CA2408870A1 - Materiau a base de polymeres biodegradables et son procede de preparation - Google Patents

Abstract

La présente invention a pour objet un matériau à structure chimique contrôlée composé d'au moins un polymère biodégradable et d'un polysaccharide à
squelette linéaire, ramifié ou réticulé, caractérisé en ce qu'il dérive de la fonctionnalisation contrôlée d'au moins une molécule dudit polymère biodégradable ou d'un de ses dérivés par greffage covalent directement au niveau de sa structure polymérique, d'au moins une molécule dudit polysaccharide. Elle vise également un vecteur de préférence sous forme de particules obtenu à partir de ce matériau ainsi que son utilisation à titre de vecteur biologique.

Description

MATERIAU A BASE DE POLYMERES BIODEGRADABLES ET SON PROCEDE DE
PREPARATION.
La présente invention concerne de nouveaux matériaux à base de polymères biodégradables et de polysaccharides, des vecteurs dérivant de ces matériaux de préférence sous forme de particules, et leurs utilisations à titre de vecteurs biologiques pour des matières actives.
La vectorisation est une opération visant à moduler et si possible à totalement maîtriser la distribution d'une substance, en l'associant à un système approprié appelé vecteur.
1o Dans le domaine de la vectorisation, trois fonctions principales sont â assurer - Transporter la ou les matières actives dans les liquides biologiques de l'organisme, - Acheminer les matières actives vers les organes à traiter, et - Assurer la libération de ces matières actives.
Bien entendu, le principe général de la vectorisation est également de rendre la distribution de la matière active aussi indépendante que possible des propriétés de la substance active elle-méme et de la soumettre à celle de vecteurs appropriés choisis en 2o fonction de l'objectif envisagé.
En fait, le devenir in vivo du vecteur est conditionné par sa taille, ses caractéristiques physico-chimiques et, en particulier, ses propriétés dé
surface qui déterminent les interactions avec les composants du milieu vivant.
Parmi les différents vecteurs déjà existants, on peut distinguer plusieurs catégories.
Les vecteurs de première génération sont des systèmes conçus pour libérer un principe actif au sein de la cible visée. II est nécessaire dans ce cas de faire appel à un mode d'administration particulier. Ces

2 vecteurs de taille relativement élevée (supérieure à quelques dizaines de microns) sont soit des systèmes pleins (microsphères), soit des systèmes creux (microcapsules), contenant une substance active, par exemple anticancéreuse, à l'état dissous ou dispersé dans le matériau constitutif de ces systèmes. Les matériaux utilisables sont de nature variable (cire, éthylcellulose, acide polylactique, copolymères des acides lactiques et ' glycolique) biodégradables ou non.
Les vecteurs de deuxième génération sont des vecteurs capables, sans mode d'administration particulier, de véhiculer un principe actif Zo jusqu'à la cible visée. Plus précisément, il s'agit de vecteurs dont la taille 'est inférieure au micromètre et dont la distribution dans l'organisme est totalement fonction de leurs uniques propriétés physico-chimiques.
A cette seconde catégorie, appartiennent notamment les vecteurs vésiculaires de type liposomes qui sont des vecteurs constitués par une OU plusieurs cavités internes contenant une phase aqueuse, les nanocapsules qui sont des vecteurs vésiculaires formés d'une cavité
huileuse erïtourée d'une paroi de nature polymérique, ainsi que les émulsions lipidiques. On distingue aussi les nanosphères qui sont constituées d'une matrice en polymère pouvant encapsuler des principes 2 o actifs. Couramment, on regroupe sous le terme « nanoparticules » les nanosphères ainsi que les nanocapsules. Les matières actives sont généralement incorporëes au niveau des nanoparticules soit au cours du processus de polymérisation des monomëres dont dérivent les nanoparticules, soit par adsorption à la surFace des nanoparticules déjà
2 s formées, soit pendant la fabrication des particules à partir des polymères préformés.
La présente invention concerne tout particulièrement le domaine des vecteurs du type nano- et micro-particules et leurs applications.

3 o Différents types de nano- et micro-particules sont déjà proposés dans la littérature. Conventionnellement, ils dérivent d'un matériau obtenu par polymérisation directe de monomères (par exemple cyanoacrylates), par réticulation, ou encore ils sont élaborés à partir de polymères préfiormés : polyacide lactique) (PLA), polyacide glycolique) (PGA), poly(s-caprolactone) (PCL), et leurs copolymères, comme par exemple le polyacide lactique-co-acide glycolique) (PLGA), etc...
Plus récemment, un nouveau type de particules a été obtenu à
partir d'un matériau dérivant de la polymérisation catalytique de monomères (comme par exemple lactide ou caprolactone), sur le squelette d'un polysaccharide.
1o Ce type de matériau présente toutefois l'inconvénient principal de ne pouvoir garantir une composition reproductible. En effet, toutes les fionctions hydroxyles présentes sur le squelette du polysaccharide considéré sont susceptibles d'amorcer la polymérisation des monomères.
il se forme ainsi sur le squelette un très grand nombre de chaînes de taille variable dérivant du monomère, qui « masquent » ce squelette. Ceci est un inconvénient majeur dans l'élaboration de vecteurs adaptés pour certaines applications (bioadhésion, « fiurtivité », ciblage,...) ou l'on recherche précisément à contrôler la nature du recouvrement des particules. En conséquence, par ce type de polymérisation, il est 2 o impossible d'obtenir une bonne reproductibilité de la synthèse, des échantillons homogènes, et de contrôler les degrés de polymérisation et de substitution, d'autant plus que la polymérisation se fait généralement en masse (en absence de solvant). En effet, lors de la synthèse du matériau, le polysaccharide est souvent utilisé sous la forme de particules dispersées dans le monomère fiondu et la polymérisation est généralement conduite en présence d'un catalyseur. En absence de catalyseur, les degrés de polymérisation sont très faibles.
Ont également été décrites dans le brevet US 6 007 845 des particules dérivant d'un matériau obtenu par couplage covalent sur un 3o matériau multifonctionnel de type acide citrique ou tartarique, d'une ou plusieurs molécules d'un polymère hydrophile comme le polyéthylène

4 glycol et d'une ou plusieurs molécules d'un polymère hydrophobe comme l'acide polylactique. Toutefois, la synthèse de ce matériau a pour inconvénient majeur de nécessiter l'utilisation d'un composé annexe jouant le rôle d'intercalaire entre les molécules des deux types de polymëres.
La présente invention a pour premier objet un nouveau matériau composite à structure contrôlée dérivant du couplage de chaînes de polymère biodégradable directement sur le squelette de polysaccharides.
Son second objet concerne un vecteur à base de ce matériau, de 2 o préférence sous forme de particules, et plus préférentiellement sous la 'forme de nanoparticules.
L'invention vise également dans un troisième objet, l'utilisation de ce vecteur, de préférence de particules, notamment à titre de véhicules biologiques.
Plus précisément, le premier aspect de l'invention concerne un matériau à structure chimique contrôlée composé d'au moins un polymère biodégradable et d'un polysaccharide à squelette linéaire, ramifié ou réticulé, caractérisé en ce qu'il dérive de la fonctionnalisation contrôlée d'au moins une molécule dudit polymère biodégradable ou d'un de ses 2 o dérivés par greffage covalent directement au niveau de sa structure polymérique, d'au moins une molécule dudit polysaccharide.
Par opposition aux matériaux précédemment évoqués, le matériau mis au point selon la présente invention a pour.premier avantage d'avoir une structure chimique contrôlée et donc d'étre à ce titre parfaitement reproductible. Sa composition chimique est clairement identifiée.
Ainsi, le matériau revendiqué est de préférence constitué d'au moins 90% en poids et plus préférentiellement en totalité d'un copolymère dérivant de la fonctionna(isation contrôlée d'au moins une molécule d'un 3 o polymère biodégradable ou d'un de ses dérivés par greffage covalent directement au niveau de sa structure polymérique d'au moins une molécule d'un polysaccharide à squelette linéaire, ramifié ou rétïçulé.
Selon un mode préféré de l'invention, le matériau revendiqué ne contient pas de molécule de départ, c'est-à-dire dudit polymère

5 biodégradable ou dudit polysaccharide.
En l'espèce, le matériau revendiqué est donc différent d'un mélange de nature polymérique dans lequel serait présent le copolymère attendu mais où demeureraient également, en des quantités très variables, les polyméres de départ. Un te! mélange de nature polymérïque 2o ne peut étre utilisé tel quel pour préparer des nano- ou micro- particules.
En l'occurrence, le matériau revendiqué possède une polydispersité inférieure ou égale à 2 et de préférence inférieure à 1,5.
Plus précisément, le matériau revendiqué est obtenu par couplage directement au niveau de la molécule du polysaccharide, d'une ou plusieurs molécules de polymère biodégradable, identiques ou différentes.
Cette liaison covalente entre les deux types de molécule peut être de natures diverses.
Elle peut ainsi dériver de la rëaction entre un groupement acide carboxylique avec soit une fonction amine pour former une liaison amide, 2o soit une fonction hydroxyle pour former une liaison ester.
Elle peut aussi rësulter de la réaction entre un groupement isocyanate avec un groupement alcool pour former une liaison de type uréthane.
Elle peut également dériver de la réaction d'une fonction thiol avec un groupement carboxylique pour conduire à une liaison de type thioester.
L'ensemble de ces réactions est bien connu de l'homme de l'art et leurs réalisations relèvent de ses compétences.
Selon une variante préférée de l'invention, la liaison covalente 3 o établie entre les deux molécules est de type ester ou amide.

6 Plus préférentiellement, elfe dérive de la réaction entre une fonction carboxylique, le cas échéant activée, présente sur le polymère biodégradable et une fonction hydroxyle ou amine présente sur le polysaccharide. Les fonctions activées préférées de l'acide sont l'ester de N-hydroxysuccinimide, le chlorure d'acide et l'imidazolide dérivé du carbonyl dümidazole. Cette fonction réactive, de préférence carboxylique, peut être soit naturellement présente sur le squelette du polymère biodégradable ou y avoir été introduite au préalable au niveau de son squelette, de manière à permettre son couplage ultérieur avec une o molécule de polysaccharide.
Cette activation d'une fonction présente sur l'une des molécules, de préfërence une fonction carboxylique sur le polymère biodégradable, est notamment avantageuse lorsque l'on veut empécher la manifestation d'une réaction secondaire parasite, comme par exemple une réaction 25 intramoléculaire. Ainsi, dans le cas particulier où le polysaccharide possède au niveau de sa molécule deux fonctions susceptibles de réagir l'une avec l'autre, par exemple une fonction hydroxyle et une fonction carboxylique, on active préalablement la fonction carboxylique présente sur le polymère biodégradable de manière à privilégier la cinétique de sa 2 o réaction de couplage avec la fonction hydroxyle du polysaccharide au détriment de celle d'une réaction intramoléculaire au niveau de la molécule du polysaccharide.
La reproductibilité et l'homogénéité du matériau correspondant sont ainsi assurées.
25 Le matériau selon l'invention a également pour avantage de posséder une biodégradabilité satisfaisante en raison de la nature des polymères qui le constituent.
Au sens de l'invention, on entend désigner sous l'appellation « biodégradable » tout polymère qui se dissous ou se dégrâde en une 3 o période acceptable pour l'application à laquelle il est destiné, habituellement en thérapie in vivo. Généralement, cette période doit être

7 inférieure à 5 ans et plus préférentiellement à une année lorsque l'on expose une solution physiologique correspondante avec un pH de 6 à 8 et à une température comprise entre 25°C et 37°C.
Les chaînes de polymères biodégradables selon l'invention sont ou dérivent de polymères biodégradables synthétiques ou naturels.
Classiquement, les polymères biodégradables synthétiques les plus employés sont les polyesters : PLA, PGA, PCL, et leurs copolymères, comme par exemple PLGA. En effet, leur biodégradabilité et biocompatibilité ont été largement éfiablies. D'autres polymères Zo synthétiques font également l'objet d'investigations. II s'agit des polyanhydrides, poly(alkylcyanoacrylates), polyorthoesters, polyphosphazènes, polyaminoacides, polyamidoamines, polyméthylidènemalonate, polysiloxane, polyesters comme le polyhydroxybutyrate ou le polyacide malique), ainsi que leurs s5 copolymères et dérivés. Des polymères biodégradables naturels (protéines comme l'albumine ou la gélatine, ou des polysaccharides comme l'alginate, le dextrane ou le chitosane) peuvent également convenir.
En l'espèce, les polymères synthétiques sont tout particulièrement 2o intéressants car leur bioérosion est observëe rapidement. Toutefois, ces polymères ne sont pas toujours adaptés à être couplés avec un ou plusieurs polysaccharides car ils ne possèdent quasiment pas de 'groupements réactifs, surtout dans le câs des polyesters biodégradables (PLA, PCL, ...), etlou parce que ces groupements réactifs n'existent qu'en 25 extrémité de chaîne. En conséquence, le couplage de ces polymères avec un polysaccharide implique une fonctionnalisation préalable de leurs chaînes avec des groupements réactifs tout en contrôlant la nature des groupements naturellement présents en extrémité de chaîne. Ce sont notamment les composés ainsi obtenus que l'on entend désigner dans le 3 o cadre de la présente invention par le terme de dérivés de polymères biodégradables.

8 C'est ainsi que le polymère biodégradable répond de préférence à
la formule générale I
(R~) polymère biodégradable (R2)m n dans laquelle - n et m représentent indépendamment l'un de l'autre, soit 0, soit 1, - R~ reprësente un groupement alkyle en C~-CZO, un polymère l o différent du polymère biodégradable [par exemple polyéthylène glycol) (PEG), ou un copolymère contenant des blocs de PEG ou des unités d'oxyde d'ëthylène, comme par exemple un polymère Pluronic~], une fonction réactive protégée prësente sur le polymère (ex. BOC-NH-), une fonction carboxylique activée ou non, ou une fonction hydroxyle, et - R~ représente une fonction hydroxyle ou une fonction carboxylique activée ou non.
Sont notamment préférés comme polymères biodégradables selon l'invention, les polyesters : polyacide lactique) (PLA), polyacide glycolique) (PGA), poly(s-caprolactone) (PCL), et leurs copolymères, 2 o comme par exemple le polyacide lactique-co-acide glycolique) (PLGA), les polymères synthétiques tels les polyanhydrides, poly(alkylcyanoacrylates), poiyorkhoesters, polyphosphazénes, polyamides (ex. polycaprolactame), polyaminoacides, polyamidoamines, polyméthylidène malonate, poly(alkylène d-tartrate), polycarbonates, polysiloxane, polyesters comme le polyhydroxybutyrate ou polyhydroxyvalérate, ou le polyacide malique), ainsi que les copolymères de ces matériaux et leurs dérivés.
II s'agit plus préférentiellement d'un polyester de poids moléculaire inférieur à 50 000 g/mole et notamment d' un 3 o polycaprolactone.

9 PCT/FRO1/01496 Outre un aspect avantageux en terme de biodégradabilité, le matériau selon l'invention est particulièrement intéressant en terme de propriétés de bioadhésion et de ciblage pour les particules qui en dérivent au niveau d'organes etlou de cellules. C'est en particulier à travers le choix du polysaccharide associé, et notamment sa composition et son organisation structurelle au niveau des particules, que ce second aspect est plus précisément atteint.
Le ou les polysaccharides mis en oeuvre selon l'invention sont des polysaccharides de structure linéaire, ramifiiée ou réticulée, modifiée ou 2 o non.
Sous cette définition, on entend exclure du domaine de l'invention, les polysaccharides possédant une structure cyclique à
l'image des cyclodextrines.
On entend par polysaccharide modifié tout polysaccharide ayant subi un changement au niveau de son squelette, comme par exemple l'introduction de fonctions réactives, le greffage d'entités chimiques (molécules, chaînons aliphatiques, chaînes de PEG, etc...). Bien sur, cette modification doit concerner peu des groupements hydroxyle ou amine présents sur le squelette, de manière à laisser la grande majorité
2o d'entre eux libres pour permettre ensuite le couplage des polymères biodégradables. Ainsi, il existe dans le commerce des polysaccharides modifiiés par greffage de la biotine, de composés fluorescents, etc...
D'autres polysaccharides greffés avec des chaînes hydrophiles (ex. PEG) ont été décrites dans la littërature.
Sous le terme réticulé, il est fait référence à des polymères formant un réseau tridimensionnel par opposition à des polymères linéaires simplifiés. Dans le réseau tridimensionnel, les chaînes sont connectées entre elles par des liaisons covalentes ou ioniques et les matériaux deviennent ainsi insolubles.
3o Les polysaccharides convenant tout particulièrement à l'invention sont ou dérivent de la D-glucose (cellulose, amidon, dextrane), D-galactose, D-mannose, D-fructose (galactosane, manane, fructosane).
La majorité de ces polysaccharides contiennent les éléments carbone, oxygène et hydrogène. Les polysaccharides conformes à l'invention peuvent contenir aussi du soufre etlou de l'azote. Ainsi, l'acide 5 hyaluronique (composé d'unités N-acëtyle glucosamine et acide glucuronique), le chitosane, la chitine, l'hëparine ou l'ovomucoïde contiennent de l'azote, tandis que la gélose, polysaccharide extrait d'algues marines, contient du soufre sous la forme de sulfate acide (>CH
O-S03H). L'acide chondroitin-sulfurique contient simultanément du soufre 1 o et de l' azote.
L'ensemble de ces polysaccharides peut être fonctionnalisé avec des polymères biodégradables selon l'invention, dans la mesure où ils possèdent naturellement des fonctions amine et/ou alcool libres.
Selon une variante préférée de l'invention, le polysaccharide possède un poids moléculaire supérieur ou égal à 6000 g/mole.
Dans le cas particulier du dextrane et de l'amitose (C6H,oO5)n, n varie entre 10 et 620 et de préfërence entre 33 et 220. Dans le cas de l'acide hyaluronique, la masse molaire varie entre 5 103 et 5 106 g/mole, de préférence entre 5 104 et 2 106 g/mole. Dans le cas du chitosane, la 2 o masse molaire varie entre 6 103 et 6 105 g/mole, de préférence entre 6 103 et 15 104 g/mole glmole.
A titre illustratif des polysaccharides convenant plus particulièrement à l' invention, on peut citer les polydextroses comme le dextrane, le chitosane, le pullulane, l'amidon, l'amitose, l'acide hyaluronique, l'héparine, l'amilopectine, la cellulose, la pectine, l'alginate, le curdlan, le fucane, le succinoglycane, la chitine, le xylane, la xanthane, l'arabinane, la carragheenane, l'acide polyguluronique, l'acide polymannuronique, et leurs dérivés (comme par exemple le sulfate de dextrane, les esters de familose, l'acétate de cellulose, etc).
3o Sont plus particulièrement préférés le dextrane, l'amitose, le chitosane et l'acide hyaluronique, et leurs dérivés.

Le matériau selon l'invention, sous forme de copolymëre, peut inclure le polymère biodégradable et le polysaccharide dans un rapport massique variant de 1 :20 à 20 :1 et de préférence de 2 :9 à 2 :1.
A titre illustratif des matériaux revendiqués, on peut plus particulièrement citer ceux composés d'un copolymère dextrane potycaprolactone, amitose-polycaprolactone, acide hyaluronique polycaprolactone ou chitosane-polycaprolactone.
Les copolymères constituant le matériau revendiqué peuvent se présenter sous la forme de copolymères di-blocs, posséder une structure Zo peigne ou encore une structure réticulée.
La nature préférée du squelette est un polysaccharide, et la nature préférée des greffons est un polymère biodégradable.
Des copolymères di-blocs ou peigne peuvent étre obtenus en jouant sur le rapport molaire polysaccharide : polymère biodégradable lors de la synthèse. Les copolymères à structure réticulée peuvent être obtenus à partir de polymères biodégradables comportant au moins deux fonctions réactives:
Le second aspect de la présente invention concerne un procédé
2 o de préparation du matériau revendiqué.
Plus précisément, ce procédé comprend la mise en prësence d'au moins une molécule d'un polymère biodëgradable ou un de ses dérivës portant au moins une fonction réactive F1 avec au moins une molécule d'un polysaccharide à squelette linéaire, ramifié ou réticulé et portant au moins une fonction réactive F2 capable de réagir avec la fonction F1, dans des conditions propices à la réaction entre les fonctions F1 et F2 pour établir une liaison covalente entre lesdites molécules et en ce que l'on récupère ledit matériau.
Dans le cas où le polymère biodégradable est le 3 o polycaprolactone, le procédé de préparation revendiqué ne requiert pas ia l'utilisation d'un catalyseur comme les procédés conventionnels. Cette spécificité du procédé revendiqué est donc particulièrement avantageuse en terme d'innocuité et biodégradabilité au niveau du matériau résultant.
Avantageusement, il s'agit d'une réaction quantitative, c'est-à-dire au moins une fonction F1 présente sur les molécules de polysaccharides réagit avec une fonction F2 présente sur une molécule de polymère biodégradable.
A ces fins, la réaction est réalisée dans des conditions telles qu'est prévenue la manifestation d'une quelconque réaction parasitaire, Zo notamment l'implication de l'une des fonctions F1 ou F2 dans une autre réaction que la réaction de couplage attendue. On entend ainsi éviter les réactions intramoléculaires évoquées précédemment.
Selon une variante préférée de l'invention, fa fonction réactive présente sur le polymère biodégradable est une fonction acide ou une ~5 fonction acide activée et la fonction réactive sur le polysaccharide est une fonction hydroxyle ôu amine. De préférence, le polysaccharide et le polymère biodégradable ou dérivé sont mis en présence dans un rapport massique variant de 1 :20 à 20 :1.
Dans le cas particulier ou la fonction réactive présente sur le 2 o polymère biodégradable est une fonction acide, la réaction de couplage peut être réalisée par activation par exemple avec la dicyclohexylcarbodümide (DCC) ou le carbonyldümidazole (DCI). Cette réaction d'estérification relève des compétences de l'homme de l'art.
Plus préférentiellement, les polysaccharides et polymères 25 biodégradables répondent aux définitions proposées précédemment. En particulier, ils peuvent dériver de molécules de polysaccharides ou polymères biodégradables, naturelles et qui ont été modifiées de manière à étre fonctionnalisées conformément à la présente invention.
3o Un troisième aspect de l'invention concerne des vecteurs constitués d'un matériau conforme à l'invention.

Ces vecteurs sont de préférence des particules possédant une taille comprise entre 50 nm et 500 ~m et de prëférence entre 80 nm et 100 gym.
En fait, selon le protocole de préparation retenu pour préparer les particules à partir du matériau revendiqué, on peut fixer la taille de celles ci.
Selon un mode préféré de l'invention, les particules ont une taille comprise entre 1 et 1000 nm et sont alors dénommées nanoparticules.
Les particules de taille variant de 1 à plusieurs milliers de microns font 1o référence à des microparticules.
Les nanoparticules ou microparticules revendiquées peuvent étre préparées selon des méthodes déjà décrites dans la littérature, comme par exemple la technique d'émulsion/évaporation du solvant [R. Gurny et al. « Development of biodegradable and injectable lafices for controlled release of potent drugs » Drug Dev. Ind. Pharm., vol 7, p. 1-25 1981 )] ; la technique de nanoprécipitation à l'aide d'un solvant miscible à l'eau (FR 2 608 988 et EP 274 691 ). II existe également des variantes de ces procédés. Par exemple, la technique dite de « double-émulsion », intéressante pour l'encapsulation de principes actifs hydrophiles, consiste 2o à dissoudre ceux-ci dans une phase aqueuse, à former une émulsion de type eaulhuile avec une phase organique contenant le polymère, puis à
former une émulsion de type eaulhuileleau à l'aide d'une nouvelle phase aqueuse contenanfi un agent tensioactif. Après évaporation du solvant organique, on récupère des nano-ou des micro-sphères.
2s Dans le cadre de la présente invention, il a également été mis au point par les inventeurs une nouvelle méthode particulièrement avantageuse qui comprend - l' introduction d' un matériau conforme à f' invention, en mélange le cas échéant avec un autre composé et/ou une matiére active, dans un liquide, de préférence l'eau, à une concentration inférieure ou égale à 50 mglml, - le chauffage de l'ensemble sous agitation jusqu'à une tempërature propice à ia fonte ou au ramollissement dudit matériau de manière à obtenir sa mise en dispersion sous forme de gouttelettes, - le refroidissement de l'ensemble de manière à figer la strucfiure ainsi obtenue, et - la récupération des partïcules.
20 ' II est à noter que ce procédé est plus particulièrement avantageux lorsque les polymères et copolymères constituant le matériau revendiqué
comprennent à titre de polymère biodégradable un dérivé de polycaprolactone, et plus préférentiellement un dérivé de polycaprolactone de poids moléculaïre inférieur à 5000 g/mole.
Le matëriau selon la présente invention a l'avantage majeur de posséder des propriétés tensioactives, de par sa nature amphiphile. Ces propriétés peuvent donc étre exploitées avantageusement lors de la préparation de particules, par exemple, de manière à éviter l'utilisation d'agents tensioactifs, systématiquement utilisés dans les procédés 2o susmentionnés. En effet, ces derniers ne sont pas toujours biocompatibles et sont difficiles à éliminer en fin de procédé.
Un autre avantage du matériau selon la présente invention est d'offrir la possibilité de moduler les propriétés qui interviennent dans le procédé de fabrication de particules à travers le choix 2s - .du rapport massique polymère biodégradable polysaccharide et/ou - des masses molaires des polymères biodégradables et des polysaccharides considérés.
II est ainsi possible d'obtenir des copolymères hydrosolubles ou 3 o insolubles dans l'eau, ayant des balances hydrophile-lipophile pouvant varier entre 2 et 18 (permettant donc de stabiliser des émulsions eaulhuile ou huileleau).
Par ailleurs, il est possible de tirer avantage, lors de la fabrication de particules, des propriétés particulières de certains polysaccharides 5 composant ledit matériau. Par exemple, il est connu que les alginates, les pectines ayant un degré d'estérification faible, et la gomme xanthane peuvent former des gels en présence d' ions Ca2+. On peut donc envisager de former des gels ou des particules à l'aide des matériaux polysaccharide-polymère biodégradable dans des conditions analogues.
1o Ces particules posséderont l'avantage, par rapport à celles ëlaborées uniquement à partir de polysaccharides, de comporter des chatnes hydrophobes dans leur matrice, permettant un contrôle de la dégradation et une meilleure encapsulation en principes actifs de nature hydrophobe ou comportant des domaines hydrophobes comme certaines protéines.
15 De méme, on peut envisager la formation de particules à partir de deux types de matériaux selon la présente invention, comme par exemple à partir de copolymëres alginate-polymère biodégradable et chitosane-polymère biodégradable.
A titre représentatif des particules selon f' invention, on peut plus 2o particulièrement citer celles consfiituées d'un matériau dérivant d'au moins une molécule de polyester üée par une liaison de type ester ou amide à
au moins une molécule de polysaccharide choisie parmi le dextrane, le chitosane, l'acide hyaluronique et l'amitose. De préférence, il s'agit de particules composées d'un matériau dérivant d'un bloc de polycaprolactone ou de polyacide lactique) lié par une liaison de type ester ou amide à au moins une molécule de polysaccharide choisie parmi le dextrane, le chitosane, l'acide hyaluronique et l'amitose.
En ce qui concerne les structures de particules pouvant être obtenues à partir du matériau selon l'invention et les procédés susmentionnés, elles peuvent être variables. On distingue ainsi - une structure de type coeur hydrophobe en polymère biodégradable (pouvant encapsuler des principes actifs)-couronne hydrophile en polysaccharide, obtenues soit à l'aide de l'un des procédés sus-mentionnés, soit par adsorption du matériau selon l'invention sur des particules préformées ;
- une structure des particules selon laquelle la matrice en polymère biodégradable contient des inclusions aqueuses qui peuvent être obtenues par un procédé de « double émulsion »
et adaptées à l'encapsulation des principes actifs hydrophiles.
1o Selon le mode opératoire choisi et la balance hydrophile-lipophile du matériau, le polysaccharide peut se disposer soit exclusivement au niveau des inclusions aqueuses, soit au niveau de ces inclusions et de la surface des particules. II peut également protéger les principes actifs encapsulés (protëines, 25 peptides, ...) vis-à-vis des interactions, souvent dénaturantes, avec le polymère biodégradable hydrophobe et le solvant organique ;
- une structure de type coeur hydrophile (polysaccharide) couronne hydrophobe (polymère biodégradable), lorsque les 2o particules sont élaborées à partir d'une émulsion huile dans huile (par exemple, huile silicone-acétone) ou eau dans huile dans huile ;
- une structure micellaire, obtenue grâce à l'autoassociation d'un matériau conforme à l'invention en phase aqueuse, et 25 - une structure dite gel formée par réticulation des polysaccharides avec des polymères biodégradables comportant au moins deux fonctions réactives.
Dans le cas de la présente invention, les particules se dégradent de préférence en une période s'étendant entre une heure et plusieurs 3 o semaines.

Les particules selon l'invention peuvent contenir une substance active qui peut être de nature hydrophile, hydrophobe ou amphiphile et biologiquement active.
Comme matières actives biologiques, on peut plus particulièrement citer les peptides, les protéines, les carbohydrates, les acides nucléiques, les lipides, les polysaccharides ou leurs mélanges. II
peut également s'agir de molëcules organiques ou inorganiques synthétiques qui, administrées in vivo à un animal ou à un patient, sont susceptibles d'induire un effet biologique et/ou manifester une activité
Zo thérapeutique. II peut ainsi s'agir d'antigènes, d'enzymes, d'hormones, de récepteurs, de peptides, de vitamines, de minéraux et/ou de stéroïdes.
A titre représentatif des médicaments susceptibles d'être incorporés dans ces particules, on peut citer les composés anti-inflammatoires, les anesthésiants, les agents chimiothérapeutiques, les z5 immunotoxines, les agents immunosuppresseurs, les stéroïdes, les antïbiotiques, (es antiviraux, les antifongiques, les antiparasitaires, les substances vaccinantes, les immunomodulateurs et les analgésiques.
De même, on peut envisager d'associer à ces matières actives des composés destinés à intervenir au niveau de leur profil de libération.
2 o Par exemple, on peut ajouter dans la composition des particules, des chaînes de PEG, ou de polyester (modifiés ou non), et obtenir ainsi des particules dites composites. Comme déjà évoqué précédemment, on peut également mélanger plusieurs types de matériaux selon la présente invention, pour obtenir des particules mixtes, dans le but d'intervenir au 2s niveau du profil de libération des matières encapsulées et d'obtenir des propriétés de surface des particules adaptées aux applications envisagées.
Enfin, on peut également incorporer dans les particules, des composés à finalité de diagnostic. II peut ainsi s'agir de substances 3 o détectables par rayons X, fluorescence, ultrasons, résonance magnétique nucléaire ou radioactivité. Les particules peuvent ainsi inclure des particules magnétiques, des matériaux radio-opaques (comme par exemple l'air ou le barium) ou des composés fluorescents. Par exemple, les composés fluorescents comme la rhodamine ou le rouge de Nile peuvent être englobés dans des particules à coaur hydrophobe.
Alternativement, des émetteurs gamma (par exemple Indium ou Technetium) peuvent y être incorporés. Des composés fluorescents hydrophiles peuvent également être encapsulés dans les particules, mais avec un rendement moindre comparativement aux composés hydrophobes, du fait de la moindre affinité avec la matrice.
o Des particules magnétiques commercialisées ayant des propriétés ~de surface contrôlées peuvent être également incorporées dans la matrice des particules ou attachées de manière covalente à l'un de leurs constituants. .
La matière active peut être incorporée dans ces particules lors de leur processus de formation ou au contraire être chargée au niveau des particules une fois que celles-ci sont obtenues.
Les particules conformes à l'invention peuvent comprendre jusqu'à 95% en poids d'une matière active.
La matiére active peut ainsi être présente en une quantité variant 2o de 0,001 à 990 mg/g de particule et préférentiellement de 0,1 à 500 mglg.
II est à noter que dans le cas de l'encapsulation de certains composés macromoléculaires (ADN, oligonucléotides, protéines, peptides, etc) des charges encore plus faibles peuvent être suffisantes.
Les particules selon l'invention peuvent être administrées de différentes façons, par exemple par voies orale, parentérale, oculaire, pulmonaire, nasale, vaginale, cutanée, buccale, etc... La voie orale, non invasive, est une voie de choix.
De manière générale, les particules administrées par voie orale peuvent subir différents processus : translocation (capture puis passage 3 o de l'ëpithélium digestif par les particules intactes), bioadhésion (immobilisation des particules à la surface de la muqueuse par un mécanisme d'adhésion) et transit. Pour ces deux premiers phénomènes, les propriétés de surFace jouent un rôle majeur.
Le fait que les particules selon l' invention possèdent en surface de nombreuses fonctions hydroxyles, s'avëre particulièrement avantageux pour y lier une molécule biologiquement active, une molécule à vocation de ciblage ou pouvant être dëtectée. On peut ainsi envisager de fonctionnaliser la surface de ces particules de manière à en modifier les propriëtés de surface et/ou les cibler plus spécifiquement vers certains tissus ou organes. Eventuellement, les particules ainsi fonctionnalisées 1o peuvent être maintenues au niveau de la cible par l'utilisation d'un champ magnétique, pendant l'imagerie médicale ou pendant qu'un composé actif est libéré. De même, des ligands de type molécules de ciblage comme des récepteurs, lectines, anticorps ou fragments de ceux-ci peuvent être fixés à la surface des particules. Ce type de fonctionnalisation relève des compétences de l'homme de l'art.
Le couplage de ces ligands ou molécules à la surface des particules peut être exécuté de différentes manières. II peut être réalisé de manière covalente en attachant le ligand au polysaccharide recouvrant les particules ou de façon non covalente c'est à dire par affinité. Ainsi, 2 o certaines lectines ont pu être attachées par affinité spécifique aux polysaccharides situés à la surface de particules selon la présente invention, en exaltant ainsi les propriétés de reconnaissance cellulaire de ces particules. II peut également être avantageux de greffer le ligand par l'intermédiaire d'un bras espaceur, pour lui permettre d'atteindre sa cible dans une conformation optimale. Alternativement, le ligand peut être porté
par un autre polymère entrant dans la composition des particules.
L'invention concerne également l'utilisation des vecteurs et de préférence des particules obtenues selon l'invention pour encapsuler une 3 0 ou plusieurs matières actives telles que définies précédemment.

Un autre aspect de l'invention concerne également les compositions pharmaceutiques ou de diagnostic comprenant des vecteurs et de préférence des particules selon l' invention, le cas échéant associées à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable et compatible.
5 Par exemple, les particules peuvent étre administrées dans des capsules gastro-résistantes, ou incorporées dans des gels, implants ou tablettes.
Elles peuvent aussi être préparées directement dans ûne huile (comme le Migliol~) et cette suspension administrée dans une capsule ou injectëe au niveau d'un site précis (par exemple tumeur).
1o Ces particules sont en particulier utiles à titre de vecteurs furtifs, c'est-à-dire capables d'échapper au système de défense immunitaire de l'organisme ei/ou comme vecteurs bioadhésifs.
Les exemples et figures figurant ci-après sont présentés à titre 15 illustratif et non limitatif de la présente invention.
Figures Figure 1 : Représentation à l'aide d'un microscope optique de 2 o particules R-PCL-COOH fabriquées selon l'exemple 13 (polymère synthétisé selon l'exemple 1 ).
Figure 2: Distribution de diamètres hydrodynamiques de particules R-PCL-COOH.

R-PCL-COOH
Des polymères PCL monofoncfiionnalisés de faible masse molaire (2 à 4000 g/mole) du type R-PCL-..CO~H (R= C9H,g) sont obtenus à partir de 5,2 g de monomère (s-caprolactone fraichement distillé) et 0,3 g 3 o d'acide caprique (C9H~9C02H) de haute pureté. L'acide et le E-caprolactone ont été introduits dans un ballon surmonté d'un réfrigérant az ascendant. Après une purge des réactifs, le ballon a été introduit dans un bain d'huile thermostaté à 225°C. La réaction s'est poursuivie pendant 3h30 sous atmosphère inerte (argon). Elle a été stoppée par immersion du ballon dans un bain de glace. Le solide obtenu à été dissout à chaud dans 15 ml THF, puis a été précipité à température ambiante avec du méthanol froid.
Après trois reprécipitations, le rendement en poids de la réaction est 60-70%. Les masses molaires moyennes en nombre (Mn) et en poids (Mw) ont été déterminées par chromatographie d'exclusion stérique (CES) 1o (éluant THF 1ml/min, calibration universelle réalisée avec des standards 'de polystyrène). Mn est égale à 3420 g/mole et Mw à 4890 g/mole ;
l'indice de polydispersité est donc égal à 1,4.
Une masse molaire moyenne en nombre égale à 3200 g/mole a été déterminée par titration avec une solution KOH/EtOH 10-2 M des échantillons de polymères d'environ 100 mg dissous dans un mélange acétone-eau.
D'autres polymères avec des R différents ont été obtenus par la méme méthode, par exemple à partir de l'acide caproïque (R=C6H,3).
EXEMPLE 2.
HOOC-PCL-COOH
Le polymère bifonctionnalisé HOOC-PCL-COOH a été synthétisé
d'après le mode opératoire de l'exemple 1.
L'acide succinique (99,9%, Aldrich) utilisé comme amorceur a été
2s séché sous vide à 110°C pendant 24h. Le monomère (a-caprolactone) a été purifié par distillation sur hydrure de calcium.
La polymérisation à partir de 0,2 g d'acide succinique et de 4 g de s-caprolactone a permis d'obtenir après 3h de réaction 3,2 g de polymère (rendement en poids 76% après quatre précipitations successives).

Le dosage des groupements COOH terminaux par KOHIEtOH

10-2 M a permis de déterminer une acidité correspondant à une masse molaire de 3500 g/mole.
Par CES, Mn est égale à 4060 g/mole et Mw à 4810 g/mole, s l'indice de polydispersité est de 1,2.
D'autres polymères de masse variable sont obtenus en changeant le rapport molaire acide : monomère.
EXEMPLE 3.
o R-PLA-COOH (R=C9H,9~
Le monomère (D,L-lactide) a été purifië par deux recristallisations dans l'acétate d'éthyle suivies de sublimation. Le catalyseur (octanoate d'étain) a été purifié par distillation sous vide très poussé. L'acide caprique utilisé comme amorceur a été purifié par recristallisation dans z5 ('acétate d'éthyle, puis anhydrisé par distillation azéotropique avec du benzène.
L'acide caprique (0,12 g) et le D,L-lactide (3,5 g) ont été introduits dans un bicot muni d'un refrigérant ascendant connecté à une rampe à
videlargon. Le ballon de réaction a été inerté, puis 7 ml de toluène 2 o anhydre ont été rajoutés à travers le septum. Après dissolution, 0,284 g de catalyseur ont été introduits et la réaction a été immédiatement démarrée par immersion du ballon dans un bain d'huile à 120°C. Après 4 heures, la réaction a été stoppée, le toluène a été évaporé, et le polymère appelé R-PLA-COOH a été dissout dans du dichlorométhane et précipité
25 avec de l'éthanol. Après quatre précipitations successives, il a été obtenu une acidité constante dans le polymère, qui a été ensuite séché.
La masse molaire Mw déterminée par CES est 22 Kg/mole. Le dosage des groupements terminaux par KOH/EtOH 102 M a permis de déterminer une acidité correspondant à une masse molaire de 21 3 o Kg/mole.

En variant le rapport molaire monomère/amorceur et le temps de réaction, il a été possible d'obtenir des polymères ayant des masses molaires comprises entre 10 et 50 Kg/mole.
EXEMPLE 4.
R-PCL-OH et R-PLA-OH (R= alk Des polymères PCL ou PLA monofonctionnalisés en bout de chaine par un groupement alcool (R-PCL-OH ou R-PLA-OH) ont été
synthétisés selon le protocole de l'exemple 3, mais en substituant à
1o l'amorceur acide, un amorceur alcool, par exemple C7H,50H.
5g de caprolactone et 0,29 g d'alcool heptilique ont été chauffés dans du toluène au reflux pendant 2h sous atmosphère inerte et en présence d'octanoate d'étain en quantité équimolaire avec l'amorceur.
Après deux précipitations, le rendement massique de la réaction est 54%.
La masse molaire Mw est de 2100 g/mole.
Le test avec KOH/EtOH n'a pas permis de détecter des traces d'acidité libre.
EXEMPLE 5.
2 o R-PEG-PLA-COOH (R=OMe) L'amorceur acide, le polyéthylène glycol) comportant à un bout de chaine un groupement méthoxy et à l'autre un groupement acide carboxylique (Me0-PEG-COOH) (Shearwater Polymers, 5000g/mole) a été séché préalablement à la réaction. Le lactide a été purifié par deux recristallisations (acétate d'éthyle) et par sublimation. Le rapport massique des réactifs Me0-PEG-COOH :lactide a été 1 :9 et le rapport molaire Me0-PEG-COOH :catalyseur a été 1 :1. La polymérisation s'est poursuivie pendant 2h sous atmosphère inerte au reflux du toluène (solvant). Après évaporation du toluëne, le copolymère est purifié par 3 o deux précipitations successives. La masse Mv~i déterminée par CES est de 42Kg/mole.

EXEMPLE 6.
R-PCL-ester de NHSI~R=alkylel La fonction acide des polymères R-PCL-COOH (exemple1 ) est transformée dans l'ester activé en la faisant réagir avec la N-hydroxy succinimide (NHSI), en présence de dicyclohéxyl carbodümide (DCC), dans un mélange DMF :CH2C12 1 :2 (v :v). La DCC a étë rajouté en léger excès molaire {1,1) par rapport aux chaînes de R-PCL-COOH et la NHSI
en excès par rapport aux fonctions -COOH. Les réactifs ont été solubilisés dans un volume minimal de solvant, avec un lëger chauffage. La réaction 1 o a lieu à 50°C pendant 24h sous atmosphère inerte. Après filtration de I'urëe formée (DCU), les solvants sont évaporés et le DMF est entraîné
avec de l'éther. Le polymère est lavé à l'eau et séché. D'après la masse de DCU pesée à chaque synthèse de ce type, le rendement de la réaction est quantitatif. L'ester ainsi obtenu est soluble dans THF, acétone, s5 solvants chlorés, etc...

PCL-DEX
Le polymère R-PCL-ester NHSI (R=C9H,9) possédant la fonction 2 o ester activée (exemple 6) est dissout dans du DMSO, puis une quantité
égale de dextran (Pharmacie, masse molaire 40 000 g/mole) est introduite. La réaction de couplage a lieu pendant 144 heures à 70°C
sous argon. La réaction de transestérification a lieu avec libération de NHSI. Après évaporation des solvants, le produit final est lavé à l'eau 25 pour enlever le NHSI et des copolymëres hydrosolubles, puis avec du dichlorométhane pour extraire des traces de polyester non réagi.
On obtient avec un rendement de 40% un copolymère Dex-PCL, de type peigne, comportant un squelette de dextrane (Dex) (masse molaire 40000 g/mole) et des chaînons latéraux de PCL liés par des ponts 3 o ester. Le copolymère est purifié en fin de réaction. Sa composition globale est déterminée par microanalyse élémentaire et par RMN. Le copolymère contient 33% en poids de PCL.
Le même protocole a été utilisé pour un dextrane de masse molaire plus faible, 6000g/mole (Fluka).

Dex-PCL
3g de R-PCL-COOH (exemple 1 ) sont anhydrisés par distillation azéotropique, puis séchés sous vide à 40-50°C, pendant une nuit, Zo directement dans le ballon'de réaction de 50 ml surmonté d'un réfrigérant ascendant et connecté à une rampe vide/argon. On rajoute ensuite dans le ballon 5 ml de THF sec. Après dissolution de l'acide, on rajoute dans le ballon 0,243 g de carbonyle dümidazole (CDI) qui se dissout rapidement.
Le mélange inerte est porté au reflux du THF. On observe un dégagement 15 de C02. Après 3 heures, le THF est évaporé.
1,29 g de dextrane (Fluka, masse molaire 6000 glmole) préalablement anhydrisé sont dissous à chaud dans 7 ml de DMSO
anhydre, puis rajoutés dans le ballon de réaction contenant l'intermédiaire imidazolide de l'acide R-PCL-COOH. On chauffie le mélange de réaction à
2 0 130°C pendant 3 heures. La solution devient brunâtre. On évapore le DMSO puis on dissout le produit de rëaction dans du chloroforme et on l'introduit dans une ampoule à décanter. On l'extrait avec de l'eau distillée. La phase aqueuse se présente comme une émulsion abondante stable. Après ëvaporation du solvant, on ne retrouve pratiquement pas de 25 résidu dans la phase organique. On évapore la phase aqueuse et on obtient ainsi un précipité qu'on sépare. On lave le polymère ainsi obtenu avec de l'éther puis on le sèche. La masse molaire déterminée par CES
(tableau 1 ) est de 11000 g/mole. Cette méthode avec rendement élevé (>
80 %), rapide et sélective, est préférée par la suite.
3 o En variant le rapport massique dextrane : R-PCL-COOH dans la synthèse du Dex-PCL, il est possible d'obtenir par cette méthode une série de copolymères Dex-PCL contenant des taux massiques de Dex variables. Ces copolymères ont été caractérisés par chromatographie de perméation sur gel (détecteurs réfractomètre et viscosimètre, à 70°C), à
l'aide d'une colonne ViscoGel (GMHHR-H, Viscotek, GB), étalonnée avec des standards de Pullulane. Les copolymères Dex-PCL ont été dissous dans du diméthyle acétamide (DMAC) à des concentrations de 5 mg/ml.
Les volumes injectés ont été 100 ~,I. L'éluant a été DMAC contenant 0,4%
LiBr, à un débit de 0,5 ml/min. Les masses molaires ont été déterminées par la méthode de la calibration universelle. Quelques exemples figurent 2o dans le tableau 1.
Dex-PCL Dex-PCL Dex-PCL
CopolymreDextrane7 chanons PCL 5 chanons PCL 3 chanons PCL
par par par chane de Dextranechane de Dexranechane de Dextrane Mw 4985 19060 16000 10870 pd 1,06 1,41 1,37 1,10 (dl/g) 0,087 0,098 0,12 0,12 IV n I2gw (nm)2,47 3,92 4,07 3,57 Di~/dc 0,147 0,052 0,084 0,088 (ml/g) Le Dex-PCL7 dérive de la mise en présence de dextrane à raison de 5% et de PCL à raison de 95%.
Le Dex-PCLS dérive de la mise en présence de dextrane à raison de 20% et de PCL à raison de 80%.
Le Dex-PCL3 dérive de la mise en présence de dextrane à raison de 33% et de PCL à raison de 67%.
2 o Tableau 1. Caractéristiques du dextrane de départ et de trois copolymères Dex-PCL comportant respectivement 7, 5 ou 3 chaînons de PCL greffés au niveau du squelette de dextrane, synthétisés en utilisant dans le mélange réactionnel 5, 20 ou 33 % en poids de dextrane (par rapport au poids total de RPCL-COOH et de dextrane) Mw : masse molaire moyenne en poids Mn : masse molaire moyenne en nombre Pd : polydispersité (=Mw/Mn) Ivw : viscosité intrinséque moyenne en poids Rgw : rayon de giration moyen en poids dn/dc : variation de l'indice de réfiraction spécifique avec la concentration.
1o Les trois copolymères présentent une faible polydispersité et des masses molaires moyennes en poids comprises entre 11000 et 19000 glmole.

15 amitose-PCL
0,2g amitose (Fluka, extraite de pommes de terre) sont dissous dans 8m1 DMSO. II résulte une solution trouble, à laquelle on rajoute 0,2 g de R-PCL-ester de NHSI (exemple 6) dissout dans 3 ml DMSO. Ce mélange est incubé à 70°C pendant 144h. Après évaporation des 2 o solvants, le solide est repris avec 200 ml eau et 200 ml chloroforme dans une ampoule à décanter. La phase intermédiaire contenant le polymère amphiphile est récupérée et extraite encore une fois, puis séchée. Ce traitement est une variante de la méthode de purifiication de l'exemple 7.
Le rendement en poids après la deuxième extraction est de 38%
2 5 (pds).
Les résultats de la microanalyse permettent de déterminer la composition globale du copolymère amphiphile obtenu, qui contient 32%
en poids de PCL.

EXEMPLE 10.
Chitosane-PCL
Le copolymère chitosane-polycaprolactone est obtenu selon le protocole de l'exemple 9. La synthèse a été effectuée à partir du s chitosane brut (Fluka, 150000 glmole) et le rendement d'obtention du copolymère a été 22% en~poids. D'après la microanalyse élémentaire, le copolymère contient 67% en poids de PCL. II est de type peigne, avec un squelette de chitosane et des chainons latéraux de PCL liés majoritairement par des liaisons amides.

HA-PCL
L'acide hyaluronique (Accros, masse molaire supérieure à 106 g/mole) sous la forme de carboxylate de sodium est dissous dans l'eau MiIIiQ, et converti sous la forme acide libre à l'aide d'une résine superéchangeuse de cation, et lyophilisé. Le produit ainsi obtenu est assez soluble dans le DMSO et permet de réaliser le couplage avec l'ester NHSI du R-PCL-COOH, d'après le protocole des exemples 7 et 9.
Le copolymère de type peigne acide hyaluronique-PCL est 2 o récupéré dans la phase aqueuse. II n'y a pas de phase intermédiaire.
' D'après la microanalyse, ce copolymère contient 18% en poids de PCL.

Nanoparticules R-PCL-COOH
Une masse bien définie de R-PCL-COOH synthétisé selon l'exemple 1 esfi dissoute dans l'acétone pour obtenir une concentration de 20mg/ml. Un volume d'eau égal au double du volume d'acétone est versé
goutte-à-goutte. Spontanément, le polymère forme des nanosphères d'un diamètre moyen de 210 nm (mesuré après l'évaporation du solvant), en 3 o absence d'agent tensioactif.

Nano~arkicules Dex-PCL
Une masse bien définie de copolymère Dex-PCL synthétisé selon l'exemple 7 est introduite dans le dichlorométhane pour obtenir une concentration de 10 mg/ml. Le polymère est dispersé et gonflé par le solvant, mais il ne se dissout pas. Un volume d'eau deux à vingt fois supérieur au volume de dichlorométhane est rajouté. Une émulsion grossière est d'abord formée, puis affinée grâce aux ultrasons. Le copolymère amphiphile stabilise !'émulsion, en évitant ainsi la nécessité
Zo de rajouter des agents tensioactifs. Aprës évaporation du solvant organique, on obtient des nanoparticules.
Le diamètre moyen des particules est déterminé par diffusion de la lumière (PCS). La taille des particules, généralement inférieure à 300 nm par ce procédë, dépend de la concentration, du rapport des volumes des deux phases aqueuse et organique, du temps et de la puissance de sonication.
EXEMPLE 14.
22 mg R-PCL-COOH (exemple 1 ) sont introduits dans 10 ml eau 2 o MiIIiQ et chauffés à 80°C sous agitation magnétique. Suite à la fusion du polymère à cette température, des particules sphériques ont été formées (Fig. 1 ). Le refroidissement du récipient a permis ensuite de figer les structures ainsi formées. Les particules ont pu étre récupérées ensuite par sédimentation.
II a été observé que le rajout de l'éthanol en faible quantité
permettait d'améliorer la fabrication en évitant la formation de films à la surface de l'eau.

EXEMPLE 15.
Des particules ont été formées selon le protocole de l'exempte 14, sauf qu'à la place de l'eau, une solution tampon acétate pH4,8 saturée en chitosane a été utilisé. Des particules sphériques ont été ainsi obtenues.

EXEMPLE 16.
22 mg R-PCL-COOH (exemple 1 ) sont introduits dans 10 ml eau MiIIiQ et chauffës à 80°C. Une sonde à ultrasons a été plongée ensuite dans le rëcipient et des ultrasons ont été appliqués (20W, 20sec). Ceci a Zo permis d'obtenir des microsphères d'un diamètre hydrodynamique moyen de 1,1 ~,m (déterminé par PCS) et ayant une faible polydispersité (fig. 2).
If a été noté que l'utilisation d'un ultraturax pouvait remplacer la sonication pour la formation des nanoparticules.
II a été observé que le copolymère Dex-PCL (exemple 7) et le 15 copolymère chitosane-PCL (exemple 9) formaient également des particules par ce procédé.
II a été noté qu'il était également possible de former des particules par ce procédé en remplaçant l'eau par une huile (par exemple Migliol~) ou par un polymère (comme le PEG de masse molaire 200 glmole). Ces 2 o essais ont été réalisés avec 25 mg de polymëre dans 5 ml de liquide.
EXEMPLE 17.
bioadhésion L'interaction des particules selon l'invention avec des cellules 25 Caco2 en culture, utilisées comme modèle d'interaction pour les particules destinées pour la voie orale a été étudiée. Le PLA tritié a été encapsulé
comme marqueur radioactif dans des nanoparticules Dex-PCL (exemple 7) pour permettre de déterminer avec précision la localisation des particules (à l'intérieur ou à la surface des cellules ou dans le milieu de 3 o culture). Ce marquage s'est révélé parfaitement stable dans le milieu de culture, autorisant donc ces études. Des cellules Caco2 ont été cultivées dans des plaques à 24 puits, avec changement du milieu (1,5 mllpuits DMEM 4,5 g/1 glucose, 15% sérum de veeu foetal) tous les 1 ou 2 jours jusqu'à confluence. Après environ 4 jours, lorsque les cellules sont arrivées à confluence, le milieu est retiré, on rajoute 1,5 ml de milieu Hank's, on attend 2h puis on rajoute les suspensions de nanosphères contenant des quantifiés bien définies de particules (dans un volume total de 100 ~,I). L'activité par puits dans le milieu de culture a été fixée à 0,1 p,Ci. Après trois heures d'incubation à 37°C dans un incubateur à C02, le surnageant a été retiré, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS, 1o puis lysées pendant 1 h avec 1 ml de NaOH 0,1 M. La radioactivité a ëté
.comptée dans le surnageant, les eaux de lavage et le lysat cellulaire.
Ainsi, il a été possible de déterminer avec prëcision la quantité de nanoparticules effectivement associée aux cellules.
La quantité des nanoparticules Dex-PCL associée aux cellules Caco2 est double par rapport à celles en polyester (PLA, Phusis, Mw 40000 g/mole) fabriquées par la technique de la nanoprécipitation (exemple 10) en présence de Pluronic~. Ainsi, 2,5% et 1,1%
respectivement des nanoparticules sont associées aux cellules.
2 o EXEMPLE 18 couplage de lectines par affinité. ciblaae Une suspension de nanoparticules radiomarquées, fabriquées à
partir de Dex-PCL (exemple 7), est mise en contact avec une solution de lectine de pois (Lens culinaris) en excès par rapport aux particules, de 2 s manière à saturer la surface de celles-ci en lectine adsorbée par affinité.
L'interaction des nanoparticules ainsi recouvertes de lectine avec des cellules Caco2 en culture est étudiée selon le protocole précédent (exemple 16).
La quantité des nanoparticules associée aux cellules Caco2 est 3 o significativement augmentée par rapport à celles non recouvertes de lectine. Ainsi, 3,5% des nanoparticules introduites en chaque puits sont associées aux cellules, par rapport à 2,5% en absence de lectine.

Furtivité
La capacité de nanoparticules recouvertes de dextrane (fabriquées à partir de Dex-PCL, exemple 7) à éviter la capture par des cellules phagocytes (J774) a étë comparée à celles de même taille (environ 200 nm) et recouvertes de PEG 5000 g/mole (fabriquées à partir zo de PEG-PLA synthétisé selon l'exemple 4, à partir de Me=O-PEG-OH
5000 glmole et de lactide, avec une masse molaire du bloc de PLA de 50000 glmole). Les cellules J774 ont été cultivées dans des plaques à 24 puits, dans un milieu DMEM contenant 4,5 gll glucose et 10% sérum de voeu foetal. Préalablement aux expériences, le surnageant des cellules a 1s été renouvelë et on a attendu 4h avant de rajouter fes suspensions de nanoparticules radiomarquées dans les puits. La capture des nanoparticules Dex-PCL et des nanoparticules de référence de même taille recouvertes par du PEG a été pratiquement la même (1 à 2%), malgré ia capacité bien connue de ce type de ceilufes à phagocyter des 2 o nanoparticules. Ceci est une indication concernant le caractère « furtif »
des nanoparticules recouvertes de dextrane, similaire à celui des particules recouvertes de PEG, bien connues dans la littérature.

Claims (42)

REVENDICATIONS

1. Matériau à structure chimique contrôlée composé d'au moins un polymère biodégradable et d'un polysaccharide à squelette linéaire, ramifié ou réticulé, caractérisé en ce qu'il dérive de la fonctionnalisation contrôlée d'au moins une molécule dudit polymère biodégradable ou d'un de ses dérivés par greffage covalent directement au niveau de sa structure polymérique, d'au moins une molécule dudit polysaccharide.

2. Matériau selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué d'au moins 90% en poids d'un copolymère dérivant de la fonctionnalisation contrôlée d'au moins une molécule d'un polymère biodégradable ou d'un de ses dérivés par greffage covalent directement au niveau de sa structure polymérique d'au moins une molécule d'un polysaccharide à squelette linéaire, ramifié ou réticulé.

3. Matériau selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il est dépourvu en produit de départ.

4. Matériau selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il possède une polydispersité inférieure ou égale à 2.

5. Matériau selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la liaison covalente établie entre la molécule de polymère biodégradable et la molécule de polysaccharide est de nature ester ou amide.

6. Matériau selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la liaison covalente dérive de la réaction entre une fonction hydroxyle ou une fonction amine présente sur la molécule du polysaccharide et une fonction carboxylique, activée ou non, présente sur la molécule du polymère biodégradable.

7. Matériau selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le polymère biodégradable répond à la formule dans laquelle:
- n et m représentent indépendamment l'un de l'autre, soit 0, soit 1, - R1 représente un groupement alkyle en C1-C20, un polymère différent du polymère biodégradable, une fonction réactive protégée présente sur le polymère, une fonction carboxylique, activée ou non, ou une fonction hydroxyle, et - R2 représente une fonction hydroxyle ou une fonction carboxylique activée ou non.

8. Matériau selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le polymère biodégradable est ou dérive d'un poly(acide lactique) (PLA), poly(acide glycolique) (PGA), poly(.epsilon.-caprolactone) (PCL), les polymères synthétiques tels les polyanhydrides, poly(alkylcyanoacrylates), polyorthoesters, polyphosphazènes, polyamides, polyaminoacides, polyamidoamines, polyméthylidène malonate, poly(alkylène d-tartrate), polycarbonates, polysiloxane, polyesters comme le polyhydroxybutyrate ou polyhydroxyvalératé, ou le poly(acide malique), ainsi que leurs copolymères et dérivés.

9. Matériau selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le polymère biodégradable est un polyester de poids moléculaire inférieur à 50.000 g/mole.

10. Matériau selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le polymère biodégradable est un polycaprolactone.

11. Matériau selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le polysaccharide possède un poids moléculaire supérieur ou égal à 6000 g/mole.

12. Matériau selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le polysaccharide est choisi parmi le dextrane, le chitosane, le pullulane, l'amidon, l'amitose, l'acide hyaluronique, fhéparine, l'amilopectine, la cellulose, la pectine, l'alginate, le curdlan, le fucane, le succinoglycane, la chitine, le xylane, la xanthane, l'arabinane, la carragheenane, l'acide polyguluronique, l'acide polymannuronique, et leurs dérivés.

13. Matériau selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il associe ou non un polymère biodégradable et un polysaccharide dans un rapport massique variant de 1:20 à 20:1 et de préférence de 2:9 à 2:1.

14. Matériau selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'un copolymère di-bloc.

15. Matériau selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il possède une structure peigne ou une structure réticulée.

16. Matériau selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un copolymère possédant un squelette polysaccharide et des greffons polymères biodégradables.

17. Matériau selon l'une des revendications précédentes, caractérises en ce qu'il dérive d'un copolymère choisi parmi dextrane-polycaprolactone, amitose-polycaprolactone, acide hyaluronique-polycaprolactone, et chitosane-polycaprolactone.

18. Procédé de préparation d'un matériau selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on met en présence au moins une molécule d'un polymère biodégradable ou un de ses dérivés portant au moins une fonction réactive F1 avec au moins une molécule d'un polysaccharide à squelette linéaire, ramifié ou réticulé et portant au moins une fonction réactive F2 capable de réagir avec la fonction F1, dans des conditions propices à la réaction entre les fonctions F1 et F2 pour établir une liaison covalente entre lesdites molécules et en ce que l'on récupère ledit matériau.

19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que le polymère biodégradable est tel que défini en revendications 7 à 10 et le polysaccharide selon la revendication 11 ou 12.

20. Procédé selon la revendication 18 ou 19, caractérisé en ce que la fonction réactive du polymère biodégradable est une fonction acide activée et celle du polysaccharide une fonction hydroxyle ou amine.

21. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que te polysaccharide et le polymère biodégradable ou dérivé sont mis en présence dans un rapport massique variant de 1:20 à
20:1.

22. Vecteur obtenu à partir d'un matériau selon l'une des revendications 1 à 17.

23. Vecteur selon la revendication 22, caractérisée en ce qu'il s'agit de particules.

24. Vecteur selon la revendication 22 ou 23, caractérisée en ce qu'il s'agit de microparticules ou nanoparticules.

25. Vecteur selon l'une des revendications 22 à 24, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une substance active.

26. Vecteur selon la revendication 25, caractérisé en ce que la substance active est choisie parmi les peptides, protéines, carbohydrates, acides nucléiques, lipides ou des molécules organiques ou inorganiques susceptibles d'induire un effet biologique etlou à activité
thérapeutique.

27. Vecteur selon l'une des revendications 22 à 26, caractérisé en ce qu'il comprend jusqu'à 95% en poids d'une matière active.

28. Vecteur selon l'une des revendications 22 à 27, caractérisée en ce qu'il s'agit de particules comprenant en outre au moins une molécule liée de manière covalente à sa surface.

29. Vecteur selon l'une des revendications 22 à 27, caractérisée en ce qu'il s'agit de particules comprenant en outre au moins une molécule liée de manière non covalente à sa surface.

30. Vecteur selon la revendication 28 ou 29, caractérisée en ce que cette molécule est une molécule biologiquement active, une molécule à vocation de ciblage ou pouvant être détectée.

31. Vecteur selon la revendication 30, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une molécule de ciblage choisie parmi les anticorps et fragments d'anticorps et lectines.

32. Vecteur selon l'une des revendications 22 à 31, caractérisé en ce qu'il s'agit de particules constituées d'un matériau dérivant d'au moins une molécule de polyester liée par une liaison de type ester ou amide à au moins une molécule de polysaccharide choisie parmi le dextrane, le chitosane, l'acide hyaluronique et l'amitose.

33. Vecteur selon l'une des revendications 22 à 31, caractérisé en ce qu'il s'agit de particules constituées d'un matériau dérivant d'un bloc de polycaprolactone ou de poly(acide lactique) lié par une liaison de type ester ou amide à au moins une molécule de polysaccharide choisie parmi le dextrane, le chitosane, l'acide hyaluronique et l'amitose.

34. Procédé de préparation d'un vecteur sous forme de particules selon l'une des revendications 22 à 33, caractérisé en ce qu'il comprend au moins:

- l'introduction d'un matériau selon l'une des revendications 1 à 17, le cas échéant avec un autre composé et/ou une matière active, dans un liquide, de préférence l'eau, à une concentration inférieure ou égale à 50 mg/ml, - le chauffage de l'ensemble sous agitation jusqu'à une température propice à la fonte ou au ramollissement dudit matériau de manière à obtenir sa mise en dispersion sous forme de gouttelettes, - le refroidissement de l'ensemble de manière à figer la structure ainsi obtenue, et - la récupération desdites particules.

35. Procédé selon la revendication 34, caractérisé en ce que le matériau est un copolymère de poly(.epsilon.-caprolactone) de poids moléculaire inférieur à 5000 g/mole.

36. Procédé selon la revendication 34 ou 35, caractérisé en ce qu'il est réalisé en présence également de la matière active à
encapsuler.

37. Utilisation d'un vecteur selon l'une des revendications 17 à 33 pour encapsuler au moins une matière active.

38. Utilisation selon la revendication 37, caractérisée en ce que les matières actives sont choisies parmi les peptides, protéines, carbohydrates, acides nucléiques, lipides, ou des molécules organiques ou inorganiques susceptibles d'induire un effet biologique et/ou à activité
thérapeutique.

39. Composition pharmaceutique ou de diagnostic caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de matière active un vecteur selon l'une des revendications 17 à 33.

40. Composition de diagnostic caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de matière active un vecteur selon l'une des revendications 17 à 33.

41. Utilisation d'un vecteur selon l'une des revendications 17 à 33, à titre de vecteurs «furtifs».

42. Utilisation d'un vecteur selon l'une des revendications 17 à 33 à titre de vecteurs bioadhésifs.