BRPI1104691B1 - tiosssemicarbazonas incorporadas ao s-(-)-limoneno com atividade antileishmania - Google Patents

Abstract

TIOSSSEMICARBAZONAS INCORPORADAS AO S-(-)-LIMONENO COM ATIVIDADE ANTILEISHMANIA. A presente invenção se enquadra dentro do setor químico-farmacêutico, referindo-se a uma série de benzaldeidotiossemicarbazonas cuja incorporação ao monoterpeno S-(-)-Limoneno aumenta consideralvemente a atividade antileishmania. As tiossemicarbazonas e o limoneno apresentam um vasto espectro de atividade biológica, sendo bastante conhecidos por suas aplicações na pesquisa de novos fármacos. Desta forma, seguindo a estratégia de combinar moléculas ativas para estudar o efeito cooperativo na busca por novos compostos com atividade biológica foram sintetizadas benzaldeidotiossemicarbazonas derivadas do S-(-)-limoneno e avaliado o potencial farmacológico desses compostos. O presente invento tem a seu favor a alta seletividade que as benzaldeidotiossemicarbazonas derivadas do S-(-)-limoneno apresentaram, sendo ativas contra as formas promastigotas de L. amazonensis, além do baixo custo e versatilidade na preparação destes compostos. A incorporação de benzaldeidotiossemicarbazonas ao S-(-)-Limoneno acarretou também um acentuado aumento na atividade antitumoral frente a diversas linhagens de células e na atividade antitripanossoma, sendo que suas características moleculares proporcionam ainda considerável potencialidade acaricida, ansiolítica, antimicrobiana, anti-inflamatória e antiviral.

Description

Introdução

A presente invenção se enquadra dentro do setor químico-farmacêutico, referindose a uma série benzaldeídotiossemicarbazonas cuja incorporação do monoterpeno S-(-)limoneno aumenta consideralvemente a atividade antileishmania.

Levando-se em consideração que o tratamento convencional das leishmanioses consiste na administração de derivados antimoniais pentavalentes, como é o caso do estibogluconato de sódio e o antimoniato de V-metilglucamina, que interferem na produção de energia das formas amastigotas de Leishmaniacomprometendo todo o ciclo de vida da célula do parasita e, ainda, que os antimoniais não são ativos quando administrados oralmente, além de necessitarem de um longo período de tratamento e de apresentarem efeitos colaterais adversos, consequentemente, a toxicidade, a dificuldade de administração, o custo e o surgimento de cepas resistentes a essas drogas tem limitado o uso das mesmas.

Por outro lado, as drogas de segunda linha utilizadas como alternativa no tratamento de casos que não respondem à terapia convencional são o desoxicolato de anfotericina B, que atua nas formas promastigotas in vitroe amastigotas in vivo de Leishmania apresentando diversos efeitos colaterais devido a sua toxicidade, e as pentamidinas que provocam efeitos colaterais como hipoglicemia seguida de hiperglicemia devido à ação da droga no metabolismo da glicose, podendo ainda, ocorrer manifestações de diabetes mellitus.

Portanto, existe uma grande demanda por novas drogas que possam servir como uma nova opção terapêutica que possam ser administradas por via oral e que apresentem menor toxicidade e menor duração de tratamento.

Desta forma, o objetivo da presente invenção é de desenvolver novos agentes antileishmania, com baixa toxicidade frente células de mamíferos, alto grau de inibição do protozoário, versatilidade de obtenção e baixo custo. Para tanto foram sintetizadas quatorze benzaldeídotiossemicarbazonas derivadas do monoterpeno S-(-)-limoneno para as quais foram avaliadas as atividades sobre as formas promastigotas de Leishmania amazonensis e as citotoxicidades sobre macrófagos da linhagem J774G8.

Estado da Técnica

A leishmaniose é uma zoonose tropical negligenciada causada por protozoários do gênero Leishmania que possui duas formas evolutivas em seu ciclo biológico. A forma amastigota, encontrada em hospedeiros vertebrados, apresenta estrutura arredondada ou ovalada sem flagelo. A forma amastigota, transformada na forma promastigota no intestino do animal infectado, é alongada e apresenta um longo flagelo livre.

No Brasil, a leishmaniose é uma das afecções dermatológicas que merece mais atenção, devido à sua magnitude e pelo risco de ocorrência de deformidades que pode ocasionar no ser humano. No período de 2001 a 2003, o circuito de maior densidade de casos (552 casos para cada 10.000 habitantes) concentrou-se na região do Tucuruí, que compreende os estados do Pará, Maranhão e Tocantins.

Os fármacos de primeira escolha utilizados no tratamento da leishmaniose desde 1945 são os antimoniais pentavalentes, descritos na patente US 1984480, 1934, sendo que os mais empregados são o antimoniato de glucamina, conhecido como glucantime na América Latina e África, e o estibogluconato de sódio, conhecido na Europa e Estados Unidos como Pentostam. Esses fármacos são administrados via intraperitonial, porém apresentam diversos efeitos colaterais como mialgia, náusea, vômito, dor abdominal, febre, tontura e fraqueza.

O tratamento de segunda escolha consiste em injeções intramusculares de pentamidina e injeção intravenosa de anfotericina B, como descrito na patente US2908611, 1959. Porém, estes fármacos também apresentam efeitos colaterias como náusea, sintomas cardiorespiratórios, febre e anemia.

Desta forma, a busca por novos agentes antileishmania vêm se intensificando nos últimos anos principalmente devido à falta de um fármaco que combata eficientemente o protozoário sem causar efeitos colaterais pronunciados.

Assim, fármacos como a paramomicina, um antibiótico glicosídico descrito na patente EP0435915, 1993, administrado por via parenteral ou como formulação tópica (US6284739, 2001) e peptídeos acilados com diferentes ácidos graxos derivados de cecropina-melitina descritos na patente ES2195734, 2003, mostraram ter eficácia no tratamento contra as formas amastigotas e promastigotas de Leishmania donovani, onde o mecanismo de ação está relacionado com a permeação destes compostos pela membrana plasmática.

Além de compostos sintéticos, algumas substâncias de origem natural demonstram grande potencial antileishmania como a 5-hidroxi-2-hidroximetil-y-pirona (HMP), um metabólito secundário obtido de Aspergillus fungicuja atividade leishmanicida contra L. amazonensis é relatada na patente W02001/017613, 2010. Este composto intensifica o mecanismo de ativação das células de macrófagos, levando à maior produção de superóxido, lisossomos, actina e polimerização de microtúbulos filamentosos. Estudos demonstraram que o HMP pode ser um potencial candidato na terapêutica da leishmaniose cutânea em concentrações de 50pg/mL.

Dentre as substâncias naturais destaca-se o limoneno ou 4-isoprenil-l-metilcicloexeno, monoterpeno monocíclico comumente encontrado em plantas cítricas como o limão e a laranja e em outras espécies vegetais nas formas enantioméricas R e ou S. Este monoterpeno apresenta propriedades antitumorais, antimicrobianas (WO2010/062933, 2010) e antiprotozoárias, e se apresentou eficaz contra espécies de Leishmania em estudos in vitroe in vivo. A eficácia do tratamento foi investigada in vitropara as formas promastigotas e amastigotas de L. amazonensis e contra a forma promastigota de L. chagasi, L. major e L. braziliensis. O tratamento de camundongos contaminados com L. amazonensis utilizando 300 pM de limoneno resultou em uma diminuição de 78% da infecção. A diminuição significativa da carga parasitária foi apresentada nas lesões tratadas topicamente com limoneno pelo exame histopatológico e no tratamento intraretal.

As tiossemicarbazonas destacam-se entre as substâncias sintéticas pelo considerável interesse científico devido as suas propriedades farmacológicas acentuadas, como a atividade antiviral relatada nas patentes W02004/066725, BP1026401 e US4927843, a antitumoral descrita em W02010/000008, W02004/06981 e US2010/0015140 e a antiinflamatória relatada na patente W02009/003255. As tiossemicarbazonas são tidas também como potentes agentes antiprotozoários, destacando as atividades contra várias espécies de Leishmania, Trypanossoma cruzi e Plasmodium falciparum.Estas atividades das tiossemicarbazonas em grande parte estão relacionadas à capacidade de formação de quelatos com metais de transição como cobre e níquel. Ainda, as tiossemicarbazonas β-carbolinicas foram efetivamente ativas contra a forma promastigota de L. donovani, porém não há registro a respeito de suas toxicidades.

Levando-se em consideração que a busca por novos agentes antileishmania deve ser pautada na eficiência do fármaco contra o protozoário e na baixa toxicidade contra células normais, não acarretando efeitos colaterais danosos ao paciente, proporcionando um tratamento curto e de baixo custo, a combinação de moléculas bioativas isoladamente como derivados da benzaldeídotiossemicarbazona e o S-(-)-limoneno na preparação de novos agentes com potencial terapêutico frente à Leishmania é uma alternativa valorosa, desde que a elevação da atividade proporcione diminuição na toxicidade.

Descrição das Figuras

Para melhor compreensão do objeto da presente invenção foram elaboradas as seguintes figuras:

Figura 1. Representa a estrutura química das benzaldeídotiossemicarbazonas derivadas do monoterpeno S-(-)-limoneno, sendo o grupo R substituído por diversas funções como: H, 2-NO2, 3-NO2, 4-NO2, 2-C1, 3-C1, 4-C1, 4-CH3, 4-OCH3, 4-N(CH3)2, 2-OH, 4-OH, 4-F e 3-OCH3-4-OH.;

Figura 2. Representa a rota de síntese das benzaldeídotiossemicarbazonas derivadas do monoterpeno S-(-)-limoneno.

Descrição Detalhada do Invento

A presente invenção relata a síntese e a atividade antileishmania de uma série de benzaldeídotiossemicarbazonas derivadas do S-(-)-limoneno, cuja estrutura está representada na Figura 1.

As tiossemicarbazonas derivadas do S-(-)-limoneno foram sintetizadas conforme Figura 2, inicialmente pela preparação do isotiocianato, onde uma suspensão de 24,99 g (0,183 mols) de KSCN, pulverizado, em CHCI3 (50mL) foi triturado com 17,79g (0,183 mols) de KHSO4 por 3min. Após decantar a solução de HSCN-CHCI3, adicionou-se mais 15mL de CHCI3 à mistura sólida e triturou-se por mais 2min., filtrando-se sobre algodão. A proporção de solução de HSCN-CHCI3 e substrato utilizada em todas as reações foi de 4:1 mol. Para a preparação do derivado isotiocianato foram utilizados 5,00g (0,037 mols) de S-(-)-limoneno e um excesso de solução de HSCN-CHCI3 que foram deixados à temperatura ambiente, sob agitação e protegidos da luz por 1 dia. O progresso da reação foi acompanhado por CCD eluída com hexano/acetato de etila 30% e revelada com iodo. Após filtração para eliminação dos subprodutos, o filtrado foi lavado com água, seco sobre Na2SO4 anidro e evaporado em evaporador rotativo. A purificação do produto bruto da reação em coluna cromatográfica de gel de sílica forneceu, na eluição com hexano, 3,45g (69%) do isotiocianato e 0,25g (5%) do tiocianato.

Na síntese da tiossemicarbazida, 1,89g (0,018mols) de cloridrato de hidrazinio, tratado com 3,02g (0,036mols) de bicarbonato de sódio à temperatura ambiente, foi submetido a agitação com 3,45g (0,018mols) do isotiocianato do S-(-)-limoneno por 4 horas, sob refluxo entre 50 a 70°C em etanol. O progresso da reação foi acompanhado por CCD eluída com hexano/acetato de etila 30% e revelada com iodo. A mistura reacional foi concentrada em evaporador rotativo, dissolvida em H2O e extraída com CHCI3. A fase orgânica foi evaporada e o sólido obtido foi lavado com hexano, fornecendo um sólido branco como produto com rendimento superior a 85%. A série de tiossemicarbazonas foi preparada através da adição do aldeído a um tubo de ensaio contendo o catalisador SiO2:H2SO4 5% (10% em mols do reagente) com posterior adição da tiossemicarbazida derivada do S-f-j-limoneno. Em seguida, o tubo de ensaio foi agitado manualmente entre 15 a 30 minutos, sendo que em alguns casos ocorreu a necessidade de submeter a reação a energia de microondas entre 2 a 8 min. na potência mínima. Os compostos foram submetidos a uma filtração com etanol para retirada da sílica e posterior cristalização em etanol/CHCl3, sendo que os rendimentos variaram de 68,3-98,5%.

Os ensaios biológicos foram realizados com formas promastigotas de Leishmania amazonensis (cepa WHOM/BR/75/JOSEFA), cultivadas em meio Warren (infusão de cérebro e coração + hemina + ácido fólico) pH 7,0 suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado (SFB) e incubadas a 25 °C. Nos experimentos foram utilizados culturas em fase logarítmica de crescimento, ou seja, após 48 horas de incubação depois do subcultivo. Para os ensaios, foram feitas soluções estoque entre 10 e 1000 pg/mL dos compostos sintetizados incluindo a tiossemicarbazida, o isotiocianato e o S-(-)-limoneno, solubilizadas com DMSO (dimetilsulfóxido) a 1%.

Para os testes, um inoculo inicial de IxlO6 células/mLem meio Warren de formas promastigotas de L. amazonensis com cultivo de 48 h foram colocadas em placa de 24 poços estéreis na presença e na ausência da substância solubilizado em DMSO a 1%. Os tratamentos foram realizados nas concentrações finais entre 1 e 100 pg/mL. O crescimento foi avaliado através da contagem em câmara hematocitrométrica de Neubauer, em um microscópio óptico, após 24 a 96 h de incubação à 25 e 32 °C. Os experimentos foram realizados duas vezes em duplicata. E a atividade antileishmania foi expressa através do percentual de inibição de crescimento em relação ao controle. Tabela 1. Valores de IC50 Para as formas promastigotas de Leishmania amazonensis do S-(-)-limoneno (1), do isotiocianato (2), da tiossemicarbazida (3) e das tiossemicarbazonas (4).

Na busca por novos compostos com atividade biológica, seguiu-se a estratégia de combinar moléculas ativas individualmente como as tiossemicarbazonas e o limoneno, devido ao vasto espectro de atividade biológica que apresentam e por suas aplicações na 25 pesquisa de novos fármacos, para estudar seu efeito cooperativo. Desta forma, foram sintetizadas benzaldeídotiossemicarbazonas derivadas do S-(-)-limoneno para avaliar os mesmos frente à Leishmania amazonensis.

Os compostos apresentados neste invento apresentaram eficácia contra as formas promastigotas de Leishmania amazonenses, que poderão ser utilizados no 30 desenvolvimento de uma formulação farmacêutica para o tratamento da leishmaniose.

O presente invento tem a seu favor a alta seletividade que as benzaldeídotiossemicarbazonas derivadas do S-(-)-limoneno apresentaram, sendo ativas contra as formas promastigotas de L. amazonensis, além do baixo custo e versatilidade na preparação destes compostos.

Assim, a combinação de moléculas bioativas isoladamente e a utilização de metabólitos secundários bioativos na preparação de novos agentes com potencial 5 terapêutico frente à Leishmania é, uma alternativa valorosa na obtenção de compostos com atividade antileishmania e baixa toxicidade, visto que, não se encontram disponíveis comercialmente fármacos com ambas as propriedades atualmente, pois a tecnologia atualmente utilizada no tratamento de leishmaniose utiliza drogas altamente tóxicas, pouco eficientes e de custo elevado como antimoniais pentavalentes, pentamidinas, 10 anfotericina B, entre outras.

A presente invenção relata a investigação de compostos que cumprem o perfil de um fármaco no tratamento da leishmaniose: baixa toxicidade, seletividade, versatilidade de obtenção e baixo custo, características das benzaldeídotiossemicarbazonas derivadas do S-(-)-limoneno.

A incorporação de benzalsídotiossemicarbazonas ao S-(-)-limoneno acarretou também um acentuado aumento na atividade antitumoral frente a diversas linhagens de células e na atividade antitripanossoma, sendo que as características moleculares destes compostos proporcionam ainda considerável potencialidade acaricida, ansiolítica, antimicrobiana, anti-inflamatória e antiviral.

Claims (7)

1. TIOSSSEMICARBAZONAS INCORPORADAS AO S-(-)-LIMONENO COM ATIVIDADE ANTILEISHMANIA caracterizadas por apresentarem uma unidade terpênica do 4-isoprenil-l-metil-cicloexeno (C10H16) em sua configuração S (isômero S) adicionada a uma unidade tiossemicarbazona (C2N3SH3), caracterizada pela presença do carbono imínico (N=C) e do carbono tiocarbonílico (S=C) e com o benzaldeído (C6H5) ou derivados conectado ao carbono imínico.

2. TIOSSSEMICARBAZONAS INCORPORADAS AO S-(-)-LIMONENO COM ATIVIDADE ANTILEISHMANIA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas por apresentarem em sua estrutura o grupo tiossemicarbazona substituído em N4 pelo monoterpeno S-(-)-Iimoneno.

3. TIOSSSEMICARBAZONAS INCORPORADAS AO S-(-)-LIMONENO COM ATIVIDADE ANTILEISHMANIA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas por apresentarem em sua estrutura o grupo tiossemicarbazona substituído em N4 por terpenos.

4. TIOSSSEMICARBAZONAS INCORPORADAS AO S-(-)-LIMONENO COM ATIVIDADE ANTILEISHMANIA, sendo a série de benzaldeidotiossemicarbazonas incorporadas ao S-(-) limoneno, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizadas por apresentarem alta seletividade sendo ativas contra as formas promastigotas e amastigotas de Leishmania amazonensis, além de outras espécies de Leishmania.

5. TIOSSSEMICARBAZONAS INCORPORADAS AO S-(-)-LIMONENO COM ATIVIDADE ANTILEISHMANIA, de acordo com as reivindicações 1, 2, 3 e 4, caracterizadas pelo uso de compostos provenientes de tiossemicarbazonas incorporadas ao S-(-)-limoneno como princípio ativo na formulação de fármacos.

6. TIOSSSEMICARBAZONAS INCORPORADAS AO S-(-)-LIMONENO COM ATIVIDADE ANTILEISHMANIA, de acordo com a reivindicação 5, caracterizadas pelo uso de compostos na formulação de medicamentos para tratamento do câncer e de doenças causadas por protozoários.

7. TIOSSSEMICARBAZONAS INCORPORADAS AO S-(-)-LIMONENO COM ATIVIDADE ANTILEISHMANIA, de acordo com a reivindicações 5 e 6, caracterizadas por possuir atividade antiprotozoária e antitumoral, e ainda potencialidade acaricida, ansiolítica, anti-inflamatória, antimicrobiana e antiviral.