 à SCR4 SCR14 à SCR20 SCR1 à SCR8 SCR11 à SCR20 SCR1 à SCR4 SCR11 à SCR20 SCR1 à SCR8 SCR10 à SCR20 SCR1 à SCR4 SCR10 à SCR20 SCR1 à SCR8 SCR9 à SCR20 SCR1 à SCR4 SCR9 à SCR20 SCR1 à SCR9 SCR19 à SCR20 SCR1 à SCR4 SCR8 à SCR20 SCR1 à SCR9 SCR16 à SCR20 SCR1 à SCR7 SCR16 à SCR20 SCR1 à SCR9 SCR14 à SCR20 SCR1 à SCR7 SCR15 à SCR20 SCR1 à SCR9 SCR13 à SCR20 SCR1 à SCR7 SCR14 à SCR20 SCR1 à SCR9 SCR12 à SCR20 SCR1 à SCR7 SCR11 à SCR20 SCR1 à SCR9 SCR11 à SCR20 SCR1 à SCR7 SCR10 à SCR20 SCR1 à SCR9 SCR10 à SCR20 SCR1 à SCR7 SCR9 à SCR20 SCR1 à SCR10 SCR11 à SCR20 SCR1 à SCR7 SCR8 à SCR20 SCR1 à SCR13 SCR14 à SCR20 SCR1 à SCR8 SCR16 à SCR20 Selon une variante préférée de l'invention, la première séquence comprend les domaines SCR1 à SCR7 du facteur H, et la deuxième séquence est choisie dans le groupe constitué :
- des domaines SCR9 à SCR20, - des domaines SCR11 à SCR20 ; et - des domaines SCR14 à SCR20 du facteur H.
Selon une autre variante préférée, la première séquence comprend les domaines SCR1 à
SCR8 et la deuxième séquence comprend les domaines SCR10 à SCR20.
Selon une autre variante préférée, la première séquence comprend les domaines SCR1 à
SCR4 du facteur H et la deuxième séquence comprend les domaines SCR16 à SCR20 du facteur H, une troisième séquence comprenant le domaine SCR7 du facteur 7 étant comprise entre la première et la deuxième séquence, et étant plus particulièrement séparés de ces dernières par des linkers tels que ceux décrits ci-dessus.
Selon un mode de réalisation, la première séquence en acides aminés comprend un peptide signal (PS) en position N-terminale. Le peptide signal peut être le peptide signal naturel du facteur H (MRLLAKIICLMLWAICVA ¨ SEQ ID NO:24), le peptide signal d'une protéine différente du facteur H, ou un peptide signal décrit dans la demande PCT/2001/050544, notamment le peptide MRWSWIFLLLLSITSANA (SEQ ID NO: 25; ou autrement appelé
PS-MB7 par la suite). Le peptide signal naturel d'une protéine différente du facteur H humain peut être un peptide signal choisi parmi les peptides signaux de toutes les protéines qui sont sécrétées chez les eucaryotes et notamment chez les mammifères et plus particulièrement chez l'homme comme ceux des immunoglobulines, des facteurs de croissance comme l'EPO, des hormones comme l'insuline, des enzymes comme le trypsinogène, des facteurs de la coagulation tel que la prothrombine. La présence d'un peptide signal permet de conférer une meilleure sécrétion de protéine recombinante dans le milieu de culture.
Selon un mode de réalisation, l'invention concerne l'un des peptides du tableau 1 dans lequel la première séquence en acides aminés comprend en N-terminal un tel peptide signal, notamment le peptide naturel du facteur H de séquence SEQ ID NO:24 ou le peptide signal PS-MB7 de séquence SEQ ID NO:25. Selon un autre mode de réalisation, la protéine recombinante selon l'invention est choisie parmi l'une des protéines du tableau 1, les première et deuxième séquences étant séparées par un linker, notamment un linker GASG
(SEQ ID
NO:3).
Selon un mode particulier de réalisation, la protéine recombinante selon l'invention est choisie parmi l'une des protéines listées dans le tableau 2 ci-dessous dans lesquelles la première séquence en acides aminés comprend un peptide signal de séquence SEQ ID NO: 25 et les première et seconde séquences sont séparées par un linker de séquence GASG
(SEQ ID
NO:3).
Tableau 3 SEQ ID Première séquence linker Deuxième séquence NO:
26 PS-MB7 + SCR1 à SCR4 GASG SCR19 à SCR20 27 PS-MB7 + SCR1 à SCR4 GASG SCR16 à SCR20 28 PS-MB7 + SCR1 à SCR4 GASG SCR15 à SCR20 29 PS-MB7 + SCR1 à SCR4 GASG SCR14 à SCR20 30 PS-MB7 + SCR1 à SCR4 GASG SCR13 à SCR20 31 PS-MB7 + SCR1 à SCR4 GASG SCR12 à SCR20 32 PS-MB7 + SCR1 à SCR4 GASG SCR11 à SCR20 33 PS-MB7 + SCR1 à SCR4 GASG SCR10 à SCR20 34 PS-MB7 + SCR1 à SCR4 GASG SCR9 à SCR20 35 PS-MB7 + SCR1 à SCR4 GASG SCR8 à SCR20 36 PS-MB7 + SCR1 à SCR7 GASG SCR19 à SCR20 37 PS-MB7 + SCR1 à SCR7 GASG SCR16 à SCR20 38 PS-MB7 + SCR1 à SCR7 GASG SCR15 à SCR20 39 PS-MB7 + SCR1 à SCR7 GASG SCR14 à SCR20 40 PS-MB7 + SCR1 à SCR7 GASG SCR13 à SCR20 41 PS-MB7 + SCR1 à SCR7 GASG SCR12 à SCR20 42 PS-MB7 + SCR1 à SCR7 GASG SCR11 à SCR20 43 PS-MB7 + SCR1 à SCR7 GASG SCR10 à SCR20 44 PS-MB7 + SCR1 à SCR7 GASG SCR9 à SCR20 45 PS-MB7 + SCR1 à SCR7 GASG SCR8 à SCR20 46 PS-MB7 + SCR1 à SCR8 GASG SCR19 à SCR20 47 PS-MB7 + SCR1 à SCR8 GASG SCR16 à SCR20 48 PS-MB7 + SCR1 à SCR8 GASG SCR15 à SCR20 49 PS-MB7 + SCR1 à SCR8 GASG SCR14 à SCR20 50 PS-MB7 + SCR1 à SCR8 GASG SCR13 à SCR20 51 PS-MB7 + SCR1 à SCR8 GASG SCR12 à SCR20 52 PS-MB7 + SCR1 à SCR8 GASG SCR11 à SCR20 53 PS-MB7 + SCR1 à SCR8 GASG SCR10 à SCR20 54 PS-MB7 + SCR1 à SCR8 GASG SCR9 à SCR20 55 PS-MB7 + SCR1 à SCR9 GASG SCR19 à SCR20 56 PS-MB7 + SCR1 à SCR9 GASG SCR16 à SCR20 SEQ ID Première séquence linker Deuxième séquence NO:
57 PS-MB7 + SCR1 à SCR9 GASG SCR15 à SCR20 58 PS-MB7 + SCR1 à SCR9 GASG SCR14 à SCR20 59 PS-MB7 + SCR1 à SCR9 GASG SCR13 à SCR20 60 PS-MB7 + SCR1 à SCR9 GASG SCR12 à SCR20 61 PS-MB7 + SCR1 à SCR9 GASG SCR11 à SCR20 62 PS-MB7 + SCR1 à SCR9 GASG SCR10 à SCR20 63 PS-MB7 + SCR1 à SCR10 GASG SCR19 à SCR20 64 PS-MB7 + SCR1 à SCR10 GASG SCR16 à SCR20 65 PS-MB7 + SCR1 à SCR10 GASG SCR15 à SCR20 66 PS-MB7 + SCR1 à SCR10 GASG SCR14 à SCR20 67 PS-MB7 + SCR1 à SCR10 GASG SCR13 à SCR20 68 PS-MB7 + SCR1 à SCR10 GASG SCR12 à SCR20 69 PS-MB7 + SCR1 à SCR10 GASG SCR11 à SCR20 70 PS-MB7 + SCR1 à SCR11 GASG SCR19 à SCR20 71 PS-MB7 + SCR1 à SCR11 GASG SCR16 à SCR20 72 PS-MB7 + SCR1 à SCR11 GASG SCR15 à SCR20 73 PS-MB7 + SCR1 à SCR11 GASG SCR14 à SCR20 74 PS-MB7 + SCR1 à SCR11 GASG SCR13 à SCR20 75 PS-MB7 + SCR1 à SCR11 GASG SCR12 à SCR20 76 PS-MB7 + SCR1 à SCR12 GASG SCR19 à SCR20 77 PS-MB7 + SCR1 à SCR12 GASG SCR16 à SCR20 78 PS-MB7 + SCR1 à SCR12 GASG SCR15 à SCR20 79 PS-MB7 + SCR1 à SCR12 GASG SCR14 à SCR20 80 PS-MB7 + SCR1 à SCR12 GASG SCR13 à SCR20 81 PS-MB7 + SCR1 à SCR13 GASG SCR19 à SCR20 82 PS-MB7 + SCR1 à SCR13 GASG SCR16 à SCR20 83 PS-MB7 + SCR1 à SCR13 GASG SCR15 à SCR20 84 PS-MB7 + SCR1 à SCR13 GASG SCR14 à SCR20 Selon un mode particulier de réalisation, la protéine recombinante selon l'invention contient une première séquence comprenant les domaines SCR1 à SCR4 du facteur H, et une deuxième séquence choisie dans le groupe constitué :
- des domaines SCR16 à SCR20, - des domaines SCR15 à SCR20 ;
- des domaines SCR10 à SCR20 ; et - des domaines SCR8 à SCR20 du facteur H.
Selon un autre mode de réalisation, la protéine recombinante selon l'invention contient une première séquence comprenant les domaines SCR1 à SCR7 du facteur H, et une deuxième séquence comprenant les domaines SCR16 à SCR20 du facteur H, ladite deuxième séquence étant de préférence choisie dans le groupe constitué :
- des domaines SCR15 à SCR20 - des domaines SCR14 à SCR20 ;
- des domaines SCR11 à SCR20 ;
- des domaines SCR10 à SCR20 ;
- des domaines SCR9 à SCR20; et - des domaines SCR8 à SCR20 du facteur H.
Selon une autre variante, l'invention concerne une protéine recombinante telle que décrite ci-dessus, la première séquence comprenant les domaines SCR1 à SCR8 du facteur H, et la deuxième séquence comprenant les domaines SCR16 à SCR20 du facteur H, ladite deuxième séquence comprenant de préférence les domaines SCR10 à SCR20 du facteur H.
Selon un autre mode de réalisation, la protéine recombinante selon l'invention contient une première séquence comprenant les domaines SCR1 à SCR4 du facteur H et une deuxième séquence comprenant les domaines SCR16 à SCR20 du facteur H, une troisième séquence comprenant le domaine SCR7 du facteur H étant comprise entre la première et la deuxième séquence.
Selon une variante de l'invention, la première séquence comprend un peptide signal de séquence SEQ ID NO :25 et les domaines SCR1 à SCR7 du facteur H, et la deuxième séquence est choisie dans le groupe constitué :
- des domaines SCR9 à SCR20, - des domaines SCR11 à SCR20 ; et - des domaines SCR14 à SCR20 du facteur H.
Dans un mode particulier de réalisation de cette variante, la première et la seconde séquences sont séparées par un linker de séquence GASG.
Selon une autre variante préférée, la première séquence comprend un peptide signal de séquence SEQ ID NO :25 et les domaines SCR1 à SCR8 et la deuxième séquence comprend les domaines SCR10 à SCR20. Dans un mode particulier de réalisation de cette variante, la première et la seconde séquences sont séparées par un linker de séquence GASG.
Selon une autre variante préférée, la première séquence comprend un peptide signal de séquence SEQ ID NO :25 et les domaines SCR1 à SCR4 du facteur H et la deuxième séquence comprend les domaines SCR16 à SCR20 du facteur H, une troisième séquence comprenant le domaine SCR7 du facteur 7 étant comprise entre la première et la deuxième séquence, et étant séparés de ces dernières par des linkers tels que ceux décrits ci-dessus.
Dans un mode particulier de réalisation de cette variante, la première et la troisième séquences, et la troisième et la seconde séquences sont séparées par un linker de séquence GASG. Une telle séquence est représentée dans SEQ ID NO: 159.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant une protéine recombinante selon l'invention.
L'invention a également pour objet une construction d'acide nucléique codant une protéine recombinante ayant une activité de facteur H telle que décrite ci-dessus.
Avantageusement, les acides nucléiques codant les protéines recombinantes selon l'invention ont fait l'objet d'une optimisation de codons.
L'optimisation de codon a pour but de remplacer les codons naturels par des codons dont les ARN de transfert (ARNt) portant les acides aminés sont les plus fréquents dans le type cellulaire considéré. Le fait de mobiliser des ARNt fréquemment rencontrés a pour avantage majeur d'accroître la vitesse de traduction des ARN messagers (ARNm) et donc d'augmenter le titre final (Carton JM et al, Protein Expr Purif, 2007). L'optimisation de séquence joue aussi sur la prédiction des structures secondaires d'ARNm qui pourraient ralentir la lecture par le complexe ribosomal. L'optimisation de séquence a également un impact sur le pourcentage de G/C qui est directement lié à la demi-vie des ARNm et donc à leur potentiel d'être traduit (Chechetkin, J. of theoretical biology 242, 2006 922-934).
L'optimisation de codons peut être faite par substitution des codons naturels en utilisant des tables de fréquence des codons (codon Usage Table) pour mammifères et plus particulièrement pour Homo sapiens. Il existe des algorithmes présents sur internet et mis à
disposition par les fournisseurs de gènes de synthèse (DNA2.0, GeneArt, MWG, Genscript) qui permettent de faire cette optimisation de séquence.
A titre illustratif, une séquence, ayant fait l'objet d'une optimisation de codon, est représentée par la séquence SEQ ID NO : 85. Cette séquence comprend le peptide signal naturel du facteur H.
Les acides nucléiques selon l'invention peuvent comprendre un site de restriction unique entre les deux séquences d'acide nucléique codant la première et la deuxième séquence en acides aminés de la protéine recombinante selon l'invention. Ce site unique de restriction peut notamment correspondre au site Nhe I présent dans la partie codant le linker GASG (séquence nucléique : GCCGCTAGCGCC (SEQ ID NO :86), la partie soulignée correspondant au site NheI qui correspond aux acides aminés AS mentionné ci-dessus. Ce site de restriction unique permet d'envisager une amélioration des protéines recombinantes produites, notamment par introduction facilitée d'un ou plusieurs domaines SCR supplémentaires au niveau de la séquence protéique correspondant au dit site de restriction, ou par introduction d'une séquence en acides aminés différente d'un domaine SCR. Il peut notamment s'agir d'un autre domaine protéique n'appartenant pas au facteur H naturel, ou d'un linker de taille et de séquence différente (notamment un linker plus long).
Les acides nucléiques codant la protéine recombinante selon l'invention peuvent être construits selon toute méthode connue de l'homme du métier dans le domaine de la biologie moléculaire. Avantageusement toutefois, ledit acide nucléique est construit en deux temps selon un procédé propre à la présente invention. Par exemple, une banque d'acides nucléiques clonés dans des vecteurs de clonage ou d'expression peut être constituée.
Chaque vecteur de la banque contient une séquence codant l'une des première ou deuxième séquences en acides aminés composant la protéine recombinante selon l'invention. Ainsi, on décrit un vecteur comprenant les séquences codant une première séquence en acides aminés comprenant à
minima les séquences des domaines SCR1 à SCR4 du facteur H (ou vecteur N-Ter).
De même, on décrit un vecteur comprenant les séquences codant une deuxième séquence en acides aminés comprenant à minima les séquences des domaines SCR19 et SCR20 du facteur H (ou vecteur C-Ter).
Les vecteurs N-Ter et C-Ter sont conçus de manière à comprendre des sites uniques de restriction utiles pour l'excision puis l'assemblage des fragments d'acides nucléiques codant chacune des parties de la protéine recombinante dans un seul et même vecteur.
Les constructions permettant l'expression des protéines du tableau 2 ci-dessus peuvent ainsi être produites à partir de 8 vecteurs N-Ter et 10 vecteurs C-Ter. Cette stratégie est décrite dans les exemples ci-dessous.
Les acides nucléiques selon l'invention peuvent également comprendre toute séquence utile, notamment toute séquence permettant une optimisation de l'expression ou la sécrétion de la protéine recombinante ou pour faciliter le clonage et le sous clonage des acides nucléiques de l'invention. Par exemple, l'acide nucléique pourra comprendre en 5' un site unique de restriction, une séquence codante et/ou une séquence codant un peptide signal.
En 3', il pourra notamment être utile d'introduire une séquence codant un motif d'acides aminés utile pour le marquage ou la purification de la protéine recombinante, par exemple une étiquette histidine, et un ou plusieurs sites de restriction.
Dans un mode de réalisation, la construction d'acide nucléique selon l'invention comprend une séquence codant un peptide signal choisi parmi:
- un acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO: 87 et codant le peptide signal naturel du facteur H, ou - un acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 88 ou par une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 88, et codant le peptide signal du facteur H, (PS naturel optimisé) ou - un acide nucléique codant un peptide signal naturel d'une protéine différente du facteur H, ou - un acide nucléique codant le peptide signal codé par la séquence SEQ ID
NO : 89 (décrit dans la demande PCT/FR2011/050544) ou par une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO:
89.
La séquence SEQ ID NO : 88 ou une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 88 est une séquence obtenue par l'optimisation de codons à partir de la séquence SEQ ID
NO : 87.
L'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 89 ou par une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 89 code le peptide signal artificiel PS-MB7 décrit ci-dessus.
Dans un mode de réalisation, la construction d'acide nucléique codant la protéine recombinante selon l'invention comprend, ou est constitué par:
- un acide nucléique codant un peptide signal, notamment un acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 87 et codant le peptide signal naturel du facteur H, ou un acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 88 ou par une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID
NO : 88, et codant le peptide signal du facteur H, (PS naturel optimisé) ou un acide nucléique codant un peptide signal naturel d'une protéine différente du facteur H, ou un acide nucléique codant le peptide signal codé par la séquence SEQ ID NO : 89 (décrit dans la demande PCT/FR2011/050544) ou par une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 89;
- un acide nucléique codant au moins les domaines SCR1, SCR2, SCR3 et SCR4 du facteur H;
- un acide nucléique codant un linker, notamment un linker GASG (SEQ ID
NO:3), ledit acide nucléique codant un linker comprenant un site unique de restriction, notamment un site NheI;
- un acide nucléique codant au moins les domaines SCR19 et SCR20 du facteur H.
Selon un mode de réalisation, la construction d'acide nucléique permet l'expression d'une protéine recombinante choisie parmi l'une des séquences SEQ ID NO:26 à SEQ ID
NO:84.
L'invention concerne également un vecteur d'expression comprenant la construction d'acide nucléique décrite ci-dessus, liée de manière fonctionnelle à des séquences de contrôle de l'expression dudit acide nucléique. Les séquences de contrôle peuvent notamment comprendre un promoteur (notamment un promoteur CMV), un enhancer, et toute séquence connue de l'homme du métier utile pour permettre l'expression de la protéine recombinante dans une cellule eucaryote, notamment une cellule de mammifère.
A ce titre, l'invention concerne par ailleurs une cellule eucaryote recombinante, notamment une cellule de mammifère, plus particulièrement une cellule non-humaine (e.g.
une cellule CHO) ou humaine, transformée au moyen de la construction d'acide nucléique ou du vecteur d'expression selon l'invention. Dans un mode de réalisation avantageux de la présente invention, la protéine recombinante telle que décrite ci-dessus est produite dans la lignée cellulaire PER.C60 ou une lignée cellulaire HEK, notamment la lignée cellulaire HEK 293F.
La lignée cellulaire PER.C60 est issue de cellules rétinales primaires humaines dans lesquelles un fragment d'ADN adénoviral Ad5 qui contient à la fois le gène ElA
et le gène E 1B est inséré dans les cellules par un vecteur. Ce fragment d'ADN adénoviral permet de conférer l'immortalité aux cellules dans lesquelles il est inséré, par l'intermédiaire de la protéine E 1B qui inhibe la protéine p53. La protéine E lA quant à elle a un tropisme pour le promoteur viral hCMV et permet sa transactivation et la potentialisation de la séquence génique qui sera insérée en 3' de ce dernier et qui pourra être la protéine recombinante selon l'invention.
La présente invention concerne particulièrement l'utilisation de la lignée cellulaire PER.C60 pour la mise oeuvre d'un procédé de préparation d'une protéine recombinante ayant une activité de facteur H, notamment l'une des protéines de séquence SEQ ID NO: 26 à SEQ ID
NO:84.
La présente invention concerne aussi particulièrement l'utilisation de la lignée cellulaire HEK
293F pour la mise oeuvre d'un procédé de préparation d'une protéine recombinante selon l'invention, notamment l'une des protéines recombinantes représentées par l'une des séquences SEQ ID NO: 26 à SEQ ID NO: 84.
L'invention concerne également un procédé pour la production d'une protéine recombinante possédant une activité de facteur H. Le procédé selon l'invention, notamment l'une des protéines représentées par les séquences SEQ ID NO:26 à 84, ledit procédé
comprenant la culture d'une cellule recombinante selon l'invention transformée par un vecteur comprenant la construction d'acide nucléique selon l'invention codant ladite protéine recombinante.
Le vecteur comprenant un tel acide nucléique peut être un quelconque vecteur d'expression pour les lignées cellulaires eucaryotes connues de l'homme du métier.
La transformation de la lignée cellulaire peut être mise en oeuvre par des techniques d'électroporation, de nucléofection type AMAXA, un "pistolet à gène" (gène gun) ou encore à
l'aide d'un agent de transfection connu de l'homme de métier, tel que des agents cationiques, des liposomes ou des polymères tel que la fectine ou l'agent PEI.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé selon la présente invention comprend les étapes suivantes :
(i) la transfection d'une cellule eucaryote par un vecteur d'expression comprenant une construction d'acide nucléique codant la protéine recombinante, pour obtenir une cellule transfectée, (ii) la culture de ladite cellule transfectée, pour obtenir l'expression de la protéine recombinante dans le milieu de culture.
Ledit vecteur d'expression peut contenir un gène de résistance aux antibiotiques pour permettre la sélection des cellules transfectées lors de l'établissement de cellules produisant de façon stable la protéine d'intérêt.
Dans un mode de réalisation, la protéine recombinante selon l'invention est produite à une concentration supérieure ou égale à 10 mg/L telle que détectée par dosage ELISA de surnageant de culture, après 7 jours de production en mode batch.
La purification de la protéine recombinante peut être mise en oeuvre par des techniques de chromatographie en une, deux ou plusieurs étapes. La purification en une étape peut-être une colonne échangeuse d'ions ou une colonne d'affinité (héparine, ligand du facteur H ou anticorps anti-facteur H). La purification en deux étapes peut-être une étape de chromatographie sur colonne échangeuse de cations suivi d'une étape de chromatographie sur colonne échangeuse d'anions ou une étape de chromatographie sur colonne échangeuse d'anions suivi d'une étape de chromatographie sur colonne échangeuse de cations ou une étape de chromatographie sur colonne échangeuse d'ions suivi d'une étape de chromatographie sur colonne d'affinité ou une étape de chromatographie sur colonne d'affinité suivi d'une étape de chromatographie sur colonne échangeuse d'ions.
La purification en plus de deux étapes peut être réalisée par une combinaison de ces différentes chromatographies. Une étape de diafiltration, d'ultrafiltration ou de gel filtration peut-être réalisée en complément. La pureté d'un produit après une telle purification peut atteindre 99%
de produit purifié.
Les protéines selon l'invention peuvent également être produites dans le lait d'animaux transgéniques non humains, tels qu'une chèvre, un lapin, la brebis, la vache ou un porc. Dans ce cas, la sécrétion des protéines par les glandes mammaires, permettant sa sécrétion dans le lait du mammifère transgénique, implique le contrôle de l'expression des protéines selon l'invention de manière tissu-dépendante. De telles méthodes de contrôle sont bien connues de l'homme du métier. Le contrôle de l'expression est effectué grâce à des séquences permettant l'expression de la protéine vers un tissu particulier de l'animal. Il s'agit notamment des séquences promotrices WAP, bêta-caséine, bêta-lactoglobuline et des séquences peptides signal. Le procédé d'extraction de protéines d'intérêt à partir du lait d'animaux transgéniques est décrit dans le brevet EP 0 264 166.
Un autre aspect de l'invention concerne également l'utilisation d'une protéine recombinante selon l'invention en tant que médicament.
L'invention concerne également l'utilisation d'une protéine recombinante selon l'invention pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'une maladie impliquant une activité indésirable ou inappropriée du complément, notamment pour le traitement de maladies dues à une inflammation incontrôlée ou un dépôt de C3b incontrôlé.
L'invention concerne aussi une méthode de traitement d'une maladie impliquant une activité
indésirable ou inappropriée du complément, comprenant l'administration d'une protéine recombinante selon l'invention à un patient nécessitant un tel traitement. Le terme traitement comprend aussi bien un traitement curatif qu'un traitement prophylactique de la maladie. Un traitement curatif est défini par un traitement aboutissant à une guérison ou un traitement allégeant, améliorant et/ou éliminant, réduisant et/ou stabilisant les symptômes d'une maladie ou la souffrance qu'elle provoque. Un traitement prophylactique comprend aussi bien un traitement aboutissant à la prévention d'une maladie qu'un traitement réduisant et/ou retardant l'incidence d'une maladie ou le risque qu'elle survienne. L'invention vise notamment le traitement d'une maladie choisie dans le groupe constitué d'une dégénérescence maculaire liée à
l'âge (DMLA), une périodontite, un lupus érythémateux, une néphrite lupique, une dermatomyosite, une myasthénie grave, une glomérulonéphrite membrano-proliférative (GNMP), un psoriasis, une sclérose en plaques et les lésions d'une ischémie/
reperfusion rénale.
La présente invention est illustrée par les figures et les exemples ci-après.
Ces figures et exemples ne visent en aucun cas la limitation de la portée de la présente invention.
Figures:
La figure 1 est un schéma représentant la stratégie de construction des fragments N-terminaux des protéines recombinantes selon l'invention.
La figure 2 est un schéma représentant la stratégie de construction des fragments C-terminaux des protéines recombinantes selon l'invention.
Les figures 3A, 3B et 3C sont des graphes montrant l'activité d'accélération de la dissociation de la C3 convertase pour les fragments de facteur H ayant la plus forte productivité.
Exemples:
Exemple 1: construction des fragments N-ter et C-ter du Facteur H dans le plasmide pCEP4 Le but est de sous cloner sous différentes formes les fragments N-terminal et C-terminal du variant Y402 du facteur H dans une version optimisée dans le vecteur d'expression pCEP4.
Les fragments seront complétés tous deux en 5' d'un site NotI, de la séquence de kozak et d'un peptide signal, et en 3' d'un His-TAG suivi du site BamHI, la différence se fera par un site NheI situé en 3' pour les fragments N-ter et en 5' pour les fragments C-ter. Des schémas explicatifs seront décrits dans le protocole ci-dessous.
I/ Construction des vecteurs pCEP4-N-ter 1/ Construction des fragments N-ter Les fragments N-ter sont construits par PCR à partir du vecteur pCDNA2001neo-MD3Y. Ce vecteur correspond au vecteur pCDNA200 lneo contenant l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO:90 qui est une séquence optimisée codant le variant Y402 du facteur H
comprenant un peptide signal artificiel PS-MB7. La stratégie de construction est représentée sur la figure 1.
Les amorces utilisées sont les suivantes:
amorce sens:
Pl-NT-FCTH 5'-CTCTAGCGGCCGCGCGCCACC-3' (SEQ ID NO:91) (les nucléotides 6 à 13 de cette séquence définissent un site de restriction NotI) amorces antisens (ou amorces P2-NT-X):
Chacune de ces amorces contient, dans cet ordre de 5' vers 3': un site BamHI, 2 codons stop, une étiquette hexahistidine, un linker (GS), un site NheI et une séquence spécifique au facteur H. Ces éléments sont représentés sur la figure 1.
P2-NT-4 (SEQ ID NO:92) CTCTAGGATCCTTATCAATGGTGGTGATGGTGGTGGCTGCCGCTAGCGCCAGATT
TTTCCTCGCAGGAAGGCAG 75pb P2-NT-7 (SEQ ID NO:93) CTCTAGGATCCTTATCAATGGTGGTGATGGTGGTGGCTGCCGCTAGCGCCAGTTTT
CACGCGGATGCACCTTG 74pb P2-NT-8 (SEQ ID NO:94) CTCTAGGATCCTTATCAATGGTGGTGATGGTGGTGGCTGCCGCTAGCGCCAGACT
TGATGCAGGTAGGCTGG 73pb P2-NT-9 (SEQ ID NO:95) CTCTAGGATCCTTATCAATGGTGGTGATGGTGGTGGCTGCCGCTAGCGCCTTCCC
GCTCATAGCAGATGGGCAG 75pb P2-NT-10 (SEQ ID NO:96) CTCTAGGATCCTTATCAATGGTGGTGATGGTGGTGGCTGCCGCTAGCGCCGCTCT
GCACCTGCTCCTTGCAAATAG 77pb P2-NT-11 (SEQ ID NO:97) CTCTAGGATCCTTATCAATGGTGGTGATGGTGGTGGCTGCCGCTAGCGCCGGTGG
ATTCCTCGACGATGCAC 73pb P2-NT-12 (SEQ ID NO:98) CTCTAGGATCCTTATCAATGGTGGTGATGGTGGTGGCTGCCGCTAGCGCCTTTCTT
CAGTTTGTCAATGGCGAC 75pb P2-NT-13 (SEQ ID NO:99) CTCTAGGATCCTTATCAATGGTGGTGATGGTGGTGGCTGCCGCTAGCGCCCAGCT
GGATCTGTGCCATAGAGCAG 76pb Cette série d'amorce P2-NT-X (X, variable) est obtenue par PCR d'assemblage.
= PCR d'assemblage entre l'amorce P2NT et les amorces P2-X (X, variable) ci-dessous :
Elle est réalisée au moyen des amorces suivantes:
1-P2NT (SEQ ID NO:100) CTCTAGGATCCTTATCAATGGTGGTGATGGTGGTGGCTGCCGCTAGC
2-P2-4 (SEQ ID NO:101) CTGCCTTCCTGCGAGGAAAAATCTGGCGCTAGCGGCAGCCAC
2-P2-7 (SEQ ID NO:102) CAAGGTGCATCCGCGTGAAAACTGGCGCTAGCGGCAGCCAC
2-P2-8 (SEQ ID NO:103) CCAGCCTACCTGCATCAAGTCTGGCGCTAGCGGCAGCCAC
2-P2-9 (SEQ ID NO:104) CTGCCCATCTGCTATGAGCGGGAAGGCGCTAGCGGCAGCCAC
2-P2-10 (SEQ ID NO:105) TATTTGCAAGGAGCAGGTGCAGAGCGGCGCTAGCGGCAGCCAC
2-P2-11 (SEQ ID NO:106) GTGCATCGTCGAGGAATCCACCGGCGCTAGCGGCAGCCAC
2-P2-12 (SEQ ID NO:107) GTCGCCATTGACAAACTGAAGAAAGGCGCTAGCGGCAGCCAC
2-P2-13 (SEQ ID NO:108) CTGCTCTATGGCACAGATCCAGCTGGGCGCTAGCGGCAGCCAC
Amplification des fragments d'intérêt :
Amorce Amorce fragment matrice Taille de sens anti-sens d'intérêt l'amplicon(pb) Pl-NT-FCTH P2-NT-4 Nter 1-4 pCDNA2001neo-MD3Y 865 Pl-NT-FCTH P2-NT-7 Nter 1-7 pCDNA2001neo-MD3Y
Pl-NT-FCTH P2-NT-8 Nter 1-8 pCDNA2001neo-MD3Y
Pl-NT-FCTH P2-NT-9 Nter 1-9 pCDNA2001neo-MD3Y
Pl-NT-FCTH P2-NT-10 Nter 1-10 pCDNA2001neo-MD3Y
Pl-NT-FCTH P2-NT-11 Nter 1-11 pCDNA2001neo-MD3Y
Pl-NT-FCTH P2-NT-12 Nter 1-12 pCDNA2001neo-MD3Y
Pl-NT-FCTH P2-NT-13 Nter 1-13 pCDNA2001neo-MD3Y 2473 2/ Construction des vecteurs = Digestion NotI/BamHI des Inserts :
Inserts Taille (pb) Nter 1-4 850 Nter 1-7 1393 Nter 1-8 1552 Nter 1-9 1732 Nter 1-10 1915 Nter 1-11 2098 Nter 1-12 2284 Nter 1-13 2458 = Digestion NotI/BamHI du vecteur pCEP4 :
¨> Obtention de 2 fragments 24 et 10162pb Nucléospin extract II (Clontech) = Ligation et transformation de bactéries TOP10 = Screening par PCR : CMV1/MD2-1Rev ¨> Obtention d'un amplicon de 594pb amorces CMV1 - SEQ ID NO: 109: 5'-CCATTGACGTCAATGGGAGTTTG-3' MD2-lrev - SEQ ID NO: 110: 5'-tgtcacactcgcggtagttg-3' 3/ Séquençage On utilise les amorces CMV1 et SV40-3'UTR pour le séquençage de tous les vecteurs. Seul les vecteurs pCEP4-1NTer11, pCEP4-1NTer12 et pCEP4-1NTer13 ont un séquençage supplémentaire avec l'amorce MD2-3.
Amorce 5V40-3'UTR ¨ SEQ ID NO: 111: 5'-TTCACTGCATTCTAGTTGTGGT-3' II/ Construction des vecteurs pCEP4-C-ter 1/ Construction des fragments C-ter Les fragments C-ter sont construits par PCR à partir du vecteur pCDNA2001neo-MD3Y. Ce vecteur correspond au vecteur pCDNA2001neo contenant l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO:90. La stratégie de construction est représentée sur la figure 2.
Les amorces utilisées sont les suivantes:
amorces sens (ou amorces Pl-CT-X):
Chacune de ces amorces contient, dans cet ordre de 5' vers 3': un site NotI, une séquence de Kozack (SK), un peptide signal (PS), un site NheI et une séquence spécifique au facteur H.
Ces éléments sont représentés sur la figure 2.
Pl-CT-19 (SEQ ID NO:112) CTCTAGCGGCCGCGCGCCACCATGCGATGGTCTTGGATTTTTCTGCTGCTGCTGTC
TATCACTTCTGCTAACGCTGCTAGCGGCTGTGGACCCCCTCCACCCATC
Pl-CT-16 (SEQ ID NO:113) CTCTAGCGGCCGCGCGCCACCATGCGATGGTCTTGGATTTTTCTGCTGCTGCTGTC
TATCACTTCTGCTAACGCTGCTAGCGGCTGTAAGAGTCCTCCAGAGATTTCACA
P1-CT-15 (SEQ ID NO:114) CTCTAGCGGCCGCGCGCCACCATGCGATGGTCTTGGATTTTTCTGCTGCTGCTGTC
TATCACTTCTGCTAACGCTGCTAGCGGCTGTAGCCAGCCCCCTCAGATC
Pl-CT-14 (SEQ ID NO:115) CTCTAGCGGCCGCGCGCCACCATGCGATGGTCTTGGATTTTTCTGCTGCTGCTGTC
TATCACTTCTGCTAACGCTGCTAGCGGCTGCCCACCACCTCCACAGATTC
P1-CT-13 (SEQ ID NO:116) CTCTAGCGGCCGCGCGCCACCATGCGATGGTCTTGGATTTTTCTGCTGCTGCTGTC
TATCACTTCTGCTAACGCTGCTAGCGGCTGCAAGTCCTCTAATCTGATCATTC
Pl-CT-12 (SEQ ID NO:117) CTCTAGCGGCCGCGCGCCACCATGCGATGGTCTTGGATTTTTCTGCTGCTGCTGTC
TATCACTTCTGCTAACGCTGCTAGCGGCTGTGGCGATATTCCAGAACTGG
P1-CT-11 (SEQ ID NO:118) CTCTAGCGGCCGCGCGCCACCATGCGATGGTCTTGGATTTTTCTGCTGCTGCTGTC
TATCACTTCTGCTAACGCTGCTAGCGGCTGTGGACCACCTCCAGAACTGC
P1-CT-10 (SEQ ID NO:119) CTCTAGCGGCCGCGCGCCACCATGCGATGGTCTTGGATTTTTCTGCTGCTGCTGTC
TATCACTTCTGCTAACGCTGCTAGCGGCTGTGAGCTGCCAAAAATTGATG
P1-CT-9 (SEQ ID NO:120) CTCTAGCGGCCGCGCGCCACCATGCGATGGTCTTGGATTTTTCTGCTGCTGCTGTC
TATCACTTCTGCTAACGCTGCTAGCGGCTGTGACATTCCAGTGTTTATGAACG
P1-CT-8 (SEQ ID NO:121) CTCTAGCGGCCGCGCGCCACCATGCGATGGTCTTGGATTTTTCTGCTGCTGCTGTC
TATCACTTCTGCTAACGCTGCTAGCGGCTGTTCTAAGAGCAGCATCGACATTG
amorce antisens (P2-CT-FCTH) Cette amorce contient, dans l'orientation 5' vers 3': un site BamHI, 2 codons stop, une étiquette hexahistidine, un linker (GGSG) et une séquence spécifique du Facteur H
P2-CT-FCTH (SEQ ID NO:122) GAGTAGGATCCTTATCAATGGTGGTGATGGTGGTGGCCGCTTCCGCCTCTCTTAG
CACAAGTAGGGTATTCCAG 74pb La série d'amorce Pl-CT-X (X, variable) et l'amorce P2-CT-FCTH sont obtenues par PCR
d'assemblage.
= PCR d'assemblage pour l'obtention des amorces:
amorces utilisées pour l'obtention de l'amorce P2-CT-FCTH
1-P2-CT-FCTH-for (SEQ ID NO:123) GAGTAGGATCCTTATCAATGGTGGTGATGGTGGTGGCCGCTTCCG
2-P2-CT-FCTH-rev (SEQ ID NO:124) CTGGAATACCCTACTTGTGCTAAGAGAGGCGGAAGCGGCCACCAC
amorces utilisées pour l'obtention des amorces Pl-CT-X
PCR1 :
1-P1-CT-FCTH1 (SEQ ID NO:125) CTCTAGCGGCCGCGCGCCACCATGCGATGGTCTTG
1-P1-CT-FCTH2 (SEQ ID NO:126) CGTTAGCAGAAGTGATAGACAGCAGCAGCAGAAAAATCCAAGACCATCGCATG
Fragment PCR1: P1-CT-FCTH-PCR1 (SEQ ID NO:127) CTCTAGCGGCCGCGCGCCACCATGCGATGGTCTTGGATTTTTCTGCTGCTGCTGTC
amorce amorce Taille des dimères sens anti-sens Dimère crée (pb) 1-Pl-CT-FCTH1 1-Pl-CT-FCTH2 Pl-CT-FCTH-Pcr1 73 PCR2 :
2-P1-CT-19 (SEQ ID NO:128) GATGGGTGGAGGGGGTCCACAGCCGCTAGCAGCGTTAGCAGAAGTGA
2-P1-CT-16 (SEQ ID NO:129) TGTGAAATCTCTGGAGGACTCTTACAGCCGCTAGCAGCGTTAGCAGAAGTGA
2-P1-CT-15 (SEQ ID NO:130) GATCTGAGGGGGCTGGCTACAGCCGCTAGCAGCGTTAGCAGAAGTGA
2-P1-CT-14 (SEQ ID NO:131) GAATCTGTGGAGGTGGTGGGCAGCCGCTAGCAGCGTTAGCAGAAGTGA
2-P1-CT-13 (SEQ ID NO:132) GAATGATCAGATTAGAGGACTTGCAGCCGCTAGCAGCGTTAGCAGAAGTGA
2-P1-CT-12 (SEQ ID NO:133) CCAGTTCTGGAATATCGCCACAGCCGCTAGCAGCGTTAGCAGAAGTGA
2-P1-CT-11 (SEQ ID NO:134) GCAGTTCTGGAGGTGGTCCACAGCCGCTAGCAGCGTTAGCAGAAGTGA
2-P1-CT-10 (SEQ ID NO:135) CATCAATTTTTGGCAGCTCACAGCCGCTAGCAGCGTTAGCAGAAGTGA
2-P1-CT-9 (SEQ ID NO:136) CGTTCATAAACACTGGAATGTCACAGCCGCTAGCAGCGTTAGCAGAAGTGA
2-P1-CT-8 (SEQ ID NO:137) CAATGTCGATGCTGCTCTTAGAACAGCCGCTAGCAGCGTTAGCAGAAGTGA
fragment Amorce Taille des anti-sens Dimère crée dimères (pb) Pl-CT-FCTH-Pcrl 2-P1-CT-19 P1-CT-19 106 Pl-CT-FCTH-Pcrl 2-P1-CT-16 P1-CT-16 111 Pl-CT-FCTH-Pcrl 2-P1-CT-15 P1-CT-15 106 Pl-CT-FCTH-Pcrl 2-P1-CT-14 P1-CT-14 107 Pl-CT-FCTH-Pcrl 2-P1-CT-13 P1-CT-13 110 Pl-CT-FCTH-Pcrl 2-P1-CT-12 P1-CT-12 107 Pl-CT-FCTH-Pcrl 2-P 1-CT-11 Pl-CT-11 107 Pl-CT-FCTH-Pcrl 2-P1-CT-10 P1-CT-10 107 Pl-CT-FCTH-Pcrl 2-P1-CT-9 P1-CT-9 110 Pl-CT-FCTH-Pcrl 2-P1-CT-8 P1-CT-8 110 = Amplification des fragments d'intérêt :
Primers Primers fragment matrice Taille de sens anti-sens d'intérêt l'amplicon(pb) P1-CT-19 P2-CT-FCTH Cter 19-20 pCDNA2001neo-MD3Y 500 P1-CT-16 P2-CT-FCTH Cter 16-20 pCDNA2001neo-MD3Y
P1-CT-15 P2-CT-FCTH Cter 15-20 pCDNA2001neo-MD3Y
P1-CT-14 P2-CT-FCTH Cter 14-20 pCDNA2001neo-MD3Y
P1-CT-13 P2-CT-FCTH Cter 13-20 pCDNA2001neo-MD3Y
P1-CT-12 P2-CT-FCTH Cter 12-20 pCDNA2001neo-MD3Y
Pl-CT-11 P2-CT-FCTH Cter 11-20 pCDNA2001neo-MD3Y
P1-CT-10 P2-CT-FCTH Cter 10-20 pCDNA2001neo-MD3Y
P1-CT-9 P2-CT-FCTH Cter 9-20 pCDNA2001neo-MD3Y
P1-CT-8 P2-CT-FCTH Cter 8-20 pCDNA2001neo-MD3Y
2/ Construction des vecteurs = Digestion NotI/BamHI des Inserts :
Inserts Taille (pb) Cter 19-20 483 Cter 16-20 1017 Cter 15-20 1200 Cter 14-20 1377 Cter 13-20 1551 Cter 12-20 1737 Cter 11-20 1920 Cter 10-20 2110 Cter 9-20 2283 Cter 8-20 2466 = Digestion NotI/BamHI du vecteur pCEP4 :
¨> Obtention de 2 fragments 24 et 10162pb Nucléospin extract II
= Ligation et transformation de bactéries TOP10 = Screening par PCR : CMV1/P2-MB7 ¨> Obtention d'un amplicon de 259pb Seq P2-MB7 ¨ SEQ ID NO :138 : 5'-TGGTGATGCTCAGCAGCAGCAGGAAGATCCAGCTCCATCG-3' 3/ Séquençage On utilise les amorces CMV1 et SV40-3'UTR pour le séquençage de tous les vecteurs. Seul les vecteurs pCEP4-9Cter20 et pCEP4-8Cter20 auront un séquençage supplémentaire avec l'amorce MD2-5.
Seq MD2-5 ¨ SEQ ID NO: 139: 5'- GGATTCACACCGTGTGCATTAATG-3' Exemple 2: Construction des vecteurs Facteur H combinant les domaines N-ter et C-ter A partir des 8 vecteurs pCEP4-1NTX et des 10 vecteurs pCEP4-XCT20 nous réalisons la construction de 59 vecteurs combinant les fragments N-ter et C-ter, contenant à minima obligatoirement les domaines SCR1-4 N-terminaux et les domaines SCR19-20 C-terminaux auxquels sont ajoutés un nombre variable des domaines SCRs dans la partie centrale de la molécule.
Dans un premier temps, nous introduisons les fragments 1NTX, présent dans le plasmide pCEP4 dans le vecteur pCDNA2001neo (par digestion NotI/BamHI).
Dans un second temps, nous introduisons dans les vecteurs pCDNA2001neo-1NTX
les fragments XCT20 (par digestion NheI/BamHI).
Nous obtenons ainsi 59 constructions plasmidiques qui correspondent aux 59 combinaisons 1NTX-XCT20 des fragments FH. Ces séquences sont présentes dans le vecteur pCDNA2001neo qui permet une expression stable de ces molécules dans la lignée cellulaire PERC6. Pour faciliter le travail de criblage et de production, les 59 fragments FH 1NTX-XCT20 sont extraits du vecteur pCDNA2001neo par digestion NotI/BamHI et clonés dans le vecteur pCEP4 qui permet une expression transitoire dans les cellules HEK293F.
I/ Construction des vecteurs pCDNA2001neo-N-Ter à partir des vecteurs pCEP4-N-ter :
= Digestion des vecteurs pCEP4-1NT X par Not I/BamHI :
Purification sur gel du fragment d'intérêt suivi d'un Nucléospin extract II.
= Digestion du vecteur pCDNA2001neo par Not I/BamHI.
Nucléospin extract II.
= Ligation et transformation TOP10.
= Criblage par PCR : CMV1/MD2-1REV Obtention d'un fragment à 706 pb.
= Contrôle par digestion NotI/BamHI : vérification de la présence de l'insert.
II/ Construction des vecteurs pCDNA2001neo-1NTX / XCT20 pour une production dans la lignée cellulaire PERC6:
Fragment Fragment Fragment Fragment Nter Cter Nter Cter = Digestion des vecteurs pCEP4-XCT20 par NheI / BamHI :
- pCEP4-19CT20 414 pb - pCEP4-16CT20 948 pb - pCEP4-15CT20 1131 pb - pCEP4-14CT20 1308 pb - pCEP4-13CT20 1482 pb - pCEP4-12CT20 1668 pb - pCEP4-11CT20 1851 pb - pCEP4-10CT20 2034 pb - pCEP4-9CT20 2214 pb - pCEP4-8CT20 2397 pb Purification sur gel du fragment d'intérêt suivi d'un Nucléospin extract II.
= Digestion du vecteur pCDNA2001neo-1NTX par Nhe I/BamHI.
Nucléospin extract II.
= Ligation et transformation TOP10.
= Criblage par PCR : MD2-6 / 2BGHPA Obtention d'un fragment à 373 pb.
Digestion de contrôle NotI/BamHI et NheI/BamHI.
Seq MD2-6 ¨ SEQ ID NO :140 : 5'-AGGGAAACAAGCGCATCACCT-3' Seq 2BGHPA ¨ SEQ ID NO :141: 5'-CAGATGGCTGGCAACTAGAA-3' Les fragments 1NTX/XCT20 sont ensuite extraits par digestion NotI / BamHI et réintroduits dans le vecteur pCEP4.
III/ Construction des vecteurs pCEP4-1NTX / XCT20 pour une production dans la lignée cellulaire HEK 293 Freestyle :
= Digestion du vecteur pCEP4 par NotI / BamHI (10162 et 24pb) Nucléospin extract II.
= Digestion des vecteurs pCDNA2001neo-1NTX/XCT20 par NotI / BamHI (Taille des fragments dans le tableau ci-dessous.) Purification sur gel Nucléospin extract II.
Taille Taille Vecteur digéré (NotI/BamHI) insert Vecteur digéré (NotI/BamHI) insert (pb) (pb) pCDNA200 lneo-1NT4/19CT20 1216 pCDNA200 lneo-1NT9/19CT20 2134 pCDNA200 lneo-1NT4/16CT20 1762 pCDNA200 lneo-1NT9/16CT20 2668 pCDNA200 lneo-1NT4/15CT20 1945 pCDNA200 lneo-1NT9/15CT20 2851 pCDNA200 lneo-1NT4/14CT20 2122 pCDNA200 lneo-1NT9/14CT20 3028 pCDNA200 lneo-1NT4/13CT20 2296 pCDNA200 lneo-1NT9/13CT20 3202 pCDNA200 lneo-1NT4/12CT20 2482 pCDNA200 lneo-1NT9/12CT20 3388 pCDNA200 lneo-1NT4/11CT20 2665 pCDNA200 lneo-1NT9/11CT20 3571 pCDNA200 lneo-1NT4/10CT20 2848 pCDNA200 lneo-1NT9/10CT20 3754 pCDNA200 lneo-1NT4/ 9CT20 3028 pCDNA200 lneo-1NT10/19CT20 2317 pCDNA2001neo-1NT4/ 8CT20 3211 pCDNA2001neo-1NT10/16CT20 2851 pCDNA200 lneo-1NT7/19CT20 1771 pCDNA200 lneo-1NT10/15CT20 3034 pCDNA200 lneo-1NT7/16CT20 2305 pCDNA200 lneo-1NT10/14CT20 3211 pCDNA2001neo-1NT7/15CT20 2488 pCDNA2001neo-1NT10/13CT20 3385 pCDNA200 lneo-1NT7/14CT20 2665 pCDNA200 lneo-1NT10/12CT20 3571 pCDNA2001neo-1NT7/13CT20 2839 pCDNA2001neo-1NT10/11CT20 3754 pCDNA200 lneo-1NT7/12CT20 3025 pCDNA200 lneo-1NT11/19CT20 2500 pCDNA2001neo-1NT7/11CT20 3208 pCDNA2001neo-1NT11/16CT20 3034 pCDNA2001neo-1NT7/10CT20 3391 pCDNA2001neo-1NT11/15CT20 3217 pCDNA2001neo-1NT7/ 9CT20 3571 pCDNA2001neo-1NT11/14CT20 3394 pCDNA2001neo-1NT7/ 8CT20 3754 pCDNA2001neo-1NT11/13CT20 3568 pCDNA2001neo-1NT8/19CT20 1954 pCDNA2001neo-1NT11/12CT20 3754 pCDNA200 lneo-1NT8/16CT20 2488 pCDNA200 lneo-1NT12/19CT20 2686 pCDNA200 lneo-1NT8/15CT20 2671 pCDNA200 lneo-1NT12/16CT20 3220 pCDNA200 lneo-1NT8/14CT20 2848 pCDNA200 lneo-1NT12/15CT20 3403 pCDNA2001neo-1NT8/13CT20 3022 pCDNA2001neo-1NT12/14CT20 3580 pCDNA2001neo-1NT8/12CT20 3208 pCDNA2001neo-1NT12/13CT20 3754 pCDNA2001neo-1NT8/11CT20 3391 pCDNA2001neo-1NT13/19CT20 2860 pCDNA200 lneo-1NT8/10CT20 3574 pCDNA200 lneo-1NT13/16CT20 3394 pCDNA2001neo-1NT8/ 9CT20 3754 pCDNA2001neo-1NT13/15CT20 3577 pCDNA2001neo-1NT13/14CT20 3754 = Ligation et transformation TOP10.
= Criblage par PCR : CMV1 / MD2-1REV Obtention d'un fragment à 594 pb.
= Séquençage des jonctions par CMV1 et SV40-3'UTR.
Exemple 3: Détermination de la concentration et de la masse moléculaire des fragments FH présents dans les surnageants des cellules HEK 293F après 7 jours de production en mode batch.
3.1: Transfection transitoire dans les cellules HEK 293F pour production transitoire des fragments FH recombinant.
1 -Transfection transitoire :
La veille de la transfection transitoire, les cellules HEK 293F sont repiquées à une concentration cellulaire de 7E5 vc/ml. La densité cellulaire et la viabilité
des cellules HEK
293F sont déterminées le jour de la transfection. Le volume de culture correspondant à 30E6 cv/ml est centrifugé. Le surnageant est éliminé et le culot de cellules est repris dans 28 ml de milieu de culture F17 (Invitrogen), transféré dans un erlen de 250 ml et incubé à 37 C.
2-Formation du complexe agent de transfection / ADN en rapport 2:1:
L'agent de transfection et l'ADN correspondant au vecteur pCEP4 contenant une des séquences des fragments FH sont préparés dans du milieu OptiMEM (Invitrogen) de la façon suivante:
- Ajout de 30ug d'ADN dans 1 ml d'OptiMEM
- Ajout de 60 iul de Fectine ou 60 iul de PEI dans 1 ml d'OptiMEM.
Ces deux préparations sont incubées séparément pendant 5 minutes à température ambiante puis la solution contenant l'agent de transfection est ajoutée délicatement à
celle contenant l'ADN. Le mélange est incubé pendant 25 minutes à température ambiante avant d'être ajouté
au 28 ml de cellules HEK 293F préalablement préparées. Les cellules sont alors incubées à
37 C sous agitation à 125 rpm.
3-Production transitoire de facteur H:
Les cellules sont maintenues en culture durant 7 jours sans ajout ou renouvellement de milieu de culture. Le 7' jour, les cellules sont centrifugées à 3000g pendant 15 minutes. Les culots cellulaires sont éliminés et les surnageant cellulaires contenant les fragments FH
recombinants sont filtrés en 0.22 ium puis congelés à -20 C.
3.2 : Dosage des fragments FH humain dans le milieu de culture par ELISA
Anticorps de coating : immunoglobuline de mouton anti-Facteur H humain (The Binding Site) diluée extemporanément dans un tampon PBS pH 7,4 pour obtenir une concentration comprise entre 3,5 et 5,5 iLtg/ml.
Tampon de saturation: PBS - BSA 1 % (p/vol) Tampon de lavage: PBS ¨ Tween-20 0,1 % (vol/vol) Tampon de dilution: Tampon PBS ¨ Tween-20 0,1 % (vol/vol) - BSA 0,1 % (p/vol) Solution standard: Calibrateur Facteur H humain NL (The Binding Site) Echantillons : les échantillons sont prédilués de façon à obtenir une concentration proche de celle du premier point de gamme. Puis diluer de 1/2 en 1/2.
Anticorps monoclonal anti Facteur H: Immunoglobulines monoclonales de souris purifiées anti-Facteur H humain (SEROTEC) Anticorps de révélation: Immunoglobulines de chèvre anti-IgG de souris marquées à la peroxydase (Jackson Immuno Research Laboratories).
Solution de révélation: TMB Kit (Pierce) Solution d'arrêt: Acide sulfurique 4 N ou 2 M (Fisher Scientific).
MODE OPERATOIRE
Sensibilisation de la phase solide :
Dans une plaque de microtitration, on distribue 100 pl par puits d'anticorps de coating dilué.
La plaque est ensuite recouverte d'une feuille adhésive puis incubée une nuit à + 4 C. La plaque est ensuite vidée par retournement.
Saturation de la phase solide :
On distribue 120 pl par puits de solution de saturation. La plaque est ensuite recouverte d'une feuille adhésive puis incubée 1 heure à 20 C. On procède ensuite à 3 lavages avec du tampon de lavage.
Capture de l'antigène :
On distribue 100 pl par puits de tampon de dilution (blanc), de chaque dilution du standard et des échantillons. La plaque est ensuite recouverte d'une feuille adhésive puis incubée 1 heure 30 minutes à 20 C. On lave ensuite 5 fois en tampon de lavage.
Reconnaissance de l'antigène par l'anticorps monoclonal :
100 pl de l'anticorps monoclonal sont distribués dans chaque puits. La plaque est recouverte d'une feuille adhésive puis incubée incubée 1 heure 30 minutes à 20 C. On lave ensuite 5 fois en tampon de lavage.
Marquage par le conjugué HRP (HorseRadish Peroxidase en anglais, ou peroxydase de raifort) :
100 pl de l'anticorps de révélation sont distribués, la plaque est recouverte d'une feuille adhésive, puis incubée 1 heure à 20 C. Les puits sont lavés 5 fois en tampon de lavage.
Réaction enzymatique :
On distribue 100 pl par puits de TMB contenant le substrat à intervalle de temps régulier et loin de toute lumière intense. Puis on incube à température ambiante entre 5 ¨
15 minutes. Ce temps doit être identique pour tous les points de dosage.
Arrêt de la réaction :
On distribue 100 pl d'H2SO4 4N par puits à intervalle de temps régulier.
Les résultats sont rapportés dans le tableau suivant.
Dosage ELISA
(mode batch 7 Masse jours) moléculaire Fragment FH mg/L (Dallons) 1NT4- 19CT20 67 43442.8 1NT4- 16CT20 46 63288.2 1NT4- 15CT20 29 69983.5 1NT4- 14CT20 15 76680.1 1NT4- 11CT20 10 97371.7 1NT4- 1OCT20 22 104213.6 1NT4- 9CT20 13 111090.2 1NT4- 8CT20 15 117650.5 1NT7- 19CT20 10 64198.2 1NT7- 16CT20 76 84043.6 1NT7- 15CT20 132 90738.9 1NT7- 14CT20 177 97435.5 1NT7- 13CT20 27 104274.3 1NT7- 12CT20 42 111244.2 1NT7- 11CT20 154 118127.1 1NT7- 1OCT20 157 124969.1 1NT7- 9CT20 161 131845.6 1NT7- 8CT20 224 138405.9 1NT8- 19CT20 7 70758.5 1NT8- 16CT20 47 90603.9 1NT8- 15CT20 124 97299.2 1NT8- 14 CT20 339 103969.8 1NT8- 13 CT20 48 110808.6 1NT8- 12 CT20 13 117804.6 1NT8- 11 CT20 115 124687.4 1NT8- 10 CT20 128 131529.4 1NT8- 9 CT20 80 138405.9 1NT9-19 CT20 5 77635.1 1NT9-16 CT20 8 97480.4 1NT9-15 CT20 43 104175.7 1NT9-14 CT20 91 110872.3 1NT9-13 CT20 25 117711.2 1NT9-12 CT20 25 124655.0 1NT9-11 CT20 45 131537.9 1NT9-10 CT20 156 138405.9 1NT10- 19CT20 5 84451.0 1NT10- 15CT20 13 110991.7 1NT10- 14CT20 21 117688.3 1NT10- 11CT20 128 138379.9 1NT11-19CT20 9 91333.8 1NT11- 16CT20 22 111179.2 1NT11- 15CT20 16 117874.5 1NT11-14CT20 36 124571.1 1NT13- 14CT20 13 138379.9 Exemple 4: Caractérisation par SDS-PAGE des fragments FH recombinants présents dans le surnageant de culture (figures 6A, 6B et 7).
A partir de la valeur de la concentration des fragments FH recombinants déterminée par ELISA, un volume correspondant à litg de facteur H recombinant est dilué
au 1/2 dans du tampon Laemmli 2x, chauffé à 95 C pendant 5 minutes puis déposé sur un gel linéaire de
La séquence du domaine SCR15 introduit dans la protéine selon l'invention a au moins 85 %, notamment au moins 90 %, notamment au moins 95 %, notamment au moins 99 %
d'identité
avec la séquence SEQ ID NO:18. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR15 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ
ID NO: 18.
La séquence en acides aminés du domaine SCR16 (acides aminés 931 à 984) du variant Y402 du facteur H humain est représentée par la séquence SEQ ID NO: 19 (CKSPPEISHGVVAHMSDSYQYGEEVTYKCFEGFGIDGPAIAKCLGEKWSHPPSC). La séquence du domaine SCR16 introduit dans la protéine selon l'invention a au moins 85 %, notamment au moins 90 %, notamment au moins 95 %, notamment au moins 99 %
d'identité
avec la séquence SEQ ID NO:19. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR16 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ
ID NO: 19.
La séquence en acides aminés du domaine SCR17 (acides aminés 989 à 1043) du variant Y402 du facteur H humain est représentée par la séquence SEQ ID NO: 20 (CLSLPSFENAIPMGEKKDVYKAGEQVTYTCATYYKMDGASNVTCINSRWTGRPTC).
La séquence du domaine SCR17 introduit dans la protéine selon l'invention a au moins 85 %, notamment au moins 90 %, notamment au moins 95 %, notamment au moins 99 %
d'identité
avec la séquence SEQ ID NO:20. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR17 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ
ID NO: 20.
La séquence en acides aminés du domaine SCR18 (acides aminés 1048 à 1102) du variant Y402 du facteur H humain est représentée par la séquence SEQ ID NO: 21 (CVNPPTVQNAYIVSRQMSKYPSGERVRYQCRSPYEMFGDEEVMCLNGNWTEPPQC) . La séquence du domaine SCR18 introduit dans la protéine selon l'invention a au moins 85 %, notamment au moins 90 %, notamment au moins 95 %, notamment au moins 99 %
d'identité avec la séquence SEQ ID NO:21. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR18 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ ID NO: 21.
La séquence en acides aminés du domaine SCR19 (acides aminés 1109 à 1163) du variant Y402 du facteur H humain est représentée par la séquence SEQ ID NO: 22 (CGPPPPIDNGDITSFPLSVYAPASSVEYQCQNLYQLEGNKRITCRNGQWSEPPKC). La séquence du domaine SCR19 introduit dans la protéine selon l'invention a au moins 85 %, notamment au moins 90 %, notamment au moins 95 %, notamment au moins 99 %
d'identité
avec la séquence SEQ ID NO:22. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR18 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ
ID NO: 22.
La séquence en acides aminés du domaine SCR20 (acides aminés 1167 à 1231) du variant Y402 du facteur H humain est représentée par la séquence SEQ ID NO: 23 (CVISREIMENYNIALRWTAKQKLYSRTGESVEFVCKRGYRLSSRSHTLRTTCWDGKL
EYPTCAKR). La séquence du domaine SCR18 introduit dans la protéine selon l'invention a au moins 85 %, notamment au moins 90 %, notamment au moins 95 %, notamment au moins 99 % d'identité avec la séquence SEQ ID NO:23. Dans un mode de réalisation, la séquence du domaine SCR20 introduit dans la protéine selon l'invention est celle représentée dans la séquence SEQ ID NO: 23.
Dans un mode de réalisation, la première ou la deuxième séquence en acides aminés comprend au moins les domaines SCR12, SCR13 et SCR14 du facteur H. Dans un autre mode de réalisation, aucun des domaines SCR12, SCR13 et SCR14 n'est présent dans la protéine recombinante selon l'invention. Une variante de réalisation de la présente invention concerne une protéine recombinante dont les domaines SCR sont constitués, dans cet ordre, des domaines SCR1, SCR2, SCR3, SCR4, SCR12, SCR13, SCR14, SCR19 et SCR20. Une telle protéine est représentée dans la séquence SEQ ID NO : 142.
Chaque domaine SCR inclus dans la première ou la deuxième séquence en acides aminés peut être lié au(x) SCR contigu(s) au moyen du linker naturel trouvé entre lesdits domaines SCR, le cas échéant. Alternativement, le linker entre chaque domaine SCR de la protéine recombinante peut être un linker non naturel. Le linker non naturel peut être constitué d'une séquence comprenant entre 2 et 20 acides aminés, notamment entre 3 et 8 acides aminés.
Par ailleurs, la liaison entre la première et la deuxième séquence en acides aminés peut être réalisée au moyen d'un linker naturel ou synthétique présent en position C-terminale de la première séquence en acides aminées ou en position N-terminale de la deuxième séquence en acides aminés. Par exemple, le premier et le deuxième polypeptide peuvent être liés par un linker de séquence GASG (SEQ ID NO:3). Par ailleurs, la première et la deuxième séquences en acides aminés peuvent être liées entre elles par un linker combinant la séquence linker naturelle suivant le dernier domaine de la première séquence (i.e. le domaine en position C-terminale de la première séquence) et un linker synthétique tel que le linker GASG. Les linkers naturels trouvés en position C-terminale de chacun des domaines SCR du facteur H
sont par exemple: QKRP (SEQ ID NO:143) pour le domaine SCR1; EVVK (SEQ ID
NO:144) pour le domaine SCR2; VEIS (SEQ ID NO:145) pour le domaine SCR3; EEKS
(SEQ ID NO:146) pour le domaine SCR4; TLKP (SEQ ID NO:147) pour le domaine SCR5;
LRK pour le domaine SCR6; IRVKT (SEQ ID NO:148) pour le domaine SCR7; IKS pour le domaine SCR8; YERE (SEQ ID NO:149) pour le domaine SCR9; KEQVQS (SEQ ID
NO:150) pour le domaine SCR10; IVEEST (SEQ ID NO:151) pour le domaine SCR11;
VAIDKLKK (SEQ ID NO:152) pour le domaine SCR12; SMAQIQL (SEQ ID NO:153) pour le domaine SCR13; VEKIP (SEQ ID NO:154) pour le domaine SCR14; EGLP (SEQ ID
NO:155) pour le domaine SCR15; IKTD (SEQ ID NO:156) pour le domaine SCR16;
RDTS
(SEQ ID NO:157) pour le domaine SCR17; KDSTGK (SEQ ID NO:158) pour le domaine SCR18; LHP pour le domaine SCR19.
Selon un mode de réalisation, la première séquence en acides aminés comprend les domaines SCR1, SCR2, SCR3 et SCR4 du facteur H.
Selon un mode de réalisation, la première séquence en acides aminés comprend les domaines SCR1, SCR2, SCR3, SCR4 et SCR5 du facteur H.
Selon un autre mode de réalisation, la première séquence en acides aminés comprend les domaines SCR1, SCR2, SCR3, SCR4, SCR5 et SCR6 du facteur H.
Selon un autre mode de réalisation, la première séquence en acides aminés comprend les domaines SCR1, SCR2, SCR3, SCR4, SCR5, SCR6 et SCR7 du facteur H.
Selon un autre mode de réalisation, la première séquence en acides aminés comprend les domaines SCR1, SCR2, SCR3, SCR4, SCR5, SCR6, SCR7 et SCR8 du facteur H.
Selon un autre mode de réalisation, la première séquence en acides aminés comprend les domaines SCR1, SCR2, SCR3, SCR4, SCR5, SCR6, SCR7, SCR8 et SCR9 du facteur H.
Selon un autre mode de réalisation, la première séquence en acides aminés comprend les domaines SCR1, SCR2, SCR3, SCR4, SCR5, SCR6, SCR7, SCR8, SCR9 et SCR10 du facteur H.
Selon un autre mode de réalisation, la première séquence en acides aminés comprend les domaines SCR1, SCR2, SCR3, SCR4, SCR5, SCR6, SCR7, SCR8, SCR9, SCR10 et SCR11 facteur H.
Selon un autre mode de réalisation, la première séquence en acides aminés comprend les domaines SCR1, SCR2, SCR3, SCR4, SCR5, SCR6, SCR7, SCR8, SCR9, SCR10, SCR11 et SCR12 facteur H.
Selon un autre mode de réalisation, la première séquence en acides aminés comprend les domaines SCR1, SCR2, SCR3, SCR4, SCR5, SCR6, SCR7, SCR8, SCR9, SCR10, SCR11, SCR12 et SCR13 facteur H.
Selon un mode de réalisation, la deuxième séquence en acides aminés comprend les domaines SCR19 et SCR20 du facteur H.
Selon un mode de réalisation, la deuxième séquence en acides aminés comprend les domaines SCR18, SCR19 et SCR20 du facteur H.
Selon un mode de réalisation, la deuxième séquence en acides aminés comprend les domaines SCR17, SCR18, SCR19 et SCR20 du facteur H.
Selon un mode de réalisation, la deuxième séquence en acides aminés comprend les domaines SCR16, SCR17, SCR18, SCR19 et SCR20 du facteur H.
Selon un mode de réalisation, la deuxième séquence en acides aminés comprend les domaines SCR15, SCR16, SCR17, SCR18, SCR19 et SCR20 du facteur H.
Selon un mode de réalisation, la deuxième séquence en acides aminés comprend les domaines SCR14, SCR15, SCR16, SCR17, SCR18, SCR19 et SCR20 du facteur H.
Selon un mode de réalisation, la deuxième séquence en acides aminés comprend les domaines SCR13, SCR14, SCR15, SCR16, SCR17, SCR18, SCR19 et SCR20 du facteur H.
Selon un mode de réalisation, la deuxième séquence en acides aminés comprend les domaines SCR12, SCR13, SCR14, SCR15, SCR16, SCR17, SCR18, SCR19 et SCR20 du facteur H.
Selon un mode de réalisation, la deuxième séquence en acides aminés comprend les domaines SCR11, SCR12, SCR13, SCR14, SCR15, SCR16, SCR17, SCR18, SCR19 et SCR20 du facteur H.
Selon un mode de réalisation, la deuxième séquence en acides aminés comprend les domaines SCR10, SCR11, SCR12, SCR13, SCR14, SCR15, SCR16, SCR17, SCR18, SCR19 et SCR20 du facteur H.
Selon un mode de réalisation, la deuxième séquence en acides aminés comprend les domaines SCR9, SCR10, SCR11, SCR12, SCR13, SCR14, SCR15, SCR16, SCR17, SCR18, SCR19 et SCR20 du facteur H.
Selon un mode de réalisation, la deuxième séquence en acides aminés comprend les domaines SCR8, SCR9, SCR10, SCR11, SCR12, SCR13, SCR14, SCR15, SCR16, SCR17, SCR18, SCR19 et SCR20 du facteur H.
Selon un autre mode de réalisation, la protéine recombinante possédant une activité de facteur H comprend les première et deuxième séquences en acides aminés listées dans le tableau 1 ci-dessous, ces séquences étant séparées par un linker, notamment un linker artificiel, en particulier le linker GASG (SEQ ID NO:3).
Tableau 1 Première séquence Deuxième séquence Première séquence Deuxième séquence SCR1 à SCR4 SCR19 à SCR20 SCR1 à SCR8 SCR14 à SCR20 SCR1 à SCR4 SCR18 à SCR20 SCR1 à SCR8 SCR13 à SCR20 SCR1 à SCR4 SCR17 à SCR20 SCR1 à SCR8 SCR12 à SCR20 SCR1 à SCR4 SCR16 à SCR20 SCR1 à SCR8 SCR11 à SCR20 SCR1 à SCR4 SCR15 à SCR20 SCR1 à SCR8 SCR10 à SCR20 SCR1 à SCR4 SCR14 à SCR20 SCR1 à SCR8 SCR9 à SCR20 SCR1 à SCR4 SCR13 à SCR20 SCR1 à SCR9 SCR19 à SCR20 SCR1 à SCR4 SCR12 à SCR20 SCR1 à SCR9 SCR18 à SCR20 SCR1 à SCR4 SCR11 à SCR20 SCR1 à SCR9 SCR17 à SCR20 SCR1 à SCR4 SCR10 à SCR20 SCR1 à SCR9 SCR16 à SCR20 SCR1 à SCR4 SCR9 à SCR20 SCR1 à SCR9 SCR15 à SCR20 SCR1 à SCR4 SCR8 à SCR20 SCR1 à SCR9 SCR14 à SCR20 SCR1 à SCR7 SCR19 à SCR20 SCR1 à SCR9 SCR13 à SCR20 SCR1 à SCR7 SCR18 à SCR20 SCR1 à SCR9 SCR12 à SCR20 SCR1 à SCR7 SCR17 à SCR20 SCR1 à SCR9 SCR11 à SCR20 SCR1 à SCR7 SCR16 à SCR20 SCR1 à SCR9 SCR10 à SCR20 SCR1 à SCR7 SCR15 à SCR20 SCR1 à SCR10 SCR19 à SCR20 SCR1 à SCR7 SCR14 à SCR20 SCR1 à SCR10 SCR18 à SCR20 SCR1 à SCR7 SCR13 à SCR20 SCR1 à SCR10 SCR17 à SCR20 SCR1 à SCR7 SCR12 à SCR20 SCR1 à SCR10 SCR16 à SCR20 SCR1 à SCR7 SCR11 à SCR20 SCR1 à SCR10 SCR15 à SCR20 SCR1 à SCR7 SCR10 à SCR20 SCR1 à SCR10 SCR14 à SCR20 SCR1 à SCR7 SCR9 à SCR20 SCR1 à SCR10 SCR13 à SCR20 SCR1 à SCR7 SCR8 à SCR20 SCR1 à SCR10 SCR12 à SCR20 SCR1 à SCR8 SCR19 à SCR20 SCR1 à SCR10 SCR11 à SCR20 SCR1 à SCR8 SCR18 à SCR20 SCR1 à SCR11 SCR19 à SCR20 SCR1 à SCR8 SCR17 à SCR20 SCR1 à SCR11 SCR18 à SCR20 SCR1 à SCR8 SCR16 à SCR20 SCR1 à SCR11 SCR17 à SCR20 SCR1 à SCR8 SCR15 à SCR20 SCR1 à SCR11 SCR16 à SCR20 Première séquence Deuxième séquence Première séquence Deuxième séquence SCR1 à SCR11 SCR15 à SCR20 SCR1 à SCR12 SCR14 à SCR20 SCR1 à SCR11 SCR14 à SCR20 SCR1 à SCR12 SCR13 à SCR20 SCR1 à SCR11 SCR13 à SCR20 SCR1 à SCR13 SCR19 à SCR20 SCR1 à SCR11 SCR12 à SCR20 SCR1 à SCR13 SCR18 à SCR20 SCR1 à SCR12 SCR19 à SCR20 SCR1 à SCR13 SCR17 à SCR20 SCR1 à SCR12 SCR18 à SCR20 SCR1 à SCR13 SCR16 à SCR20 SCR1 à SCR12 SCR17 à SCR20 SCR1 à SCR13 SCR15 à SCR20 SCR1 à SCR12 SCR16 à SCR20 SCR1 à SCR13 SCR14 à SCR20 SCR1 à SCR12 SCR15 à SCR20 Selon un mode particulier de réalisation, la protéine recombinante possédant une activité de facteur H comprend les première et deuxième séquences en acides aminés listées dans le tableau 2 ci-dessous, ces séquences étant séparées par un linker, notamment un linker artificiel, en particulier le linker GASG (SEQ ID NO:3).
Tableau 2 Première séquence Deuxième séquence Première séquence Deuxième séquence SCR1 à SCR4 SCR19 à SCR20 SCR1 à SCR8 SCR15 à SCR20 SCR1 à SCR4 SCR16 à SCR20 SCR1 à SCR8 SCR14 à SCR20 SCR1 à SCR4 SCR15 à SCR20 SCR1 à SCR8 SCR13 à SCR20 SCR1 à SCR4 SCR14 à SCR20 SCR1 à SCR8 SCR11 à SCR20 SCR1 à SCR4 SCR11 à SCR20 SCR1 à SCR8 SCR10 à SCR20 SCR1 à SCR4 SCR10 à SCR20 SCR1 à SCR8 SCR9 à SCR20 SCR1 à SCR4 SCR9 à SCR20 SCR1 à SCR9 SCR19 à SCR20 SCR1 à SCR4 SCR8 à SCR20 SCR1 à SCR9 SCR16 à SCR20 SCR1 à SCR7 SCR16 à SCR20 SCR1 à SCR9 SCR14 à SCR20 SCR1 à SCR7 SCR15 à SCR20 SCR1 à SCR9 SCR13 à SCR20 SCR1 à SCR7 SCR14 à SCR20 SCR1 à SCR9 SCR12 à SCR20 SCR1 à SCR7 SCR11 à SCR20 SCR1 à SCR9 SCR11 à SCR20 SCR1 à SCR7 SCR10 à SCR20 SCR1 à SCR9 SCR10 à SCR20 SCR1 à SCR7 SCR9 à SCR20 SCR1 à SCR10 SCR11 à SCR20 SCR1 à SCR7 SCR8 à SCR20 SCR1 à SCR13 SCR14 à SCR20 SCR1 à SCR8 SCR16 à SCR20 Selon une variante préférée de l'invention, la première séquence comprend les domaines SCR1 à SCR7 du facteur H, et la deuxième séquence est choisie dans le groupe constitué :
- des domaines SCR9 à SCR20, - des domaines SCR11 à SCR20 ; et - des domaines SCR14 à SCR20 du facteur H.
Selon une autre variante préférée, la première séquence comprend les domaines SCR1 à
SCR8 et la deuxième séquence comprend les domaines SCR10 à SCR20.
Selon une autre variante préférée, la première séquence comprend les domaines SCR1 à
SCR4 du facteur H et la deuxième séquence comprend les domaines SCR16 à SCR20 du facteur H, une troisième séquence comprenant le domaine SCR7 du facteur 7 étant comprise entre la première et la deuxième séquence, et étant plus particulièrement séparés de ces dernières par des linkers tels que ceux décrits ci-dessus.
Selon un mode de réalisation, la première séquence en acides aminés comprend un peptide signal (PS) en position N-terminale. Le peptide signal peut être le peptide signal naturel du facteur H (MRLLAKIICLMLWAICVA ¨ SEQ ID NO:24), le peptide signal d'une protéine différente du facteur H, ou un peptide signal décrit dans la demande PCT/2001/050544, notamment le peptide MRWSWIFLLLLSITSANA (SEQ ID NO: 25; ou autrement appelé
PS-MB7 par la suite). Le peptide signal naturel d'une protéine différente du facteur H humain peut être un peptide signal choisi parmi les peptides signaux de toutes les protéines qui sont sécrétées chez les eucaryotes et notamment chez les mammifères et plus particulièrement chez l'homme comme ceux des immunoglobulines, des facteurs de croissance comme l'EPO, des hormones comme l'insuline, des enzymes comme le trypsinogène, des facteurs de la coagulation tel que la prothrombine. La présence d'un peptide signal permet de conférer une meilleure sécrétion de protéine recombinante dans le milieu de culture.
Selon un mode de réalisation, l'invention concerne l'un des peptides du tableau 1 dans lequel la première séquence en acides aminés comprend en N-terminal un tel peptide signal, notamment le peptide naturel du facteur H de séquence SEQ ID NO:24 ou le peptide signal PS-MB7 de séquence SEQ ID NO:25. Selon un autre mode de réalisation, la protéine recombinante selon l'invention est choisie parmi l'une des protéines du tableau 1, les première et deuxième séquences étant séparées par un linker, notamment un linker GASG
(SEQ ID
NO:3).
Selon un mode particulier de réalisation, la protéine recombinante selon l'invention est choisie parmi l'une des protéines listées dans le tableau 2 ci-dessous dans lesquelles la première séquence en acides aminés comprend un peptide signal de séquence SEQ ID NO: 25 et les première et seconde séquences sont séparées par un linker de séquence GASG
(SEQ ID
NO:3).
Tableau 3 SEQ ID Première séquence linker Deuxième séquence NO:
26 PS-MB7 + SCR1 à SCR4 GASG SCR19 à SCR20 27 PS-MB7 + SCR1 à SCR4 GASG SCR16 à SCR20 28 PS-MB7 + SCR1 à SCR4 GASG SCR15 à SCR20 29 PS-MB7 + SCR1 à SCR4 GASG SCR14 à SCR20 30 PS-MB7 + SCR1 à SCR4 GASG SCR13 à SCR20 31 PS-MB7 + SCR1 à SCR4 GASG SCR12 à SCR20 32 PS-MB7 + SCR1 à SCR4 GASG SCR11 à SCR20 33 PS-MB7 + SCR1 à SCR4 GASG SCR10 à SCR20 34 PS-MB7 + SCR1 à SCR4 GASG SCR9 à SCR20 35 PS-MB7 + SCR1 à SCR4 GASG SCR8 à SCR20 36 PS-MB7 + SCR1 à SCR7 GASG SCR19 à SCR20 37 PS-MB7 + SCR1 à SCR7 GASG SCR16 à SCR20 38 PS-MB7 + SCR1 à SCR7 GASG SCR15 à SCR20 39 PS-MB7 + SCR1 à SCR7 GASG SCR14 à SCR20 40 PS-MB7 + SCR1 à SCR7 GASG SCR13 à SCR20 41 PS-MB7 + SCR1 à SCR7 GASG SCR12 à SCR20 42 PS-MB7 + SCR1 à SCR7 GASG SCR11 à SCR20 43 PS-MB7 + SCR1 à SCR7 GASG SCR10 à SCR20 44 PS-MB7 + SCR1 à SCR7 GASG SCR9 à SCR20 45 PS-MB7 + SCR1 à SCR7 GASG SCR8 à SCR20 46 PS-MB7 + SCR1 à SCR8 GASG SCR19 à SCR20 47 PS-MB7 + SCR1 à SCR8 GASG SCR16 à SCR20 48 PS-MB7 + SCR1 à SCR8 GASG SCR15 à SCR20 49 PS-MB7 + SCR1 à SCR8 GASG SCR14 à SCR20 50 PS-MB7 + SCR1 à SCR8 GASG SCR13 à SCR20 51 PS-MB7 + SCR1 à SCR8 GASG SCR12 à SCR20 52 PS-MB7 + SCR1 à SCR8 GASG SCR11 à SCR20 53 PS-MB7 + SCR1 à SCR8 GASG SCR10 à SCR20 54 PS-MB7 + SCR1 à SCR8 GASG SCR9 à SCR20 55 PS-MB7 + SCR1 à SCR9 GASG SCR19 à SCR20 56 PS-MB7 + SCR1 à SCR9 GASG SCR16 à SCR20 SEQ ID Première séquence linker Deuxième séquence NO:
57 PS-MB7 + SCR1 à SCR9 GASG SCR15 à SCR20 58 PS-MB7 + SCR1 à SCR9 GASG SCR14 à SCR20 59 PS-MB7 + SCR1 à SCR9 GASG SCR13 à SCR20 60 PS-MB7 + SCR1 à SCR9 GASG SCR12 à SCR20 61 PS-MB7 + SCR1 à SCR9 GASG SCR11 à SCR20 62 PS-MB7 + SCR1 à SCR9 GASG SCR10 à SCR20 63 PS-MB7 + SCR1 à SCR10 GASG SCR19 à SCR20 64 PS-MB7 + SCR1 à SCR10 GASG SCR16 à SCR20 65 PS-MB7 + SCR1 à SCR10 GASG SCR15 à SCR20 66 PS-MB7 + SCR1 à SCR10 GASG SCR14 à SCR20 67 PS-MB7 + SCR1 à SCR10 GASG SCR13 à SCR20 68 PS-MB7 + SCR1 à SCR10 GASG SCR12 à SCR20 69 PS-MB7 + SCR1 à SCR10 GASG SCR11 à SCR20 70 PS-MB7 + SCR1 à SCR11 GASG SCR19 à SCR20 71 PS-MB7 + SCR1 à SCR11 GASG SCR16 à SCR20 72 PS-MB7 + SCR1 à SCR11 GASG SCR15 à SCR20 73 PS-MB7 + SCR1 à SCR11 GASG SCR14 à SCR20 74 PS-MB7 + SCR1 à SCR11 GASG SCR13 à SCR20 75 PS-MB7 + SCR1 à SCR11 GASG SCR12 à SCR20 76 PS-MB7 + SCR1 à SCR12 GASG SCR19 à SCR20 77 PS-MB7 + SCR1 à SCR12 GASG SCR16 à SCR20 78 PS-MB7 + SCR1 à SCR12 GASG SCR15 à SCR20 79 PS-MB7 + SCR1 à SCR12 GASG SCR14 à SCR20 80 PS-MB7 + SCR1 à SCR12 GASG SCR13 à SCR20 81 PS-MB7 + SCR1 à SCR13 GASG SCR19 à SCR20 82 PS-MB7 + SCR1 à SCR13 GASG SCR16 à SCR20 83 PS-MB7 + SCR1 à SCR13 GASG SCR15 à SCR20 84 PS-MB7 + SCR1 à SCR13 GASG SCR14 à SCR20 Selon un mode particulier de réalisation, la protéine recombinante selon l'invention contient une première séquence comprenant les domaines SCR1 à SCR4 du facteur H, et une deuxième séquence choisie dans le groupe constitué :
- des domaines SCR16 à SCR20, - des domaines SCR15 à SCR20 ;
- des domaines SCR10 à SCR20 ; et - des domaines SCR8 à SCR20 du facteur H.
Selon un autre mode de réalisation, la protéine recombinante selon l'invention contient une première séquence comprenant les domaines SCR1 à SCR7 du facteur H, et une deuxième séquence comprenant les domaines SCR16 à SCR20 du facteur H, ladite deuxième séquence étant de préférence choisie dans le groupe constitué :
- des domaines SCR15 à SCR20 - des domaines SCR14 à SCR20 ;
- des domaines SCR11 à SCR20 ;
- des domaines SCR10 à SCR20 ;
- des domaines SCR9 à SCR20; et - des domaines SCR8 à SCR20 du facteur H.
Selon une autre variante, l'invention concerne une protéine recombinante telle que décrite ci-dessus, la première séquence comprenant les domaines SCR1 à SCR8 du facteur H, et la deuxième séquence comprenant les domaines SCR16 à SCR20 du facteur H, ladite deuxième séquence comprenant de préférence les domaines SCR10 à SCR20 du facteur H.
Selon un autre mode de réalisation, la protéine recombinante selon l'invention contient une première séquence comprenant les domaines SCR1 à SCR4 du facteur H et une deuxième séquence comprenant les domaines SCR16 à SCR20 du facteur H, une troisième séquence comprenant le domaine SCR7 du facteur H étant comprise entre la première et la deuxième séquence.
Selon une variante de l'invention, la première séquence comprend un peptide signal de séquence SEQ ID NO :25 et les domaines SCR1 à SCR7 du facteur H, et la deuxième séquence est choisie dans le groupe constitué :
- des domaines SCR9 à SCR20, - des domaines SCR11 à SCR20 ; et - des domaines SCR14 à SCR20 du facteur H.
Dans un mode particulier de réalisation de cette variante, la première et la seconde séquences sont séparées par un linker de séquence GASG.
Selon une autre variante préférée, la première séquence comprend un peptide signal de séquence SEQ ID NO :25 et les domaines SCR1 à SCR8 et la deuxième séquence comprend les domaines SCR10 à SCR20. Dans un mode particulier de réalisation de cette variante, la première et la seconde séquences sont séparées par un linker de séquence GASG.
Selon une autre variante préférée, la première séquence comprend un peptide signal de séquence SEQ ID NO :25 et les domaines SCR1 à SCR4 du facteur H et la deuxième séquence comprend les domaines SCR16 à SCR20 du facteur H, une troisième séquence comprenant le domaine SCR7 du facteur 7 étant comprise entre la première et la deuxième séquence, et étant séparés de ces dernières par des linkers tels que ceux décrits ci-dessus.
Dans un mode particulier de réalisation de cette variante, la première et la troisième séquences, et la troisième et la seconde séquences sont séparées par un linker de séquence GASG. Une telle séquence est représentée dans SEQ ID NO: 159.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant une protéine recombinante selon l'invention.
L'invention a également pour objet une construction d'acide nucléique codant une protéine recombinante ayant une activité de facteur H telle que décrite ci-dessus.
Avantageusement, les acides nucléiques codant les protéines recombinantes selon l'invention ont fait l'objet d'une optimisation de codons.
L'optimisation de codon a pour but de remplacer les codons naturels par des codons dont les ARN de transfert (ARNt) portant les acides aminés sont les plus fréquents dans le type cellulaire considéré. Le fait de mobiliser des ARNt fréquemment rencontrés a pour avantage majeur d'accroître la vitesse de traduction des ARN messagers (ARNm) et donc d'augmenter le titre final (Carton JM et al, Protein Expr Purif, 2007). L'optimisation de séquence joue aussi sur la prédiction des structures secondaires d'ARNm qui pourraient ralentir la lecture par le complexe ribosomal. L'optimisation de séquence a également un impact sur le pourcentage de G/C qui est directement lié à la demi-vie des ARNm et donc à leur potentiel d'être traduit (Chechetkin, J. of theoretical biology 242, 2006 922-934).
L'optimisation de codons peut être faite par substitution des codons naturels en utilisant des tables de fréquence des codons (codon Usage Table) pour mammifères et plus particulièrement pour Homo sapiens. Il existe des algorithmes présents sur internet et mis à
disposition par les fournisseurs de gènes de synthèse (DNA2.0, GeneArt, MWG, Genscript) qui permettent de faire cette optimisation de séquence.
A titre illustratif, une séquence, ayant fait l'objet d'une optimisation de codon, est représentée par la séquence SEQ ID NO : 85. Cette séquence comprend le peptide signal naturel du facteur H.
Les acides nucléiques selon l'invention peuvent comprendre un site de restriction unique entre les deux séquences d'acide nucléique codant la première et la deuxième séquence en acides aminés de la protéine recombinante selon l'invention. Ce site unique de restriction peut notamment correspondre au site Nhe I présent dans la partie codant le linker GASG (séquence nucléique : GCCGCTAGCGCC (SEQ ID NO :86), la partie soulignée correspondant au site NheI qui correspond aux acides aminés AS mentionné ci-dessus. Ce site de restriction unique permet d'envisager une amélioration des protéines recombinantes produites, notamment par introduction facilitée d'un ou plusieurs domaines SCR supplémentaires au niveau de la séquence protéique correspondant au dit site de restriction, ou par introduction d'une séquence en acides aminés différente d'un domaine SCR. Il peut notamment s'agir d'un autre domaine protéique n'appartenant pas au facteur H naturel, ou d'un linker de taille et de séquence différente (notamment un linker plus long).
Les acides nucléiques codant la protéine recombinante selon l'invention peuvent être construits selon toute méthode connue de l'homme du métier dans le domaine de la biologie moléculaire. Avantageusement toutefois, ledit acide nucléique est construit en deux temps selon un procédé propre à la présente invention. Par exemple, une banque d'acides nucléiques clonés dans des vecteurs de clonage ou d'expression peut être constituée.
Chaque vecteur de la banque contient une séquence codant l'une des première ou deuxième séquences en acides aminés composant la protéine recombinante selon l'invention. Ainsi, on décrit un vecteur comprenant les séquences codant une première séquence en acides aminés comprenant à
minima les séquences des domaines SCR1 à SCR4 du facteur H (ou vecteur N-Ter).
De même, on décrit un vecteur comprenant les séquences codant une deuxième séquence en acides aminés comprenant à minima les séquences des domaines SCR19 et SCR20 du facteur H (ou vecteur C-Ter).
Les vecteurs N-Ter et C-Ter sont conçus de manière à comprendre des sites uniques de restriction utiles pour l'excision puis l'assemblage des fragments d'acides nucléiques codant chacune des parties de la protéine recombinante dans un seul et même vecteur.
Les constructions permettant l'expression des protéines du tableau 2 ci-dessus peuvent ainsi être produites à partir de 8 vecteurs N-Ter et 10 vecteurs C-Ter. Cette stratégie est décrite dans les exemples ci-dessous.
Les acides nucléiques selon l'invention peuvent également comprendre toute séquence utile, notamment toute séquence permettant une optimisation de l'expression ou la sécrétion de la protéine recombinante ou pour faciliter le clonage et le sous clonage des acides nucléiques de l'invention. Par exemple, l'acide nucléique pourra comprendre en 5' un site unique de restriction, une séquence codante et/ou une séquence codant un peptide signal.
En 3', il pourra notamment être utile d'introduire une séquence codant un motif d'acides aminés utile pour le marquage ou la purification de la protéine recombinante, par exemple une étiquette histidine, et un ou plusieurs sites de restriction.
Dans un mode de réalisation, la construction d'acide nucléique selon l'invention comprend une séquence codant un peptide signal choisi parmi:
- un acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO: 87 et codant le peptide signal naturel du facteur H, ou - un acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 88 ou par une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 88, et codant le peptide signal du facteur H, (PS naturel optimisé) ou - un acide nucléique codant un peptide signal naturel d'une protéine différente du facteur H, ou - un acide nucléique codant le peptide signal codé par la séquence SEQ ID
NO : 89 (décrit dans la demande PCT/FR2011/050544) ou par une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO:
89.
La séquence SEQ ID NO : 88 ou une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 88 est une séquence obtenue par l'optimisation de codons à partir de la séquence SEQ ID
NO : 87.
L'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 89 ou par une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 89 code le peptide signal artificiel PS-MB7 décrit ci-dessus.
Dans un mode de réalisation, la construction d'acide nucléique codant la protéine recombinante selon l'invention comprend, ou est constitué par:
- un acide nucléique codant un peptide signal, notamment un acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 87 et codant le peptide signal naturel du facteur H, ou un acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO : 88 ou par une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID
NO : 88, et codant le peptide signal du facteur H, (PS naturel optimisé) ou un acide nucléique codant un peptide signal naturel d'une protéine différente du facteur H, ou un acide nucléique codant le peptide signal codé par la séquence SEQ ID NO : 89 (décrit dans la demande PCT/FR2011/050544) ou par une séquence ayant au moins 85%, notamment 90%, particulièrement 95% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 89;
- un acide nucléique codant au moins les domaines SCR1, SCR2, SCR3 et SCR4 du facteur H;
- un acide nucléique codant un linker, notamment un linker GASG (SEQ ID
NO:3), ledit acide nucléique codant un linker comprenant un site unique de restriction, notamment un site NheI;
- un acide nucléique codant au moins les domaines SCR19 et SCR20 du facteur H.
Selon un mode de réalisation, la construction d'acide nucléique permet l'expression d'une protéine recombinante choisie parmi l'une des séquences SEQ ID NO:26 à SEQ ID
NO:84.
L'invention concerne également un vecteur d'expression comprenant la construction d'acide nucléique décrite ci-dessus, liée de manière fonctionnelle à des séquences de contrôle de l'expression dudit acide nucléique. Les séquences de contrôle peuvent notamment comprendre un promoteur (notamment un promoteur CMV), un enhancer, et toute séquence connue de l'homme du métier utile pour permettre l'expression de la protéine recombinante dans une cellule eucaryote, notamment une cellule de mammifère.
A ce titre, l'invention concerne par ailleurs une cellule eucaryote recombinante, notamment une cellule de mammifère, plus particulièrement une cellule non-humaine (e.g.
une cellule CHO) ou humaine, transformée au moyen de la construction d'acide nucléique ou du vecteur d'expression selon l'invention. Dans un mode de réalisation avantageux de la présente invention, la protéine recombinante telle que décrite ci-dessus est produite dans la lignée cellulaire PER.C60 ou une lignée cellulaire HEK, notamment la lignée cellulaire HEK 293F.
La lignée cellulaire PER.C60 est issue de cellules rétinales primaires humaines dans lesquelles un fragment d'ADN adénoviral Ad5 qui contient à la fois le gène ElA
et le gène E 1B est inséré dans les cellules par un vecteur. Ce fragment d'ADN adénoviral permet de conférer l'immortalité aux cellules dans lesquelles il est inséré, par l'intermédiaire de la protéine E 1B qui inhibe la protéine p53. La protéine E lA quant à elle a un tropisme pour le promoteur viral hCMV et permet sa transactivation et la potentialisation de la séquence génique qui sera insérée en 3' de ce dernier et qui pourra être la protéine recombinante selon l'invention.
La présente invention concerne particulièrement l'utilisation de la lignée cellulaire PER.C60 pour la mise oeuvre d'un procédé de préparation d'une protéine recombinante ayant une activité de facteur H, notamment l'une des protéines de séquence SEQ ID NO: 26 à SEQ ID
NO:84.
La présente invention concerne aussi particulièrement l'utilisation de la lignée cellulaire HEK
293F pour la mise oeuvre d'un procédé de préparation d'une protéine recombinante selon l'invention, notamment l'une des protéines recombinantes représentées par l'une des séquences SEQ ID NO: 26 à SEQ ID NO: 84.
L'invention concerne également un procédé pour la production d'une protéine recombinante possédant une activité de facteur H. Le procédé selon l'invention, notamment l'une des protéines représentées par les séquences SEQ ID NO:26 à 84, ledit procédé
comprenant la culture d'une cellule recombinante selon l'invention transformée par un vecteur comprenant la construction d'acide nucléique selon l'invention codant ladite protéine recombinante.
Le vecteur comprenant un tel acide nucléique peut être un quelconque vecteur d'expression pour les lignées cellulaires eucaryotes connues de l'homme du métier.
La transformation de la lignée cellulaire peut être mise en oeuvre par des techniques d'électroporation, de nucléofection type AMAXA, un "pistolet à gène" (gène gun) ou encore à
l'aide d'un agent de transfection connu de l'homme de métier, tel que des agents cationiques, des liposomes ou des polymères tel que la fectine ou l'agent PEI.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé selon la présente invention comprend les étapes suivantes :
(i) la transfection d'une cellule eucaryote par un vecteur d'expression comprenant une construction d'acide nucléique codant la protéine recombinante, pour obtenir une cellule transfectée, (ii) la culture de ladite cellule transfectée, pour obtenir l'expression de la protéine recombinante dans le milieu de culture.
Ledit vecteur d'expression peut contenir un gène de résistance aux antibiotiques pour permettre la sélection des cellules transfectées lors de l'établissement de cellules produisant de façon stable la protéine d'intérêt.
Dans un mode de réalisation, la protéine recombinante selon l'invention est produite à une concentration supérieure ou égale à 10 mg/L telle que détectée par dosage ELISA de surnageant de culture, après 7 jours de production en mode batch.
La purification de la protéine recombinante peut être mise en oeuvre par des techniques de chromatographie en une, deux ou plusieurs étapes. La purification en une étape peut-être une colonne échangeuse d'ions ou une colonne d'affinité (héparine, ligand du facteur H ou anticorps anti-facteur H). La purification en deux étapes peut-être une étape de chromatographie sur colonne échangeuse de cations suivi d'une étape de chromatographie sur colonne échangeuse d'anions ou une étape de chromatographie sur colonne échangeuse d'anions suivi d'une étape de chromatographie sur colonne échangeuse de cations ou une étape de chromatographie sur colonne échangeuse d'ions suivi d'une étape de chromatographie sur colonne d'affinité ou une étape de chromatographie sur colonne d'affinité suivi d'une étape de chromatographie sur colonne échangeuse d'ions.
La purification en plus de deux étapes peut être réalisée par une combinaison de ces différentes chromatographies. Une étape de diafiltration, d'ultrafiltration ou de gel filtration peut-être réalisée en complément. La pureté d'un produit après une telle purification peut atteindre 99%
de produit purifié.
Les protéines selon l'invention peuvent également être produites dans le lait d'animaux transgéniques non humains, tels qu'une chèvre, un lapin, la brebis, la vache ou un porc. Dans ce cas, la sécrétion des protéines par les glandes mammaires, permettant sa sécrétion dans le lait du mammifère transgénique, implique le contrôle de l'expression des protéines selon l'invention de manière tissu-dépendante. De telles méthodes de contrôle sont bien connues de l'homme du métier. Le contrôle de l'expression est effectué grâce à des séquences permettant l'expression de la protéine vers un tissu particulier de l'animal. Il s'agit notamment des séquences promotrices WAP, bêta-caséine, bêta-lactoglobuline et des séquences peptides signal. Le procédé d'extraction de protéines d'intérêt à partir du lait d'animaux transgéniques est décrit dans le brevet EP 0 264 166.
Un autre aspect de l'invention concerne également l'utilisation d'une protéine recombinante selon l'invention en tant que médicament.
L'invention concerne également l'utilisation d'une protéine recombinante selon l'invention pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'une maladie impliquant une activité indésirable ou inappropriée du complément, notamment pour le traitement de maladies dues à une inflammation incontrôlée ou un dépôt de C3b incontrôlé.
L'invention concerne aussi une méthode de traitement d'une maladie impliquant une activité
indésirable ou inappropriée du complément, comprenant l'administration d'une protéine recombinante selon l'invention à un patient nécessitant un tel traitement. Le terme traitement comprend aussi bien un traitement curatif qu'un traitement prophylactique de la maladie. Un traitement curatif est défini par un traitement aboutissant à une guérison ou un traitement allégeant, améliorant et/ou éliminant, réduisant et/ou stabilisant les symptômes d'une maladie ou la souffrance qu'elle provoque. Un traitement prophylactique comprend aussi bien un traitement aboutissant à la prévention d'une maladie qu'un traitement réduisant et/ou retardant l'incidence d'une maladie ou le risque qu'elle survienne. L'invention vise notamment le traitement d'une maladie choisie dans le groupe constitué d'une dégénérescence maculaire liée à
l'âge (DMLA), une périodontite, un lupus érythémateux, une néphrite lupique, une dermatomyosite, une myasthénie grave, une glomérulonéphrite membrano-proliférative (GNMP), un psoriasis, une sclérose en plaques et les lésions d'une ischémie/
reperfusion rénale.
La présente invention est illustrée par les figures et les exemples ci-après.
Ces figures et exemples ne visent en aucun cas la limitation de la portée de la présente invention.
Figures:
La figure 1 est un schéma représentant la stratégie de construction des fragments N-terminaux des protéines recombinantes selon l'invention.
La figure 2 est un schéma représentant la stratégie de construction des fragments C-terminaux des protéines recombinantes selon l'invention.
Les figures 3A, 3B et 3C sont des graphes montrant l'activité d'accélération de la dissociation de la C3 convertase pour les fragments de facteur H ayant la plus forte productivité.
Exemples:
Exemple 1: construction des fragments N-ter et C-ter du Facteur H dans le plasmide pCEP4 Le but est de sous cloner sous différentes formes les fragments N-terminal et C-terminal du variant Y402 du facteur H dans une version optimisée dans le vecteur d'expression pCEP4.
Les fragments seront complétés tous deux en 5' d'un site NotI, de la séquence de kozak et d'un peptide signal, et en 3' d'un His-TAG suivi du site BamHI, la différence se fera par un site NheI situé en 3' pour les fragments N-ter et en 5' pour les fragments C-ter. Des schémas explicatifs seront décrits dans le protocole ci-dessous.
I/ Construction des vecteurs pCEP4-N-ter 1/ Construction des fragments N-ter Les fragments N-ter sont construits par PCR à partir du vecteur pCDNA2001neo-MD3Y. Ce vecteur correspond au vecteur pCDNA200 lneo contenant l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO:90 qui est une séquence optimisée codant le variant Y402 du facteur H
comprenant un peptide signal artificiel PS-MB7. La stratégie de construction est représentée sur la figure 1.
Les amorces utilisées sont les suivantes:
amorce sens:
Pl-NT-FCTH 5'-CTCTAGCGGCCGCGCGCCACC-3' (SEQ ID NO:91) (les nucléotides 6 à 13 de cette séquence définissent un site de restriction NotI) amorces antisens (ou amorces P2-NT-X):
Chacune de ces amorces contient, dans cet ordre de 5' vers 3': un site BamHI, 2 codons stop, une étiquette hexahistidine, un linker (GS), un site NheI et une séquence spécifique au facteur H. Ces éléments sont représentés sur la figure 1.
P2-NT-4 (SEQ ID NO:92) CTCTAGGATCCTTATCAATGGTGGTGATGGTGGTGGCTGCCGCTAGCGCCAGATT
TTTCCTCGCAGGAAGGCAG 75pb P2-NT-7 (SEQ ID NO:93) CTCTAGGATCCTTATCAATGGTGGTGATGGTGGTGGCTGCCGCTAGCGCCAGTTTT
CACGCGGATGCACCTTG 74pb P2-NT-8 (SEQ ID NO:94) CTCTAGGATCCTTATCAATGGTGGTGATGGTGGTGGCTGCCGCTAGCGCCAGACT
TGATGCAGGTAGGCTGG 73pb P2-NT-9 (SEQ ID NO:95) CTCTAGGATCCTTATCAATGGTGGTGATGGTGGTGGCTGCCGCTAGCGCCTTCCC
GCTCATAGCAGATGGGCAG 75pb P2-NT-10 (SEQ ID NO:96) CTCTAGGATCCTTATCAATGGTGGTGATGGTGGTGGCTGCCGCTAGCGCCGCTCT
GCACCTGCTCCTTGCAAATAG 77pb P2-NT-11 (SEQ ID NO:97) CTCTAGGATCCTTATCAATGGTGGTGATGGTGGTGGCTGCCGCTAGCGCCGGTGG
ATTCCTCGACGATGCAC 73pb P2-NT-12 (SEQ ID NO:98) CTCTAGGATCCTTATCAATGGTGGTGATGGTGGTGGCTGCCGCTAGCGCCTTTCTT
CAGTTTGTCAATGGCGAC 75pb P2-NT-13 (SEQ ID NO:99) CTCTAGGATCCTTATCAATGGTGGTGATGGTGGTGGCTGCCGCTAGCGCCCAGCT
GGATCTGTGCCATAGAGCAG 76pb Cette série d'amorce P2-NT-X (X, variable) est obtenue par PCR d'assemblage.
= PCR d'assemblage entre l'amorce P2NT et les amorces P2-X (X, variable) ci-dessous :
Elle est réalisée au moyen des amorces suivantes:
1-P2NT (SEQ ID NO:100) CTCTAGGATCCTTATCAATGGTGGTGATGGTGGTGGCTGCCGCTAGC
2-P2-4 (SEQ ID NO:101) CTGCCTTCCTGCGAGGAAAAATCTGGCGCTAGCGGCAGCCAC
2-P2-7 (SEQ ID NO:102) CAAGGTGCATCCGCGTGAAAACTGGCGCTAGCGGCAGCCAC
2-P2-8 (SEQ ID NO:103) CCAGCCTACCTGCATCAAGTCTGGCGCTAGCGGCAGCCAC
2-P2-9 (SEQ ID NO:104) CTGCCCATCTGCTATGAGCGGGAAGGCGCTAGCGGCAGCCAC
2-P2-10 (SEQ ID NO:105) TATTTGCAAGGAGCAGGTGCAGAGCGGCGCTAGCGGCAGCCAC
2-P2-11 (SEQ ID NO:106) GTGCATCGTCGAGGAATCCACCGGCGCTAGCGGCAGCCAC
2-P2-12 (SEQ ID NO:107) GTCGCCATTGACAAACTGAAGAAAGGCGCTAGCGGCAGCCAC
2-P2-13 (SEQ ID NO:108) CTGCTCTATGGCACAGATCCAGCTGGGCGCTAGCGGCAGCCAC
Amplification des fragments d'intérêt :
Amorce Amorce fragment matrice Taille de sens anti-sens d'intérêt l'amplicon(pb) Pl-NT-FCTH P2-NT-4 Nter 1-4 pCDNA2001neo-MD3Y 865 Pl-NT-FCTH P2-NT-7 Nter 1-7 pCDNA2001neo-MD3Y
Pl-NT-FCTH P2-NT-8 Nter 1-8 pCDNA2001neo-MD3Y
Pl-NT-FCTH P2-NT-9 Nter 1-9 pCDNA2001neo-MD3Y
Pl-NT-FCTH P2-NT-10 Nter 1-10 pCDNA2001neo-MD3Y
Pl-NT-FCTH P2-NT-11 Nter 1-11 pCDNA2001neo-MD3Y
Pl-NT-FCTH P2-NT-12 Nter 1-12 pCDNA2001neo-MD3Y
Pl-NT-FCTH P2-NT-13 Nter 1-13 pCDNA2001neo-MD3Y 2473 2/ Construction des vecteurs = Digestion NotI/BamHI des Inserts :
Inserts Taille (pb) Nter 1-4 850 Nter 1-7 1393 Nter 1-8 1552 Nter 1-9 1732 Nter 1-10 1915 Nter 1-11 2098 Nter 1-12 2284 Nter 1-13 2458 = Digestion NotI/BamHI du vecteur pCEP4 :
¨> Obtention de 2 fragments 24 et 10162pb Nucléospin extract II (Clontech) = Ligation et transformation de bactéries TOP10 = Screening par PCR : CMV1/MD2-1Rev ¨> Obtention d'un amplicon de 594pb amorces CMV1 - SEQ ID NO: 109: 5'-CCATTGACGTCAATGGGAGTTTG-3' MD2-lrev - SEQ ID NO: 110: 5'-tgtcacactcgcggtagttg-3' 3/ Séquençage On utilise les amorces CMV1 et SV40-3'UTR pour le séquençage de tous les vecteurs. Seul les vecteurs pCEP4-1NTer11, pCEP4-1NTer12 et pCEP4-1NTer13 ont un séquençage supplémentaire avec l'amorce MD2-3.
Amorce 5V40-3'UTR ¨ SEQ ID NO: 111: 5'-TTCACTGCATTCTAGTTGTGGT-3' II/ Construction des vecteurs pCEP4-C-ter 1/ Construction des fragments C-ter Les fragments C-ter sont construits par PCR à partir du vecteur pCDNA2001neo-MD3Y. Ce vecteur correspond au vecteur pCDNA2001neo contenant l'acide nucléique représenté par la séquence SEQ ID NO:90. La stratégie de construction est représentée sur la figure 2.
Les amorces utilisées sont les suivantes:
amorces sens (ou amorces Pl-CT-X):
Chacune de ces amorces contient, dans cet ordre de 5' vers 3': un site NotI, une séquence de Kozack (SK), un peptide signal (PS), un site NheI et une séquence spécifique au facteur H.
Ces éléments sont représentés sur la figure 2.
Pl-CT-19 (SEQ ID NO:112) CTCTAGCGGCCGCGCGCCACCATGCGATGGTCTTGGATTTTTCTGCTGCTGCTGTC
TATCACTTCTGCTAACGCTGCTAGCGGCTGTGGACCCCCTCCACCCATC
Pl-CT-16 (SEQ ID NO:113) CTCTAGCGGCCGCGCGCCACCATGCGATGGTCTTGGATTTTTCTGCTGCTGCTGTC
TATCACTTCTGCTAACGCTGCTAGCGGCTGTAAGAGTCCTCCAGAGATTTCACA
P1-CT-15 (SEQ ID NO:114) CTCTAGCGGCCGCGCGCCACCATGCGATGGTCTTGGATTTTTCTGCTGCTGCTGTC
TATCACTTCTGCTAACGCTGCTAGCGGCTGTAGCCAGCCCCCTCAGATC
Pl-CT-14 (SEQ ID NO:115) CTCTAGCGGCCGCGCGCCACCATGCGATGGTCTTGGATTTTTCTGCTGCTGCTGTC
TATCACTTCTGCTAACGCTGCTAGCGGCTGCCCACCACCTCCACAGATTC
P1-CT-13 (SEQ ID NO:116) CTCTAGCGGCCGCGCGCCACCATGCGATGGTCTTGGATTTTTCTGCTGCTGCTGTC
TATCACTTCTGCTAACGCTGCTAGCGGCTGCAAGTCCTCTAATCTGATCATTC
Pl-CT-12 (SEQ ID NO:117) CTCTAGCGGCCGCGCGCCACCATGCGATGGTCTTGGATTTTTCTGCTGCTGCTGTC
TATCACTTCTGCTAACGCTGCTAGCGGCTGTGGCGATATTCCAGAACTGG
P1-CT-11 (SEQ ID NO:118) CTCTAGCGGCCGCGCGCCACCATGCGATGGTCTTGGATTTTTCTGCTGCTGCTGTC
TATCACTTCTGCTAACGCTGCTAGCGGCTGTGGACCACCTCCAGAACTGC
P1-CT-10 (SEQ ID NO:119) CTCTAGCGGCCGCGCGCCACCATGCGATGGTCTTGGATTTTTCTGCTGCTGCTGTC
TATCACTTCTGCTAACGCTGCTAGCGGCTGTGAGCTGCCAAAAATTGATG
P1-CT-9 (SEQ ID NO:120) CTCTAGCGGCCGCGCGCCACCATGCGATGGTCTTGGATTTTTCTGCTGCTGCTGTC
TATCACTTCTGCTAACGCTGCTAGCGGCTGTGACATTCCAGTGTTTATGAACG
P1-CT-8 (SEQ ID NO:121) CTCTAGCGGCCGCGCGCCACCATGCGATGGTCTTGGATTTTTCTGCTGCTGCTGTC
TATCACTTCTGCTAACGCTGCTAGCGGCTGTTCTAAGAGCAGCATCGACATTG
amorce antisens (P2-CT-FCTH) Cette amorce contient, dans l'orientation 5' vers 3': un site BamHI, 2 codons stop, une étiquette hexahistidine, un linker (GGSG) et une séquence spécifique du Facteur H
P2-CT-FCTH (SEQ ID NO:122) GAGTAGGATCCTTATCAATGGTGGTGATGGTGGTGGCCGCTTCCGCCTCTCTTAG
CACAAGTAGGGTATTCCAG 74pb La série d'amorce Pl-CT-X (X, variable) et l'amorce P2-CT-FCTH sont obtenues par PCR
d'assemblage.
= PCR d'assemblage pour l'obtention des amorces:
amorces utilisées pour l'obtention de l'amorce P2-CT-FCTH
1-P2-CT-FCTH-for (SEQ ID NO:123) GAGTAGGATCCTTATCAATGGTGGTGATGGTGGTGGCCGCTTCCG
2-P2-CT-FCTH-rev (SEQ ID NO:124) CTGGAATACCCTACTTGTGCTAAGAGAGGCGGAAGCGGCCACCAC
amorces utilisées pour l'obtention des amorces Pl-CT-X
PCR1 :
1-P1-CT-FCTH1 (SEQ ID NO:125) CTCTAGCGGCCGCGCGCCACCATGCGATGGTCTTG
1-P1-CT-FCTH2 (SEQ ID NO:126) CGTTAGCAGAAGTGATAGACAGCAGCAGCAGAAAAATCCAAGACCATCGCATG
Fragment PCR1: P1-CT-FCTH-PCR1 (SEQ ID NO:127) CTCTAGCGGCCGCGCGCCACCATGCGATGGTCTTGGATTTTTCTGCTGCTGCTGTC
amorce amorce Taille des dimères sens anti-sens Dimère crée (pb) 1-Pl-CT-FCTH1 1-Pl-CT-FCTH2 Pl-CT-FCTH-Pcr1 73 PCR2 :
2-P1-CT-19 (SEQ ID NO:128) GATGGGTGGAGGGGGTCCACAGCCGCTAGCAGCGTTAGCAGAAGTGA
2-P1-CT-16 (SEQ ID NO:129) TGTGAAATCTCTGGAGGACTCTTACAGCCGCTAGCAGCGTTAGCAGAAGTGA
2-P1-CT-15 (SEQ ID NO:130) GATCTGAGGGGGCTGGCTACAGCCGCTAGCAGCGTTAGCAGAAGTGA
2-P1-CT-14 (SEQ ID NO:131) GAATCTGTGGAGGTGGTGGGCAGCCGCTAGCAGCGTTAGCAGAAGTGA
2-P1-CT-13 (SEQ ID NO:132) GAATGATCAGATTAGAGGACTTGCAGCCGCTAGCAGCGTTAGCAGAAGTGA
2-P1-CT-12 (SEQ ID NO:133) CCAGTTCTGGAATATCGCCACAGCCGCTAGCAGCGTTAGCAGAAGTGA
2-P1-CT-11 (SEQ ID NO:134) GCAGTTCTGGAGGTGGTCCACAGCCGCTAGCAGCGTTAGCAGAAGTGA
2-P1-CT-10 (SEQ ID NO:135) CATCAATTTTTGGCAGCTCACAGCCGCTAGCAGCGTTAGCAGAAGTGA
2-P1-CT-9 (SEQ ID NO:136) CGTTCATAAACACTGGAATGTCACAGCCGCTAGCAGCGTTAGCAGAAGTGA
2-P1-CT-8 (SEQ ID NO:137) CAATGTCGATGCTGCTCTTAGAACAGCCGCTAGCAGCGTTAGCAGAAGTGA
fragment Amorce Taille des anti-sens Dimère crée dimères (pb) Pl-CT-FCTH-Pcrl 2-P1-CT-19 P1-CT-19 106 Pl-CT-FCTH-Pcrl 2-P1-CT-16 P1-CT-16 111 Pl-CT-FCTH-Pcrl 2-P1-CT-15 P1-CT-15 106 Pl-CT-FCTH-Pcrl 2-P1-CT-14 P1-CT-14 107 Pl-CT-FCTH-Pcrl 2-P1-CT-13 P1-CT-13 110 Pl-CT-FCTH-Pcrl 2-P1-CT-12 P1-CT-12 107 Pl-CT-FCTH-Pcrl 2-P 1-CT-11 Pl-CT-11 107 Pl-CT-FCTH-Pcrl 2-P1-CT-10 P1-CT-10 107 Pl-CT-FCTH-Pcrl 2-P1-CT-9 P1-CT-9 110 Pl-CT-FCTH-Pcrl 2-P1-CT-8 P1-CT-8 110 = Amplification des fragments d'intérêt :
Primers Primers fragment matrice Taille de sens anti-sens d'intérêt l'amplicon(pb) P1-CT-19 P2-CT-FCTH Cter 19-20 pCDNA2001neo-MD3Y 500 P1-CT-16 P2-CT-FCTH Cter 16-20 pCDNA2001neo-MD3Y
P1-CT-15 P2-CT-FCTH Cter 15-20 pCDNA2001neo-MD3Y
P1-CT-14 P2-CT-FCTH Cter 14-20 pCDNA2001neo-MD3Y
P1-CT-13 P2-CT-FCTH Cter 13-20 pCDNA2001neo-MD3Y
P1-CT-12 P2-CT-FCTH Cter 12-20 pCDNA2001neo-MD3Y
Pl-CT-11 P2-CT-FCTH Cter 11-20 pCDNA2001neo-MD3Y
P1-CT-10 P2-CT-FCTH Cter 10-20 pCDNA2001neo-MD3Y
P1-CT-9 P2-CT-FCTH Cter 9-20 pCDNA2001neo-MD3Y
P1-CT-8 P2-CT-FCTH Cter 8-20 pCDNA2001neo-MD3Y
2/ Construction des vecteurs = Digestion NotI/BamHI des Inserts :
Inserts Taille (pb) Cter 19-20 483 Cter 16-20 1017 Cter 15-20 1200 Cter 14-20 1377 Cter 13-20 1551 Cter 12-20 1737 Cter 11-20 1920 Cter 10-20 2110 Cter 9-20 2283 Cter 8-20 2466 = Digestion NotI/BamHI du vecteur pCEP4 :
¨> Obtention de 2 fragments 24 et 10162pb Nucléospin extract II
= Ligation et transformation de bactéries TOP10 = Screening par PCR : CMV1/P2-MB7 ¨> Obtention d'un amplicon de 259pb Seq P2-MB7 ¨ SEQ ID NO :138 : 5'-TGGTGATGCTCAGCAGCAGCAGGAAGATCCAGCTCCATCG-3' 3/ Séquençage On utilise les amorces CMV1 et SV40-3'UTR pour le séquençage de tous les vecteurs. Seul les vecteurs pCEP4-9Cter20 et pCEP4-8Cter20 auront un séquençage supplémentaire avec l'amorce MD2-5.
Seq MD2-5 ¨ SEQ ID NO: 139: 5'- GGATTCACACCGTGTGCATTAATG-3' Exemple 2: Construction des vecteurs Facteur H combinant les domaines N-ter et C-ter A partir des 8 vecteurs pCEP4-1NTX et des 10 vecteurs pCEP4-XCT20 nous réalisons la construction de 59 vecteurs combinant les fragments N-ter et C-ter, contenant à minima obligatoirement les domaines SCR1-4 N-terminaux et les domaines SCR19-20 C-terminaux auxquels sont ajoutés un nombre variable des domaines SCRs dans la partie centrale de la molécule.
Dans un premier temps, nous introduisons les fragments 1NTX, présent dans le plasmide pCEP4 dans le vecteur pCDNA2001neo (par digestion NotI/BamHI).
Dans un second temps, nous introduisons dans les vecteurs pCDNA2001neo-1NTX
les fragments XCT20 (par digestion NheI/BamHI).
Nous obtenons ainsi 59 constructions plasmidiques qui correspondent aux 59 combinaisons 1NTX-XCT20 des fragments FH. Ces séquences sont présentes dans le vecteur pCDNA2001neo qui permet une expression stable de ces molécules dans la lignée cellulaire PERC6. Pour faciliter le travail de criblage et de production, les 59 fragments FH 1NTX-XCT20 sont extraits du vecteur pCDNA2001neo par digestion NotI/BamHI et clonés dans le vecteur pCEP4 qui permet une expression transitoire dans les cellules HEK293F.
I/ Construction des vecteurs pCDNA2001neo-N-Ter à partir des vecteurs pCEP4-N-ter :
= Digestion des vecteurs pCEP4-1NT X par Not I/BamHI :
Purification sur gel du fragment d'intérêt suivi d'un Nucléospin extract II.
= Digestion du vecteur pCDNA2001neo par Not I/BamHI.
Nucléospin extract II.
= Ligation et transformation TOP10.
= Criblage par PCR : CMV1/MD2-1REV Obtention d'un fragment à 706 pb.
= Contrôle par digestion NotI/BamHI : vérification de la présence de l'insert.
II/ Construction des vecteurs pCDNA2001neo-1NTX / XCT20 pour une production dans la lignée cellulaire PERC6:
Fragment Fragment Fragment Fragment Nter Cter Nter Cter = Digestion des vecteurs pCEP4-XCT20 par NheI / BamHI :
- pCEP4-19CT20 414 pb - pCEP4-16CT20 948 pb - pCEP4-15CT20 1131 pb - pCEP4-14CT20 1308 pb - pCEP4-13CT20 1482 pb - pCEP4-12CT20 1668 pb - pCEP4-11CT20 1851 pb - pCEP4-10CT20 2034 pb - pCEP4-9CT20 2214 pb - pCEP4-8CT20 2397 pb Purification sur gel du fragment d'intérêt suivi d'un Nucléospin extract II.
= Digestion du vecteur pCDNA2001neo-1NTX par Nhe I/BamHI.
Nucléospin extract II.
= Ligation et transformation TOP10.
= Criblage par PCR : MD2-6 / 2BGHPA Obtention d'un fragment à 373 pb.
Digestion de contrôle NotI/BamHI et NheI/BamHI.
Seq MD2-6 ¨ SEQ ID NO :140 : 5'-AGGGAAACAAGCGCATCACCT-3' Seq 2BGHPA ¨ SEQ ID NO :141: 5'-CAGATGGCTGGCAACTAGAA-3' Les fragments 1NTX/XCT20 sont ensuite extraits par digestion NotI / BamHI et réintroduits dans le vecteur pCEP4.
III/ Construction des vecteurs pCEP4-1NTX / XCT20 pour une production dans la lignée cellulaire HEK 293 Freestyle :
= Digestion du vecteur pCEP4 par NotI / BamHI (10162 et 24pb) Nucléospin extract II.
= Digestion des vecteurs pCDNA2001neo-1NTX/XCT20 par NotI / BamHI (Taille des fragments dans le tableau ci-dessous.) Purification sur gel Nucléospin extract II.
Taille Taille Vecteur digéré (NotI/BamHI) insert Vecteur digéré (NotI/BamHI) insert (pb) (pb) pCDNA200 lneo-1NT4/19CT20 1216 pCDNA200 lneo-1NT9/19CT20 2134 pCDNA200 lneo-1NT4/16CT20 1762 pCDNA200 lneo-1NT9/16CT20 2668 pCDNA200 lneo-1NT4/15CT20 1945 pCDNA200 lneo-1NT9/15CT20 2851 pCDNA200 lneo-1NT4/14CT20 2122 pCDNA200 lneo-1NT9/14CT20 3028 pCDNA200 lneo-1NT4/13CT20 2296 pCDNA200 lneo-1NT9/13CT20 3202 pCDNA200 lneo-1NT4/12CT20 2482 pCDNA200 lneo-1NT9/12CT20 3388 pCDNA200 lneo-1NT4/11CT20 2665 pCDNA200 lneo-1NT9/11CT20 3571 pCDNA200 lneo-1NT4/10CT20 2848 pCDNA200 lneo-1NT9/10CT20 3754 pCDNA200 lneo-1NT4/ 9CT20 3028 pCDNA200 lneo-1NT10/19CT20 2317 pCDNA2001neo-1NT4/ 8CT20 3211 pCDNA2001neo-1NT10/16CT20 2851 pCDNA200 lneo-1NT7/19CT20 1771 pCDNA200 lneo-1NT10/15CT20 3034 pCDNA200 lneo-1NT7/16CT20 2305 pCDNA200 lneo-1NT10/14CT20 3211 pCDNA2001neo-1NT7/15CT20 2488 pCDNA2001neo-1NT10/13CT20 3385 pCDNA200 lneo-1NT7/14CT20 2665 pCDNA200 lneo-1NT10/12CT20 3571 pCDNA2001neo-1NT7/13CT20 2839 pCDNA2001neo-1NT10/11CT20 3754 pCDNA200 lneo-1NT7/12CT20 3025 pCDNA200 lneo-1NT11/19CT20 2500 pCDNA2001neo-1NT7/11CT20 3208 pCDNA2001neo-1NT11/16CT20 3034 pCDNA2001neo-1NT7/10CT20 3391 pCDNA2001neo-1NT11/15CT20 3217 pCDNA2001neo-1NT7/ 9CT20 3571 pCDNA2001neo-1NT11/14CT20 3394 pCDNA2001neo-1NT7/ 8CT20 3754 pCDNA2001neo-1NT11/13CT20 3568 pCDNA2001neo-1NT8/19CT20 1954 pCDNA2001neo-1NT11/12CT20 3754 pCDNA200 lneo-1NT8/16CT20 2488 pCDNA200 lneo-1NT12/19CT20 2686 pCDNA200 lneo-1NT8/15CT20 2671 pCDNA200 lneo-1NT12/16CT20 3220 pCDNA200 lneo-1NT8/14CT20 2848 pCDNA200 lneo-1NT12/15CT20 3403 pCDNA2001neo-1NT8/13CT20 3022 pCDNA2001neo-1NT12/14CT20 3580 pCDNA2001neo-1NT8/12CT20 3208 pCDNA2001neo-1NT12/13CT20 3754 pCDNA2001neo-1NT8/11CT20 3391 pCDNA2001neo-1NT13/19CT20 2860 pCDNA200 lneo-1NT8/10CT20 3574 pCDNA200 lneo-1NT13/16CT20 3394 pCDNA2001neo-1NT8/ 9CT20 3754 pCDNA2001neo-1NT13/15CT20 3577 pCDNA2001neo-1NT13/14CT20 3754 = Ligation et transformation TOP10.
= Criblage par PCR : CMV1 / MD2-1REV Obtention d'un fragment à 594 pb.
= Séquençage des jonctions par CMV1 et SV40-3'UTR.
Exemple 3: Détermination de la concentration et de la masse moléculaire des fragments FH présents dans les surnageants des cellules HEK 293F après 7 jours de production en mode batch.
3.1: Transfection transitoire dans les cellules HEK 293F pour production transitoire des fragments FH recombinant.
1 -Transfection transitoire :
La veille de la transfection transitoire, les cellules HEK 293F sont repiquées à une concentration cellulaire de 7E5 vc/ml. La densité cellulaire et la viabilité
des cellules HEK
293F sont déterminées le jour de la transfection. Le volume de culture correspondant à 30E6 cv/ml est centrifugé. Le surnageant est éliminé et le culot de cellules est repris dans 28 ml de milieu de culture F17 (Invitrogen), transféré dans un erlen de 250 ml et incubé à 37 C.
2-Formation du complexe agent de transfection / ADN en rapport 2:1:
L'agent de transfection et l'ADN correspondant au vecteur pCEP4 contenant une des séquences des fragments FH sont préparés dans du milieu OptiMEM (Invitrogen) de la façon suivante:
- Ajout de 30ug d'ADN dans 1 ml d'OptiMEM
- Ajout de 60 iul de Fectine ou 60 iul de PEI dans 1 ml d'OptiMEM.
Ces deux préparations sont incubées séparément pendant 5 minutes à température ambiante puis la solution contenant l'agent de transfection est ajoutée délicatement à
celle contenant l'ADN. Le mélange est incubé pendant 25 minutes à température ambiante avant d'être ajouté
au 28 ml de cellules HEK 293F préalablement préparées. Les cellules sont alors incubées à
37 C sous agitation à 125 rpm.
3-Production transitoire de facteur H:
Les cellules sont maintenues en culture durant 7 jours sans ajout ou renouvellement de milieu de culture. Le 7' jour, les cellules sont centrifugées à 3000g pendant 15 minutes. Les culots cellulaires sont éliminés et les surnageant cellulaires contenant les fragments FH
recombinants sont filtrés en 0.22 ium puis congelés à -20 C.
3.2 : Dosage des fragments FH humain dans le milieu de culture par ELISA
Anticorps de coating : immunoglobuline de mouton anti-Facteur H humain (The Binding Site) diluée extemporanément dans un tampon PBS pH 7,4 pour obtenir une concentration comprise entre 3,5 et 5,5 iLtg/ml.
Tampon de saturation: PBS - BSA 1 % (p/vol) Tampon de lavage: PBS ¨ Tween-20 0,1 % (vol/vol) Tampon de dilution: Tampon PBS ¨ Tween-20 0,1 % (vol/vol) - BSA 0,1 % (p/vol) Solution standard: Calibrateur Facteur H humain NL (The Binding Site) Echantillons : les échantillons sont prédilués de façon à obtenir une concentration proche de celle du premier point de gamme. Puis diluer de 1/2 en 1/2.
Anticorps monoclonal anti Facteur H: Immunoglobulines monoclonales de souris purifiées anti-Facteur H humain (SEROTEC) Anticorps de révélation: Immunoglobulines de chèvre anti-IgG de souris marquées à la peroxydase (Jackson Immuno Research Laboratories).
Solution de révélation: TMB Kit (Pierce) Solution d'arrêt: Acide sulfurique 4 N ou 2 M (Fisher Scientific).
MODE OPERATOIRE
Sensibilisation de la phase solide :
Dans une plaque de microtitration, on distribue 100 pl par puits d'anticorps de coating dilué.
La plaque est ensuite recouverte d'une feuille adhésive puis incubée une nuit à + 4 C. La plaque est ensuite vidée par retournement.
Saturation de la phase solide :
On distribue 120 pl par puits de solution de saturation. La plaque est ensuite recouverte d'une feuille adhésive puis incubée 1 heure à 20 C. On procède ensuite à 3 lavages avec du tampon de lavage.
Capture de l'antigène :
On distribue 100 pl par puits de tampon de dilution (blanc), de chaque dilution du standard et des échantillons. La plaque est ensuite recouverte d'une feuille adhésive puis incubée 1 heure 30 minutes à 20 C. On lave ensuite 5 fois en tampon de lavage.
Reconnaissance de l'antigène par l'anticorps monoclonal :
100 pl de l'anticorps monoclonal sont distribués dans chaque puits. La plaque est recouverte d'une feuille adhésive puis incubée incubée 1 heure 30 minutes à 20 C. On lave ensuite 5 fois en tampon de lavage.
Marquage par le conjugué HRP (HorseRadish Peroxidase en anglais, ou peroxydase de raifort) :
100 pl de l'anticorps de révélation sont distribués, la plaque est recouverte d'une feuille adhésive, puis incubée 1 heure à 20 C. Les puits sont lavés 5 fois en tampon de lavage.
Réaction enzymatique :
On distribue 100 pl par puits de TMB contenant le substrat à intervalle de temps régulier et loin de toute lumière intense. Puis on incube à température ambiante entre 5 ¨
15 minutes. Ce temps doit être identique pour tous les points de dosage.
Arrêt de la réaction :
On distribue 100 pl d'H2SO4 4N par puits à intervalle de temps régulier.
Les résultats sont rapportés dans le tableau suivant.
Dosage ELISA
(mode batch 7 Masse jours) moléculaire Fragment FH mg/L (Dallons) 1NT4- 19CT20 67 43442.8 1NT4- 16CT20 46 63288.2 1NT4- 15CT20 29 69983.5 1NT4- 14CT20 15 76680.1 1NT4- 11CT20 10 97371.7 1NT4- 1OCT20 22 104213.6 1NT4- 9CT20 13 111090.2 1NT4- 8CT20 15 117650.5 1NT7- 19CT20 10 64198.2 1NT7- 16CT20 76 84043.6 1NT7- 15CT20 132 90738.9 1NT7- 14CT20 177 97435.5 1NT7- 13CT20 27 104274.3 1NT7- 12CT20 42 111244.2 1NT7- 11CT20 154 118127.1 1NT7- 1OCT20 157 124969.1 1NT7- 9CT20 161 131845.6 1NT7- 8CT20 224 138405.9 1NT8- 19CT20 7 70758.5 1NT8- 16CT20 47 90603.9 1NT8- 15CT20 124 97299.2 1NT8- 14 CT20 339 103969.8 1NT8- 13 CT20 48 110808.6 1NT8- 12 CT20 13 117804.6 1NT8- 11 CT20 115 124687.4 1NT8- 10 CT20 128 131529.4 1NT8- 9 CT20 80 138405.9 1NT9-19 CT20 5 77635.1 1NT9-16 CT20 8 97480.4 1NT9-15 CT20 43 104175.7 1NT9-14 CT20 91 110872.3 1NT9-13 CT20 25 117711.2 1NT9-12 CT20 25 124655.0 1NT9-11 CT20 45 131537.9 1NT9-10 CT20 156 138405.9 1NT10- 19CT20 5 84451.0 1NT10- 15CT20 13 110991.7 1NT10- 14CT20 21 117688.3 1NT10- 11CT20 128 138379.9 1NT11-19CT20 9 91333.8 1NT11- 16CT20 22 111179.2 1NT11- 15CT20 16 117874.5 1NT11-14CT20 36 124571.1 1NT13- 14CT20 13 138379.9 Exemple 4: Caractérisation par SDS-PAGE des fragments FH recombinants présents dans le surnageant de culture (figures 6A, 6B et 7).
A partir de la valeur de la concentration des fragments FH recombinants déterminée par ELISA, un volume correspondant à litg de facteur H recombinant est dilué
au 1/2 dans du tampon Laemmli 2x, chauffé à 95 C pendant 5 minutes puis déposé sur un gel linéaire de
10% polyacrylamide. Après migration, les protéines contenues dans le gel sont colorées au bleu de Coomassie.
L'analyse des gels de polyacrylamide montrent que les fragments FH
recombinants migrent selon les masses moléculaires apparentes attendues.
Exemple 5 : Détermination de l'activité d'accélération de la dissociation de la C3 convertase des fragments FH recombinants présents dans le surnageant de culture et ayant la plus forte productivité :
A partir de la concentration de facteur H recombinant déterminée par ELISA, les fragments FH recombinants sont dilués à une concentration finale de 20 iLtg/ml. A partir de ce tube une gamme est réalisée par les dilutions successives suivantes: 1/2; 1/10; 1/4;
1/4; 1/4; 1/4; 1/40.
Cette gamme de concentration décroissante de fragments FH est ajoutée au complexe C3 convertase formé dans les puits d'une plaque 96 puits qui est alors incubée 32 à 34 minutes à
+34 C. Après plusieurs lavages, le facteur B restant complexé avec la molécule immobilisée au fond du puits est alors dosé par une réaction immuno-enzymatique de type ELISA. Les valeurs d'absorbances obtenues en fonction de la concentration de fragments FH
ajoutée sont alors traitées dans un système modélisé non linéaire (sigmoïde à
pente variable) afin de déterminer la valeur de l'IC50 de chaque échantillon. L'équation de calcul de ce modèle est la suivante :
Y : Bottom + ( Top ¨Bottom)/(1+10^((Log IC50-X)* Hillslope) X est le logarithme de la concentration (tg/ml).
Y est la réponse (D.0).
Y débute à la ligne de base (Bottom) et va au sommet (Top) selon une forme sigmoïdale. Hillslope est la pente.
L'activité déterminée dans le surnageant cellulaire est montré dans les figures 3A, 3B et 3C
pour les fragments ayant la plus forte productivité.
Exemple 6 : Détermination de l'activité d'accélération de la dissociation de la C3 convertase des fragments FH recombinants purifiés Les fragments FH ont été purifies par l'intermédiaire de l'étiquette hexahistidine qui a été
ajoutée à l'extrémité c-terminale des protéines. La purification a été
réalisée en une étape de chromatographie d'affinité en utilisant les colonnes HisTALON (Clontech) qui contiennent une résine ayant une forte affinité et spécificité pour les polyshistidines.
La purification a été
réalisée selon les recommandations du fournisseur (HisTALON Gravity Column Purification Kit User Manual).
Après purification les échantillons sont dialysées contre du tampon PBS et conservés à
4 C.
La concentration des fragments FH recombinants purifiés est déterminée par mesure de la DO
à 280nm. Les fragments FH recombinants purifiés sont dilués à une concentration finale de 150 nM puis à partir de ce tube une gamme est réalisée par les dilutions successives suivantes:
1/2; 1/10; 1/4; 1/4; 1/4; 1/4; 1/40. Cette gamme de concentration décroissante de fragments FH est ajoutée au complexe C3 convertase formé dans les puits d'une plaque 96 puits qui est alors incubée 32 à 34 minutes à +34 C. Après plusieurs lavages, le facteur B
restant complexé
avec la molécule C3 immobilisée au fond du puits est alors dosé par une réaction immuno-enzymatique de type ELISA, utilisant le TMB (3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine) ou l'OPD
(ortho-phénylène diamine) comme substrat de la réaction. Les valeurs d'absorbances obtenues en fonction de la concentration de fragments FH ajoutée sont alors traitées dans un système modélisé non linéaire (sigmoïde à pente variable) afin de déterminer la valeur de l'IC50 de chaque échantillon. L'équation de calcul de ce modèle est la suivante :
Y : Bottom + ( Top ¨Bottom)/(1+10^((Log IC50-X)* Hillslope) X est le logarithme de la concentration (tg/ml).
Y est la réponse (D.0).
Y débute à la ligne de base (Bottom) et va au sommet (Top) selon une forme sigmoïdale. Hillslope est la pente.
Les valeurs d'IC50 obtenues sont indiquées dans le tableau ci-dessous.
Activité C3 Activité C3 convertase convertase IC50 % du (tg/m1) contrôle pCEP4- 1NT4- 16CT20 0,0281 239%
pCEP4- 1NT7- 9CT20 0,2517 156%
pCEP4- 1NT7-11CT20 0,2653 134%
pCEP4- 1NT8- 10 CT20 0,3379 107%
pCEP4- 1NT7-14CT20 0,0645 104%
pCEP4- 1NT8-11CT20 0,4713 77%
pCEP4- 1NT4-19CT20 0,0916 73%
pCEP4- 1NT7- 8CT20 0,5419 72%
pCEP 4-1NT9-11 CT20 0,1716 69%
pCEP 4-1NT9-10CT20 0,5517 64%
pCEP 4-1NT9-14 CT20 0,5698 64%
pCEP4- 1NT8-14CT20 0,6454 61%
pCEP4- 1NT7-10CT20 0,6015 59%
pCEP4- 1NT10- 11CT20 0,6118 58%
pCEP4- 1NT8- 15CT20 0,6279 58%
pCEP4- 1NT4- 15CT20 0,2061 58%
pCEP 4-1NT9-13 CT20 0,1663 56%
pCEP4- 1NT7-15CT20 0,6393 56%
pCEP 4-1NT9-19 CT20 0,2166 49%
pCEP4- 1NT13- 14CT20 0,7765 45%
pCEP4- 1NT4- 8CT20 0,2276 42%
pCEP4- 1NT4- 1 OCT20 0,2439 38%
pCEP 4-1NT9-12 CT20 0,3070 30%
pCEP4- 1NT8- 13 CT20 0,4022 30%
pCEP4- 1NT8- 9 CT20 0,4886 27%
pCEP 4-1NT9-16 CT20 0,4177 25%
pCEP4- 1NT8- 16CT20 0,4264 25%
pCEP4- 1NT4- 9CT20 0,5360 18%
pCEP4- 1NT4- 11CT20 0,5458 17%
pCEP4- 1NT4- 14CT20 0,6179 15%
pCEP4- 1NT7- 16CT20 0,4418 15%
pCEP4- 1NT10- 14CT20 0,6714 14%
pCEP4- 1NT7- 19CT20 1,0900 12%
pCEP4- 1NT11- 15CT20 0,7395 10%
pCEP4- 1NT11- 16CT20 1,2120 8%
pCEP4- 1NT7- 13CT20 1,9260 7%
pCEP4- 1NT7- 12CT20 2,0350 7%
pCEP4- 1NT10- 15CT20 1,1680 6%
pCEP4- 1NT11- 14CT20 1,9900 6%
pCEP4- 1NT11- 19CT20 1,7800 5%
pCEP 4-1NT9-15 CT20 2,1880 5%
pCEP4- 1NT8- 12 CT20 1,8700 4%
pCEP4- 1NT10- 19CT20 6,0520 1%
pCEP4- 1NT8- 19CT20 493,0000 0%
L'activité d'un facteur H recombinant entier produit dans des cellules PerC6 ou HEK et purifié a été utilisée comme contrôle d'activité. L'activité C3 du facteur H
entier produit dans les cellules PerC6 est équivalente à celle du facteur H entier produit dans des cellules HEK.
Exemple 7 : Détermination de l'activité de protection de la lyse de globules rouges de mouton par test de Sanchez-Corral modifié.
Ce test permet de mesurer l'activité fonctionnelle de la partie C-terminale du facteur H
recombinant humain purifié lors du développement de lots thérapeutiques en évaluant sa capacité à protéger des globules rouges de mouton de la lyse induite par un sérum déplété ou déficient en facteur H fonctionnel. Ce test est adapté de la méthode Sanchez-Corral permettant de mesurer l'activité anti-hémolytique du facteur H présent dans le plasma de patients atteints du syndrome hémolytique urémique. (P.Sanchez-Corral, C.
Gonzàlez-Rubio, S. Rodriguez de Cordoba and M. Lopez-Trascasa. Molecular Immunology 41(2004) 81-84).
Dans ce cadre, un mélange de sérum déplété en facteur H et d'un pool plasma humain est réalisé en proportion égale afin de créer les conditions d'une lyse spécifique. L'ajout de facteur H recombinant humain purifié assure la protection des globules rouges de mouton (absence de lyse cellulaire) vis-à-vis d'une lyse induite par le complément.
Ce test a été utilisé ici pour déterminer l'activité de protection de la lyse des globules rouges des fragments de facteur H selon l'invention.
Détermination du pourcentage de lyse :
A 40 iil d'une suspension d'hématies de mouton (1x108 hématies/mi) sont ajoutés successivement 20 iil du tampon de réaction (Hepes 10 mM, NaC1 144 mM, MgC12 7 mM, EGTA 10 mM, pH 7.2), un volume variable de fragment FH ou de FH entier (0-30 1) correspondant à des concentrations de 0 à 44,74pM, puis 9 iLt1 d'un pool de plasma humain suivi de 9 iLt1 de plasma humain déplété en FH. Le volume réactionnel est complété avec du tampon PBS pour obtenir un volume final de 110 1. Après incubation 30 min à 37 C, 400 iil de tampon HBS-EDTA (Hepes 10 mM, NaC1 144 mM, EDTA 2 mM, pH 7.2) froid pour arrêter la réaction. Après centrifugation 5 min à 1730 g, 200 iil de surnageant sont prélevés, déposés dans une plaque de microtitration afin de mesurer l'absorbance à 414 nm.
Le pourcentage de lyse est déterminé selon la formule :
0041 4 'Pte réaction -0041 4,27,1 Tete Mame (_ _ _____________________________________ )x100 dei i y.wo n 414 lm itIOU ' Le témoin 100% lyse correspond à la lyse maximale des globules rouges de mouton observée en présence d'eau.
Le témoin blanc comprend le tampon de réaction + 50mM EDTA et correspond à la lyse spontanée des globules rouges de mouton.
Sans CFH, la lyse spontanée des hématies est d'environ 30%.
Dans les tableaux qui suivent, l'analyse est faite en normalisant la valeur obtenue avec le facteur H plasmatique (FH LP03 0 pm) à 100 %. Les valeurs négatives obtenues sont normalisées à la valeur de 0 %.
Témoin LP03 PerC6 HEK pCEP4- 1NT7-FH purifié (10-12mole) Lyse spécifique (%) O 100 85,4 85,4 80,6 14,58 75 49,1 42,1 1,6 21,87 49,9 10,7 2,3 4,7 29,16 21,2 0,5 0,2 0 44,74 2,9 0 0,7 0 Témoin LP03 HEK pCEP4- 1NT7-14CT20 pCEP4- 1NT7-FH purifié (10-12mole) Lyse spécifique (%) O 100 106,3 73,2 58,3 14,58 101,4 35 3,2 3,2 21,87 29,5 0 4 0 29,16 8,4 0 4,7 0 44,74 2,7 0 2,3 17,9 Témoin LP03 HEK pCEP4- 1NT7-11CT20 pCEP4- 1NT8-FH purifié (10-12mole) Lyse spécifique (%) O 100 103,7 94,8 96,9 14,58 66,8 11,1 0 21,87 7,7 2,1 1,5 29,16 3,1 0 0 1 44,74 1 2,5 3,7 1,1 0 Témoin LP03 HEK pCEP4- 1NT8-11CT20 pCEP4- 1NT7- 16CT20 FH purifié (10-12mole) Lyse spécifique (%) 0 100 110,5 89,6 94,7 14,58 63 37 64,6 21,87 17,8 0,3 31,3 29,16 0 0 20,9 44,74 8,4 0 0 0 Témoin LP03 HEK pCEP4- 1NT4-19CT20 pCEP4- 1NT4-16CT20 FH purifié (10-12mole) Lyse spécifique (%) 0 100 105,9 100,2 116õ3 14,58 37,2 2,6 0 21,87 5,7 0 3,1 29,16 0 0 0 44,74 0 0,5 0 0 pCEP 4-1NT9-Témoin LP03 HEK
FH purifié (10-12mole) Lyse spécifique (%) 0 100 117,9 94,7 14,58 25,8 42,6 21,87 0 33,4 29,16 0 21,6 44,74 3,5 0 3 Les essais montrent des résultats proches pour les échantillons rFH PERC6 (14-HFACEX-1446-042) et rFH HEK (12-HFACEX-1446-072) et cohérents avec le FH
plasmatique (témoin LP03) : effet-dose avec protection totale de l'hémolyse à
la plus forte concentration de facteur H.
Les différents fragments de facteur H selon l'invention ressortent très actifs avec une inhibition de la lyse spécifique supérieure au rFH entier dès la plus faible concentration testée.
Pour deux fragments 1NT9-16CT20 et 1NT7-16CT20 on observe de manière fort intéressante un profil plus proche du facteur H plasmatique LP03.
L'analyse des gels de polyacrylamide montrent que les fragments FH
recombinants migrent selon les masses moléculaires apparentes attendues.
Exemple 5 : Détermination de l'activité d'accélération de la dissociation de la C3 convertase des fragments FH recombinants présents dans le surnageant de culture et ayant la plus forte productivité :
A partir de la concentration de facteur H recombinant déterminée par ELISA, les fragments FH recombinants sont dilués à une concentration finale de 20 iLtg/ml. A partir de ce tube une gamme est réalisée par les dilutions successives suivantes: 1/2; 1/10; 1/4;
1/4; 1/4; 1/4; 1/40.
Cette gamme de concentration décroissante de fragments FH est ajoutée au complexe C3 convertase formé dans les puits d'une plaque 96 puits qui est alors incubée 32 à 34 minutes à
+34 C. Après plusieurs lavages, le facteur B restant complexé avec la molécule immobilisée au fond du puits est alors dosé par une réaction immuno-enzymatique de type ELISA. Les valeurs d'absorbances obtenues en fonction de la concentration de fragments FH
ajoutée sont alors traitées dans un système modélisé non linéaire (sigmoïde à
pente variable) afin de déterminer la valeur de l'IC50 de chaque échantillon. L'équation de calcul de ce modèle est la suivante :
Y : Bottom + ( Top ¨Bottom)/(1+10^((Log IC50-X)* Hillslope) X est le logarithme de la concentration (tg/ml).
Y est la réponse (D.0).
Y débute à la ligne de base (Bottom) et va au sommet (Top) selon une forme sigmoïdale. Hillslope est la pente.
L'activité déterminée dans le surnageant cellulaire est montré dans les figures 3A, 3B et 3C
pour les fragments ayant la plus forte productivité.
Exemple 6 : Détermination de l'activité d'accélération de la dissociation de la C3 convertase des fragments FH recombinants purifiés Les fragments FH ont été purifies par l'intermédiaire de l'étiquette hexahistidine qui a été
ajoutée à l'extrémité c-terminale des protéines. La purification a été
réalisée en une étape de chromatographie d'affinité en utilisant les colonnes HisTALON (Clontech) qui contiennent une résine ayant une forte affinité et spécificité pour les polyshistidines.
La purification a été
réalisée selon les recommandations du fournisseur (HisTALON Gravity Column Purification Kit User Manual).
Après purification les échantillons sont dialysées contre du tampon PBS et conservés à
4 C.
La concentration des fragments FH recombinants purifiés est déterminée par mesure de la DO
à 280nm. Les fragments FH recombinants purifiés sont dilués à une concentration finale de 150 nM puis à partir de ce tube une gamme est réalisée par les dilutions successives suivantes:
1/2; 1/10; 1/4; 1/4; 1/4; 1/4; 1/40. Cette gamme de concentration décroissante de fragments FH est ajoutée au complexe C3 convertase formé dans les puits d'une plaque 96 puits qui est alors incubée 32 à 34 minutes à +34 C. Après plusieurs lavages, le facteur B
restant complexé
avec la molécule C3 immobilisée au fond du puits est alors dosé par une réaction immuno-enzymatique de type ELISA, utilisant le TMB (3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine) ou l'OPD
(ortho-phénylène diamine) comme substrat de la réaction. Les valeurs d'absorbances obtenues en fonction de la concentration de fragments FH ajoutée sont alors traitées dans un système modélisé non linéaire (sigmoïde à pente variable) afin de déterminer la valeur de l'IC50 de chaque échantillon. L'équation de calcul de ce modèle est la suivante :
Y : Bottom + ( Top ¨Bottom)/(1+10^((Log IC50-X)* Hillslope) X est le logarithme de la concentration (tg/ml).
Y est la réponse (D.0).
Y débute à la ligne de base (Bottom) et va au sommet (Top) selon une forme sigmoïdale. Hillslope est la pente.
Les valeurs d'IC50 obtenues sont indiquées dans le tableau ci-dessous.
Activité C3 Activité C3 convertase convertase IC50 % du (tg/m1) contrôle pCEP4- 1NT4- 16CT20 0,0281 239%
pCEP4- 1NT7- 9CT20 0,2517 156%
pCEP4- 1NT7-11CT20 0,2653 134%
pCEP4- 1NT8- 10 CT20 0,3379 107%
pCEP4- 1NT7-14CT20 0,0645 104%
pCEP4- 1NT8-11CT20 0,4713 77%
pCEP4- 1NT4-19CT20 0,0916 73%
pCEP4- 1NT7- 8CT20 0,5419 72%
pCEP 4-1NT9-11 CT20 0,1716 69%
pCEP 4-1NT9-10CT20 0,5517 64%
pCEP 4-1NT9-14 CT20 0,5698 64%
pCEP4- 1NT8-14CT20 0,6454 61%
pCEP4- 1NT7-10CT20 0,6015 59%
pCEP4- 1NT10- 11CT20 0,6118 58%
pCEP4- 1NT8- 15CT20 0,6279 58%
pCEP4- 1NT4- 15CT20 0,2061 58%
pCEP 4-1NT9-13 CT20 0,1663 56%
pCEP4- 1NT7-15CT20 0,6393 56%
pCEP 4-1NT9-19 CT20 0,2166 49%
pCEP4- 1NT13- 14CT20 0,7765 45%
pCEP4- 1NT4- 8CT20 0,2276 42%
pCEP4- 1NT4- 1 OCT20 0,2439 38%
pCEP 4-1NT9-12 CT20 0,3070 30%
pCEP4- 1NT8- 13 CT20 0,4022 30%
pCEP4- 1NT8- 9 CT20 0,4886 27%
pCEP 4-1NT9-16 CT20 0,4177 25%
pCEP4- 1NT8- 16CT20 0,4264 25%
pCEP4- 1NT4- 9CT20 0,5360 18%
pCEP4- 1NT4- 11CT20 0,5458 17%
pCEP4- 1NT4- 14CT20 0,6179 15%
pCEP4- 1NT7- 16CT20 0,4418 15%
pCEP4- 1NT10- 14CT20 0,6714 14%
pCEP4- 1NT7- 19CT20 1,0900 12%
pCEP4- 1NT11- 15CT20 0,7395 10%
pCEP4- 1NT11- 16CT20 1,2120 8%
pCEP4- 1NT7- 13CT20 1,9260 7%
pCEP4- 1NT7- 12CT20 2,0350 7%
pCEP4- 1NT10- 15CT20 1,1680 6%
pCEP4- 1NT11- 14CT20 1,9900 6%
pCEP4- 1NT11- 19CT20 1,7800 5%
pCEP 4-1NT9-15 CT20 2,1880 5%
pCEP4- 1NT8- 12 CT20 1,8700 4%
pCEP4- 1NT10- 19CT20 6,0520 1%
pCEP4- 1NT8- 19CT20 493,0000 0%
L'activité d'un facteur H recombinant entier produit dans des cellules PerC6 ou HEK et purifié a été utilisée comme contrôle d'activité. L'activité C3 du facteur H
entier produit dans les cellules PerC6 est équivalente à celle du facteur H entier produit dans des cellules HEK.
Exemple 7 : Détermination de l'activité de protection de la lyse de globules rouges de mouton par test de Sanchez-Corral modifié.
Ce test permet de mesurer l'activité fonctionnelle de la partie C-terminale du facteur H
recombinant humain purifié lors du développement de lots thérapeutiques en évaluant sa capacité à protéger des globules rouges de mouton de la lyse induite par un sérum déplété ou déficient en facteur H fonctionnel. Ce test est adapté de la méthode Sanchez-Corral permettant de mesurer l'activité anti-hémolytique du facteur H présent dans le plasma de patients atteints du syndrome hémolytique urémique. (P.Sanchez-Corral, C.
Gonzàlez-Rubio, S. Rodriguez de Cordoba and M. Lopez-Trascasa. Molecular Immunology 41(2004) 81-84).
Dans ce cadre, un mélange de sérum déplété en facteur H et d'un pool plasma humain est réalisé en proportion égale afin de créer les conditions d'une lyse spécifique. L'ajout de facteur H recombinant humain purifié assure la protection des globules rouges de mouton (absence de lyse cellulaire) vis-à-vis d'une lyse induite par le complément.
Ce test a été utilisé ici pour déterminer l'activité de protection de la lyse des globules rouges des fragments de facteur H selon l'invention.
Détermination du pourcentage de lyse :
A 40 iil d'une suspension d'hématies de mouton (1x108 hématies/mi) sont ajoutés successivement 20 iil du tampon de réaction (Hepes 10 mM, NaC1 144 mM, MgC12 7 mM, EGTA 10 mM, pH 7.2), un volume variable de fragment FH ou de FH entier (0-30 1) correspondant à des concentrations de 0 à 44,74pM, puis 9 iLt1 d'un pool de plasma humain suivi de 9 iLt1 de plasma humain déplété en FH. Le volume réactionnel est complété avec du tampon PBS pour obtenir un volume final de 110 1. Après incubation 30 min à 37 C, 400 iil de tampon HBS-EDTA (Hepes 10 mM, NaC1 144 mM, EDTA 2 mM, pH 7.2) froid pour arrêter la réaction. Après centrifugation 5 min à 1730 g, 200 iil de surnageant sont prélevés, déposés dans une plaque de microtitration afin de mesurer l'absorbance à 414 nm.
Le pourcentage de lyse est déterminé selon la formule :
0041 4 'Pte réaction -0041 4,27,1 Tete Mame (_ _ _____________________________________ )x100 dei i y.wo n 414 lm itIOU ' Le témoin 100% lyse correspond à la lyse maximale des globules rouges de mouton observée en présence d'eau.
Le témoin blanc comprend le tampon de réaction + 50mM EDTA et correspond à la lyse spontanée des globules rouges de mouton.
Sans CFH, la lyse spontanée des hématies est d'environ 30%.
Dans les tableaux qui suivent, l'analyse est faite en normalisant la valeur obtenue avec le facteur H plasmatique (FH LP03 0 pm) à 100 %. Les valeurs négatives obtenues sont normalisées à la valeur de 0 %.
Témoin LP03 PerC6 HEK pCEP4- 1NT7-FH purifié (10-12mole) Lyse spécifique (%) O 100 85,4 85,4 80,6 14,58 75 49,1 42,1 1,6 21,87 49,9 10,7 2,3 4,7 29,16 21,2 0,5 0,2 0 44,74 2,9 0 0,7 0 Témoin LP03 HEK pCEP4- 1NT7-14CT20 pCEP4- 1NT7-FH purifié (10-12mole) Lyse spécifique (%) O 100 106,3 73,2 58,3 14,58 101,4 35 3,2 3,2 21,87 29,5 0 4 0 29,16 8,4 0 4,7 0 44,74 2,7 0 2,3 17,9 Témoin LP03 HEK pCEP4- 1NT7-11CT20 pCEP4- 1NT8-FH purifié (10-12mole) Lyse spécifique (%) O 100 103,7 94,8 96,9 14,58 66,8 11,1 0 21,87 7,7 2,1 1,5 29,16 3,1 0 0 1 44,74 1 2,5 3,7 1,1 0 Témoin LP03 HEK pCEP4- 1NT8-11CT20 pCEP4- 1NT7- 16CT20 FH purifié (10-12mole) Lyse spécifique (%) 0 100 110,5 89,6 94,7 14,58 63 37 64,6 21,87 17,8 0,3 31,3 29,16 0 0 20,9 44,74 8,4 0 0 0 Témoin LP03 HEK pCEP4- 1NT4-19CT20 pCEP4- 1NT4-16CT20 FH purifié (10-12mole) Lyse spécifique (%) 0 100 105,9 100,2 116õ3 14,58 37,2 2,6 0 21,87 5,7 0 3,1 29,16 0 0 0 44,74 0 0,5 0 0 pCEP 4-1NT9-Témoin LP03 HEK
FH purifié (10-12mole) Lyse spécifique (%) 0 100 117,9 94,7 14,58 25,8 42,6 21,87 0 33,4 29,16 0 21,6 44,74 3,5 0 3 Les essais montrent des résultats proches pour les échantillons rFH PERC6 (14-HFACEX-1446-042) et rFH HEK (12-HFACEX-1446-072) et cohérents avec le FH
plasmatique (témoin LP03) : effet-dose avec protection totale de l'hémolyse à
la plus forte concentration de facteur H.
Les différents fragments de facteur H selon l'invention ressortent très actifs avec une inhibition de la lyse spécifique supérieure au rFH entier dès la plus faible concentration testée.
Pour deux fragments 1NT9-16CT20 et 1NT7-16CT20 on observe de manière fort intéressante un profil plus proche du facteur H plasmatique LP03.
Claims (15)
1. Protéine recombinante possédant une activité de facteur H, comprenant, de l'extrémité N-terminale à l'extrémité C-terminale, une première séquence d'acides aminés comprenant au moins les domaines SCR1 à SCR4 du facteur H, et une deuxième séquence d'acides aminés comprenant au moins les domaines SCR19 et SCR20 du facteur H, ladite protéine recombinante n'étant pas un facteur H naturel, et sous réserve que si la première séquence est constituée des domaines SCR1 à SCR4 et la deuxième séquence est constituée des domaines SCR19 et SCR20, le linker soit un linker synthétique.
2. Protéine recombinante selon la revendication 1, première et/ou la deuxième séquence en acides aminés comprenant en outre un ou plusieurs autres domaines SCR de facteur H
réarrangés.
réarrangés.
3. Protéine recombinante selon la revendication 1 ou 2, la première et la deuxième séquence en acides aminés étant liées entre elles par un linker non naturel, notamment un linker G-A-S-G.
4. Protéine recombinante selon l'une quelconque des revendications précédentes, la première ou la deuxième séquence en acides aminés comprenant au moins les domaines SCR12, SCR13 et SCR14 du facteur H, ou la première et la second séquence en acides aminés ne comprenant aucun des domaines SCR12, SCR13 et SCR14.
5. Protéine recombinante selon l'une quelconque des revendications précédentes, la première séquence comprenant les domaines SCR1 à SCR4 du facteur H, et la deuxième séquence est choisie dans le groupe constitué :
- des domaines SCR16 à SCR20, - des domaines SCR15 à SCR20 ;
- des domaines SCR10 à SCR20 ; et - des domaines SCR8 à SCR20 du facteur H.
- des domaines SCR16 à SCR20, - des domaines SCR15 à SCR20 ;
- des domaines SCR10 à SCR20 ; et - des domaines SCR8 à SCR20 du facteur H.
6. Protéine recombinante selon l'une quelconque des revendications précédentes, la première séquence comprenant les domaines SCR1 à SCR7 du facteur H, et la deuxième séquence comprenant les domaines SCR16 à SCR20 du facteur H, ladite deuxième séquence étant de préférence choisie dans le groupe constitué :
- des domaines SCR15 à SCR20 - des domaines SCR14 à SCR20 ;
- des domaines SCR11 à SCR20 ;
- des domaines SCR10 à SCR20 ;
- des domaines SCR9 à SCR20; et - des domaines SCR8 à SCR20 du facteur H.
- des domaines SCR15 à SCR20 - des domaines SCR14 à SCR20 ;
- des domaines SCR11 à SCR20 ;
- des domaines SCR10 à SCR20 ;
- des domaines SCR9 à SCR20; et - des domaines SCR8 à SCR20 du facteur H.
7. Protéine recombinante selon l'une quelconque des revendications précédentes, la première séquence comprenant les domaines SCR1 à SCR8 du facteur H, et la deuxième séquence comprenant les domaines SCR16 à SCR20 du facteur H, ladite deuxième séquence comprenant de préférence les domaines SCR10 à SCR20 du facteur H.
8. Protéine recombinante selon l'une quelconque des revendications précédentes, la première séquence comprend les domaines SCR1 à SCR4 du facteur H et la deuxième séquence comprend les domaines SCR16 à SCR20 du facteur H, une troisième séquence comprenant le domaine SCR7 du facteur H étant comprise entre la première et la deuxième séquence.
9. Protéine recombinante selon l'une quelconque des revendications précédentes, la première séquence en acides aminés comprenant un peptide signal en position N-terminale, notamment le peptide signal naturel du facteur H (SEQ ID NO:24), le peptide signal d'une protéine différente du facteur H, ou le peptide signal PS-MB7 représenté dans la séquence SEQ ID
NO: 25.
NO: 25.
10. Protéine recombinante selon l'une quelconque des revendications précédentes, de séquence choisie parmi les séquences représentées dans SEQ ID NO:26 à 84 et 159.
11. Construction d'acide nucléique codant une protéine recombinante selon l'une quelconque des revendications 1 à 10.
12. Construction d'acide nucléique selon la revendication 11, comprenant un site de restriction unique entre les deux séquences d'acide nucléique codant la première et la deuxième séquence en acides aminés de la protéine recombinante, notamment un site Nhe I présent dans la partie codant un linker G-A-S-G.
13. Vecteur comprenant une construction d'acide nucléique selon la revendication 11 ou 12.
14. Cellule hôte comprenant la construction d'acide nucléique selon la revendication 11 ou 12, ou le vecteur selon la revendication 13.
15. Animal transgénique non humain comprenant la construction d'acide nucléique selon la revendication 11 ou 12, ou le vecteur selon la revendication 13.
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