JP2001029074A - 膜結合型ｃ１インアクチベーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】本発明は、臓器移植時の超急性拒絶反応を引き
起こす補体活性化経路を効果的に抑制することができ、
且つ移植組織を損傷する補体活性化経路の中間体の発生
を完全に阻害し得る膜結合型補体制御因子を提供するこ
とを目的とする。 【解決手段】この目的を達成するために、本発明は、水
溶性C1インアクチベーターの機能的ドメインを含有する
タンパク質と、該タンパク質の末端及び/又は内部に付
加されたアンカー分子とを具備する膜結合型C1インアク
チベーターを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、臓器、組織、又は
細胞移植時に、ドナーに対して超急性拒絶反応を引き起
こす補体活性化経路の初発反応を抑制する膜結合型補体
制御因子、該膜結合型補体制御因子をコードする核酸分
子、及び該核酸分子を担持するベクターに関する。本発
明は、このようなベクターが導入された細胞、組織、及
び臓器にも関する。さらに、本発明は、前記膜結合型補
体制御因子が遺伝子導入されたトランスジェニック動
物、とりわけトランスジェニックブタに関する。

【０００２】

【従来の技術】臓器移植は、従来の対症療法とは全く異
なる極めて有用な根治的療法であり、近年、臓器の機能
不全又は機能低下を回復するために、腎移植、角膜移
植、肝移植、及び心臓移植等の臓器移植が盛んに実施さ
れるようになっている。

【０００３】臓器移植において克服すべき最も重大な問
題は拒絶反応であり、現在最も多く実施されている臓器
移植の一つであるヒトからヒトへの腎移植においても、
例えば血液型が一致しない場合には、移植後数分以内に
超急性拒絶反応が起き、移植臓器周辺に重篤なびまん性
の血栓症が生じるという問題を有している。同種移植
（すなわちドナーとレシピエントが同一の種に属する場
合）における超急性拒絶反応は、移植片の血液型糖鎖抗
原と、レシピエント中に予め自然抗体として存在する抗
血液型抗体とからなる免疫複合体が、C1(補体第一成分)
と結合して補体活性化経路を活性化することによって引
き起こされることが明らかとなっている。また、異種移
植（すなわちドナーとレシピエントが異なる種に属する
場合）では、レシピエントには存在しない全ての物質が
異種移植抗原となり得るので、拒絶反応の問題はさらに
深刻なものとなり、多数の臓器を提供することができる
異種移植を臨床に応用する上で著しい妨げとなってい
る。

【０００４】以上のように、臓器移植において第一に解
決されなければならない課題は、移植後即時に起こる超
急性拒絶反応を抑えることであるが、前述のように超急
性拒絶反応は、補体活性化経路の活性化から生じるの
で、該経路の抑制物質を移植臓器に予め導入しておけ
ば、超急性拒絶反応は抑制されることになる。

【０００５】現在、このような考えに基づき、内在性ヒ
ト膜結合型補体制御因子であるCD46（メンブランコファ
クタープロテイン；MCP）、CD55（崩壊促進因子；DA
F）、及びCD59（HRF20）等を遺伝子導入したトランスジ
ェニックブタが数社で生産され、異種移植に供されてい
る。ここで「補体制御因子」とは、生体内で補体系活性
化経路を制御しているタンパク質であり、上述した３つ
の補体制御因子を含む殆ど全ての補体制御因子は、補体
活性を減弱させる作用を示すので、これらの因子を導入
したトランスジェニック動物の臓器を移植すれば、レシ
ピエントの補体活性化経路が抑制される。

【０００６】以下図１を参照しながら、補体活性化経路
におけるCD46、CD55、及びCD59の作用点を説明する。ま
ず、CD46の作用点は、図１で(3)が付されている反応で
あり、CD46はI因子のコファクターとしてC3b及びC4bを
不活性型に変換する作用を示す。このうち、C3bは、
第二経路のC3転換酵素（図中のYC3bBbP）の活性化、C
3転換酵素（図中YC4b2a及びYC3bBbP）のC5転換酵素（図
中YC4b2a3b）への転換、血液細胞の補体レセプターCR
1への結合など補体活性化経路で中心的役割を果たす分
子である。一方、CD55の作用点は、図１で(2)が付され
ている反応であり、CD55は古典経路中のC3転換酵素C4b2
aからのC2a^*の解離を促進するとともに、第二経路のC3
転換酵素YC3bBbPのBbの解離をも促進する。CD59の作用
点は、図１で(4)が付されている反応であり、CD59は前
二者とは異なりC3転換酵素には作用せず、補体活性化経
路の最後のステップであるC9からZC5b-9への転換を阻害
する。

【０００７】これら３つの膜結合型補体制御因子は、以
上のような作用機序で補体活性化経路の各段階を阻害す
ることができ、且つ膜結合型であるために拒絶反応部位
での密度が高く保たれるので補体活性化経路の抑制に一
定の効果を示し得る。

【０００８】しかしながら、これらの膜結合型補体制御
因子には、それぞれ以下のような問題点が存在する。

【０００９】まず、CD46は、トランスジェニック動物内
で高発現のものが得にくく、また他の２分子に比べて、
膜上での補体抑制能力が劣るという欠点を有する。

【００１０】CD59は、カスケードの終末で補体を抑制す
るため、途中のC4、C3、及びC5が活性化されC4a、C3a、
及びC5a等のアナフィラトキシンによって移植片の損傷
をもたらすことが判明している。

【００１１】また、最も期待されているCD55において
も、C4までの反応は起こるため、C4aが発生したり、移
植片にC4bが沈着するという問題を有している。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記事情に
鑑みてなされたものであり、補体活性化経路を効果的に
抑制することができ、且つ移植組織を損傷せしめる補体
活性化経路の中間体の発生を完全に阻害し得る膜結合型
補体制御因子を提供することを目的とする。

【００１３】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、本発明は、水溶性C1インアクチベーターの機能的ド
メインを含有するタンパク質と、該タンパク質の末端及
び/又は内部に付加されたアンカー分子とを具備する膜
結合型C1インアクチベーターを提供する。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明は、天然に存在する水溶性
C1インアクチベーターに、アンカー分子を付加すること
によって人為的に作出した膜結合型C1インアクチベータ
ーを提供する。

【００１５】本明細書において、「C1インアクチベータ
ー（以下C1-INHと略記する）」とは、免疫複合体中の免
疫グロブリンと結合することによって活性化されたC1の
セリンプロテアーゼ活性を阻害するタンパク質を意味す
る。「水溶性C1-INH」とは、血清中に内在するC1-INHを
意味し、「血清型C1-INH」と同義である。

【００１６】補体活性化経路におけるC1-INHの作用点
は、該経路の初発反応なので、C1-INHを用いれば、該経
路の活性化を効果的に抑制することができ、且つ該経路
の途上で発生し得る有害な中間体も一切発生しない。

【００１７】CD46及びCD55とは異なりC1-INHの種特異性
は厳格でないので、本発明の膜結合型C1-INHを作出する
ために使用する水溶性C1-INHは、臓器又は組織を移植す
べきレシピエントと同一種のものである必要はないが、
同一種又は近縁種であることが好ましい。従って、レシ
ピエントがヒトであるときには、マウスの水溶性C1-INH
を用いることもできるが、ヒトの水溶性C1-INHを使用す
ることが好ましい。ヒトの水溶性C1-INHのアミノ酸配列
（配列番号１）と塩基配列（配列番号２）及びマウスの
C1-INHのアミノ酸配列（配列番号３）及び塩基配列（配
列番号4）は、下記の配列表に記載されている。

【００１８】本明細書において「タンパク質」とは、2
以上のアミノ酸がペプチド結合によって連結されたもの
及びを意味し、単純タンパク質のみならず、例えば糖、
脂質、核酸等のアミノ酸以外の構成成分を含有する複合
タンパク質も含む。

【００１９】また、「機能的ドメイン」とは、あるタン
パク質の機能に直接的且つ不可欠な役割を担うタンパク
質中の領域を意味する。それ故、C1-INHの機能的ドメイ
ンを含有するタンパク質を作出し、ドナーの臓器又は組
織に発現させれば、補体活性化経路の抑制が達成され
る。図２に示されているように、ヒトC1-INHの活性中心
はC末端部に存在するアミノ酸配列（444位のアルギニン
と445位のトレオニン（図２に示されているCI-INHは、2
2のアミノ酸からなるシグナルペプチドが切断されたも
のなので、図２における1位は、配列番号２のC1-INHの2
3位に相当する））であり、該活性中心は、C1のサブユ
ニットであるC1s等との結合で開裂することが明らかと
なっている。該開裂によって、前記444位のアルギニン
は、C1s等のC末端側のB鎖上の活性化されたセリンと結
合する。また、101位と406位のシステイン、108位と183
位のシステインは、ジスルフィド結合を形成して、C1-I
NHの立体構造の保持に関与している。以上の構造から、
ヒトC1-INHがその機能を発揮するためには、少なくとも
101〜445位のアミノ酸配列が不可欠であり、該部分が機
能的ドメインであると推定される。同様の構造は、マウ
スのC1-INHでも保存されており、マウスのC1-INHの活性
中心のアミノ酸配列は448位のアルギニンと449位のセリ
ンであり、ヒトC1-INHの101位と406位のシステインはマ
ウスのC1-INHの106位と410位に対応し、ヒトのC1-INHの
108位と183位のシステインは113位と188位に対応してい
る。従って、ヒトのC1-INHから、ヒト以外の哺乳類のC1
-INHの機能的ドメインを推定することができる。

【００２０】水溶性C1-INHの機能的ドメインに代えて、
該機能的ドメインの１若しくは数個のアミノ酸を欠失、
置換若しくは付加させ、且つ補体活性化経路の抑制機能
を保持したアミノ酸配列を使用してもよい。なお、補体
活性化経路の抑制機能を「保持した」とは、臓器移植に
実用し得る程度の補体活性化経路の抑制機能を有してい
ることを意味するものとする。

【００２１】このような修飾は、ジスルフィド結合に
関与しているシステインに修飾を加えず、活性中心の
アミノ酸は、塩基性アミノ酸と、非荷電極性アミノ酸又
は非極性アミノ酸（好ましい非荷電極性アミノ酸は、天
然のヒト及びマウスのC1-INHの活性中心を構成するトレ
オニンとセリン、並びに同じく水酸基を有するチロシン
であり、好ましい非極性アミノ酸は、トレオニン及びセ
リンと同様の大きさを有するアラニンとグリシンであ
る）であることを要する。

【００２２】ここで、「塩基性アミノ酸」には、リシ
ン、アルギニン、及びヒスチジン、「非荷電性極性アミ
ノ酸」には、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラ
ギン、及びグルタミン、「非極性アミノ酸」には、アラ
ニン、グリシン、バリン、イソロイシン、プロリン、フ
ェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、及びシ
ステインが含まれる。

【００２３】「アンカー分子」とは、タンパク質を膜に
組み込まれた状態、すなわち膜結合型にするための分子
を意味し、主に疎水性アミノ酸残基の配列からなる膜
貫通部分、ミリスチン酸、パルミチン酸等の脂肪酸、
グリコシルホスファチジルイノシトール(以下GPIと称
する)等のリン脂質、プレニル基、ファルネシル基等
のテルペン類、直鎖及び分枝炭化水素鎖等の天然の膜
結合型タンパク質中に存在する周知の分子又はそれらの
組み合わせであり得るが、これらに限定されない。アン
カー分子として膜貫通タンパク質の膜貫通部分を用いる
場合には、補体制御因子以外の膜貫通部分、すなわちI
型〜IV型の膜貫通タンパク質に含有される膜貫通部分も
使用し得る。膜貫通タンパク質の膜貫通部分は、C1-INH
のcDNAに連結してトランスジェニックすることが可能な
ので、特に好ましいアンカー分子である。

【００２４】本発明の膜結合型C1-INHは、水溶性C1-INH
又はその機能的ドメインに、アンカー分子を付加するこ
とによって作成される。水溶性C1-INHには、合成的にア
ンカー分子を付加してもよいが、操作の容易性及び膜上
への発現効率の見地から、水溶性C1-INHの遺伝子と、ア
ンカー分子をコードするヌクレオチド配列とを具備する
遺伝子構築物を作成し、該構築物を生体内で発現させる
ことによって付加せしめることが極めて好ましい。非タ
ンパク質アンカー分子を付加する場合には、小胞体又は
細胞質においてアンカー分子を付加するシグナルとして
作用するアミノ酸配列をコードするヌクレオチドを水溶
性C1-INH遺伝子に連結すればよい。脂肪酸、テルペン
類、GPI等を付加するシグナルとして作用するアミノ酸
配列は公知である。例えば、GPIを付加するシグナルと
して作用するアミノ酸配列は公知であり、該アミノ酸配
列は小胞体において切断されて除去される。CD55のGPI
付加シグナルの核酸配列（配列番号５）及びアミノ酸配
列（配列番号６）を配列表に示す。なお、アンカー分子
は、ドナーの種と同一の種から由来したものでなくても
よい。

【００２５】効率的に膜結合型C1-INHを細胞膜上に発現
させるためには、水溶性C1-INHのN末端には、シグナル
ペプチドを結合させねばならない。

【００２６】アンカー分子をコードするヌクレオチドを
水溶性C1-INH遺伝子に連結して、移植臓器又は組織に導
入すれば、移植臓器又は組織中の細胞膜上に、アンカー
分子としてGPIを有する膜結合型C1-INHを発現させるこ
とが可能となる。

【００２７】細胞膜上で起こる補体活性化反応を阻害す
るためには、本発明の膜結合型C1-INHは、少なくともそ
の機能的ドメインが細胞外に露出するように作出すべき
であり、水溶性C1-INHのC末端又はその近傍にGPIを付加
する態様が好ましい。

【００２８】以上のように、本発明によれば、水溶性C1
インアクチベーターと同等の補体活性化経路抑制機能を
有する膜結合型C1インアクチベーターが得られる。な
お、「同等の」補体活性化経路抑制機能とは、水溶性C1
インアクチベーターのC1阻害活性の少なくとも50%以上
の活性を有し、臓器移植に実用し得る程度の補体活性化
経路の抑制機能を有していることを意味するものとす
る。

【００２９】さらに、膜結合型C1-INHをコードする核酸
分子を提供することも本発明の目的である。本明細書に
おいて、「核酸分子」には、DNA分子とRNA分子の両者が
含まれる。前述のように、アンカー分子がタンパク質で
ある場合には、膜結合型C1-INHをコードする核酸分子
は、水溶性C1-INH遺伝子と、アンカー分子をコードする
ヌクレオチドから構成される。アンカー分子が非タンパ
ク質である場合には、水溶性C1-INH遺伝子と、ドナーの
細胞中でアンカー分子を付加するシグナルとして作用す
るアミノ酸配列をコードするヌクレオチドとから構成さ
れる。

【００３０】膜結合型C1-INHをコードする核酸分子を移
植臓器又は組織中で発現させるためのベクターを提供す
ることも本発明の目的である。これらのベクターに膜結
合型C1-INHをコードする核酸分子を挿入し、マイクロイ
ンジェクション、エレクトロポレーション、及びリポフ
ェクション等の周知の方法を用いてこれを移植臓器又は
組織に導入すれば、膜結合型C1-INHをコードする核酸分
子を遺伝子導入することができる。

【００３１】本明細書において「ベクター」には、ウイ
ルスベクター及び非ウイルスベクターの両者が含まれ
る。ウイルスベクターは、レトロウイルスやアデノウイ
ルス等の感染力を有する遺伝子配列に、移植臓器又は組
織中でC1-INHをコードする核酸分子を発現させるための
配列（プロモーター配列、ポリA部分等）が連結された
ものであり得る。好ましいウイルスベクターは、レトロ
ウイルスベクターであり、該ベクターを用いた遺伝子導
入は当業者に周知である。非ウイルスベクターは、大腸
菌等の細菌中で自己複製するために必要な遺伝子配列
に、移植臓器又は組織中でC1-INHをコードする核酸分子
を発現させるための配列（プロモーター配列、ポリA部
分等）が連結されたものであり得る。

【００３２】細胞に核酸分子を導入する方法は、ベクタ
ーを用いる方法に限定されず、移植臓器の種類に応じ
て、膜結合型C1-INHをコードする核酸分子及び該核酸分
子を発現させるための配列を具備する遺伝子配列をマイ
クロインジェクションしてもよい。

【００３３】このようにして膜結合型C1-INHを導入され
たトランスジェニック動物、臓器、組織、及び細胞も本
発明の範囲に属する。膜結合型C1-INHを導入すべき動物
は任意の哺乳動物であり得るが、ヒトに移植したときに
拒絶反応が起こり難いブタ及びサルが特に好ましい。膜
結合型C1-INHを導入すべき臓器には、肺、腎臓、心臓、
肝臓、膵臓、小腸等の消化管が含まれるがこれらに限定
されない。膜結合型C1-INHを導入すべき組織には、角
膜、半月板、脳組織、皮膚、皮下組織、上皮組織、骨、
筋等の組織が含まれるがこれらに限定されない。膜結合
型C1-INHを導入すべき細胞には、上記の臓器又は組織を
構成する全ての細胞、特に膵細胞及び脳細胞に加えて、
受精卵及び胚性幹細胞が含まれるがこれらに限定されな
い。

【００３４】以下、実施例によって本発明をさらに詳細
に記載するが、本実施例が、いかなる意味においても、
特許請求の範囲に記載した本発明の範囲を限定すること
を意図するものではないことは、当業者であれば自明で
あろう。

【００３５】［実施例１］本実施例では、図３に示され
ている膜結合型C1-INHの動物細胞膜上への発現について
説明する。

【００３６】該膜結合型C1-INHは、水溶性C1-INHのN末
端及びC末端に、それぞれシグナルペプチドとCD55のGPI
部分が結合されたものである（以下C1-INH-GPIと称す
る）。また、本実施例では、C1-INH-GPI中のシグナルペ
プチドのC末端部に、さらに検出用のエピトープタグ（F
LAGタグ）を付加した形態のもの（以下FLAG-C1-INH-GPI
と称する）も作成した（図３下段参照）。

【００３７】動物細胞の細胞膜上にC1-INH-GPI及びFLAG
-C1-INH-GPIを発現させるために、本実施例では、これ
らのcDNAを作成し、チャイニーズハムスター卵巣細胞
（CHO）にはエレクトロポレーションによって、ブタ血
管内皮細胞（SEC）にはリポフェクションによって遺伝
子導入した。

【００３８】図４は、C1-INH-GPIに対するポリクローナ
ル抗体を用いて、両細胞に蛍光ラベルを付与し、フロー
サイトメーターによってC1-INH-GPIの発現を調べた結果
である。図４のパネルA及びBに示されているように、C1
-INH-GPIは、複数のCHO株の細胞膜上に安定に発現され
た（斜線部）。同様に、C1-INH-GPIは、複数のSEC株の
細胞上でも安定に発現された（図４のパネルC及びD、斜
線部）。

【００３９】以上の結果は、アンカー分子としてGPIを
付加したC1-INHが、種々の動物細胞の細胞膜上で安定に
発現されることを示している。

【００４０】図４のパネルEには、FLAGに対するモノク
ローナル抗体で、CHO細胞を蛍光ラベルして、フローサ
イトメーターでFLAG-C1-INH-GPIの発現を調べた結果が
示してある。FLAGに対するモノクローナル抗体でも蛍光
が検出されているので、FLAG-C1-INH-GPIがCHO細胞の細
胞膜上に発現していることが確証された。また、FLAGに
対するモノクローナル抗体(M2)を用いて、Scatchard pl
ot法を実施し、CHO-CE21では51.3±3.7×10⁴／細胞、SE
C-CE9では13.3±2.3×10⁴／細胞のFLAG-C1-INH-GPI分子
が発現していることを確認した。

【００４１】図５は、これらの細胞からタンパク質を抽
出し、前記ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体
を用いてウェスタンブロットを行った結果を示してい
る。

【００４２】レーン１〜３及び７はCHO細胞、レーン4〜
６及び８はSEC細胞のウェスタンブロットである。レー
ン１〜６はポリクローナル抗体、レーン７及び８はモノ
クローナル抗体を用いたウェスタンブロットの結果であ
る。

【００４３】遺伝子導入していない細胞（レーン１及び
４）以外は、予想された位置にバンドが検出された。

【００４４】本実施例によって、水溶性CIインアクチベ
ーターにアンカー分子を付加することによって、膜結合
型C1インアクチベーターを人為的に作出して、種々の細
胞の膜上に発現させ得ることが明らかとなった。

【００４５】［実施例２］本実施例では、C1-INH-GPIの
補体に対する抑制効果を調べた。

【００４６】まず、C1-INH-GPIを発現させたCHO細胞（C
HO-C6及びCHO-CE21）に、これらの細胞に対する抗体を
反応させた後に、補体成分を含有する40%ヒト血清(NHS)
を加え、ヒト補体に対する抑制効果を調べた。結果を図
６及び図７に示す。

【００４７】図６から明らかなように、C1-INH-GPI導入
操作を行っていないナイーブCHO、及びC1-INH-GPIを加
えずに導入操作のみを行ったCHO-mock（両端の白抜きカ
ラム）では、約80%がヒト補体の攻撃で傷害されている
のに対して、C1-INH-GPIを発現させた細胞（斜線が付さ
れたカラム）では、約20%の細胞が傷害されるに留まっ
た。本実験により、C1-INH-GPIは、ヒトの補体によるCH
O細胞の傷害の発生率を約75%も抑制することが分かっ
た。

【００４８】次に、C1-INH-GPIがSEC細胞の傷害を抑制
する効果についても調べた。

【００４９】C1-INH-GPIを発現させたSEC細胞（SEC-C10
及びSEC-CE9）に、自然抗体と補体を含有する20%及び40
%ヒト血清を反応させて、ヒト補体による細胞傷害を抑
制する効果を観察した。

【００５０】図７のグラフAに示されているように、20%
ヒト血清の添加により、20%弱のナイーブCHOとCHO-mock
（カラム１及び４）が溶解したのに比べ、C1-INH-GPIを
発現させたSEC細胞の溶解は数%に留まった（カラム2及
び3）。このように、SEC細胞の膜上にC1-INH-GPIを発現
させると補体による傷害率が65〜72%減少した。

【００５１】40%ヒト血清の添加では（グラフB）、ナイ
ーブSECとSEC-mock（カラム１及び４）は約55%が溶解し
たが、C1-INH-GPIを発現させたSEC細胞の溶解率は20％
程度であった（カラム2及び3）。このように、SEC細胞
の膜上にC1-INH-GPIを発現させると補体による傷害率が
59〜65%減少することになる。

【００５２】以上のように、本実施例によって、細胞膜
上にC1-INH-GPIが発現された細胞では、補体による傷害
率が60〜75%も抑制されることが実証された。

【００５３】

【発明の効果】本発明の膜結合型C1インヒビターは、膜
結合型であるために、水溶性C1インヒビターに比べて、
細胞膜付近での濃度が極めて高く保たれる。臓器移植に
おいて超急性拒絶反応を引き起こす補体反応は、細胞膜
上で起きるので、かかる特性は、臓器移植時の超急性拒
絶反応を抑制する上で非常に有効である。より具体的に
は、水溶性C1インヒビターを用いて、本発明の膜結合型
C1インヒビターと同等の効果を得るためには、膜結合型
C1インヒビターの50〜1000倍の量が必要になると推測さ
れる。

【００５４】本発明の膜結合型C1インヒビターは、補体
活性化経路の初発反応を阻害するので、補体活性化経路
がきわめて効果的に抑制され、補体活性化経路中の有害
な中間体が一切生じないという顕著な効果を有してい
る。

【００５５】このような効果を有する本発明の膜結合型
C1インヒビターを発現させた臓器、組織、細胞を用いれ
ば、移植時の超急性拒絶反応が抑制されるので、本発明
の膜結合型C1インヒビターを発現させた臓器、組織、細
胞は、移植、とりわけ異種移植に適している。

【００５６】さらに、本発明の膜結合型C1インヒビター
遺伝子を導入したトランスジェニック動物は、このよう
な臓器、組織、細胞を取得するのに有用である。

【００５７】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Osaka University <120> Membrane bound-type C1 inactivator <130> 9903538 <160> 6 <170> PatentIn version 2.0 <210> 1 <211> 500 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Ser Arg Leu Thr Leu Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Gly Asp Arg Ala Ser Ser Asn Pro Asn Ala Thr Ser Ser Ser Ser Gln 20 25 30 Asp Pro Glu Ser Leu Gln Asp Arg Gly Glu Gly Lys Val Ala Thr Thr 35 40 45 Val Ile Ser Lys Met Leu Phe Val Glu Pro Ile Leu Glu Val Ser Ser 50 55 60 Leu Pro Thr Thr Asn Ser Thr Thr Asn Ser Ala Thr Lys Ile Thr Ala 65 70 75 80 Asn Thr Thr Asp Glu Pro Thr Thr Gln Pro Thr Thr Glu Pro Thr Thr 85 90 95 Gln Pro Thr Ile Gln Pro Thr Gln Pro Thr Thr Gln Leu Pro Thr Asp 100 105 110 Ser Pro Thr Gln Pro Thr Thr Gly Ser Phe Cys Pro Gly Pro Val Thr 115 120 125 Leu Cys Ser Asp Leu Glu Ser His Ser Thr Glu Ala Val Leu Gly Asp 130 135 140 Ala Leu Val Asp Phe Ser Leu Lys Leu Tyr His Ala Phe Ser Ala Met 145 150 155 160 Lys Lys Val Glu Thr Asn Met Ala Phe Ser Pro Phe Ser Ile Ala Ser 165 170 175 Leu Leu Thr Gln Val Leu Leu Gly Ala Gly Gln Asn Thr Lys Thr Asn 180 185 190 Leu Glu Ser Ile Leu Ser Tyr Pro Lys Asp Phe Thr Cys Val His Gln 195 200 205 Ala Leu Lys Gly Phe Thr Thr Lys Gly Val Thr Ser Val Ser Gln Ile 210 215 220 Phe His Ser Pro Asp Leu Ala Ile Arg Asp Thr Phe Val Asn Ala Ser 225 230 235 240 Arg Thr Leu Tyr Ser Ser Ser Pro Arg Val Leu Ser Asn Asn Ser Asp 245 250 255 Ala Asn Leu Glu Leu Ile Asn Thr Trp Val Ala Lys Asn Thr Asn Asn 260 265 270 Lys Ile Ser Arg Leu Leu Asp Ser Leu Pro Ser Asp Thr Arg Leu Val 275 280 285 Leu Leu Asn Ala Ile Tyr Leu Ser Ala Lys Trp Lys Thr Thr Phe Asp 290 295 300 Pro Lys Lys Thr Arg Met Glu Pro Phe His Phe Lys Asn Ser Val Ile 305 310 315 320 Lys Val Pro Met Met Asn Ser Lys Lys Tyr Pro Val Ala His Phe Ile 325 330 335 Asp Gln Thr Leu Lys Ala Lys Val Gly Gln Leu Gln Leu Ser His Asn 340 345 350 Leu Ser Leu Val Ile Leu Val Pro Gln Asn Leu Lys His Arg Leu Glu 355 360 365 Asp Met Glu Gln Ala Leu Ser Pro Ser Val Phe Lys Ala Ile Met Glu 370 375 380 Lys Leu Glu Met Ser Lys Phe Gln Pro Thr Leu Leu Thr Leu Pro Arg 385 390 395 400 Ile Lys Val Thr Thr Ser Gln Asp Met Leu Ser Ile Met Glu Lys Leu 405 410 415 Glu Phe Phe Asp Phe Ser Tyr Asp Leu Asn Leu Cys Gly Leu Thr Glu 420 425 430 Asp Pro Asp Leu Gln Val Ser Ala Met Gln His Gln Thr Val Leu Glu 435 440 445 Leu Thr Glu Thr Gly Val Glu Ala Ala Ala Ala Ser Ala Ile Ser Val 450 455 460 Ala Arg Thr Leu Leu Val Phe Glu Val Gln Gln Pro Phe Leu Phe Val 465 470 475 480 Leu Trp Asp Gln Gln His Lys Phe Pro Val Phe Met Gly Arg Val Tyr 485 490 495 Asp Pro Arg Ala 500 <210> 2 <211> 1800 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mRNA <222> (<1)...(1801) <220> <221> gene <222> (36)...(1801) <220> <221> sig peptide <222> (36)...(101) <220> <221> CDS <222> (36)...(1538) <220> <221> mat peptide <222> (102)...(1535) <220> <221> conflict <222> (1034) <220> <221> mutation <222> (1064)...(1285) <220> <221> conflict <222> (1323) <220> <221> variation <222> (1473) <400> 1 ccagaagttt ggagtccgct gacgtcgccg cccagatggc ctccaggctg accctgctga 60 ccctcctgct gctgctgctg gctggggata gagcctcctc aaatccaaat gctaccagct 120 ccagctccca ggatccagag agtttgcaag acagaggcga agggaaggtc gcaacaacag 180 ttatctccaa gatgctattc gttgaaccca tcctggaggt ttccagcttg ccgacaacca 240 actcaacaac caattcagcc accaaaataa cagctaatac cactgatgaa cccaccacac 300 aacccaccac agagcccacc acccaaccca ccatccaacc cacccaacca actacccagc 360 tcccaacaga ttctcctacc cagcccacta ctgggtcctt ctgcccagga cctgttactc 420 tctgctctga cttggagagt cattcaacag aggccgtgtt gggggatgct ttggtagatt 480 tctccctgaa gctctaccac gccttctcag caatgaagaa ggtggagacc aacatggcct 540 tttccccatt cagcatcgcc agcctcctta cccaggtcct gctcggggct gggcagaaca 600 ccaaaacaaa cctggagagc atcctctctt accccaagga cttcacctgt gtccaccagg 660 ccctgaaggg cttcacgacc aaaggtgtca cctcagtctc tcagatcttc cacagcccag 720 acctggccat aagggacacc tttgtgaatg cctctcggac cctgtacagc agcagcccca 780 gagtcctaag caacaacagt gacgccaact tggagctcat caacacctgg gtggccaaga 840 acaccaacaa caagatcagc cggctgctag acagtctgcc ctccgatacc cgccttgtcc 900 tcctcaatgc tatctacctg agtgccaagt ggaagacaac atttgatccc aagaaaacca 960 gaatggaacc ctttcacttc aaaaactcag ttataaaagt gcccatgatg aatagcaaga 1020 agtaccctgt ggcccatttc attgaccaaa ctttgaaagc caaggtgggg cagctgcagc 1080 tctcccacaa tctgagtttg gtgatcctgg taccccagaa cctgaaacat cgtcttgaag 1140 acatggaaca ggctctcagc ccttctgttt tcaaggccat catggagaaa ctggagatgt 1200 ccaagttcca gcccactctc ctaacactac cccgcatcaa agtgacgacc agccaggata 1260 tgctctcaat catggagaaa ttggaattct tcgatttttc ttatgacctt aacctgtgtg 1320 ggctgacaga ggacccagat cttcaggttt ctgcgatgca gcaccagaca gtgctggaac 1380 tgacagagac tggggtggag gcggctgcag cctccgccat ctctgtggcc cgcaccctgc 1440 tggtctttga agtgcagcag cccttcctct tcgtgctctg ggaccagcag cacaagttcc 1500 ctgtcttcat ggggcgagta tatgacccca gggcctgaga cctgcaggat caggttaggg 1560 cgagcgctac ctctccagcc tcagctctca gttgcagccc tgctgctgcc tgcctggact 1620 tgcccctgcc acctcctgcc tcaggtgtcc gctatccacc aaaagggctc ctgagggtct 1680 gggcaaggga cctgcttcta ttagcccttc tccatggccc tgccatgctc tccaaaccac 1740 tttttgcagc tttctctagt tcaagttcac cagactctat aaataaaacc tgacagacca 1800 <210> 3 <211> 504 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met Ala Ser Arg Leu Thr Pro Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Gly Asp Arg Ala Phe Ser Asp Pro Glu Ala Thr Ser His Ser Thr Gln 20 25 30 Asp Pro Leu Glu Ala Gln Ala Lys Ser Arg Glu Ser Phe Pro Glu Arg 35 40 45 Asp Asp Ser Trp Ser Pro Pro Glu Pro Thr Val Leu Pro Ser Thr Trp 50 55 60 Pro Thr Thr Ser Val Ala Ile Thr Ile Thr Asn Asp Thr Met Gly Lys 65 70 75 80 Val Ala Asn Glu Ser Phe Ser Gln His Ser Gln Pro Ala Ala Gln Leu 85 90 95 Pro Thr Asp Ser Pro Gly Gln Pro Pro Leu Asn Ser Ser Ser Gln Pro 100 105 110 Ser Thr Ala Ser Asp Leu Pro Thr Gln Ala Thr Thr Glu Pro Phe Cys 115 120 125 Pro Glu Pro Leu Ala Gln Cys Ser Asp Ser Asp Arg Asp Ser Ser Glu 130 135 140 Ala Lys Leu Ser Glu Ala Leu Thr Asp Phe Ser Val Lys Leu Tyr His 145 150 155 160 Ala Phe Ser Ala Thr Lys Met Ala Lys Thr Asn Met Ala Phe Ser Pro 165 170 175 Phe Ser Ile Ala Ser Leu Leu Thr Gln Val Leu Leu Gly Ala Gly Asp 180 185 190 Ser Thr Lys Ser Asn Leu Glu Ser Ile Leu Ser Tyr Pro Lys Asp Phe 195 200 205 Ala Cys Val His Gln Ala Leu Lys Gly Phe Ser Ser Lys Gly Val Thr 210 215 220 Ser Val Ser Gln Ile Phe His Ser Pro Asp Leu Ala Ile Arg Asp Thr 225 230 235 240 Tyr Val Asn Ala Ser Gln Ser Leu Tyr Gly Ser Ser Pro Arg Val Leu 245 250 255 Gly Pro Asp Ser Ala Ala Asn Leu Glu Leu Ile Asn Thr Trp Val Ala 260 265 270 Glu Asn Thr Asn His Lys Ile Arg Lys Leu Leu Asp Ser Leu Pro Ser 275 280 285 Asp Thr Cys Leu Val Leu Leu Asn Ala Val Tyr Leu Ser Ala Lys Trp 290 295 300 Lys Ile Thr Phe Glu Pro Lys Lys Met Met Ala Pro Phe Phe Tyr Lys 305 310 315 320 Asn Ser Met Ile Lys Val Pro Met Met Ser Ser Val Lys Tyr Pro Val 325 330 335 Ala Gln Phe Asp Asp His Thr Leu Lys Ala Lys Val Gly Gln Leu Gln 340 345 350 Leu Ser His Asn Leu Ser Phe Val Ile Val Val Pro Val Phe Pro Lys 355 360 365 His Gln Leu Lys Asp Val Glu Lys Ala Leu Asn Pro Thr Val Phe Lys 370 375 380 Ala Ile Met Lys Lys Leu Glu Leu Ser Lys Phe Leu Pro Thr Tyr Leu 385 390 395 400 Thr Met Pro His Ile Lys Val Lys Ser Ser Gln Asp Met Leu Ser Val 405 410 415 Met Glu Lys Leu Lys Phe Phe Asp Phe Thr Tyr Asp Leu Asn Leu Cys 420 425 430 Gly Leu Thr Glu Asp Pro Asp Leu Gln Val Ser Ala Met Lys His Glu 435 440 445 Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Ser Gly Val Glu Ala Ala Ala Ala Ser 450 455 460 Ala Ile Ser Phe Gly Arg Ser Leu Pro Ile Phe Glu Val Gln Arg Pro 465 470 475 480 Phe Leu Phe Leu Leu Trp Asp Gln Gln His Arg Phe Pro Val Phe Met 485 490 495 Gly Arg Val Tyr Asp Pro Arg Gly 500 <210> 4 <211> 1788 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> mRNA <222> (<1)...(1773) <220> <221> CDS <222> (49)...(1563) <400> 1 ctagtgacca agaacttgga ccaggacgca gctgacatcg ctgcccagat ggcctccagg 60 ctgaccccac tgaccctcct gctgctgctg ctggctgggg atagagcctt ctcagatccc 120 gaagctacca gccacagcac ccaggatcca ctggaggctc aagcgaaaag cagagagagc 180 ttccctgaaa gagatgactc ctggagtccc ccagagccta cagtactgcc ctctacctgg 240 ccaacaacca gtgtagccat cacaataaca aatgacacca tgggtaaagt agccaacgag 300 tccttcagcc agcacagcca gccagctgct cagctaccca cagattctcc aggacagccc 360 cctctgaatt cttccagcca gccctccact gcctcagatc ttcccaccca ggctactact 420 gaacccttct gcccggagcc gcttgctcag tgctctgatt cagacagaga ctcctcagag 480 gcaaagctct cagaggcttt gacagatttc tctgtgaagc tctaccacgc cttctcagct 540 accaagatgg ctaagaccaa catggccttt tccccattca gcattgccag cctcctcaca 600 caggttcttc ttggggctgg agacagcacc aagagcaact tggagagcat cctttcctac 660 cccaaggatt ttgcctgtgt ccaccaagca ctaaagggct tttcatccaa aggtgtcact 720 tctgtgtctc agattttcca cagcccagat ctggccataa gggacaccta tgtgaatgca 780 tctcagagcc tgtatggaag cagccccaga gtcctgggcc cagacagtgc tgctaactta 840 gaactcatca acacctgggt ggctgagaac accaaccata agatccgcaa gctgctggac 900 agcctgcctt ctgacacctg cctcgtcctt ctcaatgctg tctacttgag tgccaagtgg 960 aagataacat ttgaaccaaa aaagatgatg gcgcctttct tctacaaaaa ctctatgatt 1020 aaagtgccca tgatgagtag cgtaaagtac cctgtggccc aattcgatga ccatactttg 1080 aaggccaagg tgggacagct gcagctctct cacaacctga gctttgtgat cgtggtaccc 1140 gtgttcccaa agcaccaact taaagatgta gaaaaggctc tcaaccccac tgtcttcaag 1200 gccatcatga agaagctgga gctgtccaaa ttcctgccca cttacctgac gatgcctcat 1260 ataaaagtaa agagcagcca agacatgctg tcagtcatgg agaaactgaa attctttgac 1320 ttcacttacg atctcaacct gtgcgggctg accgaggacc cagatcttca ggtgtctgcc 1380 atgaaacacg agacagtgct ggaactgaca gagtcagggg tggaagcagc tgcagcctct 1440 gccatctcct ttggccgaag cttacccatc tttgaggtgc agcgaccttt cctcttcctg 1500 ctctgggacc agcaacacag gttcccagtc ttcatgggtc gtgtatatga ccccaggggt 1560 tgagacaggc ttgggtaaac attgtcaccc aagcttcagc tcctccggtt atttccttgc 1620 cactgcctgc ccgagccact tcaagcctta ggaactggca gacggaactg tttccatcca 1680 ccaaccccca gggtatcaac cacttttttg cagcttttac ggttcaaacc tatcaaactc 1740 tacaaataaa acttgcagac attttcttct cccaaaaaaa aaaaaaaa 1788 <210> 5 <211> 97 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Lys Ser Leu Thr Ser Lys Val Pro Pro Thr Val Gln Lys Pro Thr 1 5 10 15 Thr Val Asn Val Pro Thr Thr Glu Val Ser Pro Thr Ser Gln Lys Thr 20 25 30 Thr Thr Lys Thr Thr Thr Pro Asn Ala Gln Ala Thr Arg Ser Thr Pro 35 40 45 Val Ser Arg Thr Thr Lys His Phe His Glu Thr Thr Pro Asn Lys Gly 50 55 60 Ser Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Arg Leu Leu Ser Gly His Thr Cys 65 70 75 80 Phe Thr Leu Thr Gly Leu Leu Gly Thr Leu Val Thr Met Gly Leu Leu 85 90 95 Thr <210> 6 <211> 353 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggaaaatctc taacttccaa ggtcccacca acagttcaga aacctaccac agtaaatgtt 60 ccaactacag aagtctcacc aacttctcag aaaaccacca caaaaaccac cacaccaaat 120 gctcaagcaa cacggagtac acctgtttcc aggacaacca agcattttca tgaaacaacc 180 ccaaataaag gaagtggaac cacttcaggt actacccgtc ttctatctgg gcacacgtgt 240 ttcacgttga caggtttgct tgggacgcta gtaaccatgg gcttgctgac ttagccaaag 300 aagagttaag aagaaaatac acacaagtat acagactgtt cctagtttct tag 353

【図面の簡単な説明】

【図１】補体活性化経路における補体制御因子の作用点
を説明するための図。

【図２】C1-INHの立体構造及び活性中心を示す模式図。

【図３】実施例１で用いた膜結合型C1インヒビターの構
造を示す模式図。

【図４】チャイニーズハムスター卵巣細胞とブタ血管内
皮細胞に、膜結合型C1インヒビターが発現されているこ
とを示す図。

【図５】膜結合型C1インヒビターのcDNAを導入したチャ
イニーズハムスター卵巣細胞とブタ血管内皮細胞から抽
出したタンパク質に対して、抗膜結合型C1インヒビター
抗体を用いたウェスタンブロットを行った結果を示す
図。

【図６】膜結合型C1インヒビターが、補体によるチャイ
ニーズハムスター卵巣細胞の傷害を抑制する効果を示す
図。

【図７】膜結合型C1インヒビターが、補体によるブタ血
管内皮細胞の傷害を抑制する効果を示す図。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１２年４月２７日（２０００．４．２
７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ａ６１Ｋ 31/00 ６３７ Ａ６１Ｋ 31/00 ６３７Ｄ 38/55 37/64 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA02 EA02 EA04 GA13 GA14 GA18 4B033 NA02 NA42 NB56 ND12 4C084 AA07 BA44 DC50 ZB082 4C087 AA01 AA02 AA03 BB45 BB46 BB47 BB56 CA12 ZB08 4H045 AA10 BA10 BA52 BA55 CA42 EA34 FA74

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 水溶性C1インアクチベーターと同等の補
   体活性化経路の抑制機能を有する膜結合型C1インアクチ
   ベーター。
2. 【請求項２】 水溶性C1インアクチベーターの機能的ド
   メイン、又は該機能的ドメインの１若しくは数個のアミ
   ノ酸が欠失、置換若しくは付加され且つ水溶性C1インア
   クチベーターの補体活性化経路の抑制機能を保持したア
   ミノ酸配列を含有するタンパク質と、 該タンパク質の末端及び/又は内部に付加されたアンカ
   ー分子とを具備する膜結合型C1インアクチベーター。
3. 【請求項３】 前記水溶性C1インアクチベーターが、ヒ
   トの水溶性C1インアクチベーターである請求項１又は２
   に記載の膜結合型C1インアクチベーター。
4. 【請求項４】 前記水溶性C1インアクチベーターが、マ
   ウスの水溶性C1インアクチベーターである請求項１又は
   ２に記載の膜結合型C1インアクチベーター。
5. 【請求項５】 前記アンカー分子が、グリコシルホスフ
   ァチジルイノシトール又は膜貫通タンパク質の膜貫通部
   分の何れかである請求項１〜４の何れか1項に記載の膜
   結合型C1インアクチベーター。
6. 【請求項６】 請求項１〜５の何れか1項に記載の膜結
   合型C1インアクチベーターをコードする核酸分子。
7. 【請求項７】 請求項６に記載の膜結合型C1インアクチ
   ベーターをコードする核酸分子を移植臓器、組織、又は
   細胞に遺伝子導入するためのベクター。
8. 【請求項８】 請求項１〜５の何れか1項に記載の膜結
   合型C1インアクチベーターを発現させた細胞。
9. 【請求項９】 請求項１〜５の何れか1項に記載の膜結
   合型C1インアクチベーターを発現させた組織。
10. 【請求項１０】 前記組織が角膜、半月板、脳組織、皮
    膚、皮下組織、上皮組織、骨組織、及び筋組織からなる
    群から選択されることを特徴とする請求項９に記載の組
    織。
11. 【請求項１１】 請求項１〜５の何れか1項に記載の膜
    結合型C1インアクチベーターを発現させた臓器。
12. 【請求項１２】 前記臓器が肺、腎臓、心臓、肝臓、膵
    臓、及び小腸を含む消化管からなる群から選択されるこ
    とを特徴とする請求項１１に記載の臓器。
13. 【請求項１３】 請求項６に記載の核酸分子が導入され
    たトランスジェニック動物。
14. 【請求項１４】 請求項６に記載の核酸分子が導入され
    たトランスジェニックブタ。