CA2185103A1 - Usage combine de deux cassettes d'expression pour la production d'une proteine d'interet - Google Patents

Abstract

La présente invention a pour objet l'usage combiné de deux cassettes d'expression, l'une permettant l'expression d'un fragment d'ADN d'intérêt placé sons le contrôle d'une région promotrice régulable par la thiamine et l'autre permettant l'expression d'un gène activateur, ainsi que les cellules hôtes dans lesquelles on met en oeuvre un tel usage. La présente invention concerne également une cassette d'expression dans laquelle le fragment d'ADN d'intérêt est sons le contrôle d'une région promotrice issue du gène pho4 de Schizosaccharomyces pombe et les vecteurs et cellules comprenant une telle cassette d'expression. Enfin, l'invention comprend un nouveau procédé de production d'une protéine d'intérêt.

Description

~o 95124491 ~ 1 8 J I ~ ~ r ~ I /rh~

0 USAGE COI~BINE DE DEUX CASSETTES D'EXPRESSION POUR LA
PRODUCTION D'UNE PROTEINE D'INTERET.
La présente invention se rapporte au domaine des i; .~ , notamment a 15 un p_.~L - apporté à la production d'une protéine }~0t~,~vlGb.._ d'intérêt commercial ou li..'.AI...II;~I... dans une cellule eucaryote et, en particulier, une levure du genre ,S~ . Elle concerne, en premier lieu, I'usase d'un gène codant pour un produit capable d'activer une reeion promotrice régulable par la thiamine, cette derniàe gouvernant 20 I~A~IC~;V~ de la protéine d'interêt et, en second lieu, une cassette d'~ ca:~;v~
dans laquelle le fragment d'ADN codant pour la proteine d'interêt est placé sousle contrôle d'une région promotrice isolee ou derivee du gène phoJ de 5 ~ .c~ pombe.
25 Depuis quelques annees déjà, de ~v~v~ cassettes d~LA~ pour la production de protéines d'interêt dans les cellules eucaryotes ont été décrites dans la littérature. Ces cassettes l,v...~..~.l.._,.~ notamment une region promotrice r '' ~ dans la cellule considérée. D'une manière génerale, une région promotrice est située dans la région 5' flanquante des gènes et comprend 30 I'ensemble des elements permettant la ~ .n d'un fragment d'ADN placé
sous leur .~ ~. 1--...~ Une région promotrice peut également être constituée par W095124491 '~:~8a I03 ~ r~ s ~1

- 2 --~ aa~ bL:g~ d'élemen~s de diverses origines, r~, I;" ,rl5 dans la cellule hote, comme notamment:
.

- une region promotrice minimale comprenant la TATA box et le site e d'initiation de la llcl.a~ iu.l. Si elle semble necessaire à une initiation correcte de la l~ Liùll, elle ne peut, à elle seule, assurer une CI;~L;-~n efficace; et - des régions situées en amont de la TATA box qui permettent d'assur~r lû un niveau efficace de i , soit de manière constitutive (niveau de L~ S.,.i~-iiL~I- constant tout au lonOg du cycle cellulaire, quelles que soient les conditions de culture) soit de manière régulable (dites regions de regulation permettant une activation de la Ll~ t,.,., en présence d'un activateur et/ou repression de la ~ ,tiu.. en présence d'un répresseur), suivant le gène dont elles sont issues.
Lorsqu'on cherche a obtenir de grande quantite d'une protéine d'intérêt, on utilise O ' une région promotrice forte et constitutive pour contrôler l'expression du fragment d'ADN codant pour la protéine d'intérêt, par exemple 20 les régions 5' flanquantes des ~ènes PGK (3-j' ,' ol~ , kinase) de SU~IUI~ y~C~ cer~isiae (Hitzeman et al., 1983, Science, 219, 620-625) et adh (alcool d8 h,l..o ) de S~ ' ' , ,.,c., pombe (Russel et Hall, 1983, J. Biol. Chem., 258, 143-149).
25 Cependant, I'utilisation d'une région promotrice forte et ~,Lma~ n'est pas adaptée à la produc~:ion de protéines d'interêt présentant une certaine toxicité vis à vis de la cellule hôte . En effet, la production de proteines toxiques affecte la croissance des cellules et risque d'entrâîner la selection de mutations spontanées conduisant à une perte ou une reduction notable du taux de production. Dans les 30 cas extrêmes, la viabilité des cellules peut être affectée.

~095/24491 21~103 r~l/r~

Pour ces raisons, il peut être avantageux de disposer de régions IJlUlllU~
régulables permettant de faire varier la production de la protéine d'interet en fonction des conditions de culture ou de la phase de croissance cellulaire D'unemanière genérale, de telles regions ~ vL~;...,~ sont isolees ou dérivent de 5 gènes régulables.
Au cours de ces dernières années, un certain nombre de gènes régulables ont été
mis en evidence dans de nombreux eucaryotes et notamment dans S~ h: .,~," ,1, )~cc~ pombe. Des 1 f - - ~ très vaié~ gouvernent la 10 régulation de ces gènes. A titre d'exemples de gènes régulables de S ~ c~ pombe, on peut citer les gènes de "heat shock" dont l'expression augmente avec la ~.,.lI~J.,~dlUI~ (Gallo et al., 1991, Mol. Cell. Biol., 1/, 281-288) et le gène codant pour l'enzyme fructose ', ' , ' (fbp) pour lequel la ll~ n est réprimée en presence de glucose et induite en condition de carence en glucose (Hoffman et Winston, 1989, Gene, 8J, 473-479). Entrent également dans cette catégorie ies gènes régulables par la thiamine, à savoir les gènesphoS (Yang et S~.l... _ ul,~,., 1990, Curr. Genet., 18, 269-272), ~1n111 (Maundrdl, 1990, J. Biol. Chem., 265, 10857-1Og64) et thi2 (Zurlinden and S.,~.... _ ui,~,., 1992, Gene, 117, 141-143) dont l'expression est 20 régulée au niveau ~ Jt;UIII.~I par la thiamine, plus ~ réprimée en présence de thiamine et induite ou déréprimée en son absence.
On a maintenant caracterisé les regions de régulation de la région promotrice dugène pho~ impliquées dans la réponse à la thiamine et genéré des cassettes 25 i'~A~ ;UI~ régulables pour la production de proteines d'intérêt dans .S ~ c~. Les levures hébergeant une telle cassette ~ AI~II~.. O..
sont cultivées dans un milieu ,, ' en thiamine lorsque la culture vise à leur ~,. U~ ;UII. Dès lors qu'une culture est entreprise en vue de produire une protéine d'intérêt, les levures sont transférées dans un milieu 30 dépourvu de thiamine. Ainsi, lorsque ces régions sont placées en amont d'un fragment d'ADN codant pour le variant Lys 47 de l'ilirudine, on obtient une wossn44s~ '' r~l/rh:S'~ ^ --expression efficace en l'absence de thiamine, au moins équivalente a celle détectée avec la région promotrice forte du gène ndll. De plus, leur mise en oeuvre dans une cassette d'~lcaa;oa de la proteine CF-rR (Cystic Fibrosis T. ' O.~, Reaulator) a permis sa production par voie pourtant toxique dans S. ~ pombe.
On a également trou~lé un gène de .S~ ' ' I ,v~cs pombe codant pour un produit activateur agissant sur l'expression des gènes régulables par la thiamine dans des conditions inductrices (en absence de thiamine). L'i , ' ' de ce gène, notamment par i~ udu~,~;u~, dans un vecteur multicopie et ~la.larullllaliull d'une souche de S ,~ pombe, laquelle comprend également un grand nombre de copies d'un fragment d'ADN codant pour une protéine d'intéret, placé sous la dependance d'une région promotrice régulable par la thiamine, pourrait permettre d'ameliorer les niveaux de la production de la IS protéine d'interet en fonction des conditions de culture, en particulier en absence de thiamine TrP~iti( " t, la thiamine est ajoutee dans les milieux de culture des lewres. Le fait de ne pas en mettre represente un cout moindre et n'affecte pas ou peu leur viabilité. Ces différents critères, qui satisfont aux conditions de production à l'échelle industridle, illustrent les avantages de la présente invention.
Par c~nct~ nt, ia l)resente invention a pour objet l'usage combiné en vue de la production d'une protéine d'intéret, (a) d'une première cassette ~ JIe~a;ù.~ comportant un premier fragment d'ADN codant pour ladite protéine d'intéret, placé sous le contrôle des élements nécessaires à son expression; lesdits éléments, "
notamment une première région promotrice regulable par la thiamine;
et ~o 95~24491 218 5 ~1~ 3 P~ -lr~s~

(b) d'une deuxième cassette ~ ,At lc~;uil comportant un deuxième fragment d'ADN codant pour un produit activateur des gènes régulables par ia thiamine, placé sous le contrôle des éléments S necessaires a son expression qui CUIII~ une deuxième re~ion promotrice; ladite deuxieme cassette ~ A~ UjI étant inserée (i) dans un vecteur multicopie ou (ii) dans ie génome cellulaire et dans le cas (ii) caractérisé en ce que ladite deuxième region promotrice est I,.,t~"ulGg.l~ audit fragment d'ADN codant pour ledit produit activateur.
Comme indiqué t~ t, la présente invention s'applique à la production regulée par la thiamine d'une proteine d'intérêt dans une cellule eucaryote, notamment une souche de S '- ~ .. et, tout tJa.; ' ~,.".",t, de l'espece po~nbe.
Aux fins de la présente invention, le premier fragment d'ADN peut être issu d'un organisme eucaryote, procaryote ou d'un virus. Il peut être isolé par toutetechnique en usage dans le domaine de l'art, par exemple par clonage, PCR
(Polymerase Chain Reaction) ou synthèse chimique. D'autre part il peut coder 20 pour une protéine d'interêt (i) " ' ~ (ii) ' c presente à la surface de la levure hôte ou (iii) sécrétée dans le milieu de culture. Il peut donc , c"J,c des éléments - '" ' appropriés comme, par exemple, une séquence codant pour un signai de sécretion. De tels elements sont connus de l'homme de l'art.
Par ailleurs, le premier fragment d'Ai~N peut coder pour une protéine d'intérêt col l L r - ' à tout ou partie d'une proteine native, telle que trouvée dans la nature. Il peut également s'agir d'une protéine chimérique, par exemple provenant de la fusion de iJUl!~.~tii.~l d'origines diverses, ou d'un mutant 30 présentant des proprietés biologiques améliorées et/ou modifiées. Un tel mutant WO g5/2449~ /r~ . . -~ --~8~

peut ètre obtenu par les techniques dc biologie molécuiaire. Parmi les protéinesd'intéret au sens de la presente invention, on peut citer plus ,U.II Li~.u ;." Clll..ll:
- les cytokines et notamment les ' ' , les interférons, les facteurs de stimulation des colonies (CSF) et les facteurs de croissance;
- les ~ S~ . de préférence l'hirudine, notamment les variants de l'hirudine décrits dans la demande europeenne EP 332 523 et tout PGI ' ~ Ie variant HV2 Lys 47, - les enzymes telles que la trypsine et les l;i,~ ,.1. ~. . ~;
- les inhibiteurs d'enzymes tels que l'c~l _ y~
et les inhibiteurs de proteases virales;
- les proteines impliquées dans les canaux ioniques, telles que la proteine CFTR dont la séquence est decrite dans i~iordan et al. (1989, Science, 2-S5, 1066-1 073);
- les protéines capables d'inhiber l'initiation ou la Inuglca~;u~ de cancers, telles que les produits i'l"~ulca~;UII des gènes au~J~JICaa~iula de tumeurs, par exemple les gènes p53 et Rb; et - les protéines capables d'inhiber une infection viraie ou son dcv~lv~ . par exemple les épitopes: ,, ' . de ces virus ou des variants altérés de protéines virales 5..~ de . , ' avec les protéines viraies natives.
0 Bien entendu, ces ex~mples ne sont pas limitatifs.

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D'une façon générale, on aura recours pour l'expression du premier fragment d'ADN à une région promotrice r '' ~~ dans la cellule considérée et régulable par la thiamine. Cette dernière est isolée de la région 5' flanquante des gènes régulables par la thiamine, tels que ceux mentionnés t,.~ ' Bien 5 entendu, elle peut être modiflée par mutation, delétion etlou addition d'un ouplusieurs n~ ;fl ~(s) par rapport à la région promotrice native, à la condition que ces ,,.,..I;r,.~,;,...~ n'altèrent pas de manière drastique sa capacité de régulation. D'une façon générale, tout ou partie d'une telle région promotrice peut être utilisee dans le cadre de la présente invention. Ainsi, on peut mettre en 10 oeuvre une region promotrice d'un gène régulable par la thiamine, co...l,..
une région de régulation capable de conférer la regulation par la thiamine et une TATA box homologue audit gène regulable.
Selon un autre mode de realisation, on peut employer une région de régulation 15 issue d'un ~ène régulable par la thiamine placée en amont d'une région promotrice minimale ~,u..,t.,t..~ une TATA box d~une origine r~ lr~nq.lP, capable d'assurer une initiation correcte de la , d'un premier fragment d'ADN dans la cellule considerée. L'homme du métier connalt de telles régions t ~u~-ul-;-,~i~ minimales. On peut citer à titre d'exemples celles des 20 genes adh de S '~: ~ .b .v~c~ pombe et IEl de CMV (Cy ~ ' .:.,,~) (Boshart et al., 1985, Cell, SI, 521-530).
"Région de régulation" se refere à une séquence " ' . de taille variable, capable de conférer la regulation par la thiamine, c'est à dire d'induire en 25 absence de thiamine une expression du fragment d'ADN placé sous sa ~1. ,.. 1--.. à un niveau n.. l_l.l.. 1 plus élevé qu'en présence de thiamine.
Une region de regulation comprend notamment un ou des aéments d'activation et/ou de répression ,,~1.., ~1.1.; de la régulation.
30 Bien qu'une seule région de régulation soit suflisante pour assurer une régulation par la thiamine, on peut également envisager d'employer plusieurs WO 95124491 r~
~18~3 , ; ~
régions de régulation en tandem pour augmenter les niveaux d'~JIcaaiull.
Selon un usage selon la présente invention, on peut mettre en oeuvre notamment de I à 25 regions de regulation, a~ ~, de I à 7 et, de préférence, de I à 4. Par ailleurs, la ou les région(s) de régulation peut 5 (peuvent) ê~re inserée(s) en amont d'une ré~ion promotrice minimale dans une orientation sens ou inversee par rapport à la TATA box. De préférence, cette région de regulation est placée ' en amont de la TATA box c'est à dire à une distance de I à 35pb, ~: ,, de 1 à 20pb, de preférence de I à 10pb et de, manière tout à fait preféree, de I à 6pb, On préfëre tout p~"i ' .,..,~,.., mettre en oeuvre des régions ~u~"ul~ issues du gène ~ ou p~70 S de .S ' ' , . ~c~ pombe.
Dans le cadre de la presente invention, on aura, de preférence, recours à une première re~ion promotrice issue du gene pho4 de .S~ c~
po~77be. Dans ce contexte, les inventeurs ont caracterisé une région de regulation de 40pb localisee juste en amont de la TATA box. Ainsi, selon un mode avantageux, une région de regulation en usage dans la présente invention comprend au moins 17 nucléotides de la séquence telle que montrée dans 1' '~ ' de séquence NO: 2 et débutant au nucléotide en position +603 et se terminant au nucléotide en position +642. La presente invention inclut également toute sequence capable de s'hybrider dans des conditions stringentes avec une telle séqu~nce ainsi que son ~ , " c. Bien entendu, une région de regulation ,au sens de l'invention peut être plus grande et cu...~ c 25 plus de séquence de la région promotrice du gènepho4.
A titre d'exemples non limitatifs, on peut envisager d'employer une région de régulation ayant une séquence telle que montrée dans l~jA-~ r de séquenceNO: 2, ~!oss/244sl ~18 ~;10 3 P~ llr~ 1 -g - débutant au nucléotide en position +603 et se terminant au nucleotide en position +642;
- débutant au nucléotide en position +593 et se terrninant au nucléotide S en position +642;
- débutant au nucléotide en position +544 et se terminant au nucleotide en position +642;
- débutant au nucléotide en position +496 et se terminant au nucléotide en position +642;
- debutant au nucleotide en position +444 et se terminant au nucleotide en position +642;
- debutant au nucleotide en position +255 et se terminant au nucléotide en position +642; ou - debutant au nucléotide en position +l et se terminant au nucléotide en position +642.
Une ~ UC~iOI) ~ ' Cl~ ' est celle qui associe une région de régulation issue du gène pho4 de S~ .,... pombe et une région promotrice minimale issue du gène adh de ." ' ' ,, ~.,.., pol;Abe. Cette 25 dernière correspond à la séquence telle que publiée dans Russel et al. (1983,supra) et comprise entre les nucleotides -119 à -12. Il va de soit qu'elle peut comporter des ,-r " (mutation, delétion etlou addition d'un ou plusieurs nucleotides) par rapport à la séquence publiee du moment que ces ....~,I;r.. Ati~ ne réduisent pas d'une manière drastique sa capacdé à initier la 30 Ll~.~_.;y~

wo 95/24491 2 ~ 8 ~ I 0 3 r~llr~ ~A ~
. _ - 10`
D'autre part, une première cassette d'~".ylc~a;ull en usaæe dans la presente invention peut, en outre, contenir d'autres éléments contribuant à l'expression du premier fragment d~ADN~ notamment une séquence de termjnaison de la iyliO~ telle que celle du gene ar~ 3 de S. ,~ C~ pombe (Van Huffel et al. 1992, Eur. J Biochem, 20~i, 33-43) ainsi qu'un enhancer de llallSl,l;yl;OIl fonctionnel dans la cellule considerée, par exemple, I'enhancer du gène IEl du CMV.
Une dcuxième cassette d'~,Ayl~a;v~ en usage dans la présente invention, code pour un produit activateur capable d'activer l'expression d'un premier fragment d'ADN placé sous le ~ontrôle d'une region promotrice regulable par la thiamine Le terme "produit activateur" désigne un polypeptide capable d'interagir soit J;.c avec la région de régulation impliquee dans la regulation par la thiamine soit il~di~ ,Lcl~ i par l'i '' c de facteurs cellulaires Il s'agit de préférence d'un produit activateur agissant au niveau tl Diffërents genes ou parties de gènes isolés de cellules eucaryotes variées et codant pour un produit activateur de l'expression des gènes regulables par la thiamine peuvent etre utilisés dans le cadre de la présente invention De tels gènes activateurs peuvent etre obtenus par toute technique cu,.. c.~t;v.. ll~ dans 20 le domaine de l'art et, notamment, selon la technique décrite dans l'exemple 2 par . ~,,,1,l. ...AI~.~I~ d'une cellule mutante presentant une absence de d~cyl~,~a;vi) de l'expression des gènes ' induits en absence de thiamine.
25 Mais on préfere tout ya-i ' M,.. lt mettre en oeuvre un gène issu de 5~ pombe codant pour un produit activateur ayant la séquence telle que montrée dans l'jA- ..~ C~ de séquence NO: I débutant à
l'acide aminé en position +l et se terminant a l'acide aminé en position +775 ouun variant fonctionnel dudit produit activateur. Par "variant '` "', on 30 entend un polypepti~e capable d'exercer une fonction activatrice de l'expression des gènes régulables par la thiamine. De tels variants r., 1;., . ~- peuvent être J~0 95/24491 2 1 9 5 1 0 3 ~ r ~
obtenus par mutation, délétion, substitution et/ou addition d'un ou plusieurs residus acide aminé. Ces ~n~i~fi-_l;n- peuvent être realisées selon les techniques classiques de biologie moléculaire. La Ct ' du variant ainsi obtenu peut être confirmée selon la technique indiquée dans l'exemple 2, par 5 ~ ion des fragments d'ADN codant pour chacun de ces variants dans des souches mutanles et mesure de la dé.~,.G~ .., par IL~ldUldl;OII d'une activité .,..,r..,~ uc appropriee.
Un usage selon la présente invention, comprend le cas où la deuxième cassette 0 d'L.~I/IU~:~;I.)-- est comprise dans un vecteur à réplication autonome et, dans ce cas, le deuxième fragment d'ADN peut être sous la ~i. l.. 1- ~ soit de sa propre région promotrice~ soit d'une deuxième région promotrice h.,tu.~ bJ., audit fragment d'ADN. Selon une autre variante, la deuxieme cassette dl.,A~ ;UII
est insérée dans le génome de la cellule hôte, a la condition que le deuxième 15 fragment d'ADN soit placé sous le contrôle d'une deuxième région promotrice hétérologue audit fragment d'ADN
S'agissant d'une deuxième région promotrice h.,t.,..,logu~, elle peut être ,o..~liluliv~ ou régulable, d'une origine quelconque du moment qu'elle soit 20 ~ dans la cellule hôte. Le choix d'une telle région promotrice est a la portée de l'homme du métier. On peut, néanmoins, citer les régions ~."
des gènes adh etfbp de S~ h '`' " ' I'' " ' .r~-C ~ pombe et du gène El du CMV.
Cependant, il peut être avantageux d'avoir recours à une deuxième région 25 promotrice regulable par la thiamine du type de la première region promotriceen usage dans la presente invention.
Comme ~ , la deuxième cassette d'.~A,Ul~ lilJa peut contenir d'autres éléments necessaires à l'expression du deuxième fragment d'ADN tels que ceux 30 mentionnés ci^dessus.

W095/24491 21~5103 P~l/rl ' -. --Selon la variante, par ailleurs préférée, où une ou plusieurs copie(s) de la deuxième cassette d'~ c~aiu~ est (sont) insérée(s) dans un vecteur d'cAIJlc~aivlll on emp~oie notamment un Yecteur d'l,A~JIcaa;ùll multicopie et, en particulier, un vecteur comprenant une ou plusieurs copie(s) de la premiere 5 cassette d'~ lcaa;ùll. L'insertion de la deuxième cassette d~ JIC~;VII en usa~e dans la presente invention se fait de préfërence en dehors de la premiere cassette (.Ik API caaivll proprement dite. Un tel vecteur peut comporter par ailleurs des éléments assurant sa réplication, c'est à dire une origine de réplication telle que l'origine arsl de S~ ' ' ,, ,~",L.~ pombe et, de façon 10 optionnPllp~ ori d'Eschenchla coli. En outre, il peut également CO~ JItIIdIC des gènes de sélection, tels que le gene UR43 ou LEU2 de SULI~U~
cerel~lsioe, le ~ène l~ra~ ou lel~/ de S.~" v~u..~,u, ~ pombe ou un gène de résistance à un ~ ;v~ On préfere tout ~ li."cll~"lt mettre en usage un vecteur multicop;e présent entre 20 et 50û copies dans la cellule hote, av~ . - . 1 entre 25 et 400 copies, et de préférence entre 50 et 300 copies.
Dans le cadre de la presente invention, les premieres et deuxièmes cassettes d'~ A~JI caa;~JIl sont présentes dans une cellule hôte selon un rapport en nombre de copies de 200:1, av. ~ de 25:1, de préférence 10:1 et de manière 20 tout a fait préférée de 1:1.
La présente inventioll s'etend egalement aux cellules hotes dans lesquelles on met en oeuvre un usa~e selon la présente invention et, en particulier, aux levures " ' parmi les souches suivantes S~ c~ pombe, 25 S: ' '. v.~ sloof ae, .S ' ' . ~G~ ~ '' ' VV~
S, S. ,..~.... h-~ G;I oc~ospoms et llu~, japo~ictls Un grand nombre de ces souches sont disponibles cv.. ~"~ ' dans des organismes tels que l'AFRC (A~riculture and Food Research Council, Norfolk, UK) ou l'ATCC
(Rockville, MA, USA).

~185~03 ossn44sl ~ , , r~l,r~J,. ~^

La présente invention concerne également une troisieme cassette J't,A~JIca~;ull ~ù..""~ ,..l un fragment d'ADN codant pour une protéine d'intérêt place sous le contrôle des éléments nëcessaires à son expression, lesdits éléments comportant une region promotrice régulable par la thiamine issue du ~ène phoJ de 5 S~ c~ pornbe. Une telle région promotrice est definie IJl r~ r~
La presente invention s'étend egalement à:
(i) un vecleur d'~A,ul~a;vi~ cvlll~l une troisième cassette dl~.A~)IC ~;01~ selon l'invention; et (ii) une cellule hôte . , ~"~",l une troisième cassette d'~,A~"c:~a;u" ou un vecteur dl~,A~ ;VII selon l'invention. On prefère tout 1-,- ' `
une cellule de levure av ~, ' du genre S~,'. .. ~,,. ,1,.", y, et, de préférence, de l'espècepombe.
Enfin, la présente invention vise également un procédé de production d'une protéine d'interêt par une cellule hôte selon l'invention, notamment une cellule20 de S~ r.~ . po~nbe, selon lequel:
- on cultive dans un milieu approprié en absence de thiamine ladite cellule hôte; et - on récupère ladite proteine d'intérêt.
Dans le cadre de l'invention, la protéine d'intérêt peut être récupéréeJ;...,L.,..._.II dans le milieu de culture ou après Iyse des cdlules selon les techniques .,v"~, " Par ailleurs, elle peut être purifiée en appliquant 3û les techniques standards connues de l'homme de l'art, par exemple et à titre indicatif, par ' u~ lv~ Jh ~ ou WO95/2449~ d~ r~

Les exemples ci-après i., Ulll de mettre en évidence d'autres r~ .,f c et av~ntages de la présente inYention. Ces exempies sont illustrés par refërence aux figures suivantes:
5 La Figure I est une lc~nQcllldliull c ~ .. des cassettes pour l'expression du fragment d'ADN codant pour HV2 Lys 47 place sous la ~IPrPn~ rf, d'une région promotrice régulable par la thiamine (pTG2734 et pTG2735), constitutive (pTG17S7) ou non-~u -- ~;v Ilr (pTG17S8).
10 La Figure 2 est une l~JlC:~C.lldliOII ,.' ~;.l... d'un vecteur d'expression comportant une première cassette d'expression du variant Lys 47 de l'hirudine (HV2) sous le contrôle du promoteurpho4 et un gene activateur (ACT) capable d'activer le promoteur pho4, de même qu'un origine de réplication (ars) et des gènes codant pour des marqueurs de sélection (amp et sélection).
La Figure 3 est une ~ cAc~ldliu~ ~. h. .. ~ ... des vecteurs de délétion de la region regulatrice ~U~'-S) du gène phoJ (pTG4734 à pTG4738) et des vecteurs temoins (pTG2735: region régulatrice phoJ complète; pTG1758: région promotrice minimale adh et pTG4766: région promotrice minimale adh 20 completee de 30pb de séquence 5' et d'un site Sall). La capacite de ces vecteurs à produire et sécréter l'hirudine (HV2) après culture dans un milieu depourvu ou contenant de la thiamine (-thi ou +thi) est indiqué (+ ou -).
Les 1,OII~llUCIiUll5 décrites ci-après sont reaiisées selon les techniques géneraies 25 de génie genetique f~t de clonage moleculaire detaillees dans Maniatis et ai.(1989, Laboratory M.~nual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring ~arbor, NY). L'ensemble des étapes de clonage mettant en oeuvre des plasmides bactériens est effectué par passage dans la souche E. coli 5K.
30 On utilise pour introduire les différents vecteurs dans les souches de ,r~ pombe la technique à l'acétate de lithium (Ito et al., 1983, -~o 95~24491 X 1 8 ~ ~ 0 3 r~l/r~ 5 J. Bacteriol., 153, 163-168). Mais toute autre technique standard peut être - employee.
EXEMPLE 1: Construction de vecteurS d'~,Av,tD~;ol. dans lesauels le ~ène S c~ t -Vour le variant HV2 Lys 47 est place sous le contrôle d'une re~ion promotrice derivee du ~ène phe~ de S~ . h.~, v.,.5 pombe.
A. Yecte11r pTG2~3~ dalls leqt~el le gè~7e HV2 Lys 47 esJ placë sol~s /e col~rôle ~fe la l egioll promolrice isolée dl~ gè~e pho4 de .S~ e.~ pombe.
Le plasmide pEVpl I (Russell et Nurse, 1986, Cell, 45, 145-153) contient la region promotrice du gène adh de .S ~ -.1- ,. ,v.,c~ pombe sous forme d'un fragment Sphl-LcoRI de 700pb, le site ~coRI etant situé dans la région 5' du gène adh 59pb en amont de l'ATG initiateur. Il est digere par les enzymes ~coRI et Hi~ldlll et on introduit un fragment synthétique résultant de la ~ des ~'i~, ~' ' simple brin OTG2781 et OTG2782 (decrits Ic~ _Li~ dans les SEQ ID NO: 3 et NO: 4) dans le but de compléter la région promotrice adh jusqu'à 11 pb en amont de l'ATG
initiateur et de créer des sites de restriction appropriés &cilitant les étapes de clonage ulterieures. On génère pTG1702 dans lequel on insère en aval de la region promotrice adh une sequence codant pour le signal de sécrétion de la I ' , ' acide majeure de .S~ e~ pombe (pho I ) . Pour ce faire, un fragment d'ADN synthétique issu de la 1~ ;o ~ des ~I;g~ ;.l. c OTG2872 et OTG2873 (SEQ ~) NO: S
et NO: 6) est ligué à pTG1702 ~"_,1.1,!. - -- - ' digeré par BamH~ et Sacl. On obtient pTG1716.
Ce dernier est modifié par l'insertion d'une séquence d'ADN codant pour le variant Lys 47 de l'hirudine (HV2 Lys47). pTG1716 est digére parMlul et Hilldlll avant d'être ligué d'une part à un fragment synthétique présentant WO 95/24491 2 ~ /C -~

des extremités ~nu~ulJ Ml1~1 et Accl et resultant de la I~A",": l;nl~
des nl L.~ -l;d ~ OTG2874 et OTG2875 (décrits l~,a~ dans Ies SEQ ID NO: 7 et NO: 8) et d'autre part à un fragment Accl-Hilldlll isolé du vecteur pTG2974. Ce demier porte notamment un fragment d'ADN codant pour HV2 Lys 47.
On complète la cassette d'l~/lcaa;lall par l';..~-UIU~.L;~II en 3' du gène HV2 Lys 47 d'une séquence l~llll;ll~lliu~ de Ll~lla~ Jliull r~o~a~ùl~dlllll à la region 3' du gène ~rg3 de 5 ~7 ' ''`''' ~ .,C.~ pombc. Un fragment Hpal-lû C/al de û,92 kb est isole de pCVH3 (Van Huffel et al., 1992, Eur J.
Biochem., 205, 3343) puis traité au fragment Klenow de l'ADN
p~l~..,.,.~se. Ce fra~ment comporte les derniers codons du gène ar,~3 de .S h~ pombe suivis de la sequence de terminaison dc la ll~ms..l;~ . Il est inséré dans pTG17û2 digére par Hi~dlll et dont les extrémités ont ete rendues franches par traitement au fragment Klenow de l'ADN polymerase, pour donner pTG1746.
pTG1746 est digéré par Xbal, traite au fragment Klenow de l'ADN
polymerase avan~: d'être digeré par BamHI. Le fragment comportant les 2û séquences de terminaison de la i ;~L;u" est introduit dans le vecteur pDW23û digere l~ar LcoRI, sûumis à un traitement au fragment Klenow de l'ADN polymeras~ puis digéré parBamHI. On obtient pTG1751.
Le vecteur pDW23û est similaire à pDW232 décrit dans la littérature (Weilguny et al., 1991, Gene, 99, 47-54). Ils dénvent tous deux de pGEM3 dans lequel on a inséré une origine de replication f( "~ dans 5~'h;~ 7.~ c:~ pombe (origine arsl) ainsi que le gene ura~ de S ~ <~ c~ pombe en tant que marqueur de saection; à la différence que l';.lL~udu.,Liu-~ du fragment portant l'origine arsl au niveau du site Nael de pGEM3, donnant lieu à pDW230, a entraîné une délétion de ce site jusqu'a la base 2862.

~oss/244sl 2l8S~b3~ P,~

Le fragment Sphl-Sacl comportant la region promotrice adh suivie de la séquence codant pour le signal de sécretion phol et HV2 Lys 47 est isole de pTG1722. Il est ensuite sous-cloné entre les memes sites de pTG1751. Ilen résulte pTG1757 dans lequel l'expression de HV2 Lys 47 est controlée par la région promotrice adh et est donc constitutive (Figure I ).
D'autre part, la région promotrice du gène pho4 de .S~ a pon~be est obtenue par PCR (Polymérase Chain Reaction) à partir du clone pSp4B (Yang and S~h.. ., ul,~,., 1990, Current Genet., 181 269-272) et à
l'aide des amorces OTG3569 comportant un site Sphl (SEQ ID NO: 9) et OTG3239 muni d'un siteBan~HI (SEQ ID NO: 10).
Le fragment Sphl-BamHI ainsi æenere est substitue au fragment Sphl-BamHI portant la region promotrice adh de pTG1757 pour donner pTG2734 (Figure 1).
B. Co~str~ctiol~ de vec~e~lrs dexpressiot~ de l:IV2 Lys 47 t ._..; u~e regio~l p~omo~rice hybr~de "pho4-adhN et Cur~ t ,au~ des régio~s d~
~èl~e pho I in~pliq~ees da~s la rég1/lation par la thiamine.
On isole par PCR et a partir du vecteur pTG2734, un fragment de 642 pb comportant les sequences 5' flanquantes du gène pho4 de 5. ~.., pombe situées en amont de la TATA box. On met en oeuvre les amorces OTG3569 (SEQ ID NO: 9) et OTG3210 (SEQ ID NO:
Il).
Le fragment PCR Sphl-Ncol ainsi obtenu, est introduit dans pTG1757 digéré par les mêmes enzymes pour donner pTG2735 (Figure 1).

wo 95/24491 2 1 8 5 1 0 ~ P l/~s -~ ~

Afin de localiser les ré~ions régulatrices du æène pho~ . c de la régulation par la Ihiamine, un certain nombre de fragments PCR ont été
générés à part;r de pTG2734 et de l'amorce OTG3210 ~,.~' '' decrite combinée à l'une des amorces suivantes (voir tableau I ):
s Tableau I
Amorces Vecteur d'~ ,.~;u.. Taille de la region 5' pho4 synthétisée OTG4645 (SEQ ID NO: 12) pTG4734 50 pb 10OTG4646 (SEQ ID NO: 13) pTG4735 99 pb OTG4647 (SEQ ID NO: 14) pTG4736 147 pb OTG4648 (SEQ ID NO: 15) pTG4737 199 pb OTG4649 (SEQ ID NO: 16) pTG4738 388 pb Chacun des fra~ments PCR Sphl-Ncol génere est sous clone comme l,.~c~d .... ~ dans le vecteur pTG1757 traité par les mêmes enzymes.
Une l ~p~ Li()~ t ~ de ceux-ci fait l'objet de la Figure 3 .
Enfin, on ~enère le vecteur pTG5701 par ;~llluduul;ùll dans pTG1757 d'un fragment d'ADN murli d't~.L.; ' Sphl et Ncol et provenant de la ~``'J' -~;~. des, 'i ' ' ' OTG4924 et OTG4925 (SEQ D NO: 17 et 18). Ainsi dans pTG5701, I'expression de HV2 Lys 47 est placé sous le contrôle d'une region de regulation de 4û pb du gène pho4 precédant la TATA box du gène adh.
C C0~7st~71C~io~ d'~t~ ec~e~r d'expression de HY2 Lys 47 ~ ,~ u ~t ~ne régiol~ p~omolr~ce hybride ''phoiJ-adh'' et dans laq~oelle la régio~ de re~7~la~io~7 pho~ esl e~ one~tatio/r a~7ti-se 7s par rapport à la TA TA box du gè~e adh.

~o 95/24491 218 5 ~ 0 3 ~ = P~llr. A

Le vecteur pTG4734 est digéré par Sphl et NcoI puis traitb à l'ADN
polymerase T4 puis religue. On verifie par séquençage selon les méthodes L,~ c les clones comportant une copie d'une région de regulation du ~ène pho~ de 50 pb mais en orientation reverse par rapport au vecteur d'orisine pTG4734 et donc à la TATA box du gène adh.
D. C~ de l~ecter~rs d'expressio~1 de HY2 Iys 47 ~ t ~ e régio~l promotrice hybride 'pho~J-adh" illcl~a~7t p/t~sie1~rs régiolls de rL;gr~latioll pho~ de 50 pb e~ la~ldem.
Un fragment d'ADN ~,~nl~yullJ~ à une région de régulation du gène pho~ de 50 pb muni à ses deux extremités d'un site de restriction Bgrl est généré par .;,.~c~ ;U~I des ol;~ - OTG5296 et OTG5297 (SEQ
ID NO: 19 et 2û). L'étape de 16~ljl)lida~iùll des deux ~ ' est suivie d'une etape de ligation puis d'un traitement à l'ADN polymérase de T4. Le melange réactionnel est ensuite ligué au vecteur pTG1757 (en .~ du fragment c-~llta~,ull~ digéré parSphl et Ncol et traite à l'ADN polymérase de T4. On vérifie par s~q..~nç~er. dans les clones obtenus, le nombre d"'unités" de 50 pb de pho~ ainsi que leur orientation. C'est ainsi que l'on ~énère pTG8607, pTG8608 et pTG8609 ICD~ 1, 2 et 3 copies de region de régulation de 50 pb en orientation anti-sens par rapport a la TATA box du gène adh.
25 EXEMP~ F 2: Construction de vecteurs d~ lcaa;~JIl du ~ène HV2 Lys 47 comportant en outre le s!ène activateur de .~ S~ )onrbe.
A. clo~lage ~ gè~e ac~ a~ellr de .S~ . .s pombe.
Le gène codant pour un produit activateur capable d'activer rexpression des gènes régulables par la thiarnine est isolé par .~ 1i ' d'une wo95/24491 2~ r~llr~s -. ~

souche mutante de .S~ pombe présentant une absence de d~,u~,,c~;ul, de l'expression du gène pho~ en l'absence de thiamine. On isole des fragments ~ ",~ l digerés par Satl3A d'une souche de S~ h )~ "~ .G.~ pon~be de type sauvage. Ils sont clones S dans le site BomHI du vecteur pUR19 (Barbet et al., 1992~ Gene, 1/~, 59-66) pUiS introduil:s dans la souche mutante ~hil-23 t~ra4 D18 phol-44 (S~,l.... ~ u~, et al., 1992~ Genetics, 130, 445~449).
Les 1I r lI.d..L~ sont "~ ' pour la ,u.ulullu,ullic pour l'uracile et le ]U 5-(2 hydroxyethy~)-4-.. l.,ll-ylll.;dLul~ (Zurlinden et Su;l.. _ ul,~" 1992 Gene, 117, 141-143). 14 i r sont obtenus et leur ADN
pl~ f est i';olé selon le protocole décrit dans Moreno et al. (1991, Melhods in r~ "uloO~, Ig~, 795-G23). L'ADN est ensuite amplifie dans ~scherrc~tia col~ selon les méthodes standards (Maniatis et al., 1982, Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Sprin~ Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Quatre i ~ présentent un insert de 4 kb qui, après ~ ru~ iùll dans la souche mutante précedente, est capable de supprimer l'absence de d;lc~JlcDa;ùl~ Ceci se traduit par la lec:,ldu.d~;on d'une activité I ' , ' acide dans un milieu depourvu de 2û thiamine, mesurée selon la technique décrite dans Su~ ;...... o,ub." et al.
(19~6, J. Biol. C~lem., 261, ISG77-1SG82). Il est donc probable que l'insert de 4 kb comprenne un gène activateur de l'expression des ~ènes régulables par la thiamine )tn~JJI etphû~.
On determine la séquence de la majorite de l'insert selon les techniques uu,,.. ~;u 11 - connues de l'homme de l'art. Les données permettent de mettre en évidence un cadre de lecture ouvert de 775 residus dont la sequence est reportée darls l'i ~ - de séquence NO :1 (SEQ ID
NO : 1).

~O 95~24491 PCTIE1295/00269 ~18~103 -2~ -B. Usage con7bl~é d~l ge~1e ocllvale~r de S ' ~ e~ pombe el d ~ e cassetfe d expressio~7 de HV2 Lys ~7 sot~s le co~1trôle d t~e ~ e~io~ romot~ ice iss~e d~ gè~e pho J.
Le fragment Sphl-~coRI est isolé du plasmide pURI9 cu.. ,t"t.. ~"~ I'insert de 4 kb et traite par l'ADN polymerase T4 avant d'être introduit dans des vecteurs CI~CA~UI CDD;UI~ réplicatifs multicopies de S~ e.>
~."~ une cassette d'.~AIJltDa;ull contrôlee par le promoteur pho~ et des marqueurs de sélection appropriés. I In vecteur de ce type est represente dans la Figure 2.
C Usage co~bi~é d~l gèlle activate11r de S: ~. c ~ pombe et d lme cassette d expressio~7 de HY2 Lys ~7 sotls le co~7trôle d tl~te regio~
pron~otrice isstle d~ gè~1e ~7mtl.
~5 On génère un fragment PCR de 188 pb à partir de l'ADN génomique isolé
d'une souche de .S ~ c~ pombe par les techniques uu.,~ ;f. - 11 ~ On utilise les 'i, -" ' OTG52~7 et OTG3028 (décrits ICD~J.,~,I;~. dans les SEQ ID NO: 21 et 22). On introduit le 2û fragment Spftl et BamHI ainsi géneré entre Ics mêmes sites du vecteur pTG1757. On obtient le vecteur pTG5774.
Le fragment d'ADN codant pour le produit activateur est inseré dans un vecteur réplicatif multicopie de S~ é~ comportant notamment une cassette C~ AIJICDD;~III contrôlee par le promoteur nmtJ.
FXF.l~rrl .F. 3: Production de T~V2 Lys 47 en fonction du plasmide utilisé.
Les vecteurs ~'~,AIJICDD;U.. dcs c-Aemples I et 2 sont introduits dans une souche - 30 de S~ ,.,................... et on évalue le nivcau CIIC~API~ ;OI~ du fragment d'ADN codant de l'hirudine selon la ' ' ' '~, mentionnee ci-dessous.

WO95/2449- ~ ~8S 1 03 r l~r~ r~
' ~2~`
Une souche de S 3. ~ c~ pombe, par exemple la souche DIS
disponible à l'AFI~C sous la référence 2036, est ~.. ru.,.l.,c par les vecteurs )lca:~;ull lJ~ c~ cites. On utilise à titre de contrôle négatif la même souche Lld..~ru,...~.c en parallèle par le vecteur pTG1758 (Figure 1) comportant5 une region promotrice trûnquée reduite à la region promotrice minimale du gèneadh. Le contrôle positifd'cAI,.c~;u.. est constitue par pTG1757 permettant une expression consti~utive de HV2 Lys 47, sous le contrôle de la region promotrice du gène adh.
10 Les souches ~ rulll,.,cS sont cultivées dans un milieu Kappeli rr~
avec 2% de glucose et un melange de vitamines culll~ notamment de la thiamine à une c(Jll~ ldL;ûll finale de 0,002gA (milieu thi+). Lorsque les cultures attei~nent une DO ~densite optique) à 600nm comprise entre I et 2, elles sont diluees à une DO d'environ 0,05 soit dans du milieu thi+ de 15 u.,~ telle qu'indiquée ci-dessus, soit dans un milieu Kappeli ~",~,I,I.'.~...,t~'. avec 2% de glucose et un mélange de vitamines dépourt~u en thiamine (milieu thi-). Des aliquotes de culture sont prélevées l~ ,cll,.",L
durant la phase ~ de croissance ainsi qu'en fin de croissance (DO
600nm comprise entre 7 et 9).
On determine pour chaque échantillon preleve, la quantité d'hirudine secretée dans le milieu de culture. Bien qu'il soit possible de doser l'hirudine par toutes les techrliques con~. " , on utilise la technique ELISA telle que decrite dans Koch et al., (1993, Analytical R;C ' y, 2147 301-312) en mettant en oeuvre le couple d'arlticorps ' MATG102 et MATG106 et, de l'hirudine titrée comme décrit dans la réfërence précitée. Par ailleurs, on peutcgalement évaluer le niveau ci t~AIJI ca~;ull de l'hirudine par analyse Northern des ARNm isolés des cellules de S~ ' ' I )_e.s pombe. On met en oeuvre une sonde capable de s'hybrider `I~' ;r.. ~.. t avec les sequences codant pour HV2 Lys 47, par exemple une sonde issue du fragment Accl-Sacl de pTGI 757.
Mais d'autres sondes, tclles que des ~;".... I,'.,l ;.1~ c, peuvent être employées.

~O95/24491 ~ 3 P~

La tableau 2 resume les niveaux d'hirudine sécrétée par 5, h ."~ h,", y~
PO777be IIG~ CVIIII6C par chacun des plasmides indiqués et selon que le milieu de culture contient de la thiamine ou non (thi+ ou thi-) (voir également Figure 3).
S Tableau 2 Vecteur Region 5' Orientation TATA box Niveau de HV2 Lys47 pho4 thi+ thi-pTG~757 - - adh +++ +++
10pTG1758 - - adh pTG570 1 40pb sens adh - ++ à +++
pTG4734 50pb sens adh +++
pTG4735 99pb sens adh - ++~
pTG4736 147pb sens adh +++
15pTG4737 199pb sens adh +++
pTG4738 388pb sens adh - ++
pTG2735 642pb sens adh - +++
pTG2734 642pb sens pho4 +++
pTG4770 50pb antisens adh +++

Des estimations de la quantité d'ARNm HV2 Lys 47 par Northern blot confirment ces résultats.
25 D'autre part, lorsqu'on analyse par Northern blot les ARNm présents dans les cellules de S~ c~ pombe ~ par pTG8607, pTG8608 ou pTG8609 et cultivées en présence de thiamine, on ne peut détecter de signal d'h,~.idaliG.I. Par contre lorsque les cellules sont cultivées dans un milieu - dépourvu de thiamine, on observe une forte ~ de la quantite 30 d'ARNm HV2 Lys 47. L'intensité du signal d'll~1vl;ua~iu~ corrèle le nombre de copies de la séquencephoJ de 50 pb.

WO 9~/24491 218 ~ rh~
-2~-L'ensemble de ces resultats rnontre qu'en presence de thiamine, I'expression du gène d'interêt est reprimee alors qu'en son absence on observe une forte induction, se traduisant' par la présence d'une quantité importante d'hirudine secrétée dans le milieu de culiure.

D'autre part, ces expériences ont permis d'identifier une région de régulation, que l'on peut qualifier de minimale, comprise dans la région promotrice du gene pho~ de ~<~ .G.~ pombe et Ica~Ju~la~l~ de la régulation par la thiamine. Cette reSion de 40 à 50 pb est située en amont de la TATA box et est 10 suffisante, à elle seule, pour conférer une telle régulation (répression en présence de thiamine ~t d~ Jlcaa;ull en absence de thiamine). Le fait que cette région fonctionne que~le que soit son orientation vis à vis de la TATA box est inattendu.
15 Enfin, la présence de piusieurs copies de cette région minimale en amont d'une TATA box a un effet synergique sur le niveau ~i'bA~caa;ull, effet qui semble corréler le nombre de copies de cette région.
F XF~PLi~ 4: Constn~ction d'un vecteur ~ AVI C~ m de la protéine Ci~TR sous 20 le contrôle d'une ré~ion promotrice hybride "pho4-adh"
Le vecteur pTG5960, issu du p poly III-I* (Lathe et ai., Gene, 1987, 5~, 193-201) et modifié par l'insertion de la séquence codant pour la protéine Ci~TR
humaine dont la sequence en acide aminé est divulguee dans Riordan et ai 25 (1989, supra), est digeré par les enzymes A val et Xhol. Le fragment Aval-Xhol w..",.~ la séquence ~ codant pour la protéine CFTR est traite par le grand fragment Kienow de rADN polymérase et insére dans le vecteur ~i'CA,~llC~:.;UII de ~ .G.~ pombe pTG2735 digéré par Sacl et BamHI et traité par l'ADN polymérase T4. On genère pTG5999.

~ ss/2449I 2~18 51 0 ~ . P~l/r~

Le fragment ,4 Yal-Xhol-Klenow est introduit en parallèle dans le vecteur pTGI702 digéré par BamHI et traite au grand fragment Klenow de l'ADN
polymerase pour donner pTG1753 (expression constitutive du gène CFTR sous Ie controle de la region promotrice du gène adh de .S 1~ , h-- ~rc~., S pombe).
Après ~ aru~ div~l de S 1~ .,cspom~e D18 par pTGI753, aucun r ne produit de protéine CFTR. L'analyse par ~,al lu~latJIl;c de restriction montre que les plasmides isolés des ~ `r',~ sont réarranges, 10 par exemple au niveau de la séquence CFTR. Ces résultats indiquent que l'expression de la proteine CFTR est ~nv~a~ t toxique pour les cellules.
Après i~lLIulu~,liull de pTG5999 dans la souche ,~h:,"~...,f,... ,,~,c.~pomoe DI8 selon le protocole indiqué ,u,~ ' t, les Llall~rullllallL~ sont cultivés 15 en presence ou en absence de thiamine. Des aliquotes de cellules sont prélevées au cours du temps et la production de la proteine CFTR determinée par Western blot (Dalemans et al., 1992, r, ~ Cell Research, 201, 235-240). Aucun signal n'apparait dans les cultures placées dans un milieu thi+ (répression de l'tAlJI UA ~;U~ due à la présence de thiamine), alors qu'on détecte une bande ayant 20 la masse moléculaire attendue dans les cultures réalisées en absence de thiamine.
Ces résultats montrent l'utilité de la region promotrice issue du gènepho4 pour la production de protéines toxiques.
F~PLE 5: Influence de la position de la r~ n 50pb du ~ène pho4 vll~a~l~, de la re. ulation -var la thiamine par rapport à la TATA box.
Afln de determiner si la proximite de cette région vis à vis de la TATA box est 30 requise pour les fonctions d'activation et de répression, elle a été clonée à deux autres positions plus eloignées de la TATA box adh.

WO95i24491 .~l/rlv'~
~18~103 Le plasmide pTG6726 est obtenu par digestion de pTG4734 par l'enzyme derestriction Ncol, traitelnent à l'ADN polymérase du phage T4 et ligation. Dans ces conditions, I'unité 50pb pho4 se trouve séparé par lOpb de la TATA box du gène adh.
s Le vecteur pTG5786 provient du clonage du fragment Sphl-Ncol isole de pTG4734 et ponant l'unite 50pb pho4 dans le site Sall du pTG4766, après traitement par l'ADN polymérase T4. De ce fait, après ligation la distance separant l'unité 50pb de la TATA box adh est de 40 pb. Le plasmide pTG4766 10 dérive du pTG1757 par u~u.,liv.. d'un site Sall 30pb en amont de la TATA
box adll. Cette . ~ J~. n'a aucun effet sur l'activité du promoteur adh et la déletion des séquences situées en amont du site Sall (tel que réalise dans le pTG4766) inhibe l'activite promotrice (Cu~ olt.,.~l~"lt comparable à pTG1758).
15 Enfin le vecteur pTG5787 a été cûnstruit d'une manière similaire à la différence que l'unité 50pb pho4 es~ cloné dans l'orientation inverse. Dans ce cas par rappon à la TATA box est de 36pb.
Les plasmides pTG6729, pTG5786 et pTG5787 ont éte introduits dans la levure 20 D18. Après culture en présence ou en absence de thiamine, les transcrits synthetises par ces différents ~l a - r - . - - ~ ~ ont été analyses par Nonhern-blot~
La quantité de transcrits présents dans la souche Llall~l'ullll.'~ avec le pTG6729, en absence de thiamine, est inférieure à celle obtenue avec la souche ponant le plasmide pTG4734, mais, en presence de thiamin4 la repression est conservee.
25 En ce qui concerne l~es souches i r ' avec les plasmides pTG5786 et pTG5787 I'efficacité de ~ est comparable quelles que soient les conditions de cultur~ (plus ou moins thiamine), et elle est semblable à celle mesurée dans la souche ponant le pTG4734 en absence de thiamine.

~0 95124491 ~ 1 8 5 ~ 0 3 P~

Ainsi, I'~ de lOpb de l'unité 50pb par rapport à la TATA box adh diminue sa capacilé à activer la ~ a~ ;vll, mais ne modifie pas la répression par la thiamine. Par contre, lorsque celle-ci se trouve éloi~née de 40pb de la TATA box, ses proprietes d'activation restent intactes mais elle devient 5 incapable de réprimer la ;. , Il apparait que la proximité entre la region régulatrice de 50pb du gène pho4 etla TATA box est nécessaire pour que la répression par la thiamine soit efficace.

WO95/24491 2~85i b3 F~1/r~
LISTE DE SEQUENCES
~l) INFORMATION GENERALE:
~i) DEPOSANT:
~A NOM: Transgene S.A.
~E~ RUE: ll rue de Molsheim ~Cl VILLE: Strasbourg ~D PROVINCE: France ~E PAYS: Franc~
~F CODE POSTAL: 67082 ~G TELEPHONE: (33) 88 27 9l 00 ~Hl TELECOPIE: (33) 88 22 58 07 (ii) TITRE DE L' INVENTION: Usage combiné de deux cassettes d ' expression pour la production d'une protéine d'intéret ~iii) NOM~3RE DE SEQVENCES: 22 ~iv) EORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
~A) TYPE DE SUPPORT: Tape ~3) ~D1N~1C,~: IBM PC comp~tible ~C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
~D) LOGICIEL: PatantIn Release l~l . 0, Version ~1.25 ~OEB) ~2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: l:
~i ~ CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
~A) LONGUEUR: 775 ~cides ~minés ~E) TYPE: ac~.de aminé
~D) CONFIGURATION: lineaire ~ii) TYPE DE MOLECULE: proteine ~iii) i~YPOTllETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NO~
~vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: S~-hi ~ -h~romyces pombe (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
et Asn Glu Glu Ile Gly Phe Leu Lys Asn Gln Leu Phe Ala Asp V~1 5 10 lS
ys Asp Leu Glu Arg Lys Lys Lys Ary Arg Val Pro Pro Glu Gln Arg Arg Arg Val Phe Arg Ala Cys Lys His Cys Arg Gln Lys Lys Ile Lys Cys Asn Gly Gly Gln Pro Cys Ile Ser Cys Lys Thr Leu Asn Ile Glu Cys Val Tyr Ala Gln Lys Ser Gln Asn Lys Thr Leu Ser Arg GlU Tyr ~O 9~/24491 ~18 ~

eu Glu Glu Leu Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Glu Tyr Ile Phe Ser rg Met Cys Pro Asn Phe Asn Leu Glu Thr Lys Asn Leu Ile Ser Ile Ser Lys Lys Leu Ser Glu Asn Glu Asn Leu Pro Val Ser Lys Ile Ala Glu Val Thr Asn Glu Leu A5p Thr Leu Val Arg Ile A5n Asp Gln Leu Ser Arg Asn His Ile Ser Gly Thr Thr Glu Glu Met Gln Ser Ser Ser er Leu Ile Ala Gly Glu Val Gln Pro Gly Ile Ser Phe Arg Asp Gln eu Lys Val Gly Lys Leu Glu Asp Thr Leu Tyr Leu Gly Pro Thr Thr Ser Glu Ala Phe Ile Glu Arg Leu Gln A5n Glu Leu Glu Leu Glu Ser Ile Ser Glu Asp Asp Leu Tyr Ser Lys Arg Leu Ser Pro Ser Val Ser Tyr Ser Glu Phe Asp Glu Gln L~u Leu Leu His Ala Arg Ser Leu Ile 225 230 . 235 240 ro Ser Lys Ala Val Val Glu Phe Leu Ile Asn Ser Phe Phe Ile Asn al Gln Thr Asn Leu Phe Val Tyr His Pro His Phe Phe Lys Cys Ar Leu Glu Ile Phe Leu Ala Met Glu Asn Gln Ile ASp Ala Gly Phe Leu Cys Ile Leu Leu Met Val Leu Ala Phe Gly Asn Gln Tyr Thr Ala Glu Gln Gln Glu Asp Val Ser Lys ser Asn Phe His iila Ser Asn Ile Gly sn Arg Leu Phe Ser A1A Ala LeU Ser Il~ Phe Pro Leu Val Leu Leu ln Ser Asp Vdl Ser Ala Val Gln Ser Ser Leu Leu Ile Gly Leu Tyr Leu Gln ser Thr Ile Tyr Glu Lys Ser Ser Phe Ala Tyr Phe Gly Leu Ala Ile Lys Phe Ala Val Ala Leu Gly Leu His Lys Asn Ser Asp Asp Pro Ser Leu Thr Gln Asn Ser Ly5 Glu Leu Arg A5n Arg Leu Leu Trp ser Val Phe Cys Ile Asp Arg Phe Val Ser Met Thr Thr Gly Arg Arg Wo95/24491 ?~18~103 ~ r ~ P~,l/r~
~30 ~
ro ser Ile Pro Leu Glu Cys Ile Ser Ile Pro Tyr Pro Val Ile Leu q20 425 430 Pro Asp Leu Glu Ile Pro Gly ser Gln Ser Ile Val Glu Asn Met Arg 435 ' 440 445 Ala Val Ile Asn Leu Ala Lys Leu Thr Asn Glu Ile Cys Asp Ser Leu Tyr Trp Asn Pro 5er Pro Ser Phe Glu Ser Gln Val Asn Ser Val Arg rg Ile Tyr Ala Arg Leu Glu Leu Trp Ly~ ser Asp Leu His Ser Ser al Val Phe Asp Glu Ser Ala Val Gln His Pro Leu Phe Arg Ser Asn Ala His Val Gln Mct Ile Tyr Asp Asn Ala Ile Met Leu Thr Thr Ar 515 _ 520 525 Val Ile Met Val kyS Lys Leu Lys Asp Lys Asp Leu Thr Ala Glu Asn Arg Arg Tyr Ile Gln Leu Cys V~l Glu Ser Ala Thr Arg Val Ile Asn le Ala His Leu Leu Leu Thr His Lys Cys Leu Ser S~r L~u Ser Phe he Gly Leu His Val Pro Phe Ala s~r Ala Pro Ile Leu Leu Leu S~

Leu His Tyr Glu Asn Ser Gln Asp Ile Gln Ala Val Val Thr Lys Leu Trp Gln Val Leu Glu Phe Leu S~r ser Arg Cys Glu Phe Ala Arg Glu S~r Leu Asn Tyr Leu Lys Ser Ph~ Asn Lys Gln L~u Ser Arg Arg Asn lz Pro Asp Ile Asn Asn Pro Ile Ala Asp Phe Gln Asn Ser Phe Gln sn Trp Gln Ser Trp Val Gly Asp Met Ser His Gly Asp Met Leu Ser Thr Phe Lys Leu ~hr Gly Glu Ser ser Asn Gly Ser Asn Ser Thr Pro Asn Glu Ala Phe Gln Pro Phe Asp Gln Thr Ser Ser Leu Tyr Asn V~l Pro Gly Leu Asn Lys Ser Tyr Val Ser Asn Gln Pro ser Leu Leu Thr ro GlU Thr Phe Leu Pro Asp Pro Val Leu Asn Leu Glu Val Asp Lys ln Trp Thr Ala Pro Thr Phe Leu Ser Trp Thr Glu Leu Leu Gly Pro ~095/24491 r l"~s.3r-~
~lg~103 Thr Asn Vzl Ser Glu Gln Ser Ser His Thr Ala Glu Gln Thr Ser Asn Leu Thr Leu Glu LYS Asn Gly (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA Sl:QUENCE:
(A) LONGUEUR: 642 paires de bases (B) TYPE: acide nucleiqu~
(C) NOMBRE DE BRINS: simple ~D~ CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (genomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi ~ ORIGINE:
~A~ ORGANISME: gene pho4 de Srhi7neA~-hAromyces pombe ~xi~ DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
CTAATAAATT AAATTGTTGG ATCTTACTAA AGACTAAATA TTAATAATAA ~ l~C_A 60 AGCTCGTACA ATGTTTGCAC ATCTTTACAC AATAGTATTC l~lLllVlJ~ll ACATTATCAT 240 TTATAATTCC ATTTCACAGA GAGTAGGCAT 1~ l--A TAATATA~AT TTATATAPAA 300 CAAAAAGACT GCAA~ATCAT TTCCAACTGA AACTTCGTTC TTTAGTTCTA TTA~ATTATT 360 l~vl~ T~ AATCGCATAA TATTACTGTA ACACTTTGTC CGTAATTTGC ~.~.i .. ~.1l 480 CAGTTAACAA llVlVVVlV~, AAAATCTTAA AGTCTAATAG CGAACTACAC QGGTTTGCA 540 ACTTCATTCA TTTTTTTTAA TTCCAATGTA vl~.vlv~l.vA AATCAGACTT ~vblllvvlv 600 GTAGCCGGGG TGCTTAGTGT TAGCAGATAT CCGGATTGAT TG 6q2 ~2~ INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
~A) LONGUEUR: 79 paires de bases ~B) TYPE: acide nuclééique ~C) NOMBRE DE BRINS: simple ~D~ CONFIGUPATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON

(iii) ANTI-SENS: NON

W095124491 ~8~ ~3 P~llr~

(vi) ORIGINE:
IA~ ORGANISME: oligonucleotide synthetique OTG2781 (xi) DESCRIPTION DE iA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
AATTCCATTG TCTTGACTAT CACA~ACTTT TAAGTCTTTT ~ TCCACACCAT 60 (2) INFORMA~ION POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 79 pilires de bases (B) TYPE: acide nucleique (C) NOM RE DE BRINS: simple ~D) CONFIGURATION: lin~aire (ii) TYPE DE MOLECUIIE: ADN ~génomique) ~iii) ~IYPOTE~ETIQUE: NON
~iii) ANTI-SENS: OUI
~vi) ORIGINE:
~A) ORGANISME: oligonucleotide synth~tique ~OTG2782) ~xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
AGCTTAGATC TCCCGGGAGC I~w;~ GGATCCAAAA AAGAF~AGAC TTAMAGTTT 60 ~2) INFORMATION POUR Lr~ SEQ ID NO: 5~
~i) CARACTER~STIQUES DE LA SEQUENCE:
~A) LONGUEUR: 74 paires dc b~ses ~B) TYPE: aci.de nucléique ~C) NOMBRE DE BRINS: simple ~D) CONFIGURATION: line~ire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (g~nomique) (iii) nlr~,,n~lLQu:.: NON
(iii) ANTI-5ENS: NOI~
(vi) ORIGINE:
(A) ORG~NISME: oligonucleotide synthetique (OTG2872) ~xi) DESCRIPTION DE ~ SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
GATCCAACCA CATAATGTTC TTGCA~AATT ~ LII~V ~ . G~ 1VI.V 60 (2) lN~U~llJN POUR I~ SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQilES DE ~A SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 66 p~ires de b~lses 21~ 3 ~O 95/24491 ,, ~ I !, . P _ 1/ r 1~75. C

(B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS- ~lmple - (D) CONFIGURATION: iinéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (g~nomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: ~ltg~ln~ ntide synthetique (OTG2873) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: ll paires de bases (B1 TYPE: acide nucléique ( C ~ NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lin~aire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (genomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi ) ORIGINE:
(A) ORGANISME: oligonucleotide synthetique (OTG2874) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
CGCGATTACG T l l (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i CARACTERISTIQUES DE LA SEQUEN
GUEUR: 9 paires de b~ es (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: r~11g~ tide 5ynthetique ~OTG2875) WO 95/24491 ~ 1 8 ~ 1 ~) r~llrl~551~. 9 (xi~ DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: B:

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i~ CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: ~
(A~ LONGUEUR: 43 paires de ba~es (B) TYPE: Acid~ nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN ~génomique) (iLi) I!YPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi ) ORIGINE:
(A~ ORGANISME: ~ ~tide synthetique tOTG3S69) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
Jl~' 111~ TGCTA~ATAA ATTA~ATTGT TGG 43 ~2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: l0:
(i) CMACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 43 paires de bases (B) TYPE: Acide nucleique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique~
(iii) n~ n~llyul;: NON
( ii i ) ANT I -SENS: OU I
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISI'E: ~lig~n~ tide synthetique (OTG3239) (xi) DESCRIPTION DE L~ SEQUENCE: SEQ ID NO: l0:
GAGAAATACC ACTTAACTTC ~T~ c~-~u~rr~ ATG 43 (2) INFOPMATION POUR LA SEQ ID NO: ll:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUP.: 36 paires de bases (B) TYPE: acide nucleique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGUPATION: linéalre (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) I~YPOT~ETIQUE: NON
~iii) ANTI-SENS: OUI

~O95/24491 . . r~,l/rl~
2 i 8 ~ ~ ~

(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: oligonucleotide synthetique ~OTG3210) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:
CCQ~ACCAT GGQATQAT i,~VW,l~l.,l GCTAAC 36 ~2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 12:
ti) Q~ACT3RISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGU~UR: 30 p41res de bases (B) TYPE: dcide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: slmple (D) CONFIGURATION: llnéaire ~ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) ~iii) HYPOTHETIQUE: NON
~iii) ANTI-SENS: NON
~vi ) ORIGINE:
~A) ORGANISME: oligonucleotide synthetique ~OTG4645) ~xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:
A~ACAAGCAT i~ GTAGCCGGGG 3 0 (2) lN~ .llUN POUR LA SEQ ID NO: 13:
~i) QRACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 40 paires de bases ~B) TYPE: Acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN ~génomique) ~iii) HYPOTHETIQUE: NON
i i i ) ANTI -S ENS: NON
~vi) ORIGINE:
~A) ORGANISME: nl;g~n~ synth~tique ~OTG4646) ~xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13:
AAAQAGQT ~,.. l~l._~T TTTTTTTAAT TCCAATGTAG 40 ~2) INFOPMATION POUR LA SEQ ID NO: 14:
~i) QRACTERISTIQUES DE LA SE~QUENCE:
IA) LONGUEUR: 38 paires de bases ~B) TYPE: ~cide nucleique ~C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linédire ~ii) TYPE DE MOLECULE: ADN ~génomique) WO 95/24491 ~ 1 8 ~ ~ ~ 3 r~"r~
- 36, (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: oli~7nn~ eo~ synthetiqUe (OTG4647) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:
Ai~ACAAGCAT GCGGTCCAAA TCTTAAAGTC TA~TAGCG 38 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: lS:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 39 p~ires de bases (E) TYPE: ~cide nucleique (C) NOMSRE DE ERINS: simple (D) CONFIGURATION: lin~aire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (genomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii~ ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: oligonucleotide synthetique (OTG4648) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15:
A~ACAAGCAT GCTACTGTAA CACTTTGTCC GTAATTTGC 39 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 16:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 35 paires de b~ses (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CON~IGUR}~TION: linéaire ~ii) TYPE DE MOLECIJLE: ADN (génomique) ~iii) HYPOTHETIQUE: NON
(ii1 ) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME~ An~-le~tide synthetique (OTG4649) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16:
AZ~ACAAGQT GCCACAGAGA GTAGGCATTG CTATT 35 (2) INFORM~TION POUR LP. SEQ ID NO: 17:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 42 p~ires de b~ses (B) TYPE: ~cide nucleique (C) NOM~3RE DE BRINS: slmple ~) 9S/24491 ~1 8 ~1 0 3 P~ ~ A ;~

(D) CONFIGURATION: liné~ire TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (ili) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: oligonucleotide synthetique (OTG492q) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17:
CAGCCGGGGT GCTTAGTGTT AGCAGATATC Cbbr~ l GC 92 (2: INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 18:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 50 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: sirnple (D) CONFIGURATION: liné~ire (ii~ TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi ) ORIGINE:
tA) ORGANISME: nl~g^n~ 1eo~ 5ynthetique (OTG4925) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18:
CATGGCAATC AATCCGGATA TCTGCTAACA CTAAGCACCC ~b~ ., 50 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 19:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: ~2 paires de bases (B~ TYPE: ~cide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: rligrm~ tide synthetique (OTGS296) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 19:
~,bb~ AlVb lll~:rbl~Jbl~ b~Cbbb~.~ln-- TTAGTGTTAG CAGATATCCG ~ .llV~ 6~
~l.. bb~ . TC 72 WO 95/24491 ~18 51~ 3 P~ r~55, ~
'''' ;''' (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 20:
(i~ CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
~A) LONGUEUR: 72 paire~ de bases ~B) TYPE: acid~ nucléique ~C) NOMBRE DE BRINS: simple ~D) CONFIGURATION: liné~ire ~il) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
~A) ORGANISME: oligonucleotid~ synth~ ue ~OTG5297) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 20:

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 21:
~i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 39 palres de bases (B) TYPE: aci.de nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple ~D) CONFIGUR~TION: llnéair~
~ii) TYPE DE MOLECULE: ADN ~g~nomique) ~iii) HYPOTHETIQUE: NON
~iii) ANTI-SENS: NO~I
vi ) ORIGINE:
~A) ORGANISME: oligonucleotide synth~tique ~OTGS217) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 21:
CCCAAAGCAT GCAAGCTTAA AGGA~TCCGA TTGTCATTC 3 9 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 22:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR~ 37 p~ires de b~ses

(3) TYPE: acide nucleique (C) NOMBRE DE BRINS: simple ~D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECU~E: ADN (génomiqu~) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
~A) ORGANISM13: oligonucleotide synthetiqu~ 1OTG3028) ~095/24491 ~ 1 8 a 1 03 ` . .I/r . -~

(xi) DESC~IPTION DE LA SEQIJENCE: SEQ ID NO: 22:
ATCTTGTTAG TAGCCATGGA TÇCGATTTAA CAAAGCG 37

Claims (25)

Revendications

1. Usage combiné en vue de la production d'une protéine d'intérêt, (a) d'une première cassette d'expression comportant un premier fragment d'ADN codant pour ladite protéine d'intérêt, placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression; lesdits éléments comprenant notamment une première région promotrice régulable par la thiamine; et (b) d'une deuxième cassette d'expression comportant un deuxième fragment d'ADN codant pour un produit activateur des gènes régulables par la thiamine, placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression qui comprennent une deuxième région promotrice; ladite deuxième cassette d'expression étant insérée (i) dans un vecteur multicopie ou (ii) dans le génome cellulaire et dans le cas (ii) caractérisé en ce que ladite deuxième région promotrice est hétérologue audit fragment d'ADN
codant pour ledit produit activateur.

2. Usage selon la revendication 1, selon lequel ladite première cassette d'expression et ladite deuxième cassette d'expression sont présentes selon un rapport en nombre de copies de 200:1, avantageusement de 25:1, de préférence 10:1 et, de manière tout à fait préférée, de 1:1.

3. Usage selon la revendication 1 ou 2, selon lequel le deuxième fragment d'ADN code pour un produit activateur ayant la séquence telle que montrée dans l'identificateur de séquence NO: 1 débutant à l'acide aminé en position +1 et se terminant à l'acide aminé en position +775 ou un variant fonctionnel dudit produit activateur.

4. Usage selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, selon lequel ladite deuxième région promotrice est hétérologue audit fragment d'ADN codant pour ledit produit activateur et régulable par la thiamine.

5. Usage selon la revendication 4, selon lequel les première et ou deuxième régions promotrices régulables par la thiamine sont issues des gènes sélectionnés parmi le groupe constitué par les gènes pho? et ? de Schizosaccharomyces pombe.

6. Usage selon la revendication 5, selon lequel les première et ou deuxième régions promotrices régulables par la thiamine sont issues du gène pho? de Schizosaccharomyces pombe.

7. Usage selon l'une quelconque des revendication 4 a 6, selon lequel les première et/ou seconde régions promotrices régulables par la thiamine comprennent au moins une région de régulation conférant la régulation par la thiamine, ladite région de régulation étant placée en amont d'une région promotrice minimale.

8. Usage selon la revendication 7, selon lequel ladite région de régulation est placée immédiatement en amont de la TATA box d'une région promotrice minimale.

9. Usage selon la revendication 7 ou 8, selon lequel les première et/ou deuxièmerégions promotrices régulables par la thiamine comprennent de 1 à 25, avantageusement de 1 à 7 et de préférence de 1 à 4 régions de régulation

10. Usage selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce quela ou les région(s) de régulation est (sont) dans une orientation sens ou anti-sens par rapport à ladite région promotrice minimale.

11. Usage selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, selon lequel la ou les région(s) de régulation est (sont) issue(s) du gène pho? de Schizosaccharomyces pombe.

12. Usase selon la revendication 11, selon lequel la région de régulation comprend au moins 17 nucléotides d'une séquence telle que montrée dans l'identificateur de séquence NO: 2 et débutant au nucléotide en position 617 et se terminant au nucléotide ce position +642.

13. Usage selon la revendication 12, selon lequel la région de régulation à la séquence telle que montrée dans l'identificateur de séquence NO: 2 - débutant au nucléotide en position +603 et se terminant au nucléotide en position +642;
- débutant au nucléotide en position +593 et se terminant au nucléotide en position +642;
- debutant au nucléotide en position +544 et se terminant au nucléotide en position +642;
- débutant au nucléotide en position +496 et se terminant au nucléotide en position +642;
- débutant au nucléotide en position +444 et se terminant au nucléotide en position +642;
- débutant au nucléotide en position +255 et se terminant au nucléotide en position +642; ou - débutant au nucléotide en position +1 et se terminant au nucléotide en position +642.

14. Usase selon l'une quelconque des revendications 7 à 13, selon lequel la région promotrice minimale est issue du gène adh de Schizosaccharomyces pombe.

15. Usage selon l'une quelconque des revendications 1 a 14, selon lequel ladite deuxième cassette d'expression est insérée dans un vecteur d'expression multicopie.

16. Usage selon la revendication 15, selon lequel ladite deuxième cassette d'expression est insérée dans un vecteur d'expression multicopie comprenant notamment ladite première cassette d'expression.

17. Usage selon l'une quelconque des revendications 1 a 14, selon lequel une ou plusieurs copie(s) de ladite deuxième cassette d'expression sont insérées dans le génome d'une cellule hôte, ladite cellule hôte comprenant notamment une ou plusieurs copie(s) de ladite première cassette d'expression insérée(s) soit dans le génome de la cellule hôte soit dans un vecteur multicopie.

18. Cellule hôte caractérisée en ce qu'elle comprend une première cassette et une seconde cassette telles que définies aux revendications 1 à 17.

19. Cellule hôte selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une souche de Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces sloofiae, Schizosaccharomyces malidevorans, Schizosaccharomyces octosporus et Hasegavaca japonicus.

20. Cassette d'expression comprenant un fragment d'ADN codant pour une protéine d'intérêt, placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression, lesdits éléments comportant une région promotrice régulable par la thiamine et issue du gène pho? de Schizosaccharomyses pombe.

21. Cassette d'expression selon la revendication 20, caractérisée en ce que ladite région promotrice est telle que définie selon l'une quelconque des revendications 6 à 14.

22. Vecteur d'expression comprenant une cassette d'expression selon la revendication 20 ou 21.

23. Cellule hôte caractérisée en ce qu'elle comprend une cassette d'expression selon la revendication 20 ou 21 ou un vecteur d'expression selon la revendication 22.

24. Procédé de production d'une protéine d'intérêt par une cellule hôte selon l'une quelconque des revendications 18, 19 ou 23, selon lequel:
- on cultive dans un milieu approprié en absence de thiamine ladite cellule hôte; et - on récupère ladite protéine d'intérêt.

25. Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce que la cellule hôte est une souche de Schizosaccharomyces pombe.