CA1266831A - Compositions cosmetiques renfermant des extraits lyses d'hafnia - Google Patents
Compositions cosmetiques renfermant des extraits lyses d'hafniaInfo
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- CA1266831A CA1266831A CA000480080A CA480080A CA1266831A CA 1266831 A CA1266831 A CA 1266831A CA 000480080 A CA000480080 A CA 000480080A CA 480080 A CA480080 A CA 480080A CA 1266831 A CA1266831 A CA 1266831A
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Abstract
L'invention concerne de, nouvelles compositions cosmétiques pour les soins de la peau, caractérisées en ce qu'elles renferment dans un excipient cosmétiquement acceptable, des glycoprotéines extraites de corps microbiens lysés d'Hafnia. De telles compositions sont notamment utiles pour apaiser les peaux irritées, pour protéger la peau contre les agressions extérieures et pour lutter contre le vieillissement de la peau.
Description
~L~6~;831 La presente invention concerne de nouvelles compositions cosmetiques renfermant des extraits lyses d'Hafnia.
L'invention a pour objet de nouvelles composi-tions cosmetiques pour les soins de la peau, caracterisees en ce qu'elles renferment des glycoprotines extraites de corps microbiens lyses de l'espece ou souche Hafnia prepa-rees selon les etapes successives suivantes:
a) mise en culture d'une souche microbienne d'Hafnia;
b) lyse apres complet developpement des corps microbiens;
c) delipidation et depigmentation du lysat obtenu par traitement avec un ou plusieurs solvants;
d) mise en solution du produit brut obtenu precedemment, centrifugation et ultrafiltration de la solution obtenue.
Ce procede de lyse de la souche bactexienne d'Hafnia et les glycoproteines ainsi obtenues ont deja fait l'objet du brevet ~rançais n 2378855. La souche d'Hafnia utilisee preferentiellement est celle deposee a l'Institut Pasteur a Paris sous le n 5731.
Dans ce brevet fran~ais n 2378855, les glyco-proteines obtenues apres lyse des corps Hafnia subissent une ultrafiltration avec une membrane ne retenant que les glycoproteines ayant un poids moleculaire egal ou superieur a 300 000~
Ce brevet fran~ais n 2378855 decrit aussi la tres bonne tolerance et l'application comrne medicaments anti-inflammatoires et immunostimulants des ~lycoproteines isolees d1Hafnia ayant un poids moleculaire apparent égal ou superieur à 300 000.
Cependant jamais encore n'avait ete decrite l'utilisation en cosmetologie des proprietes topiques reelles de ces extraits bacteriens.
En effet, il vient d'être demontre que ces extraits bacteriens possedent un remarquable pcuvoir anti-~2~
irritant cutané et qu'ils sont doués d'un effet stimulant sur la croissance cellulaire.
Par ailleurs, les glycoproteines extraites de corps l~sés d'Hafnia ont un pouvoir protecteur contre les agressions extérieures: soleil, chaleur, froid, deter-gents, pollution Ces différentes propriétes illustrees plus loin dans la partie experimentale, peuvent donc être avantageu-sement mises à profit en cosmetologie.
Les compositions de l'invention peuvent notamment être utilisees pour apaiser les peaux irritees, qu'elle qu'en soit la cause. Par e~emple, les compositions de l'invention peuvent être appli~uées pour apaiser les peaux à tendance acnéique.
En particulier, appliquées le matin, elles cal-ment les sensations de picotement et de brulures dûes aux traitements médicaux locaux de l'acné appliqués le soir, qui sont souvent très irritants. Elles peuvent aussi être utilisees pour calmer les rougeurs des erythèmes solaires.
Comme il a dejà ete dit plus-haut, elles protè-gent aussi efficacement la peau contre les agressions exterieures et sont donc avantageusement utilisees pour proteger les peau~ fragilisees à problemes (couperosee, rosacee...).
Par ailleurs, les proprietes regenératrices cutanees par stimulation de la croissance cellulaire des compositions se~on l'invention leur conferent une effica-cite dans la lutte contre le vieillissement de la peau.
Les compositions de l'invéntion renferment des glycoproteines obtenues par lyse des corps d'Hafnia ayant subi ou non une ultrafiltration finale.
L'ultrafiltration finale peut être celle decrite dans le brevet français n~ 2378~55 et ainsi consister en une dialfiltration utilisant une membrane poreuse presentant ~2G~L
un seuil de retention de substances dont le poids molecu-laire est egal ou supérieur à 300 000.
En fait, la membrane utilisee peut presenter un autre seuil de retention, le choix de celui-ci dependant des substances que l'on veut separer.
L'invention concerne notamment des compositions cosmetiques, caracterisees en ce qu'elles renferment des glycoproteines extraites de corps microbiens lyses d'Hafnia n'ayant pas subi d'ultrafiltration finale.
De preference, les glycoproteines correspondent aux produits intermediaires obtenus à la fin du stade C
du procede illustre aux exemples 1 et 2 du brevet français n 2378855. Ce procede comporte notamment les stades suivants:
Stade A) l'on cultive une souche d'Hafnia (Institut Pasteur 5731) dans un milieu de culture jusqu'à
developpement complet des germes;
Stade B) l'on lyse le bouillon de culture obtenu au stade A) par action du lysozyme, recueille le lysat, l'homogeneise puis le lyophilise pour obtenir une poudre;
et Stade C) l'on traite la poudre obtenue au Stade B) par l'acetone, et obtient, après filtration une poudre que l'on traite par le methanol, obtient une suspension dont on decante le surnageant par siphonage, puis filtre le reste de la solution pour enfin obtenir une poudre de glycoproteines dont les caracteristiques physico-chimiques sont donnees plus loin à l'exemple 1 de la partie experi-mentale.
Dans les compositions de l'invention, l'extrait d'Hafnia peut être utilise sous forme pulverulente ou sous forme de solution aqueuse.
L'invention concerne notamment des compositions cosmetiques, caracterisees en ce qu'elles renferment ~2~,3~
5.10 5% à 1~ en poids de glycoprotéines extraites de corps microbiens lyses d'Hafnia.
Les compositions de l'invention peuvent renfer-mer en plus des extraits lyses d'Hafnia, d'autres composes actifs ayant des proprietes cutanees particulières.
Ainsi, les compositions de l'invention peuvent contenir egalement l'acetate d'oleyle. Ce produit a des proprietes anti-lipasique et prévient directement la forma-tion de comedons et de points noir.
Les compositions ainsi obtenues renferment deux constituants qui par leur action combinee constituent un produit bien adapte aux peaux à tendance acneique.
Les compositions de l'invention peuvent aussi renfermer un compose favorisant la cicatrisation des lesions de l'acne, tel que par exemple, un extrait de Centella Asiatica et plus particulièrement un extrait gly-colique de Centella Asiatica.
D'autres substances telles que l'huile d'onagre, les acides amines peuvent aussi y être incorpores.
L'invention a donc plus particulièrement pour objet des compositions, caracterisees en ce qu'elles ren-ferment un ou plusieurs des produits suivants: acetat~
d'oleyle, extrait glycolique de Centella Asiatica, huile d'onagre, acides amines.
Les compositions cosmetiques selon l'invention peuvent se presenter sous toutes les formes utilisees en cosmetologie: creme ou gel en pots ou en tubes, lait, huile ~u lotion en flacons de verre ou de matière plasti-que et eventuellement en flacon-doseur, ampoule, aerosol.
L'invention concerne donc des compositions cosmetiques, caractérisees en ce qu'ell~s se presentent sous forme de creme, gel, lait, lotion ou huile pour la peau.
Pour chaque forme, on a recours à des excipients 12~;83~.
appropries. Ces excipients doivent avoir toutes les qualites habituellement demandées. Ils doivent être doues d'une grande affinite pour la peau, être parfaitement bien toleres, stables, presenter une consistance ade~uate, permettant une utilisation facile et agreable.
A titre d'exemples d'excipients, on peut citer les derives palmitates, stearates, les triglycerides d'acides gras, la lanoline, la glycerine, le propylène glycol (creme), l'alcool ethylique (lotion), les huiles vegetales, animales ou minerales, les cires, les mouillants, les epaississants, les stabilisants, les emulsionnants cou-ramment utilises.
Eventuellement, les compositions selon l'inven-tion peuvent contenir des filtres, des ecrans aux radiations solaires, des bloqueurs de radicaux libres et d'Oxygène singulet, des extraits vitamines, des parfums, des conser-vateurs, des anti-oxydants, des colorants.
Les differentes formes cosmetiques mentionnees ci-dessus peuvent être obtenues selon les methodes usuelles utilisees dans ce domaine.
Les exemples donnes ci-dessous illustrent l'inven-tion sans toutefois la limiter.
L'extrait bacterien d'Hafnia (souche de l'Institut Pasteur N 5731~ est ohtenu à la fin du stade C des exemples 1 et 2 du brevet français N 2378855. Pour memoire, rappe-lons que les stades A a C de l'Exemple 1 de ce brevet fran-çais n 2378855 comportent:
Stade A . culture.
On prepare un milieu de culture repondant à la formule suivante:
- extrait de viande..... OO..... O................. 690 g - chlorure de sodium........... .................. 690 g - peptone de caseine.... O....... OO.. O............ 690 g ~266~
- autolysat de levure........................... .690 g - phosphate bipotassique............ ~........... .483 g - phosphate monopotassique...................... .207 g - glucose........................... ~........... 4104 g - peptone papainique de soja.................... 2760 g - eau distillée q.s.p........................... 138 litres On prepare le mi~ieu de culture en melangeant successivement l'extrait de viande, le chlorure de sodium, la peptone de caseine, l'autolysat de levure, le phosphate bipotassique, le phosphate monopotassique dans environ 20 litres d'eau distillee. On ajuste le pH aux environs de 7.
On sterilise le milieu à 120C pendant ~0 minutes.
Les solutions de glucose et de peptone papalnique de soja sont introduites dans le milieu de culture au moment de l'ensemencement apres avoir ete sterilisees au prealable.
La souche d'Hafnia (Institut Pasteur n 5731) cultivee sur milieu gelose, est ensemencee dans 50 cm3 de milieu de culture. ~ette solution, servant d'inoculum est introduite dans le reste du bouillon de culture. On ajuste le volume total du milieu de culture a 138 litres par addi-tion d'eau distillee sterile.
Le milieu de culture est maintenu a 37C et le pH est ajuste automatiquement à 7 (par addition d'une solu-tion d'ammoniaque ou par addition d'une solution d'acide chlorhydrique).
La croissance des germes est appreciee au photo-mètre; ~e nombre de germes est calcule en fonction de la densite optique determinee en comparaison avec une courbe etalon.
Après complet developpement, soit environ après 7 heures, le milieu renferme environ 1 milliard de germes au cm3.
Stade B l~se.
A 138 litres de bouillon de culture obtenu au ~Z~31 stade A ci-dessus, on ajoute une solution aqueuse de chlorhydrate de lysozyme, (sterilisee par filtration sur membrane millipore~0,22 ~) afin d'avoir une concentration finale de 160 y de chlorh~drate de lysozyme par cm3 de milieu de culture.
On laisse en contact une heure à 56C en presence de 0,25 g d'EDTA par litre de bouillon, de 862,5 mg de mercurothiolate sodique et de 80 g de polysorbate (commer-cialise sous le nom de Tween 80t~par litre de bouillon de culture.
On poursuit la lyse pendant 7 jours à 37C dans des conditions steriles.
On recueille le lysat, homogeneise par agitation puis lyophilise.
On obtient 7900 g d'une poudre brune.
Stade C : traitement ____________________ a) Par l'acetone On met en suspension dans 138 litres d'acetone froid la totalite de la poudre obtenu au stade B ci-dessus, puis agite vigoureusement pendant 3 heures à 3500 tours/
minute.
Après 3 heures, la suspension est filtree sur verre fritte. On recueille une poudre jaune que l'on essore xapidement.
b) Par le methanol La poudre obtenue precedemment (7295 g) est mise en suspension dans 138 litres de methanol froid et agitee vigoureusement pendant 3 heures à 1500 tours/minute.
Après 3 heures, la suspension obtenue est decan-tee, la plus grande partie du surnageant est soutiree par siphonnage, le restant de la solution est filtre sur verre fritte.
La poudre essoree est sechee à temperature am-biante sous vide pendant 24 heures. On obtient alors 3988 g t (marque de commerce) d'une poudre beige claire.
Pareillement, les stades A à C de l'exemple 2 du brevet français n 2378855, comportent les stades A et B de l'exemple 1 de ce brevet françaisl sauf qu'on prepare 90 litres de lysat que l'on lyophilise pour obtenir 4570 g d'une poudre jaune-brun; et Stade C . traitement~
a~ Par l'acetone On extrait la poudre obtenue ci-dessus au moyen de 90 litres d'acetone froid, comme indique au stade C a) de l'exemple 1 du brevet francais n 2378855.
b) Par le methanol On extrait le produit obtenu ci-dessus au moyen de 90 litres de methanol froid comme indique au stade C b) de l'exemple 1 du bre~et français n 2378855. On seche a froid sous vide et obtient 1765 g d'une poudre beige.
Les extraits bacteriens d'Hafnia obtenus aux exemples 1 et 2 du brevet français n~ 2378855 presen-tent les caracteristiques suivantes:
a) Aspect : poudre beige clair hydrosoluble.
b) Analyse elementaire:
Carbone 31,6 % + 3 hy~drogene 4,9 % + 0,6 azote 6,6 % + 0,4 c) Nature et proportion des divers constituants.
Les resultats sont exprimes en moyenne ~ ecart type (*):
proteines : 26,4 % I+ 5,2*) glucides : hexoses neutres 18,3 % (+ 3,7*) acides uroniques 0,6 % (+ 0,9*) osamines 8,7 % (+ 2,4*) acides ribonucleiques 17,4 ~ (+ 2,35*) acides desoxyribonucleiques 5,4 % (+ 2~1*) humidite 8%
d) Spectre ultra violet Le spectre ultraviolet trace entre 190 nm et 350 nm a 125 mcg/ml est classique d'un produit contenant des proteines (Do 0,73 + 0,2) et des acides nucleiques (1,4 + 0,4).
e) Chromatographie de gel filtration La chromatographie de gel filtration sur Sephacryl S 300t dans un tampon carbonate d'ammonium 0,1 M
revèle la presence de 3 familles moleculaires:
- 1 famille de haut poids moleculaire ~ 300 000 de nature glycoproteique,
L'invention a pour objet de nouvelles composi-tions cosmetiques pour les soins de la peau, caracterisees en ce qu'elles renferment des glycoprotines extraites de corps microbiens lyses de l'espece ou souche Hafnia prepa-rees selon les etapes successives suivantes:
a) mise en culture d'une souche microbienne d'Hafnia;
b) lyse apres complet developpement des corps microbiens;
c) delipidation et depigmentation du lysat obtenu par traitement avec un ou plusieurs solvants;
d) mise en solution du produit brut obtenu precedemment, centrifugation et ultrafiltration de la solution obtenue.
Ce procede de lyse de la souche bactexienne d'Hafnia et les glycoproteines ainsi obtenues ont deja fait l'objet du brevet ~rançais n 2378855. La souche d'Hafnia utilisee preferentiellement est celle deposee a l'Institut Pasteur a Paris sous le n 5731.
Dans ce brevet fran~ais n 2378855, les glyco-proteines obtenues apres lyse des corps Hafnia subissent une ultrafiltration avec une membrane ne retenant que les glycoproteines ayant un poids moleculaire egal ou superieur a 300 000~
Ce brevet fran~ais n 2378855 decrit aussi la tres bonne tolerance et l'application comrne medicaments anti-inflammatoires et immunostimulants des ~lycoproteines isolees d1Hafnia ayant un poids moleculaire apparent égal ou superieur à 300 000.
Cependant jamais encore n'avait ete decrite l'utilisation en cosmetologie des proprietes topiques reelles de ces extraits bacteriens.
En effet, il vient d'être demontre que ces extraits bacteriens possedent un remarquable pcuvoir anti-~2~
irritant cutané et qu'ils sont doués d'un effet stimulant sur la croissance cellulaire.
Par ailleurs, les glycoproteines extraites de corps l~sés d'Hafnia ont un pouvoir protecteur contre les agressions extérieures: soleil, chaleur, froid, deter-gents, pollution Ces différentes propriétes illustrees plus loin dans la partie experimentale, peuvent donc être avantageu-sement mises à profit en cosmetologie.
Les compositions de l'invention peuvent notamment être utilisees pour apaiser les peaux irritees, qu'elle qu'en soit la cause. Par e~emple, les compositions de l'invention peuvent être appli~uées pour apaiser les peaux à tendance acnéique.
En particulier, appliquées le matin, elles cal-ment les sensations de picotement et de brulures dûes aux traitements médicaux locaux de l'acné appliqués le soir, qui sont souvent très irritants. Elles peuvent aussi être utilisees pour calmer les rougeurs des erythèmes solaires.
Comme il a dejà ete dit plus-haut, elles protè-gent aussi efficacement la peau contre les agressions exterieures et sont donc avantageusement utilisees pour proteger les peau~ fragilisees à problemes (couperosee, rosacee...).
Par ailleurs, les proprietes regenératrices cutanees par stimulation de la croissance cellulaire des compositions se~on l'invention leur conferent une effica-cite dans la lutte contre le vieillissement de la peau.
Les compositions de l'invéntion renferment des glycoproteines obtenues par lyse des corps d'Hafnia ayant subi ou non une ultrafiltration finale.
L'ultrafiltration finale peut être celle decrite dans le brevet français n~ 2378~55 et ainsi consister en une dialfiltration utilisant une membrane poreuse presentant ~2G~L
un seuil de retention de substances dont le poids molecu-laire est egal ou supérieur à 300 000.
En fait, la membrane utilisee peut presenter un autre seuil de retention, le choix de celui-ci dependant des substances que l'on veut separer.
L'invention concerne notamment des compositions cosmetiques, caracterisees en ce qu'elles renferment des glycoproteines extraites de corps microbiens lyses d'Hafnia n'ayant pas subi d'ultrafiltration finale.
De preference, les glycoproteines correspondent aux produits intermediaires obtenus à la fin du stade C
du procede illustre aux exemples 1 et 2 du brevet français n 2378855. Ce procede comporte notamment les stades suivants:
Stade A) l'on cultive une souche d'Hafnia (Institut Pasteur 5731) dans un milieu de culture jusqu'à
developpement complet des germes;
Stade B) l'on lyse le bouillon de culture obtenu au stade A) par action du lysozyme, recueille le lysat, l'homogeneise puis le lyophilise pour obtenir une poudre;
et Stade C) l'on traite la poudre obtenue au Stade B) par l'acetone, et obtient, après filtration une poudre que l'on traite par le methanol, obtient une suspension dont on decante le surnageant par siphonage, puis filtre le reste de la solution pour enfin obtenir une poudre de glycoproteines dont les caracteristiques physico-chimiques sont donnees plus loin à l'exemple 1 de la partie experi-mentale.
Dans les compositions de l'invention, l'extrait d'Hafnia peut être utilise sous forme pulverulente ou sous forme de solution aqueuse.
L'invention concerne notamment des compositions cosmetiques, caracterisees en ce qu'elles renferment ~2~,3~
5.10 5% à 1~ en poids de glycoprotéines extraites de corps microbiens lyses d'Hafnia.
Les compositions de l'invention peuvent renfer-mer en plus des extraits lyses d'Hafnia, d'autres composes actifs ayant des proprietes cutanees particulières.
Ainsi, les compositions de l'invention peuvent contenir egalement l'acetate d'oleyle. Ce produit a des proprietes anti-lipasique et prévient directement la forma-tion de comedons et de points noir.
Les compositions ainsi obtenues renferment deux constituants qui par leur action combinee constituent un produit bien adapte aux peaux à tendance acneique.
Les compositions de l'invention peuvent aussi renfermer un compose favorisant la cicatrisation des lesions de l'acne, tel que par exemple, un extrait de Centella Asiatica et plus particulièrement un extrait gly-colique de Centella Asiatica.
D'autres substances telles que l'huile d'onagre, les acides amines peuvent aussi y être incorpores.
L'invention a donc plus particulièrement pour objet des compositions, caracterisees en ce qu'elles ren-ferment un ou plusieurs des produits suivants: acetat~
d'oleyle, extrait glycolique de Centella Asiatica, huile d'onagre, acides amines.
Les compositions cosmetiques selon l'invention peuvent se presenter sous toutes les formes utilisees en cosmetologie: creme ou gel en pots ou en tubes, lait, huile ~u lotion en flacons de verre ou de matière plasti-que et eventuellement en flacon-doseur, ampoule, aerosol.
L'invention concerne donc des compositions cosmetiques, caractérisees en ce qu'ell~s se presentent sous forme de creme, gel, lait, lotion ou huile pour la peau.
Pour chaque forme, on a recours à des excipients 12~;83~.
appropries. Ces excipients doivent avoir toutes les qualites habituellement demandées. Ils doivent être doues d'une grande affinite pour la peau, être parfaitement bien toleres, stables, presenter une consistance ade~uate, permettant une utilisation facile et agreable.
A titre d'exemples d'excipients, on peut citer les derives palmitates, stearates, les triglycerides d'acides gras, la lanoline, la glycerine, le propylène glycol (creme), l'alcool ethylique (lotion), les huiles vegetales, animales ou minerales, les cires, les mouillants, les epaississants, les stabilisants, les emulsionnants cou-ramment utilises.
Eventuellement, les compositions selon l'inven-tion peuvent contenir des filtres, des ecrans aux radiations solaires, des bloqueurs de radicaux libres et d'Oxygène singulet, des extraits vitamines, des parfums, des conser-vateurs, des anti-oxydants, des colorants.
Les differentes formes cosmetiques mentionnees ci-dessus peuvent être obtenues selon les methodes usuelles utilisees dans ce domaine.
Les exemples donnes ci-dessous illustrent l'inven-tion sans toutefois la limiter.
L'extrait bacterien d'Hafnia (souche de l'Institut Pasteur N 5731~ est ohtenu à la fin du stade C des exemples 1 et 2 du brevet français N 2378855. Pour memoire, rappe-lons que les stades A a C de l'Exemple 1 de ce brevet fran-çais n 2378855 comportent:
Stade A . culture.
On prepare un milieu de culture repondant à la formule suivante:
- extrait de viande..... OO..... O................. 690 g - chlorure de sodium........... .................. 690 g - peptone de caseine.... O....... OO.. O............ 690 g ~266~
- autolysat de levure........................... .690 g - phosphate bipotassique............ ~........... .483 g - phosphate monopotassique...................... .207 g - glucose........................... ~........... 4104 g - peptone papainique de soja.................... 2760 g - eau distillée q.s.p........................... 138 litres On prepare le mi~ieu de culture en melangeant successivement l'extrait de viande, le chlorure de sodium, la peptone de caseine, l'autolysat de levure, le phosphate bipotassique, le phosphate monopotassique dans environ 20 litres d'eau distillee. On ajuste le pH aux environs de 7.
On sterilise le milieu à 120C pendant ~0 minutes.
Les solutions de glucose et de peptone papalnique de soja sont introduites dans le milieu de culture au moment de l'ensemencement apres avoir ete sterilisees au prealable.
La souche d'Hafnia (Institut Pasteur n 5731) cultivee sur milieu gelose, est ensemencee dans 50 cm3 de milieu de culture. ~ette solution, servant d'inoculum est introduite dans le reste du bouillon de culture. On ajuste le volume total du milieu de culture a 138 litres par addi-tion d'eau distillee sterile.
Le milieu de culture est maintenu a 37C et le pH est ajuste automatiquement à 7 (par addition d'une solu-tion d'ammoniaque ou par addition d'une solution d'acide chlorhydrique).
La croissance des germes est appreciee au photo-mètre; ~e nombre de germes est calcule en fonction de la densite optique determinee en comparaison avec une courbe etalon.
Après complet developpement, soit environ après 7 heures, le milieu renferme environ 1 milliard de germes au cm3.
Stade B l~se.
A 138 litres de bouillon de culture obtenu au ~Z~31 stade A ci-dessus, on ajoute une solution aqueuse de chlorhydrate de lysozyme, (sterilisee par filtration sur membrane millipore~0,22 ~) afin d'avoir une concentration finale de 160 y de chlorh~drate de lysozyme par cm3 de milieu de culture.
On laisse en contact une heure à 56C en presence de 0,25 g d'EDTA par litre de bouillon, de 862,5 mg de mercurothiolate sodique et de 80 g de polysorbate (commer-cialise sous le nom de Tween 80t~par litre de bouillon de culture.
On poursuit la lyse pendant 7 jours à 37C dans des conditions steriles.
On recueille le lysat, homogeneise par agitation puis lyophilise.
On obtient 7900 g d'une poudre brune.
Stade C : traitement ____________________ a) Par l'acetone On met en suspension dans 138 litres d'acetone froid la totalite de la poudre obtenu au stade B ci-dessus, puis agite vigoureusement pendant 3 heures à 3500 tours/
minute.
Après 3 heures, la suspension est filtree sur verre fritte. On recueille une poudre jaune que l'on essore xapidement.
b) Par le methanol La poudre obtenue precedemment (7295 g) est mise en suspension dans 138 litres de methanol froid et agitee vigoureusement pendant 3 heures à 1500 tours/minute.
Après 3 heures, la suspension obtenue est decan-tee, la plus grande partie du surnageant est soutiree par siphonnage, le restant de la solution est filtre sur verre fritte.
La poudre essoree est sechee à temperature am-biante sous vide pendant 24 heures. On obtient alors 3988 g t (marque de commerce) d'une poudre beige claire.
Pareillement, les stades A à C de l'exemple 2 du brevet français n 2378855, comportent les stades A et B de l'exemple 1 de ce brevet françaisl sauf qu'on prepare 90 litres de lysat que l'on lyophilise pour obtenir 4570 g d'une poudre jaune-brun; et Stade C . traitement~
a~ Par l'acetone On extrait la poudre obtenue ci-dessus au moyen de 90 litres d'acetone froid, comme indique au stade C a) de l'exemple 1 du brevet francais n 2378855.
b) Par le methanol On extrait le produit obtenu ci-dessus au moyen de 90 litres de methanol froid comme indique au stade C b) de l'exemple 1 du bre~et français n 2378855. On seche a froid sous vide et obtient 1765 g d'une poudre beige.
Les extraits bacteriens d'Hafnia obtenus aux exemples 1 et 2 du brevet français n~ 2378855 presen-tent les caracteristiques suivantes:
a) Aspect : poudre beige clair hydrosoluble.
b) Analyse elementaire:
Carbone 31,6 % + 3 hy~drogene 4,9 % + 0,6 azote 6,6 % + 0,4 c) Nature et proportion des divers constituants.
Les resultats sont exprimes en moyenne ~ ecart type (*):
proteines : 26,4 % I+ 5,2*) glucides : hexoses neutres 18,3 % (+ 3,7*) acides uroniques 0,6 % (+ 0,9*) osamines 8,7 % (+ 2,4*) acides ribonucleiques 17,4 ~ (+ 2,35*) acides desoxyribonucleiques 5,4 % (+ 2~1*) humidite 8%
d) Spectre ultra violet Le spectre ultraviolet trace entre 190 nm et 350 nm a 125 mcg/ml est classique d'un produit contenant des proteines (Do 0,73 + 0,2) et des acides nucleiques (1,4 + 0,4).
e) Chromatographie de gel filtration La chromatographie de gel filtration sur Sephacryl S 300t dans un tampon carbonate d'ammonium 0,1 M
revèle la presence de 3 familles moleculaires:
- 1 famille de haut poids moleculaire ~ 300 000 de nature glycoproteique,
- 2 familles de poids moleculaires voisins de 12 000 de nature acides nucleiques.
EXEMPLE 2 : creme pour le visage.
- extrait Hafnia.................................. 0,5 g - acetate d'oleyle.................................. 2,0 g - alcoyle phosphate de diethanol amine..... O........ 2,0 g - palmitate d'ethyl hexyle.......................... 8,0 g - lanoline hydrogenee............................... 5,0 g - triglycerides d'acides gras....................... 4,0 g - stearate de so:rbitan............................. 1,0 g - pclymere carboxyvinylique......................... 0,4 g - conservateurs....................~...................... 0,4 g - composition aromatique............................ ...... 0,4 g - eau purifiee q.s.p. 100 g E~EMPLE 3 : gel ~our le visage.
. _~
- extrait <~Hafnia................................. ...... 0,5 g - extrait glycolique de Centella Asiatica........... 5,0 g - propylene glycol.................................. 5,0 g - polymere carboxyvinylique..~..................... 0,8 g - conservateurs.................................... 0,35 g - composition aromatique........................... 0,1 g - eau purifiee q.s.p. 100 g t (marque de commerce) ~3~
EXEMPLE 4 : crème pour le corps.
- extrait aHa~nia.,,.,.,.,....................... 0,2 g - stearate de glycerol............................ 4,0 g - palmitate de sorbitan........................... 6,0 g - perhydrosqualene~............................... 5,0 g palmitate d'isopropyle.......................... 7,0 g - triglycerides d'acides gras... ..O................ 9,0 g - glycerine..................... ~.................. 5,0 g - conservateurs................................... 0,35 g - composition aromatique........ .........,......... 1,0 g - eau purifiee q.s.p.............................. 100 g EXEMPLE 5 : lotion tonique pour le_v sage.
- extrait Hafnia................................ 0,05 g - propylène glycol................................ 5,0 g 15 - - conservateurs................................... 0,3 g - composition aromatique.......................... 0,1 g - alcool ethylique.........O........................ 10,0 g - eau purifiee q.s.p............................... . 100 ml EXEMPLE 6 : lait solaire.
-- extrait Hafnia................................. .. 0,1 g - filtres solaires................................. .. 5,0 g - huile de vaselinet............................... . 10,0 g - palmitate d'isopropyle........................... 9,0 g - huile de silicone................................ 2,5 g - ether cetylique P.O.E............................ 2,C g - stearate de sorbitan............................. 1,0 g - conservateurs.................................... 0,35 g - composition aromatique........................... 0,5 g - eau purifiee q.s.p................................ 100 ml ETUDE PHARMACOLOGIQUE
a~ Tol rance cutanee Six lapins albinos de souche RIVER ont ete tondus au niveau du dos sur une sur~ace d'environ 14x14 cm De chaque côte de l'axe vertebral sont pratiquees trois t (marque de commerce) ~83~
incisions paralleles par scarification.
On depose ensuite sur la peau (zone scarifiee et non scarifiee), du côte droit, 0,5 ml d'une crème dosee a 0,05 % d'extrait lyse d'Hafnia decrit à l'exemple 1, le côte gauche servant de zone temoin.
On apprecie l'irritation cutanee respectivement 24 et 72 heures apres l'application du produit.
Les observations sont faites sur les deux zones scarifiees et non scarifiees, selon l'echelle numerique indiquee ci-apres.
Erytheme et formation d'escarres:
_ - pas d'erytheme........................................... 0 - leger erythème, à peine visible - erytheme bien visible.................................... 2 - 15 - erytheme modere a important.............................. 3 - erytheme grave (rouge pourpre), avec formation de legeres escarres, lesions profondes................... 4 Formation d'oedeme:
- pas d'oedeme........................... ~.... O............ 0 - tres leger oedème, a peine visible..... ~................. 1 - leger oedeme (contours bien definis, gonflement apparent).............................................. .. 2 - oedeme moyen (epaisseur environ 1 mm).................. .. 3 - oedème grave (epaisseur superieure a 1 mm et surface superieure à celle du carre)................... .. 4 La determination de l'indice d'irritation primaire est calculee en additionnant les chiffres obtenus pour l'erytheme et pour l'oedème, après 24 heures et 72 heures, d'une part sur les six zones non scarifiees, d'autre part sur les six zones scarifiees.
~ nsuite, il faut calculer la moyenne en divisant le total par 24. Cette moyenne represente l'indice d'irritation primaire cutanee (IP):
,~1 - non irritant IP < 0,5 - legèrement irritant 0,5 ~ IP ~ 2 - moyennement irritant 2 s IP < 5 - très irritant 5 < IP < 8 CONCLUSION
. _ .
L'ensemble de ces resultats permet de constater, qu'en utilisant la cotation officielle, la crème dosee à
0,05 ~ d'extrait lyse d'Hafnia possède un indice d'irrita-tion cutanee IP ~ 0,05, soit NON IRRITANT.
b~ Action sur la croissance cellulaire des fibroblastes en culture On teste une solution contenant des glycopro-teines d'Hafnia de l!exemple 1 à la dose de 5.10 6 g/ml sur une culture de fibroblastes de prepuce d'embryon humain.
Le milieu de culture utilise est un milieu conte-nant divers acides amines, des vitamines, des sels inorgani-ques, du glucose, du serum de veau foetal, des antibiotiques (Penicilline, Streptomycine, Fungizone, Kanamyaire), de la biotine.
Le milieu est tamponne par du bicarbonate de sodium et le pH est ajuste a 7,2.
Les cultures sont ensemencees à la concentration de 40 x 103 cellules par ml en flacons pour culture de tissu de differentes surfaces.
Les cuLtures sont placées dans une etuve thermo-statee à 37C dont l'atmosphère est regulee en CO2 (5 %).
Pour effectuer une numeration et une evaluation de la croissance cellulaire, les fibroblastes doivent être detaches du support de culture par action d'une solution de trypsine.
La numeration est effectuee au microscope à con-traste de phase. Les cellules vivantes apparaissent réfringentes.
La figure I represente l'ensembie des experiences effectuees avec la dose de 5 x 10 6 g/ml en comparaison avec les cultures temoins.
Dans toutes les experiences, l'adjonction de la solution à base d'extraits lyses d'Hafnia stimule la croissance cellulaire.
c) Recherche d'un effet sur l'erythème cutane che~ le cobave ex~ose aux radiations ultra-violettes On utilise 20 cobayes males de souche HARTLEY, pesant entre 350 et 400 grammes dont la region costale a ete rasee et epilee sur une surface de 6 cm x 3 cm.
L'erythème solaire est realise par irradiation d'U.V. au moyen d'une lampe a usage therapeutique, a tube à quartz.
Pour empêcher l'irradiation U.V. de tout l'animal, celui-ci est habille d'un corset de tissu epais presentant quatre perforations circulaires de 8 mm de diamètre cha-cune (=spots d'irridiation).
On applique au niveau de ~ spots (les 2 autres spots servant de temoins) immediatement après l'exposition, 0,25 ml d'une creme contenant l'extrait lyse d'Hafnia decrit à l'exemple 1.
Les concentra-tions etudiees sont 0,01 ~ et 0,05 %.
Deux heures après l'irradiation, on note l'inten-site de l'erythème obtenu au niveau des spots, selon une 25echelle de 0 à 3.
Cotation 0......................... pas d'erythème 1.................. ~...... spot juste discernable 2......................... erytheme plus accuse
EXEMPLE 2 : creme pour le visage.
- extrait Hafnia.................................. 0,5 g - acetate d'oleyle.................................. 2,0 g - alcoyle phosphate de diethanol amine..... O........ 2,0 g - palmitate d'ethyl hexyle.......................... 8,0 g - lanoline hydrogenee............................... 5,0 g - triglycerides d'acides gras....................... 4,0 g - stearate de so:rbitan............................. 1,0 g - pclymere carboxyvinylique......................... 0,4 g - conservateurs....................~...................... 0,4 g - composition aromatique............................ ...... 0,4 g - eau purifiee q.s.p. 100 g E~EMPLE 3 : gel ~our le visage.
. _~
- extrait <~Hafnia................................. ...... 0,5 g - extrait glycolique de Centella Asiatica........... 5,0 g - propylene glycol.................................. 5,0 g - polymere carboxyvinylique..~..................... 0,8 g - conservateurs.................................... 0,35 g - composition aromatique........................... 0,1 g - eau purifiee q.s.p. 100 g t (marque de commerce) ~3~
EXEMPLE 4 : crème pour le corps.
- extrait aHa~nia.,,.,.,.,....................... 0,2 g - stearate de glycerol............................ 4,0 g - palmitate de sorbitan........................... 6,0 g - perhydrosqualene~............................... 5,0 g palmitate d'isopropyle.......................... 7,0 g - triglycerides d'acides gras... ..O................ 9,0 g - glycerine..................... ~.................. 5,0 g - conservateurs................................... 0,35 g - composition aromatique........ .........,......... 1,0 g - eau purifiee q.s.p.............................. 100 g EXEMPLE 5 : lotion tonique pour le_v sage.
- extrait Hafnia................................ 0,05 g - propylène glycol................................ 5,0 g 15 - - conservateurs................................... 0,3 g - composition aromatique.......................... 0,1 g - alcool ethylique.........O........................ 10,0 g - eau purifiee q.s.p............................... . 100 ml EXEMPLE 6 : lait solaire.
-- extrait Hafnia................................. .. 0,1 g - filtres solaires................................. .. 5,0 g - huile de vaselinet............................... . 10,0 g - palmitate d'isopropyle........................... 9,0 g - huile de silicone................................ 2,5 g - ether cetylique P.O.E............................ 2,C g - stearate de sorbitan............................. 1,0 g - conservateurs.................................... 0,35 g - composition aromatique........................... 0,5 g - eau purifiee q.s.p................................ 100 ml ETUDE PHARMACOLOGIQUE
a~ Tol rance cutanee Six lapins albinos de souche RIVER ont ete tondus au niveau du dos sur une sur~ace d'environ 14x14 cm De chaque côte de l'axe vertebral sont pratiquees trois t (marque de commerce) ~83~
incisions paralleles par scarification.
On depose ensuite sur la peau (zone scarifiee et non scarifiee), du côte droit, 0,5 ml d'une crème dosee a 0,05 % d'extrait lyse d'Hafnia decrit à l'exemple 1, le côte gauche servant de zone temoin.
On apprecie l'irritation cutanee respectivement 24 et 72 heures apres l'application du produit.
Les observations sont faites sur les deux zones scarifiees et non scarifiees, selon l'echelle numerique indiquee ci-apres.
Erytheme et formation d'escarres:
_ - pas d'erytheme........................................... 0 - leger erythème, à peine visible - erytheme bien visible.................................... 2 - 15 - erytheme modere a important.............................. 3 - erytheme grave (rouge pourpre), avec formation de legeres escarres, lesions profondes................... 4 Formation d'oedeme:
- pas d'oedeme........................... ~.... O............ 0 - tres leger oedème, a peine visible..... ~................. 1 - leger oedeme (contours bien definis, gonflement apparent).............................................. .. 2 - oedeme moyen (epaisseur environ 1 mm).................. .. 3 - oedème grave (epaisseur superieure a 1 mm et surface superieure à celle du carre)................... .. 4 La determination de l'indice d'irritation primaire est calculee en additionnant les chiffres obtenus pour l'erytheme et pour l'oedème, après 24 heures et 72 heures, d'une part sur les six zones non scarifiees, d'autre part sur les six zones scarifiees.
~ nsuite, il faut calculer la moyenne en divisant le total par 24. Cette moyenne represente l'indice d'irritation primaire cutanee (IP):
,~1 - non irritant IP < 0,5 - legèrement irritant 0,5 ~ IP ~ 2 - moyennement irritant 2 s IP < 5 - très irritant 5 < IP < 8 CONCLUSION
. _ .
L'ensemble de ces resultats permet de constater, qu'en utilisant la cotation officielle, la crème dosee à
0,05 ~ d'extrait lyse d'Hafnia possède un indice d'irrita-tion cutanee IP ~ 0,05, soit NON IRRITANT.
b~ Action sur la croissance cellulaire des fibroblastes en culture On teste une solution contenant des glycopro-teines d'Hafnia de l!exemple 1 à la dose de 5.10 6 g/ml sur une culture de fibroblastes de prepuce d'embryon humain.
Le milieu de culture utilise est un milieu conte-nant divers acides amines, des vitamines, des sels inorgani-ques, du glucose, du serum de veau foetal, des antibiotiques (Penicilline, Streptomycine, Fungizone, Kanamyaire), de la biotine.
Le milieu est tamponne par du bicarbonate de sodium et le pH est ajuste a 7,2.
Les cultures sont ensemencees à la concentration de 40 x 103 cellules par ml en flacons pour culture de tissu de differentes surfaces.
Les cuLtures sont placées dans une etuve thermo-statee à 37C dont l'atmosphère est regulee en CO2 (5 %).
Pour effectuer une numeration et une evaluation de la croissance cellulaire, les fibroblastes doivent être detaches du support de culture par action d'une solution de trypsine.
La numeration est effectuee au microscope à con-traste de phase. Les cellules vivantes apparaissent réfringentes.
La figure I represente l'ensembie des experiences effectuees avec la dose de 5 x 10 6 g/ml en comparaison avec les cultures temoins.
Dans toutes les experiences, l'adjonction de la solution à base d'extraits lyses d'Hafnia stimule la croissance cellulaire.
c) Recherche d'un effet sur l'erythème cutane che~ le cobave ex~ose aux radiations ultra-violettes On utilise 20 cobayes males de souche HARTLEY, pesant entre 350 et 400 grammes dont la region costale a ete rasee et epilee sur une surface de 6 cm x 3 cm.
L'erythème solaire est realise par irradiation d'U.V. au moyen d'une lampe a usage therapeutique, a tube à quartz.
Pour empêcher l'irradiation U.V. de tout l'animal, celui-ci est habille d'un corset de tissu epais presentant quatre perforations circulaires de 8 mm de diamètre cha-cune (=spots d'irridiation).
On applique au niveau de ~ spots (les 2 autres spots servant de temoins) immediatement après l'exposition, 0,25 ml d'une creme contenant l'extrait lyse d'Hafnia decrit à l'exemple 1.
Les concentra-tions etudiees sont 0,01 ~ et 0,05 %.
Deux heures après l'irradiation, on note l'inten-site de l'erythème obtenu au niveau des spots, selon une 25echelle de 0 à 3.
Cotation 0......................... pas d'erythème 1.................. ~...... spot juste discernable 2......................... erytheme plus accuse
3......................... erytheme très visible On etabli-t la moyenne du degré d'erytheme pour chaque groupe et on l'exprime ensuite en pourcentage de protection par rapport aux spots temoins.
~2~1 Moyenne de la cotation Moyenne de la cotation des témoins - des traités - x 100 Moyenne de la cotation des temoins Resultats : Les pourcentages d'activite inhibitrice sur le développement de l'érythème cutané expérimental sont les suivants:
- crème dosée à 0,01 ~ d'extrait lysé d'Hafnia....... 32,2 %
- crème dosée a 0,05 % d'extrait lyse d'Hafnia....... 44 %
d) Action sur la denaturation des proteines (serum albumine) par la chaleur : test de Mizuschima Principe du test de Mizuschima Les substances antiinflammatoires protègent les proteines (serum album~ne) de la dénaturation par la chaleur en milieu tamponné acide.
~2~3~
Resultats_du dosage nephelom ~
._ ......... ... _ ._ Densite optique a Produit 650 D m DO moyenne ler 2e 3è
essai essai essai _ _ Temoin avec serum albumine bovine à0,71 0,66 0,69 0,58 Extrait lyse d'Hafnia de 0,41 0,40 0,48 0,43 l'exe~ple 1:1 mg/ml _ _ ~
2 mg/ml 0,29 0,28 0,32 0,30 ._ _ . _ .
2,5 mg/ml 0,23 0,20 0,22 0,22 _ __ . _ _ _ 3 mg~ml 0,20 0,19 0,21 0,20 5 mg/ml 0,02 0,03 0,02 0,02 _ _ __ .. ._ ._ 10 mg/ml0,01 0,01 0,01 0,01 L'extrait a base de glycoproteines lysees d'Hafnia exerce un effet protecteur contre la denaturation de la serum albumine pax la chaleur.
~2~1 Moyenne de la cotation Moyenne de la cotation des témoins - des traités - x 100 Moyenne de la cotation des temoins Resultats : Les pourcentages d'activite inhibitrice sur le développement de l'érythème cutané expérimental sont les suivants:
- crème dosée à 0,01 ~ d'extrait lysé d'Hafnia....... 32,2 %
- crème dosée a 0,05 % d'extrait lyse d'Hafnia....... 44 %
d) Action sur la denaturation des proteines (serum albumine) par la chaleur : test de Mizuschima Principe du test de Mizuschima Les substances antiinflammatoires protègent les proteines (serum album~ne) de la dénaturation par la chaleur en milieu tamponné acide.
~2~3~
Resultats_du dosage nephelom ~
._ ......... ... _ ._ Densite optique a Produit 650 D m DO moyenne ler 2e 3è
essai essai essai _ _ Temoin avec serum albumine bovine à0,71 0,66 0,69 0,58 Extrait lyse d'Hafnia de 0,41 0,40 0,48 0,43 l'exe~ple 1:1 mg/ml _ _ ~
2 mg/ml 0,29 0,28 0,32 0,30 ._ _ . _ .
2,5 mg/ml 0,23 0,20 0,22 0,22 _ __ . _ _ _ 3 mg~ml 0,20 0,19 0,21 0,20 5 mg/ml 0,02 0,03 0,02 0,02 _ _ __ .. ._ ._ 10 mg/ml0,01 0,01 0,01 0,01 L'extrait a base de glycoproteines lysees d'Hafnia exerce un effet protecteur contre la denaturation de la serum albumine pax la chaleur.
Claims (10)
1. Compositions cosmétiques pour les soins de la peau, caractérisées en ce qu'elles renferment dans un excipient cosmétiquement acceptable, des glycoprotéines extraites de corps microbiens lysés de l'espèce ou souche Hafnia préparées selon les étapes successives suivantes:
a) mise en culture d'une souche microbienne d'Hafnia;
b) lyse après complet développement des corps microbiens;
c) délipidation et dépigmentation du lysat obtenu par traitement avec un ou plusieurs solvants;
d) mise en solution du produit brut obtenu précé-demment, centrifugation et ultrafiltration de la solution obtenue.
a) mise en culture d'une souche microbienne d'Hafnia;
b) lyse après complet développement des corps microbiens;
c) délipidation et dépigmentation du lysat obtenu par traitement avec un ou plusieurs solvants;
d) mise en solution du produit brut obtenu précé-demment, centrifugation et ultrafiltration de la solution obtenue.
2. Compositions selon la revendication 1, carac-térisées en ce qu'elles renferment des glycoprotéines ex-traites de corps microbiens lysés d'Hafnia n'ayant pas subi d'ultrafiltration finale.
3. Compositions selon la revendication 1 ou 2, caractérisées en ce qu'elles renferment 5.10 5 % à 1 % en poids de glycoprotéines extraites de corps microbiens lysés d'Hafnia.
4. Compositions selon la revendication 1 ou 2, caractérisées en ce qu'elles renferment en outre un ou plusieurs des produits choisis dans le groupe comprenant l'acétate d'oléyle, l'extrait glycolique de Centella Asiatica, l'huile d'onagre et les acides aminés.
5. Compositions selon la revendication 1 ou 2, caractérisées en ce qu'elles se présentent sous forme de crème, gel, lait, lotion ou huile pour la peau.
6. Usage des glycoprotéines extraites de corps microbiens lysées de l'espèce en souche Hafnia en cosmétologie.
7. Usage des glycoprotéines extraites de corps microbiens lysées de l'espèce en souche Hafnia comme agent anti-irritant cutané.
8. Usage des glycoprotéines extraites de corps microbiens lysées de l'espèce en souche Hafnia pour stimuler la croissance cellulaire.
9. Usage des glycoprotéines extraites de corps microbiens lysées de l'espèce en souche Hafnia comme agent protecteur contre les agressions extérieures.
10. Usage selon la revendication 6, 7, 8 ou 9, caractérisé en ce que lesdites glycoprotéines sont préparées selon les étapes successives suivantes:
a) mise en culture d'une souche microbienne d'Hafnia;
b) lyse après complet développement des corps microbiens;
c) délipidation et dépigmentation du lysat obtenu par traitement avec un ou plusieurs solvants;
d) mise en solution du produit brut obtenu précédemment, centrifugation et ultrafiltration de la solution obtenue.
a) mise en culture d'une souche microbienne d'Hafnia;
b) lyse après complet développement des corps microbiens;
c) délipidation et dépigmentation du lysat obtenu par traitement avec un ou plusieurs solvants;
d) mise en solution du produit brut obtenu précédemment, centrifugation et ultrafiltration de la solution obtenue.
Applications Claiming Priority (2)
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