CA2508266A1 - Polypeptides chimeriques et leurs applications therapeutiques contre une infection a flaviviridae - Google Patents

Polypeptides chimeriques et leurs applications therapeutiques contre une infection a flaviviridae Download PDF

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Abstract

La présente invention concerne la construction d'un pofypeptide chimérique utile dans fa prévention ou dans le traitement d'une infection à Flaviviridae. La présente invention porte également sur l'utilisation du polypeptide chimérique dans l'élaboration de vecteurs viraux recombinants, tel un vecteu r viral vivant rougeole.

Description

POLYPEPTIDES CHIMÉRIQUES ET LEURS APPLICATIONS
THÉRAPEUTIQUES CONTRE UNE INFECTION Ä FLAVIVIRIDAE
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne la construction d'un polypeptide chimérique utile dans la prévention ou dans le traitement d'une infection à
Flaviviridae. La présente invention porte également sur l'utilisation du polypeptide chimérique dans l'élaboration de vecteurs viraux recombinants, tel un vecteur viral vivant rougeole pour agir en tant que vaccin.
RÉSUMÉ DE L'INVENTION
La présente invention concerne un polypeptide chimérique et ses applications dans la prévention ou dans le traitement d'une infection à
Flaviviridae.
Plus particulièrement, la présente invention a pour objet un polypeptide chimérique comprenant un peptide de sous-domaine de la protéine E de Flaviviridae lié à un peptide de sous-domaine de la protéine de membrane M de Flaviviridae.
La présente invention a aussi pour objet, un polynucléotide isolé ou purifié
codant pour un polypeptide chimérique selon l'invention.
La présente invention a aussi pour objet, un vecteur viral recombinant de la rougeole dans le génome duquel est inséré un polynucléotide selon l'invention.
L'invention a aussi pour objet des anticorps monoclonaux ou polyclonaux purifiés reconnaissants spécifiquement au moins le polynucléotide défini précédemment et/ou le polypeptide chimérique de l'invention.
L'invention vise aussi l'utilisation d'un vecteur viral selon l'invention pour la préparation d'une composition immunogène destinée à la prévention ou au traitement d'une infection à Flaviviridae chez une espèce sensible.
2 La présente invention vise également des vecteurs de clonage ou d'expression comprenant un polynucléotide de l'invention.
Selon un autre objet, la présente invention propose une composition immunogène destinée à la prévention et/ou au traitement d'une infection à
Flaviviridae chez une espèce sensible, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un des éléments suivants - un polypeptide chimérique tel que défini précédemment;
- un polynucléotide selon l'invention;
- un vecteur viral recombinant selon l'invention;
- un anticorps selon l'invention; et - un vecteur de clonage etlou d'expression selon l'invention.
La présente invention propose également une méthode de prévention et/ou de traitement d'une infection à Flaviviridae chez une espèce sensible, comprenant l'administration d'une quantité pharmaceutiquement efficace d'au moins un des éléments suivants - un polypeptide chimérique tel que déni précédemment;
- un polynucléotide selon l'invention;
- un vecteur viral recombinant selon l'invention;
- un anticorps selon l'invention; et - un vecteur de clonage et/ou d'expression selon l'invention.
' BR~VE DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 montre la Séquence de 384 nt codant le domaine [EDIII]pv~ de la souche virale FGA/89 en phase avec le peptide signal de la calréticuline (ssCRT) dans le vecteur MVs~,,w aux sites d'insertion BsiWl (en 5') et BssHll (en 3').
3 La Figure 2 montre Séquence de 516 nt codant le protéine de fusion [EDIII + M'-40]pv~ de la souche virale FGA/89 en phase avec le peptide signal de la calréticuline (ssCRT) dans le vecteur MVs~nW aux sites d'insertion BsiWl (en 5') et BssHll (en 3').
La Figure 3 montre des résultats de cellules Vero infectées avec des vecteur viraux recombinants de la rougeole selon l'invention. Multiplicité d'infection de 10 TCIP50 /cellule pour 30 h . IF avec anti-DV1 HMAF.
La Figure 4 montre l'expression et secrétion des domaines antigéniques [EDIII]pv-~ et [EDIII+M''~°]ov_~ dans les lysats cytoplasmiques (C) et les surnageants (S) de cellules Vero infectées par les virus recombinés MVSchw-DV-1 La Figure 5 montre Expression et sécrétion des domaines antigéniques [EDIII]pv_ ~ et [EDIII+M'~°]ov_~ dans les surnageants filtrés et concentrés de cellules S2 exprimant de manière inductible ces antigènes.
La Figure 6 montre une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide chimérique selon un mode préféré de l'invention.
La Figure 7 montre une séquence en acides aminés d'un polypeptide chimérique selon un mode préféré de l'invention, ainsi que la séquence nucléotidique le codant.
La Figure 8 montre une séquence en acides aminés d'un dimère de l'ectodomaine III selon un mode préféré de l'invention, ainsi que la séquence nucléotidique le codant.
La Figure 9 montre une séquence en acides aminés d'un dimère de l'ectodomaine III selon un mode préféré de l'invention, ainsi que la séquence nucléotidique le codant.
4 La Figure 10 montre une séquence en acides aminés d'un polypeptide chimérique selon un mode préféré de l'invention, ainsi que la séquence nucléotidique le codant.
La Figure 11 montre une séquence en acides aminés de l'ectodomaine III selon un mode préféré de l'invention, ainsi que la séquence nucléotidique le codant.
La Figure 12 montre une séquence en acides aminés d'un dimére de l'ectodomaine III selon un mode préféré de l'invention, ainsi que la séquence nucléotidique le codant.
La Figure 13 montre une séquence en acides nucléiques codant pour un peptide de l'ectodomaine III selon un mode préféré de l'invention.
La Figure 14 montre une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide chimérique selon un mode préféré de l'invention.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION
L'originalité de la présente invention porte sur la construction d'un polypeptide chimérique et ses applications dans la prévention ou dans le traitement d'une infection à Flaviviridae.
1. Polypeptide et polynuciéotide Selon un premier aspect, la présente invention vise un polypeptide chimérique comprenant un peptide de sous-domaine de la protéine E de Flaviviridae lié à un peptide de sous-domaine de la protéine de membrane M de Flaviviridae. Par « Flaviviridae » on entend un virus sélectionné dans le groupe constitué par les virus du Nil Occidental, de la Dengue, de l'encéphalite japonaise et de la fièvre jaune.
Préférablement, le peptide de sous-domaine de la protéine E consiste en l'ectodomaine III comprenant une séquence en acide aminé telle que définie dans l'une quelconque des SEQ ID NOS : 1, 5, 6, 8, 9 et 10. Plus particulièrement, le peptide de sous-domaine de la protéine E consiste en un dimère de l'ectodomaine III des virus de la Dengue 1, 2, 3 ou 4 comprenant une séquence en acide aminé telle que définie dans l'une quelconque des SEQ ID
NOS : 5, 6 et 9, ou en un tétramère de l'ectodomaine III des virus de la Dengue
5 1,2,3et4.
En ce qui concerne le peptide de sous-domaine de la protéine M, celui-ci consiste en particulier en l'ectodomaine 1-40 comprenant une séquence en acide aminé allant de la position 125 à 172 de la SEQ ID NO : 2 ou en la séquence apoptoM comprenant une séquence en acide aminé allant de la position 156 à
172 de la SEQ ID NO : 2.
Selon un mode préféré, le polypeptide chimérique de l'invention comprend en outre un segment de liaison liant le peptide de sous-domaine de la protéine E
au peptide de sous-domaine de la protéine M. Ledit segment de liaison est préférablement un pentapeptide ayant pour séquence : RRDKR.
D'une manière très préférentielle, le polypeptide chimérique selon l'invention comprend une séquence en acide aminé telle que définie dans les SEQIDNOS:2,4,7et11.
L'invention vise aussi les polypeptides (et les fragments de ceux-ci) qui sont codés par les séquences nucléotidiques mentionnés ci-après. Par « polypyptide » on entend, au sens de la présente invention, désigné
indifféremment des protéines ou des peptides. Par c polypeptide chimérique »
on entend toute protéine comprenant des sous-parties de différentes origines, par exemple un polypeptide A provenant d'une première espèce et un peptide provenant d'une deuxième espèce. Une protéine est également considérée comme un polypeptide chimérique si elle comprend des sous-parties provenant de différentes protéines d'une même espèce, ou bien d'une même protéine de différentes espèces.
Selon un aspect connexe, l'invention vise un polynucléotide isolé ou purifié
codant pour un polypeptide chimérique tel que défini précédemment.
Par "isolé ou purifié", on entend les molécules qui ont été altérées par l'homme de leur état natif, c'est-à-dire, si une telle molécule existe dans la nature, elle a été changée et/ou retirée de son environnement initial. Par exemple, un
6 polynucléotide ou un polypeptide naturellement présent dans un organisme vivant n'est pas "isolé". Toutefois, le même polynucléotide ou polypeptide lorsque séparé de son environnement normal et/ou obtenu par clonage, amplification et/ou par synthèse chimique est considéré selon la présente invention comme étant "isolé". D'ailleurs, un polynucléotide ou polynucléotide qui est introduit dans un organisme par transformation, manipulation génétique ou par n'importe quelle autre méthode de recombinaison est "isolé" même si il est présent dans ledit organisme.
Par "polynucléotide" on entend toute séquence ou molécule d'ADN, d'ARN. Le terme polynucléotide englobe toutes les molécules d'acides nucléiques qui se retrouvent à l'état naturel ou artificiel. Ceci inclut les molécules d'ADN, les molécules d'ARN, les ADNc, les séquences artificielles et tous les fragments de ceux-ci. Tout polynucléotide qui ont été modifié chimiquement, enzymatiquement ou métaboliquement mais qui ont conservé les propriétés biochimiques du polypeptide chimérique d'origine est incluse dans la portée de la présente invention.
Selon un mode de réalisation préférentiel, le polynucléotide de la présente l'invention lorsqu'il code pour un polypeptide chimérique selon l'invention, comprend avantageusement une séquence nucléotidique telle que définie dans l'une quelconque des SEQ ID NOS : 2, 3, 4 et 7.
Les polypeptides et polynucléotides selon la présente invention peuvent être préparés par tout procédé approprié. Ils peuvent notamment être obtenus par synthèse chimique mais il est également possible de les obtenir par voie biologique en utilisant notamment différents vecteurs dans les cultures cellulaires appropriées. Les peptides selon la présente invention peuvent se présenter sous forme déglycosylée, ou glycosylée, si cela est nécessaire. Une personne versée dans le domaine de l'invention saura obtenir différents polynucléotides/polypeptides et elle saura également déterminer quels sont, parmi les polynucléotides/polypeptides obtenus, ceux qui ont une activité
biologique adéquate.
7 2. Vecteur viraux recombinants Selon un autre aspect, l'invention concerne un vecteur viral recombinant de la rougeole dans le génome duquel est inséré un polynucléotide selon l'invention. Selon un mode privilégié, le vecteur viral recombinant selon l'invention est avantageusement un vecteur viral vivant rougeole souche Schwarz, comme ceux sélectionné dans le groupe de vecteurs viraux constitués par ceux déposés à la CNCM sous les numéros I-3440, I-3442, I-3452, I-3453, I-3454 et I-3455.
3. Vecteurs de clonage etlou d'expression et anticorps Selon un autre aspect, l'invention concerne tout vecteur de clonage et/ou d'expression et tout hôte cellulaire (procaryote ou eucaryote) transformé par un tel vecteur, et comprenant les éléments de régulation permettant l'expression de la séquence de nucléotides codant pour un polypeptide chimérique selon l'invention.
Les polypeptides et polynucléotides de la présente invention peuvent aussi être utilisés pour préparer des anticorps polyclonaux ou monoclonaux capables de se fixer (préférablement de manière spécifique) sur au moins un polypeptide chimérique/polynucléotide objet de l'invention. La présente invention vise donc également de tels anticorps purifiés qui peuvent être obtenus par des techniques très bien connues comme par exemple la technique décrite par Kolher et Milstein (Continuons cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature (1975), 262:495-497). Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les anticorps sont de type « humanisés ». Une personne versée dans le domaine de par ses connaissances générales saura comment préparer ces types d'anticorps.
Dans le contexte de la présente invention, le terme "vecteur de clonage et/ou d'expression" se réfère à une construction polynucléotidique conçu pour être transfecté dans différents types cellulaires. De ce fait ces vecteurs visent les vecteurs d'expression conçus pour l'expression d'une séquence nucléotidique dans une cellule hôte; les vecteurs de clonage conçus pour l'isolation, propagation et la réplication de nucléotides insérés ou des vecteurs navettes qui comprennent des attributs de plus d'un vecteur.

Ö
4. Méthodes et Procédé d'utilisation Selon un autre aspect, l'invention concerne la prévention et/ou le traitement d'une infection à Flaviviridae chez une espèce sensible. Plus particulièrement, l'invention vise l'utilisation d'un vecteur viral recombinant selon l'invention pour la préparation d'une composition immunogène destinée à la prévention ou au traitement d'une infection à Flaviviridae chez une espèce sensible.
L'invention vise aussi une méthode de prévention et/ou de traitement d'une infection à Flaviviridae chez une espèce sensible, comprenant l'administration d'une quantité pharmaceutiquement efficace d'au moins un des éléments suivants - un polypeptide chimérique selon l'invention;
- un polynucléotide selon l'invention;
- un vecteur viral recombinant selon l'invention;
- un anticorps selon l'invention; et - un vecteur de clonage et/ou d'expression selon l'invention.
Par « infection à Flaviviridae » on entend par exemple des flaviviroses telles la dengue, la fièvre jaune, l'encéphalite japonaise et la fièvre du Nil occidental.
5. Compositions La présente invention concerne également des compositions immunogène utile dans la prévention etlou dans le traitement d'une infection à
Flaviviridae. Par c composition immunogène » on entend une composition qui contient des éléments ayant la capacité d'induire in vivo ou in vitro, une réponse immune de type cellulaire et/ou humorale.
Dans un mode de réalisation préféré, la composition de la présente invention contient, en outre un véhicule pharmaceutiquement acceptable, et un élément choisi dans le groupe constitué par - un polynucléotide selon la présente invention;
- un polypeptide chimérique selon la présente invention;
- un vecteur viral recombinant selon l'invention;
- un anticorps selon la présente invention; et - un vecteur de clonage et/ou d'expression selon la présente invention.
Les compositions selon la présente invention peuvent se présenter sous une forme solide ou liquide quelconque habituelle pour l'administration pharmaceutique, c'est-à-dire par exemple des formes d'administration liquide, en gel, ou tout autre support permettant par exemple la libération contrôlée.
Parmi les compositions utilisables, on peut citer notamment les compositions injectables chez l'humain.
Une personne versée dans le domaine saura préparer des compositions pharmaceutiquement acceptables et déterminer, en fonction de plusieurs facteurs, le mode d'administration privilégié et la quantité devant ëtre administrée. Parmi les facteurs pouvant influencer ses choix l'on retrouve: la nature du traitement, la nature exacte des ingrédients, actifs ou non, entrant dans la composition; le stade de la maladie; la condition, l'âge et le poids du patient, etc.

EXEMPLE
L'exemple ci-après permettra de mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention, et sert à illustrer l'étendue 5 de l'utilisation de la présente invention et non à limiter sa portée. Des modifications et variations peuvent y être effectuées sans que l'on échappe à
l'esprit et à la portée de l'invention. Bien que l'on puisse utiliser d'autres méthodes ou produits équivalents à ceux que l'on retrouve ci-dessous pour tester ou réaliser la présente invention, le matériel et les méthodes préférés sont 10 décrits.
Le virus de la rougeole recombiné MVS~,"~,-[EDIII + M~'~°]pv-~
comme prototype d'un vaccin candidat contre la dengue (PTR156) Décrites dans les Figures 1 et 2, deux constructions immunogéniques basées d'une part sur la capacité du domaine III de la glycoprotéine d'enveloppe E du virus de la dengue (EDIII; 100 aa) à induire des anticorps neutralisants et d'autre part, sur l'implication de l'ectodomaine de la protéine de membrane M
(M'es°, 40 aa) dans la pathogénicité virale (apoptose), ont été
insérées dans le génome de la souche virale atténuée Schwarz du virus de la rougeole (MVSchw).
Les séquences virales sont sous la dépendance du peptide signal de la calréticuline pour permettre leur adressage dans la voie de sécrétion.
L'expression des séquences [EDIII]pv_~ et [EDIII+M'-4°]ov_~ par les virus recombinés MVSchw a été vérifiée dans les cellules Vero infectées par immunofluorescence indirecte à l'aide d'un sérum polyclonal de souris HMAF
dirigé contre le DV-1 (Fig. 3). La sécrétion des domaines antigéniques EDIII
et EDIII fusionné à la séquence M'~° (avec le pentapeptide intercalant RRDKR) du virus dengue, type-1 (DV-1) de la souche FGAI89 a été observée par analyse en Western blot dans les surnageants de cellules infectées par les virus MVS~n""-[EDIII]ov_~ et MVS~nw-[EDIII+M'-4°jov-~, respectivement (Fig. 4). De même, la production et la sécrétion dans les surnageants de culture d'une lignée de cellules de drosophile S2/[EDIII+M''4°]ov_~ induites pour l'expression de ces protéines a été démontrée (Fig. 5).
Deux groupes de 4 souris CD46/IFNAR adultes ont été immunisées avec 104 TCID50 de chacun des virus MVSchw recombinés (Tables 1 et 2). Le virus vide MVSchw a été utilisé comme contrôle négatif. Nous avons déterminé la production d'anticorps dirigés contre le virus MVSchw (MV Ag) et le virus DV-1 (DV-1 Ag) y compris ceux qui sont spécifiques du EDIIII (DV-1 rEDlll, une protéine recombinante purifiée qui est produite en système bactérien par l'équipe d'Hughes Bedouelle) et neutralisants (Anti-DV-1 FRNT75) chez les souris immunisées (Tables 1 et 2). Nous observons que le virus MVS~n""-[EDIII]pv_~
est peu efficace à produire des anticorps spécifiques du DV-1 ou du seul EDIII
après deux inoculations espacées d'un mois (Table 1). Selon le même protocole d'immunisation, nous observons que le virus MVS~nw-[EDIII+M'-4°]pv-~
induit des titres significatifs d'anticorps dirigés contre le DV-1 et contre le seul EDIII (Table 2). Des anticorps anti-DV1 dont ceux qui sont neutralisants sont encore détectés quatre mois après la fin de l'immunisation.
Lorsque les souris immunisées plus de 6 mois avec MVS~n""-[EDIII+M'-4o]pv-~ subissent un rappel avec une dose unique de 5 Ng de protéines totales d'un concentrât de surnageant de cellules de drosophile S2/[ED111+M'-4°]pv-~
induites pour l'expression de la protéine de fusion [EDIII+M'-4°]ov-~
et en présence d'Alugel comme adjuvant, des taux élevés d'anticorps anti-DV-1, anti EDIII et neutralisants du DV-1 sont observés, qui traduisent une réponse humorale mémoire bien établie chez ces animaux vaccinés (Table 2). Les anticorps anti-DV-1 sont encore présents plusieurs mois après le rappel antigénique (Table 2).
Trois mois après le rappel antigénique avec r[EDIII+M'-4°]ov-1, les souris immunisées avec MVS~""r[EDIII+M'-4°]ov-~ ont été inoculées avec 10' UFF
du DV-1 souche FGA/NA d1d par la voie intrapéritonéale (le DV-1 est responsable d'une infection asymptomatique chez la souris IFNAR). Des titres importants en anticorps anti-DV-1 (surtout dirigés contre le EDIII) dont ceux qui neutralisent le DV-1 souche Hawaï (titre neutralisant # 4000) sont observés après 3 semaines d'épreuve virale (Table 2). A noter que les souris immunisées 9 mois avec le virus MVS~nw-[EDIII+M'-3°]ov_~, (cette construction n'induit pas d'anticorps anti-EDIII ou neutralisants du DV1) puis éprouvées avec 10' UFF du DV-1 souche FGA/NA d 1 d par la voie intrapéritonéale, poduisent des titres en anticorps anti-DV1, anti-EDIII et neutralisants de 20000, 5000 et 80, respectivement; ce sont des valeurs équivalentes à celles observées chez les souris BALB/c ou IFNAR
éprouvées selon les mêmes conditions expérimentales.
En conclusion, la séquence de fusion [EDIII+M'~°]ov_~ sécrétée par le virus MVschw-[EDIII+M'~°]pv_1 est capable de générer des anticorps neutralisants anti-DV-1 et d'induire une réponse humorale mémoire sur le long terme qui est stimulée efficacement d'une part par l'antigène soluble r[EDIII+M~~°]pv-~ et d'autre part, en réponse à une infection virale. A l'inverse, le seul domaine antigénique EDIII sécrété par le virus MVS~,"",-[EDIII]ov_1 est peu immunogène chez les souris CD46+-IFNAR. Nos travaux complémentaires démontrent que le peptide pro-apoptotique ApoptoM (M32~°) à l'extrémité C-terminale de la M est déterminant dans le pouvoir immunogène de la séquence de fusion [EDIII+M~-40]pv-1 puisque le virus MVSch~r-[EDIII+M~-30]w_1 Sans ApoptoM induit une production d'anticorps anti-DV-1 équivalente à celle obtenue après immunisation avec le virus MVS~hw-[EDIII]pv_~.
Comme méthodologie générale de vaccination pédiatrique contre la dengue, nous proposons d'immuniser les jeunes individus avec le virus MVS~h""-[EDIII+M~'~°]cv-~ par une double inoculation espacée d'un mois, puis de les restimuler tardivement avec l'antigène soluble r[EDIII+M~~°]ov-~ dans un but de rappel vaccinal ou de prophylaxie contre le risque d'une infection par le virus de la dengue. Cette stratégie d'immunisation est en cours de validation pour les quatre sérotypes de la dengue sur la base d'un antigène composé du tétramère des 4 domaines EDIII des DV-1, -2, -3 et -4 fusionné à la séquence cytotoxique ApoptoM.
Nos premiers résultats expérimentaux soulignent l'importance d'un immunogène de taille réduite dérivé de la protéine d'enveloppe du virus DV1 en combinaison avec (es capacités immunostimulatrices du vecteur rougeole vivant, une stratégie permettant l'induction d'une réponse humorale neutralisante qui est efficace contre le virus de la dengue. Ils définissent une preuve de concept pour le design des constructions tétramériques des domaines antigéniques du DV qui permettront d'immuniser simultanément et sur le long terme contre les quatre sérotypes de la dengue.

TABLE 1 : Antibody response of CD46+-IFNAR mice to i.p, inoculation of MVs~nw -IEDllllnv~
lmmunization M. V Aa DV-1 Ag DV-1 rEDlll Anti-DV-1 month titer ' titer d titer e FRNT75 f 1a 15,000 < 100 < 100 ND

2b 40, 000 100 10 < 10 a. 104 TCIPSO of MV-DV1 (EDIII+M'~°j was given i.p. to four adult mice b. Individuals were boosted with 104 TCIPSO of MV-DV1[EDIII+M''~°]
c. Determined by ELISA (Trinity Biotech) on pooled heat-inactivated sera.
d. Determined by ELISA on pooled heat-inactivated sera. Microtritation plaques were coated with 5 x 105 FFU of sucrose purified FGAINA d1d as viral antigen.
e. Determined by ELISA on pooled heat-inactivated sera. Microtritation plaques were coated with 50 ng of highly purified recombinant EDIII from DV1 as viral antigen (a gift of H. Bedouelle).
f. Anti-DV1 neutralizing antibodies were detected by use of Focus Reduction Neutralization Test (FRNT). Pooled heat-inactivated sera were incubated with DV1 strain Hawaï and virus titration was performed on Vero cells by focus immunodetection assay.
FRNT75, the highest serum dilution tested that reduced the number of FFU by at least 75%.

TABLE 2 : Antibody resaonse of CD46+-IFNAR mice to i.a. inoculation of MVs~nW-(EDIII+M'.a°l~w Immunization M-V Ag DV-1 Aa DV-1 rEDlll Anti-DV-1 month titer e titer f titer 9 FRNT75 n 1 a 15, 000 < 100 5 100 N D

2b 40,000 1,600 400 10 3 30,000 1,000 600 10 6 20,000 500 100 40 7~ 20,000 20,000 100,000 800 9 10,000 2,000 10,000 100 10d 10,000 200,000 800,000 4,000 a. 104 TCIP5o of MV-DV1 [EDlll+M''4°] was given i.p. to four adult mice b. Individuals were boosted with 104 TCIPSO of MV-DV1[EDIII+M'~°]
c. Immunized mice were boosted with 5 Ng of total secreted proteins from 10 rDV1 [EDIII+M'~4°]-expressing S2 cell supernatants in the presence of Alugel as adjuvant.
d. Immunized mice were i.p. inoculated with 10' FFU of DV1 strain FGA/NA d1d for 3 weeks.
e. Determined by ELISA (Trinity Biotech) on pooled heat-inactivated sera.
f. Determined by ELISA on pooled heat-inactivated sera. Microtritation plaques were 15 coated with 5 x 105 FFU of sucrose purified FGA/NA d1d as viral antigen.

g. Determined by ELISA on pooled heat-inactivated sera. Microtritation plaques were coated with 50 ng of highly purified recombinant EDIII from DV1 as viral antigen (a gift of H. Bedouelle).
h. Anti-DV1 neutralizing antibodies were detected by use of Focus Reduction Neutralization Test (FRNT). Pooled heat-inactivated sera were incubated with DV1 strain Hawal and virus titration was performed on Vero cells by focus immunodetection assay.
FRNT75, the highest serum dilution tested that reduced the number of FFU by at least 75%.

FIGURE 6 (SEQ ID NO : 3) >insert DIII-ectoM40 dans pTRE2, 516 bases, 2E2B32D3 checksum.
CGTACGATGCTGCTATCCGTGCCGTTGCTGCTCGGCCTCCTCGGCCTGGC
CGTCGCCAGATCTAAAGGGATGTCATATGTGATGTGCACAGGCTCATTTA
AGCTAGAGAAGGAAGTGGCTGAGACCCAGCATGGGACTGTCCTAGTGCAG
GTTAAATACGAAGGAACAGATGCGCCATGCAAGATCCCCTTTTCGACCCA
AGATGAGAAAGGAGTGACCCAGAATGGGAGATTGATAACAGCCAATCCCA
TAGTTACTGACAAAGAAAAACCAGTCAACATTGAGACAGAACCACCTTTT
GGTGAGAGCTACATCATAGTAGGGGCAGGTGAAAAAGCTTTGAAACTAAG
CTGGTTCCGACGAGACAAACGTTCCGTGGCACTGGCCCCACACGTGGGAC
TTGGTCTAGAAACAAGAACCGAAACATGGATGTCCTCTGAAGGCGCCTGG
AAACAAATACAAAAAGTGGAGACTTGGGCTTTGAGACACCCATGATAGCG
GCCGCTATAAGCGCGC

FIGURE 7 (SEQ ID NO : 4) Sequence personnelle : insert DIII-ectoMl-40 JE dans pTRE2-ssCRT, 528 bases, checksum. (Query) Base n° 1:1 aa n° 1:1 Début de traduction: 1 Acides aminés : Code à une lettre - Numérotés Code génétique : Standard Codons en dessous des acides amines Largeur d'édition : 80-Nombre d'interlignes : 1 Non-codant en minuscules P

ATG TCC CCG CTG GGC GTC

Y

TCT ACA TAT ATG ACA GCG

H

CCG ACT CAC ACA GTC TCT

I

GAT TGC ATT ATT TCC GAC

M T P V G R L T V N P F V A T S' S 90 V

CCC CGG GTG GTG CCC AGC

E

TCA CTA GAG GAA CCC ATC

Q

GGA GAC CAG AAC CAT AGC

T

TCC GTC ACA GGG AGT AAA

K

TGG TCA AAA ACA TAC AAC

W I V R N P * R P L * A R 176 *

GTA CCT TAG CCG TAA

ô

FIGURE 8 (SEQ ID NO : 5) Sequence personnelle : insert DIII 1-2 dans Apol, 798 bases, 8EADCA65 checksum. (Query) GGC CTG GCC GTC

TTT AAG CTA GAG

GTT AAA TAC GAA

GAG AAA GGA GTG

GAC AAA GAA AAA

ATC ATA GTA GGG

AGC AGC ATA GGG

ATG TCA TAC TCT

ACA CAA CAT GGA

TGT RAG ATC CCT

CTG ATT ACA GTT

GCA GAA CCT CCA

F G D S Y. I I I G V E P G Q L K L N 234 TTG AAA CTC AAC

ACA ATG AGC GGC

R V E T W A L R H P * * A R 2 66 FIGURE 9 (SEQ ID NO : 6) Seqaence personnelle : insert DIII 3-4 dans Apol, 798 bases, F0988FC1 checksum. (Query) GGC CTG GCC GTC

TTT GTG TTG AAG

GTT GAG TAC AAA

GGA CAA GGG AAA

AAG AAG GAG GAG

ATA GTG ATT GGA

AGC TCG ATT GGG

ATG TCA TAC ACG

ACA CAG CAi' GGG

TGT AAA GTT CCC

ATC ATC TCA TCT

TTG GAA CCC CCT

TTA ACA CTC CAT

ACA TAC AGC GGC

R V E T W A L R H P * * A R 266
8 FIGURE 10 (SEQ ID NO : 7) Sequence personnelle : insert DIII FGA89 dans pTRE2-ssCRT-apoptoM dent, 408 bases, 98C01816 checksum. (Query) Base n° 1:1 aa n° 1:1 Début de traduction: 1 Code génëtique : Standard Largeur d'édition : 80 - Nombre d'interlignes : 1 Acides aminés : Code à une lettre - Numérotés Codons en dessous des acides amines Non-codant en minuscules CTC GGC CTG GCC GCC

TCA TTT AAG CTA GAG

CAG GTT AAA TAC GAA

GAT GAG AAA GGA GTG

ACT GAC AAA GAA AAA

TAC ATC ATA GTA GGG

GGC CGC ATT GAA ACC

W I L R H P * * A R 136
9 FIGURE 11 (SE4 ID NO : 8) Sequence personnelle : insert DIII JE dans pTRE2-ssCRT, 390 bases, E22E7675 checksum.
(Query) Base n° 1:1 aa n° 1:1 Début de traduction: 1 Code génétique : Standard Largeur d'édition : 80 - Nombre d'interlignes : 1 Acides aminés : Code à une lettre - Numérotés Codons en dessous des acides amines Non-codant en minuscules CTA TCC TTG GTC

GGC ACA GGC GCG

GAC ACT GGA TCT

CCT TGC CCG GAC

GGG CGG ACA AGC

GTG CTA ATG ATC

V V G R G D K Q I N H H W H K * R P 126 GGA GAC ATC CCG

L * A R 130 FIGURE 12 (SEQ ID NO : 9) Sequence personnelle : insert DIII 1-2 dans Apol, 1494 bases, 33DACA2B checksum. (Query) Base n 1:1 aa n 1:1 Dbut de traduction: 1 Code gntique : Standard Largeur d'dition : 80 - Nombre d'interlignes : 1 Acides amins : Code une Iettre - Numrots Codons en dessous des acides amines Non-codant en minuscules CTC GGC CTG GCC GTC

TCA TTT AAG CTA GAG

CAG GTT AAA TAC GAA

GAT GAG AAA GGA GTG

ACT GAC AAA GAA AAA

TAC ATC ATA GTA GGG

GGA AGC AGC ATA GGG

GGA ATG TCA TAC TCT

GAA ACA CAA CAT GGA

CCA TGT AAG ATC CCT

CGC CTG ATT ACA GTT

GAA GCA GAA CCT CCA

CAA TTG AAA CTC AAC

ACA ACA ATG GGA GGA

GTG TTG AAG AAA GAA

GAG TAC AAA GGG GAA

CAA GGG AAA GCT CAC

AAG GAG GAG CCT GTC

GTG ATT GGA ATT GGA

TCG ATT GGG AAG ATG

TCA TAC ACG ATG TGC

CAG CAT GGG ACA ACA

AAA GTT CCC ATA GAG

FfCC TCA TCT ACC CCT

GAA CCC CCT TTT GGG

ACA CTC CAT TGG TTC

TAC AGC GGC CGC GTG

E T W A L R H P * * A R 498 FIGURE 13 (SEQ ID NO : 10) >insert DIII IS-98-ST1 dans pTRE2-ssCRT, 390 bases, 8BOC43EF
checksum.
CGTACGATGCTGCTATCCGTGCCGTTGCTGCTCGGCCTCCTCGGCCTGGC
CGTCGCCAGATCTAAGGGAACAACCTATGGCGTCTGTTCAAAGGCTTTCA
AGTTTCTTGGGACTCCCGCAGACACAGGTCACGGCACTGTGGTGTTGGAA
TTGCAGTACACTGGCACGGATGGACCTTGCAAAGTTCCTATCTCGTCAGT
GGCTTCATTGAACGACCTAACGCCAGTGGGCAGATTGGTCACTGTCAACC
CTTTTGTTTCAGTGGCCACGGCCAACGCTAAGGTCCTGATTGAATTGGAA
CCACCCTTTGGAGACTCATACATAGTGGTGGGCAGAGGAGAACAACAGAT
TAATCACCATTGGCACAAGTAGCGGCCGCTATAAGCGCGC
FIGURE 14 (SEQ ID NO : 11) >insert DIII-ectoM40 IS-98-ST1 dans pTRE2-ssCRT, 528 bases, 8990CDD4 checksum.
CGTACGATGCTGCTATCCGTGCCGTTGCTGCTCGGCCTCCTCGGCCTGGC
CGTCGCCAGATCTAAGGGAACAACCTATGGCGTCTGTTCAAAGGCTTTCA
AGTTTCTTGGGACTCCCGCAGACACAGGTCACGGCACTGTGGTGTTGGAA
TTGCAGTACACTGGCACGGATGGACCTTGCAAAGTTCCTATCTCGTCAGT
GGCTTCATTGAACGACCTAACGCCAGTGGGCAGATTGGTCACTGTCAACC
CTTTTGTTTCAGTGGCCACGGCCAACGCTAAGGTCCTGATTGAATTGGAA
CCACCCTTTGGAGACTCATACATAGTGGTGGGCAGAGGAGAACAACAGAT
TAATCACCATTGGCACAAGAGACGCAGTCGGAGGTCACTGACAGTGCAGA
CACACGGAGAAAGCACTCTAGCGAACAAGAAGGGGGCTTGGATGGACAGC
ACCAAGGCCACAAGGTATTTGGTAAAAP,CAGAATCATGGATCTTGAGGAA
CCCTTGATAGCGGCCGCTATAAGCGCGC

Claims (23)

1. Polypeptide chimérique comprenant un peptide de sous-domaine de la protéine E de Flaviviridae lié à un peptide de sous-domaine de la protéine de membrane M de Flaviviridae.
2. Le polypeptide chimérique selon la revendication 1, caractérisé en ce que le peptide de sous-domaine de la protéine E consiste en l'ectodomaine III
comprenant une séquence en acide aminé telle que définie dans l'une quelconque des SEQ ID NOS : 1, 5, 6, 8, 9 et 10.
3. Le polypeptide chimérique selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le peptide de sous-domaine de la protéine E consiste en un dimère de l'ectodomaine III des virus de la Dengue 1, 2, 3 ou 4 comprenant une séquence en acide aminé telle que définie dans l'une quelconque des SEQ ID NOS:5,6 et 9.
4. Le polypeptide chimérique selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le peptide de sous-domaine de la protéine E consiste en un tétramère de l'ectodomaine III des virus de la Dengue 1, 2, 3 et 4.
5. Le polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à
4, caractérisé en ce que le peptide de sous-domaine de la protéine M
consiste en l'ectodomaine 1-40 comprenant une séquence en acide aminé
allant de la position 125 à 172 de la SEQ ID NO : 2.
6. Le polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à
4, caractérisé en ce que le peptide de sous-domaine de la protéine M
consiste en la séquence apoptoM comprenant une séquence en acide aminé allant de la position 156 à 172 de la SEQ ID NO : 2.
7. Le polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à
6, comprenant en outre un segment de liaison liant le peptide de sous-domaine de la protéine E au peptide de sous-domaine de la protéine M.
8. Le polypeptide selon la revendication 7, caractérisé en ce que le segment de liaison est un pentapeptide ayant pour séquence : RRDKR.
9. Le polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à
8, comprenant une séquence en acide aminé telle que définie dans les SEQ ID NOS:2,4,7 et 11.
10. Le polypeptide chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à
9, caractérisé en ce que le Flaviviridae est sélectionné dans le groupe constitué par les virus du Nil Occidental, de la Dengue, de l'encéphalite japonaise et de la fièvre jaune.
11. Un polynucléotide isolé ou purifié codant pour un polypeptide chimérique tel que défini dans l'un quelconque des revendications 1 à 10.
12. Le polynucléotide selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique telle que définie dans l'une quelconque des SEQ ID NOS : 2, 3, 4 et 7.
13. Un vecteur viral recombinant de fa rougeole dans le génome duquel est inséré un polynucléotide selon la revendication 11 ou 12.
14. Le vecteur viral recombinant selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur viral vivant rougeole souche Schwarz.
15. Le vecteur viral recombinant selon la revendication 13 sélectionné dans le groupe de vecteurs viraux constitués par ceux déposés à la CNCM sous les numéros I-3440, I-3442, I-3452, I-3453, I-3454 et I-3455.
16. Utilisation d'un vecteur viral selon l'une quelconque des revendications à 15 pour la préparation d'une composition immunogène destinée à la prévention ou au traitement d'une infection à Flaviviridae chez une espèce sensible.
17. Anticorps monoclonaux ou polyclonaux purifiés reconnaissants spécifiquement au moins le polynucléotide défini à la revendication 11 et/ou le polypeptide chimérique défini à l'une quelconque des revendications 1 à 10.
18. Vecteur de clonage ou d'expression comprenant un polynucléotide défini à
la revendication 11.
19. Composition immunogène destinée à la prévention et/ou au traitement d'une infection à Flaviviridae chez une espèce sensible, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un des éléments suivants :
- un polypeptide chimérique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 10;
- un polynucléotide selon la revendication 11;
- un vecteur viral recombinant selon la revendication 13;
- un anticorps selon la revendication 17; et - un vecteur de clonage et/ou d'expression selon la revendication 18.
20. Composition immunogène selon la revendication 19, caractérisée en ce qu'elle comprend un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
21. Méthode de prévention et/ou de traitement d'une infection à Flaviviridae chez une espèce sensible, comprenant l'administration d'une quantité
pharmaceutiquement efficace d'au moins un des éléments suivants :

- un polypeptide chimérique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 10;
un polynucléotide selon la revendication 11;
- un vecteur viral recombinant selon la revendication 13;
- un anticorps selon la revendication 17; et - un vecteur de clonage et/ou d'expression selon la revendication 18.
22. Méthode selon la revendication 21, comprenant en outre une étape d'immunisation de rappel comprenant l'administration additionnelle d'un polypeptide chimérique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 10 en présence d'un adjuvant.
23. Utilisation selon la revendication 16 ou la méthode selon la revendication 21, caractérisée en ce que le Flaviviridae est sélectionné dans le groupe constitué par le virus de la dengue, le virus de la fièvre jaune, le virus de l'encéphalite japonaise et le virus de la fièvre du Nil occidental.
CA002508266A 2005-06-20 2005-06-20 Polypeptides chimeriques et leurs applications therapeutiques contre une infection a flaviviridae Abandoned CA2508266A1 (fr)

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