BRPI9710828B1

BRPI9710828B1 - processo para a produção da proteína do interferon beta-cis humano recombinante e proteína de interferon beta-cis humano recombinante

Info

Publication number: BRPI9710828B1
Application number: BRPI9710828A
Authority: BR
Inventors: Fiorini De Carvalho Alex; Antonio Bonjardim Cláudio; Geessien Kroon Erna; Cesar Peregrino Ferreira Paulo; Rolland Golgher Romain
Original assignee: Univ Minas Gerais
Priority date: 1997-12-18
Filing date: 1997-12-18
Publication date: 2018-09-04

Abstract

patente de invenção para o <b>"processo para produção da proteína do interferon beta- cis humano recombinante e proteína de interferon beta-cis humano recombinante"<d>. a presente invenção diz respeito a proteína de interferon beta-cis humano e do processo de produção da proteina beta-cis humano recombinante produzida através de técnicas de engenharia genética, para ser empregada em uso clínico humano ou veterinário ou ainda em pesquisa. o dna contendo o gene para a proteína interferon beta-cis humano foi obtido realizando-se as seguintes etapas: (1) cultivo primário de células amnióticas humanas ,(2) infecção com o vírus sendai, (3)obtenção de mrna, (4) lise das células,(5) fracionamento de rna, (6) dissolução de rna, (7) extração de rna, (8) precipitação de rna, (9) sintese de primeira fita de cdna, (10) amplificação do dna, (11) fracionamento do dna, (12) purificação do dna, (13) digestão do dna, (14) clonagem, (15) ligação do dna ao vetor, 16) transformação das bactérias competentes, (17) seleção dos clones positivos, (18) seqüenciamento dos clones, (19) produção da proteína, (20) indução da bactéria,(21) lise da bactéria,(22) purificação da proteína. sendo que a proteína de interferon beta-cis humano recombinante apresenta na sua estrutura a seguinte seqüência de aminoácidos: met-ser-tyr-asn-leu-leu-gly-phe-leu-arg-ser-ser-asn-phe-gln-cys-gln-lys-leu-leu-trp-gln-leu-asn-gly-arg-leu-glu-tyr-asp-leu-lys-asp-arg-met-asn-phe-asp-ile-pro-glu-glu-ile-lys-gln-leu-gln-gln-phe-gln-lys-glu-asp-ala-ala-leu-thr-ile-<b>cys<d>-glu-met-leu-gln-asn-ile-phe-ala-ile-phe-arg-gln-asp-ser-ser-ser-thr-gly-trp-asn-glu-thr-ile-val-glu-asn-leu-leu-ala-asn-val-tyr-his-gln-ile-asn-his-leu-lys-thr-val-leu-glu-glu-lys-leu-glu-lys-glu-asp-phe-thr-arg-gly-lys-leu-met-ser-ser-leu-his-leu-lys-arg-tyr-tyr-gly-arg-ile-leu-his-tyr-leu-iys-ala-lys-glu-tyr-ser-his-cys-ala-trp-thr-ile-val-arg-val-glu-ile-leu-arg-asn-phe-tyr-phe-ile-asn-arg-leu-thr-gly-tyr-leu-arg-asn

Description

(54) Título: PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DA PROTEÍNA DO INTERFERON BETA-CIS HUMANO RECOMBINANTE E PROTEÍNA DE INTERFERON BETA-CIS HUMANO RECOMBINANTE (51) Int.CI.: A61K 38/21; C07K 14/565; C12N 5/073; C12N 15/22; C12N 15/70 (73) Titular(es): UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS (72) Inventor(es): PAULO CESAR PEREGRINO FERREIRA; ROMAIN ROLLAND GOLGHER; ERNA GEESSIEN KROON; CLÁUDIO ANTONIO BONJARDIM; ALEX FIORINI DE CARVALHO (66) Prioridade Interna: PI9606270-3 de 18/12/1996 (85) Data do Início da Fase Nacional: 18/12/1997

Relatório descritivo da patente de invenção para o “PROCESSO PARA PRODUÇÃO DA PROTEÍNA DO INTERFERON BETA- CIS HUMANO RECOMBINANTE E/PROTEÍNA DE INTERFERON BETA-CIS HUMANO RECOMBINANTE”.-/

A presente invenção refere-se ao campo geral da tecnologia do DNA recombinante e engenharia de proteínas, para a produção da proteína de interferon beta-cis mutante humano, para ser empregada em uso clínico humano ou veterinário ou ainda em pesquisa.

’, Interferon (IFN) foi a designação dada por ISSACS and LINDENMAN,

Proc. R. Soc. B.147:258-260,1957, ao fator solúvel liberado no meio de cultura de células infectadas com vírus que ao interagir com outra célula erâ capaz de induzir a resistência à infecção viral. Hoje, sabe-se que os IFNs constituem uma família heterogênea de proteínas que além da atividade antiviral, são também importantes na regulação do crescimento, diferenciação celular e na imunoregulação dos sistemas biológicos.

O IFN atua se ligando à receptores específicos localizados na superfície celular, ativando desta forma a transdução de sinais citoplasmáticos que induzirão no núcleo uma série de genes responsáveis pelas atividades do IFN (JOKLIK, W.KJnterferons, ln: FIELDS, B.N.AND ΚΝΙΡΕ,ΰ.Μ. (Ed.)Virology,

2a. Ed.-New York, Raven Press Ltd., cap.16, p.383-410, 1990).

- Os IFNs consistem de proteínas de três classes antigênicas : A, B e G e são produzidos por céluías de vertebrados em resposta à uma grande variedade de estímulos. Os IFNs A e B também chamados IFN tipo I, são produzidos por leucócitos e fibroblastos respectivamente, em resposta à infecção viral, RNA de fita dupla, endotoxinas e exotoxinas bacterianas, micoplasma, ricketsia e a indutores sintéticos como polinucleotídeos, etc.. O IFN G também chamado IFN tipo II, é produzido por células T e NK (natural killer) após ativação por antígenos ou agentes mitogênicos como a fitohemaglutinina e a concanavalina-A.. Este IFN não está relacionado estruturalmente aos IFNs tipo IfJOKLIK, W.KJnterferons In: FIELDS, B.N.AND KNIPE.D.M. (Ed. JVirolOyy, 2a. Ed.-New York , Raven Press Ltd., cap.16, p.383-410, 1990).

Os IFNs A e B possuem homologia de 50% na sequência de nucleotídeos (DRON, M., TOVEY, M.G. Interferon α/β gene structure and regulation, In: BARON, S. (Ed.) The Interferon, principies and medicai applications, 1a. Ed.-University of Texas Medicai Branch at Galveston, p.3343,1992) enquanto a homologia da seqüência de aminoácidos (a.a.) é de apenas 30% (HAVELL, E.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 72: 2185-2189, 1975). Os IFNs tipo I humanos estão localizados no braço curto do cromossomo 9, formando um único cluster de genes.

Em todas as espécies de mamíferos estudadas, os IFNs A são codificados por uma família de genes estreitamente relacionados antigênica e estruturalmente. No homem, esta família é constituída de 15 genes não alélicos e 9 pseudogenes localizados no braço curto do cromossomo 9 , 45 (ΗΕΝΟΟ,Κ et al., J. Mol. Biol., 185:227-235, 1985, JOKLIK, W.K, Interferons

In: FIELDS, B.N.AND KNIPE,D.M. (Ed.)ViroIogy, 2a. Ed.-New York , Raven Press Ltd., cap.16, p.383-410, 1990). Os genes do HulFN A possuem homologia que varia de 80 a 100% e não possuem introns. Os genes dos 1FN A 1 e IFN A 13, são idênticos mas são codificadas em dois distintos locus (DRON, M, TOVEY, M.G. interferon α/β gene structure and regulation, tn: BARON, S. (Ed.) The Interferon, principies and medicai applications, 1a. Ed.-University of Texas Medical Branch at Galveston, p.33-43, 1992).

Todos os membros da família dos IFNs A possuem uma seqüência de 165 a 166 a.a., dos quais 4 cisteínas (Cys) são altamente conservadas nas posições 1; 29; 98; 99 ou 100; 138 ou 139; e são responsáveis pela ligação intramolecular de pontes de dissulfeto (ligações S-S). As ligações S-S que ocorrem entre as Cys 1; 98; 99 ou 100 e entre a Cys 29 e 138 ou 139 são importantes na estabilização da estrutura do IFN A (WETZEL, R. et al., J. Interferon Res, 1:381-389,1981). A ligação entre as duas últimas Cys são imprescindíveis na manutenção da atividade biológica deste IFN (SENDA, Τ,ΕΜΒΟ J, 11: 3193-3201 etal., 1992).

Vários subtipos de IFN A são glicosiladas e apesar de estruturalmente relacionadas, exercem diferentemente as atividades antivirais, imunoregulatórias e antiproliferativas (ZOON,K.C. et al.,Human Interferon α family: Protein structure and function In: BARON, S. (Ed.) The Interferon, principies and medical applications, 1a. Ed.-University of Texas Medical Branch at Galveston, p130-138,1992).

Outro HulFN estruturalmente relacionado ao IFN A I, que possui homologia de 60% ao nível de aa. foi classificado como IFN AII (CAPON, D.J, et al., Mol. Cell Biol., 5: 768-779, 1985) sendo atualmente denominado IFN W(AD0LF, G.R., et al, J. Gen. Virol, 68: 1669-1676,1987). Este IFN é produzido por leucócitos após estímulo vírico e representa 15% da população dos IFNs leucocitários (ADOLF, G.R, et al, Virology, 175: 410-417, 1990). Seu gene possui homologia de 70% com os genes do HulFN A e codifica uma proteína de 172 a.a, neutralizada apenas por ac (anticorpos) monoclonais antilFN W. Este tipo de IFN foi encontrado em humanos, bovinos, eqüinos e ovinos (ADOLF et al, Biochim. Biophys. Acta, 1089: 167-174, 1991).

IFN B é produzido por fibroblastos e é uma glicoproteína com massa molecular relativa de 22-23 kDa e atividade antiviral específica de 2-5x10θ unidades internacionais (Ul)/mg de proteína. Este IFN é codificado por um único gene localizado no cromossomo 9, não possui introns e codifica uma proteína de 166 a.a.. O IFN B de bovinos, suínos e caprinos são codificados por múltiplos genes (DE MAEYER, E.M. and DE MAEYER-GUIGNARD, J Interferon and other regulatory cytokines, John Wiley and Sons, New York, 1988).

A estrutura terciária do MulFN B (IFN B murino) obtida por SENDA, Τ,ΕΜΒΟ J, 11: 3193-3201 et al, 1992 através da difração de raios X da proteína demonstrou que a estrutura do MulFNp consiste de 5 α hélices. O fato da sequência de a.a. do MulFN B possuir homologia de 49% com o HulFN B e

desta homologia ocorrer em regiões específicas da molécula é indicativo de que a estrutura terciária destes lFNs possa ser semelhante (UTSUMIJ. and SHIMIZU, H., Human Interferon β, protein structure and function, In: BARON,

S. (Ed.) The Interferon, principies and medicai applications, 1a. Ed.University of Texas Medicai Branch at Galveston, 5: 107-116, 1992). Segundo SENDA Τ.,ΕΜΒΟ J., 11: 3193-3201 et al., 1992, os IFN A e B devem possuir estrutura terciária semelhante devido à similaridade entre suas estruturas _çprimárias. tf

O HulFN B natural possui várias cadeias de açúcares ligadas à Asparagina 80, sendo que 82% destas são um complexo biantenário de cadeias de açúcares nos quais estão ligados vários resíduos de N-lactosamína (KAGAWA, Y. et al.,J. Biol. Chem., 263: 17508-17513, 1988). Um padrão semelhante foi observado no HulFN B recombinante expresso em células CHO. Entretanto, foram detectados resíduos de galactosamina no HulFN B expresso em células PC8 e C127. Este açúcar não é encontrado no HulFN B natural .Apesar dos HulFN B possuírem a mesma seqüência polipeptídica verificou-se que diferentes padrões de glicosilação ocorrem dependendo das células nas quais o IFN é expresso (UTSUMI,J. and SHIMIZU, H., Human Interferon β, protein structure and function, In: BARON, S. (Ed.) The Interferon, principies and medicai applications, 1a. Ed.-University of Texas Medicai Branch at Galveston, 5:107-116,1992).

Estudos comparativos entre o HulFN B e o HulFN A 1 demonstraram que estas duas proteínas são estruturalmente relacionadas. Dos 166 a.a., 48 (29%) estão localizados nas mesmas posições. Existem dois domínios onde há maior homologia, estando o primeiro entre os a.a. 28 e 80 (41% de homologia) e o segundo entre as posições 115 e 151 (54% de homologia). Os a.a. triptofano, fenilalanina, arginina, cisteína e tirosina são os mais conservados entre as duas moléculas. Estes são os a.a. geralmente conservados entre moléculas estruturalmente relacionadas (TANIGUCHI, T.,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77: 4003-4006, 1980).

É amplamente aceito que existem dois tipos de receptores de IFN sendo um que interage com IFNs tipo I (UZÉ, G., et al., Cell, 60: 225-230, I990), e outro que interage com IFN tipo II (AGUET, M et al., Cell, 55: 273-280, I988).

Todas as espécies de IFNs A, B, W e TP-1 parecem se ligar ao mesmo receptor, mas as interações são diferentes de um interferon para outro. Até o momento não se pode excluir a possibilidade de múltiplos receptores ou de um receptor que consiste de várias sub-unidades que interagem com as várias espécies de IFNs (MARIANO, T.M., et al., Structure and function of the type I interferon receptor, In: BARON, S. (Ed.) The Interferon, principies and medicai applications, 1a. Ed.-University of Texas Medicai Branch at Galveston, p. 130-138, 1992).

O IFN B possui 3 resíduos de cisteína (Cys) nas posições 17, 31 e 141.

As duas Cys 31 e 141 estão ligadas formando uma ponte dissulfeto enquanto que a Cys 17 se mantém livre. Os estudos iniciais do gene do HulFN B por mutagènese sítio dirigida (MARK, D.F., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81:

5662-5666, 1984), na Cys 17 por uma serina(HulFN B Ser 17), mostraram que este IFN apresentou o mesmo espectro de atividades biológicas do IFN B tais como a atividade anticelular, antiproliferativa, ativação de células NK e neutralização ac anti HulFN B.Além disso, o HulFN B Ser 17 apresentou maior estabilidade que o HulFN B natural quando incubado a -70°C.

Em outro experimento, SHEPARD.H.M. et al., Nature , 294:563-565, 1981, trocou a Cys 141 por uma tirosina (Tir). O IFN B Tir 141 além de ser biologicamente inativo, não se Jigou ao ac anti HulFN B e não competiu com o receptor de IFN tipo I. Os resultados sugerem que a Cys 17 não é necessária à atividade biológica do IFN B enquanto que a ligação Cys 31/Cys 141 poderia estar envolvida na formação da estrutura terciária correta do IFN.

Por outro lado, REDLICH, P.N. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88:4040-4044, 1991, utilizando anticorpos monoclonais dirigidos contra 159 peptídeos sintéticos deduzidos a partir da sequência de a.a. do HulFN B Ser 17, concluiu que a região compreendida entre os a.a. 32 a 56 é muito importante na expressão da atividade biológicado HulFN B. Esta região, de acordo com estrutura tridimensional do MulFN B, constitui o loop existente entre a α hélice A e a α hélice B além de ser uma região bastante conservada entre os IFNs A e B. A região da molécula correspondente à α hélice D e ao loop D-E, ambas regiões conservadas, também estão envolvidas na atividade biológica do IFN B (SENDA, Τ.,ΕΜΒΟ J., 11: 3193-3201 etal., 1992).

Outras regiões também foram descritas como importantes para a ligação do receptor, como a região 93 a 150 demonstrada pelo uso de recombinantes híbridos (MEISTER, A. et al., J. Gen Virol. , 67:1633-1643, 1986). A presença de dois resíduos em HulFN-A1, de lisina na posição 121 e arginina na posição 125, aumenta a atividade em células murinas. Interessantemente estes mesmos aminoácidos são encontrados nas mesmas posições nos MulFN A. Estas observações sugerem que a parte N-terminal da molécula dos IFNs A influenciam fortemente a atividade em células humanas enquanto que a composição de aminoácidos do C-terminal é mais importante para a atividade em células murinas.

ORCHANSKY, P.L., et al.,J. Interferon Res., 12 (suppl.1): S91, 1992, utilizando técnicas de mutação sítio dirigida, introduziu na região carboxi terminal da molécula do HulFN B uma seqüência de 24 a.a. sendo um deles uma Cys. A molécula híbrida, a qual continha quatro Cys,foi expressa em células de ovário de hamster chinês (CHO) e apresentou maior estabilidade que o HulFN B quando incubada a 4°C além de maior atividade específica. Segundo a autora, uma segunda Cys promoveu a ligação de pontes S-S com a Cys 17 livre sendo esta responsável pelas alterações observadas.

Os mecanismos através dos quais os IFNs induzem o estado antiviral têm sido bastante estudados. É aceito que a ativação da enzima 2'5‘ oligoadenilato sintetase e da proteína quinase dependente de RNA de fita dupla (dsRNA) são importantes etapas na ação inibitória dos IFNs contra vírus (PESTKA, S., etal., Ann. Rev. Biochem., 56:727-777, 1987).

A indução da 2'-5'A oligoadenilato sintetase resulta na geração de oligonucteotídeos com estrutura ppp (A2'P)nA, que por sua vez ativam uma RNAseL latente. A RNAse degrada RNA de fita simples (ssRNA) tanto viral quanto celular e .dependendo do sistema celular, existem evidências de que esta via é efetiva na ação antiviral contra o vírus EMC e outros picornavírus (KUMAR, R., J. Virol., 62:3175-3181, 1988). Por outro lado, existem evidências de que a via da 2'-5'A sintetase não esteja envolvida no efeito inibitório contra o vírus VSV. A inibição da multiplicação do VSV pelos IFNs se dá por outra via na qual a tradução do mRNA do VSV é especificamente inibido (MASTER, P.S. and SAMUEL, C.E., J. Biol. Chem.,258: 12026-12033, 1983). Em células tratadas com IFN, são induzidas diferentes formas da enzima 2'-5'A sintetase as quais revelaram uma heterogeneidade estrutural e funcional . Diferenças também foram detectadas nos genes que codificavam para as diferentes formas. A forma menor induzida em células humanas possui 4 kDa e confere resistência à infecção viral por picornavírus enquanto que a forma de PM maior (100 kDa) parece estar envolvida no processamento por splicing do mRNA (CHEBATH, J. and REVEL, M., The 2-5A synthetases, species and functions, In: BARON, S. (Ed.) The Interferon, principies and medicai applications, 1a. Ed.-University of Texas Medicai Branch at Galveston, p.222-236,1992).

Outro mecanismo pelo qual o IFN induz o estado antiviral envolve o aumento da tradução de uma proteína quinase inativa de 67 kDa, denominada P1. Em presença de dsRNA ou de vírus, esta quinase é ativada e fosforila a subunidade menor do fator de iniciação da síntese de proteínas, o elF-2, inibindo,assim, a iniciação da tradução. A quantidade desta proteína quinase ( PI / eir-2 α )na célula é regulada inicialmente ao nível transcricional pelo IFN. Entretanto, a quantidade da proteína quinase ativa é regulada ao nível póstraducional por fatores de ativação ou de inibição viral, alguns dos quais são moléculas de RNA (SAMUEL, C.E., The RNA-dependent P1/e IF-2 α protein kinase, In: BARON, S. (Ed.) The Interferon, principies and medicai applications, 1a. Ed.-University of Texas Medicai Branch at Galveston, p.237248, 1992). Os adenovírus, Epstein-Barr vírus e os vírus da imunodeficiência adquirida bloqueiam a ativação da P1/elF-2 através da produção de pequenas moléculas de RNA que se ligam à proteína P1 impedindo sua ativação (MATHEWS, M.B. and SHENK, T., J.Virol., 65:5657-5660, 1991).

Os IFNs exercem potentes efeitos antitumorais através de uma variedade de mecanismos. Eles envolvem ações diretas ou indiretas como o efeito antiproliferativo; o efeito citotóxico; o aumento da expressão de antígenos na superfície celular de células tumorais; a ativação de macrófagos e monócitos; a ativação de células T; a ativação de células NK e a modulação da produção de anticorpos.

Os efeitos antitumorais diretos dos IFNs incluem o efeito antiproliferativo, efeito citotóxico e aumento da expressão de antígenos de superfície, tais como os antígenos de MHC Classe I. Efeitos benéficos não têm sido demonstrado in vitro mas sim in vivo (BALKWILL, F.R. et al., J.lnterferon *

Res., 3:319-323, I983). Num modelo de metástase experimental os IFNs mostraram inibir a formaçao de metástase pulmonar (RAMANI, P. and BALKWILL, F.R., Br.J.Câncer, 58:350, I983). Nos últimos anos foi verificado que os IFNs possuem uma significante atividade em leucemia de célula cabeluda, leucemia mielógena crônica, sarcoma de Kaposi e mieloma múltiplo (MANDELLI, F. et al., Multiple myeloma and lymphomas, In: BARON, S. (Ed.) The Interferon, principies and medicai applications, 1a. Ed.-University of Texas Medicai Branch at Galveston, p.501-518, 1992).

Em células tratadas com IFNs, estes exercem seus efeitos antiproliferativos através do aumento da progressão do ciclo celular. Muitas células tumorais crescem mais lentamente na presença de IFNs. Parece não existir um único ponto no ciclo celular que é afetado pelos IFNs e sim que estes agem prolongando todas as fases do ciclo (BALKWILL, F.R. , Nature, 274:798, 1978).

Alguns dos efeitos antiproliferativos podem ser causados pela depleção de alguns metabólitos essenciais. Todos os IFNs mas particularmente o IFN B inibe a indução da omitina decarboxilase (SEKAR, V. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 114:950-954,1983). Esta inibição afeta a síntese de poliaminas essenciais. O IFN G induz a síntese de indoleamina 2,3 dioxigenase, resultando na degradação do triptofano, o qual é um aminoácido essencial. Estes experimentos vem a confirmar que os IFNS podem causar uma alteração nos metabólitos essenciais embora existam outros mecanismos nos quais os IFNs exercem sua atividade antiproliferativa. Alguns dados têm sugerido que o nível da 2'5' oligoadenilato sintetase tem papel importante no ciclo celular. Na verdade, os níveis desta enzima variam durante o ciclo celular (WELLS, V. and MARLUCCI, L., Exp. Cell Res., 159:27, I985), todavia a modulação dos níveis desta enzima pode não ser o único mecanismo, porque células que possuem o sistema 2’5' oligoadenilato sintetase, não mostram nenhuma alteração em relação aos efeitos antiproliferativos dos IFNs (VERGHAEGEN-LEWALE, M. et al., Virology, 117:425 I982).

Os efeitos antiproliferativos direto dos IFNs não são limitados a células tumorais. Isto pode ser demonstrado pela inibição in vitro de formação de uma colônia da medula óssea na presença dos IFNs (FLEMING, W.A. et al.Jmmunology, 23:429, I972). Todavia os IFNs exercem seus efeitos antiproliferativos com mais potência em células malignas do que em células normais. Esta discriminação é ainda mais forte quando são feitas combinações dos IFNs G e A/B(FLEISCHMANN,W.R. et al., J.Biol.Resp.lWlodif., 3:397-340, I984)

A presente patente descreve um mutante de interferon beta humano contendo uma cisteina em lugar da tirosina no amino-ácido 60, detectado em células amnióticas humanas de cultivo primário

A metodologia usada para a produção desse interferon Beta -cis consiste na clonagem e expressão, em bactérias, do DNA correspondente ao gene da proteína do interferon Beta -cis usando ferramentas da Biologia Molecular. Mais especificamente, temos as seguintes etapas.(t) Cultivo

primário das células amnióticas humanas empregando membranas amnióticas que foram separadas dos demais tecidos placentários e lavados em uma solução salina e cortados em fragmentos de aproximadamente 1 cm² . Os fragmentos foram digeridos com tripsina (0,25 -0,30%) na proporção de 5 a 7 ml por grama de tecido. Após cada etapa de tratamento com tripsina as células foram centrifugadas e cultivadas em meio mínimo essencial contendo sais de Eagle na concentração de 15 a 25x 10^e em garrafas de 175 cm². Estas células 1 semana após o implante foram infectadas (2) com o vírus Sendai ou vírus da doença de Newcastle na proporção de 3,0 a 4,8 x W⁶ unidades hemagiutinantes do vírus por célula durante 1 hora e novamente incubadas a 37 ⁰ C durante 4 a 8 horas com meio mínimo essncial contendo sais de Eagle. Para a obtenção dos mRNAs (3) a monocamada de células foi lavada com salina tamponada estéril.

A etapa seguinte foi a lise das cé,ulas(4) com 3,5 a 4,5 ml de uma solução de isotiocianato de guanidina 3 a 4 M em banho de gelo durante 10a 20 minutos. Para o fracionamento de RNA (5) o lisado celular foi acrescentado a 1,5 a 2,0 ml de uma solução de cloreto de césio 5,7 a 5,8 M, e centrifugado a 114.000g durante 18 a 24 horas a 20° C- 24° C. O RNA foi dissolvido (6) em uma solução contendo Tris e EDTA e a extração (7) foi efetuada com igual volume de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico na proporção 25:24:1, agitado em vortex e centrifugado. O RNA foi precipitado (8) com 1/10 do volume de acetato de sódio 2 a 3 M pH 5.5 a 6,0 e álcool etílico, centrifugado e o sedimento dissovido em água. O RNA foi utilizado como molde para a sintese de primeira fita de cDNA (9) empregando 5 a 10 pg de RNA, 0,5 a 1 gg de iniciador T₁₅ , pirofosfato 40-50 mM, 20 a 30 U de transcriptase reversa aviária e o seu tampão.

A amplificação do fragmento correspondente ao interferon(IO) a partir do cDNA obtido nas etapas 1, 2, 3, 4 ,5 6,7,8,9 ou a partir do vetor que contenha o DNA do gene de interferon beta-cis clonado foi desenvolvida empregando-se oligonucleotideos iniciadores especíicos para a região do fragmento correspondente a proteína interferon beta contendo sítios para enzimas de restrição BamH 1 e Hind III, na reação em cadeia da polimerase (PCR) como exemplo 5 -GCCGGATCCTACAACTTGCTTGGATTCCTA-3' e 5’-GCCAAGCTTAGTTTCGGTCATTCCTGTAAGTC-3'.

A título de ilustração segue descrição do processo: a reação foi feita com tampão Taq polimerase( 500 mM KCI, 100 mM Tris-HCI pH 9,0-9,5, 1,52,5 mM MgCI₂ e 1-2% triton X-100), 0,1-1 U de Taq polimerase {Promega ,E U A-, Cat. n° M186A), 0,5-1,5 mM MgCI₂, 20-50 mM de cada nucleotídeo (dATP,dCTP,dGTP,dTTP) 10-30 pmoles de cada iniciador, e 0,01a 0,1 pg de cDNA e H₂o destilada estéril q.s.p. 50-100 pl. A reação ocorre em 1-2 ciclos a 94-96°C/1-2 min; 53 a 55°C/1 -2 min.; 70-72°C /1 - 2 min; 30 ciclos a 94-96°C/1 a 2 min; 36 -38°C/1-2min; 70-72°C/1-2 min e mais 1 ciclo a 94-96°C/1-2 min; 36 -38°C/1 a 2 min; 70-72°C/10-15 min.

O fracionamento do DNA (11) foi realizado em eletroforese em gel de agarose 1,5-2,0%.A purificação do DNA (12) da proteína interferon beta-cis amplificado pode ser efetuada recortando a banda do gel, A banda recortada foi acrescida de 2-3 vezes o volume de solução de Nal ( Nal 8M + 0,022 M DTT) e tampão fosfato de sódio 1M pH 6.0-6,5) e incubado por 5-10 mirí. à 5056°C. Em seguida foram acrescentadas esferas de vidro em suspensão, misturado por inversão e incubado por 1-5 min. à temperatura ambiente. O tubo foi centrifugado por 10-30 segundos em microcentrífuga. O sobrenadante desprezado e as esferas lavadas com tampão Etanol ( 75% de Etanol, 0,01 M Tris-HCI, pH 7,0-7,6, 0,01 M EDTA, pH 8,0-8,5). O DNA foi eluído das esferas de vidro por incubação com tampão TE ( Tris pH 7,0-7,4 10 mM, 1-3 mM EDTA) à 50-56° C por 1-5 min. Para a digestão do DNA (13) este foi tratado primeiramente com enzima Hind III em uma reação com 10-20 U de Hind III (Biolabs, Inglaterra), 3-5 μΙ de tampão (Promega,EUA) e H₂O destilada qsp 3050 μΙ com incubação a 37°C (Banho Maria) por 2-4 h. Em seguida foi adicionado ao tubo da reação 10-20 U de Bam Hl (Biolabs, Inglaterra), 5-10 μΙ de tampão react III (BRL, EUA), H₂O dd qsp 50-100 μΙ e incubação a 37°C (Banho maria) por 2-4 h. Para clonagem (14) do inserto em plasmídio PDS-56, a digestão do vetor foi realizada com as enzimas de restrição Hind III e Bam Hl em uma reação contendo vetor, 10-20 U de enzima Hind III (Promega, E.U.A.), 2-5 μΙ de tampão B (Promega,E.U.A.), H₂0 destilada qsp 20-50 μΙ, com incubação a 37°C (banho maria) por 2-4 h. Em seguida foi adicionado ao tubo da reação 10-20 U da enzima Bam Hl (Promega, E.U. A.), 5-10 μΙ de tampão react III (BRL, E.U.A), H₂O destilada qsp 50-100 μΙ, com incubação a 37°C (banho-maria) por 2-4 h. O produto desta digestão foi analisado em eletroforese em gel de agarose-TAE a 1% como descrito anteriormente na análise da digestão do inserto. A banda correspondente ao plasmídio digerido foi recortada do gel e transferida para um tubo eppendorf (1,5 ml) e purificada como descrito anteriormente na etapa 12.

Na reação de ligação do fragmento de DNA ao vetor (15) foi adicionado 20-50 ng de inserto , 5-15 ng do vetor, 0,5-2,0 U de T4 ligase (Promega, E.U.A.), ATP 5 mM (Promega,E.U.A.), tampão de ligação (Promega,E.U.A.), H₂O dd qsp 15 μΙ com incubação a 14-16°C (BOD, FANEN, Brasil) por 12-18 h.

A transformação bacteriana (16) foi feita com bactérias Escherichia coli. O volume das reações de ligação (etapa 15) foi completato para 40-60 μΙ com tampão TE ( Tris 10 mM pH 7,2-7,4, EDTA 1 mM) estéril e acrescidos de mais 100 μΙ de suspensão de bactérias competentes. Os tubos foram agitados levemente e imediatamente incubados em banho de gelo por 20-40 min. Logo após os mesmos foram submetidos a um choque térmico incubando-os a 4042°C por 1-3 min. e novamente em banho de gelo por 20-40 segundos. Foi adicionado Meio LB (Bacto triptona 1% p/v, extrato de levedura 0,5% p/v, NaCI 171 mM) sem antibióticos por tubo e incubados a 37°C por 1-2 h. As bactérias foram sedimentadas, homogeneizadas em Meio LB e semeadas em placas de Petri contendo Meio LB ágar (ágar 1,5% p/v, extrato de levedura 0,5% p/v, triptona 0,1% p/v, NaCI 0,5% p/v pH 7,2-7,5) acrescido de 50-200 pg/ml de ampicilina e 20-100 pg/ml de Kanamicina. As placas foram incubadas em estufa a 37°C por 15-24 h. Para a seleção dos clones (17) positivos foram selecionados colônias que foram crescidas em meio LB com 50-200 gg/ml de ampicilina e 20-100 gg/ml de Kanamicina com incubação a 37°C sob agitação por 15-20 h. Após incubação foi feita uma reação em cadeia da polimerase utilizando iniciadores específicos do vetor (para amplificação da região correspondente ao inserto) sendo iniciador (senso) ⁵TTCATTAAAGAGGAGAAATT³ e iniciador (anti-senso) ⁵ CTATCAACAGGAGTCCAAGC³. A reação foi feita com tampão Taq. polimerase 10 X (KCI 500 mM, Tris-HC1100 mM pH 9,0-9,5, MgCJ₂ 15-25 mM e triton X-100 1-2%), 0,5-1,0 U de Taq polimerase (Promega, E.U.A.) ,0,5-1,5 mM MgCI₂.20-50 mM de cada nucleotídio (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 10-30 pmoles de cada iniciador, 0,5-1 μΙ de suspensão bacteriana e H₂Odd estéril qsp 20-40 μΙ. A reação foi processada com 1-3 ciclos a 94-96°C/5min., 50-55°C/1-2 min., 70-72°C/1-2 min,; 30 ciclos a 94-96°C/30^45 seg., 45-50°C/30^5 seg., 70-72°C/30-45 seg. e 1 ciclo a 94-96°C/1-2 min., 45-50°C/1-2 min., 70-72°C/1015min. O produto desta reação foi fracionado em eletroforese em gel de agarose a 1-2%.

Os clones positivos foram seqüenciados (18)até ser encontrado o mutante interferon beta-cis.

Os clones positivos para o mutante interferon beta-cis foram empregados para a produção da proteína (19) e foram repicados para meio LB com 50-200 pg/ml de ampicilina e 50-200 μg/ml de Kanamicina e incubadas a 37°C sob agitação até a densidade óptica (DO a 600 nm) de 0,5-0,7 quando para a indução da proteína (20) foi adicionado ao meio IPTG (lsopropyl-3-Dthiogalacoside) a 0,2-0,4 M com incubação por mais 3-5 h . Para a lise das bactérias (21) foi feita centrifugação, o sobrenadante foi descartado e o sedimento homogeneizado em tampão A (Guanidina-HCI 5-6 M, fosfato de sódio 0,1-0,2 M, Tris 0,01-0,02 M pH 7,8-8,0) com agitação por 1-2 Η. O homogeneizado foi centrifugado e o sobrenadante recolhido foi aplicado em uma coluna cromatográfica com uma matriz de resina de Ni-NTA previamente equilibrada com tampão A. Para a purificação da proteína (22) a coluna foi lavada seqüencialmente com tampão A , tampão B (Uréia 7-8 M, fosfato de sódio 0,1-0,2 M, Tris 0,01-0,02 M pH 7,8-8,0).e com tampão C (Uréia 7-8 M, fosfato de sódio 0,1-0,2 M, Tris 0,01-0,02 M pH 7,0-7,2). A eluição das proteínas foi feita com tampão D (Uréia 7-8 M, fosfato de sódio 0,1-0,2 M, Tris 0,01-0,02 M pH 5,0-5,2) e seqüencialmente com tampão E (Uréia 7-8 M, fosfato de sódio 0,1-0,2 M, Tris 0,01-0,02 M pH 4,0-4,2); Foram coletadas frações e uma amostra de 50 μΙ de cada fração foi diluída v/v em tampão de amostra, fervido por 10 min. e submetidas a eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). O gel foi analisado quanto a presença da fração que continha apenas a banda correspondente a proteína interferon beta-cis purificada

1/5

Claims

REIVINDICAÇÕES

PROTEÍNA DE INTERFERON BETA-CIS HUMANO RECOMBINANTE caracterizada por compreender a Seq ID n° 1.

PROCESSO PARA PRODUÇÃO DA PROTEÍNA DO INTERFERON BETACIS HUMANO RECOMBINANTE”, caracterizado por compreender as seguintes etapas:

(1) Cultivo primário de células amnióticas humanas;
(2) Infecção com o vírus Sendai;
(3) Obtenção de mRNA que;
(4) Lise das células;
(5) Fracionamento de RNA;
(6) Dissolução de RNA;
(7) Extração de RNA;
(8) Precipitação de RNA;
(9) Síntese de primeira fita de cDNA;
(10) Amplificação do DNA;
(11) Fracionamento do DNA;
(12) Purificação do DNA;
(13) Digestão do DNA;
(14) Clonagem;
(15) Ligação do DNA ao vetor;
(16) Transformação das bactérias competentes;
(17) Seleção dos clones positivos produtores da proteína do Interferon BetaCis humano recombinante;
(18) Seqüenciamento dos clones;
(19) Produção da proteína identificada pela Seq ID n° 1;
(20) Indução da bactéria;
(21) Lise da bactéria;
(22) Purificação da proteína.

PROCESSO PARA PRODUÇÃO DA PROTEÍNA DO INTERFERON BETACIS HUMANO RECOMBINANTE”, de acordo com a etapa 9 da reivindicação 2, caracterizado pelo cDNA compreender a seqüência de nucleotídeos

2/5 descrita na Seq ID n° 2 ou qualquer outra seqüência de nucleotídeos que codifique a mesma seqüência de aminoácidos descrita na Seq ID n° 1.

4. PROCESSO PARA PRODUÇÃO DA PROTEÍNA DO INTERFERON BETACIS HUMANO RECOMBINANTE”, de acordo com a reivindicação 2,

5 caracterizado pelo fato de que o cultivo primário de células amnióticas (1) é obtido através separação das células da membrana amniótica por ação de tripsina ou outro agente proteolítico.

5. PROCESSO PARA PRODUÇÃO DA PROTENA DO INTERFERON BETACIS HUMANO RECOMBINANTE”, de acordo com a reivindicação 2,

10 caracterizado pelo fato de que a infecção das células (2) é feita com o vírus

Sendai ou outro vírus ou droga que estimule a produção de interferon na célula.

6. PROCESSO PARA PRODUÇÃO DA PROTEÍNA DO INTERFERON BETACIS HUMANO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 2,

15 caracterizado pelo fato de que a obtenção de mRNA (3) é feita através da lavagem da monocamada de células com salina tamponada ou qualquer tampão com pH e concentração salina fisiológica, e a lise das células (4) é feita com isotiocianato de guanidina ou outro processo físico-químico com propriedades líticas.

20 7. PROCESSO PARA PRODUÇÃO DA PROTEÍNA DO INTERFERON BETACIS HUMANO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o fracionamento do RNA (5) é feito com cloreto de césio ou qualquer outra substancia que forme gradiente para o fracionamento.

25 8. PROCESSO PARA PRODUÇÃO DA PROTEÍNA DO INTERFERON BETACIS HUMANO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que dissolução do RNA (6) é feita em Tris e EDTA ou outro solvente.

9. PROCESSO PARA PRODUÇÃO DA PROTEÍNA DO INTERFERON BETA30 CIS HUMANO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a extração de RNA (7) é feita com fenol, clorofórmio e álcool isoamílico ou por quaisquer outras proteínas que removam proteínas.

V

3/5

10. PROCESSO PARA PRODUÇÃO DA PROTEÍNA DO INTERFERON BETACIS HUMANO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a precipitação do RNA (8) é feita com acetato de sódio e álcool etílico, ou qualquer outro agente precipitante de RNA.

5 11. PROCESSO PARA PRODUÇÃO DA PROTEÍNA DO INTERFERON BETACIS HUMANO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a síntese da primeira fita de cDNA (9) é feita com transcriptase reversa.

12. PROCESSO PARA PRODUÇÃO DA PROTEÍNA DO INTERFERON BETA10 CIS HUMANO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a amplificação do DNA (10) é feita com oligonucleotídeos iniciadores específicos para a região do gene ou por quaisquer outros iniciadores em reação de PCR ou outra reação de amplificação de DNA.

15 13. PROCESSO PARA PRODUÇÃO DA PROTEÍNA DO INTERFERON BETACIS HUMANO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo iniciador direto ser, preferencialmente, a Seq ID n° 3.

14. PROCESSO PARA PRODUÇÃO DA PROTEÍNA DO INTERFERON BETACIS HUMANO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 12,

20 caracterizado pelo iniciador reverso ser, preferencialmente, a Seq ID n° 4.

15. PROCESSO PARA PRODUÇÃO DA PROTEÍNA DO INTERFERON BETACIS HUMANO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o fracionamento do DNA (11) é feito em eletrotorese em gel de agarose ou qualquer outro sistema que permita o

25 fracionamento do DNA.

16. PROCESSO PARA PRODUÇÃO DA PROTEÍNA DO INTERFERON BETACIS HUMANO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a purificação do DNA (12) é feita com Kit “Glass milk (Promega) ou qualquer outro sistema que permita purificação de

30 DNA.

17. PROCESSO PARA PRODUÇÃO DA PROTEÍNA DO INTERFERON BETA-CIS HUMANO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a digestão do DNA (13) é feita com enzimas de restrição Hind III e Bam Hl ou qualquer outra enzima que permita a clonagem no

Λ *,

4/5 vetor de expressão.

18. PROCESSO PARA PRODUÇÃO DA PROTEÍNA DO INTERFERON BETA-CIS HUMANO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a clonagem (14) do inserto é feita em plasmídio PDS-56 ou em

5 qualquer outro vetor de expressão.

19. PROCESSO PARA PRODUÇÃO DA PROTEÍNA DO INTERFERON BETA-CIS HUMANO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a ligação do DNA ao vetor (15) é feita com T4 ligase e tampões ou qualquer outro sistema de ligação.

10 20. PROCESSO PARA PRODUÇÃO DA PROTEÍNA DO INTERFERON BETA-CIS

HUMANO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a transformação das bactérias competentes (16) é feita com bactérias Escherichia coli ou qualquer outro microorganismo susceptível ao vetor.

21. PROCESSO PARA PRODUÇÃO DA PROTEÍNA DO INTERFERON BETA-CIS

15 HUMANO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que seleção dos clones positivos (17) é feita utilizando iniciadores específicos do vetor ou qualquer iniciador que amplifique a região correspondente ao inserto.

22. PROCESSO PARA PRODUÇÃO DA PROTEÍNA DO INTERFERON BETA-CIS

20 HUMANO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a seleção dos clones positivos (18) é feita utilizando iniciadores específicos do vetor ou qualquer iniciador que permita o seqüenciamento.

23. PROCESSO PARA PRODUÇÃO DA PROTEÍNA DO INTERFERON BETA-CIS HUMANO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado

25 pelo fato de que para a produção da proteína (19) os clones positivos são repicados para meio LB com antibióticos ou qualquer outro meio seletivo que permita o crescimento dos microorganismos.

24. PROCESSO PARA PRODUÇÃO DA PROTEÍNA DO INTERFERON BETA-CIS HUMANO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado

30 pelo fato de que a indução da bactéria (20) é feita com IPTG ou com qualquer outra substância que induza a expressão do gene.

25. PROCESSO PARA PRODUÇÃO DA PROTEÍNA DO INTERFERON BETA-CIS HUMANO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a lise da bactéria (21) é feita com tampão Tris/guanidina-HCI ou

V

5/5 qualquer outro tampão que lise as bactérias.

26. PROCESSO PARA PRODUÇÃO DA PROTEÍNA BETA-CIS HUMANO

RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a purificação da proteína (22) é feita em coluna de quelato de níquel ou qualquer outro método que permita a purificação da proteína.

1/5

Figure 1

2/5

ATGAGCTACAACTTGCTTGGATTCCTACAAAGAAGCAGCAATTTTCAGTGTCAG

MetSerTyrAsnLeuLeuGlyPheLeuGlnArgSerSerAsnPheGlnCisGln

AAGCTCCTGTGGCAATTGAATGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAAGGACAGGATG

LysLeuLeuTrpGlnLeuAsnGlyArgLeuGluTyrCysLeuLysAspArgMet

AACTTTGACATCCCTGAGGAGATTAAGCAGCTGCAGCAGTTCCAGAAGGAGGAC

AsnPheAspIleProGluGluIleLysGlnLeuGlnGlnPheGlnLysGluAsp

GCCGCATTGACCATCTGTGAGATGCTCCAGAACATCTTTGCTATTTTCAGACAA

AlaAlaLeuThrlleCysGluMetLeuGlnAsnllePheAlallePheArgGln

GATT CAT CTAG CAC T GGCT GGAATGAGACTAT T GT T GAGAACCT C C T GGCTAAT AspSerSerSerThrGlyTrpAsnGluThrlleValGluAsnLeuLeuAlaAsn

GTCTATCATCAGATAAACCATCTGAAGACAGTCCTGGAAGAAAAACTGGAGAAA

ValTyrHisGlnlleAsnHisLeuLysThrValLeuGluGluLysLeuGluLys

GAAGAT T T CAC CAGGGGAAAAC TCATGAGCAGTCTGCACCT GAAAAGATAT TAT GluAspPheThrArgGlyLysLeuMetSerSerLeuHisLeuLysArgTyrTyr

GGGAGGATTCTGCATTACCTGAAGGCCAAGGAGTACAGTCACTGTGCCTGGACC

GlyArglleLeuHisTyrLeuLysAlaLysGluTyrSerHisCysAlaTrpThr

ATAGTCAGAGTGGAAATCCTAAGGAACTTTTACTTCATTAACAGACTTACAGGT

IleValArgValGluIleLeuArgAsnPheTyrPhelleAsnArgLeuThrGly

TACCTCCGAAACTGA

TyrLeuArgAsnEnd

Figure 2

3/5

2 3 MW

21.5

14.4

Figure 3

4/5

MW

Figure 4

5/5

1 2 3

Figure 5