EP2863937A1 - Modification des effets immunomodulateurs des cellules - Google Patents

Modification des effets immunomodulateurs des cellules

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EP2863937A1
EP2863937A1 EP13759010.5A EP13759010A EP2863937A1 EP 2863937 A1 EP2863937 A1 EP 2863937A1 EP 13759010 A EP13759010 A EP 13759010A EP 2863937 A1 EP2863937 A1 EP 2863937A1
Authority
EP
European Patent Office
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cell
periostin
expression
cells
supernatant
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP13759010.5A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Louis Casteilla
Roxane BLATTES
Yannick JEANSON
Karin. TARTE
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening

Definitions

  • the present invention relates to the fields of cellular immunotherapy, and more particularly to the use of mammalian cells having an immunomodulatory potential and which have been genetically or pharmacologically modified as an immunosuppressive or immunostimulatory drug.
  • the present invention also relates to novel molecules having an immunosuppressive or immunostimulatory effect.
  • Cell therapy involves injecting a subject with autologous or allogeneic living cells for the purpose of treating or preventing disease or reconstructing damaged tissue.
  • These cells may be stem cells, progenitor or precursor cells, or differentiated functional cells from blood or tissue.
  • These cells can also be genetically transformed to express in a tissue a transgene of therapeutic interest.
  • the genetic modification of these cells can improve their survival, their metabolic characteristics, their proliferative abilities or, for stem cells or precursors, their differentiating abilities. These same objectives can be obtained by preconditioning these cells using pharmacological tools.
  • Embryonic stem cells that come from an early stage embryo (from zygote to blastomer). These cells are totipotent, that is, they are capable of differentiating into any tissue of the organism, and are capable of self-renewal;
  • adult stem cells that are present in most tissues of the body. These cells are either pluripotent, that is, they are capable of forming all cell types except embryonic appendages, such as induced pluripotent stem cells or "Multilineage-differentiating Stress Enduring Cells"; multipotent, that is, they are capable of forming different types of cells of a given cell lineage; either unipotent, that is to say that they can form only one cell type.
  • Progenitor and precursor cells are derived from stem cells, that is, they are more involved in a differentiation pathway than cells. strains. They are also capable of forming one or more cell types but are not able to self-renew.
  • MSCs Mesenchymal stem cells
  • BM-MSC bone marrow mononuclear cells
  • BM-MSC bone marrow mononuclear cells
  • MSCs have phenotypic characteristics, for example CD45 ⁇ , CD34 + / ⁇ (depending on the tissue origin and their stage of proliferation), CD13 + , which distinguish them from hematopoietic stem cells which are CD45 + , CD34 + , CD13 ". They have, as inductors used, a potential of osteogenic differentiation, adipogenic, chondrogenic, myogenic and angiogenic example.
  • ASC adipose derived stem / stroma cells
  • ADAS adipose tissue-derived adult stem cells
  • AD-MSC adipose-derived MSC
  • ASCs are then isolated and purified after proteolytic digestion of white adipose tissue (eg, with collagenase) and selection by a step of adhesion on a plastic support (see for review Gimble et al, 2007) or can be directly selected from their surface phenotype (for example, selection of CD45 " , CD34 + and CD31 " cells).
  • white adipose tissue eg, with collagenase
  • selection by a step of adhesion on a plastic support see for review Gimble et al, 2007
  • CD45 CD45
  • CD34 + and CD31 CD31
  • ASC show many common features with bone marrow mesenchymal stem cells, including paracrine activity and immunomodulatory properties (Planat-Bénard et al, 2004, Puissant et al, 2005, Yanez et al, 2006, Gonzalez et al, 2009a and 2009b, Constantin et al, 2009 and Yoo et al, 2009).
  • mesenchymal stromal cells should be used to describe them (Casteilla et al, 2011). Nevertheless, these cells can serve as a cellular model for all mesenchymal stem cells. ASCs are currently being studied clinically in several types of applications (see Casteilla et al, 2011 for review), including critical ischemia of the lower limb and treatment of fistulas with and without Crohn's disease (Garcia-Olmo et al., 2009).
  • Periostin is an adhesion protein of the extracellular matrix, secreted in particular by osteoblasts and expressed preferentially in the periosteum of the bones and the peridontal ligament of the teeth (see for review Kudo, 2011 and Frangogianni, 2012), Periostin is also expressed in other tissues, such as the heart, mammary glands, mesenchymal stromal cells derived from bone marrow (Couru et al, 2008) and some cancer cells.
  • Periostin contains, from its N-terminal end towards its C-terminal end: a secretory signal sequence, a cysteine-rich domain (EMI domain), 4 homologous repeat regions (Fasciclin I domains (FAS1)) and a hydrophobic domain.
  • the FAS1 domains of proteins are well known to those skilled in the art; they are referenced, for example, in the EMBL-EBI database under the access number IPR000782 or in the PFAM database under the access number PF02469.
  • the FAS1 domains of periostin have been described by Coutu et al, 2008. Periostin maintains the structure and integrity of supporting tissues (collagen) and participates in bone growth. udo et al. (2004) have shown in zebrafish that inhibition of periostin mRNA translation by an antisense morpholino oligonucleotide inhibits the formation of myoseptum in the embryo. Rios et al.
  • periostin-expressing knock-in transgenic mice are necessary for maintenance of peridontal ligament integrity in response to mechanical stress.
  • Takayama et al. (2006) showed that periostin expression is induced by cytokines TGF- ⁇ and / or IL-4 and IL-13 expressed in response to inflammation or mechanical stress.
  • increased periostin expression in tissue repair or remodeling processes and fibrosis may be due to local activation of TGF- ⁇ and the bone morphogenetic protein (BMP) signaling pathway. (see for review Frangogianni, 2012).
  • BMP bone morphogenetic protein
  • periostin can be used as a medicament for the regeneration of pancreatic tissue.
  • the inventors have set themselves the goal of modifying the immunomodulatory potential of cells having an immunomodulatory potential, and more particularly mesenchymal stem / stromal cells.
  • the inventors have then shown that the inhibition of the expression of periostin in mesenchymal stromal cells derived from human adipose tissue (AUC), which are not genetically transformed, makes it possible to increase the immunosuppressive potential of these cells.
  • AUC human adipose tissue
  • ASC non-genetically transformed human adipose tissue derived mesenchymal stromal cells
  • periostin in controlling the paracrine activity of cells possessing an immunomodulatory potential, especially stem cells. mesenchymal stromal. These results also show that periostin can be used as an immunostimulatory drug and that a periostin inhibitor can be used as an immunosuppressive drug.
  • the subject of the present invention is an isolated diploid cell having an immunomodulatory potential, wherein the expression and / or activity of periostin is modulated, or the culture supernatant of said cell, for use as a medicament.
  • said drug is an immunosuppressive drug or an immunostimulatory drug.
  • cell having an immunomodulatory potential is meant a cell which makes it possible to decrease or increase the natural capacities of the immune system in an organism, that is to say to reduce (immunosuppressions) the natural immune defenses when they may be harmful to said body. organism, or on the contrary to strengthen them (immunostimulation) when they are insufficient or depressed.
  • This cell is characterized by its ability to act on the effectors of immunity.
  • the determination of the immunomodulatory potential of a cell can be carried out by those skilled in the art using well-known techniques, such as immunophenotyping and more particularly and by way of example for the lymphocytes.
  • MLR mixed lymphocyte reaction
  • mesenchymal stromal cells see Perico et al, 2011; for dendritic cells, see Zhao et al, 2012; for NK cells, see Abdelrazik et al, 2011; for lymphocytes, see Perico et al, 2011, Najar et al, 2010, Zhou et al, 2011 and Kronsteiner et al, 2011.
  • Said cell having an immunomodulatory potential (before modulation of expression and / or activity of the periostin) expresses periostin.
  • said cell having an immunomodulatory potential also expresses at least one immunomodulatory molecule, such as IFN- ⁇ , IDO-1, TSG-6, HLA-G, PGE2, TGF- ⁇ , galectin, HO-1, IL-6 , IL-1RA, IL-33, AIRE ("autoimmune regulator"), hEGF, TNF, GM-CSF and / or JAG1, well known to those skilled in the art, preferably IFN- ⁇ , IDO-1, TSG-1, 6, HLA-G and IL-1RA.
  • immunomodulatory molecule such as IFN- ⁇ , IDO-1, TSG-6, HLA-G, PGE2, TGF- ⁇ , galectin, HO-1, IL-6 , IL-1RA, IL-33, AIRE ("autoimmune regulator"), hEGF, TNF, GM-CSF and / or JAG1, well known to those skilled in the art, preferably IFN- ⁇ , IDO-1, TSG-1, 6, HLA-G and IL-1RA.
  • said cell having an immunomodulatory potential is chosen from a mesenchymal stromal cell, a progenitor cell, a precursor cell, a cell differentiated from a mesenchymal stromal cell, a macrophage, a monocyte, a mastocyte or a myeloid cell. , a fibroblast, a dendritic cell, a lymphocyte (for example a Treg lymphocyte), an NK cell, a lymphoid cell and a myoblast.
  • said mesenchymal stromal cell is selected from mesenchymal stromal cells derived from bone marrow (BM-MSC), adipose tissue (ASC or AD-MSC), solid tissue, placenta, adult blood or cord blood.
  • BM-MSC bone marrow
  • ASC adipose tissue
  • AD-MSC adipose tissue
  • said cell having an immunomodulatory potential is a mammalian cell, more preferably a human cell.
  • said cell having an immunomodulatory potential is a living cell.
  • said cell having an immunomodulatory potential is not a cancer cell.
  • modulate the expression and / or the activity of the periostin is by total or partial inhibition of the expression and / or activity of said periostin, including by inhibition of its signaling pathways, either by increasing the expression and / or the activity of said periostin (overexpression of said periostin or stimulation of the signaling pathways of said periostin).
  • Determination of the immunosuppressive potential (or immunosuppressive properties) or immunostimulatory potential (or immunostimulatory properties) of a cell according to the present invention can be achieved by measuring the expression of mRNAs of genes involved in immunomodulation, such as genes encoding IFN- ⁇ , IDO-1, TSG-6, HLA-G, PGE2, TGF- ⁇ , galectin, HO-1, IL-6, IL-IRA, IL-33, AIRE, hEGF, TNF , GM-CSF and / or JAG1, or by measuring the content of these proteins in this cell.
  • genes involved in immunomodulation such as genes encoding IFN- ⁇ , IDO-1, TSG-6, HLA-G, PGE2, TGF- ⁇ , galectin, HO-1, IL-6, IL-IRA, IL-33, AIRE, hEGF, TNF , GM-CSF and / or JAG1, or by measuring the content of these proteins in this cell.
  • said isolated cell having an immunomodulatory potential in which the expression and / or the activity of periostin is totally or partially inhibited, or the culture supernatant of this cell, is useful.
  • an immunosuppressive drug for the regeneration (reconstruction) of a tissue, organ transplant (to limit rejections), such as renal transplantation, or in the treatment of:
  • GVHD graft-versus-host disease
  • inflammatory bowel diseases such as Crohn's disease, celiac disease and irritable bowel syndrome
  • chronic inflammatory rheumatism such as arthritis, rheumatoid arthritis, ankylosing spondylitis and psoriatic arthritis
  • chronic inflammatory diseases of the central nervous system such as multiple sclerosis and amyotrophic lateral sclerosis;
  • inflammatory scars such as hypertrophic scars
  • autoimmune diseases such as autoimmune encephalitis, autoimmune colitis and systemic lupus erythematosus;
  • microbial infections for example due to a bacterium, a protozoan parasite or a virus.
  • said isolated cell in which the expression and / or activity of periostin, including its signaling pathways, is increased, or the culture supernatant of this cell, is useful as an immunostimulatory drug for vaccination, i.e. a vaccine adjuvant or for treatment:
  • Periostin is well known to those skilled in the art.
  • the amino acid sequences of the four isoforms of human periostin are available in the GANBANK database under accession numbers GL209863034 (NP_001129408.1; isoform 1), GI: 209862911 (NP_001129406.1; isoform 2), GL209863011 (NP_001 129407.1; isoform 3) and GL209863034 (NP_001129408.1; isoform 4).
  • peripherally means these four isoforms and their functional variants (or mutants).
  • periostin The function of a variant (or mutant) of periostin can be determined according to methods known to those skilled in the art (see for review Kudo et al, 2011).
  • Total or partial inhibition of the expression and / or activity of periostin can be obtained in various ways, by methods known per se.
  • This inhibition can be obtained by intervening upstream of the production of periostin, by mutagenesis of the gene coding for this protein, or by inhibition or modification of the transcription or translation of periostin.
  • Mutagenesis of the gene coding for periostin may occur at the level of the coding sequence or of the expression regulation sequences, in particular of the promoter. It is possible, for example, to delete all or part of said gene and / or to insert an exogenous sequence (see, for example, Rios et al, 2005).
  • telomeres may be introduced, for example, by PCR using primers specific for said gene (see, for example, Rios et al, 2005).
  • RNAs derived from the said periostin gene can be obtained by the expression of sense, antisense or double-stranded RNAs derived from the said periostin gene, or the cDNA of this protein, or else by the use of interfering RNAs.
  • Cell genetic modification techniques are known to those skilled in the art. For example, Casteilla et al., 2008, describes a method of gene transfer into cells derived from adipose tissue using viral vectors.
  • a recombinant DNA construct comprising one or more polynucleotides capable of inhibiting the expression of periostin.
  • said polynucleotides can encode antisense RNAs, such as morpholino antisense oligonucleotides, hairpin RNAs, interfering RNAs (non-coding double-stranded RNAs with a length of approximately 21 to 25 ⁇ m). nucleotides), shRNAs, microRNAs (non-coding single-stranded RNAs of a length of about 21 to 25 nucleotides), aptamers, or ribozymes targeting a gene encoding periostin.
  • antisense RNAs such as morpholino antisense oligonucleotides, hairpin RNAs, interfering RNAs (non-coding double-stranded RNAs with a length of approximately 21 to 25 ⁇ m). nucleotides), shRNAs, microRNAs (non-coding
  • said polynucleotide capable of inhibiting the expression of periostin is an interfering RNA (RNAi or "siRNA").
  • RNAi interfering RNA
  • RNAi of sequence SEQ ID NO: 1 can be used.
  • Blocking antibodies against periostin or periostin inhibitors may also be used. Such antibodies are described by Zhu et al, 2011 and Orecchia et al, 2011.
  • the increase of the expression (ie, overexpression) and / or the activity of periostin in a cell having an immunomodulatory potential as defined above, can be carried out by modifying the genome of said cell, by stimulation. periostin signaling pathways in said cell or by the use of mediators inducing periostin expression.
  • This modification of the genome can in particular be carried out by genetic transformation of said cell with one or more copies of a polynucleotide encoding said periostin, associated with cis regulatory sequences of its expression.
  • the overexpression of said periostin may also be obtained by modifying the cis-regulatory sequences of the expression of said periostin, for example by replacing its endogenous promoter with a stronger promoter, allowing a higher level of transcription, or by adding to the endogenous promoter enhancer-type transcription enhancer sequences, or translation.
  • an expression cassette comprising a polynucleotide encoding a periostin as defined above, placed under the transcriptional control of a suitable promoter.
  • Said promoter may be a heterologous promoter.
  • a constitutive promoter such as the CMV, ⁇ -actin, EF1- ⁇ , PGK and Ubiquitin C promoters, a specific promoter of a given tissue or a locally inducible promoter.
  • Recombinant vectors can also be used, resulting from the insertion of an expression cassette as described above into a host vector.
  • the expression cassettes and recombinant vectors as described above may, of course, also comprise other sequences, usually employed in this type of constructions.
  • the choice of these other sequences will be made, in a conventional manner, by those skilled in the art based in particular on criteria such as the chosen host cells, the transformation protocols envisaged, etc.
  • leader sequences transcription terminators and leader sequences
  • These sequences may be those which are naturally associated with the gene encoding periostin as defined above, or may be heterologous sequences. These sequences do not interfere with the specific properties of the promoter or gene with which they are associated, but can improve overall qualitatively or quantitatively, the transcription and, where appropriate, the translation. It is also possible, in order to increase the level of expression, to use enhancer sequences (enhancer sequences) of transcription and translation.
  • Stimulation of the periostin signaling pathway can be achieved by stimulating the TGF- ⁇ signaling pathway or the signaling pathway of the bone morphogenetic protein (BMP) in said immunomodulatory cell (see for review Frangogiannis, 2012).
  • BMP bone morphogenetic protein
  • mediators inducing the expression of periostin include angiotensin II, cytokines IL-4 and IL-13 (see for review Frangogiannis, 2012).
  • the culture supernatant of an isolated cell having an immunomodulatory potential, in which the expression and / or the activity of periostin is modulated, as defined above, can be obtained by culturing said cell in a medium of appropriate culture, and recovery and filtration of the culture supernatant.
  • the subject of the present invention is also a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising an isolated cell having an immunomodulatory potential in which the expression and / or the activity of periostin is modulated, or the culture supernatant of said cell, as defined above. and at least one pharmaceutically acceptable carrier.
  • said pharmaceutically acceptable vehicle is suitable for cell therapy.
  • the preparation of stromal cells for their uses in cell therapy is well known to those skilled in the art (Le Blanc et al, 2008, Constantin et al, 2009, Garcia-Olmo et al, 2009, Gonzalez et al, 2009a and 2009b and Karussis et al, 2010).
  • the present invention also relates to the use of an isolated cell having an immunomodulatory potential in which the expression and / or the activity of periostin is modulated, or the culture supernatant of said cell, or a composition pharmaceutical, as defined above, for the manufacture of an immunosuppressive or immunostimulatory drug as defined above.
  • the present invention also relates to a method for tissue regeneration, organ transplantation or to treat or prevent a disease as defined above, comprising administering to said subject a therapeutically effective amount of an isolated cell having an immunomodulatory potential in which the expression and / or activity of periostin is modulated, or the culture supernatant of said cell, or a pharmaceutical composition as defined above.
  • the present invention also relates to the in vitro use of an isolated cell having an immunomodulatory potential in which the expression and / or the periostin activity is modulated, as defined above, to identify (or screen) a product modifying the effects of periostin in said cell.
  • the present invention also relates to an in vitro model for carrying out pharmacological or toxicological tests, comprising an isolated cell having an immunomodulatory potential in which the expression and / or the activity of periostin is modulated, as defined above. to identify (or screen for) a product that modifies the effects of periostin in said cell.
  • the present invention also relates to
  • nucleic acid molecule comprising a sequence coding for said protein or
  • a pharmaceutical composition comprising said protein or said nucleic acid molecule, and at least one pharmaceutically acceptable carrier, for use as an immunostimulatory drug for vaccination, i.e., a vaccine adjuvant or in the treatment of a immune deficiency, selective or combined immunoglobulin deficiency, isolated T-cell deficiency, purine nucleoside phosphorylase deficiency, severe combined immunodeficiency deficiency, and adenosine deaminase, or common hypogammaglobulinemia of variable expression.
  • an immunostimulatory drug for vaccination i.e., a vaccine adjuvant or in the treatment of a immune deficiency, selective or combined immunoglobulin deficiency, isolated T-cell deficiency, purine nucleoside phosphorylase deficiency, severe combined immunodeficiency deficiency, and adenosine deaminase, or common hypogammaglobulinemia of variable expression.
  • the invention encompasses natural, recombinant or synthetic periostin.
  • recombinant periostin is meant periostin produced by genetic engineering, for example by cloning and gene amplification.
  • periostin is meant periostin produced by enzymatic and / or chemical synthesis.
  • Said periostin may be of human origin as described above, or of animal origin.
  • the nucleic acid molecule encoding said protein is obtained by conventional methods, known in themselves to those skilled in the art, following the standard protocols (see for example International Application WO 2010/025555).
  • the nucleic acid molecule may be in the form of a eukaryotic or prokaryotic recombinant vector comprising an insert consisting of a polynucleotide encoding periostin.
  • vectors in which a polynucleotide of interest can be inserted in order to introduce and maintain it in a eukaryotic or prokaryotic host cell are known per se; the choice of an appropriate vector depends on the intended use for that vector (eg, expression of that sequence or integration into the chromosomal material of the host), as well as the nature of the host cell.
  • viral or non-viral vectors such as plasmids may be used.
  • said recombinant vector is an expression vector wherein said polynucleotide is under the control of appropriate transcriptional and translational regulatory elements.
  • the subject of the present invention is also an inhibitor of periostin selected from the group consisting of an anti-periostin blocking antibody, an antisense RNA, a morpholino antisense oligonucleotide, a hairpin RNA, an interfering RNA (RNAi), an aptamer directed against periostin, or a pharmaceutical composition comprising said inhibitor and at least one pharmaceutically acceptable carrier, for use as an immunosuppressive drug for regeneration of tissue, organ transplant or treatment of a selected disease in the group consisting of graft-versus-host disease, inflammatory bowel disease, chronic inflammatory rheumatism, chronic inflammatory diseases of the central nervous system, lupus, autoimmune thyroiditis, complex anal fistulas , type IV hypersensitivity-type asthmatic reactions, scarring Inflammatory diseases, allergies, tissue necrosis, autoimmune diseases, ulcers, diabetes and microbial infections.
  • periostin selected from the group consisting of an anti-periostin blocking antibody, an antisense RNA,
  • anti-periostin antibodies The preparation of anti-periostin antibodies is known to those skilled in the art (see Application EP 2168599 A1).
  • human anti-periostin blocking antibodies may have been those described by Orecchia et al, 2011 and Zhu et al, 2011.
  • the sequence RNAi can be used
  • a pharmaceutically acceptable vehicle acceptable there may be mentioned dispersants, solubilizers, stabilizers, preservatives, etc.
  • Pharmaceutically acceptable vehicles that can be used in formulations include methylcellulose, hydroxymethylcellulose, carboxymethylcellulose, cyclodextrins, polysorbate 80, mannitol, gelatin, lactose, oils and the like. vegetable or animal, acacia, etc.
  • Said drug or said pharmaceutical composition may be in the form of a physiological saline solution, isotonic and buffered, compatible with a pharmaceutical use and known to those skilled in the art.
  • the amount of said protein or said periostin inhibitor used as a medicament according to the invention or present in the pharmaceutical composition according to the invention may be modulated so as to obtain a circulating level of active principle (in a physiological liquid such as blood) necessary to achieve the desired therapeutic effect for a particular subject.
  • the amount chosen will depend on multiple factors, in particular the route of administration, the duration of administration, the timing of administration, the rate of elimination of the compound, the or various products used in combination with said drug or said pharmaceutical composition, the age, weight and physical condition of the patient, as well as its medical history, and any other information known in medicine.
  • the drug or pharmaceutical composition according to the present invention may be used alone or in combination with at least one other therapeutically active compound, such as for example an antigen or a second immunostimulatory or immunosuppressive compound according to the desired use of the drug.
  • the use of said drug or said pharmaceutical composition, and said therapeutically active compound may be simultaneous, separate or spread over time.
  • the present invention also relates to a method for treating or preventing, in a subject, a cancer or an infection related to an immunodeficiency, a selective or combined deficiency in immunoglobulins, a deficiency isolated T cells, purine nucleoside phosphorylase deficiency, severe combined immunodeficiency deficiency of adenosine deaminase or common variable expression hypogammaglobulinemia, comprising administering to said subject a therapeutically effective amount of said composition pharmaceutical composition comprising said protein (periostin or a protein comprising 1, 2, 3 or 4 FAS1 domains of the periostin) or a nucleic acid molecule comprising a sequence coding for said protein, as defined above.
  • the present invention also relates to a method of regenerating a tissue, transplanting an organ or treating or preventing a disease selected from the group consisting of graft versus host disease, inflammatory diseases bowel diseases, chronic inflammatory rheumatism, chronic inflammatory diseases of the central nervous system, lupus, autoimmune thyroiditis, complex anal fistulas, type IV delayed-type hypersensitivity reactions, inflammatory scars, allergies, tissue necrosis, autoimmune diseases, ulcers, diabetes and microbial infections, in a subject comprising administering to said subject a therapeutically effective amount of said pharmaceutical composition comprising an anti-periostin blocking antibody, an antisense RNA, a morpholino antisense oligonucleotide, a hairpin RNA, an interfering RNA rent (RNAi), an aptamer directed against periostin, as defined above
  • the invention includes other arrangements, which will become apparent from the following description, which refers to examples showing in vitro the effect of the modulation of the expression of periostin in stromal cells.
  • Figure 1 shows the effect of MRA against POSTN (siRNA POSTN) and non-specific control RNAi (siRNA scramble) on the amount of mRNA encoding PUM1 (used as a control) in treated ASCs.
  • POSTN siRNA POSTN
  • siRNA scramble non-specific control RNAi
  • FIG. 2 represents the effect of RNAi directed against POSTN (siRNA POSTN) and non-specific control RNAi (siRNA scramble) on the amount of mRNA encoding periostin in treated ASCs.
  • A The mean ⁇ standard deviation to the mean (sem) is shown after normalizing the values on the graph.
  • FIG. 3 represents the in vitro effect of the treatment of AUCs with TLR3 Poly (I: C) ligand alone or in combination with periostin (POSTN) at a dose of 1, 2, 4, or 10 ⁇ ⁇ ⁇ , on expression of POSTN (A) and IDO1 (B) mRNA.
  • TLR3 Poly I: C
  • Figure 4 shows the IDO-1 assay in the culture supernatant of ASC treated with RNAi directed against POSTN (siRNA POSTN) or non-specific control RNAi (siRNA scramble).
  • Figure 5 shows the effect of RNAi directed against POSTN (siRNA POSTN) and non-specific control RNAi (siRNA scramble) on the amount of mRNA coding for POSTN, IDO1 (IDO) and IFN- ⁇ (IFNB ) in the processed BM-MSCs.
  • POSTN POSTN
  • siRNA scramble non-specific control RNAi
  • FIG. 6 represents (A) the in vitro effect of treatment of AUCs with IFN ⁇ (A) at a dose of 4, 20, 100 or 500 IU / ml on the expression of POSTN and (B) mRNA. ) the in vitro effect of treating AUCs with IFNy at a dose of 100 IU / ml in combination with periostin (POSTN) at a dose of 1, 2, 4, or 10 ⁇ g / ml, on the expression IDOl mRNA.
  • POSTN periostin
  • EXAMPLE 1 IN VITRO EFFECT OF INHIBITION OF EXPRESSION OF PERIOSTIN IN MESENCHYMAL STROMAL CELLS DERIVED FROM ADIPOSE TISSUE (ASC)
  • ASC adipose tissue
  • the FCS cells were plated at a density of 4000 cells / cm 2 in the CPM medium. After 12h of culture at 37 ° C and 5% of C0 2 , the non-adherent cells were removed by washing with PBS (phosphate-buffered saline). Fraction adherent was then cultured in vitro in the same culture medium CPM; the medium being renewed three times a week. After 8 days of culture, the ASCs (passage 0) were harvested with trypsin-EDTA (LifeTechnologies). The number of viable cells was determined by excluding the blue Trypan on a Countess® automaton. The cells were then plated at a density of 2000 cells / cm 2 and cultured for an additional 2 days (passage 1). Treatment with RNAi (siRNA) was then performed.
  • siRNA RNAi
  • BM-MSC bone marrow
  • Human nucleated bone marrow cells were first seeded at 5 ⁇ 10 4 cells / cm 2 in a culture medium consisting of minimal essential medium alpha (aMEM) supplemented with 10% fetal calf serum (FCS; Hyclone), 1 ng / ml of fibroblastic growth factor 2 (FGF2, R & D System, Lille, France), and 10 ⁇ / ⁇ of ciprofloxacin. All the medium was renewed twice a week until the cells reached confluence (end of P0). Then the cells were detached with trypsin. Viable cells were numbered and reseeded at 500 cells / cm 2 (PI passage).
  • aMEM minimal essential medium alpha
  • FCS fetal calf serum
  • FGF2 fibroblastic growth factor 2
  • FGF2 fibroblastic growth factor 2
  • RNAi directed against periostin was provided by SIGMA (MISSION esiRNA Human POSTN, EHU069741). This RNAi is directed against the 4 isforms of human periostin.
  • Non-specific AF488 RNAi was provided by QIAGEN (siRNA AllStarNeg AF488).
  • the culture medium of the ASC or BM-MSC was replaced by the culture medium for the treatment with RNAi, prepared as described below.
  • RNA extraction 2 ⁇ of 28 ⁇ RNAi were diluted in 100 ⁇ of ⁇ - ⁇ OK medium, vortexed for 10 seconds and then mixed with 12 ⁇ l of HiPerfect reagent (QIAGEN). After vortexing again, the suspension obtained was left for 10 minutes at room temperature before being mixed with 2 ml of CPM medium. The ASC cells were then added to this medium. The cells were then cultured for 4 days in this medium at 37 ° C. and 5% CO 2 . RNA extraction
  • RNA extraction was performed according to the manufacturer's instructions (RNeasy mimkit, QIAGEN). The RNAs were quantified using the Nanodrop (ThermoScientific) controller and 1 ⁇ g of RNA was retro-transcribed using the SuperScript One Step RT kit according to the manufacturer's recommendations (LifeTechnologies).
  • RT-qPCR Quantitative RT-PCR
  • RNAs used for the quantification of RNAs are as follows:
  • Pumillo-1 (PUM1) is used as a reference gene. Statistical analyzes
  • Quantitative RT-PCR results are expressed as mean values ⁇ standard deviation at mean (wk). Significance analysis was performed using the Mann & Whitney test or Student's t test (Prism Software). (* P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01).
  • IDO-1 indoleamine 2,3-dioxygenase 1
  • IDO-1 indoleamine 2,3-dioxygenase 1
  • the activity of IDO-1 was determined by high performance liquid chromatography by measuring the concentration of kynurenin in the culture supernatant of the MRS treated with MRA against POSTN or nonspecific RNAi, and using 3-nitro-L-tyrosine as an internal standard. Kynurenine and 3-nitro-L-tyrosine were detected by UV absorption at 360 nm.
  • Non-specific MRA can therefore be used as RNAi control.
  • the amount of mRNA encoding periostin was then determined by RT-qPCR after treatment of AUCs with either MRA against POSTN or non-specific MRA. The results are shown in Figure 2. These results show that the treatment of ASC with MRA against POSTN is effective in inhibiting the expression of POSTN in these cells.
  • the amount of mRNA encoding different immunosuppressive proteins was then determined by RT-qPCR after treatment of AUCs with the AR against POSTN or non-specific MRA. The results are shown in Table 2 below.
  • RNAi non-specific RNAi POSTN Effect of MRA against POSTN and non-specific control PARNi on the amount of mRNA encoding periostin (POSTN) and different immunosuppressive proteins in the treated ASCs. The means ⁇ standard deviation after normalization of the measured values are shown.
  • RNAi non-specific RNAi POSTN Effect of MRA against POSTN and non-specific control PARNi on the amount of mRNA encoding periostin (POSTN) and different immunosuppressive proteins in the treated ASCs. The means ⁇ standard deviation after normalization of the measured values are shown.
  • HLA-G 1.00 0.00 3.70 1.64
  • AUCs have similar characteristics to other mesenchymal stem / stromal cells, and to progenitor cells, precursor cells, differentiated cells from mesenchymal stromal cells, macrophages, monocytes, mast cells, myeloid cells, fibroblasts, dendritic cells , lymphocytes (eg Treg cells), cellules cells, lymphoid cells and myoblasts, it is likely that periostin also plays a role in modulating the immunosuppressive properties of these cells.
  • BM-MSC bone marrow mesenchymal stromal cells
  • IDO indoleamine-2,3-dioxygenase
  • EXAMPLE 2 IN VITRO EFFECT OF THE ADDITION OF PERIOSTIN IN ASCES TREATED WITH LIGANG TLR3
  • mesenchymal stromal cells derived from human adipose tissue was performed as previously described in Example 1-1 above, except that the SVF cells were plated at a density of 2000. cells / cm 2 and cultured for an additional 5 days (passage 1) with a change of culture medium after 2 days.
  • the medium used for the treatment is the CPM medium supplemented with Poly (I: C) at a concentration of 500 ⁇ g / ml and / or periostin (POSTN) at a concentration of 1, 2, 4 or 10 ⁇ g ml.
  • AUC adipose tissue

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Abstract

La présente invention concerne une cellule isolée possédant un potentiel immunomodulateur, dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est modulée, ou le surnageant de culture de ladite cellule, pour son utilisation comme médicament immunosuppresseur ou immunostimulateur. La présente invention concerne également la périostine pour son utilisation comme médicament immunostimulateur ou un inhibiteur de la périostine pour son utilisation comme médicament immunosuppresseur.

Description

MODIFICATION DES EFFETS IMMUNOMODULATEURS DES CELLULES
La présente invention concerne les domaines de l'immunothérapie cellulaire, et plus particulièrement l'utilisation de cellules de mammifère possédant un potentiel immunomodulateur et qui ont été génétiquement ou pharmacologiquement modifiées comme médicament immunosuppresseur ou immunostimulateur. La présente invention concerne également de nouvelles molécules possédant un effet immunosuppresseur ou immunostimulateur.
La thérapie cellulaire consiste en l'injection à un sujet de cellules vivantes autologues ou allogènes, dans le but de traiter ou prévenir une maladie ou de reconstruire un tissu endommagé. Ces cellules peuvent être des cellules souches, des cellules progénitrices ou précurseurs, ou des cellules différenciées fonctionnelles provenant du sang ou d'un tissu. Ces cellules peuvent aussi être génétiquement transformées pour exprimer dans un tissu un transgène d'intérêt thérapeutique. En outre, la modification génétique de ces cellules peut améliorer leur survie, leurs caractéristiques métaboliques, leurs capacités prolifératives ou, pour les cellules souches ou les précurseurs, leurs capacités de différenciation. Ces mêmes objectifs peuvent être obtenus par le préconditionnement de ces cellules à l'aide d'outils pharmacologiques.
Parmi les cellules souches on distingue :
les cellules souches embryonnaires (ESC) qui proviennent d'un embryon à un stade précoce (du zygote au blastomère). Ces cellules sont totipotentes, c'est- à-dire qu'elles sont capables de se différencier en n'importe quel tissu de l'organisme, et sont capables de s'auto-renouveler ;
les cellules souches adultes qui sont présentes dans la plupart des tissus de l'organisme. Ces cellules sont soit pluripotentes, c'est-à-dire qu'elles sont capables de former tous les types cellulaires sauf les annexes embryonnaires, telles que les cellules souches pluripotentes induites ou les « Multilineage-differentiating Stress Enduring Cells » ; soit multipotentes, c'est-à-dire qu'elles sont capables de former différents types de cellules d'un lignage cellulaire donné ; soit unipotentes, c'est-à-dire qu'elles ne peuvent former qu'un seul type cellulaire.
Les cellules progénitrices et précurseurs sont issues des cellules souches, c'est-à-dire qu'elles sont plus engagées dans une voie de différenciation que les cellules souches. Elles sont également capables de former un ou plusieurs types cellulaires mais ne sont pas capables de s'auto-renouveler.
Les cellules souches mésenchymateuses (CSM ou MSC) - aussi appelées cellules stromales mésenchymateuses - font actuellement l'objet de nombreuses recherches pour leurs applications thérapeutiques. Dans la description qui suit les termes « cellule souche mésenchymateuse » et « cellule stromale mésenchymateuse » sont utilisés indifféremment. Ces cellules souches adultes ont été initialement isolées et caractérisées à partir des cellules mononucléées de la moelle osseuse (BM-MSC) mais peuvent également être isolées à partir du tissu adipeux, de la peau, de la rate ou du cœur. Les CSM possèdent des caractéristiques phénotypiques, par exemple CD45~, CD34+/~ (selon l'origine tissulaire et leur stade de prolifération), CD13+, qui permettent de les distinguer des cellules souches hématopoïétiques qui sont CD45+, CD34+, CD13". Elles possèdent, selon les inducteurs utilisés, un potentiel de différenciation ostéogénique, adipogénique, chondrogénique, myogénique et angiogénique par exemple. Elles possèdent aussi une activité paracrine et sont capables de sécréter des facteurs de croissance, des cytokines pro- ou antiinflammatoires, des chémokines et des prostaglandines (voir pour revue Le Blanc 2006, Kode et al, 2009, Hoogduijn et al, 2010 et Dazzi et al, 2011). De ce fait, elles présentent aussi de grandes similarités avec les monocytes et les macrophages (Charrière et al, 2006) ainsi que les fibroblastes (Hannifa et al, 2007) qui possèdent des propriétés immunomodulatrices similaires. Les CSM sont donc utilisées en thérapie cellulaire régénératrice pour leurs propriétés de différenciation multiple ainsi que pour leurs propriétés prolifératives, angiogéniques, anti-apoptotiques, trophiques et immunomodulatrices. Par exemple, Le Blanc et al. (2008) ont montré chez l'Homme que les cellules souches mésenchymateuses combinées à une greffe de cellules souches hématopoïétiques peuvent réduire le risque de réaction aiguë du greffon contre l'hôte dans les allogreffes (graft-versus host disease, GVHD).
Les CSM isolées du tissu adipeux sont appelées ASC, ADSC (adipose derived stem/stroma cells), ADAS {adipose tissue-derived adult stem cells) ou AD-MSC (adipose-derived MSC). Le tissu adipeux présente l'avantage d'être obtenu facilement par liposuccion sous anesthésie locale et de contenir plusieurs populations de cellules immatures dont une forte majorité d'ASC. Les ASC sont ensuite isolées et purifiées après digestion protéolytique du tissu adipeux blanc (e.g., avec la collagénase) et sélection par une étape d'adhésion sur un support plastique (voir pour revue Gimble et al, 2007) ou peuvent être directement sélectionnées à partir de leur phénotype de surface (par exemple, sélection des cellules CD45", CD34+ et CD31"). Bien que possédant des caractéristiques spécifiques, les ASC montrent beaucoup de caractéristiques communes avec les cellules souches mésenchymateuses issues de la moelle osseuse, y compris l'activité paracrine et les propriétés immunomodulatrices (Planat-Bénard et al, 2004, Puissant et al, 2005, Yanez et al, 2006, Gonzalez et al, 2009a et 2009b, Constantin et al, 2009 et Yoo et al, 2009). En outre, dans la mesure où leur auto-renouvellement n'a pas été clairement établi, il convient d'utiliser le terme « cellules stromales mésenchymateuses » pour les qualifier (Casteilla et al, 2011). Néanmoins, ces cellules peuvent servir de modèle cellulaire pour l'ensemble des cellules souches mésenchymateuses. Les ASC sont actuellement étudiées au niveau clinique dans plusieurs types d'applications (voir pour revue Casteilla et al, 2011), dont l'ischémie critique du membre inférieur et le traitement des fistules associées ou non à la maladie de Crohn (Garcia-Olmo et al, 2009).
Malgré des résultats pré-cliniques et cliniques encourageants sur l'utilisation des CSM dans le cadre de thérapies cellulaires (voir pour revue Uccelli et al, 2008), le potentiel immunomodulateur des CSM est parfois trop faible pour obtenir de bons résultats dans le traitement de maladies ou dysfonctions impliquant l'inflammation, telles que les maladies inflammatoires chroniques ou maladies auto-immunes. Il existe donc un besoin d'améliorer le potentiel immunomodulateur des CSM, permettant ainsi de diminuer le nombre de cellules nécessaires au traitement et/ou d'améliorer leur efficacité, ce qui diminue d'autant la quantité de cellules prélevées initialement et nécessaire pour l'obtention des CSM greffées, ainsi que les temps de culture des cellules.
La périostine (POSTN ou PN) est une protéine d'adhésion de la matrice extracellulaire, sécrétée notamment par les ostéoblastes et exprimée préférentiellement dans le périoste des os et le ligament péridontal des dents (voir pour revue Kudo, 2011 et Frangogianni, 2012), La périostine est également exprimée dans d'autres tissus, tels que le cœur, les glandes mammaires, les cellules stromales mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse (Couru et al, 2008) et certaines cellules cancéreuses. Les séquences nucléotidique et peptidique des quatre isoformes connues de la périostine sont disponibles dans la base de données GENBAN , sous les numéros d'accès GI:209863034 (NP_001129408.1 ; isoforme 1), GI:209862911 (NP_001129406.1 ; isoforme 2), GI:209863011 (NP_001129407.1 ; isoforme 3) et GL209863034 (NP_001129408.1 ; isoforme 4). La périostine contient, de son extrémité N-terminale vers son extrémité C- terminale : une séquence signal de sécrétion, un domaine riche en cystéine (domaine EMI), 4 régions répétées homologues (domaines Fasciclin I (FASl)) et un domaine hydrophobe. Les domaines FASl des protéines sont bien connus de l'homme du métier ; ils sont référencés par exemple dans la base de données EMBL-EBI sous le numéro d'accès IPR000782 ou dans la base de données PFAM sous le numéro d'accès PF02469. Les domaines FASl de la périostine ont notamment été décrits par Coutu et al, 2008. La périostine maintient la structure et l'intégrité des tissus de soutien (le collagène) et participe à la croissance osseuse. udo et al. (2004) ont montré chez le poisson zèbre, que l'inhibition de la traduction de l'ARNm de la périostine par un oligonucléotide morpholino antisens inhibe la formation du myoseptum dans l'embryon. Rios et al. (2005) ont montré, à l'aide de souris transgéniques « knock-in » n'exprimant pas la périostine, que la périostine est nécessaire pour le maintien de l'intégrité du ligament péridontal en réponse à un stress mécanique. Takayama et al. (2006) ont montré que l'expression de la périostine est induite par les cytokines TGF-β et/ou IL-4 et IL- 13 exprimées en réponse à l'inflammation ou à un stress mécanique. En outre, l'augmentation de l'expression de la périostine dans les processus de réparation ou de remodelage tissulaire et de fibrose peut être due à une activation locale de TGF-β et de la voie de signalisation de la protéine morphogénétique osseuse (BMP) (voir pour revue Frangogianni, 2012). Par ailleurs, il semble que la périostine stimule la croissance cellulaire de plusieurs types de cancer, tels que le cancer du sein. Orecchia et al. (2011) ont montré in vitro que le traitement des cellules SKMEL-28 avec un anticorps monoclonal bloquant, dirigé contre le motif YN situé dans le deuxième domaine FASl de la périostine humaine, inhibe la croissance tumorale et réduit la densité vasculaire tumorale. Enfin, la Demande Internationale WO 2010/025555 décrit que la périostine peut être utilisée comme médicament pour la régénération du tissu pancréatique.
A la connaissance des inventeurs, aucune donnée ne lie la périostine à un effet immunomodulateur des cellules exprimant cette protéine.
Les inventeurs se sont donnés pour but de modifier le potentiel immunomodulateur des cellules possédant un potentiel immunomodulateur, et plus particulièrement des cellules souches/stromales mésenchymateuses. Les inventeurs ont alors montré que l'inhibition de l'expression de la périostine dans les cellules stromales mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (ASC) humain, non génétiquement transformées, permet d'augmenter le potentiel immunosuppresseur de ces cellules.
Les inventeurs ont aussi montré que le potentiel immunosuppresseur des cellules stromales mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (ASC) humain, non génétiquement transformées, est inhibé lorsque la périostine est ajoutée à ces cellules. L'augmentation de l'expression de la périostine dans les ASC permet donc de diminuer ou d'inhiber le potentiel immunosuppresseur de ces cellules, c'est-à-dire de conférer un potentiel immunostimulateur à ces cellules.
Au regard de ces résultats obtenus avec les ASC utilisées comme cellules modèles, les inventeurs ont donc mis en évidence, de manière inattendue, le rôle de la périostine dans le contrôle de l'activité paracrine des cellules possédant un potentiel immunomodulateur, notamment des cellules souches/stromales mésenchymateuses. Ces résultats montent aussi que la périostine peut être utilisée comme médicament immunostimulateur et qu'un inhibiteur de la périostine peut être utilisé comme médicament immunosuppresseur.
La présente invention a pour objet une cellule diploïde isolée possédant un potentiel immunomodulateur, dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est modulée, ou le surnageant de culture de ladite cellule, pour son utilisation comme médicament.
De préférence, ledit médicament est un médicament immunosuppresseur ou un médicament immunostimulateur.
On entend par « cellule possédant un potentiel immunomodulateur » une cellule qui permet de diminuer ou augmenter les capacités naturelles du système immunitaire chez un organisme, c'est-à-dire de diminuer (immunosuppresssion) les défenses immunitaires naturelles lorsqu'elles peuvent nuire audit organisme, ou au contraire de les renforcer (immunostimulation) lorsqu'elles sont insuffisantes ou déprimées. Cette cellule se caractérise par sa capacité à agir sur les effecteurs de l'immunité. La détermination du potentiel immunomodulateur d'une cellule peut être effectuée par l'homme du métier à l'aide de techniques bien connues, telles que l'immunophénotypage et plus particulièrement et à titre d'exemple pour les lymphocytes la réaction lymphocytaire mixte (MLR) mais aussi la réponse sous stimulation des neutrophiles ; par exemple pour les cellules stromales mésenchymateuses, voir Perico et al, 2011 ; pour les cellules dendritiques, voir Zhao et al, 2012 ; pour les cellules NK, voir Abdelrazik et al, 2011 ; pour les lymphocytes, voir Perico et al, 2011, Najar et al, 2010, Zhou et al, 2011 et Kronsteiner et al, 2011. Ladite cellule possédant un potentiel immunomodulateur (avant modulation de l'expression et/ou l'activité de la périostine) exprime la périostine. De préférence, ladite cellule possédant un potentiel immunomodulateur exprime aussi au moins une molécule immunomodulatrice, telle que IFN-β, IDO-1, TSG-6, HLA-G, PGE2, TGF- β, galectine, HO-1, IL-6, IL-1RA, IL-33, AIRE {« autoimmune regulator »), hEGF, TNF, GM-CSF et/ou JAGl, bien connus de l'homme du métier, de préférence IFN-β, IDO-1, TSG-6, HLA-G et IL-1RA. La mesure de l'expression de ces gènes dans une cellule peut être effectuée par RT-PCR, tel que décrit dans les Exemples ci-après.
De manière avantageuse, ladite cellule possédant un potentiel immunomodulateur est choisie parmi une cellule stromale mésenchymateuse, une cellule progénitrice, une cellule précurseur, une cellule différenciée à partir d'une cellule stromale mésenchymateuse, un macrophage, un monocyte, un mastocyte, une cellule myéloïde, un fïbroblaste, une cellule dendritique, un lymphocyte (par exemple un lymphocyte Treg), une cellule NK, une cellule lymphoïde et un myoblaste.
De manière avantageuse encore, ladite cellule stromale mésenchymateuse est choisie parmi une cellule stromale mésenchymateuse dérivée de la moelle osseuse (BM-MSC), du tissu adipeux (ASC ou AD-MSC), d'un tissu solide, du placenta, du sang adulte ou du sang de cordon.
De préférence, ladite cellule possédant un potentiel immunomodulateur est une cellule de mammifère, de préférence encore une cellule humaine.
Bien entendu, ladite cellule possédant un potentiel immunomodulateur est une cellule vivante.
En outre, ladite cellule possédant un potentiel immunomodulateur n'est pas une cellule cancéreuse.
On entend par « moduler l'expression et/ou l'activité de la périostine », la modification de l'expression et/ou l'activité de la périostine par rapport à une cellule possédant un potentiel immunomodulateur, soit par inhibition totale ou partielle de l'expression et/ou de l'activité de ladite périostine y compris par inhibition de ses voies de signalisation soit par augmentation de l'expression et/ou de l'activité de ladite périostine (surexpression de ladite périostine ou stimulation des voies de signalisation de ladite périostine).
Le choix par l'homme du métier d'inhiber ou d'augmenter l'expression et/ou l'activité de ladite périostine comme indiqué précédemment s'effectue en fonction du résultat que l'on souhaite obtenir en termes d'immunomodulation, à savoir respectivement stimuler l'effet immunosuppresseur ou immunostimulateur de ladite cellule possédant un potentiel immunomodulateur. Ainsi, si l'homme du métier souhaite stimuler l'effet immunosuppresseur d'une cellule possédant un potentiel immunomodulateur, alors il est nécessaire d'inhiber l'expression et/ou l'activité de ladite périostine, incluant l'inhibition de ses voies de signalisation, dans ladite cellule. Si l'homme du métier souhaite stimuler l'effet immunostimulateur d'une cellule possédant un potentiel immunomodulateur alors il est nécessaire d'augmenter l'expression et/ou l'activité de ladite périostine, incluant la stimulation de ses voies de signalisation, dans ladite cellule.
La détermination du potentiel immunosuppresseur (ou des propriétés immunosuppressives) ou du potentiel immunostimulateur (ou des propriétés immunostimulatrices) d'une cellule selon la présente invention peut être réalisée en mesurant l'expression des ARNm des gènes impliqués dans l'immunomodulation, tels que les gènes codant pour les protéines IFN-β, IDO-1, TSG-6, HLA-G, PGE2, TGF- β, galectine, HO-1, IL-6, IL- IRA, IL-33, AIRE, hEGF, TNF, GM-CSF et/ou JAG1, ou en mesurant le contenu de ces protéines dans cette cellule.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite cellule isolée possédant un potentiel immunomodulateur, dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est totalement ou partiellement inhibée, ou le surnageant de culture de cette cellule, est utile comme médicament immunosuppresseur destiné à la régénération (reconstruction) d'un tissu, la greffe d'organe (pour limiter les rejets), telle que la transplantation rénale, ou dans le traitement :
de la maladie du greffon contre l'hôte (GVHD),
- des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, telles que la maladie de Crohn, la maladie c liaque et le syndrome de l'intestin irritable ; des rhumatismes inflammatoires chroniques, tels que l'arthrite, la polyarthrite rhumatoïde, la spondylarthrite ankylosante et le rhumatisme psoriasique ;
des maladies inflammatoires chroniques du système nerveux central, telles que la sclérose en plaque et la sclérose latérale amyotrophique ;
du lupus ;
des thyroïdites auto-immunes ;
des fistules anales complexes ;
des réactions asthmatiques de type hypersensibilité retardée de type
IV ;
des allergies ;
des cicatrices inflammatoires, telles que les cicatrices hypertrophiques ;
des nécroses tissulaires ;
des maladies auto-immunes, telles que l'encéphalite auto-immune, la colite auto-immune et le lupus érythémateux systémique ;
des ulcères ;
du diabète ;
des infections microbiennes, dues par exemples à une bactérie, un parasite protozoaire ou un virus.
Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, ladite cellule isolée, dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine, incluant ses voies de signalisation, est augmentée, ou le surnageant de culture de cette cellule, est utile comme médicament immunostimulateur destiné à la vaccination, c'est-à-dire un adjuvant vaccinal ou destiné au traitement :
d'un cancer ou d'une infection liés à un déficit immunitaire ;
d'un déficit sélectif ou combiné en immunoglobulines ;
d'un déficit isolé en lymphocytes T ;
d'un déficit en purine nucléoside phosphorylase ;
d'un déficit immunitaire combiné sévère par déficit en adénosine désaminase ;
de Phypogammaglobulinémie commune d'expression variable. La périostine est bien connue de l'homme du métier. Les séquences d'acides aminés des quatre isoformes de la périostine humaine sont disponibles dans la base de données GANBANK sous les numéros d'accès GL209863034 (NP_001129408.1 ; isoforme 1), GI:209862911 (NP_001129406.1 ; isoforme 2), GL209863011 (NP_001 129407.1 ; isoforme 3) et GL209863034 (NP_001129408.1 ; isoforme 4).
Au sens de la présente invention, on entend par « périostine », ces quatre isoformes et leurs variants (ou mutants) fonctionnels.
La fonction d'un variant (ou mutant) de la périostine peut être déterminée selon des méthodes connues de l'homme du métier (voir pour revue Kudo et al, 2011).
L'inhibition totale ou partielle de l'expression et/ou de l'activité de la périostine peut être obtenue de diverses manières, par des méthodes connues en elles mêmes.
Cette inhibition peut être obtenue en intervenant en amont de la production de la périostine, par mutagenèse du gène codant pour cette protéine, ou bien par inhibition ou modification de la transcription ou de la traduction de la périostine.
La mutagenèse du gène codant pour la périostine peut intervenir au niveau de la séquence codante ou des séquences de régulation de l'expression, notamment du promoteur. On peut par exemple procéder à la délétion de tout ou partie dudit gène et/ou à l'insertion d'une séquence exogène (voir par exemple Rios et al, 2005).
On peut également introduire une ou plusieurs mutations ponctuelles avec des agents physiques (par exemple radiations) ou chimiques. Ces mutations ont pour conséquence de décaler le cadre de lecture et/ou d'introduire un codon stop dans la séquence et/ou de modifier le niveau de la transcription et/ou de la traduction du gène et/ou de rendre la périostine moins active que la périostine sauvage. Les allèles mutés du gène codant pour la périostine peuvent être identifiés par exemple par PCR à l'aide d'amorces spécifiques dudit gène (voir par exemple Rios et al, 2005).
On peut aussi effectuer une mutagenèse dirigée, ciblant un gène codant pour ladite périostine. L'inhibition ou la modification de la transcription et/ou de la traduction peuvent être obtenues par l'expression d'ARNs sens, antisens ou double-brin dérivés du gène de ladite périostine, ou de l'ADNc de cette protéine, ou bien par l'utilisation d'ARNs interférents. Les techniques de modifications génétiques des cellules sont connues de l'homme du métier. A titre d'exemple, Casteilla et al, 2008, décrit une méthode de transfert de gène dans les cellules dérivées du tissu adipeux à l'aide de vecteurs viraux.
Selon ce mode de mise en œuvre de la présente invention, on peut utiliser une construction d'ADN recombinant, comprenant un ou plusieurs polynucléotides capables d'inhiber l'expression de la périostine. A titre d'exemples non limitatifs, lesdits polynucléotides peuvent coder pour des ARN antisens, tels que des oligonucléotides antisens morpholino, des ARN en épingle à cheveux, des ARN interférents (ARN double brin non codants d'une longueur d'environ 21 à 25 nucléotides), des shRNA, des micro- ARN (ARN simple brin non codants d'une longueur d'environ 21 à 25 nucléotides), des aptamères, ou des ribozymes ciblant un gène codant pour la périostine.
De préférence, ledit polynucléotide capable d'inhiber l'expression de la périostine est un ARN interfèrent (ARNi ou « siRNA »).
Selon une disposition avantageuse, on peut utiliser l'ARNi de séquence SEQ ID NO : l .
L'homme du métier dispose d'un très large choix d'éléments utilisables pour l'obtention de constractions d'ADN recombinant conformes à ce mode de mise en œuvre de l'invention.
On peut également utiliser des anticorps bloquant dirigés contre la périostine ou des inhibiteurs de la périostine. De tels anticorps sont décrit par Zhu et al, 2011 et Orecchia et al, 2011.
L'augmentation de l'expression (i.e., surexpression) et/ou de l'activité de la périostine dans une cellule possédant un potentiel immunomodulateur telle que définie ci-dessus, peut être effectuée par la modification du génome de ladite cellule, par stimulation des voies de signalisation de la périostine dans ladite cellule ou par l'utilisation de médiateurs induisant l'expression de la périostine.
Cette modification du génome peut notamment s'effectuer par transformation génétique de ladite cellule par une ou plusieurs copies d'un polynucléotide codant pour ladite périostine, associé à des séquences de régulation en cis de son expression. La surexpression de ladite périostine peut également être obtenue par modification des séquences de régulation en cis de l'expression de ladite périostine, par exemple en remplaçant son promoteur endogène par un promoteur plus fort, permettant un niveau de transcription plus élevé, ou bien en adjoignant au promoteur endogène des séquences activatrices de la transcription, de type « amplificateur », ou de la traduction.
Selon une modalité de ce mode de mise en œuvre de la présente invention, on utilise une cassette d'expression, comprenant un polynucléotide codant pour une périostine telle que définie ci-dessus, placé sous le contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié. Ledit promoteur peut être un promoteur hétérologue. Dans ce cas, on peut utiliser par exemple un promoteur constitutif, tel que les promoteurs CMV, β-actine, EFl-α, PGK et de l'Ubiquitine C, un promoteur spécifique d'un tissu donné ou un promoteur localement inductible.
On peut également utiliser des vecteurs recombinants, résultant de l'insertion d'une cassette d'expression telle que décrite ci-dessus dans un vecteur hôte.
Les cassettes d'expression et vecteurs recombinants tels que décrits ci- dessus peuvent, bien entendu, comprendre en outre d'autres séquences, usuellement employées dans ce type de constructions. Le choix de ces autres séquences sera effectué, de manière classique, par l'homme du métier en fonction notamment de critères tels que les cellules-hôtes choisies, les protocoles de transformation envisagés, etc.
On citera, à titre d'exemples non limitatifs, les terminateurs de transcription et les séquences de tête (séquences « leader »). Ces séquences peuvent être celles qui sont naturellement associées au gène codant la périostine telle que définie ci- dessus, ou bien peuvent être des séquences hétérologues. Ces séquences n'interviennent pas sur les propriétés spécifiques du promoteur ou du gène auxquelles elles sont associées, mais peuvent améliorer globalement qualitativement ou quantitativement, la transcription, et le cas échéant, la traduction. On peut également, dans le but d'augmenter le niveau d'expression, utiliser des séquences amplificatrices (séquences « enhancer ») de la transcription et de la traduction.
Parmi les autres séquences couramment employées dans la construction de cassettes d'expression et vecteurs recombinants, on citera également les séquences permettant le suivi de la transformation, et l'identification et/ou la sélection des cellules transformées.
La stimulation de la voie de signalisation de la périostine peut être effectuée en stimulant la voie de signalisation de TGF-β ou la voie de signalisation de la protéine morphogénétique osseuse (BMP) dans ladite cellule immunomodulatrice (voir pour revue Frangogiannis, 2012).
A titre d'exemples de médiateurs induisant l'expression de périostine, on peut citer l'angiotensine II, les cytokines IL-4 et IL-13 (voir pour revue Frangogiannis, 2012).
Le surnageant de culture d'une cellule isolée possédant un potentiel immunomodulateur, dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est modulée, telle que définie ci-dessus, peut être obtenu par culture de ladite cellule dans un milieu de culture approprié, et récupération et filtration du surnageant de culture.
La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant une cellule isolée possédant un potentiel immunomodulateur dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est modulée, ou le surnageant de culture de ladite cellule, tels que définis ci-dessus et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite composition, ledit véhicule pharmaceutiquement acceptable est adapté à la thérapie cellulaire. La préparation de cellules stromales pour leurs utilisations en thérapie cellulaire est bien connue de l'homme du métier (Le Blanc et al, 2008, Constantin et al, 2009, Garcia-Olmo et al, 2009, Gonzalez et al, 2009a et 2009b et Karussis et al, 2010).
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une cellule isolée possédant un potentiel immunomodulateur dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est modulée, ou le surnageant de culture de ladite cellule, ou d'une composition pharmaceutique, tels que définis ci-dessus, pour la fabrication d'un médicament immunosuppresseur ou immunostimulateur tels que définis ci-dessus.
La présente invention a également pour objet une méthode pour la régénération d'un tissu, la greffe d'organe ou pour traiter ou prévenir une maladie telles que définie ci-dessus, comprenant l'administration audit sujet d'une quantité thérapeutiquement efficace d'une cellule isolée possédant un potentiel immunomodulateur dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est modulée, ou le surnageant de culture de ladite cellule, ou d'une composition pharmaceutique tels que définis ci-dessus.
La présente invention a également pour objet l'utilisation in vitro d'une cellule isolée possédant un potentiel immunomodulateur dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est modulée, telle que définie ci-dessus, pour identifier (ou cribler) un produit modifiant les effets de la périostine dans ladite cellule.
La présente invention a également pour objet un modèle in vitro pour réaliser des tests pharmacologiques ou toxicologiques, comprenant une cellule isolée possédant un potentiel immunomodulateur dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est modulée, telle que définie ci-dessus, pour identifier (ou cribler) un produit modifiant les effets de la périostine dans ladite cellule.
La présente invention a également pour objet
une protéine choisie parmi la périostine et une protéine comprenant le premier, deuxième, troisième et/ou quatrième domaine FAS1, préférentiellement le deuxième domaine FAS1, de la périostine, de préférence la périostine,
une molécule d'acide nucléique comprenant une séquence codant pour ladite protéine ou
une composition pharmaceutique comprenant ladite protéine ou ladite molécule d'acide nucléique, et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable, pour son utilisation comme médicament immunostimulateur destiné à la vaccination, c'est-à-dire un adjuvant vaccinal ou dans le traitement d'un cancer ou d'une infection liés à un déficit immunitaire, d'un déficit sélectif ou combiné en immunoglobulines, d'un déficit isolé en lymphocytes T, d'un déficit en purine nucléoside phosphorylase, d'un déficit immunitaire combiné sévère par déficit en adénosine désaminase, ou de Phypogammaglobulinémie commune d'expression variable.
L'invention englobe la périostine naturelle, recombinante ou synthétique. Par « périostine recombinante » on entend la périostine produite par génie génétique, par exemple par clonage et amplification génique.
Par « périostine synthétique » on entend la périostine produite par synthèse enzymatique et/ou chimique.
Ladite périostine peut être d'origine humaine telle que décrite ci-dessus, ou d'origine animale.
La molécule d'acide nucléique codant pour ladite protéine est obtenue par des méthodes classiques, connues en elles-mêmes de l'homme du métier, en suivant les protocoles standards (voir par exemple la Demande Internationale WO 2010/025555). Ladite molécule d'acide nucléique peut se présenter sous la forme d'un vecteur recombinant eucaryote ou procaryote, comprenant un insert constitué par un polynucléotide codant pour la périostine. De nombreux vecteurs dans lesquels on peut insérer un polynucléotide d'intérêt afin de l'introduire et de le maintenir dans une cellule hôte eucaryote ou procaryote, sont connus en eux-mêmes ; le choix d'un vecteur approprié dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple expression de cette séquence ou intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte. Par exemple, on peut utiliser des vecteurs viraux ou non-viraux comme des plasmides.
De préférence, ledit vecteur recombinant est un vecteur d'expression dans lequel ledit polynucléotide est placé sous le contrôle d'éléments régulateurs de la transcription et de la traduction appropriés.
La présente invention a également pour objet un inhibiteur de la périostine sélectionné dans le groupe constitué par un anticorps bloquant anti-périostine, un ARN antisens, un oligonucléotide antisens morpholino, un ARN en épingle à cheveux, un ARN interfèrent (ARNi), un aptamère dirigés contre la périostine, ou une composition pharmaceutique comprenant ledit inhibiteur et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable, pour son utilisation comme médicament immunosuppresseur destiné à la régénération d'un tissu, à la greffe d'organe ou dans le traitement d'une maladie choisie dans le groupe constitué par la maladie du greffon contre l'hôte, les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, les rhumatismes inflammatoires chroniques, les maladies inflammatoires chroniques du système nerveux central, le lupus, les thyroïdites auto-immunes, les fistules anales complexes, les réactions asthmatiques de type hypersensibilité retardée de type IV, les cicatrices inflammatoires, les allergies, les nécroses tissulaires, les maladies auto-immunes, les ulcères, le diabète et les infections microbiennes.
La préparation d'anticorps anti-périostine est connue de l'homme du métier (voir Demande EP 2168599 Al). A titre d'exemple, d'anticorps bloquant anti- périostine humaine ont peut cités ceux décrits par Orecchia et al, 2011 et Zhu et al, 2011.
Selon une disposition avantageuse, on peut utiliser l'ARNi de séquence
SEQ ID NO : 1.
A titre d'exemples non limitatifs de véhicule pharmaceutiquement acceptable, on peut citer les dispersants, solubilisants, stabilisants, conservateurs, etc. Des véhicules pharmaceutiquement acceptables utilisables dans des formulations (liquides et/ou injectables et/ou solides) sont notamment la méthylcellulose, l'hydroxyméthyl cellulose, la carboxyméthylcellulose, les cyclodextrines, le polysorbate 80, le mannitol, la gélatine, le lactose, des huiles végétales ou animales, l'acacia, etc.
Ledit médicament ou ladite composition pharmaceutique peut se présenter sous la forme d'une solution saline, physiologique, isotonique et tamponnée, compatible avec un usage pharmaceutique et connu de l'homme du métier.
La quantité de ladite protéine ou dudit inhibiteur de la périostine utilisée à titre de médicament selon l'invention ou présente dans la composition pharmaceutique selon l'invention peut être modulée de façon à obtenir un taux circulant de principe actif (dans un liquide physiologique tel que le sang) nécessaire à l'obtention de l'effet thérapeutique désiré pour un sujet particulier. La quantité choisie dépendra de multiples facteurs, en particulier de la voie d'administration, de la durée d'administration, du moment de l'administration, de la vitesse d'élimination du composé, du ou des différents produits utilisés en combinaison avec ledit médicament ou ladite composition pharmaceutique, de l'âge, du poids et de la condition physique du patient, ainsi que de son histoire médicale, et de toutes autres informations connues en médecine.
Le médicament ou la composition pharmaceutique selon la présente invention peut être utilisé seul ou en association avec au moins un autre composé thérapeutiquement actif, tel que par exemple un antigène ou un second composé immunostimulateur ou immuno suppresseur selon l'utilisation désirée du médicament. L'utilisation dudit médicament ou de ladite composition pharmaceutique, et dudit composé thérapeutiquement actif peut être simultanée, séparée ou étalée dans le temps.
La présente invention a également pour objet une méthode de traitement ou de prévention, chez un sujet, d'un cancer ou d'une infection liés à un déficit immunitaire, d'un déficit sélectif ou combiné en immunoglobulines, d'un déficit isolé en lymphocytes T, d'un déficit en purine nucléoside phosphorylase, d'un déficit immunitaire combiné sévère par déficit en adénosine désaminase ou de l'hypogammaglobulinémie commune d'expression variable, comprenant l'administration audit sujet d'une quantité thérapeutiquement efficace de ladite composition pharmaceutique comprenant ladite protéine (la périostine ou une protéine comprenant 1, 2, 3 ou 4 domaines FAS1 de la périostine) ou une molécule d'acide nucléique comprenant une séquence codant pour ladite protéine, telle que définie ci-dessus.
La présente invention a également pour objet une méthode de régénération d'un tissu, de greffe d'un organe ou de traitement ou de prévention d'une maladie choisie dans le groupe constitué par la maladie du greffon contre l'hôte, les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, les rhumatismes inflammatoires chroniques, les maladies inflammatoires chroniques du système nerveux central, le lupus, les thyroïdites auto-immunes, les fistules anales complexes, les réactions asthmatiques de type hypersensibilité retardée de type IV, les cicatrices inflammatoires, les allergies, les nécroses tissulaires, les maladies auto-immunes, les ulcères, le diabète et les infections microbiennes, chez un sujet, comprenant l'administration audit sujet d'une quantité thérapeutiquement efficace de ladite composition pharmaceutique comprenant un anticorps bloquant anti-périostine, un ARN antisens, un oligonucléotide antisense morpholino, un ARN en épingle à cheveux, un ARN interfèrent (ARNi), un aptamère dirigés contre la périostine, telle que définie ci-dessus
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples montrant in vitro l'effet de la modulation de l'expression de la périostine dans les cellules stromales mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (ASC) sur le potentiel immunomodulateur de ces cellules, ainsi qu'aux figures annexées, dans lesquels :
la Figure 1 représente l'effet de l'ARM dirigé contre POSTN (siRNA POSTN) et de l'ARNi non spécifique contrôle (siRNA scramble) sur la quantité d'ARNm codant pour PUM1 (utilisé comme contrôle) dans les ASC traitées. A. La moyenne ± écart type à la moyenne (sem) après normalisation des valeurs est représentée sur le graphique. B. Le tableau représente les valeurs individuelles mesurées.
la Figure 2 représente l'effet de l'ARNi dirigé contre POSTN (siRNA POSTN) et de l'ARNi non spécifique contrôle (siRNA scramble) sur la quantité d'ARNm codant pour la périostine dans les ASC traitées. A. La moyenne ± écart type à la moyenne (sem) est représentée après normalisation des valeurs sur le graphique. B. Le tableau représente les valeurs individuelles mesurées. la Figure 3 représente l'effet in vitro du traitement des ASC avec le ligand TLR3 Poly(I:C) seul ou en combinaison avec la périostine (POSTN) à une dose de 1, 2, 4, ou 10 μ^ιηΐ, sur l'expression de l'ARNm POSTN (A) et IDOl (B).
la Figure 4 représente le dosage de l'IDO-1 dans le surnagent de culture d'ASC traitées avec unARNi dirigé contre POSTN (siRNA POSTN) ou un ARNi non spécifique contrôle (siRNA scramble).
la Figure 5 représente l'effet de l'ARNi dirigé contre POSTN (siRNA POSTN) et de l'ARNi non spécifique contrôle (siRNA scramble) sur la quantité d'ARNm codant pour POSTN, IDOl (IDO) et IFN-β (IFNB) dans les BM-MSC traitées.
- la Figure 6 représente (A) l'effet in vitro du traitement des ASC avec l'IFNy (A) à une dose de 4, 20, 100 ou 500 Ul/ml sur l'expression de l'ARNm POSTN et (B) l'effet in vitro du traitement des ASC avec l'IFNy à une dose de 100 Ul/ml en combinaison avec la périostine (POSTN) à une dose de 1, 2, 4, ou 10 μg/ml, sur l'expression de l'ARNm IDOl.
EXEMPLE 1 : EFFET IN VITRO DE L'INHIBITION DE L'EXPRESSION DE LA PERIOSTINE DANS LES CELLULES STROMALES MESENCHYMATEUSES DERIVEES DU TISSU ADIPEUX (ASC)
1) Matériels et méthodes
Isolement des cellules stromales mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux humain (ASC)
La fraction stroma vasculaire (SVF) a été isolée à partir de tissu adipeux sous-cutané humain par digestion avec la collagénase NB4 (0,4 U/ml final dans le milieu a-MEM + Ciprofloxacine 10 pg/ml final [= milieu α-ΜΕΜ OK]) pendant 45 min à 37°C sous agitation. La digestion a été arrêtée en utilisant le milieu α-ΜΕΜ OK froid. La suspension cellulaire a ensuite été filtrée à travers une membrane de nylon 100 μηι. Après centrifugation pendant 10 min à 1600 rpm, les cellules ont été reprises dans le milieu de culture CPM (a-MEM OK + Héparine 1 U/ml + 2% de plasma enrichi en facteur de croissance plaquettaire) et comptées sur un automate Countess®, selon les informations du fabricant (LifeTechnologies).
Les cellules de la SVF ont été étalées à une densité de 4000 cellules/cm2 dans le milieu CPM. Après 12h de culture à 37°C et 5% de C02, les cellules non adhérentes ont été retirées par lavage au PBS (phosphate-buffered saline). La fraction adhérente a ensuite été mise en culture in vitro dans le même milieu de culture CPM ; le milieu étant renouvellé trois fois par semaine. Après 8 jours de culture, les ASC (passage 0) ont été récoltées avec de la trypsine-EDTA (LifeTechnologies). Le nombre de cellules viables a été déterminé par l'exclusion du Trypan bleu sur un automate Countess®. Les cellules ont ensuite été étalées à une densité de 2000 cellules/cm2 et cultivées pendant 2 jours supplémentaires (passage 1). Le traitement avec l'ARNi (siRNA) a ensuite été effectué.
Isolement des cellules stromales mésenchymateuses issues de la moelle osseuse (BM-MSC)
Des cellules de moelle osseuse nucléées humaines ont d'abord été ensemencées à raison de 5x104 cellules/cm2 dans un milieu de culture consistant en le milieu essentiel minimum alpha (aMEM) supplémenté par 10% de sérum filtré de veau foetal (SVF ; Hyclone), 1 ng/ml de facteur de croissance fibroblastique 2 (FGF2, R&D Système, Lille, France), et 10 μ /ιηί de la ciprofloxacine. Tout le milieu a été renouvelé deux fois par semaine jusqu'à ce que les cellules atteignent la confluence (fin de P0). Ensuite, les cellules ont été détachées à l'aide de la trypsine. Les cellules viables ont été numérotées et réensemencés à 500 cellules/cm2 (passage PI).
Traitement avec l'ARNi
L'ARNi dirigé contre la périostine (POSTN) a été fourni par SIGMA (MISSION esiRNA Human POSTN, EHU069741). Cet ARNi est dirigé contre les 4 isformes de la périostine humaine. L'ARNi non spécifique AF488 a été fourni par QIAGEN (siARN AllStarNeg AF488).
Après 2 jours de culture, le milieu de culture des ASC ou des BM-MSC a été remplacé par le milieu de culture pour le traitement avec l'ARNi, préparé comme décrit ci-dessous.
Brièvement, 2 μΐ d'ARNi à 28 μΜ ont été dilués dans 100 μΐ de milieu α-ΜΕΜ OK, mélangés au vortex pendant 10 secondes et ensuite mélangés avec 12 μΐ de réactif HiPerfect (QIAGEN). Après mélange à nouveau au vortex, la suspension obtenue a été laissée 10 min à température ambiante avant d'être mélangée à 2 ml de milieu CPM. Les cellules ASC ont alors été ajoutées à ce milieu. Les cellules ont ensuite été cultivées 4 jours dans ce milieu à 37°C et 5% de C02. Extraction des ARN
Après 4 jours de culture, le milieu de culture des a été retiré et les cellules ont été congelées à -80°C. L'extraction des ARNs a été effectuée selon les instructions du fabricant (RNeasy mimkit, QIAGEN). Les ARN ont été quantifiés à l'aide de l'automate Nanodrop (ThermoScientific) et 1 μg dARN a été rétro-transcrit en utilisant le kit SuperScript One Step RT selon les recommandations du fabricant (LifeTechnologies).
RT-PCR quantitative (RT-qPCR)
La quantification des ADNc a été réalisée en utilisant la technologie StepOnePlus et le Mix SybrGreen selon les instructions du fabricant (LifeTechnologies).
Amorces
Les amorces utilisées pour la quantification des ARN sont les suivantes:
Tableau 1 :
Pumillo-1 (PUM1) est utilisé en tant que gène de référence. Analyses statistiques
Les résultats des RT-PCR quantitatives sont exprimés en valeurs moyennes ± écart type à la moyenne (sem). L'analyse de la significativité a été effectuée en utilisant le test de Mann & Whitney ou le test t de Student (Prism 5 logiciels). (* P <0,05, ** P <0,01).
Activité de ΓΙΡΟ dans le surnageant de culture d'ASC traitées avec Γ ARNi dirigé contre POSTN
L'activité de l'IDO-1 (indoleamine 2,3-dioxygénase 1) a été déterminée par chromatographie en phase liquide à haute performance en mesurant la concentration en kynurénine dans le surnageant de culture des ASC traitées avec l'ARM dirigé contre POSTN ou un ARNi non spécifique, et en utilisant la 3-nitro-L-tyrosine comme étalon interne. La kynurénine et la 3-nitro-L-tyrosine ont été détectées par absorption UV à 360 nm.
2) Résultats
Le traitement des ASC avec PARNi dirigé contre POSTN n'induit pas de modification significative de l'expression de PUM1 par rapport au traitement avec l'ARM non spécifique (voir Figure 1). L'ARM non spécifique peut donc être utilisé comme ARNi contrôle.
La quantité d'ARNm codant pour la périostine a ensuite été déterminée par RT-qPCR après le traitement des ASC avec l'ARM dirigé contre POSTN ou l'ARM non spécifique. Les résultats sont représentés à la Figure 2. Ces résultats montrent que le traitement des ASC avec l'ARM dirigé contre POSTN est efficace pour inhiber l'expression de POSTN dans ces cellules.
La quantité d'ARNm codant pour différentes protéines immunosuppressives a ensuite été déterminée par RT-qPCR après le traitement des ASC avec l'AR dirigé contre POSTN ou l'ARM non spécifique. Les résultats sont représentés au Tableau 2 ci-dessous.
Tableau 2 : effet de l'ARM dirigé contre POSTN et de PARNi non spécifique contrôle sur la quantité d'ARNm codant pour la périostine (POSTN) et différentes protéines immunosuppressives dans les ASC traitées. Les moyennes ± écart type après normalisation des valeurs mesurées sont représentées. ARNi non spécifique ARNi POSTN
Protéine Moyenne sem Moyenne sem
POSTN 1,00 0,00 0,08 0,03
IFN-β 1,00 0,00 289,38 120,77
IDO-1 1,00 0,00 92,74 72,18
TSG-6 1,00 0,00 1,89 0,59
HLA-G 1,00 0,00 3,70 1,64
IL- IRA 1,00 0,00 4,00 1,81
AIRE 1,00 0,00 2,15 0,48
Ces résultats montrent que l'inhibition de l'expression de POSTN par une stratégie d'ARN interfèrent induit une très forte augmentation de l'expression de l'IFN-β (Interféron béta) et de l'IDO-l (Indoléamine- 2,3-dioxygénase 1) et une augmentation de l'expression de TSG-6 (« Tumor necrosis factor-inducible gene 6 protein »), HLA-G (Antigène du complexe majeur d'histocompatibilité, Classe I, G), IL- 1RA (Antagoniste au récepteur de l'Interleukine-1) et AIRE (« Autoimmune regulator »).
Ces résultats suggèrent que la périostine contrôle l'expression des gènes codant IFN-β et l'IDO-l, qui possèdent des propriétés immunosuppressives. Ces résultats suggèrent également que la périostine contrôle l'activité immunomodulatrice des ASC.
En outre, l'inhibition de l'expression de POSTN par une stratégie d'ARN interfèrent induit une très forte augmentation de l'activité de l'IDO-l dans le surnageant de culture des ASC traitées avec l'ARNi dirigé contre POSTN (voir Figure 4).
Dans la mesure où les ASC possèdent des caractéristiques similaires aux autres cellules souches/stromales mésenchymateuses, et aux cellules progénitrices, cellules précurseurs, cellules différenciées à partir d'une cellule stromale mésenchymateuse, macrophages, monocytes, mastocytes, cellules myéloïdes, fibroblastes, cellules dendritiques, lymphocytes (par exemple lymphocytes Treg), cellules ΝΚ, cellules lymphoïdes et myoblastes, il est probable que la périostine joue également un rôle dans la modulation des propriétés immunosuppressives de ces cellules.
Des résultats similaires ont d'ailleurs été obtenus avec des cellules stromales mésenchymateuses issues de la moelle osseuse (BM-MSC) : l'inhibition de l'expression de POSTN par une stratégie d'ARN interfèrent a induit une très forte augmentation de l'expression de l'IDO-1 et de l'IFN-β par les BM-MSC (voir Figure 5). L'effet de la modulation de l'expression de la périostine sur le potentiel immunomodulateur des cellules n'est donc pas spécifique aux cellules stromales mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (ASC), mais s'exerce aussi notamment sur les cellules stromales mésenchymateuses issues de la moelle osseuse (BM-MSC).
Par ailleurs, il a été montré que les cellules stromales mésenchymateuses humaines présentent des fonctions d'effecteurs antimicrobiens induites par l'indoléamine- 2,3-dioxygénase (IDO), contre différents pathogènes, tels que les bactéries, les parasites protozoaires et les virus (Meisel et al, 2011 et Krampera, 2011).
Les résultats obtenus ci-dessus suggèrent par conséquent qu'une cellule isolée possédant un potentiel immunomodulateur, de préférence une ASC, dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est inhibée présente des propriétés antimicrobiennes, dans la mesure où l'expression d'IDO-l est significativement augmentée dans ladite cellule.
EXEMPLE 2 : EFFET IN VITRO DE L'AJOUT DE LA PERIOSTINE DANS LES ASC TRAITES AVEC LE LIGANG TLR3
1) Matériels et méthodes
L'isolement des cellules stromales mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux humain (ASC) a été effectué comme précédemment décrit à l'Exemple 1-1 ci- dessus, à l'exception que les cellules de la SVF ont été étalées à une densité de 2000 cellules/cm2 et cultivées pendant 5 jours supplémentaires (passage 1) avec un changement de milieu de culture au bout de 2 jours.
Après les 5 jours de culture en passage 1, les cellules ont été traitées avec du Poly(I:C) qui est un ligand de TLR3 (InvivoGen, Poly(I:C)-LMW) et/ou la périostine (POSTN ; R&D SYSTEMS, Reconbinant Human Periostin/OSF-2). Le milieu utilisé pour le traitement est le milieu CPM additionné de Poly(I:C) à une concentration de 500 μg/ml et/ou de la périostine (POSTN) à une concentration de 1, 2, 4 ou 10 μg ml.
Après 24 heures de traitement le milieu a été retiré et les cellules ont été congelées à -80°C. L'extraction des ARNs IDOl et la RT-qPCR ont été effectuées comme précédemment (voir Exemple 1-1 ci-dessus). 2) Résultats
Les résultats sont représentés à la Figure 3.
Les propriétés immunosuppressives des ASC ont été stimulées par l'ajout de Poly(I:C).
L'ajout de doses croissantes de périostine inhibe l'effet de Poly(I:C) sur l'expression d'IDOl .
Ces résultats montrent que lorsque l'on stimule l'effet immunosuppresseur, l'ajout de POSTN inhibe cet effet.
Des résultats similaires ont été obtenus en remplaçant le Poly(I:C) par l'IFNy (R&D SYSTEMS), qui est un stimulus capable d'induire aussi la production de l'IDO-1. En effet, l'ajout d'IFNy a induit une diminution de l'expression de POSTN par les ASC (mesurée par RT-qPCR) de manière dose-dépendante et l'ajout de POSTN dans le surnagent de culture des ASC a inhibé l'expression de l'IDO-1 induite par l'IFNy (voir Figure 6). Ces résultats montrent que l'effet de POSTN n'est pas spécifique à TLR3.
L'augmentation de l'expression de la périostine dans les cellules stromales mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (ASC) permet donc de diminuer le potentiel immunosuppresseur de ces cellules.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Cellule diploïde isolée possédant un potentiel immunomodulateur, dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est modulée, ou le surnageant de culture de ladite cellule, pour son utilisation comme médicament.
2. Cellule ou surnageant pour son utilisation selon la revendication 1, caractérisés en ce que l'on inhibe totalement ou partiellement l'expression et/ou l'activité de ladite périostine.
3. Cellule ou surnageant pour son utilisation selon la revendication 2, caractérisés en ce que ledit médicament est un médicament immunosuppresseur destiné à la régénération d'un tissu, à la greffe d'organe ou dans le traitement d'une maladie choisie dans le groupe constitué par la maladie du greffon contre l'hôte, les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, les rhumatismes inflammatoires chroniques, les maladies inflammatoires chroniques du système nerveux central, le lupus, les thyroïdites auto-immunes, les fistules anales complexes, les réactions asthmatiques de type hypersensibilité retardée de type IV, les cicatrices inflammatoires, les allergies, les nécroses tissulaires, les maladies auto-immunes, les ulcères, le diabète et les infections microbiennes.
4. Cellule ou surnageant pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisés en ce que l'expression et/ou l'activité de ladite périostine est totalement ou partiellement inhibée à l'aide d'un composé choisi dans le groupe constitué par un anticorps bloquant, un ARN antisens, un oligonucléotide antisens morpholino, un ARN en épingle à cheveux, un ARN interfèrent, un aptamère dirigés contre la périostine et un inhibiteur de la périostine.
5. Cellule ou surnageant pour son utilisation selon la revendication 5, caractérisés en ce que ledit composé est un ARNi dirigé contre la périostine.
6. Cellule ou surnageant pour son utilisation selon la revendication 1 , caractérisés en ce que l'on augmente l'expression et/ou l'activité de ladite périostine.
7. Cellule ou surnageant pour son utilisation selon la revendication 6, caractérisés en ce que l'augmentation de l'expression et/ou de l'activité de ladite périostine est effectuée par la modification du génome de ladite cellule, par stimulation de la voie de signalisation de la périostine dans ladite cellule ou par l'utilisation de médiateurs induisant l'expression de la périostine.
8. Cellule ou surnageant pour son utilisation selon la revendication 6 ou la revendication 7, caractérisés en ce que ledit médicament est un médicament immunostimulateur destiné à la vaccination ou dans le traitement d'une maladie choisie dans le groupe constitué par un cancer ou une infection liés à un déficit immunitaire, un déficit sélectif ou combiné en immunoglobulines, un déficit isolé en lymphocytes T, un déficit en purine nucléoside phosphorylase, un déficit immunitaire combiné sévère par déficit en adénosine désaminase et l'hypogammaglobulinémie commune d'expression variable.
9. Cellule ou surnageant pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisés en ce que ladite cellule dans laquelle l'expression de la périostine est modulée est une cellule humaine.
10. Cellule ou surnageant pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisés en ce que ladite cellule dans laquelle l'expression de la périostine est modulée est choisie dans le groupe constitué par une cellule stromale mésenchymateuse, une cellule progénitrice, une cellule précurseur, une cellule différenciée à partir d'une cellule stromale mésenchymateuse, un macrophage, un monocyte, un mastocyte, une cellule myéloïde, un fibroblaste une cellule dendritique, un lymphocyte, une cellule N , une cellule lymphoïde et un myoblaste.
1 1. Cellule ou surnageant pour son utilisation selon la revendication 10, caractérisés en ce que ladite cellule stromale mésenchymateuse est une cellule stromale mésenchymateuse dérivée de la moelle osseuse, du tissu adipeux, d'un tissu solide, du placenta, du sang adulte ou du sang de cordon.
12. Cellule ou surnageant pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisés en ce que ladite cellule possédant un potentiel immunomodulateur exprime IFN-β, IDO-1, TSG-6, HLA-G, PGE2, TGF- β, galectine, HO-1, IL-6, IL-1RA, IL-33, AIRE, hEGF, TNF, GM-CSF et/ou JAG1.
13. Composition pharmaceutique comprenant une cellule diploïde possédant un potentiel immunomodulateur, dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est modulée ou le surnageant de culture de ladite cellule, tels que définis à l'une quelconque des revendications 1, 2, 4-7 et 9-12, et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
14. Modèle in vitro pour réaliser des tests pharmacologiques ou toxicologiques, comprenant une cellule diploïde possédant un potentiel immunomodulateur dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est modulée, telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 , 2, 7-7 et 9-12, pour identifier un produit modifiant les effets de la périostine dans ladite cellule.
15. Utilisation in vitro d'une cellule diploïde isolée possédant un potentiel immunomodulateur dans laquelle l'expression et/ou l'activité de la périostine est modulée, telle que définie à l'une quelconque des revendications 1, 2, 4-7 et 9-12, pour identifier un produit modifiant les effets de la périostine dans ladite cellule.
16. Protéine choisie parmi la périostine et une protéine comprenant le premier, deuxième, troisième et/ou quatrième domaine FAS1 de la périostine, ou molécule d'acide nucléique comprenant une séquence codant pour ladite protéine, ou composition pharmaceutique comprenant ladite protéine ou ladite molécule d'acide nucléique et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable, pour son utilisation comme médicament immunostimulateur destiné à la vaccination ou dans le traitement d'un cancer ou d'une infection liés à un déficit immunitaire, d'un déficit sélectif ou combiné en immunoglobulines, d'un déficit isolé en lymphocytes T, d'un déficit en purine nucléoside phosphorylase, d'un déficit immunitaire combiné sévère par déficit en adénosine désaminase, ou de Phypogammaglobulinémie commune d'expression variable.
17. Inhibiteur de la périostine sélectionné dans le groupe constitué par un anticorps bloquant anti-périostine, un ARN antisens, un oligonucléotide antisens morpholino, un ARN en épingle à cheveux, un ARN interfèrent, un aptamère dirigés contre la périostine, ou une composition pharmaceutique comprenant ledit inhibiteur et au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable, pour son utilisation comme médicament immunosuppresseur destiné à la régénération d'un tissu, à la greffe d'organe ou dans le traitement d'une maladie choisie dans le groupe constitué par la maladie du greffon contre l'hôte, les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, les maladies inflammatoires chroniques du système nerveux central, le lupus, les thyroïdites auto-immunes, les fistules anales complexes, les réactions asthmatiques de type hypersensibilité retardée de type IV, les allergies, les maladies auto-immunes, les ulcères, le diabète et les infections microbiennes.
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