CA2886289A1 - Modification des effets immunomodulateurs des cellules - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne une cellule isolée possédant un potentiel immunomodulateur, dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est modulée, ou le surnageant de culture de ladite cellule, pour son utilisation comme médicament immunosuppresseur ou immunostimulateur. La présente invention concerne également la périostine pour son utilisation comme médicament immunostimulateur ou un inhibiteur de la périostine pour son utilisation comme médicament immunosuppresseur.
Description
MODIFICATION DES EFFETS IMMUNOMODULATEURS DES CELLULES
La présente invention concerne les domaines de l'immunothérapie cellulaire, et plus particulièrement l'utilisation de cellules de mammifère possédant un potentiel immunomodulateur et qui ont été génétiquement ou pharmacologiquement modifiées comme médicament immunosuppresseur ou immunostimulateur. La présente invention concerne également de nouvelles molécules possédant un effet immunosuppresseur ou immuno stimulateur.
La thérapie cellulaire consiste en l'injection à un sujet de cellules vivantes autologues ou allogènes, dans le but de traiter ou prévenir une maladie ou de reconstruire un tissu endommagé. Ces cellules peuvent être des cellules souches, des cellules progénitrices ou précurseurs, ou des cellules différenciées fonctionnelles provenant du sang ou d'un tissu. Ces cellules peuvent aussi être génétiquement transformées pour exprimer dans un tissu un transgène d'intérêt thérapeutique. En outre, la modification génétique de ces cellules peut améliorer leur survie, leurs caractéristiques métaboliques, leurs capacités prolifératives ou, pour les cellules souches ou les précurseurs, leurs capacités de différenciation. Ces mêmes objectifs peuvent être obtenus par le pré-conditionnement de ces cellules à l'aide d'outils pharmacologiques.
Parmi les cellules souches on distingue :
- les cellules souches embryonnaires (ESC) qui proviennent d'un embryon à un stade précoce (du zygote au blastomère). Ces cellules sont totipotentes, c'est-à-dire qu'elles sont capables de se différencier en n'importe quel tissu de l'organisme, et sont capables de s'auto-renouveler ;
-les cellules souches adultes qui sont présentes dans la plupart des tissus de l'organisme. Ces cellules sont soit pluripotentes, c'est-à-dire qu'elles sont capables de former tous les types cellulaires sauf les annexes embryonnaires, telles que les cellules souches pluripotentes induites ou les Multilineage-differentiating Stress Enduring Cells ; soit multipotentes, c'est-à-dire qu'elles sont capables de former différents types de cellules d'un lignage cellulaire donné ; soit unipotentes, c'est-à-dire qu'elles ne peuvent former qu'un seul type cellulaire.
Les cellules progénitrices et précurseurs sont issues des cellules souches, c'est-à-dire qu'elles sont plus engagées dans une voie de différenciation que les cellules
La présente invention concerne les domaines de l'immunothérapie cellulaire, et plus particulièrement l'utilisation de cellules de mammifère possédant un potentiel immunomodulateur et qui ont été génétiquement ou pharmacologiquement modifiées comme médicament immunosuppresseur ou immunostimulateur. La présente invention concerne également de nouvelles molécules possédant un effet immunosuppresseur ou immuno stimulateur.
La thérapie cellulaire consiste en l'injection à un sujet de cellules vivantes autologues ou allogènes, dans le but de traiter ou prévenir une maladie ou de reconstruire un tissu endommagé. Ces cellules peuvent être des cellules souches, des cellules progénitrices ou précurseurs, ou des cellules différenciées fonctionnelles provenant du sang ou d'un tissu. Ces cellules peuvent aussi être génétiquement transformées pour exprimer dans un tissu un transgène d'intérêt thérapeutique. En outre, la modification génétique de ces cellules peut améliorer leur survie, leurs caractéristiques métaboliques, leurs capacités prolifératives ou, pour les cellules souches ou les précurseurs, leurs capacités de différenciation. Ces mêmes objectifs peuvent être obtenus par le pré-conditionnement de ces cellules à l'aide d'outils pharmacologiques.
Parmi les cellules souches on distingue :
- les cellules souches embryonnaires (ESC) qui proviennent d'un embryon à un stade précoce (du zygote au blastomère). Ces cellules sont totipotentes, c'est-à-dire qu'elles sont capables de se différencier en n'importe quel tissu de l'organisme, et sont capables de s'auto-renouveler ;
-les cellules souches adultes qui sont présentes dans la plupart des tissus de l'organisme. Ces cellules sont soit pluripotentes, c'est-à-dire qu'elles sont capables de former tous les types cellulaires sauf les annexes embryonnaires, telles que les cellules souches pluripotentes induites ou les Multilineage-differentiating Stress Enduring Cells ; soit multipotentes, c'est-à-dire qu'elles sont capables de former différents types de cellules d'un lignage cellulaire donné ; soit unipotentes, c'est-à-dire qu'elles ne peuvent former qu'un seul type cellulaire.
Les cellules progénitrices et précurseurs sont issues des cellules souches, c'est-à-dire qu'elles sont plus engagées dans une voie de différenciation que les cellules
2 PCT/1B2013/055111 souches. Elles sont également capables de foimer un ou plusieurs types cellulaires mais ne sont pas capables de s' auto-renouveler.
Les cellules souches mésenchymateuses (CSM ou MSC) - aussi appelées cellules stromales mésenchymateuses - font actuellement l'objet de nombreuses recherches pour leurs applications thérapeutiques. Dans la description qui suit les termes cellule souche mésenchymateuse et cellule stromale mésenchymateuse sont utilisés indifféremment. Ces cellules souches adultes ont été initialement isolées et caractérisées à
partir des cellules mononucléées de la moelle osseuse (BM-MSC) mais peuvent également être isolées à partir du tissu adipeux, de la peau, de la rate ou du coeur.
Les CSM possèdent des caractéristiques phénotypiques, par exemple CD45-, CD34+/- (selon l'origine tissulaire et leur stade de prolifération), CD134-, qui permettent de les distinguer des cellules souches hématopoïétiques qui sont CD45+, CD34+, CD13-. Elles possèdent, selon les inducteurs utilisés, un potentiel de différenciation ostéogénique, adipogénique, chondrogénique, myogénique et angiogénique par exemple. Elles possèdent aussi une activité
paracrine et sont capables de sécréter des facteurs de croissance, des cytokines pro- ou anti-inflammatoires, des chémokines et des prostaglandines (voir pour revue Le Blanc 2006, Kode et al., 2009, Hoogduijn et al., 2010 et Dazzi et al., 2011). De ce fait, elles présentent aussi de grandes similarités avec les monocytes et les macrophages (Charrière et al., 2006) ainsi que les fibroblastes (Hannifa et al., 2007) qui possèdent des propriétés immunomodulatrices similaires. Les CSM sont donc utilisées en thérapie cellulaire régénératrice pour leurs propriétés de différenciation multiple ainsi que pour leurs propriétés prolifératives, angiogéniques, anti-apoptotiques, trophiques et imm.unomodulatrices. Par exemple, Le Blanc et al. (2008) ont montré chez l'Homme que les cellules souches mésenchymateuses combinées à une greffe de cellules souches hématopoïétiques peuvent réduire le risque de réaction aiguë du greffon contre l'hôte dans les allogreffes (graft-versus host disease, GVHD).
Les CSM isolées du tissu adipeux sont appelées ASC, ADSC (adipose derived stem/stroma cells), ADAS (adipose tissue-derived adult stem cells) ou AD-MSC
(adipose-derived MSC). Le tissu adipeux présente l'avantage d'être obtenu facilement par liposuccion sous anesthésie locale et de contenir plusieurs populations de cellules immatures dont une forte majorité d'ASC. Les ASC sont ensuite isolées et purifiées après digestion protéolytique du tissu adipeux blanc (e.g., avec la collagénase) et sélection par
Les cellules souches mésenchymateuses (CSM ou MSC) - aussi appelées cellules stromales mésenchymateuses - font actuellement l'objet de nombreuses recherches pour leurs applications thérapeutiques. Dans la description qui suit les termes cellule souche mésenchymateuse et cellule stromale mésenchymateuse sont utilisés indifféremment. Ces cellules souches adultes ont été initialement isolées et caractérisées à
partir des cellules mononucléées de la moelle osseuse (BM-MSC) mais peuvent également être isolées à partir du tissu adipeux, de la peau, de la rate ou du coeur.
Les CSM possèdent des caractéristiques phénotypiques, par exemple CD45-, CD34+/- (selon l'origine tissulaire et leur stade de prolifération), CD134-, qui permettent de les distinguer des cellules souches hématopoïétiques qui sont CD45+, CD34+, CD13-. Elles possèdent, selon les inducteurs utilisés, un potentiel de différenciation ostéogénique, adipogénique, chondrogénique, myogénique et angiogénique par exemple. Elles possèdent aussi une activité
paracrine et sont capables de sécréter des facteurs de croissance, des cytokines pro- ou anti-inflammatoires, des chémokines et des prostaglandines (voir pour revue Le Blanc 2006, Kode et al., 2009, Hoogduijn et al., 2010 et Dazzi et al., 2011). De ce fait, elles présentent aussi de grandes similarités avec les monocytes et les macrophages (Charrière et al., 2006) ainsi que les fibroblastes (Hannifa et al., 2007) qui possèdent des propriétés immunomodulatrices similaires. Les CSM sont donc utilisées en thérapie cellulaire régénératrice pour leurs propriétés de différenciation multiple ainsi que pour leurs propriétés prolifératives, angiogéniques, anti-apoptotiques, trophiques et imm.unomodulatrices. Par exemple, Le Blanc et al. (2008) ont montré chez l'Homme que les cellules souches mésenchymateuses combinées à une greffe de cellules souches hématopoïétiques peuvent réduire le risque de réaction aiguë du greffon contre l'hôte dans les allogreffes (graft-versus host disease, GVHD).
Les CSM isolées du tissu adipeux sont appelées ASC, ADSC (adipose derived stem/stroma cells), ADAS (adipose tissue-derived adult stem cells) ou AD-MSC
(adipose-derived MSC). Le tissu adipeux présente l'avantage d'être obtenu facilement par liposuccion sous anesthésie locale et de contenir plusieurs populations de cellules immatures dont une forte majorité d'ASC. Les ASC sont ensuite isolées et purifiées après digestion protéolytique du tissu adipeux blanc (e.g., avec la collagénase) et sélection par
3 PCT/1B2013/055111 une étape d'adhésion sur un support plastique (voir pour revue Gimble et al., 2007) ou peuvent être directement sélectionnées à partir de leur phénotype de surface (par exemple, sélection des cellules CD45-, CD34+ et CD31"). Bien que possédant des caractéristiques spécifiques, les ASC montrent beaucoup de caractéristiques communes avec les cellules souches mésenchymateuses issues de la moelle osseuse, y compris l'activité
paracrine et les propriétés immunomodulatrices (Planat-Bénard et al., 2004, Puissant et al., 2005, Yailez et al., 2006, Gonzàlez et al., 2009a et 2009b, Constantin et al., 2009 et Yoo et al., 2009). En outre, dans la mesure où leur auto-renouvellement n'a pas été
clairement établi, il convient d'utiliser le terme cellules stromales mésenchymateuses pour les qualifier (Casteilla et al., 2011). Néanmoins, ces cellules peuvent servir de modèle cellulaire pour l'ensemble des cellules souches mésenchymateuses. Les ASC sont actuellement étudiées au niveau clinique dans plusieurs types d'applications (voir pour revue Casteilla et al., 2011), dont l'ischémie critique du membre inférieur et le traitement des fistules associées ou non à la maladie de Crohn (Garcia-Olmo et al., 2009).
Malgré des résultats pré-cliniques et cliniques encourageants sur l'utilisation des CSM dans le cadre de thérapies cellulaires (voir pour revue Uccelli et al., 2008), le potentiel immunomodulateur des CSM est parfois trop faible pour obtenir de bons résultats dans le traitement de maladies ou dysfonctions impliquant l'inflammation, telles que les maladies inflammatoires chroniques ou maladies auto-immunes. Il existe donc un besoin d'améliorer le potentiel immunomodulateur des CSM, permettant ainsi de diminuer le nombre de cellules nécessaires au traitement et/ou d'améliorer leur efficacité, ce qui diminue d'autant la quantité de cellules prélevées initialement et nécessaire pour l'obtention des CSM greffées, ainsi que les temps de culture des cellules.
La périostine (POSTN ou PN) est une protéine d'adhésion de la matrice extracellulaire, sécrétée notamment par les ostéoblastes et exprimée préférentiellement dans le périoste des os et le ligament péridontal des dents (voir pour revue Kudo, 2011 et Frangogianni, 2012). La périostine est également exprimée dans d'autres tissus, tels que le coeur, les glandes mammaires, les cellules stromales mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse (Coutu et al., 2008) et certaines cellules cancéreuses. Les séquences nucléotidique et peptidique des quatre isoformes connues de la périostine sont disponibles dans la base de données GENBANK, sous les numéros d'accès GI:209863034 (NP 001129408.1 ; isoforme 1), GI:209862911 (NP 001129406.1 ; isoforme 2),
paracrine et les propriétés immunomodulatrices (Planat-Bénard et al., 2004, Puissant et al., 2005, Yailez et al., 2006, Gonzàlez et al., 2009a et 2009b, Constantin et al., 2009 et Yoo et al., 2009). En outre, dans la mesure où leur auto-renouvellement n'a pas été
clairement établi, il convient d'utiliser le terme cellules stromales mésenchymateuses pour les qualifier (Casteilla et al., 2011). Néanmoins, ces cellules peuvent servir de modèle cellulaire pour l'ensemble des cellules souches mésenchymateuses. Les ASC sont actuellement étudiées au niveau clinique dans plusieurs types d'applications (voir pour revue Casteilla et al., 2011), dont l'ischémie critique du membre inférieur et le traitement des fistules associées ou non à la maladie de Crohn (Garcia-Olmo et al., 2009).
Malgré des résultats pré-cliniques et cliniques encourageants sur l'utilisation des CSM dans le cadre de thérapies cellulaires (voir pour revue Uccelli et al., 2008), le potentiel immunomodulateur des CSM est parfois trop faible pour obtenir de bons résultats dans le traitement de maladies ou dysfonctions impliquant l'inflammation, telles que les maladies inflammatoires chroniques ou maladies auto-immunes. Il existe donc un besoin d'améliorer le potentiel immunomodulateur des CSM, permettant ainsi de diminuer le nombre de cellules nécessaires au traitement et/ou d'améliorer leur efficacité, ce qui diminue d'autant la quantité de cellules prélevées initialement et nécessaire pour l'obtention des CSM greffées, ainsi que les temps de culture des cellules.
La périostine (POSTN ou PN) est une protéine d'adhésion de la matrice extracellulaire, sécrétée notamment par les ostéoblastes et exprimée préférentiellement dans le périoste des os et le ligament péridontal des dents (voir pour revue Kudo, 2011 et Frangogianni, 2012). La périostine est également exprimée dans d'autres tissus, tels que le coeur, les glandes mammaires, les cellules stromales mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse (Coutu et al., 2008) et certaines cellules cancéreuses. Les séquences nucléotidique et peptidique des quatre isoformes connues de la périostine sont disponibles dans la base de données GENBANK, sous les numéros d'accès GI:209863034 (NP 001129408.1 ; isoforme 1), GI:209862911 (NP 001129406.1 ; isoforme 2),
4 PCT/1B2013/055111 GI:209863011 (NP 001129407.1 ; isoforme 3) et GI:209863034 (NP 001129408.1 ;
isoforme 4). La périostine contient, de son extrémité N-terminale vers son extrémité C-tellninale : une séquence signal de sécrétion, un domaine riche en cystéine (domaine EMI), 4 régions répétées homologues (domaines Fasciclin I (FAS1)) et un domaine hydrophobe.
Les domaines FAS1 des protéines sont bien connus de l'homme du métier ; ils sont référencés par exemple dans la base de données EMBL-EBI sous le numéro d'accès IPR000782 ou dans la base de données PFAM sous le numéro d'accès PF02469. Les domaines FAS1 de la périostine ont notamment été décrits par Coutu et al., 2008. La périostine maintient la structure et l'intégrité des tissus de soutien (le collagène) et participe à la croissance osseuse. Kudo et al. (2004) ont montré chez le poisson zèbre, que l'inhibition de la traduction de l'ARNm de la périostine par un oligonucléotide morpholino antisens inhibe la formation du myoseptum dans l'embryon. Rios et al. (2005) ont montré, à l'aide de souris transgéniques knock-in n'exprimant pas la périostine, que la périostine est nécessaire pour le maintien de l'intégrité du ligament péridontal en réponse à
un stress mécanique. Takayama et al. (2006) ont montré que l'expression de la périostine est induite par les cytokines TGF-I3 et/ou IL-4 et IL-13 exprimées en réponse à
l'inflammation ou à un stress mécanique. En outre, l'augmentation de l'expression de la périostine dans les processus de réparation ou de remodelage tissulaire et de fibrose peut être due à une activation locale de TGF-(3 et de la voie de signalisation de la protéine morphogénétique osseuse (BMP) (voir pour revue Frangogianni, 2012). Par ailleurs, il semble que la périostine stimule la croissance cellulaire de plusieurs types de cancer, tels que le cancer du sein. Orecchia et al. (2011) ont montré in vitro que le traitement des cellules SKMEL-28 avec un anticorps monoclonal bloquant, dirigé contre le motif YN
situé dans le deuxième domaine FAS1 de la périostine humaine, inhibe la croissance tumorale et réduit la densité vasculaire tumorale. Enfin, la Demande Internationale
isoforme 4). La périostine contient, de son extrémité N-terminale vers son extrémité C-tellninale : une séquence signal de sécrétion, un domaine riche en cystéine (domaine EMI), 4 régions répétées homologues (domaines Fasciclin I (FAS1)) et un domaine hydrophobe.
Les domaines FAS1 des protéines sont bien connus de l'homme du métier ; ils sont référencés par exemple dans la base de données EMBL-EBI sous le numéro d'accès IPR000782 ou dans la base de données PFAM sous le numéro d'accès PF02469. Les domaines FAS1 de la périostine ont notamment été décrits par Coutu et al., 2008. La périostine maintient la structure et l'intégrité des tissus de soutien (le collagène) et participe à la croissance osseuse. Kudo et al. (2004) ont montré chez le poisson zèbre, que l'inhibition de la traduction de l'ARNm de la périostine par un oligonucléotide morpholino antisens inhibe la formation du myoseptum dans l'embryon. Rios et al. (2005) ont montré, à l'aide de souris transgéniques knock-in n'exprimant pas la périostine, que la périostine est nécessaire pour le maintien de l'intégrité du ligament péridontal en réponse à
un stress mécanique. Takayama et al. (2006) ont montré que l'expression de la périostine est induite par les cytokines TGF-I3 et/ou IL-4 et IL-13 exprimées en réponse à
l'inflammation ou à un stress mécanique. En outre, l'augmentation de l'expression de la périostine dans les processus de réparation ou de remodelage tissulaire et de fibrose peut être due à une activation locale de TGF-(3 et de la voie de signalisation de la protéine morphogénétique osseuse (BMP) (voir pour revue Frangogianni, 2012). Par ailleurs, il semble que la périostine stimule la croissance cellulaire de plusieurs types de cancer, tels que le cancer du sein. Orecchia et al. (2011) ont montré in vitro que le traitement des cellules SKMEL-28 avec un anticorps monoclonal bloquant, dirigé contre le motif YN
situé dans le deuxième domaine FAS1 de la périostine humaine, inhibe la croissance tumorale et réduit la densité vasculaire tumorale. Enfin, la Demande Internationale
5 décrit que la périostine peut être utilisée comme médicament pour la régénération du tissu pancréatique.
A la connaissance des inventeurs, aucune donnée ne lie la périostine à un effet immunomodulateur des cellules exprimant cette protéine.
Les inventeurs se sont donnés pour but de modifier le potentiel immunomodulateur des cellules possédant un potentiel immunomodulateur, et plus particulièrement des cellules souches/stromales mésenchymateuses.
A la connaissance des inventeurs, aucune donnée ne lie la périostine à un effet immunomodulateur des cellules exprimant cette protéine.
Les inventeurs se sont donnés pour but de modifier le potentiel immunomodulateur des cellules possédant un potentiel immunomodulateur, et plus particulièrement des cellules souches/stromales mésenchymateuses.
6 5 PCT/1B2013/055111 Les inventeurs ont alors montré que l'inhibition de l'expression de la périostine dans les cellules stromales mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (ASC) humain, non génétiquement transformées, peimet d'augmenter le potentiel immunosuppresseur de ces cellules.
Les inventeurs ont aussi montré que le potentiel immunosuppresseur des cellules stromales mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (ASC) humain, non génétiquement transfolinées, est inhibé lorsque la périostine est ajoutée à
ces cellules.
L'augmentation de l'expression de la périostine dans les ASC permet donc de diminuer ou d'inhiber le potentiel immunosuppresseur de ces cellules, c'est-à-dire de conférer un potentiel immunostimulateur à ces cellules.
Au regard de ces résultats obtenus avec les ASC utilisées comme cellules modèles, les inventeurs ont donc mis en évidence, de manière inattendue, le rôle de la périostine dans le contrôle de l'activité paracrine des cellules possédant un potentiel immunomodulateur, notamment des cellules souches/stromales mésenchymateuses.
Ces résultats montent aussi que la périostine peut être utilisée comme médicament immunostimulateur et qu'un inhibiteur de la périostine peut être utilisé comme médicament immunosuppresseur.
La présente invention a pour objet une cellule diploïde isolée possédant un potentiel immunomodulateur, dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est modulée, ou le surnageant de culture de ladite cellule, pour son utilisation comme médicament.
De préférence, ledit médicament est un médicament immunosuppresseur ou un médicament immunostimulateur.
On entend par cellule possédant un potentiel immunomodulateur une cellule qui permet de diminuer ou augmenter les capacités naturelles du système immunitaire chez un organisme, c'est-à-dire de diminuer (immunosuppresssion) les défenses immunitaires naturelles lorsqu'elles peuvent nuire audit organisme, ou au contraire de les renforcer (immunostimulation) lorsqu'elles sont insuffisantes ou déprimées. Cette cellule se caractérise par sa capacité à agir sur les effecteurs de l'immunité. La détermination du potentiel immunomodulateur d'une cellule peut être effectuée par l'homme du métier à l'aide de techniques bien connues, telles que l'immunophénotypage et plus particulièrement et à titre d'exemple pour les lymphocytes la réaction lymphocytaire mixte (MLR) mais aussi la réponse sous stimulation des neutrophiles ; par exemple pour les cellules stromales mésenchymateuses, voir Perico et al., 2011; pour les cellules dendritiques, voir Zhao et al., 2012 ; pour les cellules NK, voir Abdelrazik et aL, 2011 ; pour les lymphocytes, voir Perico et al., 2011, Najar et al., 2010, Zhou et al., 2011 et Kronsteiner et al., 2011. Ladite cellule possédant un potentiel immunomodulateur (avant modulation de l'expression et/ou l'activité de la périostine) exprime la périostine. De préférence, ladite cellule possédant un potentiel immunomodulateur exprime aussi au moins une molécule immunomodulatrice, telle que IFN-f3, IDO-1, TSG-6, HLA-G, PGE2, TGF- p, galectine, HO-1, IL-6, IL-1RA, IL-33, AIRE ( autoimmune regulator ), hEGF, TNF, GM-CSF et/ou JAG1, bien connus de l'homme du métier, de préférence IFN-P, IDO-1, TSG-6, HLA-G et IL-1RA. La mesure de l'expression de ces gènes dans une cellule peut être effectuée par RT-PCR, tel que décrit dans les Exemples ci-après.
De manière avantageuse, ladite cellule possédant un potentiel immunomodulateur est choisie parmi une cellule stromale mésenchymateuse, une cellule progénitrice, une cellule précurseur, une cellule différenciée à partir d'une cellule stromale mésenchymateuse, un macrophage, un monocyte, un mastocyte, une cellule myéloïde, un fibroblaste, une cellule dendritique, un lymphocyte (par exemple un lymphocyte Treg), une cellule NK, une cellule lymphoïde et un myoblaste.
De manière avantageuse encore, ladite cellule stromale mésenchymateuse est choisie parmi une cellule stromale mésenchymateuse dérivée de la moelle osseuse (BM-MSC), du tissu adipeux (ASC ou AD-MSC), d'un tissu solide, du placenta, du sang adulte ou du sang de cordon.
De préférence, ladite cellule possédant un potentiel immunomodulateur est une cellule de mammifère, de préférence encore une cellule humaine.
Bien entendu, ladite cellule possédant un potentiel immunomodulateur est une cellule vivante.
En outre, ladite cellule possédant un potentiel immunomodulateur n'est pas une cellule cancéreuse.
On entend par moduler l'expression et/ou l'activité de la périostine , la modification de l'expression et/ou l'activité de la périostine par rapport à
une cellule possédant un potentiel immunomodulateur, soit par inhibition totale ou partielle de
Les inventeurs ont aussi montré que le potentiel immunosuppresseur des cellules stromales mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (ASC) humain, non génétiquement transfolinées, est inhibé lorsque la périostine est ajoutée à
ces cellules.
L'augmentation de l'expression de la périostine dans les ASC permet donc de diminuer ou d'inhiber le potentiel immunosuppresseur de ces cellules, c'est-à-dire de conférer un potentiel immunostimulateur à ces cellules.
Au regard de ces résultats obtenus avec les ASC utilisées comme cellules modèles, les inventeurs ont donc mis en évidence, de manière inattendue, le rôle de la périostine dans le contrôle de l'activité paracrine des cellules possédant un potentiel immunomodulateur, notamment des cellules souches/stromales mésenchymateuses.
Ces résultats montent aussi que la périostine peut être utilisée comme médicament immunostimulateur et qu'un inhibiteur de la périostine peut être utilisé comme médicament immunosuppresseur.
La présente invention a pour objet une cellule diploïde isolée possédant un potentiel immunomodulateur, dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est modulée, ou le surnageant de culture de ladite cellule, pour son utilisation comme médicament.
De préférence, ledit médicament est un médicament immunosuppresseur ou un médicament immunostimulateur.
On entend par cellule possédant un potentiel immunomodulateur une cellule qui permet de diminuer ou augmenter les capacités naturelles du système immunitaire chez un organisme, c'est-à-dire de diminuer (immunosuppresssion) les défenses immunitaires naturelles lorsqu'elles peuvent nuire audit organisme, ou au contraire de les renforcer (immunostimulation) lorsqu'elles sont insuffisantes ou déprimées. Cette cellule se caractérise par sa capacité à agir sur les effecteurs de l'immunité. La détermination du potentiel immunomodulateur d'une cellule peut être effectuée par l'homme du métier à l'aide de techniques bien connues, telles que l'immunophénotypage et plus particulièrement et à titre d'exemple pour les lymphocytes la réaction lymphocytaire mixte (MLR) mais aussi la réponse sous stimulation des neutrophiles ; par exemple pour les cellules stromales mésenchymateuses, voir Perico et al., 2011; pour les cellules dendritiques, voir Zhao et al., 2012 ; pour les cellules NK, voir Abdelrazik et aL, 2011 ; pour les lymphocytes, voir Perico et al., 2011, Najar et al., 2010, Zhou et al., 2011 et Kronsteiner et al., 2011. Ladite cellule possédant un potentiel immunomodulateur (avant modulation de l'expression et/ou l'activité de la périostine) exprime la périostine. De préférence, ladite cellule possédant un potentiel immunomodulateur exprime aussi au moins une molécule immunomodulatrice, telle que IFN-f3, IDO-1, TSG-6, HLA-G, PGE2, TGF- p, galectine, HO-1, IL-6, IL-1RA, IL-33, AIRE ( autoimmune regulator ), hEGF, TNF, GM-CSF et/ou JAG1, bien connus de l'homme du métier, de préférence IFN-P, IDO-1, TSG-6, HLA-G et IL-1RA. La mesure de l'expression de ces gènes dans une cellule peut être effectuée par RT-PCR, tel que décrit dans les Exemples ci-après.
De manière avantageuse, ladite cellule possédant un potentiel immunomodulateur est choisie parmi une cellule stromale mésenchymateuse, une cellule progénitrice, une cellule précurseur, une cellule différenciée à partir d'une cellule stromale mésenchymateuse, un macrophage, un monocyte, un mastocyte, une cellule myéloïde, un fibroblaste, une cellule dendritique, un lymphocyte (par exemple un lymphocyte Treg), une cellule NK, une cellule lymphoïde et un myoblaste.
De manière avantageuse encore, ladite cellule stromale mésenchymateuse est choisie parmi une cellule stromale mésenchymateuse dérivée de la moelle osseuse (BM-MSC), du tissu adipeux (ASC ou AD-MSC), d'un tissu solide, du placenta, du sang adulte ou du sang de cordon.
De préférence, ladite cellule possédant un potentiel immunomodulateur est une cellule de mammifère, de préférence encore une cellule humaine.
Bien entendu, ladite cellule possédant un potentiel immunomodulateur est une cellule vivante.
En outre, ladite cellule possédant un potentiel immunomodulateur n'est pas une cellule cancéreuse.
On entend par moduler l'expression et/ou l'activité de la périostine , la modification de l'expression et/ou l'activité de la périostine par rapport à
une cellule possédant un potentiel immunomodulateur, soit par inhibition totale ou partielle de
7 PCT/1B2013/055111 l'expression et/ou de l'activité de ladite périostine y compris par inhibition de ses voies de signalisation soit par augmentation de l'expression et/ou de l'activité de ladite périostine (surexpression de ladite périostine ou stimulation des voies de signalisation de ladite périostine).
Le choix par l'homme du métier d'inhiber ou d'augmenter l'expression et/ou l'activité de ladite périostine comme indiqué précédemment s'effectue en fonction du résultat que l'on souhaite obtenir en termes d'immunomodulation, à savoir respectivement stimuler l'effet immunosuppresseur ou immunostimulateur de ladite cellule possédant un potentiel immunomodulateur. Ainsi, si l'homme du métier souhaite stimuler l'effet immunosuppresseur d'une cellule possédant un potentiel immunomodulateur, alors il est nécessaire d'inhiber l'expression et/ou l'activité de ladite périostine, incluant l'inhibition de ses voies de signalisation, dans ladite cellule. Si l'homme du métier souhaite stimuler l'effet immunostimulateur d'une cellule possédant un potentiel immunomodulateur alors il est nécessaire d'augmenter l'expression et/ou l'activité de ladite périostine, incluant la stimulation de ses voies de signalisation, dans ladite cellule.
La détermination du potentiel immunosuppresseur (ou des propriétés immunosuppressives) ou du potentiel immunostimulateur (ou des propriétés immunostimulatrices) d'une cellule selon la présente invention peut être réalisée en mesurant l'expression des ARNm des gènes impliqués dans l'immunomodulation, tels que les gènes codant pour les protéines IFN-fl, IDO-1, TSG-6, HLA-G, PGE2, TGF- p, galectine, HO-1, IL-6, IL-1RA, IL-33, AIRE, hEGF, TNF, GM-CSF et/ou JAG1, ou en mesurant le contenu de ces protéines dans cette cellule.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite cellule isolée possédant un potentiel immunomodulateur, dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est totalement ou partiellement inhibée, ou le surnageant de culture de cette cellule, est utile comme médicament immunosuppresseur destiné à la régénération (reconstruction) d'un tissu, la greffe d'organe (pour limiter les rejets), telle que la transplantation rénale, ou dans le traitement :
- de la maladie du greffon contre l'hôte (GVHD), - des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, telles que la maladie de Crohn, la maladie c liaque et le syndrome de l'intestin irritable ;
Le choix par l'homme du métier d'inhiber ou d'augmenter l'expression et/ou l'activité de ladite périostine comme indiqué précédemment s'effectue en fonction du résultat que l'on souhaite obtenir en termes d'immunomodulation, à savoir respectivement stimuler l'effet immunosuppresseur ou immunostimulateur de ladite cellule possédant un potentiel immunomodulateur. Ainsi, si l'homme du métier souhaite stimuler l'effet immunosuppresseur d'une cellule possédant un potentiel immunomodulateur, alors il est nécessaire d'inhiber l'expression et/ou l'activité de ladite périostine, incluant l'inhibition de ses voies de signalisation, dans ladite cellule. Si l'homme du métier souhaite stimuler l'effet immunostimulateur d'une cellule possédant un potentiel immunomodulateur alors il est nécessaire d'augmenter l'expression et/ou l'activité de ladite périostine, incluant la stimulation de ses voies de signalisation, dans ladite cellule.
La détermination du potentiel immunosuppresseur (ou des propriétés immunosuppressives) ou du potentiel immunostimulateur (ou des propriétés immunostimulatrices) d'une cellule selon la présente invention peut être réalisée en mesurant l'expression des ARNm des gènes impliqués dans l'immunomodulation, tels que les gènes codant pour les protéines IFN-fl, IDO-1, TSG-6, HLA-G, PGE2, TGF- p, galectine, HO-1, IL-6, IL-1RA, IL-33, AIRE, hEGF, TNF, GM-CSF et/ou JAG1, ou en mesurant le contenu de ces protéines dans cette cellule.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite cellule isolée possédant un potentiel immunomodulateur, dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est totalement ou partiellement inhibée, ou le surnageant de culture de cette cellule, est utile comme médicament immunosuppresseur destiné à la régénération (reconstruction) d'un tissu, la greffe d'organe (pour limiter les rejets), telle que la transplantation rénale, ou dans le traitement :
- de la maladie du greffon contre l'hôte (GVHD), - des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, telles que la maladie de Crohn, la maladie c liaque et le syndrome de l'intestin irritable ;
8 PCT/1B2013/055111 - des rhumatismes inflammatoires chroniques, tels que l'arthrite, la polyarthrite rhumatoïde, la spondylarthrite ankylosante et le rhumatisme psoriasique ;
- des maladies inflammatoires chroniques du système nerveux central, telles que la sclérose en plaque et la sclérose latérale amyotrophique ;
- du lupus ;
- des thyroïdites auto-immunes ;
- des fistules anales complexes ;
- des réactions asthmatiques de type hypersensibilité retardée de type IV;
- des allergies ;
- des cicatrices inflammatoires, telles que les cicatrices hypertrophiques ;
- des nécroses tissulaires ;
- des maladies auto-immunes, telles que l'encéphalite auto-immune, la colite auto-immune et le lupus érythémateux systémique ;
- des ulcères ;
- du diabète ;
- des infections microbiennes, dues par exemples à une bactérie, un parasite protozoaire ou un virus.
Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, ladite cellule isolée, dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine, incluant ses voies de signalisation, est augmentée, ou le surnageant de culture de cette cellule, est utile comme médicament immunostimulateur destiné à la vaccination, c'est-à-dire un adjuvant vaccinal ou destiné au traitement :
- d'un cancer ou d'une infection liés à un déficit immunitaire ;
- d'un déficit sélectif ou combiné en immunoglobulines ;
- d'un déficit isolé en lymphocytes T;
- d'un déficit en purine nucléoside phosphorylase ;
- d'un déficit immunitaire combiné sévère par déficit en adénosine désaminase ;
- de l'hypogammaglobulinémie commune d'expression variable.
- des maladies inflammatoires chroniques du système nerveux central, telles que la sclérose en plaque et la sclérose latérale amyotrophique ;
- du lupus ;
- des thyroïdites auto-immunes ;
- des fistules anales complexes ;
- des réactions asthmatiques de type hypersensibilité retardée de type IV;
- des allergies ;
- des cicatrices inflammatoires, telles que les cicatrices hypertrophiques ;
- des nécroses tissulaires ;
- des maladies auto-immunes, telles que l'encéphalite auto-immune, la colite auto-immune et le lupus érythémateux systémique ;
- des ulcères ;
- du diabète ;
- des infections microbiennes, dues par exemples à une bactérie, un parasite protozoaire ou un virus.
Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, ladite cellule isolée, dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine, incluant ses voies de signalisation, est augmentée, ou le surnageant de culture de cette cellule, est utile comme médicament immunostimulateur destiné à la vaccination, c'est-à-dire un adjuvant vaccinal ou destiné au traitement :
- d'un cancer ou d'une infection liés à un déficit immunitaire ;
- d'un déficit sélectif ou combiné en immunoglobulines ;
- d'un déficit isolé en lymphocytes T;
- d'un déficit en purine nucléoside phosphorylase ;
- d'un déficit immunitaire combiné sévère par déficit en adénosine désaminase ;
- de l'hypogammaglobulinémie commune d'expression variable.
9 PCT/1B2013/055111 La périostine est bien connue de l'homme du métier. Les séquences d'acides aminés des quatre isoformes de la périostine humaine sont disponibles dans la base de données GANBANK sous les numéros d'accès GI:209863034 (NP 001129408.1 ;
isoforme 1), GI:209862911 (NP 001129406.1 ; isofonne 2), GI:209863011 (NP 001129407.1 ; isoforme 3) et GI:209863034 (NP 001129408.1 ; isoforme 4).
Au sens de la présente invention, on entend par périostine , ces quatre isoformes et leurs variants (ou mutants) fonctionnels.
La fonction d'un variant (ou mutant) de la périostine peut être déterminée selon des méthodes connues de l'homme du métier (voir pour revue Kudo et al., 2011).
L'inhibition totale ou partielle de l'expression et/ou de l'activité de la périostine peut être obtenue de diverses manières, par des méthodes connues en elles mêmes.
Cette inhibition peut être obtenue en intervenant en amont de la production de la périostine, par mutagenèse du gène codant pour cette protéine, ou bien par inhibition ou modification de la transcription ou de la traduction de la périostine.
La mutagenèse du gène codant pour la périostine peut intervenir au niveau de la séquence codante ou des séquences de régulation de l'expression, notamment du promoteur. On peut par exemple procéder à la délétion de tout ou partie dudit gène et/ou à l'insertion d'une séquence exogène (voir par exemple Rios et al., 2005).
On peut également introduire une ou plusieurs mutations ponctuelles avec des agents physiques (par exemple radiations) ou chimiques. Ces mutations ont pour conséquence de décaler le cadre de lecture et/ou d'introduire un codon stop dans la séquence et/ou de modifier le niveau de la transcription et/ou de la traduction du gène et/ou de rendre la périostine moins active que la périostine sauvage. Les allèles mutés du gène codant pour la périostine peuvent être identifiés par exemple par PCR à l'aide d'amorces spécifiques dudit gène (voir par exemple Rios et al., 2005).
On peut aussi effectuer une mutagenèse dirigée, ciblant un gène codant pour ladite périostine. L'inhibition ou la modification de la transcription et/ou de la traduction peuvent être obtenues par l'expression d'ARNs sens, antisens ou double-brin dérivés du gène de ladite périostine, ou de l'ADNc de cette protéine, ou bien par l'utilisation d'ARNs interférents.
isoforme 1), GI:209862911 (NP 001129406.1 ; isofonne 2), GI:209863011 (NP 001129407.1 ; isoforme 3) et GI:209863034 (NP 001129408.1 ; isoforme 4).
Au sens de la présente invention, on entend par périostine , ces quatre isoformes et leurs variants (ou mutants) fonctionnels.
La fonction d'un variant (ou mutant) de la périostine peut être déterminée selon des méthodes connues de l'homme du métier (voir pour revue Kudo et al., 2011).
L'inhibition totale ou partielle de l'expression et/ou de l'activité de la périostine peut être obtenue de diverses manières, par des méthodes connues en elles mêmes.
Cette inhibition peut être obtenue en intervenant en amont de la production de la périostine, par mutagenèse du gène codant pour cette protéine, ou bien par inhibition ou modification de la transcription ou de la traduction de la périostine.
La mutagenèse du gène codant pour la périostine peut intervenir au niveau de la séquence codante ou des séquences de régulation de l'expression, notamment du promoteur. On peut par exemple procéder à la délétion de tout ou partie dudit gène et/ou à l'insertion d'une séquence exogène (voir par exemple Rios et al., 2005).
On peut également introduire une ou plusieurs mutations ponctuelles avec des agents physiques (par exemple radiations) ou chimiques. Ces mutations ont pour conséquence de décaler le cadre de lecture et/ou d'introduire un codon stop dans la séquence et/ou de modifier le niveau de la transcription et/ou de la traduction du gène et/ou de rendre la périostine moins active que la périostine sauvage. Les allèles mutés du gène codant pour la périostine peuvent être identifiés par exemple par PCR à l'aide d'amorces spécifiques dudit gène (voir par exemple Rios et al., 2005).
On peut aussi effectuer une mutagenèse dirigée, ciblant un gène codant pour ladite périostine. L'inhibition ou la modification de la transcription et/ou de la traduction peuvent être obtenues par l'expression d'ARNs sens, antisens ou double-brin dérivés du gène de ladite périostine, ou de l'ADNc de cette protéine, ou bien par l'utilisation d'ARNs interférents.
10 PCT/1B2013/055111 Les techniques de modifications génétiques des cellules sont connues de l'homme du métier. A titre d'exemple, Casteilla et al., 2008, décrit une méthode de transfert de gène dans les cellules dérivées du tissu adipeux à l'aide de vecteurs viraux.
Selon ce mode de mise en oeuvre de la présente invention, on peut utiliser une construction d'ADN recombinant, comprenant un ou plusieurs polynucléotides capables d'inhiber l'expression de la périostine. A titre d'exemples non limitatifs, lesdits polynucléotides peuvent coder pour des ARN antisens, tels que des oligonucléotides antisens morpholino, des ARN en épingle à cheveux, des ARN interférents (ARN
double brin non codants d'une longueur d'environ 21 à 25 nucléotides), des shRNA, des micro-ARN (ARN simple brin non codants d'une longueur d'environ 21 à 25 nucléotides), des aptamères, ou des ribozymes ciblant un gène codant pour la périostine.
De préférence, ledit polynucléotide capable d'inhiber l'expression de la périostine est un ARN interférent (ARNi ou siRNA ).
Selon une disposition avantageuse, on peut utiliser l'ARNi de séquence SEQ ID NO : 1.
L'homme du métier dispose d'un très large choix d'éléments utilisables pour l'obtention de constructions d'ADN recombinant conformes à ce mode de mise en oeuvre de l'invention.
On peut également utiliser des anticorps bloquant dirigés contre la périostine ou des inhibiteurs de la périostine. De tels anticorps sont décrit par Zhu et al., 2011 et Orecchia et al., 2011.
L'augmentation de l'expression (i.e., surexpression) et/ou de l'activité de la périostine dans une cellule possédant un potentiel immunomodulateur telle que définie ci-dessus, peut être effectuée par la modification du génome de ladite cellule, par stimulation des voies de signalisation de la périostine dans ladite cellule ou par l'utilisation de médiateurs induisant l'expression de la périostine.
Cette modification du génome peut notamment s'effectuer par transformation génétique de ladite cellule par une ou plusieurs copies d'un polynucléotide codant pour ladite périostine, associé à des séquences de régulation en cis de son expression. La surexpression de ladite périostine peut également être obtenue par modification des séquences de régulation en cis de l'expression de ladite périostine, par exemple en remplaçant son promoteur endogène par un promoteur plus fort, permettant un
Selon ce mode de mise en oeuvre de la présente invention, on peut utiliser une construction d'ADN recombinant, comprenant un ou plusieurs polynucléotides capables d'inhiber l'expression de la périostine. A titre d'exemples non limitatifs, lesdits polynucléotides peuvent coder pour des ARN antisens, tels que des oligonucléotides antisens morpholino, des ARN en épingle à cheveux, des ARN interférents (ARN
double brin non codants d'une longueur d'environ 21 à 25 nucléotides), des shRNA, des micro-ARN (ARN simple brin non codants d'une longueur d'environ 21 à 25 nucléotides), des aptamères, ou des ribozymes ciblant un gène codant pour la périostine.
De préférence, ledit polynucléotide capable d'inhiber l'expression de la périostine est un ARN interférent (ARNi ou siRNA ).
Selon une disposition avantageuse, on peut utiliser l'ARNi de séquence SEQ ID NO : 1.
L'homme du métier dispose d'un très large choix d'éléments utilisables pour l'obtention de constructions d'ADN recombinant conformes à ce mode de mise en oeuvre de l'invention.
On peut également utiliser des anticorps bloquant dirigés contre la périostine ou des inhibiteurs de la périostine. De tels anticorps sont décrit par Zhu et al., 2011 et Orecchia et al., 2011.
L'augmentation de l'expression (i.e., surexpression) et/ou de l'activité de la périostine dans une cellule possédant un potentiel immunomodulateur telle que définie ci-dessus, peut être effectuée par la modification du génome de ladite cellule, par stimulation des voies de signalisation de la périostine dans ladite cellule ou par l'utilisation de médiateurs induisant l'expression de la périostine.
Cette modification du génome peut notamment s'effectuer par transformation génétique de ladite cellule par une ou plusieurs copies d'un polynucléotide codant pour ladite périostine, associé à des séquences de régulation en cis de son expression. La surexpression de ladite périostine peut également être obtenue par modification des séquences de régulation en cis de l'expression de ladite périostine, par exemple en remplaçant son promoteur endogène par un promoteur plus fort, permettant un
11 PCT/1B2013/055111 niveau de transcription plus élevé, ou bien en adjoignant au promoteur endogène des séquences activatrices de la transcription, de type amplificateur , ou de la traduction.
Selon une modalité de ce mode de mise en oeuvre de la présente invention, on utilise une cassette d'expression, comprenant un polynucléotide codant pour une périostine telle que définie ci-dessus, placé sous le contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié. Ledit promoteur peut être un promoteur hétérologue. Dans ce cas, on peut utiliser par exemple un promoteur constitutif, tel que les promoteurs CMV, f3-actine, EF1-a, PGK et de l'Ubiquitine C, un promoteur spécifique d'un tissu donné ou un promoteur localement inductible.
On peut également utiliser des vecteurs recombinants, résultant de l'insertion d'une cassette d'expression telle que décrite ci-dessus dans un vecteur hôte.
Les cassettes d'expression et vecteurs recombinants tels que décrits ci-dessus peuvent, bien entendu, comprendre en outre d'autres séquences, usuellement employées dans ce type de constructions. Le choix de ces autres séquences sera effectué, de manière classique, par l'homme du métier en fonction notamment de critères tels que les cellules-hôtes choisies, les protocoles de transformation envisagés, etc.
On citera, à titre d'exemples non limitatifs, les terminateurs de transcription et les séquences de tête (séquences leader ). Ces séquences peuvent être celles qui sont naturellement associées au gène codant la périostine telle que définie ci-dessus, ou bien peuvent être des séquences hétérologues. Ces séquences n'interviennent pas sur les propriétés spécifiques du promoteur ou du gène auxquelles elles sont associées, mais peuvent améliorer globalement qualitativement ou quantitativement, la transcription, et le cas échéant, la traduction. On peut également, dans le but d'augmenter le niveau d'expression, utiliser des séquences amplificatrices (séquences enhancer ) de la transcription et de la traduction.
Panni les autres séquences couramment employées dans la construction de cassettes d'expression et vecteurs recombinants, on citera également les séquences permettant le suivi de la transformation, et l'identification et/ou la sélection des cellules transformées.
La stimulation de la voie de signalisation de la périostine peut être effectuée en stimulant la voie de signalisation de TGF-13 ou la voie de signalisation de la
Selon une modalité de ce mode de mise en oeuvre de la présente invention, on utilise une cassette d'expression, comprenant un polynucléotide codant pour une périostine telle que définie ci-dessus, placé sous le contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié. Ledit promoteur peut être un promoteur hétérologue. Dans ce cas, on peut utiliser par exemple un promoteur constitutif, tel que les promoteurs CMV, f3-actine, EF1-a, PGK et de l'Ubiquitine C, un promoteur spécifique d'un tissu donné ou un promoteur localement inductible.
On peut également utiliser des vecteurs recombinants, résultant de l'insertion d'une cassette d'expression telle que décrite ci-dessus dans un vecteur hôte.
Les cassettes d'expression et vecteurs recombinants tels que décrits ci-dessus peuvent, bien entendu, comprendre en outre d'autres séquences, usuellement employées dans ce type de constructions. Le choix de ces autres séquences sera effectué, de manière classique, par l'homme du métier en fonction notamment de critères tels que les cellules-hôtes choisies, les protocoles de transformation envisagés, etc.
On citera, à titre d'exemples non limitatifs, les terminateurs de transcription et les séquences de tête (séquences leader ). Ces séquences peuvent être celles qui sont naturellement associées au gène codant la périostine telle que définie ci-dessus, ou bien peuvent être des séquences hétérologues. Ces séquences n'interviennent pas sur les propriétés spécifiques du promoteur ou du gène auxquelles elles sont associées, mais peuvent améliorer globalement qualitativement ou quantitativement, la transcription, et le cas échéant, la traduction. On peut également, dans le but d'augmenter le niveau d'expression, utiliser des séquences amplificatrices (séquences enhancer ) de la transcription et de la traduction.
Panni les autres séquences couramment employées dans la construction de cassettes d'expression et vecteurs recombinants, on citera également les séquences permettant le suivi de la transformation, et l'identification et/ou la sélection des cellules transformées.
La stimulation de la voie de signalisation de la périostine peut être effectuée en stimulant la voie de signalisation de TGF-13 ou la voie de signalisation de la
12 PCT/1B2013/055111 protéine morphogénétique osseuse (BMP) dans ladite cellule immunomodulatrice (voir pour revue Frangogiannis, 2012).
A titre d'exemples de médiateurs induisant l'expression de périostine, on peut citer l'angiotensine II, les cytokines IL-4 et IL-13 (voir pour revue Frangogiannis, 2012).
Le surnageant de culture d'une cellule isolée possédant un potentiel immunomodulateur, dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est modulée, telle que définie ci-dessus, peut être obtenu par culture de ladite cellule dans un milieu de culture approprié, et récupération et filtration du surnageant de culture.
La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant une cellule isolée possédant un potentiel immunomodulateur dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est modulée, ou le surnageant de culture de ladite cellule, tels que définis ci-dessus et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite composition, ledit véhicule pharmaceutiquement acceptable est adapté à la thérapie cellulaire. La préparation de cellules stromales pour leurs utilisations en thérapie cellulaire est bien connue de l'homme du métier (Le Blanc et al., 2008, Constantin et al., 2009, Garcia-Olmo et al., 2009, Gonzàlez et al., 2009a et 2009b et Karussis et al., 2010).
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une cellule isolée possédant un potentiel immunomodulateur dans laquelle l'expression et/ou l'activité
de la périostine est modulée, ou le surnageant de culture de ladite cellule, ou d'une composition pharmaceutique, tels que définis ci-dessus, pour la fabrication d'un médicament immunosuppresseur ou immunostimulateur tels que définis ci-dessus.
La présente invention a également pour objet une méthode pour la régénération d'un tissu, la greffe d'organe ou pour traiter ou prévenir une maladie telles que définie ci-dessus, comprenant l'administration audit sujet d'une quantité
thérapeutiquement efficace d'une cellule isolée possédant un potentiel immunomodulateur dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est modulée, ou le surnageant de culture de ladite cellule, ou d'une composition pharmaceutique tels que définis ci-dessus.
La présente invention a également pour objet l'utilisation in vitro d'une cellule isolée possédant un potentiel immunomodulateur dans laquelle l'expression et/ou
A titre d'exemples de médiateurs induisant l'expression de périostine, on peut citer l'angiotensine II, les cytokines IL-4 et IL-13 (voir pour revue Frangogiannis, 2012).
Le surnageant de culture d'une cellule isolée possédant un potentiel immunomodulateur, dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est modulée, telle que définie ci-dessus, peut être obtenu par culture de ladite cellule dans un milieu de culture approprié, et récupération et filtration du surnageant de culture.
La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant une cellule isolée possédant un potentiel immunomodulateur dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est modulée, ou le surnageant de culture de ladite cellule, tels que définis ci-dessus et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite composition, ledit véhicule pharmaceutiquement acceptable est adapté à la thérapie cellulaire. La préparation de cellules stromales pour leurs utilisations en thérapie cellulaire est bien connue de l'homme du métier (Le Blanc et al., 2008, Constantin et al., 2009, Garcia-Olmo et al., 2009, Gonzàlez et al., 2009a et 2009b et Karussis et al., 2010).
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une cellule isolée possédant un potentiel immunomodulateur dans laquelle l'expression et/ou l'activité
de la périostine est modulée, ou le surnageant de culture de ladite cellule, ou d'une composition pharmaceutique, tels que définis ci-dessus, pour la fabrication d'un médicament immunosuppresseur ou immunostimulateur tels que définis ci-dessus.
La présente invention a également pour objet une méthode pour la régénération d'un tissu, la greffe d'organe ou pour traiter ou prévenir une maladie telles que définie ci-dessus, comprenant l'administration audit sujet d'une quantité
thérapeutiquement efficace d'une cellule isolée possédant un potentiel immunomodulateur dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est modulée, ou le surnageant de culture de ladite cellule, ou d'une composition pharmaceutique tels que définis ci-dessus.
La présente invention a également pour objet l'utilisation in vitro d'une cellule isolée possédant un potentiel immunomodulateur dans laquelle l'expression et/ou
13 PCT/1B2013/055111 l'activité de la périostine est modulée, telle que définie ci-dessus, pour identifier (ou cribler) un produit modifiant les effets de la périostine dans ladite cellule.
La présente invention a également pour objet un modèle in vitro pour réaliser des tests pharmacologiques ou toxicologiques, comprenant une cellule isolée possédant un potentiel immunomodulateur dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est modulée, telle que définie ci-dessus, pour identifier (ou cribler) un produit modifiant les effets de la périostine dans ladite cellule.
La présente invention a également pour objet -une protéine choisie parmi la périostine et une protéine comprenant le premier, deuxième, troisième et/ou quatrième domaine FAS1, préférentiellement le deuxième domaine FAS1, de la périostine, de préférence la périostine, -une molécule d'acide nucléique comprenant une séquence codant pour ladite protéine ou - une composition pharmaceutique comprenant ladite protéine ou ladite molécule d'acide nucléique, et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable, pour son utilisation comme médicament immunostimulateur destiné à
la vaccination, c'est-à-dire un adjuvant vaccinal ou dans le traitement d'un cancer ou d'une infection liés à un déficit immunitaire, d'un déficit sélectif ou combiné en immunoglobulines, d'un déficit isolé en lymphocytes T, d'un déficit en purine nucléoside phosphorylase, d'un déficit immunitaire combiné sévère par déficit en adénosine désaminase, ou de l'hypogammaglobulinémie commune d'expression variable.
L'invention englobe la périostine naturelle, recombinante ou synthétique.
Par périostine recombinante on entend la périostine produite par génie génétique, par exemple par clonage et amplification génique.
Par périostine synthétique on entend la périostine produite par synthèse enzymatique et/ou chimique.
Ladite périostine peut être d'origine humaine telle que décrite ci-dessus, ou d'origine animale.
La molécule d'acide nucléique codant pour ladite protéine est obtenue par des méthodes classiques, connues en elles-mêmes de l'homme du métier, en suivant les protocoles standards (voir par exemple la Demande Internationale WO
2010/025555).
La présente invention a également pour objet un modèle in vitro pour réaliser des tests pharmacologiques ou toxicologiques, comprenant une cellule isolée possédant un potentiel immunomodulateur dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est modulée, telle que définie ci-dessus, pour identifier (ou cribler) un produit modifiant les effets de la périostine dans ladite cellule.
La présente invention a également pour objet -une protéine choisie parmi la périostine et une protéine comprenant le premier, deuxième, troisième et/ou quatrième domaine FAS1, préférentiellement le deuxième domaine FAS1, de la périostine, de préférence la périostine, -une molécule d'acide nucléique comprenant une séquence codant pour ladite protéine ou - une composition pharmaceutique comprenant ladite protéine ou ladite molécule d'acide nucléique, et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable, pour son utilisation comme médicament immunostimulateur destiné à
la vaccination, c'est-à-dire un adjuvant vaccinal ou dans le traitement d'un cancer ou d'une infection liés à un déficit immunitaire, d'un déficit sélectif ou combiné en immunoglobulines, d'un déficit isolé en lymphocytes T, d'un déficit en purine nucléoside phosphorylase, d'un déficit immunitaire combiné sévère par déficit en adénosine désaminase, ou de l'hypogammaglobulinémie commune d'expression variable.
L'invention englobe la périostine naturelle, recombinante ou synthétique.
Par périostine recombinante on entend la périostine produite par génie génétique, par exemple par clonage et amplification génique.
Par périostine synthétique on entend la périostine produite par synthèse enzymatique et/ou chimique.
Ladite périostine peut être d'origine humaine telle que décrite ci-dessus, ou d'origine animale.
La molécule d'acide nucléique codant pour ladite protéine est obtenue par des méthodes classiques, connues en elles-mêmes de l'homme du métier, en suivant les protocoles standards (voir par exemple la Demande Internationale WO
2010/025555).
14 PCT/1B2013/055111 Ladite molécule d'acide nucléique peut se présenter sous la foime d'un vecteur recombinant eucaryote ou procaryote, comprenant un insert constitué
par un polynucléotide codant pour la périostine. De nombreux vecteurs dans lesquels on peut insérer un polynucléotide d'intérêt afin de l'introduire et de le maintenir dans une cellule hôte eucaryote ou procaryote, sont connus en eux-mêmes ; le choix d'un vecteur approprié
dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple expression de cette séquence ou intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte. Par exemple, on peut utiliser des vecteurs viraux ou non-viraux comme des plasmides.
De préférence, ledit vecteur recombinant est un vecteur d'expression dans lequel ledit polynucléotide est placé sous le contrôle d'éléments régulateurs de la transcription et de la traduction appropriés.
La présente invention a également pour objet un inhibiteur de la périostine sélectionné dans le groupe constitué par un anticorps bloquant anti-périostine, un ARN antisens, un oligonucléotide antisens morpholino, un ARN en épingle à
cheveux, un ARN interférent (ARNi), un aptamère dirigés contre la périostine, ou une composition pharmaceutique comprenant ledit inhibiteur et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable, pour son utilisation comme médicament immunosuppresseur destiné à
la régénération d'un tissu, à la greffe d'organe ou dans le traitement d'une maladie choisie dans le groupe constitué par la maladie du greffon contre l'hôte, les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, les rhumatismes inflammatoires chroniques, les maladies inflammatoires chroniques du système nerveux central, le lupus, les thyroïdites auto-immunes, les fistules anales complexes, les réactions asthmatiques de type hypersensibilité retardée de type IV, les cicatrices inflammatoires, les allergies, les nécroses tissulaires, les maladies auto-immunes, les ulcères, le diabète et les infections microbiennes.
La préparation d'anticorps anti-périostine est connue de l'homme du métier (voir Demande EP 2168599 Al). A titre d'exemple, d'anticorps bloquant anti-périostine humaine ont peut cités ceux décrits par Orecchia et al., 2011 et Zhu et al., 2011.
Selon une disposition avantageuse, on peut utiliser l'ARNi de séquence SEQ ID NO : 1.
A titre d'exemples non limitatifs de véhicule pharmaceutiquement
par un polynucléotide codant pour la périostine. De nombreux vecteurs dans lesquels on peut insérer un polynucléotide d'intérêt afin de l'introduire et de le maintenir dans une cellule hôte eucaryote ou procaryote, sont connus en eux-mêmes ; le choix d'un vecteur approprié
dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple expression de cette séquence ou intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte. Par exemple, on peut utiliser des vecteurs viraux ou non-viraux comme des plasmides.
De préférence, ledit vecteur recombinant est un vecteur d'expression dans lequel ledit polynucléotide est placé sous le contrôle d'éléments régulateurs de la transcription et de la traduction appropriés.
La présente invention a également pour objet un inhibiteur de la périostine sélectionné dans le groupe constitué par un anticorps bloquant anti-périostine, un ARN antisens, un oligonucléotide antisens morpholino, un ARN en épingle à
cheveux, un ARN interférent (ARNi), un aptamère dirigés contre la périostine, ou une composition pharmaceutique comprenant ledit inhibiteur et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable, pour son utilisation comme médicament immunosuppresseur destiné à
la régénération d'un tissu, à la greffe d'organe ou dans le traitement d'une maladie choisie dans le groupe constitué par la maladie du greffon contre l'hôte, les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, les rhumatismes inflammatoires chroniques, les maladies inflammatoires chroniques du système nerveux central, le lupus, les thyroïdites auto-immunes, les fistules anales complexes, les réactions asthmatiques de type hypersensibilité retardée de type IV, les cicatrices inflammatoires, les allergies, les nécroses tissulaires, les maladies auto-immunes, les ulcères, le diabète et les infections microbiennes.
La préparation d'anticorps anti-périostine est connue de l'homme du métier (voir Demande EP 2168599 Al). A titre d'exemple, d'anticorps bloquant anti-périostine humaine ont peut cités ceux décrits par Orecchia et al., 2011 et Zhu et al., 2011.
Selon une disposition avantageuse, on peut utiliser l'ARNi de séquence SEQ ID NO : 1.
A titre d'exemples non limitatifs de véhicule pharmaceutiquement
15 PCT/1B2013/055111 acceptable, on peut citer les dispersants, solubilisants, stabilisants, conservateurs, etc. Des véhicules pharmaceutiquement acceptables utilisables dans des formulations (liquides et/ou injectables et/ou solides) sont notamment la méthylcellulose, l'hydroxyméthylcellulose, la carboxyméthylcellulose, les cyclodextrines, le polysorbate 80, le mannitol, la gélatine, le lactose, des huiles végétales ou animales, l'acacia, etc.
Ledit médicament ou ladite composition pharmaceutique peut se présenter sous la forme d'une solution saline, physiologique, isotonique et tamponnée, compatible avec un usage pharmaceutique et connu de l'homme du métier.
La quantité de ladite protéine ou dudit inhibiteur de la périostine utilisée à titre de médicament selon l'invention ou présente dans la composition pharmaceutique selon l'invention peut être modulée de façon à obtenir un taux circulant de principe actif (dans un liquide physiologique tel que le sang) nécessaire à l'obtention de l'effet thérapeutique désiré pour un sujet particulier. La quantité choisie dépendra de multiples facteurs, en particulier de la voie d'administration, de la durée d'administration, du moment de l'administration, de la vitesse d'élimination du composé, du ou des différents produits utilisés en combinaison avec ledit médicament ou ladite composition pharmaceutique, de l'âge, du poids et de la condition physique du patient, ainsi que de son histoire médicale, et de toutes autres informations connues en médecine.
Le médicament ou la composition pharmaceutique selon la présente invention peut être utilisé seul ou en association avec au moins un autre composé
thérapeutiquement actif, tel que par exemple un antigène ou un second composé
immunostimulateur ou immunosuppresseur selon l'utilisation désirée du médicament.
L'utilisation dudit médicament ou de ladite composition pharmaceutique, et dudit composé
thérapeutiquement actif peut être simultanée, séparée ou étalée dans le temps.
La présente invention a également pour objet une méthode de traitement ou de prévention, chez un sujet, d'un cancer ou d'une infection liés à un déficit immunitaire, d'un déficit sélectif ou combiné en immunoglobulines, d'un déficit isolé en lymphocytes T, d'un déficit en purine nucléoside phosphorylase, d'un déficit immunitaire combiné sévère par déficit en adénosine désaminase ou de l'hypogammaglobulinémie commune d'expression variable, comprenant l'administration audit sujet d'une quantité
thérapeutiquement efficace de ladite composition pharmaceutique comprenant ladite protéine (la périostine ou une protéine comprenant 1, 2, 3 ou 4 domaines FAS1 de la
Ledit médicament ou ladite composition pharmaceutique peut se présenter sous la forme d'une solution saline, physiologique, isotonique et tamponnée, compatible avec un usage pharmaceutique et connu de l'homme du métier.
La quantité de ladite protéine ou dudit inhibiteur de la périostine utilisée à titre de médicament selon l'invention ou présente dans la composition pharmaceutique selon l'invention peut être modulée de façon à obtenir un taux circulant de principe actif (dans un liquide physiologique tel que le sang) nécessaire à l'obtention de l'effet thérapeutique désiré pour un sujet particulier. La quantité choisie dépendra de multiples facteurs, en particulier de la voie d'administration, de la durée d'administration, du moment de l'administration, de la vitesse d'élimination du composé, du ou des différents produits utilisés en combinaison avec ledit médicament ou ladite composition pharmaceutique, de l'âge, du poids et de la condition physique du patient, ainsi que de son histoire médicale, et de toutes autres informations connues en médecine.
Le médicament ou la composition pharmaceutique selon la présente invention peut être utilisé seul ou en association avec au moins un autre composé
thérapeutiquement actif, tel que par exemple un antigène ou un second composé
immunostimulateur ou immunosuppresseur selon l'utilisation désirée du médicament.
L'utilisation dudit médicament ou de ladite composition pharmaceutique, et dudit composé
thérapeutiquement actif peut être simultanée, séparée ou étalée dans le temps.
La présente invention a également pour objet une méthode de traitement ou de prévention, chez un sujet, d'un cancer ou d'une infection liés à un déficit immunitaire, d'un déficit sélectif ou combiné en immunoglobulines, d'un déficit isolé en lymphocytes T, d'un déficit en purine nucléoside phosphorylase, d'un déficit immunitaire combiné sévère par déficit en adénosine désaminase ou de l'hypogammaglobulinémie commune d'expression variable, comprenant l'administration audit sujet d'une quantité
thérapeutiquement efficace de ladite composition pharmaceutique comprenant ladite protéine (la périostine ou une protéine comprenant 1, 2, 3 ou 4 domaines FAS1 de la
16 PCT/1B2013/055111 périostine) ou une molécule d'acide nucléique comprenant une séquence codant pour ladite protéine, telle que définie ci-dessus.
La présente invention a également pour objet une méthode de régénération d'un tissu, de greffe d'un organe ou de traitement ou de prévention d'une maladie choisie dans le groupe constitué par la maladie du greffon contre l'hôte, les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, les rhumatismes inflammatoires chroniques, les maladies inflammatoires chroniques du système nerveux central, le lupus, les thyroïdites auto-immunes, les fistules anales complexes, les réactions asthmatiques de type hypersensibilité retardée de type IV, les cicatrices inflammatoires, les allergies, les nécroses tissulaires, les maladies auto-immunes, les ulcères, le diabète et les infections microbiennes, chez un sujet, comprenant l'administration audit sujet d'une quantité
thérapeutiquement efficace de ladite composition pharmaceutique comprenant un anticorps bloquant anti-périostine, un ARN antisens, un oligonucléotide antisense morpholino, un ARN en épingle à cheveux, un ARN interférent (ARNi), un aptamère dirigés contre la périostine, telle que définie ci-dessus Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples montrant in vitro l'effet de la modulation de l'expression de la périostine dans les cellules stromales mésenchyrnateuses dérivées du tissu adipeux (ASC) sur le potentiel immunomodulateur de ces cellules, ainsi qu'aux figures annexées, dans lesquels :
- la Figure 1 représente l'effet de l'ARNi dirigé contre POSTN
(siRNA POSTN) et de l'ARNi non spécifique contrôle (siRNA scramble) sur la quantité
d'ARNm codant pour PUM1 (utilisé comme contrôle) dans les ASC traitées. A. La moyenne écart type à la moyenne (sem) après normalisation des valeurs est représentée sur le graphique. B. Le tableau représente les valeurs individuelles mesurées.
- la Figure 2 représente l'effet de l'ARNi dirigé contre POSTN
(siRNA POSTN) et de l'ARNi non spécifique contrôle (siRNA scramble) sur la quantité
d'ARNm codant pour la périostine dans les ASC traitées. A. La moyenne écart type à la moyenne (sem) est représentée après noimalisation des valeurs sur le graphique. B. Le tableau représente les valeurs individuelles mesurées.
La présente invention a également pour objet une méthode de régénération d'un tissu, de greffe d'un organe ou de traitement ou de prévention d'une maladie choisie dans le groupe constitué par la maladie du greffon contre l'hôte, les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, les rhumatismes inflammatoires chroniques, les maladies inflammatoires chroniques du système nerveux central, le lupus, les thyroïdites auto-immunes, les fistules anales complexes, les réactions asthmatiques de type hypersensibilité retardée de type IV, les cicatrices inflammatoires, les allergies, les nécroses tissulaires, les maladies auto-immunes, les ulcères, le diabète et les infections microbiennes, chez un sujet, comprenant l'administration audit sujet d'une quantité
thérapeutiquement efficace de ladite composition pharmaceutique comprenant un anticorps bloquant anti-périostine, un ARN antisens, un oligonucléotide antisense morpholino, un ARN en épingle à cheveux, un ARN interférent (ARNi), un aptamère dirigés contre la périostine, telle que définie ci-dessus Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples montrant in vitro l'effet de la modulation de l'expression de la périostine dans les cellules stromales mésenchyrnateuses dérivées du tissu adipeux (ASC) sur le potentiel immunomodulateur de ces cellules, ainsi qu'aux figures annexées, dans lesquels :
- la Figure 1 représente l'effet de l'ARNi dirigé contre POSTN
(siRNA POSTN) et de l'ARNi non spécifique contrôle (siRNA scramble) sur la quantité
d'ARNm codant pour PUM1 (utilisé comme contrôle) dans les ASC traitées. A. La moyenne écart type à la moyenne (sem) après normalisation des valeurs est représentée sur le graphique. B. Le tableau représente les valeurs individuelles mesurées.
- la Figure 2 représente l'effet de l'ARNi dirigé contre POSTN
(siRNA POSTN) et de l'ARNi non spécifique contrôle (siRNA scramble) sur la quantité
d'ARNm codant pour la périostine dans les ASC traitées. A. La moyenne écart type à la moyenne (sem) est représentée après noimalisation des valeurs sur le graphique. B. Le tableau représente les valeurs individuelles mesurées.
17 PCT/1B2013/055111 - la Figure 3 représente l'effet in vitro du traitement des ASC avec le ligand TLR3 Poly(I:C) seul ou en combinaison avec la périostine (POSTN) à une dose de 1, 2, 4, ou 10 kig/ml, sur l'expression de l'ARNm POSTN (A) et IDO1 (B).
- la Figure 4 représente le dosage de l'IDO-1 dans le surnagent de culture d'ASC traitées avec unARNi dirigé contre POSTN (siRNA POSTN) ou un ARNi non spécifique contrôle (siRNA scramble).
-la Figure 5 représente l'effet de l'ARNi dirigé contre POSTN
(siRNA POSTN) et de l'ARNi non spécifique contrôle (siRNA scramble) sur la quantité
d'ARNm codant pour POSTN, IDO1 (IDO) et IFN-13 (IFNB) dans les BM-MSC
traitées.
- la Figure 6 représente (A) l'effet in vitro du traitement des ASC
avec l'IFNy (A) à une dose de 4, 20, 100 ou 500 Ul/ml sur l'expression de PARNm POSTN et (B) l'effet in vitro du traitement des ASC avec l'IFNy à une dose de 100 Ul/ml en combinaison avec la périostine (POSTN) à une dose de 1, 2, 4, ou 10 tg/ml, sur l'expression de l'ARNm IDO1.
EXEMPLE 1: EFFET IN VITRO DE L'INHIBITION DE L'EXPRESSION DE LA
PERIOSTINE DANS LES CELLULES STROMALES MESENCHYMATEUSES
DERIVEES DU TISSU ADIPEUX (ASC) 1) Matériels et méthodes Isolement des cellules stromales mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux humain (ASC) La fraction stroma vasculaire (SVF) a été isolée à partir de tissu adipeux sous-cutané humain par digestion avec la collagénase NB4 (0,4 U/m1 final dans le milieu a-MEM + Ciprofloxacine 10 pg/rnl final [= milieu a-MEM OK]) pendant 45 min à
sous agitation. La digestion a été arrêtée en utilisant le milieu a-MEM OK
froid. La suspension cellulaire a ensuite été filtrée à travers une membrane de nylon 100 m. Après centrifugation pendant 10 min à 1600 rpm, les cellules ont été reprises dans le milieu de culture CPM (a-MEM OK + Héparine 1 U/ml + 2% de plasma enrichi en facteur de croissance plaquettaire) et comptées sur un automate Countesse, selon les informations du fabricant (LifeTechnologies).
Les cellules de la SVF ont été étalées à une densité de 4000 cellules/cm2 dans le milieu CPM. Après 12h de culture à 37 C et 5% de CO2, les cellules non adhérentes ont été retirées par lavage au PBS (phosphate-buffered saline). La fraction
- la Figure 4 représente le dosage de l'IDO-1 dans le surnagent de culture d'ASC traitées avec unARNi dirigé contre POSTN (siRNA POSTN) ou un ARNi non spécifique contrôle (siRNA scramble).
-la Figure 5 représente l'effet de l'ARNi dirigé contre POSTN
(siRNA POSTN) et de l'ARNi non spécifique contrôle (siRNA scramble) sur la quantité
d'ARNm codant pour POSTN, IDO1 (IDO) et IFN-13 (IFNB) dans les BM-MSC
traitées.
- la Figure 6 représente (A) l'effet in vitro du traitement des ASC
avec l'IFNy (A) à une dose de 4, 20, 100 ou 500 Ul/ml sur l'expression de PARNm POSTN et (B) l'effet in vitro du traitement des ASC avec l'IFNy à une dose de 100 Ul/ml en combinaison avec la périostine (POSTN) à une dose de 1, 2, 4, ou 10 tg/ml, sur l'expression de l'ARNm IDO1.
EXEMPLE 1: EFFET IN VITRO DE L'INHIBITION DE L'EXPRESSION DE LA
PERIOSTINE DANS LES CELLULES STROMALES MESENCHYMATEUSES
DERIVEES DU TISSU ADIPEUX (ASC) 1) Matériels et méthodes Isolement des cellules stromales mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux humain (ASC) La fraction stroma vasculaire (SVF) a été isolée à partir de tissu adipeux sous-cutané humain par digestion avec la collagénase NB4 (0,4 U/m1 final dans le milieu a-MEM + Ciprofloxacine 10 pg/rnl final [= milieu a-MEM OK]) pendant 45 min à
sous agitation. La digestion a été arrêtée en utilisant le milieu a-MEM OK
froid. La suspension cellulaire a ensuite été filtrée à travers une membrane de nylon 100 m. Après centrifugation pendant 10 min à 1600 rpm, les cellules ont été reprises dans le milieu de culture CPM (a-MEM OK + Héparine 1 U/ml + 2% de plasma enrichi en facteur de croissance plaquettaire) et comptées sur un automate Countesse, selon les informations du fabricant (LifeTechnologies).
Les cellules de la SVF ont été étalées à une densité de 4000 cellules/cm2 dans le milieu CPM. Après 12h de culture à 37 C et 5% de CO2, les cellules non adhérentes ont été retirées par lavage au PBS (phosphate-buffered saline). La fraction
18 PCT/1B2013/055111 adhérente a ensuite été mise en culture in vitro dans le même milieu de culture CPM ; le milieu étant renouvellé trois fois par semaine. Après 8 jours de culture, les ASC (passage 0) ont été récoltées avec de la trypsine-EDTA (LifeTechnologies). Le nombre de cellules viables a été déterminé par l'exclusion du Trypan bleu sur un automate Countesse. Les cellules ont ensuite été étalées à une densité de 2000 cellules/cm2 et cultivées pendant 2 jours supplémentaires (passage 1). Le traitement avec l'ARNi (siRNA) a ensuite été
effectué.
Isolement des cellules stromales mésenchymateuses issues de la moelle osseuse (BM-MSC) Des cellules de moelle osseuse nucléées humaines ont d'abord été
ensemencées à raison de 5x104 cellules/cm2 dans un milieu de culture consistant en le milieu essentiel minimum alpha (aMEM) supplémenté par 10% de sérum filtré de veau foetal (SVF ; Hyclone), 1 ng/ml de facteur de croissance fibroblastique 2 (FGF2, R&D
Système, Lille, France), et 10 p,g/mL de la ciprofloxacine. Tout le milieu a été renouvelé
deux fois par semaine jusqu'à ce que les cellules atteignent la confluence (fin de PO).
Ensuite, les cellules ont été détachées à l'aide de la trypsine. Les cellules viables ont été
numérotées et réensemencés à 500 cellules/cm2 (passage Pl).
Traitement avec l'ARNi L'ARNi dirigé contre la périostine (POSTN) a été fourni par SIGMA
(MISSION esiRNA Human POSTN, EHU069741). Cet ARNi est dirigé contre les 4 isfoimes de la périostine humaine. L'ARNi non spécifique AF488 a été fourni par QIAGEN (siARN AllStarNeg AF488).
Après 2 jours de culture, le milieu de culture des ASC ou des BM-MSC a été remplacé par le milieu de culture pour le traitement avec l'ARNi, préparé
comme décrit ci-dessous.
Brièvement, 2 1 d'ARNi à 28 p,M ont été dilués dans 100 pl de milieu a-MEM OK, mélangés au vortex pendant 10 secondes et ensuite mélangés avec 12 p,1 de réactif HiPerfect (QIAGEN). Après mélange à nouveau au vortex, la suspension obtenue a été laissée 10 min à température ambiante avant d'être mélangée à 2 ml de milieu CPM.
Les cellules ASC ont alors été ajoutées à ce milieu. Les cellules ont ensuite été cultivées 4 jours dans ce milieu à 37 C et 5% de CO2.
effectué.
Isolement des cellules stromales mésenchymateuses issues de la moelle osseuse (BM-MSC) Des cellules de moelle osseuse nucléées humaines ont d'abord été
ensemencées à raison de 5x104 cellules/cm2 dans un milieu de culture consistant en le milieu essentiel minimum alpha (aMEM) supplémenté par 10% de sérum filtré de veau foetal (SVF ; Hyclone), 1 ng/ml de facteur de croissance fibroblastique 2 (FGF2, R&D
Système, Lille, France), et 10 p,g/mL de la ciprofloxacine. Tout le milieu a été renouvelé
deux fois par semaine jusqu'à ce que les cellules atteignent la confluence (fin de PO).
Ensuite, les cellules ont été détachées à l'aide de la trypsine. Les cellules viables ont été
numérotées et réensemencés à 500 cellules/cm2 (passage Pl).
Traitement avec l'ARNi L'ARNi dirigé contre la périostine (POSTN) a été fourni par SIGMA
(MISSION esiRNA Human POSTN, EHU069741). Cet ARNi est dirigé contre les 4 isfoimes de la périostine humaine. L'ARNi non spécifique AF488 a été fourni par QIAGEN (siARN AllStarNeg AF488).
Après 2 jours de culture, le milieu de culture des ASC ou des BM-MSC a été remplacé par le milieu de culture pour le traitement avec l'ARNi, préparé
comme décrit ci-dessous.
Brièvement, 2 1 d'ARNi à 28 p,M ont été dilués dans 100 pl de milieu a-MEM OK, mélangés au vortex pendant 10 secondes et ensuite mélangés avec 12 p,1 de réactif HiPerfect (QIAGEN). Après mélange à nouveau au vortex, la suspension obtenue a été laissée 10 min à température ambiante avant d'être mélangée à 2 ml de milieu CPM.
Les cellules ASC ont alors été ajoutées à ce milieu. Les cellules ont ensuite été cultivées 4 jours dans ce milieu à 37 C et 5% de CO2.
19 PCT/1B2013/055111 Extraction des ARN
Après 4 jours de culture, le milieu de culture des a été retiré et les cellules ont été congelées à -80 C. L'extraction des ARNs a été effectuée selon les instructions du fabricant (RNeasy minikit, QIAGEN). Les ARN ont été quantifiés à l'aide de l'automate Nanodrop (ThermoScientific) et 1 tig dARN a été rétro-transcrit en utilisant le kit SuperScript One Step RT selon les recommandations du fabricant (LifeTechnologies).
RT-PCR quantitative (RT-qPCR) La quantification des ADNc a été réalisée en utilisant la technologie StepOnePlus et le Mix SybrGreen selon les instructions du fabricant (LifeTechnologies).
Amorces Les amorces utilisées pour la quantification des ARN sont les suivantes:
Tableau 1 :
Gène Amorce sens 5'-3' Amorce antisens 5'-3' PUMI AGTGGGGGACTAGGCGTTAG GTTTTCATCACTGTCTGCATCC
(SEQ ID NO : 2) (SEQ ID NO : 3) IFN-fl CCTGTGGCAATTGAATGGG GGCGTCCTCCTTCTGGAAC
(SEQ BD NO :4) (SEQ ID NO: 5) (SEQ ID NO :6) (SEQ ID NO: 7) (SEQ LD NO : 8) (SEQ ID NO : 9) HLA-G GAAGAGGAGACACGGAACACCA TCGCAGCCAATCATCCACTGGA
(SEQ ID NO : 10) (SEQ ID NO : 11) (SEQ ID NO: 12) (SEQ ID NO: 13) AIRE CAGACCATGTCAGCTTCAGTCC ACCTGGATGCACTTCTTGGAGC
(SEQ II) NO: 14) (SEQ ID NO: 15) POSTN CAGCAAACCACCTTCACGGATC TTAAGGAGGCGCTGAACCATGC
(SEQ ID NO : 16) (SEQ ID NO : 17) Pumillo-1 (PUM1) est utilisé en tant que gène de référence.
Après 4 jours de culture, le milieu de culture des a été retiré et les cellules ont été congelées à -80 C. L'extraction des ARNs a été effectuée selon les instructions du fabricant (RNeasy minikit, QIAGEN). Les ARN ont été quantifiés à l'aide de l'automate Nanodrop (ThermoScientific) et 1 tig dARN a été rétro-transcrit en utilisant le kit SuperScript One Step RT selon les recommandations du fabricant (LifeTechnologies).
RT-PCR quantitative (RT-qPCR) La quantification des ADNc a été réalisée en utilisant la technologie StepOnePlus et le Mix SybrGreen selon les instructions du fabricant (LifeTechnologies).
Amorces Les amorces utilisées pour la quantification des ARN sont les suivantes:
Tableau 1 :
Gène Amorce sens 5'-3' Amorce antisens 5'-3' PUMI AGTGGGGGACTAGGCGTTAG GTTTTCATCACTGTCTGCATCC
(SEQ ID NO : 2) (SEQ ID NO : 3) IFN-fl CCTGTGGCAATTGAATGGG GGCGTCCTCCTTCTGGAAC
(SEQ BD NO :4) (SEQ ID NO: 5) (SEQ ID NO :6) (SEQ ID NO: 7) (SEQ LD NO : 8) (SEQ ID NO : 9) HLA-G GAAGAGGAGACACGGAACACCA TCGCAGCCAATCATCCACTGGA
(SEQ ID NO : 10) (SEQ ID NO : 11) (SEQ ID NO: 12) (SEQ ID NO: 13) AIRE CAGACCATGTCAGCTTCAGTCC ACCTGGATGCACTTCTTGGAGC
(SEQ II) NO: 14) (SEQ ID NO: 15) POSTN CAGCAAACCACCTTCACGGATC TTAAGGAGGCGCTGAACCATGC
(SEQ ID NO : 16) (SEQ ID NO : 17) Pumillo-1 (PUM1) est utilisé en tant que gène de référence.
20 PCT/1B2013/055111 Analyses statistiques Les résultats des RT-PCR quantitatives sont exprimés en valeurs moyennes écart type à la moyenne (sem). L'analyse de la significativité a été effectuée en utilisant le test de Mann 84 Whitney ou le test t de Student (Prism 5 logiciels). (* P <0,05, ** P <0,01).
Activité de l'ID dans le surnageant de culture d'ASC traitées avec l'ARNi dirigé contre POSTN
L'activité de 1'IDO-1 (indoleamine 2,3-dioxygénase 1) a été déterminée par chromatographie en phase liquide à haute performance en mesurant la concentration en kynurénine dans le surnageant de culture des ASC traitées avec l'ARNi dirigé
contre POSTN ou un ARNi non spécifique, et en utilisant la 3-nitro-L-tyrosine comme étalon interne. La kynurénine et la 3-nitro-L-tyrosine ont été détectées par absorption UV à 360 nm.
2) Résultats Le traitement des ASC avec l'ARNi dirigé contre POSTN n'induit pas de modification significative de l'expression de PUM1 par rapport au traitement avec l'ARNi non spécifique (voir Figure 1). L'ARNi non spécifique peut donc être utilisé
comme ARNi contrôle.
La quantité d'ARNm codant pour la périostine a ensuite été déterminée par RT-qPCR après le traitement des ASC avec l'ARNi dirigé contre POSTN ou l'ARNi non spécifique. Les résultats sont représentés à la Figure 2. Ces résultats montrent que le traitement des ASC avec l'ARNi dirigé contre POSTN est efficace pour inhiber l'expression de POSTN dans ces cellules.
La quantité d'ARNm codant pour différentes protéines immunosuppressives a ensuite été déterminée par RT-qPCR après le traitement des ASC
avec l'ARNi dirigé contre POSTN ou l'ARNi non spécifique. Les résultats sont représentés au Tableau 2 ci-dessous.
Tableau 2 : effet de l'ARNi dirigé contre POSTN et de l'ARNi non spécifique contrôle sur la quantité d'ARNm codant pour la périostine (POSTN) et différentes protéines immunosuppressives dans les ASC traitées. Les moyennes écart type après normalisation des valeurs mesurées sont représentées.
Activité de l'ID dans le surnageant de culture d'ASC traitées avec l'ARNi dirigé contre POSTN
L'activité de 1'IDO-1 (indoleamine 2,3-dioxygénase 1) a été déterminée par chromatographie en phase liquide à haute performance en mesurant la concentration en kynurénine dans le surnageant de culture des ASC traitées avec l'ARNi dirigé
contre POSTN ou un ARNi non spécifique, et en utilisant la 3-nitro-L-tyrosine comme étalon interne. La kynurénine et la 3-nitro-L-tyrosine ont été détectées par absorption UV à 360 nm.
2) Résultats Le traitement des ASC avec l'ARNi dirigé contre POSTN n'induit pas de modification significative de l'expression de PUM1 par rapport au traitement avec l'ARNi non spécifique (voir Figure 1). L'ARNi non spécifique peut donc être utilisé
comme ARNi contrôle.
La quantité d'ARNm codant pour la périostine a ensuite été déterminée par RT-qPCR après le traitement des ASC avec l'ARNi dirigé contre POSTN ou l'ARNi non spécifique. Les résultats sont représentés à la Figure 2. Ces résultats montrent que le traitement des ASC avec l'ARNi dirigé contre POSTN est efficace pour inhiber l'expression de POSTN dans ces cellules.
La quantité d'ARNm codant pour différentes protéines immunosuppressives a ensuite été déterminée par RT-qPCR après le traitement des ASC
avec l'ARNi dirigé contre POSTN ou l'ARNi non spécifique. Les résultats sont représentés au Tableau 2 ci-dessous.
Tableau 2 : effet de l'ARNi dirigé contre POSTN et de l'ARNi non spécifique contrôle sur la quantité d'ARNm codant pour la périostine (POSTN) et différentes protéines immunosuppressives dans les ASC traitées. Les moyennes écart type après normalisation des valeurs mesurées sont représentées.
21 PCT/1B2013/055111 ARNi non spécifique ARNi POSTN
Protéine Moyenne sem Moyenne sem POSTN 1,00 0,00 0,08 0,03 IFN-P 1,00 0,00 289,38 120,77 IDO-1 1,00 0,00 92,74 72,18 TSG-6 1,00 0,00 1,89 0,59 HLA-G 1,00 0,00 3,70 1,64 IL-1RA 1,00 0,00 4,00 1,81 AIRE 1,00 0,00 2,15 0,48 Ces résultats montrent que l'inhibition de l'expression de POSTN par une stratégie d'ARN interférent induit une très forte augmentation de l'expression de 1'IFN-13 (Interféron béta) et de l'IDO-1 (Indoléamine- 2,3-dioxygénase 1) et une augmentation de l'expression de TSG-6 ( Tumor necrosis factor-inducible gene protein ), HLA-G (Antigène du complexe majeur d'histocompatibilité, Classe I, G), IL-1RA (Antagoniste au récepteur de l'Interleukine-1) et AIRE ( Autoimmune regulator ).
Ces résultats suggèrent que la périostine contrôle l'expression des gènes codant IFN-f3 et l'IDO-1, qui possèdent des propriétés immunosuppressives. Ces résultats suggèrent également que la périostine contrôle l'activité immunomodulatrice des ASC.
En outre, l'inhibition de l'expression de POSTN par une stratégie d'ARN
interférent induit une très forte augmentation de l'activité de 1'IDO-1 dans le surnageant de culture des ASC traitées avec l'ARNi dirigé contre POSTN (voir Figure 4).
Dans la mesure où les ASC possèdent des caractéristiques similaires aux autres cellules souches/stromales mésenchymateuses, et aux cellules progénitrices, cellules précurseurs, cellules différenciées à partir d'une cellule stromale mésenchyrnateuse, macrophages, monocytes, mastocytes, cellules myéloïdes, fibroblastes, cellules dendritiques, lymphocytes (par exemple lymphocytes Treg), cellules NK, cellules lymphoïdes et myoblastes, il est probable que la périostine joue également un rôle dans la modulation des propriétés immunosuppressives de ces cellules.
Des résultats similaires ont d'ailleurs été obtenus avec des cellules stromales mésenchymateuses issues de la moelle osseuse (BM-MSC) : l'inhibition de l'expression de POSTN par une stratégie d'ARN interférent a induit une très forte
Protéine Moyenne sem Moyenne sem POSTN 1,00 0,00 0,08 0,03 IFN-P 1,00 0,00 289,38 120,77 IDO-1 1,00 0,00 92,74 72,18 TSG-6 1,00 0,00 1,89 0,59 HLA-G 1,00 0,00 3,70 1,64 IL-1RA 1,00 0,00 4,00 1,81 AIRE 1,00 0,00 2,15 0,48 Ces résultats montrent que l'inhibition de l'expression de POSTN par une stratégie d'ARN interférent induit une très forte augmentation de l'expression de 1'IFN-13 (Interféron béta) et de l'IDO-1 (Indoléamine- 2,3-dioxygénase 1) et une augmentation de l'expression de TSG-6 ( Tumor necrosis factor-inducible gene protein ), HLA-G (Antigène du complexe majeur d'histocompatibilité, Classe I, G), IL-1RA (Antagoniste au récepteur de l'Interleukine-1) et AIRE ( Autoimmune regulator ).
Ces résultats suggèrent que la périostine contrôle l'expression des gènes codant IFN-f3 et l'IDO-1, qui possèdent des propriétés immunosuppressives. Ces résultats suggèrent également que la périostine contrôle l'activité immunomodulatrice des ASC.
En outre, l'inhibition de l'expression de POSTN par une stratégie d'ARN
interférent induit une très forte augmentation de l'activité de 1'IDO-1 dans le surnageant de culture des ASC traitées avec l'ARNi dirigé contre POSTN (voir Figure 4).
Dans la mesure où les ASC possèdent des caractéristiques similaires aux autres cellules souches/stromales mésenchymateuses, et aux cellules progénitrices, cellules précurseurs, cellules différenciées à partir d'une cellule stromale mésenchyrnateuse, macrophages, monocytes, mastocytes, cellules myéloïdes, fibroblastes, cellules dendritiques, lymphocytes (par exemple lymphocytes Treg), cellules NK, cellules lymphoïdes et myoblastes, il est probable que la périostine joue également un rôle dans la modulation des propriétés immunosuppressives de ces cellules.
Des résultats similaires ont d'ailleurs été obtenus avec des cellules stromales mésenchymateuses issues de la moelle osseuse (BM-MSC) : l'inhibition de l'expression de POSTN par une stratégie d'ARN interférent a induit une très forte
22 PCT/1B2013/055111 augmentation de l'expression de l'IDO-1 et de l'IFN-P par les BM-MSC (voir Figure 5).
L'effet de la modulation de l'expression de la périostine sur le potentiel immunomodulateur des cellules n'est donc pas spécifique aux cellules stromales mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (ASC), mais s'exerce aussi notamment sur les cellules stromales mésenchymateuses issues de la moelle osseuse (BM-MSC).
Par ailleurs, il a été montré que les cellules stromales mésenchymateuses humaines présentent des fonctions d'effecteurs antimicrobiens induites par l'indoléamine-2,3-dioxygénase (IDO), contre différents pathogènes, tels que les bactéries, les parasites protozoaires et les virus (Meisel et al., 2011 et Krampera, 2011).
Les résultats obtenus ci-dessus suggèrent par conséquent qu'une cellule isolée possédant un potentiel immunomodulateur, de préférence une ASC, dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est inhibée présente des propriétés anti-microbiennes, dans la mesure où l'expression d'IDO-1 est significativement augmentée dans ladite cellule.
EXEMPLE 2: EFFET IN VITRO DE L'AJOUT DE LA PERIOSTINE DANS LES
I) Matériels et méthodes L'isolement des cellules stromales mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux humain (ASC) a été effectué comme précédemment décrit à l'Exemple 1-1 ci-dessus, à l'exception que les cellules de la SVF ont été étalées à une densité
de 2000 cellules/cm2 et cultivées pendant 5 jours supplémentaires (passage 1) avec un changement de milieu de culture au bout de 2 jours.
Après les 5 jours de culture en passage 1, les cellules ont été traitées avec du Poly(I:C) qui est un ligand de TLR3 (InvivoGen, Poly(I:C)-LMW) et/ou la périostine (POSTN ; R&D SYSTEMS, Reconbinant Human Periostin/OSF-2). Le milieu utilisé
pour le traitement est le milieu CPM additionné de Poly(I:C) à une concentration de 500 g/mi et/ou de la périostine (POSTN) à une concentration de 1, 2, 4 ou 10 ltg/m1.
Après 24 heures de traitement le milieu a été retiré et les cellules ont été
congelées à -80 C. L'extraction des ARNs IDO1 et la RT-qPCR ont été effectuées comme précédemment (voir Exemple 1-1 ci-dessus).
L'effet de la modulation de l'expression de la périostine sur le potentiel immunomodulateur des cellules n'est donc pas spécifique aux cellules stromales mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (ASC), mais s'exerce aussi notamment sur les cellules stromales mésenchymateuses issues de la moelle osseuse (BM-MSC).
Par ailleurs, il a été montré que les cellules stromales mésenchymateuses humaines présentent des fonctions d'effecteurs antimicrobiens induites par l'indoléamine-2,3-dioxygénase (IDO), contre différents pathogènes, tels que les bactéries, les parasites protozoaires et les virus (Meisel et al., 2011 et Krampera, 2011).
Les résultats obtenus ci-dessus suggèrent par conséquent qu'une cellule isolée possédant un potentiel immunomodulateur, de préférence une ASC, dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est inhibée présente des propriétés anti-microbiennes, dans la mesure où l'expression d'IDO-1 est significativement augmentée dans ladite cellule.
EXEMPLE 2: EFFET IN VITRO DE L'AJOUT DE LA PERIOSTINE DANS LES
I) Matériels et méthodes L'isolement des cellules stromales mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux humain (ASC) a été effectué comme précédemment décrit à l'Exemple 1-1 ci-dessus, à l'exception que les cellules de la SVF ont été étalées à une densité
de 2000 cellules/cm2 et cultivées pendant 5 jours supplémentaires (passage 1) avec un changement de milieu de culture au bout de 2 jours.
Après les 5 jours de culture en passage 1, les cellules ont été traitées avec du Poly(I:C) qui est un ligand de TLR3 (InvivoGen, Poly(I:C)-LMW) et/ou la périostine (POSTN ; R&D SYSTEMS, Reconbinant Human Periostin/OSF-2). Le milieu utilisé
pour le traitement est le milieu CPM additionné de Poly(I:C) à une concentration de 500 g/mi et/ou de la périostine (POSTN) à une concentration de 1, 2, 4 ou 10 ltg/m1.
Après 24 heures de traitement le milieu a été retiré et les cellules ont été
congelées à -80 C. L'extraction des ARNs IDO1 et la RT-qPCR ont été effectuées comme précédemment (voir Exemple 1-1 ci-dessus).
23 PCT/1B2013/055111 2) Résultats Les résultats sont représentés à la Figure 3.
Les propriétés immunosuppressives des ASC ont été stimulées par l'ajout de Poly(I:C).
L'ajout de doses croissantes de périostine inhibe l'effet de Poly(I:C) sur l'expression d' ID01.
Ces résultats montrent que lorsque l'on stimule l'effet immunosuppresseur, l'ajout de POSTN inhibe cet effet.
Des résultats similaires ont été obtenus en remplaçant le Poly(I:C) par l'IFNy (R&D SYSTEMS), qui est un stimulus capable d'induire aussi la production de l'IDO-1. En effet, l'ajout d'IFN7 a induit une diminution de l'expression de POSTN par les ASC (mesurée par RT-qPCR) de manière dose-dépendante et l'ajout de POSTN dans le surnagent de culture des ASC a inhibé l'expression de l'IDO-1 induite par l'IFNy (voir Figure 6). Ces résultats montrent que l'effet de POSTN n'est pas spécifique à
TLR3.
L'augmentation de l'expression de la périostine dans les cellules stromales mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (ASC) peiinet donc de diminuer le potentiel immunosuppresseur de ces cellules.
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Les propriétés immunosuppressives des ASC ont été stimulées par l'ajout de Poly(I:C).
L'ajout de doses croissantes de périostine inhibe l'effet de Poly(I:C) sur l'expression d' ID01.
Ces résultats montrent que lorsque l'on stimule l'effet immunosuppresseur, l'ajout de POSTN inhibe cet effet.
Des résultats similaires ont été obtenus en remplaçant le Poly(I:C) par l'IFNy (R&D SYSTEMS), qui est un stimulus capable d'induire aussi la production de l'IDO-1. En effet, l'ajout d'IFN7 a induit une diminution de l'expression de POSTN par les ASC (mesurée par RT-qPCR) de manière dose-dépendante et l'ajout de POSTN dans le surnagent de culture des ASC a inhibé l'expression de l'IDO-1 induite par l'IFNy (voir Figure 6). Ces résultats montrent que l'effet de POSTN n'est pas spécifique à
TLR3.
L'augmentation de l'expression de la périostine dans les cellules stromales mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (ASC) peiinet donc de diminuer le potentiel immunosuppresseur de ces cellules.
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Claims (17)
1. Cellule diploïde isolée possédant un potentiel immunomodulateur, dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est modulée, ou le surnageant de culture de ladite cellule, pour son utilisation comme médicament.
2. Cellule ou surnageant pour son utilisation selon la revendication 1, caractérisés en ce que l'on inhibe totalement ou partiellement l'expression et/ou l'activité
de ladite périostine.
de ladite périostine.
3. Cellule ou surnageant pour son utilisation selon la revendication 2, caractérisés en ce que ledit médicament est un médicament immunosuppresseur destiné à
la régénération d'un tissu, à la greffe d'organe ou dans le traitement d'une maladie choisie dans le groupe constitué par la maladie du greffon contre l'hôte, les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, les rhumatismes inflammatoires chroniques, les maladies inflammatoires chroniques du système nerveux central, le lupus, les thyroïdites auto-immunes, les fistules anales complexes, les réactions asthmatiques de type hypersensibilité retardée de type IV, les cicatrices inflammatoires, les allergies, les nécroses tissulaires, les maladies auto-immunes, les ulcères, le diabète et les infections microbiennes.
la régénération d'un tissu, à la greffe d'organe ou dans le traitement d'une maladie choisie dans le groupe constitué par la maladie du greffon contre l'hôte, les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, les rhumatismes inflammatoires chroniques, les maladies inflammatoires chroniques du système nerveux central, le lupus, les thyroïdites auto-immunes, les fistules anales complexes, les réactions asthmatiques de type hypersensibilité retardée de type IV, les cicatrices inflammatoires, les allergies, les nécroses tissulaires, les maladies auto-immunes, les ulcères, le diabète et les infections microbiennes.
4. Cellule ou surnageant pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisés en ce que l'expression et/ou l'activité de ladite périostine est totalement ou partiellement inhibée à l'aide d'un composé choisi dans le groupe constitué par un anticorps bloquant, un ARN antisens, un oligonucléotide antisens morpholino, un ARN en épingle à cheveux, un ARN interférent, un aptamère dirigés contre la périostine et un inhibiteur de la périostine.
5. Cellule ou surnageant pour son utilisation selon la revendication 5, caractérisés en ce que ledit composé est un ARNi dirigé contre la périostine.
6. Cellule ou surnageant pour son utilisation selon la revendication 1, caractérisés en ce que l'on augmente l'expression et/ou l'activité de ladite périostine.
7. Cellule ou surnageant pour son utilisation selon la revendication 6, caractérisés en ce que l'augmentation de l'expression et/ou de l'activité de ladite périostine est effectuée par la modification du génome de ladite cellule, par stimulation de la voie de signalisation de la périostine dans ladite cellule ou par l'utilisation de médiateurs induisant l'expression de la périostine.
8. Cellule ou surnageant pour son utilisation selon la revendication 6 ou la revendication 7, caractérisés en ce que ledit médicament est un médicament immunostimulateur destiné à la vaccination ou dans le traitement d'une maladie choisie dans le groupe constitué par un cancer ou une infection liés à un déficit immunitaire, un déficit sélectif ou combiné en immunoglobulines, un déficit isolé en lymphocytes T, un déficit en purine nucléoside phosphorylase, un déficit immunitaire combiné
sévère par déficit en adénosine désaminase et l'hypogammaglobulinémie commune d'expression variable.
sévère par déficit en adénosine désaminase et l'hypogammaglobulinémie commune d'expression variable.
9. Cellule ou surnageant pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisés en ce que ladite cellule dans laquelle l'expression de la périostine est modulée est une cellule humaine.
10. Cellule ou surnageant pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisés en ce que ladite cellule dans laquelle l'expression de la périostine est modulée est choisie dans le groupe constitué par une cellule stromale mésenchymateuse, une cellule progénitrice, une cellule précurseur, une cellule différenciée à partir d'une cellule stromale mésenchymateuse, un macrophage, un monocyte, un mastocyte, une cellule myéloïde, un fibroblaste une cellule dendritique, un lymphocyte, une cellule NK, une cellule lymphoïde et un myoblaste.
11. Cellule ou surnageant pour son utilisation selon la revendication 10, caractérisés en ce que ladite cellule stromale mésenchymateuse est une cellule stromale mésenchymateuse dérivée de la moelle osseuse, du tissu adipeux, d'un tissu solide, du placenta, du sang adulte ou du sang de cordon.
12. Cellule ou surnageant pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisés en ce que ladite cellule possédant un potentiel immunomodulateur exprime IFN-.beta., IDO-1, TSG-6, HLA-G, PGE2, TGF- .beta., galectine, HO-1, IL-6, IL-1RA, IL-33, AIRE, hEGF, TNF, GM-CSF et/ou JAG1.
13. Composition pharmaceutique comprenant une cellule diploïde possédant un potentiel immunomodulateur, dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est modulée ou le surnageant de culture de ladite cellule, tels que définis à l'une quelconque des revendications 1, 2, 4-7 et 9-12, et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
14. Modèle in vitro pour réaliser des tests pharmacologiques ou toxicologiques, comprenant une cellule diploïde possédant un potentiel immunomodulateur dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est modulée, telle que définie à
l'une quelconque des revendications 1, 2, 7-7 et 9-12, pour identifier un produit modifiant les effets de la périostine dans ladite cellule.
l'une quelconque des revendications 1, 2, 7-7 et 9-12, pour identifier un produit modifiant les effets de la périostine dans ladite cellule.
15. Utilisation in vitro d'une cellule diploïde isolée possédant un potentiel immunomodulateur dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est modulée, telle que définie à l'une quelconque des revendications 1, 2, 4-7 et 9-12, pour identifier un produit modifiant les effets de la périostine dans ladite cellule.
16. Protéine choisie parmi la périostine et une protéine comprenant le premier, deuxième, troisième et/ou quatrième domaine FAS1 de la périostine, ou molécule d'acide nucléique comprenant une séquence codant pour ladite protéine, ou composition pharmaceutique comprenant ladite protéine ou ladite molécule d'acide nucléique et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable, pour son utilisation comme médicament immunostimulateur destiné à la vaccination ou dans le traitement d'un cancer ou d'une infection liés à un déficit immunitaire, d'un déficit sélectif ou combiné en immunoglobulines, d'un déficit isolé en lymphocytes T, d'un déficit en purine nucléoside phosphorylase, d'un déficit immunitaire combiné sévère par déficit en adénosine désaminase, ou de Phypogammaglobulinémie commune d'expression variable.
17. Inhibiteur de la périostine sélectionné dans le groupe constitué par un anticorps bloquant anti-périostine, un ARN antisens, un oligonucléotide antisens morpholino, un ARN en épingle à cheveux, un ARN interférent, un aptamère dirigés contre la périostine, ou une composition pharmaceutique comprenant ledit inhibiteur et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable, pour son utilisation comme médicament immunosuppresseur destiné à la régénération d'un tissu, à la greffe d'organe ou dans le traitement d'une maladie choisie dans le groupe constitué par la maladie du greffon contre l'hôte, les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, les maladies inflammatoires chroniques du système nerveux central, le lupus, les thyroïdites auto-immunes, les fistules anales complexes, les réactions asthmatiques de type hypersensibilité retardée de type IV, les allergies, les maladies auto-immunes, les ulcères, le diabète et les infections microbiennes.
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|---|---|---|---|
| FR1255957 | 2012-06-22 | ||
| FR1255957A FR2992221A1 (fr) | 2012-06-22 | 2012-06-22 | Modification des effets immunomodulateurs des cellules |
| PCT/IB2013/055111 WO2013190516A1 (fr) | 2012-06-22 | 2013-06-21 | Modification des effets immunomodulateurs des cellules |
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