CA2886289A1 - Modification of the immunomodulatory effects of cells - Google Patents
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Abstract
Description
MODIFICATION DES EFFETS IMMUNOMODULATEURS DES CELLULES
La présente invention concerne les domaines de l'immunothérapie cellulaire, et plus particulièrement l'utilisation de cellules de mammifère possédant un potentiel immunomodulateur et qui ont été génétiquement ou pharmacologiquement modifiées comme médicament immunosuppresseur ou immunostimulateur. La présente invention concerne également de nouvelles molécules possédant un effet immunosuppresseur ou immuno stimulateur.
La thérapie cellulaire consiste en l'injection à un sujet de cellules vivantes autologues ou allogènes, dans le but de traiter ou prévenir une maladie ou de reconstruire un tissu endommagé. Ces cellules peuvent être des cellules souches, des cellules progénitrices ou précurseurs, ou des cellules différenciées fonctionnelles provenant du sang ou d'un tissu. Ces cellules peuvent aussi être génétiquement transformées pour exprimer dans un tissu un transgène d'intérêt thérapeutique. En outre, la modification génétique de ces cellules peut améliorer leur survie, leurs caractéristiques métaboliques, leurs capacités prolifératives ou, pour les cellules souches ou les précurseurs, leurs capacités de différenciation. Ces mêmes objectifs peuvent être obtenus par le pré-conditionnement de ces cellules à l'aide d'outils pharmacologiques.
Parmi les cellules souches on distingue :
- les cellules souches embryonnaires (ESC) qui proviennent d'un embryon à un stade précoce (du zygote au blastomère). Ces cellules sont totipotentes, c'est-à-dire qu'elles sont capables de se différencier en n'importe quel tissu de l'organisme, et sont capables de s'auto-renouveler ;
-les cellules souches adultes qui sont présentes dans la plupart des tissus de l'organisme. Ces cellules sont soit pluripotentes, c'est-à-dire qu'elles sont capables de former tous les types cellulaires sauf les annexes embryonnaires, telles que les cellules souches pluripotentes induites ou les Multilineage-differentiating Stress Enduring Cells ; soit multipotentes, c'est-à-dire qu'elles sont capables de former différents types de cellules d'un lignage cellulaire donné ; soit unipotentes, c'est-à-dire qu'elles ne peuvent former qu'un seul type cellulaire.
Les cellules progénitrices et précurseurs sont issues des cellules souches, c'est-à-dire qu'elles sont plus engagées dans une voie de différenciation que les cellules WO 2013/190516 MODIFICATION OF IMMUNOMODULATORY EFFECTS OF CELLS
The present invention relates to the fields of immunotherapy cell, and more particularly the use of mammalian cells possessing a immunomodulatory potential and that have been genetically or pharmacologically modified as an immunosuppressive or immunostimulatory drug. The current The invention also relates to novel molecules having an effect immunosuppressive or immune stimulator.
Cell therapy involves injecting a subject with cells autologous or non-native living organisms, for the purpose of treating or preventing disease or rebuild a damaged tissue. These cells can be cells strains, progenitor cells or precursors, or differentiated cells functional from blood or tissue. These cells can also be genetically transformed for to express in a tissue a transgene of therapeutic interest. In addition, the change Genetics of these cells can improve their survival, their characteristics metabolic, their proliferative capacity or, for stem cells or precursors, their differentiation capabilities. These same objectives can be achieved by pre-conditioning of these cells using pharmacological tools.
Among the stem cells we distinguish:
- embryonic stem cells (ESC) which come from a embryo at an early stage (from zygote to blastomer). These cells are totipotent, that is to say that they are able to differentiate themselves in any fabric of the body, and are able to self-renew;
-adult stem cells that are present in most tissues of the body. These cells are either pluripotent, i.e.
what are capable of forming all cell types except embryonic appendages, such as induced pluripotent stem cells or Multilineage-differentiating Stress Enduring Cells; multipotent, that is, they are capable of form different types of cells of a given cell lineage; unipotent, that is to say that they can only form one cell type.
Progenitor and precursor cells are derived from stem cells, that is, they are more engaged in a way of differentiation than cells WO 2013/190516
2 PCT/1B2013/055111 souches. Elles sont également capables de foimer un ou plusieurs types cellulaires mais ne sont pas capables de s' auto-renouveler.
Les cellules souches mésenchymateuses (CSM ou MSC) - aussi appelées cellules stromales mésenchymateuses - font actuellement l'objet de nombreuses recherches pour leurs applications thérapeutiques. Dans la description qui suit les termes cellule souche mésenchymateuse et cellule stromale mésenchymateuse sont utilisés indifféremment. Ces cellules souches adultes ont été initialement isolées et caractérisées à
partir des cellules mononucléées de la moelle osseuse (BM-MSC) mais peuvent également être isolées à partir du tissu adipeux, de la peau, de la rate ou du coeur.
Les CSM possèdent des caractéristiques phénotypiques, par exemple CD45-, CD34+/- (selon l'origine tissulaire et leur stade de prolifération), CD134-, qui permettent de les distinguer des cellules souches hématopoïétiques qui sont CD45+, CD34+, CD13-. Elles possèdent, selon les inducteurs utilisés, un potentiel de différenciation ostéogénique, adipogénique, chondrogénique, myogénique et angiogénique par exemple. Elles possèdent aussi une activité
paracrine et sont capables de sécréter des facteurs de croissance, des cytokines pro- ou anti-inflammatoires, des chémokines et des prostaglandines (voir pour revue Le Blanc 2006, Kode et al., 2009, Hoogduijn et al., 2010 et Dazzi et al., 2011). De ce fait, elles présentent aussi de grandes similarités avec les monocytes et les macrophages (Charrière et al., 2006) ainsi que les fibroblastes (Hannifa et al., 2007) qui possèdent des propriétés immunomodulatrices similaires. Les CSM sont donc utilisées en thérapie cellulaire régénératrice pour leurs propriétés de différenciation multiple ainsi que pour leurs propriétés prolifératives, angiogéniques, anti-apoptotiques, trophiques et imm.unomodulatrices. Par exemple, Le Blanc et al. (2008) ont montré chez l'Homme que les cellules souches mésenchymateuses combinées à une greffe de cellules souches hématopoïétiques peuvent réduire le risque de réaction aiguë du greffon contre l'hôte dans les allogreffes (graft-versus host disease, GVHD).
Les CSM isolées du tissu adipeux sont appelées ASC, ADSC (adipose derived stem/stroma cells), ADAS (adipose tissue-derived adult stem cells) ou AD-MSC
(adipose-derived MSC). Le tissu adipeux présente l'avantage d'être obtenu facilement par liposuccion sous anesthésie locale et de contenir plusieurs populations de cellules immatures dont une forte majorité d'ASC. Les ASC sont ensuite isolées et purifiées après digestion protéolytique du tissu adipeux blanc (e.g., avec la collagénase) et sélection par WO 2013/190516 2 PCT / 1B2013 / 055111 strains. They are also capable of foaming one or more types cellular but not are not able to self-renew.
Mesenchymal stem cells (MSCs) - also called mesenchymal stromal cells - are currently the subject of numerous research for their therapeutic applications. In the following description cell terms mesenchymal strain and mesenchymal stromal cell are used indifferently. These adult stem cells were initially isolated and characterized mononuclear cells from the bone marrow (BM-MSC) but can also be isolated from adipose tissue, skin, spleen or heart.
CSMs have phenotypic characteristics, for example CD45-, CD34 +/- (according to tissue origin and their stage of proliferation), CD134-, which make it possible to distinguish them from stem cells hematopoietic which are CD45 +, CD34 +, CD13-. They possess, according to the inducers used, a potential for osteogenic differentiation, adipogenic, chondrogenic, myogenic and angiogenic for example. They also have an activity paracrine and are able to secrete growth factors, pro cytokines or anti-inflammatory agents, chemokines and prostaglandins (see for review White 2006, Kode et al., 2009, Hoogduijn et al., 2010 and Dazzi et al., 2011). Thereby, they present also great similarities with monocytes and macrophages (Charrière et al., 2006) as well as fibroblasts (Hannifa et al., 2007) that possess similar immunomodulatory agents. MSCs are therefore used in therapy cellular regenerative for their multiple differentiation properties as well as for their proliferative, angiogenic, anti-apoptotic, trophic and imm.unomodulatrices. For example, Le Blanc et al. (2008) showed in the man that mesenchymal stem cells combined with cell transplantation strains hematopoietic agents may reduce the risk of acute graft versus the host in allografts (graft-versus host disease, GVHD).
MSCs isolated from adipose tissue are called ASC, ADSC (adipose derived stem / stroma cells), ADAS (adipose tissue-derived AD-MSC
(adipose-derived MSC). Adipose tissue has the advantage of being obtained easily by liposuction under local anesthesia and to contain several populations of cell immature with a strong majority of ASC. CHVs are then isolated and purified after proteolytic digestion of white adipose tissue (eg, with collagenase) and selection by WO 2013/190516
3 PCT/1B2013/055111 une étape d'adhésion sur un support plastique (voir pour revue Gimble et al., 2007) ou peuvent être directement sélectionnées à partir de leur phénotype de surface (par exemple, sélection des cellules CD45-, CD34+ et CD31"). Bien que possédant des caractéristiques spécifiques, les ASC montrent beaucoup de caractéristiques communes avec les cellules souches mésenchymateuses issues de la moelle osseuse, y compris l'activité
paracrine et les propriétés immunomodulatrices (Planat-Bénard et al., 2004, Puissant et al., 2005, Yailez et al., 2006, Gonzàlez et al., 2009a et 2009b, Constantin et al., 2009 et Yoo et al., 2009). En outre, dans la mesure où leur auto-renouvellement n'a pas été
clairement établi, il convient d'utiliser le terme cellules stromales mésenchymateuses pour les qualifier (Casteilla et al., 2011). Néanmoins, ces cellules peuvent servir de modèle cellulaire pour l'ensemble des cellules souches mésenchymateuses. Les ASC sont actuellement étudiées au niveau clinique dans plusieurs types d'applications (voir pour revue Casteilla et al., 2011), dont l'ischémie critique du membre inférieur et le traitement des fistules associées ou non à la maladie de Crohn (Garcia-Olmo et al., 2009).
Malgré des résultats pré-cliniques et cliniques encourageants sur l'utilisation des CSM dans le cadre de thérapies cellulaires (voir pour revue Uccelli et al., 2008), le potentiel immunomodulateur des CSM est parfois trop faible pour obtenir de bons résultats dans le traitement de maladies ou dysfonctions impliquant l'inflammation, telles que les maladies inflammatoires chroniques ou maladies auto-immunes. Il existe donc un besoin d'améliorer le potentiel immunomodulateur des CSM, permettant ainsi de diminuer le nombre de cellules nécessaires au traitement et/ou d'améliorer leur efficacité, ce qui diminue d'autant la quantité de cellules prélevées initialement et nécessaire pour l'obtention des CSM greffées, ainsi que les temps de culture des cellules.
La périostine (POSTN ou PN) est une protéine d'adhésion de la matrice extracellulaire, sécrétée notamment par les ostéoblastes et exprimée préférentiellement dans le périoste des os et le ligament péridontal des dents (voir pour revue Kudo, 2011 et Frangogianni, 2012). La périostine est également exprimée dans d'autres tissus, tels que le coeur, les glandes mammaires, les cellules stromales mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse (Coutu et al., 2008) et certaines cellules cancéreuses. Les séquences nucléotidique et peptidique des quatre isoformes connues de la périostine sont disponibles dans la base de données GENBANK, sous les numéros d'accès GI:209863034 (NP 001129408.1 ; isoforme 1), GI:209862911 (NP 001129406.1 ; isoforme 2), WO 2013/190516 3 PCT / 1B2013 / 055111 an adhesion step on a plastic support (see for review Gimble et al., 2007) or can be directly selected from their surface phenotype (for example, selection of CD45-, CD34 + and CD31 cells).
characteristics the CHWs show a lot of common characteristics with the cell mesenchymal strains derived from the bone marrow, including paracrine and immunomodulatory properties (Planat-Bénard et al., 2004, Powerful and al., 2005, Yailez et al., 2006, Gonzalez et al., 2009a and 2009b, Constantin et al., 2009 and Yoo et al.
2009). In addition, to the extent that their self-renewal has not been clearly established, the term mesenchymal stromal cells should be used for qualify them (Casteilla et al., 2011). Nevertheless, these cells can serve as a model cell for all the mesenchymal stem cells. CHVs are currently studied at the clinical level in several types of applications (see for review Casteilla et al., 2011), including critical ischemia of the lower limb and treatment of associated fistulas or not to Crohn's disease (Garcia-Olmo et al., 2009).
Despite encouraging pre-clinical and clinical results on the use of MSCs in the context of cellular therapies (see for review Uccelli et al., 2008), the immunomodulatory potential of MSCs is sometimes too low to get from good results in the treatment of diseases or dysfunctions involving inflammation, such as chronic inflammatory diseases or autoimmune diseases. he exist therefore a need to improve the immunomodulatory potential of MSCs, allowing so reduce the number of cells needed for treatment and / or improve their effectiveness, which decreases the amount of cells taken initially and necessary for obtaining grafted CSMs, as well as cell culture times.
Periostin (POSTN or PN) is a matrix adhesion protein extracellular secreted in particular by osteoblasts and expressed preferably in the periosteum of the bones and the peridontal ligament of the teeth (see for review Kudo, 2011 and Frangogianni, 2012). Periostin is also expressed in other tissues, such as the heart, mammary glands, mesenchymal stromal cells derived of the bone marrow (Coutu et al., 2008) and some cancer cells. The sequences nucleotide and peptide levels of the four known isoforms of periostin are available in the GENBANK database, under access numbers GI: 209863034 (NP 001129408.1, isoform 1), GI: 209862911 (NP 001129406.1, isoform 2), WO 2013/190516
4 PCT/1B2013/055111 GI:209863011 (NP 001129407.1 ; isoforme 3) et GI:209863034 (NP 001129408.1 ;
isoforme 4). La périostine contient, de son extrémité N-terminale vers son extrémité C-tellninale : une séquence signal de sécrétion, un domaine riche en cystéine (domaine EMI), 4 régions répétées homologues (domaines Fasciclin I (FAS1)) et un domaine hydrophobe.
Les domaines FAS1 des protéines sont bien connus de l'homme du métier ; ils sont référencés par exemple dans la base de données EMBL-EBI sous le numéro d'accès IPR000782 ou dans la base de données PFAM sous le numéro d'accès PF02469. Les domaines FAS1 de la périostine ont notamment été décrits par Coutu et al., 2008. La périostine maintient la structure et l'intégrité des tissus de soutien (le collagène) et participe à la croissance osseuse. Kudo et al. (2004) ont montré chez le poisson zèbre, que l'inhibition de la traduction de l'ARNm de la périostine par un oligonucléotide morpholino antisens inhibe la formation du myoseptum dans l'embryon. Rios et al. (2005) ont montré, à l'aide de souris transgéniques knock-in n'exprimant pas la périostine, que la périostine est nécessaire pour le maintien de l'intégrité du ligament péridontal en réponse à
un stress mécanique. Takayama et al. (2006) ont montré que l'expression de la périostine est induite par les cytokines TGF-I3 et/ou IL-4 et IL-13 exprimées en réponse à
l'inflammation ou à un stress mécanique. En outre, l'augmentation de l'expression de la périostine dans les processus de réparation ou de remodelage tissulaire et de fibrose peut être due à une activation locale de TGF-(3 et de la voie de signalisation de la protéine morphogénétique osseuse (BMP) (voir pour revue Frangogianni, 2012). Par ailleurs, il semble que la périostine stimule la croissance cellulaire de plusieurs types de cancer, tels que le cancer du sein. Orecchia et al. (2011) ont montré in vitro que le traitement des cellules SKMEL-28 avec un anticorps monoclonal bloquant, dirigé contre le motif YN
situé dans le deuxième domaine FAS1 de la périostine humaine, inhibe la croissance tumorale et réduit la densité vasculaire tumorale. Enfin, la Demande Internationale WO 2010/025554 PCT / 1B2013 / 055111 GI: 209863011 (NP 001129407.1; isoform 3) and GI: 209863034 (NP 001129408.1;
isoform 4). Periostin contains, from its N-terminus to its end C-tellninal: a secretory signal sequence, a domain rich in cysteine (EMI domain), 4 homologous repeat regions (Fasciclin I domains (FAS1)) and one domain hydrophobic.
The FAS1 domains of proteins are well known to those skilled in the art; they are referenced for example in the EMBL-EBI database under the access number IPR000782 or in the PFAM database under access number PF02469. The FAS1 domains of periostin have in particular been described by Coutu et al.
2008. The periostin maintains the structure and integrity of the supporting tissues (the collagen) and participates in bone growth. Kudo et al. (2004) have shown in zebrafish, that inhibition of mRNA translation of periostin by a morpholino oligonucleotide antisense inhibits the formation of myoseptum in the embryo. Rios et al. (2005) showed, using transgenic knock-in mice that do not express periostin, that the periostin is necessary for maintaining the integrity of the ligament peridontal in response to mechanical stress. Takayama et al. (2006) have shown that the expression of periostin is induced by cytokines TGF-I3 and / or IL-4 and IL-13 expressed in response at inflammation or mechanical stress. In addition, the increase in the expression of the periostin in the processes of tissue repair or remodeling and fibrosis can due to local activation of TGF- (3 and the the protein bone morphogenetic (BMP) (see for review Frangogianni, 2012). By elsewhere he seems that periostin stimulates cell growth of several types of cancer, such than breast cancer. Orecchia et al. (2011) have shown in vitro that treatment of SKMEL-28 cells with a blocking monoclonal antibody against the YN pattern located in the second FAS1 domain of human periostin, inhibits the growth tumor and reduces tumor vascular density. Finally, the Request Internationale WO 2010/02555
5 décrit que la périostine peut être utilisée comme médicament pour la régénération du tissu pancréatique.
A la connaissance des inventeurs, aucune donnée ne lie la périostine à un effet immunomodulateur des cellules exprimant cette protéine.
Les inventeurs se sont donnés pour but de modifier le potentiel immunomodulateur des cellules possédant un potentiel immunomodulateur, et plus particulièrement des cellules souches/stromales mésenchymateuses.
WO 2013/190515 describes that periostin can be used as a medicament for the regeneration of pancreatic tissue.
To the knowledge of the inventors, no data binds periostin to a immunomodulatory effect of cells expressing this protein.
The inventors set out to change the potential immunomodulating cells with immunomodulatory potential, and more particularly mesenchymal stem / stromal cells.
WO 2013/19051
6 5 PCT/1B2013/055111 Les inventeurs ont alors montré que l'inhibition de l'expression de la périostine dans les cellules stromales mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (ASC) humain, non génétiquement transformées, peimet d'augmenter le potentiel immunosuppresseur de ces cellules.
Les inventeurs ont aussi montré que le potentiel immunosuppresseur des cellules stromales mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (ASC) humain, non génétiquement transfolinées, est inhibé lorsque la périostine est ajoutée à
ces cellules.
L'augmentation de l'expression de la périostine dans les ASC permet donc de diminuer ou d'inhiber le potentiel immunosuppresseur de ces cellules, c'est-à-dire de conférer un potentiel immunostimulateur à ces cellules.
Au regard de ces résultats obtenus avec les ASC utilisées comme cellules modèles, les inventeurs ont donc mis en évidence, de manière inattendue, le rôle de la périostine dans le contrôle de l'activité paracrine des cellules possédant un potentiel immunomodulateur, notamment des cellules souches/stromales mésenchymateuses.
Ces résultats montent aussi que la périostine peut être utilisée comme médicament immunostimulateur et qu'un inhibiteur de la périostine peut être utilisé comme médicament immunosuppresseur.
La présente invention a pour objet une cellule diploïde isolée possédant un potentiel immunomodulateur, dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est modulée, ou le surnageant de culture de ladite cellule, pour son utilisation comme médicament.
De préférence, ledit médicament est un médicament immunosuppresseur ou un médicament immunostimulateur.
On entend par cellule possédant un potentiel immunomodulateur une cellule qui permet de diminuer ou augmenter les capacités naturelles du système immunitaire chez un organisme, c'est-à-dire de diminuer (immunosuppresssion) les défenses immunitaires naturelles lorsqu'elles peuvent nuire audit organisme, ou au contraire de les renforcer (immunostimulation) lorsqu'elles sont insuffisantes ou déprimées. Cette cellule se caractérise par sa capacité à agir sur les effecteurs de l'immunité. La détermination du potentiel immunomodulateur d'une cellule peut être effectuée par l'homme du métier à l'aide de techniques bien connues, telles que l'immunophénotypage et plus particulièrement et à titre d'exemple pour les lymphocytes la réaction lymphocytaire mixte (MLR) mais aussi la réponse sous stimulation des neutrophiles ; par exemple pour les cellules stromales mésenchymateuses, voir Perico et al., 2011; pour les cellules dendritiques, voir Zhao et al., 2012 ; pour les cellules NK, voir Abdelrazik et aL, 2011 ; pour les lymphocytes, voir Perico et al., 2011, Najar et al., 2010, Zhou et al., 2011 et Kronsteiner et al., 2011. Ladite cellule possédant un potentiel immunomodulateur (avant modulation de l'expression et/ou l'activité de la périostine) exprime la périostine. De préférence, ladite cellule possédant un potentiel immunomodulateur exprime aussi au moins une molécule immunomodulatrice, telle que IFN-f3, IDO-1, TSG-6, HLA-G, PGE2, TGF- p, galectine, HO-1, IL-6, IL-1RA, IL-33, AIRE ( autoimmune regulator ), hEGF, TNF, GM-CSF et/ou JAG1, bien connus de l'homme du métier, de préférence IFN-P, IDO-1, TSG-6, HLA-G et IL-1RA. La mesure de l'expression de ces gènes dans une cellule peut être effectuée par RT-PCR, tel que décrit dans les Exemples ci-après.
De manière avantageuse, ladite cellule possédant un potentiel immunomodulateur est choisie parmi une cellule stromale mésenchymateuse, une cellule progénitrice, une cellule précurseur, une cellule différenciée à partir d'une cellule stromale mésenchymateuse, un macrophage, un monocyte, un mastocyte, une cellule myéloïde, un fibroblaste, une cellule dendritique, un lymphocyte (par exemple un lymphocyte Treg), une cellule NK, une cellule lymphoïde et un myoblaste.
De manière avantageuse encore, ladite cellule stromale mésenchymateuse est choisie parmi une cellule stromale mésenchymateuse dérivée de la moelle osseuse (BM-MSC), du tissu adipeux (ASC ou AD-MSC), d'un tissu solide, du placenta, du sang adulte ou du sang de cordon.
De préférence, ladite cellule possédant un potentiel immunomodulateur est une cellule de mammifère, de préférence encore une cellule humaine.
Bien entendu, ladite cellule possédant un potentiel immunomodulateur est une cellule vivante.
En outre, ladite cellule possédant un potentiel immunomodulateur n'est pas une cellule cancéreuse.
On entend par moduler l'expression et/ou l'activité de la périostine , la modification de l'expression et/ou l'activité de la périostine par rapport à
une cellule possédant un potentiel immunomodulateur, soit par inhibition totale ou partielle de WO 2013/190516 6 5 PCT / 1B2013 / 055111 The inventors then showed that the inhibition of the expression of the periostin in mesenchymal stromal cells derived from tissue adipose (ASC) human, non-genetically transformed, to increase the potential immunosuppressant of these cells.
The inventors have also shown that the immunosuppressive potential of mesenchymal stromal cells derived from human adipose tissue (AUC), no genetically transfolled, is inhibited when periostin is added to these cells.
The increase in periostin expression in CHWs therefore allows decrease or to inhibit the immunosuppressive potential of these cells, i.e.
confer a immunostimulatory potential to these cells.
With regard to these results obtained with ASC used as cells models, the inventors have, therefore, unexpectedly highlighted the role of periostin in the control of paracrine activity in cells with potential immunomodulator, including mesenchymal stem / stromal cells.
These results also mount that periostin can be used as a medicine immunostimulator and that an inhibitor of periostin can be used as immunosuppressive drug.
The subject of the present invention is an isolated diploid cell possessing an immunomodulatory potential, in which the expression and / or activity of periostin is modulated, or the culture supernatant of said cell, for its use as drug.
Preferably, said medicament is an immunosuppressive drug or an immunostimulatory drug.
By cell having an immunomodulatory potential is meant a cell which makes it possible to decrease or increase the natural capacities of the system immune system in an organism, ie to decrease (immunosuppressation) the natural immune defenses when they can harm the body, or to contrary to strengthening them (immunostimulation) when they are insufficient or depressed. This cell is characterized by its ability to act on effectors of Immunity. The determination of the immunomodulatory potential of a cell may to be performed by those skilled in the art using well-known techniques, such as than immunophenotyping and more particularly and as an example for the lymphocytes mixed lymphocyte reaction (MLR) but also the response under stimulation of neutrophils; for example for mesenchymal stromal cells, see Perico and al., 2011; for dendritic cells, see Zhao et al., 2012; for the NK cells, see Abdelrazik et al., 2011; for lymphocytes, see Perico et al., 2011, Najar et al., 2010, Zhou et al., 2011 and Kronsteiner et al., 2011. The said cell having a potential immunomodulator (before modulation of expression and / or activity of the periostin) expresses periostin. Preferably, said cell having a potential immunomodulator also expresses at least one immunomodulatory molecule, such as than IFN-f3, IDO-1, TSG-6, HLA-G, PGE2, TGF-β, galectin, HO-1, IL-6, IL-1RA, IL-AIRE (autoimmune regulator), hEGF, TNF, GM-CSF and / or JAG1, well known those skilled in the art, preferably IFN-β, IDO-1, TSG-6, HLA-G and IL-1RA. The measure of the expression of these genes in a cell can be carried out by RT-PCR, such as described in the Examples below.
Advantageously, said cell having a potential immunomodulator is selected from a mesenchymal stromal cell, a cell progenitor, a precursor cell, a cell differentiated from a stromal cell mesenchymal, a macrophage, a monocyte, a mastocyte, a cell myeloid, a fibroblast, a dendritic cell, a lymphocyte (for example a lymphocyte Treg), a NK cell, a lymphoid cell and a myoblast.
Advantageously still, said stromal cell mesenchymal is selected from a derived mesenchymal stromal cell of the bone marrow (BM-MSC), adipose tissue (ASC or AD-MSC), solid tissue, of placenta, adult blood or cord blood.
Preferably, said cell having an immunomodulatory potential is a mammalian cell, more preferably a human cell.
Of course, said cell having an immunomodulatory potential is a living cell.
In addition, said cell having an immunomodulatory potential is not not a cancer cell.
By modulating the expression and / or activity of periostin, the modification of the expression and / or activity of periostin with respect to a cell having an immunomodulatory potential, either by total inhibition or partial of WO 2013/190516
7 PCT/1B2013/055111 l'expression et/ou de l'activité de ladite périostine y compris par inhibition de ses voies de signalisation soit par augmentation de l'expression et/ou de l'activité de ladite périostine (surexpression de ladite périostine ou stimulation des voies de signalisation de ladite périostine).
Le choix par l'homme du métier d'inhiber ou d'augmenter l'expression et/ou l'activité de ladite périostine comme indiqué précédemment s'effectue en fonction du résultat que l'on souhaite obtenir en termes d'immunomodulation, à savoir respectivement stimuler l'effet immunosuppresseur ou immunostimulateur de ladite cellule possédant un potentiel immunomodulateur. Ainsi, si l'homme du métier souhaite stimuler l'effet immunosuppresseur d'une cellule possédant un potentiel immunomodulateur, alors il est nécessaire d'inhiber l'expression et/ou l'activité de ladite périostine, incluant l'inhibition de ses voies de signalisation, dans ladite cellule. Si l'homme du métier souhaite stimuler l'effet immunostimulateur d'une cellule possédant un potentiel immunomodulateur alors il est nécessaire d'augmenter l'expression et/ou l'activité de ladite périostine, incluant la stimulation de ses voies de signalisation, dans ladite cellule.
La détermination du potentiel immunosuppresseur (ou des propriétés immunosuppressives) ou du potentiel immunostimulateur (ou des propriétés immunostimulatrices) d'une cellule selon la présente invention peut être réalisée en mesurant l'expression des ARNm des gènes impliqués dans l'immunomodulation, tels que les gènes codant pour les protéines IFN-fl, IDO-1, TSG-6, HLA-G, PGE2, TGF- p, galectine, HO-1, IL-6, IL-1RA, IL-33, AIRE, hEGF, TNF, GM-CSF et/ou JAG1, ou en mesurant le contenu de ces protéines dans cette cellule.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite cellule isolée possédant un potentiel immunomodulateur, dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est totalement ou partiellement inhibée, ou le surnageant de culture de cette cellule, est utile comme médicament immunosuppresseur destiné à la régénération (reconstruction) d'un tissu, la greffe d'organe (pour limiter les rejets), telle que la transplantation rénale, ou dans le traitement :
- de la maladie du greffon contre l'hôte (GVHD), - des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, telles que la maladie de Crohn, la maladie c liaque et le syndrome de l'intestin irritable ;
WO 2013/190516 7 PCT / 1B2013 / 055111 the expression and / or activity of said periostin, including by inhibition of his ways of signaling either by increasing the expression and / or the activity of said periostin (overexpression of said periostin or stimulation of signaling pathways of said periostin).
The choice by the skilled person of inhibiting or increasing the expression and / or the activity of said periostin as indicated above is carried out in function of desired result in terms of immunomodulation, namely respectively to stimulate the immunosuppressive or immunostimulatory effect of said cell possessing a immunomodulatory potential. Thus, if the person skilled in the art wishes to stimulate the effect immunosuppressant of a cell with an immunomodulatory potential, then he is necessary to inhibit the expression and / or activity of said periostin, including inhibition of its signaling pathways in said cell. If the person skilled in the art wish to stimulate the immunostimulatory effect of a cell with potential immunomodulator then he is necessary to increase the expression and / or the activity of said periostin, including stimulation of its signaling pathways in said cell.
Determination of the immunosuppressive potential (or properties immunosuppressive) or immunostimulatory potential (or immunostimulatory agents) of a cell according to the present invention may be realized in measuring the expression of the mRNAs of genes involved in immunomodulation, such as the genes encoding the IFN-α, IDO-1, TSG-6, HLA-G, PGE2, TGF-β proteins, galectin, HO-1, IL-6, IL-1RA, IL-33, AREA, hEGF, TNF, GM-CSF and / or JAG1, or in measuring the content of these proteins in this cell.
According to a preferred embodiment of the invention, said isolated cell having an immunomodulatory potential, wherein the expression and / or activity of the periostin is totally or partially inhibited, or the supernatant of culture of this cell, is useful as an immunosuppressive drug for regeneration (reconstruction) of a tissue, the organ transplant (to limit rejections), such as kidney transplant, or in treatment:
- graft-versus-host disease (GVHD), - inflammatory bowel diseases, such as Crohn's disease, celiac disease and irritable bowel syndrome;
WO 2013/190516
8 PCT/1B2013/055111 - des rhumatismes inflammatoires chroniques, tels que l'arthrite, la polyarthrite rhumatoïde, la spondylarthrite ankylosante et le rhumatisme psoriasique ;
- des maladies inflammatoires chroniques du système nerveux central, telles que la sclérose en plaque et la sclérose latérale amyotrophique ;
- du lupus ;
- des thyroïdites auto-immunes ;
- des fistules anales complexes ;
- des réactions asthmatiques de type hypersensibilité retardée de type IV;
- des allergies ;
- des cicatrices inflammatoires, telles que les cicatrices hypertrophiques ;
- des nécroses tissulaires ;
- des maladies auto-immunes, telles que l'encéphalite auto-immune, la colite auto-immune et le lupus érythémateux systémique ;
- des ulcères ;
- du diabète ;
- des infections microbiennes, dues par exemples à une bactérie, un parasite protozoaire ou un virus.
Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, ladite cellule isolée, dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine, incluant ses voies de signalisation, est augmentée, ou le surnageant de culture de cette cellule, est utile comme médicament immunostimulateur destiné à la vaccination, c'est-à-dire un adjuvant vaccinal ou destiné au traitement :
- d'un cancer ou d'une infection liés à un déficit immunitaire ;
- d'un déficit sélectif ou combiné en immunoglobulines ;
- d'un déficit isolé en lymphocytes T;
- d'un déficit en purine nucléoside phosphorylase ;
- d'un déficit immunitaire combiné sévère par déficit en adénosine désaminase ;
- de l'hypogammaglobulinémie commune d'expression variable.
WO 2013/190516 8 pct / 1b2013 / 055111 - chronic inflammatory rheumatism, such as arthritis, rheumatoid arthritis, ankylosing spondylitis and rheumatism psoriatic;
- chronic inflammatory diseases of the system central nervous such as multiple sclerosis and amyotrophic lateral sclerosis;
- lupus;
- autoimmune thyroiditis;
- complex anal fistulas;
- asthmatic reactions of delayed type hypersensitivity type IV;
- allergies ;
- inflammatory scars, such as scars hypertrophic;
- tissue necrosis;
- autoimmune diseases, such as autoimmune encephalitis, autoimmune colitis and systemic lupus erythematosus;
- ulcers;
- diabetes;
- microbial infections, due for example to a bacterium, a protozoan parasite or a virus.
According to another preferred embodiment of the invention, said cell isolated, in which the expression and / or activity of periostin, including his ways of signaling, is increased, or the culture supernatant of this cell, is useful as immunostimulatory medicament for vaccination, i.e.
vaccine adjuvant or for treatment:
- cancer or infection related to immune deficiency;
- a selective or combined deficiency in immunoglobulins;
- an isolated deficit in T lymphocytes;
- purine nucleoside phosphorylase deficiency;
- severe combined immunodeficiency by deficiency in adenosine deaminase;
- common hypogammaglobulinemia of expression variable.
WO 2013/190516
9 PCT/1B2013/055111 La périostine est bien connue de l'homme du métier. Les séquences d'acides aminés des quatre isoformes de la périostine humaine sont disponibles dans la base de données GANBANK sous les numéros d'accès GI:209863034 (NP 001129408.1 ;
isoforme 1), GI:209862911 (NP 001129406.1 ; isofonne 2), GI:209863011 (NP 001129407.1 ; isoforme 3) et GI:209863034 (NP 001129408.1 ; isoforme 4).
Au sens de la présente invention, on entend par périostine , ces quatre isoformes et leurs variants (ou mutants) fonctionnels.
La fonction d'un variant (ou mutant) de la périostine peut être déterminée selon des méthodes connues de l'homme du métier (voir pour revue Kudo et al., 2011).
L'inhibition totale ou partielle de l'expression et/ou de l'activité de la périostine peut être obtenue de diverses manières, par des méthodes connues en elles mêmes.
Cette inhibition peut être obtenue en intervenant en amont de la production de la périostine, par mutagenèse du gène codant pour cette protéine, ou bien par inhibition ou modification de la transcription ou de la traduction de la périostine.
La mutagenèse du gène codant pour la périostine peut intervenir au niveau de la séquence codante ou des séquences de régulation de l'expression, notamment du promoteur. On peut par exemple procéder à la délétion de tout ou partie dudit gène et/ou à l'insertion d'une séquence exogène (voir par exemple Rios et al., 2005).
On peut également introduire une ou plusieurs mutations ponctuelles avec des agents physiques (par exemple radiations) ou chimiques. Ces mutations ont pour conséquence de décaler le cadre de lecture et/ou d'introduire un codon stop dans la séquence et/ou de modifier le niveau de la transcription et/ou de la traduction du gène et/ou de rendre la périostine moins active que la périostine sauvage. Les allèles mutés du gène codant pour la périostine peuvent être identifiés par exemple par PCR à l'aide d'amorces spécifiques dudit gène (voir par exemple Rios et al., 2005).
On peut aussi effectuer une mutagenèse dirigée, ciblant un gène codant pour ladite périostine. L'inhibition ou la modification de la transcription et/ou de la traduction peuvent être obtenues par l'expression d'ARNs sens, antisens ou double-brin dérivés du gène de ladite périostine, ou de l'ADNc de cette protéine, ou bien par l'utilisation d'ARNs interférents.
WO 2013/190516 9 PCT / 1B2013 / 055111 Periostin is well known to those skilled in the art. The sequences of amino acids from the four isoforms of human periostin are available in the GANBANK database under access numbers GI: 209863034 (NP 001129408.1 ;
isoform 1), GI: 209862911 (NP 001129406.1; isoform 2), GI: 209863011 (NP 001129407.1, isoform 3) and GI: 209863034 (NP 001129408.1, isoform 4).
For the purposes of the present invention, periostin means these four isoforms and their functional variants (or mutants).
The function of a variant (or mutant) of periostin can be determined according to methods known to those skilled in the art (see for review Kudo et al., 2011).
Total or partial inhibition of the expression and / or activity of the Periostin can be obtained in various ways, by methods known in they same.
This inhibition can be obtained by intervening upstream of the periostin production, by mutagenesis of the gene coding for this protein, or by inhibition or modification of the transcription or translation of the periostin.
Mutagenesis of the gene coding for periostin may occur at level of the coding sequence or expression regulation sequences, especially of the promoter. For example, the deletion of all or part of said gene and / or the insertion of an exogenous sequence (see, for example, Rios et al.
2005).
One or more point mutations can also be introduced with physical agents (for example radiation) or chemical agents. These mutations have for consequence of shifting the reading frame and / or introducing a stop codon in the sequence and / or change the level of transcription and / or gene translation and / or to make periostin less active than wild periostin. Alleles mutated gene coding for periostin can be identified for example by PCR using primer specific to said gene (see, for example, Rios et al., 2005).
It is also possible to carry out a directed mutagenesis, targeting a coding gene for said periostin. Inhibition or modification of transcription and / or translation can be obtained by the expression of sense, antisense or double-stranded derivatives of the said periostin gene, or the cDNA of this protein, or else by the use of interfering RNAs.
WO 2013/190516
10 PCT/1B2013/055111 Les techniques de modifications génétiques des cellules sont connues de l'homme du métier. A titre d'exemple, Casteilla et al., 2008, décrit une méthode de transfert de gène dans les cellules dérivées du tissu adipeux à l'aide de vecteurs viraux.
Selon ce mode de mise en oeuvre de la présente invention, on peut utiliser une construction d'ADN recombinant, comprenant un ou plusieurs polynucléotides capables d'inhiber l'expression de la périostine. A titre d'exemples non limitatifs, lesdits polynucléotides peuvent coder pour des ARN antisens, tels que des oligonucléotides antisens morpholino, des ARN en épingle à cheveux, des ARN interférents (ARN
double brin non codants d'une longueur d'environ 21 à 25 nucléotides), des shRNA, des micro-ARN (ARN simple brin non codants d'une longueur d'environ 21 à 25 nucléotides), des aptamères, ou des ribozymes ciblant un gène codant pour la périostine.
De préférence, ledit polynucléotide capable d'inhiber l'expression de la périostine est un ARN interférent (ARNi ou siRNA ).
Selon une disposition avantageuse, on peut utiliser l'ARNi de séquence SEQ ID NO : 1.
L'homme du métier dispose d'un très large choix d'éléments utilisables pour l'obtention de constructions d'ADN recombinant conformes à ce mode de mise en oeuvre de l'invention.
On peut également utiliser des anticorps bloquant dirigés contre la périostine ou des inhibiteurs de la périostine. De tels anticorps sont décrit par Zhu et al., 2011 et Orecchia et al., 2011.
L'augmentation de l'expression (i.e., surexpression) et/ou de l'activité de la périostine dans une cellule possédant un potentiel immunomodulateur telle que définie ci-dessus, peut être effectuée par la modification du génome de ladite cellule, par stimulation des voies de signalisation de la périostine dans ladite cellule ou par l'utilisation de médiateurs induisant l'expression de la périostine.
Cette modification du génome peut notamment s'effectuer par transformation génétique de ladite cellule par une ou plusieurs copies d'un polynucléotide codant pour ladite périostine, associé à des séquences de régulation en cis de son expression. La surexpression de ladite périostine peut également être obtenue par modification des séquences de régulation en cis de l'expression de ladite périostine, par exemple en remplaçant son promoteur endogène par un promoteur plus fort, permettant un WO 2013/190516 10 PCT / 1B2013 / 055111 Genetic modification techniques of cells are known from the skilled person. For example, Casteilla et al., 2008, describes a method of gene transfer into cells derived from adipose tissue using viral vectors.
According to this embodiment of the present invention, it is possible to use a recombinant DNA construct comprising one or more polynucleotides capable of inhibiting the expression of periostin. As non-examples limiting, said polynucleotides can encode antisense RNAs, such as oligonucleotides antisense morpholino, hairpin RNA, interfering RNA (RNA
double non-coding strand with a length of about 21 to 25 nucleotides), shRNAs, microphone-RNA (single-stranded non-coding RNA with a length of about 21 to 25 nucleotides), aptamers, or ribozymes targeting a gene encoding periostin.
Preferably, said polynucleotide capable of inhibiting the expression of Periostin is an interfering RNA (RNAi or siRNA).
According to an advantageous arrangement, the sequence RNAi can be used SEQ ID NO: 1.
The skilled person has a very wide choice of usable elements for obtaining recombinant DNA constructs conforming to this mode of implementation of the invention.
It is also possible to use blocking antibodies directed against periostin or periostin inhibitors. Such antibodies are described by Zhu et al., 2011 and Orecchia et al., 2011.
The increase in expression (ie, overexpression) and / or activity of periostin in a cell with such an immunomodulatory potential that defined above, can be performed by modifying the genome of said cell, by stimulation of periostin signaling pathways in said cell or by use mediators inducing the expression of periostin.
This modification of the genome can in particular be effected by genetic transformation of said cell by one or more copies of a polynucleotide coding for said periostin, associated with cis-regulatory sequences of his expression. Overexpression of said periostin can also be achieved by modification of the cis regulatory sequences of the expression of said periostin, by example by replacing its endogenous promoter with a stronger promoter, allowing a WO 2013/190516
11 PCT/1B2013/055111 niveau de transcription plus élevé, ou bien en adjoignant au promoteur endogène des séquences activatrices de la transcription, de type amplificateur , ou de la traduction.
Selon une modalité de ce mode de mise en oeuvre de la présente invention, on utilise une cassette d'expression, comprenant un polynucléotide codant pour une périostine telle que définie ci-dessus, placé sous le contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié. Ledit promoteur peut être un promoteur hétérologue. Dans ce cas, on peut utiliser par exemple un promoteur constitutif, tel que les promoteurs CMV, f3-actine, EF1-a, PGK et de l'Ubiquitine C, un promoteur spécifique d'un tissu donné ou un promoteur localement inductible.
On peut également utiliser des vecteurs recombinants, résultant de l'insertion d'une cassette d'expression telle que décrite ci-dessus dans un vecteur hôte.
Les cassettes d'expression et vecteurs recombinants tels que décrits ci-dessus peuvent, bien entendu, comprendre en outre d'autres séquences, usuellement employées dans ce type de constructions. Le choix de ces autres séquences sera effectué, de manière classique, par l'homme du métier en fonction notamment de critères tels que les cellules-hôtes choisies, les protocoles de transformation envisagés, etc.
On citera, à titre d'exemples non limitatifs, les terminateurs de transcription et les séquences de tête (séquences leader ). Ces séquences peuvent être celles qui sont naturellement associées au gène codant la périostine telle que définie ci-dessus, ou bien peuvent être des séquences hétérologues. Ces séquences n'interviennent pas sur les propriétés spécifiques du promoteur ou du gène auxquelles elles sont associées, mais peuvent améliorer globalement qualitativement ou quantitativement, la transcription, et le cas échéant, la traduction. On peut également, dans le but d'augmenter le niveau d'expression, utiliser des séquences amplificatrices (séquences enhancer ) de la transcription et de la traduction.
Panni les autres séquences couramment employées dans la construction de cassettes d'expression et vecteurs recombinants, on citera également les séquences permettant le suivi de la transformation, et l'identification et/ou la sélection des cellules transformées.
La stimulation de la voie de signalisation de la périostine peut être effectuée en stimulant la voie de signalisation de TGF-13 ou la voie de signalisation de la WO 2013/190516 11 PCT / 1B2013 / 055111 higher level of transcription, or by adding to the sponsor endogenous enhancer-enhancing transcriptional sequences, or the translation.
According to a modality of this embodiment of the present invention, an expression cassette comprising a polynucleotide coding for a periostin as defined above, under control transcriptional of a appropriate promoter. Said promoter may be a heterologous promoter. In this case, we can use for example a constitutive promoter, such as promoters CMV, f3-actin, EF1-a, PGK and Ubiquitin C, a specific promoter of a given tissue or a locally inducible promoter.
It is also possible to use recombinant vectors, resulting from insertion of an expression cassette as described above in a host vector.
Expression cassettes and recombinant vectors as described above.
above may, of course, furthermore comprise other sequences, usually used in this type of construction. The choice of these other sequences will be done, conventionally, by the person skilled in the art, in particular according to criteria such as selected host cells, the proposed transformation protocols, etc.
By way of nonlimiting examples, the terminators of transcription and leader sequences (leader sequences). These sequences can be those that are naturally associated with the gene encoding periostin such as defined above above, or can be heterologous sequences. These sequences will intervene not on the specific properties of the promoter or gene to which they are associated, but can improve overall qualitatively or quantitatively, the transcription, and where applicable, the translation. One can also, in order to increase level expression, use enhancer sequences (enhancer sequences) of the transcription and translation.
Among the other sequences commonly used in construction expression cassettes and recombinant vectors, mention may also be made of sequences allowing the monitoring of the transformation, and the identification and / or cell selection transformed.
Stimulation of the periostin signaling pathway can be performed by stimulating the TGF-13 signaling pathway or the signage of the WO 2013/190516
12 PCT/1B2013/055111 protéine morphogénétique osseuse (BMP) dans ladite cellule immunomodulatrice (voir pour revue Frangogiannis, 2012).
A titre d'exemples de médiateurs induisant l'expression de périostine, on peut citer l'angiotensine II, les cytokines IL-4 et IL-13 (voir pour revue Frangogiannis, 2012).
Le surnageant de culture d'une cellule isolée possédant un potentiel immunomodulateur, dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est modulée, telle que définie ci-dessus, peut être obtenu par culture de ladite cellule dans un milieu de culture approprié, et récupération et filtration du surnageant de culture.
La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant une cellule isolée possédant un potentiel immunomodulateur dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est modulée, ou le surnageant de culture de ladite cellule, tels que définis ci-dessus et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite composition, ledit véhicule pharmaceutiquement acceptable est adapté à la thérapie cellulaire. La préparation de cellules stromales pour leurs utilisations en thérapie cellulaire est bien connue de l'homme du métier (Le Blanc et al., 2008, Constantin et al., 2009, Garcia-Olmo et al., 2009, Gonzàlez et al., 2009a et 2009b et Karussis et al., 2010).
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une cellule isolée possédant un potentiel immunomodulateur dans laquelle l'expression et/ou l'activité
de la périostine est modulée, ou le surnageant de culture de ladite cellule, ou d'une composition pharmaceutique, tels que définis ci-dessus, pour la fabrication d'un médicament immunosuppresseur ou immunostimulateur tels que définis ci-dessus.
La présente invention a également pour objet une méthode pour la régénération d'un tissu, la greffe d'organe ou pour traiter ou prévenir une maladie telles que définie ci-dessus, comprenant l'administration audit sujet d'une quantité
thérapeutiquement efficace d'une cellule isolée possédant un potentiel immunomodulateur dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est modulée, ou le surnageant de culture de ladite cellule, ou d'une composition pharmaceutique tels que définis ci-dessus.
La présente invention a également pour objet l'utilisation in vitro d'une cellule isolée possédant un potentiel immunomodulateur dans laquelle l'expression et/ou WO 2013/190516 12 pct / 1b2013 / 055111 bone morphogenetic protein (BMP) in said immunomodulatory cell (see for review Frangogiannis, 2012).
As examples of mediators inducing the expression of periostin, one may include angiotensin II, cytokines IL-4 and IL-13 (see for review Frangogiannis, 2012).
The culture supernatant of an isolated cell with potential immunomodulator, in which the expression and / or activity of periostin is modulated, as defined above, can be obtained by culturing said cell in a medium of appropriate culture, and recovery and filtration of the culture supernatant.
The present invention also relates to a composition pharmaceutical composition comprising an isolated cell having a potential immunomodulatory wherein the expression and / or activity of periostin is modulated, or the supernatant of culture of said cell, as defined above and at least one vehicle pharmaceutically acceptable.
According to an advantageous embodiment of said composition, said Pharmaceutically acceptable vehicle is suitable for cell therapy. The preparation of stromal cells for their uses in cell therapy is well known from the person skilled in the art (Le Blanc et al., 2008, Constantin et al., 2009, Garcia-Olmo et al., 2009, Gonzalez et al., 2009a and 2009b and Karussis et al., 2010).
The present invention also relates to the use of a cell isolated having an immunomodulatory potential in which the expression and / or activity periostin is modulated, or the culture supernatant of said cell, or a pharmaceutical composition, as defined above, for the manufacture a immunosuppressive or immunostimulatory drug as defined above.
Another subject of the present invention is a method for regeneration of a tissue, organ transplant or to treat or prevent a disease such as defined above, including administering to said subject a quantity therapeutically effective isolated cell with potential immunomodulatory wherein the expression and / or activity of periostin is modulated, or the supernatant of culture of said cell, or a pharmaceutical composition such as defined above.
The subject of the present invention is also the use in vitro of a isolated cell having an immunomodulatory potential in which the expression and / or WO 2013/190516
13 PCT/1B2013/055111 l'activité de la périostine est modulée, telle que définie ci-dessus, pour identifier (ou cribler) un produit modifiant les effets de la périostine dans ladite cellule.
La présente invention a également pour objet un modèle in vitro pour réaliser des tests pharmacologiques ou toxicologiques, comprenant une cellule isolée possédant un potentiel immunomodulateur dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est modulée, telle que définie ci-dessus, pour identifier (ou cribler) un produit modifiant les effets de la périostine dans ladite cellule.
La présente invention a également pour objet -une protéine choisie parmi la périostine et une protéine comprenant le premier, deuxième, troisième et/ou quatrième domaine FAS1, préférentiellement le deuxième domaine FAS1, de la périostine, de préférence la périostine, -une molécule d'acide nucléique comprenant une séquence codant pour ladite protéine ou - une composition pharmaceutique comprenant ladite protéine ou ladite molécule d'acide nucléique, et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable, pour son utilisation comme médicament immunostimulateur destiné à
la vaccination, c'est-à-dire un adjuvant vaccinal ou dans le traitement d'un cancer ou d'une infection liés à un déficit immunitaire, d'un déficit sélectif ou combiné en immunoglobulines, d'un déficit isolé en lymphocytes T, d'un déficit en purine nucléoside phosphorylase, d'un déficit immunitaire combiné sévère par déficit en adénosine désaminase, ou de l'hypogammaglobulinémie commune d'expression variable.
L'invention englobe la périostine naturelle, recombinante ou synthétique.
Par périostine recombinante on entend la périostine produite par génie génétique, par exemple par clonage et amplification génique.
Par périostine synthétique on entend la périostine produite par synthèse enzymatique et/ou chimique.
Ladite périostine peut être d'origine humaine telle que décrite ci-dessus, ou d'origine animale.
La molécule d'acide nucléique codant pour ladite protéine est obtenue par des méthodes classiques, connues en elles-mêmes de l'homme du métier, en suivant les protocoles standards (voir par exemple la Demande Internationale WO
2010/025555).
WO 2013/190516 13 PCT / 1B2013 / 055111 the activity of periostin is modulated, as defined above, for identify (or screening) a product modifying the effects of periostin in said cell.
The subject of the present invention is also an in vitro model for carry out pharmacological or toxicological tests, including a cell isolated having an immunomodulatory potential in which the expression and / or activity of the periostin is modulated, as defined above, to identify (or to sift) a product modifying the effects of periostin in said cell.
The present invention also relates to -a protein selected from periostin and a protein comprising the first, second, third and / or fourth domain FAS1, preferentially second domain FAS1, periostin, preferably periostin, -a nucleic acid molecule comprising a coding sequence for said protein or a pharmaceutical composition comprising said protein or said nucleic acid molecule, and at least one pharmaceutically acceptable vehicle acceptable for use as an immunostimulatory drug for the vaccination, that is to say, a vaccine adjuvant or in the treatment of a cancer or infection related to immune deficiency, selective or combined immunoglobulins, isolated T-cell deficiency, purine deficiency nucleoside phosphorylase, a severe combined immunodeficiency deficiency adenosine deaminase, or common hypogammaglobulinemia of variable expression.
The invention encompasses natural, recombinant or synthetic periostin.
By recombinant periostin is meant periostin produced by genetic engineering, for example by cloning and gene amplification.
By synthetic periostin is meant periostin produced by enzymatic and / or chemical synthesis.
Said periostin may be of human origin as described above, or of animal origin.
The nucleic acid molecule encoding said protein is obtained by conventional methods, known in themselves to those skilled in the art, in following the standard protocols (see for example the International Application WO
2010/025555).
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14 PCT/1B2013/055111 Ladite molécule d'acide nucléique peut se présenter sous la foime d'un vecteur recombinant eucaryote ou procaryote, comprenant un insert constitué
par un polynucléotide codant pour la périostine. De nombreux vecteurs dans lesquels on peut insérer un polynucléotide d'intérêt afin de l'introduire et de le maintenir dans une cellule hôte eucaryote ou procaryote, sont connus en eux-mêmes ; le choix d'un vecteur approprié
dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple expression de cette séquence ou intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte. Par exemple, on peut utiliser des vecteurs viraux ou non-viraux comme des plasmides.
De préférence, ledit vecteur recombinant est un vecteur d'expression dans lequel ledit polynucléotide est placé sous le contrôle d'éléments régulateurs de la transcription et de la traduction appropriés.
La présente invention a également pour objet un inhibiteur de la périostine sélectionné dans le groupe constitué par un anticorps bloquant anti-périostine, un ARN antisens, un oligonucléotide antisens morpholino, un ARN en épingle à
cheveux, un ARN interférent (ARNi), un aptamère dirigés contre la périostine, ou une composition pharmaceutique comprenant ledit inhibiteur et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable, pour son utilisation comme médicament immunosuppresseur destiné à
la régénération d'un tissu, à la greffe d'organe ou dans le traitement d'une maladie choisie dans le groupe constitué par la maladie du greffon contre l'hôte, les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, les rhumatismes inflammatoires chroniques, les maladies inflammatoires chroniques du système nerveux central, le lupus, les thyroïdites auto-immunes, les fistules anales complexes, les réactions asthmatiques de type hypersensibilité retardée de type IV, les cicatrices inflammatoires, les allergies, les nécroses tissulaires, les maladies auto-immunes, les ulcères, le diabète et les infections microbiennes.
La préparation d'anticorps anti-périostine est connue de l'homme du métier (voir Demande EP 2168599 Al). A titre d'exemple, d'anticorps bloquant anti-périostine humaine ont peut cités ceux décrits par Orecchia et al., 2011 et Zhu et al., 2011.
Selon une disposition avantageuse, on peut utiliser l'ARNi de séquence SEQ ID NO : 1.
A titre d'exemples non limitatifs de véhicule pharmaceutiquement WO 2013/190516 14 PCT / 1B2013 / 055111 Said nucleic acid molecule may be in the form of a recombinant eukaryotic or prokaryotic vector, comprising an insert constituted by by a polynucleotide encoding periostin. Many vectors in which we can insert a polynucleotide of interest to introduce and maintain it in a cell eukaryotic or prokaryotic host, are known in themselves; the choice of a vector appropriate depending on the intended use for that vector (eg expression of this sequence or integration into the chromosomal material of the host), as well as of nature of the host cell. For example, viral or non-viral vectors viral as plasmids.
Preferably, said recombinant vector is an expression vector in wherein said polynucleotide is under the control of regulatory elements of the proper transcription and translation.
The present invention also relates to an inhibitor of periostin selected from the group consisting of an anti-blocking antibody periostin, a Antisense RNA, a morpholino antisense oligonucleotide, an RNA pinned to hair, a Interfering RNA (RNAi), an aptamer directed against periostin, or composition pharmaceutical composition comprising said inhibitor and at least one vehicle pharmaceutically acceptable for use as an immunosuppressive drug for the tissue regeneration, organ transplantation or in the treatment of selected disease in the group consisting of graft-versus-host disease, diseases inflammatory bowel disease, inflammatory rheumatism chronicles, inflammatory diseases of the central nervous system, lupus, thyroiditis autoimmune, complex anal fistulas, asthmatic reactions of type delayed hypersensitivity type IV, inflammatory scars, allergies, tissue necrosis, autoimmune diseases, ulcers, diabetes and infections microbial.
The preparation of anti-periostin antibodies is known to the human profession (see Application EP 2168599 A1). For example, blocking antibodies anti-human periostin may have been those described by Orecchia et al., 2011 and Zhu et al., 2011.
According to an advantageous arrangement, the sequence RNAi can be used SEQ ID NO: 1.
As non-limiting examples of a pharmaceutically acceptable vehicle WO 2013/190516
15 PCT/1B2013/055111 acceptable, on peut citer les dispersants, solubilisants, stabilisants, conservateurs, etc. Des véhicules pharmaceutiquement acceptables utilisables dans des formulations (liquides et/ou injectables et/ou solides) sont notamment la méthylcellulose, l'hydroxyméthylcellulose, la carboxyméthylcellulose, les cyclodextrines, le polysorbate 80, le mannitol, la gélatine, le lactose, des huiles végétales ou animales, l'acacia, etc.
Ledit médicament ou ladite composition pharmaceutique peut se présenter sous la forme d'une solution saline, physiologique, isotonique et tamponnée, compatible avec un usage pharmaceutique et connu de l'homme du métier.
La quantité de ladite protéine ou dudit inhibiteur de la périostine utilisée à titre de médicament selon l'invention ou présente dans la composition pharmaceutique selon l'invention peut être modulée de façon à obtenir un taux circulant de principe actif (dans un liquide physiologique tel que le sang) nécessaire à l'obtention de l'effet thérapeutique désiré pour un sujet particulier. La quantité choisie dépendra de multiples facteurs, en particulier de la voie d'administration, de la durée d'administration, du moment de l'administration, de la vitesse d'élimination du composé, du ou des différents produits utilisés en combinaison avec ledit médicament ou ladite composition pharmaceutique, de l'âge, du poids et de la condition physique du patient, ainsi que de son histoire médicale, et de toutes autres informations connues en médecine.
Le médicament ou la composition pharmaceutique selon la présente invention peut être utilisé seul ou en association avec au moins un autre composé
thérapeutiquement actif, tel que par exemple un antigène ou un second composé
immunostimulateur ou immunosuppresseur selon l'utilisation désirée du médicament.
L'utilisation dudit médicament ou de ladite composition pharmaceutique, et dudit composé
thérapeutiquement actif peut être simultanée, séparée ou étalée dans le temps.
La présente invention a également pour objet une méthode de traitement ou de prévention, chez un sujet, d'un cancer ou d'une infection liés à un déficit immunitaire, d'un déficit sélectif ou combiné en immunoglobulines, d'un déficit isolé en lymphocytes T, d'un déficit en purine nucléoside phosphorylase, d'un déficit immunitaire combiné sévère par déficit en adénosine désaminase ou de l'hypogammaglobulinémie commune d'expression variable, comprenant l'administration audit sujet d'une quantité
thérapeutiquement efficace de ladite composition pharmaceutique comprenant ladite protéine (la périostine ou une protéine comprenant 1, 2, 3 ou 4 domaines FAS1 de la WO 2013/190516 15 PCT / 1B2013 / 055111 acceptable, mention may be made of dispersants, solubilizers, stabilizers, curators, etc. of the pharmaceutically acceptable carriers for use in formulations (liquids and / or injectables and / or solids) include methylcellulose, hydroxymethylcellulose, carboxymethylcellulose, cyclodextrins, polysorbate 80, mannitol, gelatin, the lactose, vegetable or animal oils, acacia, etc.
Said medicament or said pharmaceutical composition may be present in the form of saline, physiological, isotonic and buffered compatible with a pharmaceutical use and known to those skilled in the art.
The amount of said protein or periostin inhibitor used as a medicament according to the invention or present in the composition pharmaceutical according to the invention can be modulated so as to obtain a circulating rate of active ingredient (in a physiological fluid such as blood) necessary to obtain the effect desired therapeutic for a particular subject. The quantity chosen will depend multiple factors, in particular the route of administration, duration administration, time of administration, the rate of elimination of the compound, the different products used in combination with said medicament or said composition the age, weight and physical condition of the patient, as well as his medical history, and any other information known in medicine.
The drug or pharmaceutical composition according to the present invention can be used alone or in combination with at least one other compound therapeutically active, such as for example an antigen or a second compound immunostimulator or immunosuppressant according to the desired use of the drug.
The use of said drug or said pharmaceutical composition, and said compound Therapeutically active can be simultaneous, separate or spread over time.
The present invention also relates to a method of treatment or prevention, in a subject, of a cancer or infection related to a deficit immune system, selective or combined immunoglobulin deficiency, isolated deficit in T lymphocytes, a purine nucleoside phosphorylase deficiency, a deficiency immune combined with severe adenosine deaminase deficiency or hypogammaglobulinemia variable expression, including the administration to said subject of a quantity therapeutically effective of said pharmaceutical composition comprising said protein (periostin or a protein comprising 1, 2, 3 or 4 domains FAS1 of the WO 2013/190516
16 PCT/1B2013/055111 périostine) ou une molécule d'acide nucléique comprenant une séquence codant pour ladite protéine, telle que définie ci-dessus.
La présente invention a également pour objet une méthode de régénération d'un tissu, de greffe d'un organe ou de traitement ou de prévention d'une maladie choisie dans le groupe constitué par la maladie du greffon contre l'hôte, les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, les rhumatismes inflammatoires chroniques, les maladies inflammatoires chroniques du système nerveux central, le lupus, les thyroïdites auto-immunes, les fistules anales complexes, les réactions asthmatiques de type hypersensibilité retardée de type IV, les cicatrices inflammatoires, les allergies, les nécroses tissulaires, les maladies auto-immunes, les ulcères, le diabète et les infections microbiennes, chez un sujet, comprenant l'administration audit sujet d'une quantité
thérapeutiquement efficace de ladite composition pharmaceutique comprenant un anticorps bloquant anti-périostine, un ARN antisens, un oligonucléotide antisense morpholino, un ARN en épingle à cheveux, un ARN interférent (ARNi), un aptamère dirigés contre la périostine, telle que définie ci-dessus Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples montrant in vitro l'effet de la modulation de l'expression de la périostine dans les cellules stromales mésenchyrnateuses dérivées du tissu adipeux (ASC) sur le potentiel immunomodulateur de ces cellules, ainsi qu'aux figures annexées, dans lesquels :
- la Figure 1 représente l'effet de l'ARNi dirigé contre POSTN
(siRNA POSTN) et de l'ARNi non spécifique contrôle (siRNA scramble) sur la quantité
d'ARNm codant pour PUM1 (utilisé comme contrôle) dans les ASC traitées. A. La moyenne écart type à la moyenne (sem) après normalisation des valeurs est représentée sur le graphique. B. Le tableau représente les valeurs individuelles mesurées.
- la Figure 2 représente l'effet de l'ARNi dirigé contre POSTN
(siRNA POSTN) et de l'ARNi non spécifique contrôle (siRNA scramble) sur la quantité
d'ARNm codant pour la périostine dans les ASC traitées. A. La moyenne écart type à la moyenne (sem) est représentée après noimalisation des valeurs sur le graphique. B. Le tableau représente les valeurs individuelles mesurées.
WO 2013/190516 16 PCT / 1B2013 / 055111 periostin) or a nucleic acid molecule comprising a coding sequence for said protein as defined above.
The present invention also relates to a method of regeneration of a tissue, organ transplant or treatment or prevention of selected from the group consisting of graft disease against the host, inflammatory bowel diseases, rheumatism inflammatory chronic inflammatory diseases of the central nervous system, lupus, autoimmune thyroiditis, complex anal fistulas, reactions asthmatics delayed hypersensitivity type IV, inflammatory scars, allergies, tissue necrosis, autoimmune diseases, ulcers, diabetes and infections microbials, in a subject, including administration to said subject of a quantity therapeutically effective manner of said pharmaceutical composition comprising a antibody anti-periostin blocker, antisense RNA, antisense oligonucleotide morpholino, a Hairpin RNA, an interfering RNA (RNAi), an aptamer directed against the periostin, as defined above In addition to the foregoing, the invention includes other provisions, which will emerge from the following description, which refers to to examples showing in vitro the effect of modulation of periostin expression in the cells Mesenchrenal stromal derived adipose tissue (AUC) on the potential immunomodulator of these cells, and to the accompanying figures, in which :
- Figure 1 represents the effect of RNAi directed against POSTN
(siRNA POSTN) and non-specific RNAi control (siRNA scramble) on the quantity mRNA encoding PUM1 (used as a control) in the treated ASCs. To the average standard deviation to the mean (sem) after normalization of the values is represented on the graph. B. The table represents the individual values measured.
- Figure 2 represents the effect of RNAi directed against POSTN
(siRNA POSTN) and non-specific RNAi control (siRNA scramble) on the quantity mRNA encoding periostin in the treated ASCs. A. The average difference type at the mean (sem) is represented after noimalisation of the values on the graphic. Corn table represents the individual values measured.
WO 2013/190516
17 PCT/1B2013/055111 - la Figure 3 représente l'effet in vitro du traitement des ASC avec le ligand TLR3 Poly(I:C) seul ou en combinaison avec la périostine (POSTN) à une dose de 1, 2, 4, ou 10 kig/ml, sur l'expression de l'ARNm POSTN (A) et IDO1 (B).
- la Figure 4 représente le dosage de l'IDO-1 dans le surnagent de culture d'ASC traitées avec unARNi dirigé contre POSTN (siRNA POSTN) ou un ARNi non spécifique contrôle (siRNA scramble).
-la Figure 5 représente l'effet de l'ARNi dirigé contre POSTN
(siRNA POSTN) et de l'ARNi non spécifique contrôle (siRNA scramble) sur la quantité
d'ARNm codant pour POSTN, IDO1 (IDO) et IFN-13 (IFNB) dans les BM-MSC
traitées.
- la Figure 6 représente (A) l'effet in vitro du traitement des ASC
avec l'IFNy (A) à une dose de 4, 20, 100 ou 500 Ul/ml sur l'expression de PARNm POSTN et (B) l'effet in vitro du traitement des ASC avec l'IFNy à une dose de 100 Ul/ml en combinaison avec la périostine (POSTN) à une dose de 1, 2, 4, ou 10 tg/ml, sur l'expression de l'ARNm IDO1.
EXEMPLE 1: EFFET IN VITRO DE L'INHIBITION DE L'EXPRESSION DE LA
PERIOSTINE DANS LES CELLULES STROMALES MESENCHYMATEUSES
DERIVEES DU TISSU ADIPEUX (ASC) 1) Matériels et méthodes Isolement des cellules stromales mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux humain (ASC) La fraction stroma vasculaire (SVF) a été isolée à partir de tissu adipeux sous-cutané humain par digestion avec la collagénase NB4 (0,4 U/m1 final dans le milieu a-MEM + Ciprofloxacine 10 pg/rnl final [= milieu a-MEM OK]) pendant 45 min à
sous agitation. La digestion a été arrêtée en utilisant le milieu a-MEM OK
froid. La suspension cellulaire a ensuite été filtrée à travers une membrane de nylon 100 m. Après centrifugation pendant 10 min à 1600 rpm, les cellules ont été reprises dans le milieu de culture CPM (a-MEM OK + Héparine 1 U/ml + 2% de plasma enrichi en facteur de croissance plaquettaire) et comptées sur un automate Countesse, selon les informations du fabricant (LifeTechnologies).
Les cellules de la SVF ont été étalées à une densité de 4000 cellules/cm2 dans le milieu CPM. Après 12h de culture à 37 C et 5% de CO2, les cellules non adhérentes ont été retirées par lavage au PBS (phosphate-buffered saline). La fraction WO 2013/190516 17 PCT / 1B2013 / 055111 FIG. 3 represents the in vitro effect of ASC treatment with the Poly (I: C) TLR3 ligand alone or in combination with periostin (POSTN) at a dose of 1, 2, 4, or 10 kig / ml, on expression of POSTN (A) and IDO1 (B) mRNA.
FIG. 4 represents the dosage of IDO-1 in the supernatant of culture of ASC treated with an RNA directed against POSTN (siRNA POSTN) or a RNAi non-specific control (siRNA scramble).
-Figure 5 shows the effect of RNAi directed against POSTN
(siRNA POSTN) and non-specific RNAi control (siRNA scramble) on the quantity of mRNA coding for POSTN, IDO1 (IDO) and IFN-13 (IFNB) in BM-MSC
processed.
FIG. 6 represents (A) the in vitro effect of ASC treatment with IFNy (A) at a dose of 4, 20, 100 or 500 IU / ml on the expression of mRNA
POSTN and (B) the in vitro effect of treating AUCs with IFNy at a dose of 100 IU / ml in combination with periostin (POSTN) at a dose of 1, 2, 4, or 10 tg / ml, sure the expression of IDO1 mRNA.
EXAMPLE 1: IN VITRO EFFECT OF THE INHIBITION OF THE EXPRESSION OF THE
PERIOSTIN IN MESENCHYMAL STROMAL CELLS
ADIPOSE TISSUE DERIVATIVES (ASC) 1) Materials and methods Isolation of mesenchymal stromal cells derived from the tissue human adipose (ASC) The stromal vascular fraction (SVF) was isolated from adipose tissue human subcutaneous by digestion with collagenase NB4 (0.4 U / m1 final in the middle a-MEM + Ciprofloxacin 10 μg / ml final [= medium α-MEM OK]) for 45 min at with stirring. Digestion was stopped using medium a-MEM OK
cold. The cell suspension was then filtered through a nylon membrane 100 m. After centrifugation for 10 min at 1600 rpm, the cells were taken up in the middle of CPM culture (α-MEM OK + heparin 1 U / ml + 2% factor-enriched plasma platelet growth) and counted on a Countesse automaton, according to information from manufacturer (LifeTechnologies).
The cells of the SVF were spread at a density of 4000 cells / cm2 in the CPM environment. After 12 hours of culture at 37 C and 5% of CO2, the cells adherents were removed by washing with PBS (phosphate-buffered saline). The fraction WO 2013/190516
18 PCT/1B2013/055111 adhérente a ensuite été mise en culture in vitro dans le même milieu de culture CPM ; le milieu étant renouvellé trois fois par semaine. Après 8 jours de culture, les ASC (passage 0) ont été récoltées avec de la trypsine-EDTA (LifeTechnologies). Le nombre de cellules viables a été déterminé par l'exclusion du Trypan bleu sur un automate Countesse. Les cellules ont ensuite été étalées à une densité de 2000 cellules/cm2 et cultivées pendant 2 jours supplémentaires (passage 1). Le traitement avec l'ARNi (siRNA) a ensuite été
effectué.
Isolement des cellules stromales mésenchymateuses issues de la moelle osseuse (BM-MSC) Des cellules de moelle osseuse nucléées humaines ont d'abord été
ensemencées à raison de 5x104 cellules/cm2 dans un milieu de culture consistant en le milieu essentiel minimum alpha (aMEM) supplémenté par 10% de sérum filtré de veau foetal (SVF ; Hyclone), 1 ng/ml de facteur de croissance fibroblastique 2 (FGF2, R&D
Système, Lille, France), et 10 p,g/mL de la ciprofloxacine. Tout le milieu a été renouvelé
deux fois par semaine jusqu'à ce que les cellules atteignent la confluence (fin de PO).
Ensuite, les cellules ont été détachées à l'aide de la trypsine. Les cellules viables ont été
numérotées et réensemencés à 500 cellules/cm2 (passage Pl).
Traitement avec l'ARNi L'ARNi dirigé contre la périostine (POSTN) a été fourni par SIGMA
(MISSION esiRNA Human POSTN, EHU069741). Cet ARNi est dirigé contre les 4 isfoimes de la périostine humaine. L'ARNi non spécifique AF488 a été fourni par QIAGEN (siARN AllStarNeg AF488).
Après 2 jours de culture, le milieu de culture des ASC ou des BM-MSC a été remplacé par le milieu de culture pour le traitement avec l'ARNi, préparé
comme décrit ci-dessous.
Brièvement, 2 1 d'ARNi à 28 p,M ont été dilués dans 100 pl de milieu a-MEM OK, mélangés au vortex pendant 10 secondes et ensuite mélangés avec 12 p,1 de réactif HiPerfect (QIAGEN). Après mélange à nouveau au vortex, la suspension obtenue a été laissée 10 min à température ambiante avant d'être mélangée à 2 ml de milieu CPM.
Les cellules ASC ont alors été ajoutées à ce milieu. Les cellules ont ensuite été cultivées 4 jours dans ce milieu à 37 C et 5% de CO2.
WO 2013/190516 18 PCT / 1B2013 / 055111 adherent was then cultured in vitro in the same medium of CPM culture; the medium being renewed three times a week. After 8 days of cultivation, the ASC (passage 0) were harvested with trypsin-EDTA (LifeTechnologies). Number of cell viable was determined by excluding the blue Trypan on an automaton Countesse. The cells were then plated at a density of 2000 cells / cm 2 and grown during 2 additional days (passage 1). Treatment with RNAi (siRNA) was then summer made.
Isolation of mesenchymal stromal cells from the spinal cord bone (BM-MSC) Human nucleated bone marrow cells were first inoculated at a rate of 5 × 10 4 cells / cm 2 in a culture medium consisting of the minimal essential medium alpha (aMEM) supplemented with 10% filtered serum veal fetal (SVF; Hyclone), 1 ng / ml of fibroblastic growth factor 2 (FGF2, R & D
System, Lille, France), and 10 μg / ml of ciprofloxacin. The whole community has been renewed twice a week until the cells reach confluence (end of PO).
Then the cells were detached with trypsin. Cells viable have been numbered and reseeded at 500 cells / cm2 (passage P1).
Treatment with RNAi RNAi directed against periostin (POSTN) was provided by SIGMA
(MISSION esiRNA Human POSTN, EHU069741). This RNAi is directed against the 4 isfoimes of human periostin. Non-specific AF488 RNAi was provided by QIAGEN (siRNA AllStarNeg AF488).
After 2 days of culture, the culture medium of the ASC or BM-MSC has been replaced by the culture medium for treatment with RNAi, prepared as described below.
Briefly, 2 1 of 28 μM RNAi were diluted in 100 μl of medium a-MEM OK, vortexed for 10 seconds and then mixed with 12 p, 1 of HiPerfect reagent (QIAGEN). After vortexing again, the suspension obtained was left for 10 minutes at room temperature before being mixed with 2 ml of CPM medium.
The ASC cells were then added to this medium. The cells then been grown 4 days in this environment at 37 C and 5% CO2.
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19 PCT/1B2013/055111 Extraction des ARN
Après 4 jours de culture, le milieu de culture des a été retiré et les cellules ont été congelées à -80 C. L'extraction des ARNs a été effectuée selon les instructions du fabricant (RNeasy minikit, QIAGEN). Les ARN ont été quantifiés à l'aide de l'automate Nanodrop (ThermoScientific) et 1 tig dARN a été rétro-transcrit en utilisant le kit SuperScript One Step RT selon les recommandations du fabricant (LifeTechnologies).
RT-PCR quantitative (RT-qPCR) La quantification des ADNc a été réalisée en utilisant la technologie StepOnePlus et le Mix SybrGreen selon les instructions du fabricant (LifeTechnologies).
Amorces Les amorces utilisées pour la quantification des ARN sont les suivantes:
Tableau 1 :
Gène Amorce sens 5'-3' Amorce antisens 5'-3' PUMI AGTGGGGGACTAGGCGTTAG GTTTTCATCACTGTCTGCATCC
(SEQ ID NO : 2) (SEQ ID NO : 3) IFN-fl CCTGTGGCAATTGAATGGG GGCGTCCTCCTTCTGGAAC
(SEQ BD NO :4) (SEQ ID NO: 5) (SEQ ID NO :6) (SEQ ID NO: 7) (SEQ LD NO : 8) (SEQ ID NO : 9) HLA-G GAAGAGGAGACACGGAACACCA TCGCAGCCAATCATCCACTGGA
(SEQ ID NO : 10) (SEQ ID NO : 11) (SEQ ID NO: 12) (SEQ ID NO: 13) AIRE CAGACCATGTCAGCTTCAGTCC ACCTGGATGCACTTCTTGGAGC
(SEQ II) NO: 14) (SEQ ID NO: 15) POSTN CAGCAAACCACCTTCACGGATC TTAAGGAGGCGCTGAACCATGC
(SEQ ID NO : 16) (SEQ ID NO : 17) Pumillo-1 (PUM1) est utilisé en tant que gène de référence.
WO 2013/190516 19 pct / 1b2013 / 055111 RNA extraction After 4 days of culture, the culture medium was removed and the cells were frozen at -80 C. RNA extraction was performed according to manufacturer's instructions (RNeasy minikit, QIAGEN). RNAs were quantified help of the Nanodrop (ThermoScientific) automaton and 1 tig dARN was retro-transcribed using the SuperScript One Step RT kit according to the manufacturer's recommendations (LifeTechnologies).
Quantitative RT-PCR (RT-qPCR) Quantification of the cDNAs was performed using the technology StepOnePlus and SybrGreen Mix according to the manufacturer's instructions (LifeTechnologies).
primers The primers used for the quantification of RNAs are as follows:
Table 1:
Gene Primer sense 5'-3 'Antisense primer 5'-3' PUMI AGTGGGGGACTAGGCGTTAG GTTTTCATCACTGTCTGCATCC
(SEQ ID NO: 2) (SEQ ID NO: 3) IFN-fl CCTGTGGCAATTGAATGGG GGCGTCCTCCTTCTGGAAC
(SEQ BD NO: 4) (SEQ ID NO: 5) (SEQ ID NO: 6) (SEQ ID NO: 7) (SEQ ID NO: 8) (SEQ ID NO: 9) HLA-G GAAGAGGAGACACGGAACACCA TCGCAGCCAATCATCCACTGGA
(SEQ ID NO: 10) (SEQ ID NO: 11) (SEQ ID NO: 12) (SEQ ID NO: 13) AREA CAGACCATGTCAGCTTCAGTCC ACCTGGATGCACTTCTTGGAGC
(SEQ ID NO: 14) (SEQ ID NO: 15) POSTN CAGCAAACCACCTTCACGGATC TTAAGGAGGCGCTGAACCATGC
(SEQ ID NO: 16) (SEQ ID NO: 17) Pumillo-1 (PUM1) is used as a reference gene.
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20 PCT/1B2013/055111 Analyses statistiques Les résultats des RT-PCR quantitatives sont exprimés en valeurs moyennes écart type à la moyenne (sem). L'analyse de la significativité a été effectuée en utilisant le test de Mann 84 Whitney ou le test t de Student (Prism 5 logiciels). (* P <0,05, ** P <0,01).
Activité de l'ID dans le surnageant de culture d'ASC traitées avec l'ARNi dirigé contre POSTN
L'activité de 1'IDO-1 (indoleamine 2,3-dioxygénase 1) a été déterminée par chromatographie en phase liquide à haute performance en mesurant la concentration en kynurénine dans le surnageant de culture des ASC traitées avec l'ARNi dirigé
contre POSTN ou un ARNi non spécifique, et en utilisant la 3-nitro-L-tyrosine comme étalon interne. La kynurénine et la 3-nitro-L-tyrosine ont été détectées par absorption UV à 360 nm.
2) Résultats Le traitement des ASC avec l'ARNi dirigé contre POSTN n'induit pas de modification significative de l'expression de PUM1 par rapport au traitement avec l'ARNi non spécifique (voir Figure 1). L'ARNi non spécifique peut donc être utilisé
comme ARNi contrôle.
La quantité d'ARNm codant pour la périostine a ensuite été déterminée par RT-qPCR après le traitement des ASC avec l'ARNi dirigé contre POSTN ou l'ARNi non spécifique. Les résultats sont représentés à la Figure 2. Ces résultats montrent que le traitement des ASC avec l'ARNi dirigé contre POSTN est efficace pour inhiber l'expression de POSTN dans ces cellules.
La quantité d'ARNm codant pour différentes protéines immunosuppressives a ensuite été déterminée par RT-qPCR après le traitement des ASC
avec l'ARNi dirigé contre POSTN ou l'ARNi non spécifique. Les résultats sont représentés au Tableau 2 ci-dessous.
Tableau 2 : effet de l'ARNi dirigé contre POSTN et de l'ARNi non spécifique contrôle sur la quantité d'ARNm codant pour la périostine (POSTN) et différentes protéines immunosuppressives dans les ASC traitées. Les moyennes écart type après normalisation des valeurs mesurées sont représentées.
WO 2013/190516 20 PCT / 1B2013 / 055111 Statistical analyzes Quantitative RT-PCR results are expressed in terms of mean standard deviation (mean). The analysis of significance has been carried out in using the Whitney Mann 84 test or the Student's t test (Prism 5 software). (* P <0.05, ** P <0.01).
ID activity in culture supernatant of ASC treated with RNAi directed against POSTN
The activity of IDO-1 (indoleamine 2,3-dioxygenase 1) was determined by high performance liquid chromatography by measuring the concentration in kynurenin in the culture supernatant of ASC treated with RNAi-directed against POSTN or nonspecific RNAi, and using 3-nitro-L-tyrosine as standard internal. Kynurenine and 3-nitro-L-tyrosine were detected by UV absorption at 360 nm.
2) Results Treatment of ASC with RNAi against POSTN does not induce significant change in PUM1 expression compared to treatment with RNAi non-specific (see Figure 1). Non-specific RNAi can therefore be used as RNAi control.
The amount of mRNA encoding periostin was then determined by RT-qPCR after treatment of ASC with RNAi against POSTN or RNAi not specific. The results are shown in Figure 2. These results show that the ASC treatment with RNAi against POSTN is effective in inhibiting the expression of POSTN in these cells.
The amount of mRNA coding for different proteins Immunosuppressive was then determined by RT-qPCR after treatment CHWs with RNAi directed against POSTN or non-specific RNAi. The results are represented in Table 2 below.
Table 2: Effect of RNAi directed against POSTN and non-specific RNAi control over the amount of mRNA encoding periostin (POSTN) and different proteins immunosuppressive agents in treated ASCs. The standard deviations after normalization measured values are represented.
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21 PCT/1B2013/055111 ARNi non spécifique ARNi POSTN
Protéine Moyenne sem Moyenne sem POSTN 1,00 0,00 0,08 0,03 IFN-P 1,00 0,00 289,38 120,77 IDO-1 1,00 0,00 92,74 72,18 TSG-6 1,00 0,00 1,89 0,59 HLA-G 1,00 0,00 3,70 1,64 IL-1RA 1,00 0,00 4,00 1,81 AIRE 1,00 0,00 2,15 0,48 Ces résultats montrent que l'inhibition de l'expression de POSTN par une stratégie d'ARN interférent induit une très forte augmentation de l'expression de 1'IFN-13 (Interféron béta) et de l'IDO-1 (Indoléamine- 2,3-dioxygénase 1) et une augmentation de l'expression de TSG-6 ( Tumor necrosis factor-inducible gene protein ), HLA-G (Antigène du complexe majeur d'histocompatibilité, Classe I, G), IL-1RA (Antagoniste au récepteur de l'Interleukine-1) et AIRE ( Autoimmune regulator ).
Ces résultats suggèrent que la périostine contrôle l'expression des gènes codant IFN-f3 et l'IDO-1, qui possèdent des propriétés immunosuppressives. Ces résultats suggèrent également que la périostine contrôle l'activité immunomodulatrice des ASC.
En outre, l'inhibition de l'expression de POSTN par une stratégie d'ARN
interférent induit une très forte augmentation de l'activité de 1'IDO-1 dans le surnageant de culture des ASC traitées avec l'ARNi dirigé contre POSTN (voir Figure 4).
Dans la mesure où les ASC possèdent des caractéristiques similaires aux autres cellules souches/stromales mésenchymateuses, et aux cellules progénitrices, cellules précurseurs, cellules différenciées à partir d'une cellule stromale mésenchyrnateuse, macrophages, monocytes, mastocytes, cellules myéloïdes, fibroblastes, cellules dendritiques, lymphocytes (par exemple lymphocytes Treg), cellules NK, cellules lymphoïdes et myoblastes, il est probable que la périostine joue également un rôle dans la modulation des propriétés immunosuppressives de ces cellules.
Des résultats similaires ont d'ailleurs été obtenus avec des cellules stromales mésenchymateuses issues de la moelle osseuse (BM-MSC) : l'inhibition de l'expression de POSTN par une stratégie d'ARN interférent a induit une très forte WO 2013/190516 21 PCT / 1B2013 / 055111 RNAi non-specific RNAi POSTN
Protein Average sem Sem sem POSTN 1.00 0.00 0.08 0.03 IFN-P 1.00 0.00 289.38 120.77 IDO-1 1.00 0.00 92.74 72.18 TSG-6 1.00 0.00 1.89 0.59 HLA-G 1.00 0.00 3.70 1.64 IL-1RA 0,00 4.00 1.81 AREA 1.00 0.00 2.15 0.48 These results show that the inhibition of POSTN expression by an interfering RNA strategy induces a very strong increase in the expression of IFN-13 (Interferon beta) and IDO-1 (Indoleamine-2,3-dioxygenase 1) and a increased expression of TSG-6 (Tumor necrosis factor-inducible gene protein), HLA-G (Major Histocompatibility Complex Antigen, Class I, G), IL-1RA (Interleukin-1 receptor antagonist) and AIRE (Autoimmune regulator).
These results suggest that periostin controls gene expression encoding IFN-f3 and IDO-1, which possess immunosuppressive properties. These results also suggest that periostin controls the immunomodulatory activity ASCs.
In addition, the inhibition of POSTN expression by an RNA strategy interferent induces a very strong increase in the activity of IDO-1 in the supernatant of culture of ASC treated with RNAi against POSTN (see Figure 4).
Since ASCs have characteristics similar to those other mesenchymal stem / stromal cells, and to the cells progenitor, cells precursors, differentiated cells from a stromal cell mésenchyrnateuse, macrophages, monocytes, mast cells, myeloid cells, fibroblasts, cells dendritic cells, lymphocytes (eg Treg cells), NK cells, cell lymphoids and myoblasts, it is likely that periostin also plays a role in role in the modulation of the immunosuppressive properties of these cells.
Similar results have been obtained with cells stromal mesenchymal bone marrow (BM-MSC): inhibition of the expression of POSTN by an interfering RNA strategy induced a very strong WO 2013/190516
22 PCT/1B2013/055111 augmentation de l'expression de l'IDO-1 et de l'IFN-P par les BM-MSC (voir Figure 5).
L'effet de la modulation de l'expression de la périostine sur le potentiel immunomodulateur des cellules n'est donc pas spécifique aux cellules stromales mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (ASC), mais s'exerce aussi notamment sur les cellules stromales mésenchymateuses issues de la moelle osseuse (BM-MSC).
Par ailleurs, il a été montré que les cellules stromales mésenchymateuses humaines présentent des fonctions d'effecteurs antimicrobiens induites par l'indoléamine-2,3-dioxygénase (IDO), contre différents pathogènes, tels que les bactéries, les parasites protozoaires et les virus (Meisel et al., 2011 et Krampera, 2011).
Les résultats obtenus ci-dessus suggèrent par conséquent qu'une cellule isolée possédant un potentiel immunomodulateur, de préférence une ASC, dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est inhibée présente des propriétés anti-microbiennes, dans la mesure où l'expression d'IDO-1 est significativement augmentée dans ladite cellule.
EXEMPLE 2: EFFET IN VITRO DE L'AJOUT DE LA PERIOSTINE DANS LES
I) Matériels et méthodes L'isolement des cellules stromales mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux humain (ASC) a été effectué comme précédemment décrit à l'Exemple 1-1 ci-dessus, à l'exception que les cellules de la SVF ont été étalées à une densité
de 2000 cellules/cm2 et cultivées pendant 5 jours supplémentaires (passage 1) avec un changement de milieu de culture au bout de 2 jours.
Après les 5 jours de culture en passage 1, les cellules ont été traitées avec du Poly(I:C) qui est un ligand de TLR3 (InvivoGen, Poly(I:C)-LMW) et/ou la périostine (POSTN ; R&D SYSTEMS, Reconbinant Human Periostin/OSF-2). Le milieu utilisé
pour le traitement est le milieu CPM additionné de Poly(I:C) à une concentration de 500 g/mi et/ou de la périostine (POSTN) à une concentration de 1, 2, 4 ou 10 ltg/m1.
Après 24 heures de traitement le milieu a été retiré et les cellules ont été
congelées à -80 C. L'extraction des ARNs IDO1 et la RT-qPCR ont été effectuées comme précédemment (voir Exemple 1-1 ci-dessus).
WO 2013/190516 22 PCT / 1B2013 / 055111 increased expression of IDO-1 and IFN-P by BM-MSC (see Figure 5).
The effect of modulation of periostin expression on the potential immunomodulator of the cells is therefore not specific to stromal cells mesenchymal tissue derived from adipose tissue (ASC), but also especially on Mesenchymal stromal cells from the bone marrow (BM-MSC).
Moreover, it has been shown that mesenchymal stromal cells humans have antimicrobial effectors functions induced by the indoléamine-2,3-dioxygenase (IDO), against different pathogens, such as bacteria, parasites protozoa and viruses (Meisel et al., 2011 and Krampera, 2011).
The results obtained above therefore suggest that a cell isolated having an immunomodulatory potential, preferably an ASC, in which the expression and / or activity of periostin is inhibited present anti-properties microbials, since the expression of IDO-1 is significantly increased in said cell.
EXAMPLE 2: IN VITRO EFFECT OF THE ADDITION OF PERIOSTIN IN THE
I) Materials and methods Isolation of mesenchymal stromal cells derived from the tissue human adipose (ASC) was performed as previously described in Example 1-1 this-above, with the exception that the FCS cells were spread at a specific density from 2000 cells / cm2 and cultured for an additional 5 days (pass 1) with a change of culture medium after 2 days.
After 5 days of culture in passage 1, the cells were treated with Poly (I: C) which is a ligand of TLR3 (InvivoGen, Poly (I: C) -LMW) and / or the periostin (POSTN; R & D SYSTEMS, Human Reconbinant Periostin / OSF-2). The medium used for the treatment is the CPM medium supplemented with Poly (I: C) at a concentration of 500 g / mi and / or periostin (POSTN) at a concentration of 1, 2, 4 or 10 μg / ml.
After 24 hours of treatment the medium was removed and the cells were frozen at -80 C. The extraction of IDO1 and RT-qPCR were carried out as previously (see Example 1-1 above).
WO 2013/190516
23 PCT/1B2013/055111 2) Résultats Les résultats sont représentés à la Figure 3.
Les propriétés immunosuppressives des ASC ont été stimulées par l'ajout de Poly(I:C).
L'ajout de doses croissantes de périostine inhibe l'effet de Poly(I:C) sur l'expression d' ID01.
Ces résultats montrent que lorsque l'on stimule l'effet immunosuppresseur, l'ajout de POSTN inhibe cet effet.
Des résultats similaires ont été obtenus en remplaçant le Poly(I:C) par l'IFNy (R&D SYSTEMS), qui est un stimulus capable d'induire aussi la production de l'IDO-1. En effet, l'ajout d'IFN7 a induit une diminution de l'expression de POSTN par les ASC (mesurée par RT-qPCR) de manière dose-dépendante et l'ajout de POSTN dans le surnagent de culture des ASC a inhibé l'expression de l'IDO-1 induite par l'IFNy (voir Figure 6). Ces résultats montrent que l'effet de POSTN n'est pas spécifique à
TLR3.
L'augmentation de l'expression de la périostine dans les cellules stromales mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (ASC) peiinet donc de diminuer le potentiel immunosuppresseur de ces cellules.
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WO 2013/190516 23 PCT / 1B2013 / 055111 2) Results The results are shown in Figure 3.
The immunosuppressive properties of ASC were stimulated by the addition Poly (I: C).
The addition of increasing doses of periostin inhibits the effect of Poly (I: C) on the expression of ID01.
These results show that when the effect is stimulated immunosuppressant, the addition of POSTN inhibits this effect.
Similar results were obtained by replacing Poly (I: C) with the IFNy (R & D SYSTEMS), which is a stimulus capable of inducing also the production of IDO-1. In fact, the addition of IFN7 induced a decrease in the expression of POSTN by the AUC (measured by RT-qPCR) in a dose-dependent manner and the addition of POSTN in the AUC supernatant inhibited the expression of IDO-1 induced by the IFNy (see Figure 6). These results show that the effect of POSTN is not specific to TLR3.
Increased expression of periostin in cells mesenchymal stromal derived adipose tissue (ASC) peiinet therefore from decrease immunosuppressive potential of these cells.
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Claims (17)
de ladite périostine. 2. Cell or supernatant for its use according to claim 1, characterized in that the expression is totally or partially inhibited and / or activity of said periostin.
la régénération d'un tissu, à la greffe d'organe ou dans le traitement d'une maladie choisie dans le groupe constitué par la maladie du greffon contre l'hôte, les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, les rhumatismes inflammatoires chroniques, les maladies inflammatoires chroniques du système nerveux central, le lupus, les thyroïdites auto-immunes, les fistules anales complexes, les réactions asthmatiques de type hypersensibilité retardée de type IV, les cicatrices inflammatoires, les allergies, les nécroses tissulaires, les maladies auto-immunes, les ulcères, le diabète et les infections microbiennes. Cell or supernatant for use according to claim 2, characterized in that said medicament is an immunosuppressive drug intended for tissue regeneration, organ transplantation or in the treatment of selected disease in the group consisting of graft-versus-host disease, diseases inflammatory bowel disease, inflammatory rheumatism chronicles, inflammatory diseases of the central nervous system, lupus, thyroiditis autoimmune, complex anal fistulas, asthmatic reactions of type delayed hypersensitivity type IV, inflammatory scars, allergies, tissue necrosis, autoimmune diseases, ulcers, diabetes and infections microbial.
sévère par déficit en adénosine désaminase et l'hypogammaglobulinémie commune d'expression variable. Cell or supernatant for use according to claim 6 or according to claim 7, characterized in that said medicament is a medicament immunostimulator for vaccination or treatment of a disease selected in the group consisting of cancer or infection related to a deficit immune, a selective or combined immunoglobulin deficiency, an isolated deficiency in T lymphocytes, one purine nucleoside phosphorylase deficiency, a combined immunodeficiency severe by adenosine deaminase deficiency and common hypogammaglobulinemia expression variable.
l'une quelconque des revendications 1, 2, 7-7 et 9-12, pour identifier un produit modifiant les effets de la périostine dans ladite cellule. 14. In vitro model for performing pharmacological tests or toxicological data, including a diploid cell with potential immunomodulatory wherein the expression and / or activity of periostin is modulated, as defined in any one of claims 1, 2, 7-7 and 9-12 to identify a modifying product the effects of periostin in said cell.
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