BRPI1006642A2

BRPI1006642A2 - método para produzir um l-aminoácido, bactéria que pertence à famìlia enterobacteriaceae, e, dna

Info

Publication number: BRPI1006642A2
Application number: BRPI1006642-0A
Authority: BR
Inventors: Kazuhiro Takumi; Gen Nonaka
Original assignee: Ajinomoto Kk
Priority date: 2009-02-16
Filing date: 2010-02-12
Publication date: 2012-04-17
Also published as: CN101864465B; US20100209977A1; US9458206B2; JP2010187552A; EP2218729A1; JP5521347B2; EP2218729B1; BRPI1006642B1; CN101864465A

Abstract

MéTODO PARA PRODUZIR UM L-AMINOáCIDO, BACTéRIA QUE PERTENCE à FAMìLIA ENTEROBACTERIACEAE, E, DNA. Uma bactéria pertencendo à família Enterobacteriaceae, que tem uma capacidade para produzir um aminoácido como L-cisteína, e foi modificada para ter um gene yeaS tendo uma mutação específica, é cultivada em um meio, e o L-aminoácido é coletado do meio para produzir o L-aminoácido.

Description

"MÉTODO PARA PRODUZIR UM L-AMINOÁCIDO, BACltKiA y^E PERTENCE À FAMÍLIA ENTEROBACTERlACEAE, E, DNA"

Antecedentes da invenção

Campo técnico

A presente invenção refere-se a um método para produzir um L-aminoácido como L-cisteína. Mais precisamente, a presente invenção refere-se a uma bactéria apropriada para produção de um L-aminoácido e um método para produzir um L-aminoácido utilizando esta bactéria. L- aminoácidos são usados em vários campos, por exemplo, os dos temperos, aditivos alimentícios, aditivos para ração, produtos químicos, fármacos, e assim por diante.

Antecedentes da Técnica

L-aminoácidos são industrialmente produzidos por fermentação usando microorganismos pertencendo ao gênero Brevibacteria, Corynebacteria, Escherichia, ou outros. Em tais métodos, cepas são usadas as quais são isoladas da natureza ou variantes artificiais de tais cepas. Além disso, cepas de microorganismo podem ser usadas, que são modificadas por técnicas de DNA recombinante de modo que a atividade de uma enzima biossintética de L-aminoácido básica é aumentada, e assim por diante (EP 0643135 B, EP 0733712 B, EP 1477565 A, EP 0796912 A, EP 0837134 A, WOOl/53459, EP 1170376 A, W02005/010175, W096/17930, W02006/013807).

Além disso, L-cisteína, por exemplo, é obtida por extração de substâncias contendo queratina como cabelos, chifres e penas ou conversão de ácido DL-2-aminotiazolina-4-carboxílico como um precursor usando uma enzima microbiana. Também é planejado produzir L-cisteína em uma larga escala por um método de enzima imobilizada utilizando uma enzima nova.

Além disso, também foi tentado produzir L-cisteína por fermentação utilizando uma bactéria. Por exemplo, os inventores da presente invenção descreveram um método para produzir L-cisteína usando uma bactéria Escherichia tendo um sistema de decomposição de L-cisteína suprimido e uma serina acetiltransferase (EC 2.3.1.30, daqui em diante também referida como "SAT") da qual a retroinibição por L-cisteína é atenuada (Patente Japonesa aberta ao público (Kokai) N0 11-155571). Além disso, como bactérias em que capacidade de produzir L-cisteína é otimizada por supressão do sistema de decomposição de L-cisteína, são conhecidas como bactérias corineformes ou bactérias Eseheriehia em que a atividade de cistationina-P-liase (patente japonesa acessível ao público (Kokai) No. 11- 155571), triptofanoase (patente japonesa acessível ao público No. 2003- 169668), ou O-acetilserina sulfidrilase B (patente japonesa acessível ao público No. 2005-245311) é atenuada ou deletada. Um método para produzir L-cisteína por uso da bactéria em que metabolismo de L-cisteína é descontrolado por uso de uma seqüência de DNA codificada para SAT que tem uma mutação específica para atenuar a retroinibição por L-cisteína também é conhecido (publicação nacional da versão traduzida em japonês (Kohyo) No. 2000-504926).

Além disso, também se sabe que o gene ydeD que codifica a proteína YdeD (Dabler et al., Mol. Microbiol., 36, 1101 - 1112 (2000)) e o gene yfiK que codifica a proteína YfiK (patente japonesa acessível ao público No. 2004-49237) participam na secreção dos produtos metabólicos da via cisteína. Além disso, também são conhecidas as técnicas de otimizar a capacidade de produzir L-cisteína pelo aumento da expressão do loeus mar-, loeus aer-, loeus emr-, gene mex-, gene bmr- ou gene qaeA-, que codifica as proteínas apropriadas para secretar uma substância tóxica de células (patente U.S. No. 5.972.663), ou genes emrAB, emrKY, yojIH, aerEF, ber ou cusA (patente japonesa acessível ao público No. 2005-287333).

Além disso, também foi registrado um método para produzir L-cisteína usando a bactéria que superexpressa um gene codificando para uma proteína apropriada para liberar um antibiótico ou uma substância tóxica para uma bactéria diretamente de uma célula (patente japonesa acessível ao público No. 11-56381).

Além disso, também se sabe que a produtividade de bactérias para L-aminoácidos, não somente L-cisteína, pode ser otimizada por aumento da expressão de uma proteína de secreção de L-aminoácido. Também se sabe que, em bactérias corineformes, a produção de L-Iisina é melhorada pelo aumento da expressão de um veículo de secreção de L-lisina, denominado LysE (patente japonesa acessível ao público No. 2000-189180). Além disso, para bactérias Escherichia, várias proteínas de membrana que se espera sejam veículos de secreção de aminoácidos são conhecidas. Por exemplo, foi relatado que, por aumento do número de cópias de um gene chamado rhtB, a resistência para L-homoserina, L-treonina, L-alanina, L-valina, e L-isoleucina de concentração elevada é melhorada, e espera-se que o produto deste gene seja um veículo de secreção destes L-aminoácidos (patente japonesa acessível ao público No. 2000-189180).

O gene yeaS pertence à família do gene rhtB acima mencionada, do qual o produto é presumido como sendo uma proteína da membrana, e foi relatado que, pelo aumento da quantidade de expressão deste gene, resistência a L-treonina, L-homoserina, L-lisina, ácido L-glutâmico, L- histidina, L-prolina e ácido α-aminobutírico em concentração elevada é melhorada como comparado com a de uma cepa de controle, e pelo aumento da expressão deste gene em uma bactéria produzindo L-aminoácido, a produtividade para L-valina, L-isoleucina, L-alanina, L-prolina, e L-histidina é melhorada (EP 1013765 A1).

Como descrito acima, o efeito de aumento de expressão do gene yeaS na produção de vários aminoácidos foi investigado (Kutukova et al., FEBS Lett., 579, 4629 - 4634 (2005)). No entanto, não se conhece qualquer mutação do gene yeaS que melhora a produtividade de L- aminoácido.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um aspecto da presente invenção é para desenvolver novas técnicas para melhorar a capacidade de produzir L-aminoácido das bactérias, e assim prover uma bactéria produzindo L-aminoácido, e um método para produzir um L-aminoácido usando esta bactéria.

Este aspecto foi obtido ao se descobrir que a capacidade de produzir L-aminoácido de uma bactéria pode ser melhorada por introdução de uma mutação específica no gene yeaS.

E um aspecto da presente invenção obter um método para produzir um L-aminoácido compreendendo:

a) cultivar em um meio uma bactéria pertencendo à família Enterobacteriaceae, que tem uma capacidade de produzir L-aminoácido, e que foi modificada para ter um gene yeaS mutante tendo uma mutação selecionada dentre o grupo consistindo de:

(I) uma mutação para substituição de um resíduo de aminoácido diferente de resíduo de treonina pelo resíduo de treonina em posição 28 na proteína codificada pelo gene yeaS,

(II) uma mutação para substituição de um resíduo de aminoácido diferente de resíduo de fenilalanina pelo resíduo de fenilalanina em posição 137 na proteína codificada pelo gene yeaS, e

(III) uma mutação para substituição de um resíduo de aminoácido diferente de resíduo de leucina pelo resíduo de leucina em posição 188 na proteína codificada pelo gene yeaS, e,

b) coletar o L-aminoácido do meio, em que o gene yeaS sem referida mutação ou mutações codifica para uma proteína selecionada dentre o grupo consistindo de:

(A) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, e (B) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, mas em que 1 a 10 resíduos de aminoácidos são substituídos, deletados, inseridos ou adicionados, e a proteína tem uma atividade para melhorar a capacidade de produzir L-cisteína na bactéria pertencendo à família Enterobacteriaceae como comparado com uma bactéria não modificada quando a expressão de uma proteína é aumentada na bactéria.

E um outro aspecto da presente invenção prover o método como descrito acima, em que o gene yeaS sem referida mutação ou mutações é selecionado dentre o grupo consistindo de:

(a) um DNA compreendendo a seqüência nucleotídica de SEQ ID NO: 1, ou

(b) um DNA que é capaz de hibridizar com uma seqüência complementar a uma seqüência nucleotídica de SEQ ID NO: 1 ou uma sonda que pode ser preparada a partir da seqüência nucleotídica sob condições estringentes, e em que referido DNA codifica para uma proteína tendo uma atividade de melhorar uma capacidade de produzir L-cisteína na bactéria pertencendo à família Enterobacteriaceae como comparado a uma cepa não modificada quando a expressão a proteína é aumentada na bactéria.

E um outro aspecto da presente invenção prover um método como descrito acima, em que as mutações de (I) a (III) são mutações dos seguintes (i) a (iii), respectivamente:

(i) uma mutação para substituição de um resíduo de asparagina pelo resíduo de treonina em posição 28,

(ii) uma mutação para substituição de um resíduo de serina, glutamina, alanina, histidina, cisteína ou glicina pelo resíduo de fenilalanina em posição 137,

(iii) uma mutação para substituição de um resíduo de glutamina pelo resíduo de leucina em posição 188.

E um outro aspecto da presente invenção prover o método como descrito acima, em que a bactéria tem um gene yeaS mutante tendo a mutação de (ii), e em uma proteína codificada por este gene, um resíduo de serina ou glutamina substitui pelo resíduo de fenilalanina em posição 137.

E um outro aspecto da presente invenção prover o método como descrito acima, em que o L-aminoácido é selecionado dentre o grupo consistindo de L-cisteína, L-leucina, L-treonina, L-serina, L-metionina, L- histidina, L-valina, ácido L-glutâmico, L-arginina, L-isoleucina, L- fenilalanina, L-tirosina, L-triptofano, e L-prolina.

E um outro aspecto da presente invenção prover o método como descrito acima, em que o L-aminoácido é L-cisteína.

E um outro aspecto da presente invenção prover o método como descrito acima, em que a bactéria foi modificada para aumentar a atividade de uma enzima do sistema de biossíntese de L-cisteína.

É um outro aspecto da presente invenção prover o método como descrito acima, em que a bactéria foi modificada para aumentar a atividade de serina acetiltransferase.

E um outro aspecto da presente invenção prover o método como descrito acima, em que a bactéria tem uma serina acetiltransferase mutante em que retroinibição por L-cisteína é reduzida.

E um outro aspecto da presente invenção prover o método como descrito acima, em que a bactéria é uma bactéria Pantoea.

E um outro aspecto da presente invenção prover o método como descrito acima, em que a bactéria é Pantoea ananatis.

E um outro aspecto da presente invenção prover o método como descrito acima, em que a bactéria é Escherichia eoli.

E um outro aspecto da presente invenção prover uma bactéria pertencendo à família Enterobaeteriaeeae, que tem uma capacidade de produzir L-cisteína, e foi modificada para ter um gene yeaS mutante tendo uma mutação selecionada dentre o grupo consistindo de: (I) uma mutação para substituição de um resíduo de aminoácido diferente de resíduo de treonina pelo resíduo de treonina em posição 28 na proteína codificada pelo gene yeaS,

em que o gene yeaS sem referida mutação ou mutações codifica para uma proteína selecionada dentre o grupo consistindo de:

(A) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, e

(B) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, mas em que 1 a 10 resíduos de aminoácidos são substituídos, deletados, inseridos ou adicionados, e a proteína tem uma atividade de melhorar uma capacidade de produzir L-cisteína em uma bactéria pertencendo à família Enterobacteriaceae como comparado com uma bactéria não modificada quando a expressão de uma proteína é aumentada na bactéria.

E um outro aspecto da presente invenção prover a bactéria como descrito acima, em que o L-aminoácido é L-cisteína.

E um outro aspecto da presente invenção prover um DNA que codifica para uma proteína selecionada dentre o grupo consistindo de:

(A) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, e

(B) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, mas em que 1 a 10 resíduos de aminoácidos são substituídos, deletados, inseridos ou adicionados, e a proteína tem uma atividade de melhorar uma capacidade de produzir L-cisteína em uma bactéria pertencendo à família Enterobacteriaceae como comparado com uma bactéria não modificada quando a expressão de uma proteína é aumentada na bactéria,

em que a proteína tem uma mutação selecionada dentre o grupo consistindo de:

(I) uma mutação para substituição de um resíduo de aminoácido diferente de resíduo de treonina pelo resíduo de treonina em posição 28,

(II) uma mutação para substituição de um resíduo de aminoácido diferente de resíduo de fenilalanina pelo resíduo de fenilalanina em posição 137, e

(III) uma mutação para substituição de um resíduo de aminoácido diferente de resíduo de leucina pelo resíduo de leucina em posição 188.

De acordo com a presente invenção, capacidade de produzir L- aminoácido de uma bactéria pertencendo à família Enterobaeteriaeeae pode ser melhorada. Além disso, por usar a bactéria da presente invenção, L- aminoácidos pode ser eficientemente produzido por fermentação.

Além disso, a presente invenção também provê um novo gene de codificação para uma proteína tendo uma atividade de melhorar a capacidade de produzir L-aminoácido de uma célula hospedeira comparado com uma cepa não modificada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Fig. 1 mostra a seqüência do promotor Pnlp.

Fig. 2 mostra resistência a cisteína de uma cepa otimizada em YeaSF137S de E. eoli MG1655 (curva de crescimento). O símbolo o representa os resultados para um tipo selvagem, e o símbolo · representa os resultados para a cepa mutante F137S.

Fig. 3 mostra concentrações de aminoácido no meio de cultura de cepas otimizadas em YeaSWT- e YeaSF 137S de P ananatis. Fig. 4 mostra concentrações de aminoácido em meio de cultura de cepas otimizadas em YeaSWT- e YeaSF 137S de E. coli.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS

<1> Bactéria

A bactéria de acordo com o assunto ora descrito tem uma capacidade de produzir L-aminoácido, e foi modificada para ter um gene yeaS mutante tendo uma mutação específica.

Apesar do tipo do L-aminoácido não ser particularmente limitado, exemplos incluem aminoácidos básicos como L-lisina, L-ornitina, L-arginina, L-histidina e L-citrulina, aminoácidos alifáticos como L- isoleucina, L-alanina, L-valina, L-Ieucina e L-glicina, aminoácidos que são ácidos hidróxi-monoaminocarboxílico como L-treonina e L-serina, aminoácidos cíclicos como L-prolina, aminoácidos aromáticos como L- fenilalanina, L-tirosina e L-triptofano, aminoácidos contendo enxofre como L-cisteína, L-cistina e L-metionina, e aminoácidos ácidos como ácido L- glutâmico, ácido L-aspártico, L-glutamina e L-asparagina. L-cisteína, L- leucina, L-treonina, L-serina, L-metionina, L-histidina, L-valina, ácido L- glutâmico, L-arginina, L-isoleucina, L-fenilalanina, L-tirosina, L-triptofano, e L-prolina, e especialmente L-cisteína são exemplos particulares. A bactéria de acordo com o assunto ora descrito pode ter uma capacidade para produzir dois ou mais tipos de aminoácidos.

L-aminoácido inclui L-aminoácido em uma forma livre e sais dos mesmos como sulfatos, hidrocloretos, carbonatos, sais de amônio, sais de sódio, e sais de potássio.

A capacidade de produzir L-aminoácido pode significar uma capacidade de uma bactéria para produzir e causar acúmulo de um L- aminoácido em um meio ou células de uma bactéria em tal quantidade que o L-aminoácido pode ser coletado do meio ou células quando a bactéria é cultivada no meio. A bactéria tendo uma capacidade de produzir L- aminoácido pode significar uma bactéria que pode produzir e causar acúmulo de uma quantidade maior de L-aminoácido em um meio como comparado para uma cepa de tipo selvagem ou parental, e a bactéria que pode produzir e causar acúmulo de um L-aminoácido em um meio em uma quantidade de 0,2 g/L ou mais, 0,3 g/L ou mais, ou ainda 0,4 g/L ou mais.

Quando o L-aminoácido é L-cisteína, uma parte de L-cisteína produzida por uma bactéria pode mudar na L-cistina em um meio por formação de ligação dissulfeto. Além disso, como descrito abaixo, S- sulfocisteína pode ser gerada pela reação de L-cisteína e ácido tiossulfürico contido no meio (Szczepkowski T. W., Nature, vol. 182 (1958)). Além disso, L-cisteína gerada em células bacterianas pode ser condensada com uma cetona, aldeído, ou, por exemplo, ácido pirúvico, que existe nas células, para produzir um derivado de tiazolidina via um hemitiocetal como um intermediário (fazer referência à patente japonesa No. 2992010). Este derivado de tiazolidina e hemitiocetal pode existir como uma mistura equilibrada. Deste modo, a capacidade de produzir L-cisteína não é limitada à capacidade para acumular somente L-cisteína em um meio ou células, mas também inclui uma capacidade para acumular, além de L-cisteína, L-cistina ou um derivado da mesma como S-sulfocisteína, um derivado tiazolidina, ou um hemitiocetal ou uma mistura do mesmo no meio. A "L-cisteína" produzida pelo método de acordo com o assunto ora descrito refere-se a, salvo especificamente mencionado, L-cisteína de tipo reduzido, L-cistina, um derivado como o mencionado acima ou uma mistura dos mesmos.

A bactéria tendo uma capacidade de produzir L-aminoácido pode ser uma bactéria inerentemente tendo uma capacidade de produzir L- aminoácido, ou pode ser obtido por modificação de uma bactéria como o descrito abaixo por técnicas de mutagênese ou DNA recombinante para obter uma capacidade de produzir L-aminoácido. A bactéria não é particularmente limitada desde que a bactéria pertença à família Enterobacteriaceae como dos gêneros Eseherichia, Enterobaeter, Pantoea, Klebsiella, Serratia, Erwinia, Salmonella e Morganella, e tenha a capacidade de produzir L-cisteína. Especificamente, as classificadas entre a família Enterobaeteriaeeae de acordo com a taxonomia usados nas bases de dados do NCBI (National Center for Biotechnology Information)

(http ://www.ncbi .nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi ?id=91347) podem ser usadas. Como a cepa parental da família Enterobaeteriaeeae usada para a modificação, é desejável usar especialmente, as bactérias dos gêneros Eseheriehia, Enterobaeter, Pantoea, Erwinia, ou Klebsiella.

Apesar das bactérias Eseheriehia não serem particularmente limitadas, especificamente, as descritas no trabalho de Neidhardt et al. (Backmann B. J., 1996, Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Eseheriehia eoli K-12, p. 2460 - 2488, tabela 1, In F. D. Neidhardt (ed.), Eseheriehia eoli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/segunda edição, American Society for Microbiology Press, Washington, D. C.) podem ser usadas. Dentre estas, Eseheriehia eoli é um exemplo. Exemplos de Eseheriehia eoli incluem Eseheriehia eoli W3110 (ATCC 27325), Eseheriehia eoli MGl655 (ATCC 47076) e assim por diante, derivadas do protótipo de cepa de tipo selvagem, Cepa Kl 2.

Estas cepas são disponíveis de, por exemplo, American Type Culture Collection (Endereço: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, Estados Unidos da América). Isto é, números de acesso são dados para cada uma das cepas, e as cepas podem ser ordenadas por uso destes números de registro (fazer referência a http://www.atcc.org/). Os números de acesso das cepas são listados no catálogo do American Type Culture Collection. Exemplos das bactérias Enterobacter incluem Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes e assim por diante, e exemplos das bactérias Pantoea incluem Pantoea ananatis. Algumas cepas de Enterobacter agglomerans foram recentemente reclassificadas em Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, ou Pantoea stewartii com base na análise da seqüência nucleotídica de 16S rRNA etc. A bactéria pertencente a qualquer do gênero Enterobaeter ou Pantoea pode ser usada desde que ela seja uma bactéria classificada na família Enterobacteriaceae.

Em particular, bactérias Pantoea, bactérias Erwinia, e bactérias Enterobacter são classificadas como γ-proteobactérias, e elas são taxonomicamente muito próximas umas das outras (J. Gen. Appl. Microbiol., 1997, 43, 355 - 361; International Journal of Systematic Bacteriology, outubro de 1997, pp. 1061 - 1067). Nos últimos anos, algumas bactérias pertencendo ao gênero Enterobaeter foram reclassificadas como Pantoea agglomerans, Pantoea dispersa, ou outros, com base em experimentos de hibridização de DNA-DNA etc. (International Journal of Systematic Bacteriology, julho de 1989, 39: 337 - 345). Além disso, algumas bactérias pertencendo ao gênero Erwinia foram reclassificadas como Pantoea ananas ou Pantoea stewartii (fazer referência a International Journal of Systematic BacteriologyJaneiro de 1993, 43(1), pp. 162 - 173).

Exemplos das bactérias Enterobaeter incluem, mas não são limitados a, Enterobaeter agglomerans, Enterobaeter aerogenes, e semelhanes. Especificamente, as cepas exemplificadas na publicação de patente européia No. 952221 podem ser usadas. Uma cepa típica do gênero Enterobaeter é a cepa Enterobacter agglomerans es ATCC 12287.

As cepas típicas das bactérias Pantoea incluem, mas não são limitadas para, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii, Pantoea agglomerans, e Pantoea eitrea. Exemplos específicos de Pantoea ananatis incluem a cepa Pantoea ananatis AJl3355, a cepa SC17, e a cepa SC 17(0). A cepa SC17 é uma cepa selecionada como uma cepa mutante com baixa produção de flegma da cepa AJ13355 (FERM BP-6614) isolada do solo em Iwata-shi, Shizuoka- ken, Japão, como uma cepa que pode proliferar em um meio de pH baixo contendo ácido L-glutâmico e uma fonte de carbono (patente U.S. No. 6.596.517). A cepa SC 17(0) foi construída como uma cepa resistente ao produto do gene λ Red para a realização de disruptura do gene em Pantoea ananatis (W02008/075483). A cepa SC17 foi depositada no National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depository (endereço: Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 - 8566, Japão) em 4 de fevereiro de 2009, e recebeu o número de acesso FERM ABP-11091. A cepa SC 17(0) foi depositada no Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika (endereço: Rússia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd. 1) em 21 de setembro de 2005 com um número de acesso de VKPM B-9246.

A cepa de Pantoea ananatis AJ13355 foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (atualmente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, endereço: Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 - 8566, Japão) em 19 de fevereiro de 1998 e recebeu o número de acesso FERM P- 16644. Ela foi então convertida em um depósito internacional sob as provisões do Tratado de Budapeste em 11 de janeiro de 1999 e recebeu o número de acesso FERM BP-6614. Esta cepa foi identificada como Enterobacter agglomerans quando foi isolada e depositada como a cepa Enterobacter agglomerans AJ13355. No entanto, ela foi recentemente reclassificada como Pantoea ananatis com base no sequenciamento de nucleotídeos de 16S rRNAe semelhantes. Exemplos das bactérias Erwinia incluem, mas não são limitados a, Erwinia amylovora e Erwinia carotovora, e exemplos das bactérias Klebsiella incluem Klebsiella planticola.

Conferir ou otimizar a capacidade de produzir L-aminoácido

Para conferir a capacidade de produzir um L-aminoácido, métodos convencionalmente empregados na criação de bactérias corineformes ou bactérias do gênero Escherichia (ver "Amino Acid Fermentation", Gakkai Shuppan Center (Ltd.), Ia. edição, publicado em 30 de maio de 1986, pp. 77 - 100) podem ser usados. Tais métodos incluem adquirir as propriedades de um mutante auxotrófico, um análogo de cepa resistente, ou um mutante de regulação metabólica, ou construir uma cepa recombinante de modo que ela superexpressa uma enzima biossintética de L-aminoácido. Aqui, na criação de bactérias produzindo L-aminoácido, uma ou mais das propriedades descritas acima como auxotrofia, resistência a análogo, e mutação de regulação metabólica podem ser concedidas. A expressão de enzima(s) biossintética(s) de L-aminoácido pode ser acetuada sozinha ou em combinações de duas ou mais. Além disso, os métodos de conferir propriedades como uma auxotrofia, resistência a análogo, ou mutação de regulação metabólica podem ser combinados com otimização das enzimas biossintéticas.

Uma cepa mutante auxotrófica, cepa resistente a análogo de L- aminoácido, ou cepa mutante de regulação metabólica com uma capacidade para produzir um L-aminoácido pode ser obtida submetendo-se uma cepa parental ou de tipo selvagem a mutagêneses convencionais, como exposição a raios X ou irradiação UV, ou tratamento com um mutagene como N-metil-N'- nitro-N-nitrosoguanidina ou metanossulfonato de etila (EMS), então selecionar a que exibe autotrofia, resistência a análogo, ou a mutação de regulação metabólica e que também tem a capacidade para produzir um L- aminoácido.

Além disso, a capacidade de produzir L-aminoácido também pode ser conferida ou otimizada por aumento da atividade enzimática por recombinação genética. Um exemplo do método para aumentar a atividade enzimática inclui modificar a bactéria de modo que a expressão de um gene de codificação para uma enzima envolvida na biossíntese de um L- aminoácido é otimizada. Expressão de gene também pode ser aumentada por introdução de uma amplificação de plasmídeo preparada por introdução de um fragmento de DNA contendo o gene em um plasmídeo apropriado que contém, por exemplo, pelo menos um gene responsável pela replicação e proliferação do plasmídeo no microorganismo, aumento do número de cópias do gene no cromossomo por conjugação, transferência, ou outros, ou introdução de uma mutação na região de promotor do gene (fazer referência à publicação de patente internacional WO 95/34672).

Quando um gene objetivo é introduzido no plasmídeo de amplificação ou cromossomo acima mencionado, qualquer promotor pode ser usado para expressar o gene desde que tenha as funções escolhidas do promotor nas bactérias pertencendo à família Enterobacteriaceae. O promotor pode ser o promotor nativo para o gene, ou um promotor modificado. A expressão de um gene também pode ser controlada por escolha apropriada de um promotor que fortalece as funções nas bactérias pertencendo à família Enterobaeteriaceae, ou tornando as regiões do promotor -35 e -10 mais próximas da seqüência de consenso. Estes métodos para otimizar a expressão de genes de enzimas são completamente descritos na publicação de patente internacional WO 00/18935, publicação de patente européia No. 1010755, e semelhantes.

Métodos específicos para conferir uma capacidade de produzir L-aminoácido para bactérias e bactérias dotadas com capacidade de produzir L-aminoácido são exemplificados abaixo.

Bactérias produzindo L-cisteína

Exemplos de bactérias produzindo L-cisteína e cepas parentais para derivar bactérias produzindo L-cisteína incluem, mas não são limitados a, cepas pertencendo ao gênero Escherichia, como E. coli JM15 que é transformado com alelos cysE diferentes codificando serina acetiltransferases resistentes a realimentação (SAT) (patente U.S. No. 6.218.168); E. coli W3110 tendo genes superexpressados que codificam as proteínas apropriadas para secretar substâncias tóxicas para as células (patente U.S. No. 5.972.663); cepas E. coli tendo atividade dessulfo-hidrase cisteína inferior (patente japonesa acessível ao público No. 11-155571); E. coli W3110 com aumento da atividade de um regulador de transcrição positivo para regulon de cisteína codificado pelo gene cysB (WOO1/27307), e assim por diante. A bactéria de acordo com o assunto ora descrito foi modificada para ter um gene yeaS tendo uma mutação específica. Como será descrito abaixo, presume-se que uma proteína codificada pelo gene yeaS (daqui em diante também referido como "proteína YeaS") tem uma atividade de secretar L-aminoácidos como L- cisteína fora das células.

Para E. coli, as proteínas conhecidas tendo uma atividade de secretar L-cisteína, não são conhecidas como uma proteína codificada por ydeD (patente japonesa acessível ao público No. 2002-233384), a proteína codificada por yfiK (patente japonesa acessível ao público No. 2004-49237) e as proteínas codificadas por emrAB, emrKY, yojIH, acrEF, bcr, e eus A, respectivamente (patente japonesa acessível ao público No. 2005-287333) como descrito acima. Além de levar a bactéria a ter um gene yeaS mutante, esta atividade SAT resistente à retroinibição e atividade de proteínas secretando L -cisteína pode ser aumentada.

A seguir, como o método para conferir uma capacidade para produzir L-cisteína, a otimização de uma atividade de enzima do sistema de biossíntese de L-cisteína será explicada.

Exemplos da enzima biossintética L-cisteína incluem, por exemplo, serina acetiltransferase (SAT). A atividade SAT em células de uma bactéria pertencendo à família Enterobacteriaceae pode ser otimizada por aumento do número de cópia de um gene codificando para SAT, ou modificação de uma seqüência de controle de expressão como promotor do gene codificando para SAT. Por exemplo, um DNA recombinante pode ser preparado por ligação de um fragmento do gene codificando para SAT com um vetor, como um vetor de múltiplas cópias, que é capaz de funcionar na bactéria hospedeira escolhida pertencendo à família Enterobaeteriaeeae para preparar um DNA recombinante. Este DNA recombinante pode então ser introduzido em uma bactéria hospedeira pertencendo à família Enterobaeteriaeeae para transformar a mesma. Mais especificamente, pode ser aplicado um método similar ao método para o gene yeaS descrito depois.

Como o gene SAT, qualquer um dos genes derivados de bactérias Eseheriehia e genes derivados de outros organismos pode ser usado. Como o gene codificando para SAT de Eseheriehia eoli, eycE foi clonado a partir de uma cepa de tipo selvagem e uma cepa mutante de excreção de L- cisteína, e a seqüência nucleotídica do mesmo foi elucidada (Denk, D. e Boeck, A., J. General Microbiol., 133, 515 - 525 (1987)). Deste modo, um gene SAT pode ser obtido por PCR utilizando-se iniciadores preparados à base da seqüência nucleotídica (SEQ ID NO: 3) e DNA cromossômico de bactéria Eseheriehia como o gabarito (fazer referência à patente japonesa acessível ao público No. 11-155571). Genes de codificação para SAT de outros organismos também podem ser obtidos em um modo similar. Expressão do gene SAT obtido como descrito acima pode ser otimizada no mesmo modo como explicado acima.

Quando um mecanismo de supressão como "retroinibição por L-cisteína" existe para uma expressão do gene SAT, expressão do gene SAT também pode ser otimizada por modificação de uma seqüência de expressão regulatória ou um gene envolvido na supressão de modo que a expressão do gene SAT é insensível para o mecanismo de supressão. Por exemplo, a atividade SAT pode ser ainda aumentada levando a bactéria Enterobacteriaceae a conter SAT em que a retroinibição por L-cisteína é reduzida ou eliminada (daqui em diante também referido como "SAT mutante"). Exemplos do SAT mutante incluem SAT tendo uma mutação substituindo um resíduo de aminoácido correspondendo ao resíduo metionina em posição 256 de um SAT tipo selvagem (SEQ ID NO: 4) com um resíduo de aminoácido diferente de resíduo de lisina e resíduo de leucina, ou uma mutação deletando uma região lateral de término C de um resíduo de aminoácido correspondendo ao resíduo metionina como posição 256. Exemplos do resíduo de aminoácido diferente de resíduo de lisina e resíduo de leucina incluem os 17 tipos de resíduos de aminoácidos dentre os aminoácidos constituindo proteínas comuns, exceto para metionina, lisina e leucina. Resíduo de isoleucina e resíduo de ácido glutâmico são exemplos. Como um método de introduzir uma mutação desejada em um gene SAT de tipo selvagem, mutagênese sítio-específico pode ser usada. Como um gene SAT mutante, um mutante eysE de codificação para um SAT mutante de Eseheriehia eoli é conhecido (fazer referência à publicação de patente internacional WO 97/15673 e patente japonesa acessível ao público No. 11- 155571). Cepa Escheriehia eoli JM39-8 abrigando um plasmídeo pCEM256E contendo um mutante eysE de codificação para um SAT mutante em que o resíduo de metionina em posição 256 é substituído com um resíduo de ácido glutâmico {E. eoli JM39-8(pCEM256E), número particular: AJ13391) foi depositado junto ao National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (código postal: 305, 1-3 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão) em 20 de novembro de 1997 e recebeu o número de acesso FERM P-16527. O depósito foi então convertido em um depósito internacional sob as provisões de Tratado de Budapeste em 8 de julho de 2002, e recebeu um número de acesso FERM BP- 8112. Apesar de "SAT insensível à retroinibição por L-cisteína" poder ser SAT que foi modificado de modo a ser insensível à retroinibição por L-cisteína, ele pode ser um SAT originalmente livre da retroinibição por L- cisteína. Por exemplo, SAT de Arabidopsis thaliana é conhecido como sendo livre da retroinibição por L-cisteína e pode ser apropriadamente usado. Como um plasmídeo contendo o gene SAT derivado de Arabidopsis thaliana, pEAS- m é conhecido (FEMS Microbiol. Lett., 179 (1999) 453 - 459).

Além disso, a capacidade de produzir L-cisteína também pode ser melhorada otimizando-se a expressão dos genes de agrupamento cysPTWAM codificando para as proteínas do sistema de transporte sulfato/tiossulfato (patente japonesa acessível ao público No. 2005-137369, EP 1528108).

Além disso, um sulfeto é incorporado em O-acetil-L-serina via uma reação catalisada pela O-acetilserina (tiol)-liase A ou B codificada por genes cysK e cysM, respectivamente, para produzir L-cisteína. Deste modo, a capacidade de produzir L-cisteína também pode ser melhorada otimizando-se a expressão dos genes codificando para estas enzimas.

Um gene objetivo pode ser modificado para otimizar a expressão, por exemplo, por aumento do número de cópias do gene objetivo nas células por meios de técnicas de recombinação genética. Por exemplo, um DNA recombinante pode ser preparado por ligação de um fragmento de DNA contendo o gene objetivo com um vetor, como um vetor de múltiplas cópias, que é capaz de funcionar em um microorganismo hospedeiro, e introduzido em uma bactéria para transformar o mesmo.

O número de cópias de um gene objetivo também pode ser aumentado por introdução de cópias plural do gene objetivo em um DNA cromossômico de uma bactéria. Várias cópias do gene objetivo podem ser introduzidas em um DNA cromossômico de uma bactéria pelo método descrito depois para o gene mutante yeaS. Além da amplificação do número de cópia do gene descrito acima, a expressão de um gene objetivo também pode ser otimizada por substituição de uma seqüência de expressão regulatória do gene objetivo yeaS, como um promotor, em um DNA cromossômico ou um plasmídeo com um promotor forte, amplificação de um regulador que aumenta a expressão do gene objetivo, ou deleção ou atenuação de um regulador que reduz a expressão do gene objetivo. Como um regulador que reduz a expressão de um gene objetivo, a proteína Lrp e semelhantes são conhecidos (Kutukova et al., FEBS Lett., 579, 4629 - 4634 (2005)). Como promotores fortes, por exemplo, promotor Iac, promotor trp, promotor trc e semelhantes são conhecidos. Além disso, um promotor de um gene objetivo também pode ser modificado para ser resistente por introdução de substituição de nucleotídeos ou outros na região de promotor do gene objetivo. A substituição acima mencionada ou modificação do promotor otimiza a expressão do gene objetivo. Exemplos de métodos para avaliar a força dos promotores e os promotores resistentes são descritos em um artigo por Goldstein e Doi (Goldstein, M. A. e Doi R. H., 1995, Prokaryotic promotors in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128), e assim por diante. A modificação de uma seqüência de expressão regulatória pode ser combinada como aumento do número de cópias de um gene objetivo. Além disso, a fim de otimizar a produção de um produto do gene objetivo, uma mutação pode ser introduzida próxima ao sítio de iniciação de tradução do gene objetivo para aumentar a eficiência da tradução, e isto pode ser combinado com a otimização de expressão do gene objetivo.

O aumento do nível de expressão do gene objetivo pode ser confirmado por comparação da quantidade de mRNA transcrito do gene objetivo com o da cepa tipo selvagem não modificada. Exemplos do método para confirmar a quantidade de mRNA incluem hibridização Northern e PCR de transcriptase reversa (RT-PCR, Sambrook, J., e Russell, D.W., Molecular Cloning A Laboratory Manual/terceira edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001).

O aumento da quantidade de um produto do gene objetivo também pode ser confirmado por Western blotting usando um anticorpo ("Molecular Cloning..." acima mencionado).

Além disso, a capacidade de produção de L-cisteína também pode ser otimizada por supressão do sistema de decomposição de L-cisteína. A frase o sistema de decomposição de L-cisteína é suprimido ' pode significar que a atividade de decomposição de L-cisteína intracelular é diminuída como comparada com a de uma cepa não modificada como uma cepa de tipo selvagem ou parental. As proteínas responsáveis pelo sistema de decomposição de L-cisteína, cistationina-P-liase (produto metC, patente japonesa acessível ao público No. 11-155571, Chandra et al., Biochemistry, 21 (1982) 3064 - 3069), triptofanoase (produto tnaA, patente japonesa acessível ao público No. 2003-169668, Austin Newton et al., J. Biol. Chem., 240 (1965) 1211 - 1218)), O-acetilserina sulfhidrilase B (produto do gene cysM, patente japonesa acessível ao público No. 2005-245311) e o produto do gene malY (patente japonesa acessível ao público No. 2005-245311) são conhecidos. Por diminuição das atividades destas proteínas, a capacidade de produzir L-cisteína melhorou.

A atividade de uma proteína pode ser diminuída por, por exemplo, redução da expressão de um gene de codificação para uma proteína. Especificamente, por exemplo, a atividade intracelular de uma proteína pode ser reduzida por deleção de uma parte de, ou da região de codificação completa do gene em um cromossomo. A expressão de um gene também pode ser diminuída por modificação de uma seqüência de controle de expressão do gene como promotor e seqüência Shine-Dalgarno (SD). Além disso, a expressão do gene também pode ser reduzida por modificação de uma região de não tradução diferente da seqüência de controle de expressão. Além disso, o gene completo, incluindo as seqüências em ambos os lados do gene em um cromossomo, pode ser deletado. Além disso, a expressão do gene também pode ser reduzida por introdução de uma mutação para uma substituição de aminoácido (mutação de sentido negativo), um códon parado (mutação não sentido), ou uma mutação por deslocamento de quadro que adiciona ou deleta um ou dois nucleotídeos na região de codificação do gene objetivo em um cromossomo (Journal of Biological Chemistry, 272: 8611 - 8617 (1997); Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 95 5511 - 5515 (1998); Journal of Biological Chemistry, 266, 20833 - 20839 (1991)).

Além disso, a modificação pode ser uma modificação causada por um mutagênese típico causado por irradiação de raios X ou ultravioleta, ou por uso de um mutagene como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina, desde que a modificação resulte em uma diminuição da atividade da proteína alvo.

Modificação de uma seqüência de controle de expressão é realizada para um ou mais nucleotídeos em um exemplo, dois ou mais nucleotídeos em outro exemplo, três ou mais nucleotídeos em outro exemplo. Quando a região de codificação é deletada, a região a ser deletada pode ser uma região N-terminal, uma região interna ou uma região C-terminal, ou ainda a região de codificação completa, desde que a função da proteína alvo seja diminuída ou deletada. Deleção de uma região mais longa pode geralmente inativar com maior certeza um gene. Além disso, quadros de leitura a montante e a jusante da região a ser deletada podem ser iguais ou diferentes.

Para inativar um gene por inserção de uma seqüência na região de codificação do gene, a seqüência pode ser inserida em qualquer parte da região de codificação do gene. Quanto mais longa a seqüência inserida, maior a possibilidade de inativar o gene. Os quadros de leitura localizados a montante e a jusante do sítio de inserção podem ser iguais ou diferentes. A seqüência a ser inserida não é particularmente limitada desde que diminua a inserção ou delete a função da proteína codificada, e exemplos incluem, por exemplo, um transposon portando um gene de resistência a antibiótico, um gene utilizável para a produção de L-cisteína e semelhantes.

Bactérias produzindo L-treonina

Exemplos de microorganismos tendo capacidade de produzir L-treonina incluem bactérias em que uma ou mais atividades de enzimas do sistema de biossíntese de L -treonina são otimizadas. Exemplos de enzimas biossintéticas de L-treonina incluem aspartoquinase III (IysC), aspartato semialdeído desidrogenase (asd), aspartoquinase I (thrA), homoserina quinase {thrB), treonina sintase (thrC) codificada por operon de thr, e aspartato aminotransferase (aspartato transaminase) (<aspC). Os nomes do genes de codificação para as respectivas enzimas são mencionados em parênteses depois dos nomes das enzimas (o mesmo se aplica em todo este relatório). Dentre estas enzimas, aspartato semialdeído desidrogenase, aspartoquinase I, homoserina quinase, aspartato aminotransferase, e treonina sintase são exemplos. Os genes de codificação para as enzimas biossintéticas de L- treonina podem ser introduzidos em uma bactéria Escherichia que tem uma capacidade reduzida para decompor treonina. Um exemplo desta bactéria Eseheriehia tendo uma capacidade reduzida para decompor treonina é a cepa TDH6 que é deficiente na atividade de treonina desidrogenase (patente japonesa acessível ao público No. 2001-346578).

As atividades enzimáticas das enzimas biossintéticas de L- treonina são inibidas pelo produto final, L-treonina. Deste modo, os genes para as enzimas biossintéticas de L-treonina podem ser modificados de modo que as enzimas são dessensibilizadas para retroinibição por L-treonina nas cepas produzindo L-treonina. Os thrA, thrB, e thrC mencionados acima constituem o operon de treonina, que contém um atenuador. A expressão do operon de treonina é inibida por isoleucina e treonina no meio de cultura e também suprimida por atenuação. Deste modo, o operon de treonina pode ser modificado por remoção da seqüência líder ou da seqüência responsável pela atenuação na região do atenuador (fazer referência a Lynn, S. P., Burton, W. S., Donohue, T. J., Gould, R. M., Gumport, R. L, e Gardner, J. F., J. Mol. Biol. 194: 59 - 69 (1987); WO 02/26993; WO 2005/049808).

O promotor nativo do operon de treonina está presente a montante do operon de treonina, e pode ser substituído com um promotor não ativo (fazer referência a WO 98/04715), ou um operon de treonina que foi modificado de modo que a expressão do gene da biossíntese de treonina é controlada pelo repressor e o promotor de λ-fago pode ser construído (EP 0593792). Além disso, a fim de modificar a bactéria de modo que ela seja dessensibilizada à retroinibição por L-treonina, uma cepa resistente a ácido a- amino-P-hidroxi sovalérico (AHV) pode ser selecionada.

O número de cópias do operon de treonina que é modificado para dessensibilizar para retroinibição por L-treonina pode ser aumentado, ou a expressão do operon de treonina pode ser aumentado por ligação a um promotor potente. O número de cópia também pode ser aumentado por, além de amplificação usando um plasmídeo, transferência do operon de treonina de um genoma usando um transposon, Mu-fago, ou outros.

Diferente de aumentar a expressão dos genes biossintéticos de L-treonina, a expressão dos genes envolvidos na via glicolítica, ciclo TCA, ou cadeia respiratória, os genes que regulam a expressão destes genes, ou os genes envolvidos em absorção de açúcar também podem ser aumentados. Exemplos de tais genes incluem os genes de codificação de trans-hidrogenase (pntAB, EP 733712 B), fosfoenolpiruvato carboxilase (pepC, WO 95/06114), fosfoenolpiruvato sintase (pps, EP 877090 B), e um gene de codificação de piruvato carboxilase de bactéria corineforme ou bactéria Bacillus (WO 99/18228, EP 1092776 A).

Resistência a L-treonina, L-homoserina, ou ambas, pode ser conferida do hospedeiro por, por exemplo, otimizando a expressão de um gene que confere resistência a L-treonina ou L-homoserina. Exemplos destes genes incluem rhtA (Res. Microbiol., 154: 123 - 135 (2003)), rhtB (EP 0994190 A), rhtC (EP 1013765 A), yfiK, QyeaS (EP 1016710 A). Os métodos para conferir a resistência a L-treonina a um hospedeiro são descritos em EP 0994190 A e WO 90/04636.

Exemplos de bactérias produzindo L-treonina e cepas parentais que podem ser usadas para derivar tais bactérias incluem, mas não são limitados a cepas pertencendo ao gênero Escherichia, como E. eoli TDH- 6/pVIC40 (VKPM B-3996) (patente U.S. No. 5.175.107, patente U.S. No. 5.705.371), E. eoli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (patente U.S. No. 5.631.157), E. eoli NRRL-21593 (patente U.S. No. 5.939.307), E. eoli FERM BP-3756 (patente U.S. No. 5.474.918), E. eoli FERM BP-3519 e FERM BP- 3520 (patente U.S. No. 5.376.538), E. eoli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (em russo), 14, 947 - 956 (1978)), E. eoli VL643 e VL2055 (EP 1149911 A) e semelhantes.

A cepa TDH-6 é deficiente no gene thrC, assim como sendo assimilativa de sacarose, e o gene ilvA tem uma mutação hipomórfica. Esta cepa também tem uma mutação no gene rhtA, que confere resistência em concentração elevada de treonina ou homoserina. A cepa B-3996 contém o plasmídeo pVIC40, que foi obtido por inserção do operon thrA *BC, incluindo um gene thrA mutante, no vetor derivado de RSF1010. Este gene thrA mutante codifica aspartoquinase homoserina desidrogenase I que é substancialmente dessensibilizada para retroinibição por treonina. A cepa B-3996 foi depositada em 19 de novembro de 1987 in the All-Union Scientific Center of Antibiotics (Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Rússia) sob o número de acesso RIA 1867. A cepa também foi depositada junto ao Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Rússia) em 7 de abril de 1987 sob o número de acesso VKPM B-3996.

VKPM B-5318 de E. eoli (EP 0593792 B) também pode ser usado como uma bactéria produzindo L-treonina ou uma cepa parental para derivar a mesma. A cepa B-5318 é prototrófica com relação a isoleucina, e um promotor PR e repressor Cl de fago lambda sensível à temperatura substituem a região de regulação do operon de treonina no plasmídeo pVIC40. A cepa VKPM B-5318 foi depositada junto ao Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Rússia) em 3 de maio de 1990 sob o número de acesso de VKPM B-5318.

O gene thrA que codifica aspartoquinase homoserina desidrogenase I de Escherichia coli foi elucidado (posições de nucleotídeos 337 a 2799, número de acesso do GenBank NC_000913.2, gi: 49175990). O gene thrA está localizado entre os genes thrL e thrB no cromossomo de E. coli K-12. O gene thrB que codifica homoserina quinase de Eseherichia coli foi elucidado (posições de nucleotídeos 2801 a 3733, número de acesso GenBank NC 000913.2, gi: 49175990). O gene thrB está localizado entre os genes thrA e thrC no cromossomo de E. coli K-12. O gene thrC que codifica treonina sintase de Escherichia coli foi elucidado (posições de nucleotídeos 3734 a 5020, número de acesso GenBank NC 000913.2, gi: 49175990). O gene thrC está localizado entre o gene thrB e a matriz de leitura aberta de yaaX no cromossomo de E. coli K-12. Todos os três genes funcionam como um operon de treonina único. Para otimizar a expressão do operon de treonina, a região do atenuador que afeta a transcrição desejavelmente é removida do operon (WO 2005/049808, WO 2003/097839).

Um gene thrA mutante que codifica para aspartoquinase homoserina desidrogenase I resistente à retroinibição por treonina, assim como os genes thrB e thrC podem ser obtidos como um operon a partir do plasmídeo pVIC40 bem conhecido, que está presente na cepa de E. coli produzindo treonina VKPM B-3996. pVIC40 é descrito em detalhes na patente U.S. No. 5.705.371. O gene rhtA está presente a 18 min no cromossomo de E. coli próximo ao operon de glnHPQ, que codifica os componentes do sistema de transporte de glutamina. O gene rhtA é idêntico a ORFl (gene ybiF, números de nucleotídeo 764 a 1651, número de acesso GenBank AAA218541, gi:440181) e está localizado entre os genes pexB e ompX. A unidade expressando a proteína codificada pelo ORPl foi designada o gene rhtA (rht: resistência a homoserina e treonina). Também, foi revelado que a mutação rhtA23 é uma substituição A-por-G em posição -1 com relação ao códon de partida ATG (ABSTRACTS of the 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, Califórnia 24-29 de agosto de 1997, resumo No. 457, EP 1013765 A).

O gene asd de E. coli já tinha sido elucidado (números de nucleotídeo 3572511 a 3571408, número de acesso GenBank NC_000913.1, gi: 16131307), e pode ser obtido por PCR (reação de cadeia de polimerase; fazer referência a White, T. J. et al., Trends Genet, 5, 185 (1989)) utilizando iniciadores preparados à base da seqüência nucleotídica do gene. Os genes asd de outros microorganismos também podem ser obtidos em um modo similar.

Também, o gene aspC de E. coli já tinha sido elucidado (números de nucleotídeo 983742 a 984932, número de acesso GenBank NC 000913.1, gi: 16128895), e pode ser obtido por PCR. Os genes aspC de outros microorganismos também podem ser obtidos em um modo similar.

Bactérias produzindo L-lisina

Exemplos de bactérias produzindo L-Iisina pertencendo ao gênero Escherichia incluem mutantes tendo resistência a um análogo de L- lisina. Análogos de L-Iisina inibem o crescimento de bactérias Eseheriehia, mas esta inibição é completamente ou parcialmente dessensibilizada quando L-Iisina está presente no meio. Exemplos destes análogos de L-Iisina incluem, mas não são limitados a, oxalisina, lisina hidroxamato, S-(2-aminoetil)-L- cisteína (AEC), γ-metillisina, α-clorocaprolactamo, e assim por diante. Mutantes tendo resistência a estes análogos de lisina podem ser obtidos submetendo-se as bactérias Escherichia a tratamentos convencionais de mutagênese artificial. Exemplos específicos de bactérias de cepas utilizáveis para produzir L-Iisina incluem Eseheriehia eoli AJl 1442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; ver patente U.S. No. 4.346.170) e Eseheriehia eoli VL611. Nestes microorganismos, a retroinibição de aspartoquinase por L-Iisina é dessensibilizada.

Exemplos de bactérias produzindo L-Iisina e cepas parentais que podem ser usados para derivar as bactérias produzindo L-Iisina também incluem cepas em que a expressão de um ou mais genes codificando uma enzima biossintética de L-Iisina é otimizada. Exemplos de tais enzimas incluem, mas não são limitados a, di-hidrodipicolinato sintase (dapA), aspartoquinase (IysC), di-hidrodipicolinato redutase (dapB), diaminopimelato decarboxilase (IysA), diaminopimelato desidrogenase (ddh) (patente U.S. No. 6.040.160), fosfoenolpiruvato carboxilase (ppe), aspartato semialdeído desidrogenease (asd), diaminopimelato epimerase («dapF), gene aspartato semialdeído desidrogenease {asd), tetra-hidrodipicolinato succinilase (dapD), succinil diaminopimelato deacilase {dapE), e aspartase (aspA) (EP 1253195 A). Dentre estas enzimas, di-hidrodipicolinato redutase, diaminopimelato decarboxilase, diaminopimelato desidrogenase, fosfoenolpirvato carboxilase, aspartato aminotransferase, diaminopimelato epimerase, aspartato semialdeído desidrogenease, tetra-hidrodipicolinato succinilase, e succinil diaminopimelato deacilase são exemplos particulares. Além disso, as cepas parentais podem expressar níveis aumentados dos genes envolvidos em eficiência energética (eyo) (EP 1170376 A), o gene codificando nicotinamida nucleotídeo trans-hidrogenase (pntAB) (patente U.S. No. 5.830.716), o gene ybjE (WO 2005/073390), ou combinações dos mesmos.

Exemplos de bactérias produzindo L-Iisina e cepas parentais que podem ser usadas para derivar as bactérias produzindo L-Iisina também incluem cepas em que a atividade de uma ou mais enzimas, que catalisam uma ou mais reações que dirigem a síntese de um ou mais compostos diferentes de L-lisina, por exemplo, dirigindo a síntese afastada da via biossintética de L-lisina, é reduzida ou eliminada. Exemplos destas enzimas incluem homoserina desidrogenase, lisina decarboxilase (patente U.S. No. 5.827.698), e a enzima málica (WO 2005/010175).

Diminuição de atividade de enzima pode ser obtida por, por exemplo, deleção de uma parte de ou da região de codificação completa de um gene de enzima alvo em um cromossomo, ou inserção de outra seqüência na região de codificação. As técnicas também são chamadas de disruptura do gene. Um gene alvo também pode ser inativado por diminuição da expressão do gene via modificação de uma seqüência de controle de expressão do gene alvo como um promotor ou seqüência de Shine Dargarno (SD). Diminuição da expressão inclui a diminuição de transcrição e tradução. Expressão de um gene também pode ser reduzida por modificação de uma região não de tradução diferente de controle de regiões de expressão.

Além disso, gene alvo completo incluindo regiões a montante e a jusante do gene em um cromossomo pode ser deletado. Além disso, um gene alvo também pode ser inativado por introdução de uma mutação para uma substituição de aminoácido (mutação sentido negativo), um códon parado (mutação não sentido), ou mutação de deslocamento de quadro que adicionam ou deletam um ou dois nucleotídeos na região de codificação do gene alvo em um cromossomo (Journal of Biological Chemistry, 272: 8611 - 8617 (1997), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 95 5511 - 5515 (1998), Journal of Biological Chemistry, 266, 20833 - 20839 (1991)). Um exemplo de uma cepa produzindo L-Iisina é E. coli WC196AcadAAldcC/pCABD2 (W02006/078039). Esta cepa foi obtida por introdução do plasmídeo pCABD2 contendo genes da enzima biossintética lisina (patente U.S. No. 6.040.160) na cepa WC196, em que os genes cadA e IdcC de codificação para lisina decarboxilase são disrompidos. A cepa WC196 foi criada a partir da cepa W3110, que foi derivada de Escherichia coli K-12, por substituição do gene IysC de tipo selvagem no cromossomo da cepa W3110 com um gene IysC mutante codificando um mutante aspartoquinase III dessensibilizado para retroinibição por L-Iisina em que treonina em posição 352 foi substituído com isoleucina, e conferindo resistência a AEC à cepa resultante (patente U.S. No. 5.661.012). A cepa WC196 foi designada Eseheriehia coli AJ13069 e foi depositada junto ao National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (atualmente National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 - 8566, Japão) 6 de dezembro de 1994 e recebeu um número de acesso FERM P- 14690. A seguir, ela foi convertida para um depósito internacional sob as provisões do Tratado de Budapeste em 29 de setembro de 1995, e recebeu um número de acesso FERM BP-5252 (patente U.S. No. 5.827.698). A cepa WC196AcadAAldcC sozinha também é cepa produzindo L-lisina. A cepa WC196AcadAAldcC foi designada Eseherichia coli AJl 10692 e foi depositada junto ao National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Tsukuba Central 6, 1- 1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 - 8566, Japão) em 7 de outubro de 2008 como um depósito internacional sob as provisões do Tratado de Budapeste e recebeu um número de acesso FERM BP-11027.

O plasmídeo pCABD2 contém o gene dapA derivado de Escherichia coli, que foi mudado de modo a codificar di-hidrodipicolinato sintase (DDPS) que é dessensibilizada para a retroinibição por L-lisina, o gene lysC derivado de Escherichia coli, que foi mudado para codificar aspartoquinase III que é dessensibilizada para retroinibição por L-lisina, o gene dapB derivado de Eseheriehia coli codificado para di-hidrodipicolinato redutase, e o gene ddh derivado de Brevibaeteria laetofermentum codificado para diaminopimelato desidrogenase (WO 95/16042, WO 01/53459).

Bactérias produzindo L-Ieucina

Exemplos de bactérias produzindo L-Ieucina e cepas parentais que podem ser usadas para derivar as bactérias produzindo L-Ieucina incluem, mas não são limitados a, cepas bacterianas Eseheriehia, como cepas de E. coli resistentes a leucina (por exemplo, a cepa 57 (VKPM B-7386, patente U.S. No. 6.124.121)) ou análogos de leucina incluindo β-2-tienilalanina, 3- hidroxileucina, 4-azaleucina, 5,5,5-trifluoroleucina, e assim por diante (publicação de patente japonesa (Kokoku) No. 62-34397 e patente japonesa acessível ao público No. 8-70879), cepas de E. coli obtidas pelo método genérico de engenharia, descrito em WO 96/06926, E. coli H-9068 (patente japonesa acessível ao público No. 8-70879), e assim por diante.

A bactéria pode ser melhorada otimizando-se a expressão de um ou mais genes envolvidos na biossíntese de L-leucina. Exemplos de tais genes incluem os genes do operon de leuABCD, do qual um exemplo típico é o gene IeuA mutante codificando para isopropil malato sintase que foi mudado para ser dessensibilizado para a retroinibição por L-leucina (patente U.S. No. 6.403.342). Além disso, a bactéria pode ser melhorada otimizando- se a expressão de um ou mais genes de codificação para proteínas que aumentam a secreção de L-aminoácido de células bacterianas. Exemplos de tais genes incluem b2682 e b2683 (os genesygaZH) (EP 1239041 A2).

Bactérias produzindo L-histidina

Exemplos de bactérias produzindo L-histidina e cepas parentais que podem ser usadas para derivar as bactérias produzindo L- histidina incluem, mas não são limitados a, cepas bacterianas Escherichia, como cepa de E. coli 24 (VKPM B-5945, RU2003677), cepa de E. coli 80 (VKPM B-7270, RU2119536), E. coli NRRL B-12116 - B 12121 (patente U.S. No. 4.388.405), E. coli H-9342 (FERM BP-6675), E. coli H-9343 (FERM BP-6676) (patente U.S. No. 6.344.347), E. coli H-9341 (FERM BP- 6674) (EP 1085087), E. coli AI80/pFM201 (patente U.S. No. 6.258.554), e assim por diante.

Exemplos de bactérias produzindo L-histidina e cepas parentais que podem ser usadas para derivar as bactérias produzindo L- histidina também incluem cepas em que a expressão de um ou mais genes codificando enzimas biossintéticas de L-histidina é otimizada. Exemplos de tais genes incluem os genes codificando ATP fosforibosiltransferase (hisG), fosforibosil AMP ciclo-hidrolase (hisl), fosforibosil-ATP pirofosfo-hidrolase (hisIE), fosforibosilformimino-5-aminoimidazol carboxamida ribotídeo isomerase (hisA), amidotransferase (hisH), histidinol fosfato aminotransferase (hisC), histidinol fosfatase (hisB), histidinol desidrogenase (hisD), e assim por diante.

Também se sabe que as enzimas biossintéticas de L-histidina codificadas por hisG e hisBHAFI são inibidas por L-histidina, e deste modo a capacidade para produzir L-histidina também pode ser eficientemente otimizada por introdução de uma mutação que confere a resistência à retroinibição no gene codificando para ATP fosforibosiltransferase {hisG) (patente russa Nos. 2003677 e 2119536).

Exemplos específicos de cepas que são capazes de produzir L- histidina incluem E. coli FERM-P 5038 e 5048 que foram transformadas com um vetor portando um DNA codificando uma enzima biossintética de L- histidina (patente japonesa acessível ao público No. 56-005099), cepas de E. coli transformadas com um gene codificando uma proteína envolvida em exportação de aminoácido (EP 1016710 A), cepa de E. coli 80 que é resistente a sulfaguanidina, DL-l,2,4-triazol-3-alanina, e estreptomicina (VKPM B- 7270, patente russa No. 2119536), e assim por diante.

Bactérias produzindo ácido L-glutâmico

Exemplos de bactérias produzindo ácido L-glutâmico e cepas parentais que podem ser usadas para derivar as bactérias produzindo ácido L- glutâmico incluem, mas não são limitados a, cepas bacterianas de Escherichia, como E. coli VL334thrC+ (EP 1172433). E. coli VL334 (VKPM B-1641) é auxotrófica para L-isoleucina e L-treonina e contém thrC mutante e genes ilvA (patente U.S. No. 4.278.765). Um alelo de tipo selvagem do gene thrC foi transferido por tradução geral usando bacteriófago Pl cultivado em células E. coli Kl2 (VKPM B-7) de tipo selvagem, resultando em uma cepa, que é capaz de produzir ácido L-glutâmico. Esta cepa foi chamada VL334thrC+ (VKPM B-8961).

Exemplos de bactérias produzindo ácido L-glutâmico e cepas parentais que podem ser usadas para derivar as bactérias produzindo ácido L- glutâmico também incluem, mas não são limitados a, cepas em que expressão de um ou mais genes codificando uma enzima biossintética de ácido L- glutâmico é otimizada. Exemplos de tais genes incluem os genes codificando glutamato desidrogenase {gdhA), glutamina sintetase (glnA), glutamato sintetase (gltAB), isocitrato desidrogenase (icdA), aconitato hidratase (acnA, acnB), citrato sintase (gltA), gene metil citrato sintase iprpC), fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc), piruvato desidrogenase (aceEF, IpdA), piruvato quinase (pykA, pykF), fosfoenolpiruvato sintase (ppsA), enolase (eno), fosfogliceromutase (pgmA, pgml), fosfoglicerato quinase (pgk), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (gapA), triose fosfato isomerase (tpiÁ), frutose bisfosfato aldolase (fbp), fosfofrutoquinase (pfkA, pfkB), glicose fosfato isomerase (pgi), e assim por diante. Dentre estas enzimas, glutamato desidrogenase, citrato sintase, fosfoenolpiruvato carboxilase, e metil citrato sintase são exemplos. Exemplos de cepas, que foram modificadas de modo que a expressão do gene citrato sintetase, do gene fosfoenolpiruvato carboxilase, e/ou do gene glutamato desidrogenase é otimizada, incluem os descritos em EP 1078989 A, EP 955368 A, e EP 952221 A.

Exemplos de bactérias produzindo ácido L-glutâmico e cepas parentais que podem ser usadas para derivar as bactérias produzindo ácido L- glutâmico também incluem cepas em que a atividade de uma ou mais enzimas, que catalisam uma ou mais reações que dirigem a síntese de um ou mais compostos diferentes de ácido L-glutâmico, por exemplo, ao dirigir a síntese afastada da via biossintética de ácido L-glutâmico, é reduzida ou eliminada. Exemplos destas enzimas incluem isocitrato liase (aceA), a- cetoglutarato desidrogenase (sucA), fosfotransacetilase (pta), acetato quinase (ack), ácido acetohidróxi sintase (ilvG), acetolactato sintase (ilvl), formato acetiltransferase (pj7), lactato desidrogenase (Idh), glutamato decarboxilase (gadAB), e assim por diante. Bactérias Escherichia sem atividade de a- cetoglutarato desidrogenase ou com atividade de a-cetoglutarato desidrogenase reduzida e métodos para obter tais bactérias são descritos na patente U.S. Nos. 5.378.616 e 5.573.945.

Especificamente, estas cepas incluem as seguintes:

E. coli W311 OsucA: :Kmr.

E. coli AJ12624 (FERM BP-3853).

E. coli AJ12628 (FERM BP-3854).

E. coli AJ12949 (FERM BP-4881).

E. coli W311 OsucA: :Kmr é obtido por disruptura do gene a- cetoglutarato desidrogenase (abaixo também referido como o "gene sucA ") de E. coli W3110. Esta cepa é completamente deficiente em a-cetoglutarato desidrogenase.

Outros exemplos de bactérias produzindo ácido L-glutâmico incluem bactérias Escherichia que são resistentes a um ácido aspártico antimetabólito. Estas cepas também pode ser deficientes em atividade a- cetoglutarato desidrogenase e incluem, por exemplo, E. coli AJl3199 (FERM BP-5807) (patente U.S. No. 5.908.768), FFRM P-12379, que adicionalmente é incapaz de decompor ácido L-glutâmico (patente U.S. No. 5.393.671); AJ13138 (FERM BP-5565) (patente U.S. No. 6.110.714), e assim por diante.

Um exemplo de uma bactéria produzindo ácido L-glutâmico que pertence a Pantoea ananatis é a cepa de Pantoea ananatis AJ13355. Esta cepa foi isolada de solo em Iwata-shi, Shizuoka-ken, Japão, e foi identificada como sendo capaz de proliferar em um meio contendo ácido L-glutâmico e uma fonte de carbono a um pH baixo. A cepa Pantoea ananatis AJ13355 foi depositada junto ao National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Tsukuba Central 6, 1- 1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 - 8566, Japão) em 19 de fevereiro de 1998 e recebeu um número de acesso FERM P-16644. Ela foi então convertida em um depósito internacional sob as provisões de Tratado de Budapeste em 11 de janeiro de 1999 e recebeu o número de acesso FERM BP-6614. Esta cepa foi originalmente identificada como Enterobacter agglomerans quando foi isolada, e depositada como Enterobacter agglomerans AJ13355. No entanto, foi recentemente re-classificada como Pantoea ananatis à base da seqüência de nucleotídeo de 16S rRNA e assim por diante.

Além disso, exemplos de uma bactéria produzindo ácido L- glutâmico de Pantoea ananatis também incluem Pantoea ananatis deficiente na atividade de α-cetoglutarato desidrogenase (aKGDH) ou tendo atividade de aKGDH reduzida. Exemplos de tal cepa incluem AJ13356 (patente U.S. No. 6.331.419), que foi derivada por deleção do gene da subunidade aKGDH- El (sucA) em AJ13355, e a cepa SC17sucA (patente U.S. No. 6.596.517) que também não tem o gene sue A, e foi selecionado de AJl 33 55 devido às suas propriedades de produção de flegma baixas. A cepa AJ13356 foi depositada junto ao National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (atualmente, a agência administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba- shi, Ibaraki-ken, Japão, código postal: 305-8566)) em 19 de fevereiro de 1998, e recebeu o número de acesso FERM P-16645. A seguir, o depósito foi convertido em um depósito internacional sob as provisões do Tratado de Budapeste em 11 de janeiro de 1999, e recebeu um número de acesso FERM BP-6616. Apesar das cepas AJ13355 e AJ13356 estarem depositadas no depositório acima mencionado como Enterobacter agglomerans, elas são referidas como Pantoea ananatis neste relatório. A cepa SC17sucA recebeu o número privado de AJ417, e foi depositada junto ao National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary em 26 de fevereiro de 2004, sob um número de acesso FERM BP- 08646.

Exemplos de bactérias produzindo Pantoea ananatis a partir de ácido L-glutâmico ainda incluem as cepas SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB, AJ13 601, NP106, e NA1. A cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB foi obtida por introdução do plasmídeo RSFCPG contendo o gene citrato sintase (gltA), gene fosfoenolpiruvato carboxilase (ppsA), e gene glutamato desidrogenase (gdhA) derivado de Escherichia coli, e o plasmídeo pSTVCB contendo o gene citrato sintase (gltA) derivado de Brevibaeteria laetofermentum, na cepa SC17sucA. A cepa AJ13 601 foi selecionada a partir da cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB devido à sua resistência em concentração elevada de ácido L-glutâmico a um pH baixo. Além disso, a cepa NP106 foi derivada da cepa AJ13601 por eliminação do plasmídeo RSFCPG+pSTVCB, como descrito nos exemplos. A cepa AJ13601 foi depositada junto ao National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1- Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão, código postal: 305-8566) em 18 de agosto de 1999, e recebeu o número de acesso FERM P-17516. A seguir, o depósito foi convertido em um depósito internacional sob as provisões do Tratado de Budapeste em 6 de julho de 2000, e recebeu um número de acesso FERM BP-7207.

Bactérias produzindo L-fenilalanina

Exemplos de bactérias produzindo L-fenilalanina e cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produzindo Ε- fenilalanina incluem, mas não são limitados a, cepas Escherichia bacterianas, como E. coli AJ12739 (tyrA::TnlO, tyrR) (VKPM B-8197) que falta corismato mutase-prefenato desidrogenase e o repressor de tirosina (WO 03/044191), E. coli HW1089 (ATCC 55371) que contém o gene pheA34 codificado para corismato mutase-prefenato desidratase que foi mudado para ser dessensibilizado para a retroinibição (patente U.S. No. 5.354.672), E. coli MWEC101 -b (KR8903681), E. coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146, e NRRL B-12147 (patente U.S. No. 4.407.952). Também, as seguintes cepas podem ser usadas para derivar bactérias produzindo L- fenilalanina: E. coli K-12 [W3110(tyrA)/pPHAB (FERM BP-3566) que contém genes de codificação para corismato mutase-prefenato desidratase que foi mudado para ser dessensibilizado para retroinibição, E. coli K-12 [ W3110(tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659), E. coli K-12 [ W3110(tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662), e E. coli K-12 [W3110(tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (também conhecido como AJ12604 (FERM BP-3579) (EP 488424 BI). Além disso, bactérias Escherichia produzindo L-fenilalanina com atividade otimizada da proteína codificada pelo gene yedA ou o gene yddG também podem ser usadas (pedidos de patente U.S. publicados Nos. 2003/0148473 Al e 2003/0157667 Al, WO 03/044192). Bactérias produzindo L-triptofano

Exemplos de bactérias produzindo L-triptofano e cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produzindo L- triptofano incluem, mas não são limitados a, cepas bacterianas Escherichia, como E. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122) e E. coli JP6015/pMU91 (DSM10123) que faltam triptofanoil-tRNA sintetase codificada por um gene trpS mutante (patente U.S. No. 5.756.345), E. coli SVl64 (pGH5) que contém o alelo serA codificando fosfoglicerato desidrogenase e o alelo trpE codificando antranilato sintase, que são dessensibilizados para retroinibição por serina e triptofano, respectivamente (patente U.S. No. 6.180.373), E. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263), e E. coli AGX6(pGX50)aroP (NRRL B- 12264) que faltam triptofanoase (patente U.S. No. 4.371.614), e E. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps em que a capacidade de produzir fosfoenolpiruvato é otimizada (WO 9708333, patente U.S. No. 6.319.696). Bactérias produzindo L-triptofano pertencendo ao gênero Escherichia com atividade otimizada de uma proteína codificada pelo gene yedA ou o gene yddG também podem ser usadas (pedido de patente U.S. publicado Nos. 2003/0148473 Al e 2003/0157667 Al).

Exemplos de bactérias produzindo L-triptofano e cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produzindo L- triptofano também incluem cepas em que uma ou mais atividades das seguintes enzimas são otimizadas: antranilato sintase (trpE), fosfoglicerato desidrogenase (serÂ), 3-deóxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato sintase (aroG), 3-desidroquinato sintase {aroB), shiquimato desidrogenase (aroE), shiquimato quinase (aroL), 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase (aroA), corismato sintase (aroC), prefenato desidratase, corismato mutase, e triptofano sintase (trpAB). Prefenato desidratase e corismato mutase são codificadas pelo gene pheA como uma enzima bifuncional (CM-PD). Dentre estas enzimas, fosfoglicerato desidrogenase, 3-deóxi-D-arabino- heptulosonato-7-fosfato sintase, 3-desidroquinato sintase, shiquimato desidratase, shiquimato quinase, 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase, corismato sintase, prefenato desidratase, e corismato mutase-prefenato desidratase são exemplos particulares. Antranilato sintase e fosfoglicerato desidrogenase sofrem ambas de retroinibição por L-triptofano e L-serina, e deste modo uma mutação de dessensibilização da retroinibição pode ser introduzida nos genes codificando estas enzimas. Exemplos específicos de cepas tendo como uma mutação incluem E. coli SVl64 tendo uma antranilato sintase de tipo dessensibilizada e uma cepa transformante obtida por introdução de pGH5 (W094/08031) contendo um gene serA mutante codificado para fosfoglicerato desidrogenase dessensibilizada para retroinibição em£. coli SVl64.

Exemplos de bactérias produzindo L-triptofano e cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produzindo L- triptofano também incluem cepas que foram transformadas com o operon de triptofano, que contém um gene codificando antranilato sintase dessensibilizada na inibição (patente japonesa acessível ao público Nos. 57- 71397, 62-244382, patente U.S. No. 4.371.614). Além disso, a capacidade de produzir L-triptofano pode ser conferida otimizando a expressão de um gene que codifica triptofano sintase no operon de triptofano (trpBA). Triptofano sintase inclui ambas subunidades α β, que são codificadas por trpA e trpB, respectivamente. Além disso, a capacidade de produzir L-triptofano pode ser melhorada otimizando-se a expressão do operon de isocitrato liase-malato sintase (W02005/103275).

Bactérias produzindo L-prolina

Exemplos de bactérias produzindo L-prolina e cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produzindo L-prolina incluem, mas não são limitados a, cepas bacterianas de Escherichia, como E. coli 702ilvA (VKPM B-8012) que falta o gene ilvA e pode produzir L-prolina (EP 1172433).

A bactéria pode ser melhorada otimizando-se a expressão de um ou mais genes envolvidos na biossíntese de L-prolina. Exemplos de genes incluem o gene proB codificado para glutamato quinase que é dessensibilizado para retroinibição por L-prolina (DE patente 3127361). Além disso, a bactéria pode ser melhorada otimizando-se a expressão de um ou mais genes de codificação para proteínas responsáveis pela secreção de L- aminoácidos de uma célula bacteriana. Exemplos de tais genes são b2682 e genes b2683 (genes ygaZH) (EP 1239041 A2).

Bactérias Escherichia que produzem L-prolina incluem as seguintes cepas E. coli: NRRL B-12403 e NRRL B-12404 (GB patente 2075056), VKPM B-8012 (pedido de patente russa 2000124295), mutantes plasmídeo descritos na patente DE 3127361, mutantes plasmídeos descritos por Bloom F. R. et al (The 15th Miami Winter Symposium, 1983, p. 34), e assim por diante.

Bactérias produzindo L-arginina

Exemplos de bactérias produzindo L-arginina e cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produzindo L-arginina incluem, mas não são limitados a, cepas bacterianas de Escherichia, como cepa de E. coli 237 (VKPM B-7925) (pedido de patente U.S. publicado No. 2002/058315 Al) e suas cepas derivadas abrigando N-acetilglutamato sintase mutante (pedido de patente russa No. 2001112869), cepa de E. coli 382 (VKPM B-7926) (EP 1170358A1), e um cepa produzindo arginina transformada com um gene argA codificando N-acetilglutamato sintetase (EP 1170361 Al).

Exemplos de bactérias produzindo L-arginina e cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produzindo L-arginina também incluem cepas em que a expressão de um ou mais genes codificando uma enzima biossintética de L-arginina é otimizada. Exemplos de tais genes incluem os genes codificando N-acetilglutamil fosfato redutase (argC), ornitina acetil transferase (argJ), N-acetilglutamato quinase (argB), acetilornitina transaminase (argD), ornitina carbamoil transferase (argF), ácido argininosuccínico sintetase (argG), ácido argininosuccínico liase (argH), e carbamoil fosfato sintetase (carAB).

Bactérias produzindo L-valina

Exemplos de bactérias produzindo L-valina e cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produzindo L-valina incluem, mas não são limitados a, cepas que foram modificadas para superexpressar o operon de ilvGMEDA (patente U.S. No. 5.998.178). É desejável remover a região no operon de ilvGMEDA que é requerido para atenuar de modo que a expressão do operon não é atenuada pela L-valina produzida. Além disso, o gene ilvA η operon é desejavelmente disrompido de modo que a atividade de treonina deaminase é diminuída.

Exemplos de bactérias produzindo L-valina e cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produzindo L-valina também incluem mutantes tendo mutações amino-acil t-RNA sintetase (patente U.S. No. 5.658.766). Um exemplo é E. coli VL1970, que tem uma mutação no gene UeS codificando isoleucina tRNA sintetase. E. coli VL1970 foi depositado junto ao Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Rússia) em 24 de junho de 1988 sob o número de acesso VKPM B-4411.

Além disso, cepas mutantes que requerem ácido lipóico para o crescimento e/ou faltam H+-ATPase (WO 96/06926) também são efetivas para derivar bactérias produzindo L-valina.

Bactérias produzindo L-isoleucina

Exemplos de bactérias produzindo L-isoleucina e cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produzindo L- isoleucina incluem, mas não são limitados a, mutantes que são resistentes a 6- dimetilaminopurina (patente japonesa acessível ao público No. 5-304969), mutantes que são resistentes a análogos de isoleucina como tiaisoleucina e hidroxamato de isoleucina, e mutantes que são adicionalmente resistentes a DL-etionina e/ou hidroxamato de arginina (patente japonesa acessível ao público No. 5-130882). Além disso, cepas recombinantes transformadas como genes codificando proteínas envolvidas na biossíntese de L-isoleucina, como treonina deaminase e aceto-hidroxato sintase, também são efetivas para derivar bactérias produzindo L-isoleucina (patente japonesa acessível ao público No. 2-458, FR 0356739, e patente U.S. No. 5.998.178).

Bactérias produzindo L-tirosina

Exemplos de bactérias produzindo tirosina incluem bactérias Escherichia com um gene prefenato desidratase dessensibilizado (tyrA). Um produto de expressão deste gene é dessensibilizado para inibição por tirosina (pedido de patente européia acessível ao público No. 1616940).

Em uma bactéria, a fim de otimizar a capacidade de assimilação de glicerol, expressão do gene glpR (EP 1715056) pode ser atenuada, ou expressão dos genes de metabolismo de glicerol (EP 1715055 A) como genes glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, glpT, glpX, tpiA, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR,fsa, e talC pode ser otimizada.

Gene yeaS mutante

A bactéria de acordo com o assunto ora descrito pode ser obtida por modificação da bactéria pertencendo à família Enterobaeteriaeeae e tendo uma capacidade de produzir L-aminoácido como descrito acima para ter um gene yeaS mutante tendo uma mutação específica. No entanto, depois da bactéria ser modificada como descrito acima, então uma capacidade de produzir L-aminoácido pode ser conferida. A "mutação específica" será explicada depois. O gene yeaS não tendo a mutação específica pode ser chamado de "gene yeaS de tipo selvagem". Um gene yeaS não tendo a mutação específica, mas tendo outra mutação, também é um "gene yeaS de tipo selvagem", desde que ele tenha uma atividade de melhorar uma capacidade de produzir L-cisteína de uma bactéria pertencendo à família Enterobacteriaceae como comparado a uma cepa não modificada quando sua expressão é aumentada na bactéria.

O gene yeaS será explicado abaixo.

Exemplos específicos do gene yeaS incluem um gene compreendendo a seqüência nucleotídica de SEQ ID NO: 1. A seqüência nucleotídica de um gene yeaS de tipo selvagem de uma cepa Eseheriehia eoli é mostrada em SEQ ID NO: 1. A seqüência de aminoácido codificada por este gene é mostrada em SEQ ID NO: 2.

Apesar de se saber que a capacidade de produção para vários aminoácidos é melhorada por otimização da expressão do gene yeaS (FEBS Lett., 579, 4629 - 4634 (2005)), a relação entre o gene yeaS e a produção de L-cisteína não é conhecida. Os inventores da presente invenção verificaram que a capacidade de produzir L-cisteína foi melhorada por otimização da expressão do gene yeaS.

O gene yeaS também pode ser um gene codificando uma proteína tendo uma seqüência correspondente à seqüência de aminoácido acima mencionada, mas que inclui substituições, deleções, inserções, ou adições de um ou vários resíduos de aminoácidos em uma ou várias posições, desde que o gene codifique uma proteína tendo uma atividade de melhorar uma capacidade de produzir L-cisteína em uma bactéria pertencendo à família Enterobaeteriaeeae como comparado a uma cepa não modificada quando sua expressão é aumentada na bactéria. Neste caso, significa-se que uma proteína tendo a seqüência de aminoácido acima mencionada, incluindo substituições, deleções, inserções, ou adições de um ou vários resíduos de aminoácidos, mantém 70% ou mais, 80% ou mais, ou ainda 90% ou mais, da atividade de melhorar uma capacidade de produzir L-cisteína como comparado a uma cepa não modificada de uma proteína tendo a seqüência de aminoácido acima mencionada não incluindo as substituições, deleções, inserções, ou adições de um ou vários resíduos de aminoácidos. Apesar do número de "um ou vários" resíduos de aminoácidos poder diferir dependendo da sua posição na estrutura tridimensional ou dos tipos de resíduos de aminoácidos das proteínas, ele pode ser de 1 a 20, 1 a 10, ou ainda 1 a 5.

As substituições, deleções, inserções, ou adições acima mencionadas de um ou vários resíduos de aminoácidos são uma mutação conservativa que conserva a função normal de uma proteína. A mutação conservativa é tipicamente uma substituição conservativa. A substituição conservativa é uma mutação em que a substituição ocorre mutuamente entre Phe, Trp e Tyr, se o sítio de substituição é um aminoácido aromático; entre Leu, Ile e Vai, se o sítio de substituição é um aminoácido hidrofóbico; entre Gln e Asn, se ele é um aminoácido polar; entre Lys, Arg e His, se ele é um aminoácido básico; entre Asp e Glu, se ele é um aminoácido ácido; e entre Ser e Thr, se ele é um aminoácido tendo um grupo hidroxila. Exemplos específicos de substituições conservativas incluem: substituição de Ser ou Thr por Ala; substituição de Gln, His ou Lys por Arg; substituição de Glu, Gln, Lys, His ou Asp por Asn; substituição de Asn, Glu ou Gln por Asp; substituição de Ser ou Ala por Cys; substituição de Asn, Glu, Lys, His, Asp ou Arg por Gln; substituição de Gly, Asn, Gln, Lys ou Asp por Glu; substituição de Pro por Gly; substituição de Asn, Lys, Gln, Arg ou Tyr por His; substituição de Leu, Met, Val ou Phe por lie; substituição de lie, Met, Val ou Phe por Leu; substituição de Asn, Glu, Gln, KQs ou Arg por Lys; substituição de lie, Leu, Val ou Phe por Met; substituição de Trp,Tyr, Met, Ile ou Leu por Phe; substituição de Thr ou Ala por Ser; substituição de Ser ou Ala por Thr; substituição de Phe ou Tyr por Trp; substituição de His, Phe ou Trp por Tyr; e substituição de Met, Ile ou Leu por Vai. A substituição, deleção, inserção, adição, inversão etc de aminoácido acima mencionados pode ser o resultado de uma mutação de ocorrência natural (mutante ou variante) devido a uma diferença individual, uma diferença de espécies, ou outros de uma bactéria da qual o gene é derivado.

Exemplos específicos de gene codificando para uma proteína YeaS tendo uma atividade de melhora de uma capacidade de produzir L- aminoácido de uma célula hospedeira, e tendo um seqüência de aminoácido incluindo substituições, deleções, inserções ou adições de um ou vários resíduos de aminoácidos incluem genes de codificação para uma proteína YeaS tendo a seqüência de SEQ ID NO: 2 incluindo pelo menos um ou mais mutações selecionadas dentre uma mutação para substituição de um resíduo glicina pelo resíduo triptofano em posição 11, uma mutação para substituição de um resíduo arginina pelo resíduo lisina em posição 33, uma mutação para substituição de um resíduo valina pelo resíduo de isoleucina em posição 52, uma mutação para substituição de um resíduo de serina pelo resíduo de fenilalanina em posição 59, uma mutação para substituição de um resíduo de glutamina pelo resíduo de leucina em posição 60, uma mutação para substituição de um resíduo de ácido glutâmico pelo resíduo valina em posição 65, uma mutação para substituição de um resíduo alanina pelo resíduo de treonina em posição 72, uma mutação para substituição de um resíduo de serina pelo resíduo de asparagina em posição 77, uma mutação para substituição de um resíduo de isoleucina pelo resíduo de fenilalanina em posição 85, e uma mutação para substituição de um resíduo de fenilalanina para um resíduo tirosina em posição 86. As mutações são as presumidas como sendo mutações silentes, não reduzindo a atividade no exemplo 2 descrito depois. A mutação conservativa não é limitada a estes, e um gene codificando para uma proteína YeaS tendo um seqüência de aminoácido incluindo substituições de um ou vários resíduos de aminoácidos, mas mantendo uma atividade de melhorar uma capacidade de produzir L-aminoácido quando sua expressão é aumentada em uma bactéria pertencendo à família Enterobacteriaceae pode ser obtido a partir dos genes yeaS artificialmente introduzidos com mutações aleatórias, como mostrado no exemplo 2.

Além disso, o gene tendo como uma mutação conservativa como descrito acima pode ser um gene codificando uma proteína mostrando uma homologia de 80% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais, 97% ou mais, ou ainda 99% ou mais, para a seqüência de aminoácido completa codificada, e tendo uma atividade de melhorar uma capacidade de produzir L-aminoácido de uma bactéria pertencendo à família Enterobacteriaceae como comparado a uma cepa não modificada quando sua expressão é aumentada na bactéria. Informação da seqüência de genes de codificação para uma proteína homóloga a esta YeaS (YeaS homólogo) pode ser facilmente obtida a partir de bases de dados abertas ao público para busca BLAST ou busca FASTA usando o gene yeaS de tipo selvagem da cepa Eseherichia coli acima mencionada como uma seqüência de consulta, e um yeaS homólogo pode ser obtido por uso de oligonucleotídeos produzidos à base de tais seqüências conhecidas do gene como iniciadores. O termo "homologia" pode significar "identidade".

O gene yeaS pode ser um gene que hibridiza com uma seqüência complementar nas seqüências nucleotídicas acima mencionadas ou uma sonda que pode ser preparada a partir das seqüências nucleotídicas acima mencionadas sob as condições estringentes, desde que seja um gene que codifica uma proteína tendo uma atividade de melhorar uma capacidade de produzir L-aminoácido de uma bactéria pertencendo à família Enterobaeteriaeeae quando sua expressão é aumentada na bactéria. Exemplos das "condições estringentes" incluem condições de lavagem a 60°C, 1 χ SSC, 0,1% de SDS, preferivelmente 60°C, 0,1 χ SSC, 0,1% de SDS, uma vez ou preferivelmente duas vezes ou três vezes.

A sonda usada para a hibridização acima mencionada pode ter uma seqüência parcial de uma seqüência complementar do gene. Esta sonda pode ser preparada por PCR usando oligonucleotídeos preparados à base nas seqüências nucleotídicas do gene conhecidas como iniciadores, e um fragmento de DNA contendo estas seqüências como o gabarito. Quando um fragmento de DNA de um comprimento de cerca de 300 bp é usado como a sonda, as condições de lavagem após hibridização podem ser, por exemplo, 50°C, 2 χ SSC, e 0,1% de SDS.

A atividade de melhorar uma capacidade de produzir L- aminoácido de uma bactéria pertencendo à família Enterobacteriaceae quando comparada à de uma cepa não modificada quando sua expressão é aumentada na bactéria pode significar uma atividade de melhorar uma capacidade para produzir e acumular uma maior quantidade de um L- aminoácido, como L-cisteína, em um meio como comparado a de uma cepa não modificada, como uma cepa de tipo selvagem ou parental, por exemplo, uma atividade de conferir uma capacidade para acumular um L-aminoácido em um meio em uma quantidade de 0,1 g/L ou mais, 0,2 g/L ou mais, ou ainda 0,3 g/L ou mais, para a bactéria pertencendo à família Enterobacteriaeeae quando sua expressão é aumentada na bactéria.

Se uma proteína tem uma atividade de melhorar uma capacidade de produzir L-aminoácido de uma bactéria pertencendo à família Enterobaeteriaeeae quando comparada à de uma cepa não modificada quando sua expressão é aumentada na bactéria pode ser confirmado por preparação de uma bactéria em que a expressão do gene codificando para uma proteína é aumentada a partir de uma cepa de tipo selvagem ou parental, cultivo desta bactéria em um meio, e quantificação do L-aminoácido acumulado no meio. Quando o L-aminoácido é L-cisteína, exemplos da cepa de tipo selvagem ou parental incluem uma cepa de E. coli MGl 655 em que um gene codificando para um SAT mutante dessensibilizado para retroinibição é otimizado.

Também pode ser facilmente confirmado que uma certa proteína tendo atividade de melhorar uma capacidade de produzir L- aminoácido de uma bactéria pertencendo à família Enterobacteriaeeae como comparado a uma cepa não modificada quando sua expressão é aumentada na bactéria ao se confirmar que o crescimento de uma bactéria em que a expressão do gene é aumentada se torna mais favorável como comparado a uma cepa de tipo selvagem ou parental em um meio contendo um L- aminoácido em uma concentração maior, como comparado a uma cepa de tipo selvagem ou parental, isto é, examinado a resistência a L-aminoácido da cepa. Quando o L-aminoácido é L-cisteína, isto pode ser confirmado por, especificamente, inoculação de uma bactéria em um meio contendo cerca de 0,1 a 10 mM de L-cisteína, medição dos diâmetros de colônias após um período apropriado de 10 a 120 horas, e confirmação de que o seu valor é maior do que o observado para a cepa de tipo selvagem ou parental. Os inventores da presente invenção verificaram que ocorreu uma considerável correlação entre a atividade de melhorar a capacidade de produzir L-cisteína de uma célula hospedeira como comparado com uma cepa não modificada e a resistência a L-cisteína.

A "mutação específica" no gene yeaS mutante é especificamente uma mutação selecionada dentre os seguintes (I) a (III):

(II) uma mutação para substituição de um resíduo de aminoácido diferente de resíduo de fenilalanina pelo resíduo de fenilalanina em posição 137 na proteína codificada pelo gene yeaS,

(III) uma mutação para substituição de um resíduo de aminoácido diferente de resíduo de leucina pelo resíduo de leucina em posição 188 na proteína codificada pelo geneyeaS.

Exemplos específicos das mutações (I) a (III) são os seguintes (i) a (iii), respectivamente.

A mutação pode consistir de qualquer um tipo das mutações acima mencionadas, ou uma combinação dos tipos arbitrários ou três tipos das mutações.

Um exemplo particular é a mutação de (ii) correspondendo a uma mutação para substituição de um resíduo de serina ou glutamina pelo resíduo de fenilalanina em posição 137.

As posições 28, 137, e 188 mencionadas nas mutações de (I) a (III) não necessariamente significam posições absolutas a partir do N-término de uma proteína codificada por um gene yeaS (YeaS), e posições relativas indicadas com relação à seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2. Por exemplo, se um resíduo de aminoácido é deletado da proteína YeaS tendo a seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 2 em posição no lado do N-término a montante da posição 28, a posição 28 então se torna a posição 27. Mesmo em tal caso, o resíduo de aminoácido da posição 27 é ainda considerado como um resíduo de aminoácido da "posição 28". A posição absoluta de substituição de aminoácido pode ser determinada por alinhamento da seqüência de aminoácido de uma proteína YeaS objetiva e uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2.

As mutações de (I) a (III) podem ser introduzidas em um gene yeaS por introdução de uma mutação pré-determinada em um códon correspondendo à mutação de um gene yeaS de tipo selvagem por, por exemplo, métodos de mutagênese sítio-específico, método de extensão de sobreposição, ou outros. Apesar do códon usado após a introdução da mutação não se particularmente limitado, desde que ele codifique para um aminoácido pré-determinado, é preferível usar um códon freqüentemente usado na bactéria objetiva pertencendo à família Enterobacteriaceae.

Uma mutação selecionada dentre as mutações de (I) a (III) pode ser introduzida no gene yeaS em um cromossomo de bactéria por substituição de um gene yeaS mutante contendo um ponto de mutação ou um fragmento do mesmo para uma porção correspondente do gene yeaS no cromossomo. Também ela pode ser atingida por transformação de uma bactéria com o genQyeaS mutante ou um vetor contendo o gene. Neste caso, o gene yeaS mutante pode ser introduzido em um cromossomo ou um plasmídeo. O gene yeaS de tipo selvagem pode continuar a ser portado no cromossomo, ou deletado.

Além disso, uma ou duas ou mais cópias do gene yeaS mutante pode estar contida na bactéria. Além disso, o promotor para expressar o gene yeaS mutante pode ser um promotor de um gene yeaS de tipo selvagem ou outro promotor, como promotor lac, promotor trp e promotor trc.

Exemplos do vetor usado para a transformação incluem um plasmídeo que pode replicar autonomamente em um microorganismo escolhido. Exemplos de plasmídeo autonomamente replicáveis em um microorganismo pertencendo à família Enterobacteriaceae incluem vetores de série pUC19, pUC18, pBR322, RSF1010, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, pSTV28, pSTV29, pTWV228, pTWV229 (pHSG, pSTV e pTWV são disponíveis de Takara Bio), pMW119, pMW118, pMW219, pMW218 (vetores de série pMW são disponíveis de Nippon Gene), e assim por diante. Além disso, plasmídeos para bactérias corineformes incluem pAM330 (patente japonesa acessível ao público No. 58-67699), pHM1519 (patente japonesa acessível ao público No. 58 - 77895), pSFK6 (patente japonesa acessível ao público No. 2000-262288), pVK7 (pedido de patente U.S. publicado No. 2003/0175912), pAJ655, pAJ611, pAJ1844 (patente japonesa acessível ao público No. 58-192900), pCGl (patente japonesa acessível ao público No. 57-134500), pCG2 (patente japonesa acessível ao público No. 58- 35197), pCG4, pCGll (patente japonesa acessível ao público No. 57- 183799), pHK4 (patente japonesa acessível ao público No. 5-7491), e assim por diante.

Exemplos de método de transformação incluem tratar as células recipientes com cloreto de cálcio para aumentar a permeabilidade para DNA, o que foi registrado para Escherichia coli K-12 (Mandei, M. e Higa, A., J. Mol. Biol., 1970, 53: 159 - 162), preparar as células competentes a partir de células que estão na fase de crescimento, seguido por transformação com DNA, o que foi registrado para Bacillus subtilis (Duncan, C. H., Wilson, G. A. e Young, F. E., 1977, Gene, 1: 153 - 167), e assim por diante. Alternativamente, um método de fazer células de DNA recipientes nos protoplastos ou esferoplastos, que pode facilmente capturar DNA recombinante, seguido por introdução de um DNA recombinante nas células, o que é conhecido como sendo aplicável para Bacillus subtilis, actinomicetes e leveduras (Chang, S. e Choen, S. N., 1979, Mol. Gen. Genet., 168: 111 - 115; Bibb, M. J., Ward, J. M. e Hopwood, O. A., 1978, Nature, 274: 398 - 400; Hinnen, A., Hicks, J. B. e Fink, G.R., 1978, Proc. Natl. Sci., USA, 75: 1929 - 1933) também pode ser empregado. Além disso, a transformação de microorganismos também pode ser realizada pelo método de pulso elétrico (patente japonesa acessível ao público No. 2-207791).

O gene yeaS mutante também pode ser introduzido em uma bactéria por introdução em um cromossomo do microorganismo hospedeiro, como descrito depois para o gene yeaS mutante. O gene yeaS mutante pode ser introduzido em um cromossomo de um microorganismo por um método de introdução aleatória do mesmo em um cromossomo usando um transposon ou Mini-Mu (patente japonesa acessível ao público No. 2-109985, patente U.S. No. 5.882.888, EP 805867 BI), ou por recombinação homóloga usando uma seqüência presente em um DNA cromossômico em um múltiplo do número de cópias como uma marcação. Como uma seqüência presente em um DNA cromossômico em um múltiplo do número de cópias, pode ser usado DNA repetitivo, e repetição invertida localizada na extremidade de um elemento transponível. Alternativamente, por uso do método "Red driven integration" (W02005/010175), também é possível para introduzir um gene objetivo em um cromossomo. Além disso, um gene objetivo também pode ser introduzido em um cromossomo por transdução usando fagos como fago PI, ou usando um vetor de transferência conjugativo. Além disso, também é possível introduzir um gene yeaS mutante usando um gene desnecessário para a produção de uma substância objetiva como um alvo, como descrito em WO 03/040373. Uma ou várias cópias de um gene yeaS mutante pode ser introduzida em uma seqüência alvo por tais métodos.

Transferência de um gene objetivo em um cromossomo pode ser confirmada por hibridização Southern usando a sonda tendo uma seqüência complementar para o gene objetivo ou uma parte do mesmo, usando iniciadores PCR preparados com base em uma seqüência do gene objetivo, e assim por diante.

<2> Método para produzir L-aminoácido

Um L-aminoácido pode ser produzido por cultivo de uma bactéria de acordo com o assunto ora descrito obtido como descrito acima em um meio, e coleta do L-aminoácido do meio. O L-aminoácido pode ser um derivado do L-aminoácido. Quando L-aminoácido é L-cisteína, exemplos de derivados de L-cisteína incluem S-sulfocisteína, um derivado tiazolidina, um hemitiocetal correspondente ao derivado tiazolidina, e assim por diante, como descrito acima.

Exemplos do meio usado em cultura incluem meio comum contendo uma fonte de carbono, fonte de nitrogênio, fonte de enxofre, íons inorgânicos, e outros componentes orgânicos, como requerido. Como fonte de carbono, sacarídeos como glicose, frutose, sacarose, glicerol, melaço e hidrolisado de amido, e ácidos orgânicos como ácido fumárico, ácido cítrico e ácido succínico, podem ser usados.

Como a fonte de nitrogênio, sais inorgânicos de amônio como sulfato de amônio, cloreto de amônio e fosfato de amônio, nitrogênio orgânico como hidrolisado de soja, gás de amônia, amônia aquosa e assim por diante podem ser usados.

Como a fonte de enxofre, compostos de enxofre inorgânicos, como sulfatos, sulfitos, sulfetos, hipossulfitos e tiossulfatos podem ser usados.

Como nutrientes orgânicos em quantidade de traço, é desejável adicionar substâncias necessárias como vitamina Bj, extrato de levedura e semelhantes, em quantidades apropriadas. Diferentes destes, fosfato de potássio, sulfato de magnésio, íons de ferro, íons de manganês e semelhantes são adicionados em quantidades pequenas.

A cultura é preferivelmente realizada sob condições aeróbicas durante 30 a 90 horas. A temperatura de cultura é preferivelmente controlada para ser a 25°C a 37°C, e o pH é preferivelmente controlada para ser 5 a 8 durante a cultura. Para ajuste de pH, substâncias inorgânicas ou orgânicas ácidas ou alcalinas, gás de amônia e semelhantes podem ser usadas.

Para coleta de L-aminoácido do meio após completar a cultura, não é requerido um método especial. O L-aminoácido coletado pode conter células bacterianas, componentes do meio, mistura, e metabólitos de sub- produtos do microorganismo além do L-aminoácido. Pureza do L-aminoácido coletado é, por exemplo, 50% ou maior, 85% ou maior, ou ainda 95% ou maior (patente U.S. No. 5.431.933, publicação de patente japonesa No. 1- 214636, patente U.S. Nos. 4.956.471, 4.777.051, 4.946.654, 5.840.358, 6.238.714, pedido de patente U.S. publicado No. 2005/0025878).

O L-aminoácido pode ser coletado por uma combinação de método de resina de troca iônica convencionalmente conhecido (Nagai, H. et al., Separation Science and Technology, 39(16), 3691 - 3710), método de separação da membrana (patente japonesa acessível ao público Nos. 9-164323 e 9-173792), método de cristalização (WO 2008/078448, WO 2008/078646), e outros métodos.

L-cisteína obtida como descrito acima pode ser usada para a produção de derivados L-cisteína. Os derivados de L-cisteína incluem metilcisteína, etilcisteína, carbocisteína, sulfocisteína, acetilcisteína, e semelhantes.

Além disso, quando um derivado tiazolidina de L-cisteína é acumulado no meio, L-cisteína pode ser produzida pela mudança do equilíbrio de reação entre o derivado tiazolidina e L-cisteína para o lado L- cisteína. Além disso, quando S-sulfocisteína é acumulada no meio, ela pode ser convertida em L-cisteína por redução usando um agente de redução como ditiotreitol.

Exemplos

Abaixo, a presente invenção será explicada mais especificamente com referência aos exemplos.

Exemplo 1: Efeito do aumento de produção de L-cisteína de otimização de YeaS de tipo selvagem.

A fim de investigar o efeito de otimização de expressão de um gene yeaS de tipo selvagem em P. ananatis em produção de L-cisteína, uma cepa introduzida com o gene cysE5 codificada para um SAT mutante (pedido de patente U.S. publicado No. 2005/0112731) e tendo um aumento no número de cópia do gene yeaS foi construída.

Primeiro, um plasmídeo para construir a cepa acima mencionada foi construído. O método para isto é descrito abaixo.

Por PCR usando o DNA cromossômico de E. coli MGl 655 (ATCC No. 47076) como um gabarito assim como Pl (agctgagtcg acccccagga aaaattggtt aataac, SEQ ID NO: 20) e P2 (agctgagcat gcttccaact gcgctaatga cgc, SEQ ID NO: 21) como iniciadores, um fragmento de DNA contendo uma região de promotor do gene nlpD (daqui em diante promotor de gene nlpD de tipo selvagem é referido como "PnlpO") com cerca de 300 bp foi obtido. Nas extremidades 5' e 3' dos iniciadores acima mencionados, sítios para as enzimas de restrição Sall e Pael foram designados, respectivamente. O ciclo PCR foi como a seguir: 95°C durante 3 minutos, então 2 ciclos de 95°C durante 60 segundos, 50°C durante 30 segundos, e 72°C durante 40 segundos, 25 ciclos de 94°C durante 20 segundos, 55°C durante 20 segundos, e 72°C durante 15 segundos, e 72°C durante 5 minutos como o ciclo final. O fragmento obtido foi tratado com Sall e PaeI, e inserido em pMIV-5JS (patente japonesa acessível ao público No. 2008-99668) no sítio SaR-Pael para obter um plasmídeo pMIV-PnlpO. A seqüência nucleotídica do fragmento Pael-SaK do promotor PnlpO inserido neste plasmídeo pMIV-PnlpO foi como mostrada na SEQ ID NO: 5.

Então, por PCR, usando o DNA cromossômico de MGl655 como um gabarito, assim como P3 (agctgatcta gaaaacagaa tttgcctggc ggc, SEQ ID NO: 22) e P4 (agctgaggat ccaggaagag tttgtagaaa cgc, SEQ ID NO: 23) como iniciadores, um fragmento de DNA contendo uma região de terminador do gene rrnB de cerca de 300 bp foi obtido. Nas extremidades 5' dos iniciadores acima mencionados, sítios para as enzimas de restrição Xbal e BamHl foram designados, respectivamente. O ciclo PCR foi como a seguir: 95°C durante 3 minutos, então 2 ciclos de 95°C durante 60 segundos, 50°C durante 30 segundos, e 72°C durante 40 segundos, 25 ciclos de 94°C durante 20 segundos, 59°C durante 20 segundos, e 72°C durante 15 segundos, e 72°C durante 5 minutos como o ciclo final. O fragmento obtido foi tratado com Xbal e BamHl, e inserido em pMIV-PnlpO no sítio Xbal-BamHl para obter um plasmídeo pMIV-PnlpO-ter.

Então, por PCR usando o DNA cromossômico da cepa MG1655 como um gabarito, assim como P5 (agctgagtcg acgtgttcgc tgaatacggg gt, SEQ ID NO: 24) e P6 (agctgatcta gagaaagcat caggattgca gc, SEQ ID NO: 25) como iniciadores, um fragmento de DNA de cerca de 700 bp contendo o gene yeaS foi obtido. Nas extremidades 5' dos iniciadores acima mencionados, sítios para as enzimas de restrição SaIi e Xbal foram designados, respectivamente. O ciclo de PCR foi como a seguir: 95°C durante 3 minutos, então 2 ciclos de 95°C durante 60 segundos, 50°C durante 30 segundos, e 72°C durante 40 segundos, 25 ciclos de 94°C durante 20 segundos, 55°C durante 20 segundos, e 72°C durante 15 segundos, e 72°C durante 5 minutos como o ciclo final. O fragmento obtido foi tratado com SalI e Xbal, e inserido em pMIV-PnlpO-ter no sítio SaK-Xbal para obter um plasmídeo pMIV-PnlpO-YeaS3. Como descrito acima, foi construída uma unidade de expressão yeaS compreendendo o vetor pMTV-5JS em que o promotor nlpD, o gene yeaS, e o terminador rrnB foram ligados nesta ordem.

A fim de modificar a região -10 do promotor nlpD para torná- lo um promotor mais forte, a região 10 foi randomizada pelo seguinte método. A região de promotor nlpD contém duas regiões presumidas como funcionando como promotores (fig. 1), e eles são indicadas como pnlpl e pnlp2, respectivamente, no desenho. Por PCR usando o plasmídeo pMIV- PnlpO como um gabarito assim como Pl e P7 (atcgtgaaga tcttttccag tgttnannag ggtgccttgc acggtnatna ngtcactgg ("n" significa que o resíduo correspondente pode ser qualquer um dentre a, t, g e c), SEQ ID NO: 26) como iniciadores, foi obtido um fragmento de DNA em que a região 10 contida na extremidade 3' da seqüência do promotor nlpD (referido como - IO(Pnlpl)) foi randomizada (fig. 1). O ciclo de PCR foi como a seguir: 95°C durante 3 minutos, então 2 ciclos de 95°C durante 60 segundos, 50°C durante 30 segundos, e 72°C durante 40 segundos, 25 ciclos de 94°C durante 20 segundos, 60°C durante 20 segundos, e 12°C durante 15 segundos, e 72°C durante 5 minutos como o ciclo final.

Além disso, por PCR usando o plasmídeo pMIV-PnlpO como um gabarito assim como P2 e P8 (tggaaaagat cttcannnnn cgctgacctg cg ("n" significa que o resíduo correspondente pode ser qualquer um dentre a, t, g e c), SEQ ID NO: 27) como iniciadores, um fragmento de DNA em que a região 10 contida na seqüência de extremidade 5' da seqüência do promotor nlpD (referido como -10(Pnlp2)) foi randomizada foi similarmente obtida (fig. 1). O ciclo de PCR foi como a seguir: 95°C durante 3 minutos, então 2 ciclos de 950C durante 60 segundos, 50°C durante 30 segundos, e 72°C durante 40 segundos, 25 ciclos de 94°C durante 20 segundos, 60°C durante 20 segundos, e 72°C durante 15 segundos, e 72°C durante 5 minutos como o ciclo final.

Os fragmentos de extremidades 3' e 5' obtidos podem ser ligados usando os sítios BgIll designados nos iniciadores P7 e P8, e o promotor nlpD de comprimento completo em que as duas regiões -10 foram randomizadas, pode ser construído por tal ligação. Por PCR usando este fragmento como um gabarito assim como Pl e P2 como iniciadores, um fragmento de DNA correspondendo a um promotor nlpD de comprimento completo de tipo modificado foi obtido. O ciclo de PCR foi como a seguir: 950C durante 3 minutos, então 2 ciclos de 950C durante 60 segundos, 50°C durante 30 segundos, e 72°C durante 40 segundos, 12 ciclos de 94°C durante 20 segundos, 60°C durante 20 segundos, e 12°C durante 15 segundos, e 12°C durante 5 minutos como o ciclo final.

O fragmento amplificado foi tratado com as enzimas de restrição SaIi e Pael, para as quais os sítios foram designados nas extremidades 5' dos iniciadores, e inserido no plasmídeo pMIV-Pnlp0-YeaS3 similarmente tratado com Sall e PaeI para substituir o Pnlp mutante para a região de promotor nlpD de tipo selvagem (PnlpO) no plasmídeo. De tais plasmídeos, um tendo a seqüência de promotor (Pnlp8) mostrado na fig. 1 foi selecionado, e designado pMIV-Pnlp8-YeaS7. A seqüência nucleotídica do fragmento Pael-Sall do promotor Pnlp8 inserido neste plasmídeo foi como mostrada em SEQ ID NO: 6. No mesmo modo, um fragmento de DNA da região do promotor nlpD contendo uma mutação foi inserido no plasmídeo pMIV-PnlpO-ter tratado com Sall e Pael para substituir o Pnlp mutante para a região de promotor nlpD (região de PnlpO) no plasmídeo. Um deles foi designado pMIV-Pnlp23-ter. A seqüência nucleotídica do fragmento Pael-Sall do promotor Pnlp23 inserido neste plasmídeo foi como mostrada em SEQ ID NO: 7.

Então, a partir de pMW-Pomp-cysE5 (W02005/007841), a porção de cassete Pomp-cysE5 foi excisada com Pael e SacI, e inserida no mesmo sítio de pMIV-5JS para construir pMIV-Pomp-CysE5. pMW-Pomp- cysE5 foi um plasmídeo obtido por inserção do gene cysE5 codificado para o SAT mutante ligado com o promotor de gene ompC em pMW118. De ρACYC184 (número de acesso do GenBank/EMBL X06403, disponível de NIPPON GENE), o gene de resistência a tetraciclina foi excisado com Xbal e £co88I, e este fragmento do gene foi tratado com o fragmento Klenow, e então inserido em pMIV-Pomp-CysE5 no sítio PvuI para construir pMT- Pomp-CysE5. A seguir, pMIV-Pnlp8-YeaS7 foi digerido com Hinàlll, terminado de modo cego com o fragmento Klenow, e então digerido com Ncol para excisar um fragmento contendo o cassete do terminador Pnlp8- YeaS-rrnB e o marcador de resistência cloranfenicol. Este fragmento foi ligado com um fragmento de digestão Smal e Ncol de pMT-Pomp-CysE5 similarmente tendo pMIV-5JS como a estrutura dorsal para construir pMT- EY2. pMT-EY2 é um plasmídeo tendo o cassete do Pnlp8-YeaS-rmZ? terminador e o cassete Pomp-CysE5 em um plasmídeo.

A fim de investigar o efeito de otimização de expressão do gene yeaS de tipo selvagem na produção de L-cisteína, pMT-Pomp-CysE5 e pMT-EY2 construídos pelo métodos descritos acima foram introduzidos na cepa de P. ananatis SC17 (patente U.S. No. 6.596.517), e a capacidade de produzir L-cisteína dos transformantes obtidos foi avaliada. Um meio de produção de L-cisteína (composição: 15 g/L de sulfato de amônio, 1,5 g/L de di-hidrogenofosfato de potássio, 1 g/L de sulfato de magnésio heptaidratado, 0,1 g/L de triptona, 0,05 g/L de extrato de levedura, 0,1 g/L de cloreto de sódio, 20 g/L de carbonato de cálcio, 40 g/L de glicose, e 20 mg/L de tetraciclina) foi usado na cultura.

A cultura de produção de L-cisteína foi realizada pelo seguinte procedimento. A cepa SC17/pMT-PompCysE5 e a cepa SC17/pMT-EY2 foram, cada, aplicadas ao meio ágar LB para realizar a pré-cultura durante a noite a 34°C, então as células correspondentes a 1/8 da placa foram raspadas com um laço de inoculação, inoculadas em 2 ml do meio de produção de L- cisteína contido em um tubo de teste grande (diâmetro interno: 23 mm, comprimento: 20 cm), e cultivado a 32°C com agitação a 220 a 230 rpm, e a cultura foi terminada após dois dias. L-cisteína produzida no meio foi quantificada pelo método descrito por Gaitonde, Μ. K. (Biochem. J., 1967 Aug., 104(2): 627-33). Como mostrado na tabela 1, verificou-se que a otimização de expressão do gene yeaS tem um efeito de aumentar a quantidade de produção de L-cisteína. A L-cisteína quantificada acima inclui L-cisteína assim como L-cistina, e derivados da mesma como S-sulfocisteína, derivados de tiazolidina, hemitiocetais, e misturas dos mesmos, e o mesmo deve se aplicar para L-cisteína quantificada nos exemplos salvo particularmente indicado.

Tabela 1: Efeito de otimização de yeaS em cepa SC17

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Exemplo 2 Aquisição de gene yeaS mutante e efeito de aumento da produção de L-cisteína

Então, a fim de obter um mutante tendo uma atividade maior de melhorar a capacidade de produzir L-cisteína de uma célula hospedeira como comparado com YeaS de tipo selvagem, mutações aleatórias foram artificialmente introduzidas no gene yeaS por técnica de Error-Prone PCR.

(1) Técnica de Error-prone PCR de yeaS e preparação de biblioteca de introdução de mutação

Primeiro, as condições de error-prone PCR para introduzir 1 a 3 mutações no gene yeaS foram examinadas com base em descobertas anteriores. (Evert Bokma et al., FEBS Letters, 580: 5339 - 5343 (2006); Zao et al., Nat. Biotechnol. Mar., 16(3): 258 - 61 (1998)). Como DNA polimerase, taq polimerase (produzida por QIAGEN) foi usada, e a composição da mistura de reação consistiu de 10 mM de Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM de KCl, 7 mM de MgCl2, 0,2 mM de dGTP e dATP, 1 mM de dCTP e dTTP, e 12,5 μΜ de MnCl2. Como os iniciadores, P9 (catgccatgg tcgctgaata cggggttctg, SEQ ID NO: 28) e PlO (aactgcagtc aggattgcag cgtcgcc, SEQ ID NO: 29), aos quais o sítio Ncol e o sítio Pstl foram adicionados, respectivamente, foram usados, e a amplificação foi realizada com um ciclo PCR consistindo de 94°C durante 5 minutos, então 50 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 50°C durante 45 segundos, e 12°C durante 45 segundos, e 72°C durante 7 minutos como o ciclo final. A reação foi realizada na mistura de reação dividida em 16 de tubos de PCR independentes para tornar óbvia uma mutação enviesada.

O fragmento amplificado foi digerido com Ncol e Pstl, ligado com pTrc99-Kmr tratado com as mesmas enzimas, e usado para transformar a cepa de E. eoli JMl 09. pTrc99-Kmr foi preparado por tratamento de pTrc99A (numero de acesso GenBank/EMBL M22744, disponível de Amersham Bioscience) com a enzima de restrição Dral para remover o gene de resistência a ampicilina, e inserir um gene de resistência a canamicina neste sítio. O gene de resistência a canamicina foi obtido por amplificação de pACYC177 (número de acesso do GenBank/EMBL X06402, disponível de NIPPON GENE) como um gabarito por PCR usando Pll (aaagccacgt tgtgtctcaa aatc, SEQ ID NO: 30) e P12 (ggtgttgctg actcatacca ggc, SEQ ID NO: 31) como iniciadores com um programa de 94°C durante 1 minuto, então 30 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, e 72°C durante 75 segundos, e 72°C durante 5 minutos como o ciclo final.

A seleção dos transformantes acima mencionados foi realizada no meio ágar LB contendo 25 mg/L de canamicina, e foi confirmado que os transformantes têm yeaS introduzido com uma mutação ao realizar PCR usando uma cepa aleatoriamente tomada das colônias obtidas como um gabarito assim como Pl3 (gacaattaatcatccggctc g, SEQ ID NO: 32) e P14 (tttatcagac cgcttctgcg, SEQ ID NO: 33) como iniciador com um programa de 94°C durante 5 minutos, então 30 ciclos de 98°C durante 5 segundos, 60°C durante 10 segundos, e 72°C durante 45 segundos, e 12°C durante 2 minutos como o ciclo final. Todas as colônias na placa foram raspadas, e os plasmídeos foram coletados com WizardR Plus Midipreps DNA Purification System (Promega) para obter uma biblioteca.

(2) Triagem de yeaS mutante com base em resistência a L- cisteína como marcador

A biblioteca obtida foi introduzido na cepa MG1655 por eletroporação, e as células foram aplicadas em uma placa de seleção M9 (12,8 g/L de hidrogenofosfato dissódico heptaidratado, 3,0 g/L de di- hidrogenofosfato de potássio, 0,5 g/L de cloreto de sódio, 1,0 g/L de cloreto de amônio, 2 mM de sulfato de magnésio, 0,4% de glicose, 0,1 mM de cloreto de potássio, 25 mg/L de canamicina, e 1,5% de agarose) contendo 3 mM ou 6 mM de L-cisteína. Depois a placa desta seleção foi incubada a 37°C durante 2 dias, um pouco menos do que 100 de cepas resistentes foram obtidas quando a placa de seleção M9 continha 6 mM de L-cisteína, e 200 a 300 cepas resistentes foram obtidas quando a placa continha 3 mM de L-cisteína. Isolamento de colônia única foi realizada para 80 cepas obtidas na placa contendo 6 mM de L-cisteína e 12 cepas obtidas na placa contendo 3 mM de L-cisteína, e fragmentos de DNAs contendo a região do gene yeaS nos plasmídeos foram amplificados por PCR usando estas colônias como gabaritos assim como P13 e P14 como iniciadores com um programa de 94°C durante 5 minutos, então 30 ciclos de 98°C durante 5 segundos, 60°C durante 10 segundos, e 72°C durante 45 segundos, e 72°C durante 2 minutos como o ciclo final. As seqüências nucleotídicas destes fragmentos foram determinadas usando P13 como um iniciador de sequenciamento para confirmar os sítios introduzidos em mutação no gene yeaS. Os clones dos quais a seqüência pode ser determinada foram divididos em grupos dos mostrando os mesmos resultados, então os plasmídeos foram extraídos de clones típicos e introduzidos na bactéria produzindo L-cisteína mencionada abaixo, e a bactéria foi avaliada por cultura. Dentre os clones obtidos, um número considerável dos mesmos continha uma mutação T28N, e foram obtidas muitas cepas mutantes duplas e triplas em que outras mutações foram simultaneamente introduzidas junto com T28N, como mostrado na tabela 2. Além disso, vários clones contendo a mutação F137S também foram obtidos. Além disso, foram obtidos clones independentemente tendo a mutação L188Q também.

(3) Construção de bactéria produzindo L-cisteína para confirmar efeito de yeaS mutante (1) (introdução de cysE5 QyeaS mutante em cepa de P. ananatis SC17)

pMT-EY2 descrito acima tem os sítios de fixação de fagos Mu originados de pMIV-5JS (patente japonesa acessível ao público No. 2008- 99668). Ao permitir a este plasmídeo coexistir com o plasmídeo ajudante pMHIO tendo Mu transposase (Zimenkov D. et al., Biotechnologiya and (em russo), 6, 1-22 (2004)) na mesma célula, o cassete de terminador PompC- cysE5-Pnlp8-YeaS-rrnB incluindo o marcador de resistência ao cloranfenicol localizado entre os sítios de fixação de fago Mu neste plasmídeo pMT-EY2 pode ser inserido no cromossomo da cepa de P. ananatis SC17 (patente U.S. No. 6.596.517). Além disso, porque o marcador de resistência ao cloranfenicol localizado no plasmídeo pMT-EY2 tem uma estrutura em que ele existe entre dois sítios de fixação de fago λ ( λttR e λattL), o marcador de resistência ao cloranfenicol pode ser excisado e removido pelo método descrito depois.

Primeiro, uma cepa SC17 introduzida com pMHIO por eletroporação foi selecionada por cultura durante a noite a 30°C no meio ágar LB contendo 20 mg/L de canamicina. O transformante obtido foi cultivado a 30°C, e pMT-E2 foi ainda introduzido nesta cepa por eletroporação. Esta cepa transformada com ambos pMHIO e pMT-EY2 recebeu um choque térmico com as condições de 42°C durante 20 minutos, e colônias de cepas resistentes a cloranfenicol foram selecionadas no meio ágar LB contendo 20 mg/L de cloranfenicol. A temperatura de cultura para esta seleção foi 39°C. Como descrito acima, cerca de 50 clones foram obtidos, e a cura de pMHIO e pMT- EY2 foi realizada por cultivo de cada clone a 39°C durante 48 horas no meio ágar LB. Uma cepa mostrando resistência a cloranfenicol devido à inserção do cassete no cromossomo e mostrando sensibilidades a canamicina e ampicilina devido à cura de ambos os plasmídeos foi obtida. Além disso, foi confirmado que o cassete objetivo foi inserido no cromossomo da cepa obtida por PCR usando o DNA cromossômico desta cepa como um gabarito, assim como Pl e P6 como iniciadores. Todos os clones obtidos foram designados EYOl a EY50, respectivamente, e a cultura de produção de L-cisteína foi realizada por uso das cepas EYOl a EY5. Para a cultura, o método descrito no exemplo 1 mencionado acima foi usado. A cepa EY19 foi selecionada, que foi um clone que produziu L-cisteína na maior quantidade como um resultado da cultura.

O marcador de resistência ao cloranfenicol introduzido na cepa EY19 foi removido com um sistema de excisão derivado de fago λ. Especificamente, a cepa EY19 foi transformada com pMT-Int-Xis2 (W02005/010175) portando o gene Int-Xis de fago λ, e uma cepa EY19(s) mostrando sensibilidade a cloranfenicol foi obtida a partir dos transformantes obtidos.

(4) Construção de bactéria produzindo L-cisteína para confirmar o efeito de yeaS mutante (2) (preparação de cepa otimizada na expressão de gene cysPTWA de cepa EY19(s))

Então, a fim de otimizar a expressão do gene cysPTWA, o promotor localizado a montante do agrupamento de genes cysPTWA no cromossomo foi substituído com o promotor Pnlp8 potente acima mencionado. Um fragmento de DNA contendo o promotor nlp8 de cerca de 300 bp foi obtido por PCR usando pMIV-Pnlp8-YeaS7 como um gabarito, assim como Ple P2. O ciclo PCR foi como a seguir: 95°C durante 3 minutos, então 2 ciclos de 95°C durante 60 segundos, 50°C durante 30 segundos, e 12°C durante 40 segundos, 20 ciclos de 94°C durante 20 segundos, 59°C durante 20 segundos, e 72°C durante 15 segundos, e 72°C durante 5 minutos como o ciclo final.

O fragmento de DNA amplificado contendo o promotor nlp8 foi tratado com o fragmento Klenow, inserido no plasmídeo pMW118-(λattL- KmRλattR) (W02006/093322A2) digerido com Xbal e então tratado com o fragmento Klenow para obter um plasmídeo pMW-Km-Pnlp8. Por PCR usando pMW-Km-Pnlp8 como um gabarito, assim como iniciadores Pl5 (tccgctcacg atttttttca tcgctggtaa ggtcatttat cccccaggaa aaattggtta, SEQ ID NO: 34) e Pl6 (tttcacaccg ctcaaccgca gggcataacc ggcccttgaa gcctgctttt ttatactaag ttg, SEQ ID NO: 35), um fragmento de DNA de cerca de 1,6 kb contendo o cassete Km-Pnlp8 foi amplificado. O ciclo PCR para esta amplificação foi como a seguir: 95°C durante 3 minutos, então 2 ciclos de 95°C durante 60 segundos, 50°C durante 30 segundos, e 72°C durante 40 segundos, 30 ciclos de 94°C durante 20 segundos, 54°C durante 20 segundos, e 12°C durante 90 segundos, e 72°C durante 5 minutos como o ciclo final. Em ambos os iniciadores, foi designada uma seqüência servindo como uma marcação no cromossomo para inserir um fragmento objetivo por integração λ-dependente (o método chamado "Red-driven integration" (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2000, vol. 97, No. 12, pp. 6640 - 6645)) (neste caso, uma seqüência próxima do promotor de cysPTWA). Deste modo, se o fragmento obtido de DNA for inserido na cepa objetiva por esta integração λ-dependente, é provida uma estrutura em que Km-Pnlp8 é inserido imediatamente antes do gene cysPTWA no cromossomo, e o gene cysPTWA é ligado com o promotor nlp8. A seqüência nucleotídica do agrupamento de genes cysPTWA é mostrada na SEQ ID NO: 12, e a seqüência de aminoácidos codificada pelos genes cysP, cysT e cysW é mostrada em SEQ ID NOS: 13 a 15, respectivamente. A seqüência nucleotídica do gene cysA e a seqüência de aminoácidos codificada por este gene são mostradas na SEQ ID NOS: 16 e 17, respectivamente.

A cepa de P ananatis SC17(0)/RSF-Red-TER é uma cepa hospedeira para realizar de modo eficiente a integração λ-dependente, e é uma cepa obtida por introdução do plasmídeo RSF-Red-TER ajudante que expressa os genes gam, bet e exo (daqui em diante referidos como "genes λ Red") na cepa SC 17(0), que é uma cepa de P ananatis resistente a produto de gene λ Red (WO 2008/075483). A cepa SC 17(0) foi depositada junto ao Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika (endereço: Rússia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd. 1) em 21 de setembro de 2005 com um número de acesso de VKPM B-9246. Um método para construir o plasmídeo RSF-Red-TER é descrito em detalhes em WO 2008/075483.

A cepa SC17(0)/RSF-Red-TER acima mencionada foi cultivada com a adição de IPTG para induzir a expressão de genes λ Red para preparar as células para eletroporação. O fragmento de DNA objetivo acima mencionado foi introduzido nestas células por eletroporação, e uma cepa recombinante em que o promotor nlp8 foi inserido a montante do gene cysPTWA por integração λ-dependente foi obtida por uso de uma resistência a canamicina como um marcador. Por PCR usando o DNA cromossômico da cepa obtida como um gabarito, assim como Pl7 (ctttgtccct ttagtgaagg, SEQ ID NO: 36) e Pl8 (agctgatcta gaagctgact cgagttaatg gcctcccaga cgac, SEQ ID NO: 37) como iniciadores, foi confirmado que a estrutura objetiva, Km- Pnlp8-CysPTWA, foi formada, e esta cepa foi designado cepa SC17(0)-Pnlp8- PTWA.

Então, o DNA cromossômico da cepa SC17(0)-Pnlp8-PTWA foi purificado, e 10 μg deste DNA cromossômico foram introduzidos na cepa EY19(s) por eletroporação para obter uma cepa resistente a canamicina. A amplificação foi realizada por PCR usando o DNA cromossômico da cepa obtida como um gabarito, assim como Pl7 e P18 como iniciadores para confirmar que a estrutura de Km-Pnlp8-cysPTWA foi introduzida no cromossomo da cepa EYl9(s). A cepa obtida como descrita acima foi designada cepa EYP197. Além disso, o marcador resistente a canamicina foi removido do cromossomo por uso de pMT-Int-Xis2 como descrito acima, e a cepa que se tornou sensível a canamicina foi designada cepa EYP197(s).

(5) Construção de bactéria produzindo L-cisteína para confirmar efeito de yeaS mutante (3) (preparação de cepa portando gene 3- fosfoglicerato desidrogenase (serA348) mutante de cepa EYP197(s))

Como um gene de 3-fosfoglicerato desidrogenase para ser introduzido na bactéria produzindo L-cisteína, o gene serA348, que é um gene codificando para 3-fosfoglicerato desidrogenase de Pantoea ananatis e codificando para uma enzima mutante incluindo uma mutação para substituição de um resíduo de alanina pelo resíduo de asparagina na 348â posição (N348A) (J. Biol. Chem., 1996, 271 (38): 23235-8), foi construído pelo seguinte método.

A seqüência do gene serA de tipo selvagem derivado de Pantoea ananatis é mostrada em SEQ ID NO: 10. A fim de obter um fragmento lateral de extremidade de fragmento 3' de DNA do gene ser a, em que a mutação acima mencionada foi introduzida, PCR foi realizado por uso do DNA cromossômico da cepa SC17 como um gabarito assim como P19 (agctgagtcg acatggcaaa ggtatcactg gaa, SEQ ID NO: 38) e P20 (gagaacgccc gggcgggctt cgtgaatatg cagc, SEQ ID NO: 39) como iniciadores (950C durante 3 minutos, então 2 ciclos de 950C durante 60 segundos, 50°C durante 30 segundos, e 72°C durante 40 segundos, 25 ciclos de 94°C durante 20 segundos, 60°C durante 20 segundos, e 72°C durante 60 segundos, e 72°C durante 5 minutos como o ciclo final). A seguir, a fim de obter um fragmento lateral de extremidade 5' de DNA em que uma mutação foi introduzida, PCR foi realizado no mesmo modo por uso do DNA cromossômico da cepa SC17 como um gabarito assim como P21 (agctgatcta gacgtgggat cagtaaagca gg, SEQ ID NO: 40) e P22 (aaaaccgccc gggcgttctc ac, SEQ ID NO: 41) como iniciadores (95°C durante 3 minutos, então 2 ciclos de 95°C durante 60 segundos, 50°C durante 30 segundos, e 12°C durante 40 segundos, 20 ciclos de 94°C durante 20 segundos, 60°C durante 20 segundos, e 12°C durante 20 segundos, e Il0C durante 5 minutos como o ciclo final). Ambos os fragmentos PCR obtidos foram tratados com a enzima de restrição SmaI, e ligados por uso de uma DNA ligase para obter um fragmento de DNA correspondente e um gene serA mutante de comprimento completo incluindo a mutação objetiva (N348A). Este fragmento de DNA foi amplificado por PCR usando o mesmo como um gabarito assim como P19 e P21 como iniciadores (950C durante 3 minutos, então 2 ciclos de 950C durante 60 segundos, 50°C durante 30 segundos, e Il0C durante 40 segundos, 15 ciclos de 94°C durante 20 segundos, 60°C durante 20 segundos, e ITC durante 75 segundos, e 110C durante 5 minutos como o ciclo final). Os sítios de enzima de restrição SalI e Xbal designados nos iniciadores Pl9 e P21 foram tratados com SalI and Xbal, e o fragmento foi inserido em pMIV-Pnlp8-ter e similarmente tratado com Sali e Xbal para preparar pMIV-Pnlp8-serA348.

O pMIV-Pnlp8-serA348 construído transportou o sítio de fixação de Mu se originando em pMIV-5JS (patente japonesa acessível ao público No. 2008-99668). Por uso deste plasmídeo junto com o plasmídeo pMHIO ajudante tendo Mu transposase, o cassete de terminador Pnlp8- serA348-rrnB incluindo o marcador de resistência ao cloranfenicol pode ser inserido no cromossomo da cepa de P. ananatis SC17, como descrito acima.

O plasmídeo pMIV-Pnlp8-serA348 e pMHIO foram introduzidos na cepa SC 17(0) para obter uma cepa em que o cassete de terminador Pnlp8-serA348- rrnB foi inserido no cromossomo. Por PCR usando os iniciadores Pl e P21, foi confirmado que o cassete objetivo existia nas células. A atividade de 3- fosfoglicerato desidrogenase nos extratos de célula de cerca de 50 dos clones obtidos foi medida, e uma cepa que mostrou a maior atividade foi selecionada, e designada cepa SC17int-serA348. A seguir, 10 μg do DNA cromossômico da cepa SC17int-serA348 foram introduzidos na cepa EYP197(s) por eletroporação para obter uma cepa resistente a cloranfenicol, e por PCR usando os iniciadores Pl e P21, foi confirmado que a estrutura de Pnlp8-serA348 foi introduzida junto com o marcador de resistência ao cloranfenicol no cromossomo da cepa EYP197(s). A cepa obtida como descrito acima foi designada cepa EYPS1976.

Pelo método acima mencionado para a remoção do marcador usando pMT-Int-Xis2, o marcador de resistência ao cloranfenicol foi removido, e a cepa que se tornou sensível a cloranfenicol foi designada cepa EYPS1976(s).

(6) Construção de bactéria produzindo L-cisteína para confirmar o efeito de yeaS mutante (4) (preparação da cepa portando o gene O-acetil-L-serina sulfhidrilase B (cysM) ) de cepa EYPS1976(s))

Primeiro, a fim de clonar o gene cysM com um promotor de resistência apropriada, um promotor novo foi preparado. Primeiro, um fragmento de DNA contendo a região de promotor de cerca de 180 bp para o gene rilpD foi obtido por uso do genoma de cepa de P ananatis SC17 como um gabarito. Os iniciadores usados foram P23 (agctgaaagc ttgcatgcac gcgtggcgat ctggcctgac tgc, SEQ ID NO: 42) e P24 (agctgagtcg accccgtggt ggcaaccttt aaaaaactg, SEQ ID NO: 43), e sítios de enzima de restrição Sall e Pae I foram designados nas extremidades 5' destes iniciadores, respectivamente. O ciclo de PCR foi como a seguir: 95°C durante 5 minutos, então 27 ciclos de 94°C durante 20 segundos, 59°C durante 20 segundos, e 72°C durante 20 segundos, e 72°C durante 5 minutos como o ciclo final.

A seqüência nucleotídica do gene cysM de Escherichia eoli e uma seqüência de aminoácido codificada pelo gene são mostradas em SEQ ID NOS: 14 e 15, respectivamente.

O fragmento de DNA obtido foi tratado com Sall e PaeI, e inserido em pMIV-PnlpO-ter similarmente tratado com Sall e PaeI para obter pMIV-Pnlp4-ter. A seqüência nucleotídica do fragmento Pael-SaIl do promotor Pnlp4 inserido no plasmídeo pMIV-Pnlp4-ter acima foi como mostrada na SEQ ID NO: 8. Em um modo similar, por PCR usando o plasmídeo pMIV-Pnlp4-ter como um gabarito assim como P23 e P25 (agctgagtcg acnnngtggt ggcaaccttt aaaaaactg ("n" significa que o resíduo correspondente pode ser qualquer dentre a, t, g e c), SEQ ID NO: 44) como iniciadores (95°C durante 5 minutos, então 27 ciclos de 94°C durante 20 segundos, 59°C durante 20 segundos, e 72°C durante 20 segundos, e 72°C durante 5 minutos como o ciclo final), um fragmento de DNA em que a região -7 a -9 contida no lado de extremidade 5' do promotor nlpD foi randomizada, foi preparado, tratado com SalI e PaeI, e inserido em pMIV-PnlpO-ter tratado com as mesmas enzimas para obter pMIV-Pnlpl-ter. A seqüência nucleotídica do fragmento PaeI-SalI do promotor Pnlpl inserido no plasmídeo pMIV- Pnlpl acima foi como mostrada em SEQ ID NO: 9. A região -7 a -9 significa as posições de do sétimo ao novo nucleotídeos no lado 5' de um sítio de iniciação de transcrição do promotor nlpD.

O gene cysM clonado da cepa de E. eoli MG1655 foi incorporado no vetor acima. Especificamente, o genoma da cepa de E. eoli MG1655 como um gabarito foi amplificado por PCR usando P26 (agctgagtcg acgtgagtacattagaacaa acaat, SEQ ID NO: 45) e P27 (agctgatcta gaagtctccg atgctattaa tcc, SEQ ID NO: 46) como iniciadores (950C durante 5 minutos, então 30 ciclos de 98°C durante 5 segundos, 50°C durante 10 segundos, e 72°C durante 60 segundos, e 72°C durante 2 minutos como o ciclo final). O fragmento de DNA obtido como descrito acima foi tratado com enzimas de restrição SalI e XbaI, e inserido em pMIV-Pnlp4-ter e pMIV-Pnlpl-ter e tratado com as mesmas enzimas para preparar pMIV-Pnlp4-CysM e pMIV- Pnlpl-CysM, respectivamente.

Por uso de pMIV-Pnlp4-CysM e pMIV-Pn1p 1-CysM construídos como descrito acima, cepas SC17 em que um cassete compreendendo o gene cysM foi inserido no cromossomo, foram obtidas pelo método acima mencionado usando pMHIO, respectivamente. As cepas preparadas como descrito acima foram designadas SC17int-4M e SC17int- 1M, e o DNA cromossômico foi extraído de cada um das cepas. Este DNA cromossômico em uma quantidade de 10 μg foi introduzido na cepa EYP1976(s) por eletroporação para obter uma cepa resistente a cloranfenicol.

As cepas preparadas como descrito acima foram designadas EYPSint-4M e EYPSint-1M, respectivamente, o marcador de resistência ao cloranfenicol foi removido pelo método acima mencionado para eliminar o marcador usando pMT-Int-Xis2, e as cepas que se tornaram sensíveis a cloranfenicol foram designadas EYPSint-4M(s) e as cepas EYPSint-lM(s), respectivamente.

(7) Influência de yeaS mutante em produção de L-cisteína Alguns dos genes yeaS mutantes preparados no exemplo 2, (2) mencionado acima, foram selecionados e introduzidos na bactéria produzindo cisteína preparada acima, EYPSintlM(s), e a cultura de produção de L- cisteína foi realizada. As cepas a serem avaliadas foram cada aplicadas no meio ágar LB, pré-cultura foi realizada durante a noite a 34°C, e as células em cerca de 7 centímetros quadrados da placa foram raspadas com um laço de inoculação de 10 μΐ de tamanho (NUNC), e inoculadas em 2 ml de um meio na produção de L-cisteína (composição: 15 g/L de sulfato de amônio, 1,5 g/L de di-hidrogenofosfato de potássio, 1 g/L de sulfato de magnésio heptaidratado, 0,1 mg/L de cloridrato de tiamina, 1,7 mg/L sulfato ferroso heptaidratado, 0,15 mg/L de molibdato de sódio diidratado, 0,7 mg/L de cloreto de cobalto hexaidratado, 1,6 mg/L de cloreto de manganês tetraidratado, 0,3 mg/L de sulfato de zinco heptaidratado, 0,25 mg/L de sulfato de cobre pentaidratado, 0,6 g/L de triptona, 0,3 g/L de extrato de levedura, 0,6 g/L de cloreto de sódio, 20 g/L de carbonato de cálcio, 135 mg/L de cloridrato de L-histidina monoidratado, 4 g/L de tiossulfato de sódio, 2 mg/L de cloridrato de piridoxina, 20 g/L de glicose, 20 mg/L de canamicina, e 1 mM de IPTG) contidos em um tubo de teste grande (diâmetro interno: 23 mm, comprimento: 20 cm), de modo que as quantidades de células no início da cultura devem ser substancialmente iguais.

Cultura foi realizada a 32°C com agitação, e terminada quando glicose foi completamente consumida (cerca de 15 a 19 horas), e a L-cisteína produzida no meio foi quantificada. Para os números de testes 1 e 2 mencionados na tabela 2, o experimento foi realizado em triplicata a quintuplicata simultaneamente, e para o número de teste. 3, o experimento único foi separadamente realizado duas vezes. As médias e desvios padrão das quantidades de L-cisteína produzidas obtidas como resultado são mostrados na tabela 2. Verificou-se que os mutantes obtidos pelo sistema de triagem acima mencionado também foram efetivos na cultura de produção de L- cisteína. Com base nestes resultados, verificou-se que pelo menos as mutações na posição 28 e na posição 188 foram independentemente efetivas. Além disso, nas várias cepas em que a capacidade de produzir L-cisteína foi melhorada, mutação tripla incluindo a mutação na posição 137- (F137S) foi observada. Deste modo, pensa-se que F137S pode estar independentemente envolvido na melhora da capacidade de produzir L-cisteína. Além disso, com base em várias análises, pensa-se que as mutações nas posições 11, 33, 52, 59, 60, 65, 72, 77, 85, e 86 são mutações silentes que não diminuem uma atividade da proteína YeaS.

Tabela 2: Avaliação de cepas obtidas por triagem por cultura

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(8) Introdução de mutação típica no gene yeaS e avaliação de resistência a L-cisteína de cepa introduzida por mutação no meio líquido

Por independentemente introduzir a mutação F137S para

substituição de um resíduo de serina pelo resíduo de fenilalanina em posição 137 no gene yeaS, e ainda transferir o gene mutante para pSTV29 (Takara Bio), o efeito desta mutação sozinho foi examinado.

Pelo método PCR de sobreposição, um vetor incorporado com a mutação objetiva, o promotor apropriado e o terminador de yeas foi preparado. Um iniciador P28 contendo a mutação (cgataaactg tacgaaagac gacacataga ac, SEQ ID NO: 47) foi designado primeiro, e usado junto com um iniciador P29 (cgcggatcca gtggtcattt agtgc, SEQ ID NO: 48) como iniciadores, e o genoma de E. coli MGl 655 como um gabarito para amplificar um fragmento Γ de DNA por PCR. O programa consistiu de 94°C durante 5 minutos, então 30 ciclos de 98°C durante 5 segundos, 550C durante 10 segundos, e 72°C durante 45 segundos, e 72°C durante 2 minutos como o ciclo final. Além disso, um 'fragmento 2' de DNA foi amplificado por PCR usando P9 e P30 (cgcggatcct gtgggatttg aagcatcc, SEQ ID NO: 49) com um programa consistindo de 94°C durante 5 minutos, então 30 ciclos de 98°C durante 5 segundos, 5 50C durante 10 segundos, e 72°C durante 60 segundos, e 72°C durante 2 minutos como o ciclo final. Os fragmentos obtidos foram submetidos a eletroforese de gel agarose, e as bandas foram excisadas e purificadas. PCR foi realizado por uso de uma mistura do 'fragmento Γ de DNA e do 'fragmento 2' de DNA diluído 10 vezes como um gabarito assim como P29 e P30 como iniciadores com um ciclo consistindo de 94°C durante 5 minutos, então 30 ciclos de 98°C durante 5 segundos, 55°C durante 10 segundos, e 72°C durante 1 minuto e 10 segundos, e 72°C durante 2 minutos como o ciclo final, e o fragmento de DNA amplificado foi submetido a eletroforese de gel agarose e então purificado no mesmo modo como o descrito acima.

O produto de purificação e um vetor pSTV29 foram digeridos com BamHI, a extremidade do vetor foi defosforilada com CIAP (Takara Bio), então eles foram ligados, e JM109 foi transformado com o plasmídeo obtido. Os plasmídeos foram extraídos dos transformantes para obter pSTV- YeaSFl 3 7 S portando um gene yeaS mutante codificado para YeaS incluindo a substituição de um resíduo de serina pelo resíduo de fenilalanina na 137â posição. Como um controle, pSTV-YeaSWT portando um gene yeaS de tipo selvagem na mesma estrutura de modo que o pSTV-YeaSF137S também foi construído. No entanto, porque não foi necessário introduzir a mutação, as etapas de preparar o 'fragmento Γ e o 'fragmento 2' foram omitidas, e um fragmento contendo o gene yeaS foi obtido por PCR usando o genoma de E. coli MGl655 como um gabarito assim como P29 e P30 como iniciadores.

Então, a resistência a L-cisteína do gene yeaS mutante introduzido na cepa em um meio líquido foi confirmada. MGl 655 de E. coli foi transformado com pSTV-YeaSWT e pSTV-YeaSF137S para preparar MG1655/pSTV-YeaSWT e MG1655/pSTV-YeaSF137S. Cada uma das cepas foi inoculada no meio M9 contendo 25 mg/L de cloranfenicol e 0,4% de glicose (Sambrook et ai., Molecular Cloning, 3a edição, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press), e cultivadas a 37°C durante 24 horas para obter uma cultura de sementes. Esta cultura de sementes foi inoculada em uma quantidade de 1/50 no meio M9 recentemente preparado. A cultura foi realizada a 37°C durante 14 horas, e então absorvância foi medida a 660 nm (OD66O). As densidades celulares de todas as cepas de teste foram ajustadas de modo que seus valores OD66O podem ser iguais que o valor OD66O da cepa que mostrou o menor valor OD66O, e cada cepa foi inoculada em uma quantidade de 1/100 para o meio M9 contendo 200 μΜ de L-cisteína contida em um tubo de teste em formato de L. O crescimento das células foi observado fixando o tubo de teste em formato de L acima em um aparelho de medição de cultura OD automático BIO-PHOTORECORDER TN-1506 (ADVANTEC) e medindo OD66O a cada 10 minutos. A diferença na resistência a L-cisteína das cepas de teste foi avaliada como determinado com base na rapidez de aumento de crescimento no meio acima mencionado. Nesta cultura, como a resistência a L-cisteína foi maior, o aumento do valor OD66O começou antes, e a resistência a L-cisteína foi inferior,o aumento do valor OD66O começou mais lentamente, e o período onde o crescimento aparente não pode ser observado (atraso) começou depois. A curva de crescimento é mostrada na fig. 2. Como mostrado na fig. 2, o início de aumento no valor OD66O da cepa tendo YeaS tendo a mutação F137S (YeaSF137S) foi antes comparado com o da cepa tendo o YeaS (YeaSWT) de tipo selvagem, e foi sugerido que resistência a L-cisteína foi conferida ao primeiro.

(9) Influência de YeaSFl37S na produção de L-cisteína

A fim de confirmar a capacidade de produzir L-cisteína da cepa otimizada em YeaSF 137S, que mostrou maior resistência a L-cisteína comparada com a cepa otimizada em YeaSWT na cultura de líquido M9 contendo L-cisteína, um plasmídeo ligado com um gene codificando para YeaSF137S sob o controle do promotor Pnlp8 mais forte foi construído. Este plasmídeo foi introduzido nas bactérias produzindo L-cisteína EYPSint-4M, e o efeito na produção de L-cisteína foi confirmado. Primeiro, por uso de pSTV-YeaSWT e pSTV-YeaSF137S como gabaritos junto com P31 (aagtcgacgt gttcgctgaa tacggggttc tg, SEQ ID NO: 50) e P32 (aatctagatc aggattgcag cgtcgcc, SEQ ID NO: 51) como iniciadores, PCR foi realizado com um programa consistindo de 94°C durante 5 minutos, então 30 ciclos de 98°C durante 5 segundos, 60°C durante 10 segundos, e 72°C durante 60 segundos, e 72°C durante 2 minutos como o ciclo final para amplificar o fragmento yeaSWT do gene e fragmento yeaSF137S do gene, que foram adicionados aos sítios SalI e XbaI na extremidade 5' e extremidade 3', respectivamente. Estes e os pMIV-Pnlp8 acima mencionados foram digeridos com SalI e XbaI, e ligados, e JMl 09 foi transformado com o produto de reação de ligação. Os plasmídeos foram extraídos a partir dos transformantes, e introduzidos na cepa produzindo L-cisteína EYPSint-4M(s) para obter EYPSint-4M/pMIV-Pnlp8-YeaSWT e EYPSint-4M/pMIV-Pnlp8-YeaSF137S, respectivamente. Além disso, EYPSint-4M/pMIV-5JS introduzido com somente o vetor também foi preparado como um controle, e a avaliação por cultura do tubo de teste foi realizada pelo método descrito em (3) mencionado acima. No entanto, a concentração de glicose foi mudadas para 40 g/L, e IPTG não foi adicionado.

Os resultados são mostrados na tabela 3. Pode ser visto que enquanto L-cisteína aumentou apenas levemente com otimização de YeaSWT, a otimização de YeaSFl 3 7S aumentou marcadamente a produção de L- cisteína. Isto é, foi considerado que YeaSF 137S melhorou ainda mais a atividade de aumentar marcadamente a capacidade de produzir L-cisteína da célula hospedeira comparado com uma cepa não modificada, comparado com o YeaSWT convencional. Tabela 3: Efeito de otimização YeaSWT e YeaSFl 37S em cepa produzindo cisteína

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(10) Influência de YeaSFl 3 7S na produção de L-cisteína em E. coli

Efeito de otimização de expressão do gene yeaS em E. coli foi examinado.

Um plasmídeo contendo um gene cysE mutante foi construído primeiro. Especificamente, um plasmídeo pACYC-DEl foi construído de acordo com o método para construir pACYC-DES, descrito na patente japonesa acessível ao público No. 2005-137369 desde que foi omitida a etapa de incorporar um gene serA5 mutante codificando para uma fosfoglicerato desidrogenase dessensibilizada para retroinibição por serina (descrito na patente U.S. No. 6.180.373). Enquanto pACYC-DES portou o mutante serA5 acima mencionado, o gene codificando para o SAT mutante dessensibilizado para a retroinibição, o gene cysEX, e o gene ydeD codificando para o fator de secreção de L-cisteína e acetilserina (patente U.S. No. 5.972.663), pACYC- DE1 construído acima não continham serA5 mencionado acima, mas continham cysEX e ydeD. Para expressão de todos os genes, o promotor ompA foi usado.

Como descrito depois, enquanto YeaS foi esperado como estando envolvido na secreção de L-cisteína, mas pensou-se que o produto ydeD, que é um fator de secreção de L-cisteína, otimiza o fundo quando o efeito de YeaSF 137S é avaliado. Deste modo, a fim de confirmar o efeito líquido do YeaSFl37S, o gene ydeD foi deletado de pACYC-DEl. ρ ACYC- DE1 foi tratado com Mnul e auto-ligado para construir um plasmídeo em que cerca de 330 bp da seqüência interna do gene ydeD ORF foram deletados. Este plasmídeo não expressando YdeD funcionando como um fator de secreção de L-cisteína, mas portando somente CysEX foi designado pACYC- E1. MG1655 de E. coli foi transformado com este plasmídeo pACYC-E1 para preparar uma cepa MG1655/pACYC-El. Para isto, a cepa MG1655/pACYC- E1 como um hospedeiro, o plasmídeo pMIV-Pnlp8-yeaSWT portando o gene yeaS de tipo selvagem, o plasmídeo pMIV-Pnlp8-yeaS137 portando o gene yeas mutante, e pMIV-5JS como um controle, foram introduzidos por eletroporação, respectivamente. A produção de L-cisteína das cepas obtidas foi examinada por cultura de tubo de teste sob as mesmas condições como o do método descrito no exemplo 1 (tabela 4). A cultura de tubo de teste foi simultaneamente realizada para quadruplicar em cada cepa, e a média dos resultados é mostrada na tabela. Verificou-se que as quantidades de produção de L -cisteína foram melhoradas pelo aumento das quantidades de expressão do gene yeaS e do gene yeaS mutante também em E. coli tendo uma capacidade de produzir L-cisteína. Isto é, pode ser confirmado que o produto de gene yeaS também mostrou uma atividade de melhorar a capacidade de produzir L-cisteína de uma célula hospedeira comparado com uma cepa não modificada também em E. coli tendo uma capacidade de produzir L-cisteína.

Tabela 4: Efeito de otimização de YeaSWT e YeaSF137S na cepa de

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(11) Caracterização de YeaSFl 3 7S

Os resultados descritos acima revelam que YeaSF 137S foi utilizável para a produção de L-cisteína, e foi considerado que isto pode ser devido ao aumento da capacidade de secretar de L-cisteína. Deste modo, a fim de investigar a influência na secreção de outros aminoácidos, cada uma de três amostras do meio em que cada das três cepas acima mencionadas, EYPSint-4M/pMIV-5JS, EYPSint-4M/pMIV-Pnlp8-YeaSWT, e EYPSint- 4M/pMIV-Pnlp8-YeaSF 137S, foram cultivadas, foram diluídas 20 vezes com 0,1 N de ácido clorídrico, e os vários L-aminoácidos contidos foram quantificados por uso de um analisador de aminoácido (L-8500, Hitachi). Os resultados são mostrados na fig. 3. Outros vários L-aminoácidos foram secretados por uma cepa com YeaSFl 3 7S comparado com uma cepa com YeaSWT, e especialmente secreção de L-Ieucina aumentou de 21 mg/L para 656 mg/L. A partir dos resultados acima, foi revelado que a substituição de um resíduo de serina pelo resíduo de fenilalanina na 137â posição de YeaS não somente promoveu o acúmulo de L-cisteína no meio, mas também promoveu o acúmulo de outros aminoácidos como L-leucina, L-treonina, L-serina, glicina, L-alanina, L-cistina, L-metionina, L-histidina, e L-valina. Deste modo, estima-se que YeaSFl 37S também promove a secreção destes aminoácidos. Deste modo, YeaSF 137S é vantajoso para a produção fermentativa destes aminoácidos.

Além disso, cepas pMIV-5JS, pMIV-Pnlp8-YeaSWT e pMIV- Pnlp8-YeaSF137S introduzidas foram similarmente preparadas para MG165 5 de E. coli, a cultura do tubo de teste foi realizada sob as mesmas condições como as da cultura de EYPSint-4M(s), e análise de aminoácido do meio foi realizada como descrito acima. Os resultados são mostrados na fig. 4. Também em E. coli, YeaSF 137S promoveu o acúmulo de glicina, L- metionina, L-leucina, L-histidina, L-alanina, L-cistina, L-valina, e ácido L- glutâmico, e assim é vantajoso para produção fermentativa destes aminoácidos.

(12) Exame de efeito de substituição de outros resíduos de aminoácidos por resíduo de fenilalanina em posição 137 de YesS

A influência da substituição de um resíduo de aminoácido diferente de resíduo de serina pelo resíduo de fenilalanina na posição 137 de YesS na produção de L-cisteína foi examinada. Primeiro, um 'fragmento 1' de DNA foi amplificado por PCR usando pMIV-Pnlp8-YeaS como um gabarito assim como P33 (aaacgtgagg aaatacctgg, SEQ ID NO: 52) e P34 (cgataaactg tacgaannnc gacacataga ac ("n" significa que o resíduo correspondente pode ser qualquer dentre a, t, g e c), SEQ ID NO: 53) como iniciadores. O programo consistiu de 94°C durante 5 minutos, então 30 ciclos de 98°C durante 5 segundos, 60°C durante 10 segundos, e 72°C durante 1 minuto, e 72°C durante 1 minuto como o ciclo final. Além disso, o 'fragmento 2' de DNA foi similarmente amplificado por usar P31 e P32 com o mesmo ciclo. PCR de sobreposição foi realizado por uso de uma mistura do 'fragmento Γ e o 'fragmento 2' diluído 10 vezes como um gabarito assim como P32 e P33 como iniciadores com o programa acima mencionado, e o fragmento de DNA obtido foi purificado, então tratado com Sall e Xbal, e introduzido no vetor pMIV-Pnlp23 acima mencionado tratado com as mesmas enzimas para preparar pMIV-Pnlp23-YeaSF137*. Depois a seqüência foi confirmada, o plasmídeo portando um gene yeaS mutante tendo uma mutação para substituição de um resíduo de aminoácido diferente de resíduo de serina pelo resíduo de fenilalanina na 137â posição foi introduzido na cepa de E. coli MGl 655 por eletroporação, e as células foram inoculadas em uma placa de seleção M9 contendo 1 mM de L-cisteína preparada no mesmo modo que descrito acima, e cultivado a 37°C para examinar a resistência a L-cisteína da cepa.

A resistência a L-cisteína foi avaliada com base na da cepa tendo fenilalanina (WT). Como resultado, o grau de resistência a L-cisteína aumentou nas cepas tendo substituição de, além de serina (S), glutamina (Q), alanina (A), histidina (H), cisteína (C), e glicina (G). Especialmente resistência a L-cisteína elevada foi observada para uma cepa tendo substituição de um resíduo de glutamina (F137Q).

Deste modo, pMIV-Pnlp23-YeaSFl 37Q foi tratado com Sal.I e Xbal, e inserido em pMIV-Pnlp8 tratado com as mesmas enzimas para preparar pMIV-Pnlp8-YeaSF137Q ligado com yeaSF137Q sob o controle de pnlp8. Este plasmídeo foi introduzido em uma cepa produzindo L-cisteína de P. ananatis, e cultura de produção de L-cisteína foi realizada. Como controles, cepas EYPSint- lM(s) introduzidas com pMIV-Pnlp8-YeaSWT e pMIV- Pnlp8-YeaSF137S foram usadas. Os resultados são mostrados na tabela 5. Foi revelado que a atividade de melhorar a capacidade de produzir L-cisteína de uma célula hospedeira comparado com uma cepa não modificada foi mais melhorada com o YeaS mutante em que um resíduo de glutamina substituído pelo resíduo de fenilalanina na 137â posição (YeaSF137Q) comparado com o YeaS de tipo selvagem.

Tabela 5: Efeito de otimização de YeaSWT, YeaSF137S e YeaSF137Q em cepa produzindo cisteína

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Como descrito acima, verificou-se que existia uma correlação entre aquisição de resistência a L-cisteína pelo aumento de quantidade de expressão de um mutante yeaS e produção de L-cisteína. Considera-se que a resistência a L-cisteína é melhorada por promoção de secreção extracelular de L-cisteína. Pode-se considerar que, se isto for correto, genes yeaS mutantes incluindo uma mutação para substituição de uma alanina, histidina, cisteína, ou glicina pelo resíduo de fenilalanina na 137^_posição, que mostrou um efeito de melhora da resistência a L-cisteína efeito na placa de seleção M9 contendo L-cisteína, são similarmente efetivos para aumentar a produção de L-cisteína. A fim de verificar esta expectativa, a confirmação pode ser realizada por preparação de pMIV-Pnlp8-YeaSF137A, pMIV-Pnlp8-YeaSF137H, pMIV- Pnlp8-YeaSF137C e pMIV-Pnlp8-YeaSF137G no mesmo modo como descrito para a construção de pMIV-Pnlp8-YeaSF137Q mencionado acima, introduzindo os mesmos em EYPSint-lM(s), e realizando a produção de cultura de L-cisteína usando as cepas obtidas. Explicação de listagem de seqüência

SEQ ID NO: 1: Seqüência nucleotídica de gene yeaS de tipo selvagem. SEQ ID NO: 2: Seqüência de aminoácido de YeaS de tipo selvagem. SEQ ID NO: 3: Seqüência nucleotídica de gene cysE de tipo selvagem. SEQ ID NO: 4: Seqüência de aminoácido de serina acetiltransferase codificada por cysE de tipo selvagem. SEQ ID NO: 5: Seqüência nucleotídica de PnlpO. SEQ ID NO: 6: Seqüência nucleotídica de Pnlp8. SEQ ID NO: 7: Seqüência nucleotídica de Pnlp23. SEQ ID NO: 8: Seqüência nucleotídica de Pnlp4. SEQ ID NO: 9: Seqüência nucleotídica de Pnlp 1.

SEQ ID NO: 10: Seqüência nucleotídica de gene serA de tipo selvagem de Pantoea ananatis.

SEQ ID NO: 11: Seqüência de aminoácido codificada por gene serA de tipo selvagem de Pantoea ananatis.

SEQ ID NO: 12: Seqüência nucleotídica de agrupamento de gene cysPTWA. SEQ ID NO: 13: Seqüência de aminoácido codificada por gene cysP. SEQ ID NO: 14: Seqüência de aminoácido codificada por gene cysT. SEQ ID NO: 15: Seqüência de aminoácido codificada por gene cysW. SEQ ID NO: 16: Seqüência nucleotídica de gene cysA. SEQ ID NO: 17: Seqüência de aminoácido codificada por gene cysA. SEQ ID NO: 18: Seqüência nucleotídica de gene cysM. SEQ ID NO: 19: Seqüência de aminoácido codificada por gene cysM. SEQ ID NOS: 20 a 53: Iniciadores P1 a P34.

Claims

1. Método para produzir um L-aminoácido, caracterizado pelo fato de compreender: a) cultivar em um meio uma bactéria pertencendo à família Enterobacteriaceae, que tem uma capacidade de produzir L-aminoácido, e foi modificada para ter um gene yeaS mutante tendo uma mutação selecionada dentre o grupo consistindo de: (I) uma mutação para substituição de um resíduo de aminoácido diferente de resíduo de treonina pelo resíduo de treonina em posição 28 na proteína codificada pelo genQyeaS, (II) uma mutação para substituição de um resíduo de aminoácido diferente de resíduo de fenilalanina pelo resíduo de fenilalanina em posição 137 na proteína codificada pelo gene yeaS, e (III) uma mutação para substituição de um resíduo de aminoácido diferente de resíduo de leucina pelo resíduo de leucina em posição 188 na proteína codificada pelo geneyeaS, e, b) coletar o L-aminoácido do meio, em que o gene yeaS sem referida mutação ou mutações codifica para uma proteína selecionada dentre o grupo consistindo de: (A) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, e (B) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, mas em que 1 a 10 resíduos de aminoácidos são substituídos, deletados, inseridos ou adicionados, e a proteína tem uma atividade de melhorar uma capacidade de produzir L-cisteína na bactéria pertencendo à família Enterobaeteriaceae quando comparado com uma bactéria não modificada quando a expressão de uma proteína é aumentada na bactéria.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o gene yeaS sem referida mutação ou mutações é selecionado dentre o grupo consistindo de: (a) um DNA compreendendo a seqüência nucleotídica de SEQ ID NO: 1, ou (b) um DNA que é capaz de hibridizar com uma seqüência complementar a uma seqüência nucleotídica de SEQ ID NO: 1 ou uma sonda que pode ser preparada a partir da seqüência nucleotídica sob condições estringentes, e em que referido DNA codifica para uma proteína tendo uma atividade de melhorar uma capacidade de produzir L-cisteína na bactéria pertencendo à família Enterobacteriaceae como comparado a uma cepa não modificada quando a expressão da proteína é aumentada na bactéria.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que as mutações de (I) a (III) são mutações dos seguintes (i) a (iii), respectivamente: (i) uma mutação para substituição de um resíduo de asparagina pelo resíduo de treonina em posição 28, (ii) uma mutação para substituição de um resíduo de serina, glutamina, alanina, histidina, cisteína ou glicina pelo resíduo de fenilalanina em posição 137, (iii) uma mutação para substituição de um resíduo de glutamina pelo resíduo de leucina em posição 188.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a bactéria tem um gene yeaS mutante tendo a mutação de (ii), e em uma proteína codificada por este gene, um resíduo de serina ou glutamina substitui o resíduo de fenilalanina em 13 7â posição.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -3, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido é selecionado dentre o grupo consistindo de L-cisteína, L-leucina, L-treonina, L-serina, L-metionina, L- histidina, L-valina, ácido L-glutâmico, L-arginina, L-isoleucina, L- fenilalanina, L-tirosina, L-triptofano, e L-prolina.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido é L-cisteína.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a bactéria foi modificada para aumentar a atividade de uma enzima do sistema de biossíntese de L-cisteína.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a bactéria foi modificada para aumentar a atividade de serina acetiltransferase.

9. Método de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que a bactéria tem uma serina acetiltransferase mutante em que a retroinibição por L-cisteína é reduzida.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a bactéria é uma bactéria Pantoea.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a bactéria é Pantoea ananatis.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a bactéria é Escherichia eoli.

13. Bactéria que pertence à família Enterobaeteriaeeae, caracterizada pelo fato de ter uma capacidade de produzir L-cisteína, e foi modificada para ter um gene yeaS mutante tendo uma mutação selecionada dentre o grupo consistindo de: (I) uma mutação para substituição de um resíduo de aminoácido diferente de resíduo de treonina pelo resíduo de treonina em posição 28 na proteína codificada pelo gene yeaS, (II) uma mutação para substituição de um resíduo de aminoácido diferente de resíduo de fenilalanina pelo resíduo de fenilalanina em posição 137 na proteína codificada pelo gene yeaS, e (III) uma mutação para substituição de um resíduo de aminoácido diferente de resíduo de leucina pelo resíduo de leucina em posição 188 na proteína codificada pelo gene yeaS, e, em que o gene yeaS sem referida mutação ou mutações codifica para uma proteína selecionada dentre o grupo consistindo de: (A) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, e (B) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, mas em que 1 a 10 resíduos de aminoácidos são substituídos, deletados, inseridos ou adicionados, e a proteína tem uma atividade de melhorar uma capacidade de produzir L-cisteína em uma bactéria pertencendo à família Enterobacteriaceae quando comparado com uma bactéria não modificada quando a expressão de uma proteína é aumentada na bactéria.

14. Bactéria de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o L-aminoácido é L-cisteína.

15. DNA, caracterizado pelo fato de que codifica para uma proteína selecionada dentre o grupo consistindo de: (A) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, e (B) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, mas em que 1 a 10 resíduos de aminoácidos são substituídos, deletados, inseridos ou adicionados, e a proteína tem uma atividade de melhorar uma capacidade de produzir L-cisteína em uma bactéria pertencendo à família Enterobaeteriaceae como comparado com uma bactéria não modificada quando a expressão de uma proteína é aumentada na bactéria, em que a proteína tem uma mutação selecionada dentre o grupo consistindo de: (I) uma mutação para substituição de um resíduo de aminoácido diferente de resíduo de treonina pelo resíduo de treonina em posição 28, (II) uma mutação para substituição de um resíduo de aminoácido diferente de resíduo de fenilalanina pelo resíduo de fenilalanina em posição 137, e (III) uma mutação para substituição de um resíduo de aminoácido diferente de resíduo de leucina pelo resíduo de leucina em posição 188.