BRPI0921438B1 - processos de fermentação para produção de mistura de celulase - Google Patents

Description

(54) Título: PROCESSOS DE FERMENTAÇÃO PARA PRODUÇÃO DE MISTURA DE CELULASE (73) Titular: IOGEN ENERGY CORPORATION, Sociedade Canadense. Endereço: 310 Hunt Club Road East, Ottawa ONT K1V 1C1, CANADÁ(CA) (72) Inventor: LORETA GUDYNAITE-SAVITCH; CHRISTOPHER D. HINDLE; THERESA C. WHITE.

Código de Controle: C9AEC4CECC1BB816 BFA1B8442BCCBD04

Prazo de Validade: 20 (vinte) anos contados a partir de 03/11/2009, observadas as condições legais

Expedida em: 27/11/2018

Assinado digitalmente por:

Alexandre Gomes Ciancio

Diretor Substituto de Patentes, Programas de Computador e Topografias de Circuitos Integrados

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Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PROCESSOS DE FERMENTAÇÃO PARA PRODUÇÃO DE MISTURA DE CELULASE. CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um processo de fermentação para a produção de uma mistura de celulase. Mais especificamente, a presente invenção se refere a um processo de fermentação compreendendo o uso de fungos filamentosos hospedeiros geneticamente modificados para a produção de uma mistura de celulase.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As paredes das células das plantas consistem principalmente de grandes biopolímeros de celulose, hemicelulose, lignina e pectina. A celulose e a hemicelulose constituem uma fonte de carbono renovável e barata importante para a produção de açúcar fermentável. A celulose consiste de unidades de D-glicose ligadas em conjunto em cadeias lineares via ligações glicosídicas beta-1,4. A hemicelulose consiste principalmente de uma cadeia principal de xilano linear compreendendo unidades de D-xilose ligadas em conjunto via a ligações glicosídicas beta-1,4 e numerosas cadeias laterais ligadas às unidades de xilose via ligações glicosídicas ou ligações éster beta-1,2 ou beta-1,3 (por exemplo, L-arabinose, ácido acético, ácido ferúlico, etc.).

Os fungos filamentosos do filo (divisão) Ascomycota, incluindo vários Penicillium, Phanerochaete, Agaricus, Neurospora, Humicola, Fusarium, Chaetomium, Magnaporthe, as espécies de Aspergillus e Tríchoderma, têm um papel-chave na degradação dos polímeros mais abundantes encontrados na natureza, celulose e hemicelulose. Tríchoderma reesei (o anamorfo assexual Hypocrea jecorínd) é uma fonte industrial importante de enzimas de hemicelulase e celulase. O termo celulase (ou enzimas de celulase) se refere amplamente a enzimas que catalisam a hidrólise das ligações beta1,4-glicosídicas que juntam unidades de glicose individuais no polímero de celulose. O mecanismo catalítico envolve as ações sinergísticas de endoglicanases (E.C. 3.2.1.4), celobioidrolases (E.C. 3.2.1.91) e beta-glicosidase

2/66 (E.C. 3.2.1.21). O termo hemicelulase se refere amplamente a enzimas que catalisam a hidrólise de várias ligações glicosídicas que individualmente unem xilose, arabinose, manose, galactose e outras partes no polímero de hemicelulose. As hemicelulases incluem, por exemplo, endo-1,4-beta5 xilanases (CE 3.2.1.8), beta-mananases (CE 3.2.1.28), alfaarabinofuranosidases (CE 3.2.1.55), 1,4-beta-xilosidase (CE 3.2.1.27) e alfaglucuronidase (CE 3.2.1.139).

O Tríchoderma reesei é uma espécie industrial comumente usada de fungos filamentosos para a produção de enzimas degradantes de bi10 omassa, tais como as celulases e hemicelulases. A análise do secretoma da cepa do T. reesei RutC30 revelou a presença de 31 glicosil hidrolases secretadas quando cultivada no meio complementado com palha de milho prétratada (Nagendran et al., 2009).Os estudos do secretoma de F. graminearum cultivado na parede de célula de lúpulo identificaram que pelo menos 45 % das proteínas secretadas estão envolvidas na degradação da parede celular da planta, com 25, 19 e 11 proteínas diferentes para a hemicelulose, pectina e degradação de celulose, respectivamente (Phalip et al., 2005).

O sequenciamento e a análise do genoma do T. reesei revelaram a presença de 10 genes que codificam celulase e 16 genes que codifi20 cam hemicelulases (Martinez et al., 2008). Eles incluem duas celobioidrolases, oito endoglicanases, quatro xilanases, duas alfa-Larabinofuranosidases, e uma beta-mananase. O T. reesei também produz diversas enzimas acessórias que assistem na geração de monossacarídios da celulose e hemicelulose, incluindo acetil xilano esterase, beta-xilosidase e várias beta-glicosidases (de Vries e Visser, 2001; Aro et al., 2005, e referências no mesmo). Contudo, comparando com os genomas de outros fungos filamentosos, o genoma do T. reesei tem surpreendentemente poucos genes que codificam hidrolases de glicosídeo (200 no total) (Martinez et al., 2008). Por exemplo, Aspergillus oryzae, Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans e Fusaríum graminearum codificam 285, 263, 247 e 243 glicosilidrolases,

I respectivamente (Martinez et al., 2008). j

A produção de enzimas degradantes das paredes celulares das |

3/66 plantas, tais como as celulases, hemicelulases, ligninases e pectinases, por fungos filamentosos é regulada principalmente ao nível transcricional em resposta a fontes de carbono disponíveis. A glicose reprime a expressão de genes da celulase através da ação de reguladores transcricionais, tais como cre1 (Strauss et ai., 1995,). Sob condições limitantes da glicose, a transcrição de celulase é des-reprimida, com a ativação completa da transcrição que necessita da presença de um carboidrato indutor de celulase, ou indutor, tal como celulose, ou dissacarídios ligados por ligação beta, tais como celobiose, soforose, genciobiose e lactose (llmen et al., 1997), enquanto a ativa10 ção da transcrição de hemicelulase é dependente da presença do xilano ou dos seus derivados (xilose, xilobiose, arabinose) no meio de crescimento (Margolles-Clark et al., 1997).

O regulador transcricional XlnR (regulador de xilanase), inicialmente identificado no Aspergillus niger, controla a transcrição de aproxima15 damente 20-30 genes que codificam hemicelulases e celulases (Strieker et al, 2008 e referências no mesmo). Além disso, a degradação de xilano extracelular e o metabolismo de D-xilose intracelular são ligados via a regulação transcricional do gene xyrA (codificando a redutase da D-xilose) por XlnR (Hasper et al, 2000). Os fatores de transcrição ortólogos em T. reesei, 20 Xyr1 (regulador de xilanase 1) e Aspergillus oryzae (Ao XlnR) são também uns reguladores gerais da expressão de genes de celulase e de hemicelulase (Striker et al, 2006; Marui et al, 2002). Os estudos de vários outros reguladores identificados da expressão de xilanase em fungos são limitados à regulação de genes de hemicelulase (Tamayo et al, 2008; Rao et al, 2002; 25 Calero-Nieto et al, 2007). Por exemplo, mostrou-se que a eliminação de um fator de transcrição ortólogo ao Xyr1 de Fusaríum graminearum não afetou os níveis de expressão básicos de xilanases e celulases mas realmente evitou a alta expressão induzível (Brunner et al, 2007). Este achado está na contradição aos estudos com Trichoderma e Aspergillus, onde a supressão 30 do regulador correspondente anula a expressão de celulase e de xilanase completamente. Esta observação levou a um sistema para a produção de proteínas homólogas e/ou heterólogas usando o promotor regulado do XlnR

AIQQ junto com a sobreexpressão do regulador de xilanase, XlnR, a partir de múltiplas cópias de gene (Patente dos Estados Unidos N° 6177261 B1, 2001).

Os reguladores de xilanase, tais como Xyr1 do Trichoderma e

XlnR do Aspergillus, pertencem à família de proteínas do grupo binuclear de zinco classe III encontrada exclusivamente em fungos e possuem um motivo de aminoácido conservado (CX2CX6CX5.12CX2CX6-8C) na parte da termina’ ção N da proteína (MacPherson et al., 2006). Esta classe de fatores de transcrição é única em conter só um dedo de zinco que liga dois átomos de zinco. Os reguladores de xilanase ligam elementos de resposta 5'10 GGC(T/A)₃-3' nos promotores dos genes de destino, e podem interagir com

DNA como monômeros, homodímeros ou heterodímeros (MacPherson et al., 2006; Strieker et al., 2008). Vários estudos mostraram que o Xyr1 do T. reesei é essencial para a expressão de todos os genes principais da (hemi) celulase (Strieker et al., 2006) e que ele liga a 1, 2 e 3 promotores de gene da 15 xilanase (Rauscher et al, 2006; Strieker et al, 2007; Furukawa et al, 2009).

Contudo, a ligação in vitro do Xyr1 do T. reesei a promotores de gene da celulase só foi recentemente demonstrado (Furukawa et al, 2009; Ling et al., 2009). A análise de in silico revelou que os motivos 5'-GGC(T/A)₃-3' são espalhados como sítios únicos na região 5'- à montante região de todo o Xyr120 genes regulados em T. reesei (Furukawa et al, 2009). Contudo os estudos de in vitro do Xyr1 ligando a motivos selecionados revelou que somente uma grande quantidade deles podem ser reconhecidos por este fator de transcrição (Furukawa et al, 2009).

Outros domínios funcionais foram identificados para o XlnR do 25 A. niger pela mutações da perda de função e da análises de projetos racionais de mutagênese (Hasper et al., 2004). Estes estudos demonstraram que 0 segundo domínio coiled-coil putativo está envolvido na localização nuclear da proteína. As predições de estrutura da proteína sugerem a presença de dois domínios coiled-coil em posições semelhantes no Xyr1 do A. niger e no 30 XlnR do T. reesei. Assim, o segundo domínio coiled-coil no Xyr1 do T. reesei pode ser do mesmo modo responsável pelo seu transporte no núcleo. O C terminal do XlnR é essencial para a regulação transcricional; a eliminação de

5/66 aminoácidos da terminação C causa a expressão aumentada de genes de objetivo do XlnR, até sob condições de repressão de glicose, sugerindo que esta região amortece a ativação transcricional por XlnR (Hasper et al., 2004). Contudo, certas mutações de aminoácido único nesta região, tais como Tyr864Phe, Leu823Ser e Tyr864Asp levam à ativação severamente diminuída por XlnR (Hasper et al., 2004).

Embora o XlnR do A. niger e o Xyr1 do T. reesei compartilhem similaridades na estrutura e em sítios de ligação de consenso, há evidências para sugerir que estes fatores interagem com promotores via mecanismos diferentes. Por exemplo, foi sugerido que o XlnR do A. niger se ligue como um monômero (Hasper et al., 2004), enquanto o Xyr1 do T. reesei se liga a uma repetição inversa dentro de um promotor de gene regulado, como um homodímero ou um heterodímero com Ace2, um regulador positivo conhecido da expressão de celulase em T. reesei (Strieker et al., 2006, 2008). Também é suposto que a regulação de hemicelulase e expressão de genes da celulase no T. reesei pelo Xyr1 e Ace2 possa envolver a fosforilação e o recrutamento de outras proteínas reguladoras (Strieker et al., 2008). O Xyr1 do T. reesei também tem uma relação antagônica com o ace1, um regulador negativo de genes da celulase, através de uma competição possível dos dois fatores do mesmo sítio de ligação dentro de promotores de celulase (Strieker et al, 2006). Os genes codificando o ace1 Putativo foram isolados de várias diferentes espécies fúngicas, tais como Aspergillus nidulans, Talaromyces emersonii, e Neurospora crassa (Aro et al, 2005); contudo, a sua interação possível com XlnR e a sua participação na ativação transcricional de genes que codificam a hidrolase ainda não foram mostradas (Strieker et | al., 2006).í í

O T. reesei produz níveis baixos da atividade de xilanase sobj

I condições que induzem a celulase; contudo, o sistema de enzima produzidoi i por culturas do T. reesei que cresce em xilano, xilose ou arabinose, é enri-{ quecido em atividades de hemicelulase em relação às atividades da celulase

I (Mach e Zeilinger 2003; Margolles-Clark et al., 1997; Xiong et al., 2004). Istoj pode ser benéfico quando a meta é produzir uma composição de enzimasg

6/66 possuindo alta atividade xilanolítica em relação atividade de celulase, como na indústria de forragem e papel e polpa. As Patentes dos Estados Unidos N°. 6.300.112 e 5.298.405 divulgam o uso de cepas para eliminação da celulase como uma aproximação alternativa para a produção de preparações de enzima enriquecidas de hemicelulase para uso em forragem e para aplicações de biobranqueamento

Há situações nas quais é desejável produzir misturas de celulase com uma alta atividade específica de celulase a partir de culturas fúngicas usando fontes de carboidrato compreendendo principalmente xilose e outro açúcar de pentose derivado da hemicelulose, tal como aqueles produzidos por tratamentos químicos da biomassa de lignocelulósicos. Estes podem conter hemicelulose derivada de carboidrato (HDC) ou carboidrato indutor de celulase (CIC). Contudo, tais fontes de carbono resultam em composições de enzima contendo alta atividade de hemicelulase com reduzida ativi15 dade específica para celulase e, por conseguinte, dosagens mais altas de proteína total são necessárias para a hidrólise eficaz da celulose. Também, a produção e a secreção de enzimas de hemicelulase usam recursos de vias enérgicas e vias de secreção da célula e limitam a expressão de celulase e a capacidade de secreção da célula hospedeira.

Foi relatado que uma combinação de carboidratos derivados do xilano com indutores de celulase, tais como celobiose ou lactose pode levar a proporções diferentes de celulase e hemicelulase na mistura de proteína secretada por Tríchoderma reesei (Zeilinger, S., et al., 1996,). Além disso, considerou-se que as concentrações do indutor de 8 a 15 % podem melhorar a !

produção de proteína na hemicelulose derivada de carboidrato (HDC) quase| até os níveis produzidos quando os carboidratos de indução de celulase sãoí ü I usados como a fonte de carbono. (Ver a Pedido co-Pendente dos Estados|

Unidos 12/200,492). Contudo, devido ao alto custo de carboidratos de indu-| ção, o uso de tais misturas em grande escala pode aumentar significativa-ίξ mente custos de produção da enzima. Além disso, uma proporção significa- tiva de tal mistura de enzimas ainda será composta de hemicelulases. Con-j sequentemente, devido ao alto teor de hemicelulases, e a exigência de a1 i

7/66 crescentar carboidratos de indução de celulase, a produção da celulase na hemicelulase derivada de carboidratos não possui uma relação muito boa de custo-benefício.

Assim, há uma necessidade na técnica de um método rentável para produzir uma mistura de celulase contendo os baixos níveis de atividade da hemicelulase de fungos filamentosos usando principalmente o carboidrato derivado de hemicelulose (HDC) na ausência dos carboidratos de indução de celulase, tais como a celulose, ou dissacarídeos com ligação β, tais como celobiose, soforose, genciobiose e lactose, ou contêm níveis baixos de tais carboidratos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a um processo de fermentação para a produção de misturas de celulase com uma alta proporção de componentes de celulase usando fungos filamentosos geneticamente modificados providos de uma fonte de carbono compreendendo carboidratos derivados da hemicelulose (HDC) a ausência de, ou contendo baixos níveis de, carboidratos de indução de celulase (CIC) tradicionais. Processo e as modificações genéticas descritos aqui podem ser usados para o desenvolvimento de cepas de fungos que produzem altos rendimentos de enzimas de celulase de alta qualidade onde a expressão de celulase não é dependente da presença ou da ausência de um carboidrato que induzem celulase.

O fungo filamentoso hospedeiro é geneticamente modificado para sobreexpressar um fator de transcrição Xyr1 ou um fator de transcrição equivalente ao Xyr1. Esta modificação genética resulta na produção de uma mistura de celulase enriquecida na atividade da celulase quando o fungo filamentoso hospedeiro é fornecido com uma fonte de carbono contendo carboidrato derivado da hemicelulose e níveis baixos de um carboidrato de indução de celulase.

A presente invenção fornece um processo de fermentação para a produção de uma mistura de celulase compreendendo: a) o fornecimento de um fungo filamentoso hospedeiro geneticamente modificado sobreexpressando um fator de transcrição Xyr1 ou um fator de transcrição equiva-

8/66 lente ao Xyr1 e b) o cultivo de um fungo filamentoso hospedeiro da etapa a) em um meio compreendendo uma fonte de carbono contendo de aproximadamente 60 % em peso a aproximadamente 100 % em peso de um carboidrato derivado da hemicelulose e de aproximadamente 0 % em peso a aproximadamente 3 % em peso de um carboidrato que induz a celulase ou em um meio compreendendo uma fonte de carbono contendo de aproximadamente 25 % em peso a aproximadamente 100 % em peso de um álcool de açúcar derivado da hemicelulose, de aproximadamente 0 % de carboidrato que induz a celulase e de aproximadamente 0 % em peso a 75 % em peso de glicose, glicerol ou uma combinação dos mesmos para produzir a mistura de celulase. A mistura de celulase assim produzida compreende a forma de aproximadamente 40 % a aproximadamente 100 % de componentes de celulase e tem pelo menos um aumento de 1,7 vezes na atividade da celulase em relação a uma mistura de celulase produzida por um fungo filamentoso parental que não sobreexpressa um fator de transcrição Xyr1 quando cultivado no mesmo meio.

O fator de transcrição Xyr1 que é sobreexpressado no fungo filamentoso hospedeiro usado no processo de fermentação da presente invenção é uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 27, uma proteína com uma sequência de aminoácidos exibindo de aproximadamente 90 % a aproximadamente 100 % de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 27. O fator de transcrição equivalente do Xyr1, uma proteína com uma sequência de aminoácidos que exibe de aproximadamente 45 % a aproximadamente 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 27, uma proteína com uma sequência de aminoácidos que exibe de aproximadamente 90 % a aproximadamente 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos das SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 28, SEQ ID N°: 29, SEQ ID N°: 30, SEQ ID N°: 31, SEQ ID N°: 32, SEQ ID N°: 33, SEQ ID N°: 34, ou SEQ ID N°: 35 ou uma proteína contendo um grupo binuclear de zinco que possui a atividade de ligação do DNA equivalente específica para uma sequência de consenso com motivo semelhante a GGC(T/A)₃ dentro das sequências promotoras de celulase

9/66 e/ou de hemicelulase como a proteína com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 27.

O fungo filamentoso hospedeiro usado no processo de fermentação da presente invenção pode ser uma espécie do fungo celulolítico que pertence ao subfilo Pezizomycotina. Por exemplo, o fungo filamentoso hospedeiro pode ser uma espécie de Trichoderma, Hypocrea, Aspergillus, Fusarium, Penicillium, ou Neurospora. Preferivelmente, o fungo filamentoso hospedeiro é o Trichoderma reesei ou o Hypocrea jecorina.

Em uma primeira modalidade do processo de fermentação do presente invenção, o hospedeiro filamentoso compreende um construto genético Xyr1 no qual uma sequência de ácido nucleico que codifica um fator de transcrição Xyr1 ou um fator de transcrição equivalente ao Xyr1 é operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucleico promotor. O fungo filamentoso hospedeiro pode ser produzido por transformação com o construto genético Xyr1 e selecionando o transformante contendo o construto genético.

A sequência de ácido nucleico promotor pode ser nativa ou heteróloga em relação da sequência de ácido nucleico que codifica o fator de transcrição de Xyr1. A sequência de ácido nucleico promotor pode ser derivada de um gene cuja expressão é induzida durante o crescimento do fungo filamentoso hospedeiro em uma fonte de carbono compreendendo o carboidrato derivado de hemicelulose. Por exemplo, se o fungo filamentoso hospedeiro é T. reesei, a sequência de ácido nucleico promotor pode ser derivada de uma ou mais genes do T. reesei que codificam beta-xilosidase 1, betaxilosidase 2, xilanase 1, xilanase 2, xilanase 3, ou qualquer combinação dos mesmos. A sequência de ácido nucleico promotor também pode ser uma combinação de sequências de ácido nucleico derivadas de dois ou mais promotores. Alternativamente, a sequência de ácido nucleico promotor pode ser derivada de um gene cuja expressão é constitutiva durante o crescimento do fungo filamentoso hospedeiro e cujos níveis de expressão são independentes da fonte de carbono usada para o processo de fermentação.

Em uma segunda modalidade do processo de fermentação de

10/66 acordo com a presente invenção, o fungo filamentoso hospedeiro modificado é modificado também para ser parcialmente ou completamente deficiente na expressão de uma ou mais enzimas de hemicelulase incluindo, mas não limitado a, xilanases, beta-xilosidases, alfa-arabinofuranosidases, betamanases, alfa-glucuronidases, acetil xilano estearase ou qualquer combinação dos mesmos. Por exemplo, o fungo filamentoso hospedeiro modificado pode ser deficiente na expressão de uma ou mais xilanases, uma ou mais beta-xilosidases, uma ou mais alfa-arabinofuranosidases, ou qualquer combinação dos mesmos. Se o fungo filamentoso hospedeiro modificado é uma cepa do T. reesei ou H. jecorina, o hospedeiro pode ser modificado para ser parcialmente ou completamente deficiente na expressão de xilanase 1, xilanase 2, beta-xilosidase 1, beta-xilosidase 2, alfa-arabinofuranosidase 1, alfaarabinofuranosidase 2, ou qualquer combinação dos mesmos.

A fonte de carbono fornecida ao fungo filamentoso hospedeiro durante o processo de fermentação da presente invenção pode compreender outras fontes de carbono além do carboidrato derivado da hemicelulose. Por exemplo, a fonte de carbono pode compreender o glicerol ou outro açúcar derivado de álcoois, tal como xilitol ou arabitol ou um ácido orgânico, tal como ácido acético ou ácido glucurônico.

O processo de fermentação da presente invenção pode exibir o aumento de pelo menos aproximadamente 2 vezes na produtividade específica (q_p) quando em comparação com o q_p de um processo no qual o fungo filamentoso hospedeiro não sobreexpressa o Xyr1

O processo de fermentação da presente invenção pode ser conduzido em uma temperatura de aproximadamente 20°C a aproximadamente 35°C e em um pH de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 6,5 e pode ser executado como uma batelada, batelada alimentada, ou processo contínuo. Qualquer um desses modos pode ser operado aerobicamente, na presença de oxigênio, ou anaerobicamente, a ausência de oxigênio.

A presente invenção é baseada em parte na observação de que as misturas de celulase com uma alta proporção de componentes de celulase podem ser produzidas por um fungo filamentoso hospedeiro sobreex11/66 pressando um fator de transcrição Xyr1 em um processo de fermentação no qual a fonte de carbono compreende carboidratos derivados da hemicelulose (HDC) ou açúcar de álcoois derivados da hemicelulose (HDSA) na ausência, ou contendo níveis baixos, de carboidratos que induzem a celulase. A produtividade do processo de fermentação é significativamente mais alta do que o mesmo processo usando um fungo filamentoso hospedeiro que não sobreexpressa um fator de transcrição Xyr1 e/ou possui níveis de produção de hemicelulases do tipo selvagem.

O processo de fermentação da presente invenção produz uma mistura de celulase que tem o aumento de pelo menos aproximadamente 1,7 vezes na atividade da celulase em relação à atividade da celulase de uma mistura de celulase produzida por um fungo filamentoso parental que não sobreexpressa o Xyr1. Os componentes de celulase compreendem de aproximadamente 40 % em peso a aproximadamente 100 % em peso da proteína total presente na mistura de celulase produzida pelo processo de fermentação de acordo com a presente invenção. A mistura de celulase assim produzida pode ser usada na hidrólise de um substrato de celulose para produzir a glicose. Por exemplo, a mistura de celulase pode ser usada para hidrolisar a celulose contida em uma matéria-prima de material lignocelulósico pré-tratado.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

FIGURA 1:

A - vetor de transformação de Trichoderma reesei usado para a eliminação da endoglicanase 2 (Cel5a) e geração da cepa P285-6. B - hibridização tipo Southern usando a codificação da sequência Cel5a como uma sonda para confirmar a eliminação de Cel5a nos transformantes P285-6 e P285-4. O painel superior mostra o esquema do sítio nativo do Cel5a e o gene Cel5a interrompido após a integração objetivada do vetor de transformação. Os sítios de restrição da enzima usada para digerir o DNA genômico são indicados no fundo. A posição da sonda usada para a hibridização tipo Southern é indicada no topo. O painel mais baixo mostra a hibridização tipo Southern e o nome da cepa ou o plasmídio é indicado no topo e os tama12/66 nhos dos fragmentos são indicados à esquerda.

FIGURA 2:

A - vetor de transformação de Tríchoderma reesei usado para a eliminação da xilanase 2 e geração da cepa P491P. B - produção de xilanase 2 em cepas parentais e transformantes cultivadas em microculturas em xilose como uma fonte de carbono. As alíquotas (10 pg) da proteína secretada total produzida por cepas parentais (M2C38 e M2C38aux5) e transformantes (P43W, P491N, P491P, p509A-G) foram separadas em SDS-PAGE, transferida para a membrana PVDF e submetidas a imunoblot com anticorpos crescidos contra a xilanase 2 do T. reesei. Xyn2 purificado (faixa 1) foi usado como um controle. A banda de proteína que corresponde a Xyn 2 é indicada com uma seta. O peso dos marcadores de peso molecular de proteína é indicado em kD à esquerda.

FIGURA 3:

Níveis de transcrição relativos dos genes cel7a (barras listadas), xyr1 (barras pretas) e ace1 (barras cinzentas). As amostras de biomassa para o isolamento total do RNA foram coletadas em 42 h de tempo de fermentação da cepa P59G do T. reesei quando cultivado em 100 % de arabinose, 98 % de xilose + 2% de celobiose, ou 65% de glicose + 35% de coquetel que induz a celulase (CIC) como a fonte de carbono. Os níveis de transcrição relativos foram avaliados por qRT-PCR em tempo real e normalizados aos níveis de transcrição do gene Ntf2.

FIGURA 4:

A - vetores de transformações de usados para gerar transformantes de T. reesei sobreexpressando o xyr1. B - amplificação de PCR de fragmento de gene xyr1 quimérico de DNA genômico isolado de cepas de hospedeiro filamentoso fúngico modificadas contendo cassetes de expressão de Pbxl:xyr1 e as suas cepas fúngicas filamentosas parentais. Os mapas do cassete de expressão de Xyr1 são mostrados no fundo de cada painel. Os iniciadores usados para a amplificação de PCR são indicados por setas. A fita de DNA foi carregada na faixa 1 e o tamanho de cada marcador

13/66 é indicado à esquerda. Os produtos de PCR foram amplificados dos seguintes padrões: DNA genômico isolado de P285-6aux parental (faixa 2) e cepas de hospedeiro filamentoso fúngico modificadas P692A (faixa 3), P692B (faixa 4), 693A (faixa 5), 693B (faixa 6), água como um controle negativo (faixa 7) e vetor pPbxl:xyr1 -pyr4 como um controle positivo (faixa 8).

FIGURA 5:

A - Os níveis de expressão relativos dos genes xyr1, cel7a, ce!7b, xyn1, xyn2, bxl1 em fungos filamentosos parentais (7. reesei P285-6) e fungo filamentoso hospedeiro modificado sobreexpressando xyr1 (cepa P692 do T. reesei). B - Os níveis de expressão relativos de xyr1 e cel7a em fungos filamentosos parentais (cepa RutC30 do T. reesei) e fungos filamentosos hospedeiros modificados sobreexpressando xyr1 (cepa RutC30-R3 do T. reesei) após 48 e 72 horas de indução de expressão de celulase. As amostras de biomassa para o isolamento total do RNA foram preparadas como descrito no Exemplo 5.2. Os níveis de transcrição relativos foram avaliados por qRT-PCR em tempo real e normalizados aos níveis de transcrição do gene Ntf2. Os números das corridas de fermentação são indicados em cima das barras.

FIGURA 6:

Acumulação de proteína (linhas sólidas) e biomassa (linhas salpicadas), expressada em g/L, nas fermentações de hospedeiro filamentoso fúngico modificado sobreexpressando Xyr1 (T. reesei P692B) (A) e fungos filamentosos parentais (cepa P285-6 do T. reesei) (B) cepas cultivadas em 100 % de xilose como uma fonte de carbono em pH 3,5.

FIGURA 7:

Acumulação de proteína (linhas sólidas) e biomassa (linhas salpicadas), expressada em g/L, nas fermentações de hospedeiro filamentoso fúngico modificado sobreexpressando Xyr1 (T. reesei RutC30-R3) (A) e fungos filamentosos parentais (cepa RutC30 do T. reesei) (B) cepas cultivadas em 100 % de xilose como uma fonte de carbono em pH 3,5.

FIGURA 8:

Acumulação de proteína (linhas sólidas) e biomassa (linhas sal-

14/66 picadas), expressada em g/L, em fermentações de cepas do T. reesei P1194E (A), P1197B (B), P491P (C) e M2C38 (D) cultivadas em 100 % de xilose como uma fonte de carbono em pH 3,5.

FIGURA 9:

(A) mostra a atividade de hidrólise de celulose relativa das misturas de celulase secretadas pela cepa fúngica filamentosa parental P285-6 e hospedeiro filamentoso fúngico modificado cepas P692B (xyr1+) e P692A (xyr7+). As misturas de celulase são agrupadas baseadas na fonte de carbono usada para a fermentação de cada uma destas cepas. Os números de referência das fermentações são mostrados ao longo do topo do gráfico. (B) mostra a abundância relativa (em % em peso da proteína secretada total) de celulase individual e componentes da xilanase Cel7A, Cel6A, Cel7B, Xyn1 e Xyn2 nas misturas de celulase produzidas por fungos filamentosos hospedeiro parental (cepa P285-6) e modificado (cepas P692B e P692A) cultivados em 100% de xilose, 100% de arabinose, 25 % de xilose/50 % de glicose/25 % de glicerol ou 25 % de xilitol/50 % de glicose/25 % de glicerol. FIGURA 10:

(A) mostra a atividade de hidrólise de celulose relativa das misturas de celulase secretadas por cepa fúngica filamentosa parental RutC30 e e cepas de hospedeiro filamentoso fúngico modificadas RutC30-R3 (xyr1+). As misturas de celulase são agrupadas baseadas na fonte de carbono usada para a fermentação de cada uma destas cepas. Os números de referência das fermentações são mostrados ao longo do topo do gráfico. (B) mostra a abundância relativa (como % em peso da proteína secretada total) de celulase individual e componentes de xilanase Cel7A, Cel6A, Cel7B, Celõa, Xyn1 e Xyn2 nas misturas de celulase produzidas por fungos filamentosos modificados parental (RutC30) e hospedeiro (RutC30-R3) cultivados em 100 % de xilose ou 25 % de xilitol/50 % de glicose/25 % de glicerol.

FIGURA 11:

Mostra a atividade de hidrólise de celulose relativa das misturas de celulase secretadas pela cepa de fungos filamentosos parentais RutC30, M2C38 e P491P e os fungos filamentosos hospedeiros modificados corados

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RutC30-R3, P1194E, P1194F e P1197B (xyr1) quando cultivado em uma fonte de carbono compreendendo 100% de xilose ou 35% de CIC + 65% de glicose. Os números de referência das fermentações são mostrados ao longo do topo do gráfico.

FIGURA 12:

(A) mostra a correlação entre a atividade de hidrólise de celulose relativa contra a proporção relativa de componentes de celulase (Cel7A+Cel6A+Cel7B) das misturas de celulase produzidas por P285-6, P692B (xyr1+) e P692A (xyr1+) em fermentações usando 100% de xilose, 100% de arabinose, 25 % em peso de xilose/50 % em peso de glicose/25% de glicerol ou 25% de xilitol/50% de glicose/25% de glicerol como a fonte de carbono. A linha salpicada é uma análise da regressão linear de toda a atividade relativa contra a percentagem de componente de celulase de P285-6, P692B, e misturas de celulase P692A. O valor do r-quadrado derivado da regressão linear foi 0,75. (B) mostra a correlação entre a atividade de hidrólise de celulose relativa e contra a proporção relativa de componentes de celulase (Cel7A + Cel6A + Cel7B + Cel5 A) em misturas de celulase produzidas de RutC30 e RutC30-R3 (xyr1+). A linha salpicada é uma análise da regressão linear de toda a atividade relativa contra a percentagem de componentes de celulase para RutC30 e misturas de celulase RutC30-R3. FIGURA 13:

Alinhamento da sequência de aminoácidos de Xyr1 do T. reesei da SEQ ID N°: 27 com o Xyr1 fatores de transcrição equivalentes de Aspergillus niger (identidade 46.65 %, SEQ ID 25), Aspergillus nidulans (identidade 46,24 %, SEQ ID 28), Aspergillus kawachii (identidade 47,06 %, SEQ ID 29), Aspergillus oryzae (identidade 46,55 %, SEQ ID 30), Aspergillus terreus (identidade 42,83 %, SEQ ID 31), Fusarium oxysporum (identidade, 59,30 %, SEQ ID 32), Neurospora crassa (identidade 58,65 %, SEQ ID 33), Penicillum canescens (identidade 50,91 %, SEQ ID 34), e Pyrenophora triticirepentis (identidade 42,11 %, SEQ ID 35). Os aminoácidos dentro de caixas são aqueles que são altamente conservados nas sequências.

FIGURA 14:

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Mostra a identidade % de sequência de aminoácidos da região que corresponde aos aminoácidos 343-940 do Xyr1 do Tríchoderma reesei com a região correspondente entre os pares dos fatores de transcrição equivalentes ao Xyr1 dos Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus kawachii, Neurospora crassa, Penicillum canescens, Fusarium oxysporum, Pyrenophora triticirepentis e Trichoderma reesei. 343-940 aminoácidos do xyr1 do T. reesei. A identidade foi calculada usando programa DNAman com a multa por fenda = 3 e K-tuplo = 2.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a um processo de fermentação para produzir celulases de um fungo filamentoso hospedeiro modificado.

A seguinte descrição é de uma modalidade preferida como forma somente de exemplo e sem restrição à combinação de características necessárias para tornar a invenção factível.

Fungos Filamentosos Hospedeiros Modificados

O fungo filamentoso hospedeiro usado no processo de fermentação da presente invenção é modificado para a expressão aumentada de um fator de transcrição Xyr1 ou um fator de transcrição equivalente ao Xyr1. Tal como aqui utilizado, um fator de transcrição de Xyr1 é uma proteína que pertence à família do grupo binuclear de zinco dos fatores de transcrição de fungo e possuindo uma sequência de aminoácidos de aproximadamente 90 % a aproximadamente 100 % de identidade da SEQ ID N°: 27 ou demonstra atividade de ligação do DNA equivalente ao do Xyr1 do T. reesei. Por exemplo, a proteína pode ter identidade de sequência de 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 % da SEQ ID N°: 27, ou qualquer valor entre os mesmos.

Tal como aqui utilizado, um fator de transcrição equivalente ao Xyr1 é uma proteína que pertence à família do grupo binuclear de zinco dos fatores de transcrição de fungo e possuindo uma sequência de aminoácidos que exibe identidade de aproximadamente 45 % a aproximadamente 99 % da sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 27, uma proteína com uma se17/66 quência de aminoácidos que exibe identidade de aproximadamente 90 % a aproximadamente 99 % da sequência de aminoácidos do qualquer uma das SEQ ID N°: 25, SEQ ID N°: 28, SEQ ID N°: 29, SEQ ID N°: 30, SEQ ID N°: 31, SEQ ID N°: 32, SEQ ID N°: 33, SEQ ID N°: 34, ou SEQ ID N°: 35 ou uma proteína contendo um grupo binuclear de zinco que possui a atividade de ligação do DNA equivalente específica para uma sequência de consenso com motivo semelhante a GGC(T/A)₃ dentro das sequências promotoras de celulase e/ou de hemicelulase como a proteína com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 27.

Figura 13 mostra um alinhamento do fator de transcrição Xyr1 do T. reesei da SEQ ID N°: 27 com o Xyr1 fatores de transcrição equivalentes de outras espécies fúngicas. Todas destas enzimas exibem de aproximadamente 42 % identidade de sequência de aminoácidos a aproximadamente 59 % a SEQ ID N°: 27 (Tabela 1). Também, como mostrado na Figura 14, aminoácidos que correspondem a aminoácidos 343-940 do Trichoderma reesei Xyr1 nos fatores de transcrição equivalentes ao Xyr1 de outros fungos filamentosos celulolíticos do Suhphylum Pezizomycotina exibem identidade de aproximadamente 48 % a aproximadamente 66 % aos aminoácidos 343-940 do Xyr1 do T. reesei (SEQ ID N°: 27).

Tabela 1: Fatores de transcrição equivalentes ao Xyr1.

Organismo fonte	Sequência de identificação	Identidade para T. reesei Xyr1 (SEQ ID NO: 27)
Aspergillus niger	SEQ ID25	46,65%
Aspergillus nidulans	SEQ ID28	46,24%
Aspergillus kawachii	SEQ ID29	47,06%
Aspergillus oryzae	SEQ ID30	46,55%
Aspergillus terreus	SEQ ID31	42,83%
Fusarium oxysporum	SEQ ID 32	59,30%
Neurospora crassa	SEQ ID33	58,65%
Penicillum canescens	SEQ ID 34	50,91%
Pyrenophora triticirepentis	SEQ ID 35	42,11%

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Os métodos para alinhar sequências de aminoácidos e determinar a identidade de sequência entre sequências de aminoácidos são bem conhecidos e disponíveis para aqueles versados na técnica e incluem o BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, ver a URL: blast.ncbi.nlm.nihh.gov/Blast.cgi; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990) que é útil para alinhar duas sequências e o CLUSTALW (ver URL: ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html) para alinhamento de duas ou mais sequências. A identidade de sequência também pode ser determinada por alinhamento manual e inspeção visual.

Por atividade de ligação de DNA equivalente se deseja significar o DNA de ligação do Xyr1 ou fator de transcrição equivalente ao Xyr1 com motivo de consenso semelhante ao GGC(T/A)₃ mediado por um grupo binuclear de zinco Zn₂CyS₆ ou domínio de dedo de zinco. Este grupo é bem conservado em todos os membros a família de proteínas de grupo binuclear de zinco do fungo e consiste do motivo de aminoácido Cys Xaa(2) Cys Xaa(6) Cys Xaa(5-12) Cys Xaa(2), Cys Xaa(6-8), Cys. Além disso, a sequência de consenso de DNA reconhecida pelo grupo binuclear de zinco no Xyr1 ou fator de transcrição equivalente ao Xyr1 pode estar presente como uma repetição única, dupla ou tripla dentro do promotor de gene regulado. O Xyr1 ou o Xyr1 que o fator de transcrição equivalente pode ligar às sequências de promotor de gene descritas como um monômero ou como um complexo de proteína em formas homodiméricas ou heterodiméricas. Sem desejar estar preso pela teoria, o Xyr1 ou o fator de transcrição equivalente ao Xyr1 podem interagir com outros fatores transcricionais específicos para o gene e/ou gerais, tais como proteínas ace1 e Ace2 durante a ligação do DNA. A atividade de ligação do DNA de um Xyr1 ou fator de transcrição equivalente ao Xyr1 com motivo de consenso semelhante ao GGC(T/A)₃ que pode ser medida usando um ou mais métodos conhecidos de uma pessoa com habilidade na técnica que inclui o ensaio de deslocamento da mobilidade eletroforética (EMSA) ou o DNA footprinting. Tais métodos são descritos em Furukawa, et al. 2009.

Para os propósitos aqui descritos, expressão aumentada ou

19/66 sobreexpressão significa um aumento de pelo menos aproximadamente 50 % no nível de transcrição de um dado gene no fungo filamentoso hospedeiro modificado comparando com o nível de transcrição do mesmo gene no fungo filamentoso parental quando cultivado sob condições idênticas de composição do meio, temperatura, pH, densidade das célula e idade da cultura.

Para os propósitos aqui descritos, pelo termo fungo filamentoso parental, quando usado no contexto de determinar o nível de expressão do gene Xyr1, se deseja significar um fungo filamentoso que não foi geneticamente modificado para aumentar a expressão de um Xyr1 ou fator de transcrição equivalente ao Xyr1, mas que é de outra maneira idêntico ao fungo filamentoso hospedeiro modificado.

Expressão aumentada ou sobreexpressão do Xyr1 ou fator de transcrição equivalente ao Xyr1 pode ser atingido por métodos conhecidos daqueles versados na técnica, incluindo mutação clássica e seleção ou engenharia genética. Por exemplo, uma célula hospedeira pode ser geneticamente projetada para aumentar a expressão de um Xyr1 ou do fator de transcrição equivalente ao Xyr1 pela transformação da célula hospedeira com um construto genético Xyr1.

Tal como aqui utilizado, construto genético se refere a uma sequência de ácido nucleico isolada compreendendo os elementos de ácido nucleico necessários para a expressão de uma proteína e a seleção de células hospedeiras contendo o construto genético. Estes elementos incluem, mas não são limitados a, uma região de codificação compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um produto de proteína, e um promotor, compreendendo uma sequência de ácido nucleico que dirige a transcrição de uma região de codificação. Como entendido por um dos técnicos normalmente versados na técnica, estes elementos de ácido nucleico podem ser derivados da célula hospedeira ou de um organismo diferente, e/ou serem sintetizados in vitro. Estes elementos de sequência de ácido nucleico também podem ser alterados ou projetados por troca, substituição, adição, ou eliminação de um ou mais ácidos nucleicos. A prática desta invenção não é reprimida pela fonte de ou nenhuma tal alteração aos elementos de ácido

20/66 nucleico compreendendo o construto genético

Um construto genético Xyr1 se refere a uma sequência de ácido nucleico isolada compreendendo uma região de codificação para um fator Xyr1 ou de transcrição equivalente ao Xyr1 operacionalmente ligado a um promotor. Por exemplo, o promotor pode ser derivado de um gene que é altamente expressado quando a célula hospedeira é cultivada com uma fonte de carbono compreendendo HDC. Por exemplo, se o fungo filamentoso hospedeiro é T. reesei, a sequência de ácido nucleico promotor pode ser derivada de um ou mais genes do T. reesei que codificam beta-xilosidase (JGI Proteína ID 3264), beta-xilosidase 2 (JGI Proteína ID 105276), xilanase 1 (JGI Proteína ID 74223), xilanase 2 (JGI Proteína ID 23246) ou xilanase 3 (JGI Proteína ID 2034), ou qualquer combinação dos mesmos, que estão disponíveis em URL: genome.jgi-psf.org/cgi-bin/browserLoad?db-Trire2. Alternativamente, o promotor pode ser derivado de um gene que é constitutivamente expressado. Um exemplo de um promotor constitutivo em T. reesei é o que derivou da quinase de fosfoglicerato ipgk) o gene. Contudo, deve entender-se que a prática da presente invenção não é limitada pela escolha do promotor no construto genético Xyr1.

Tal como aqui utilizado em relação da sequência de ácido nucleico, os meios isolados alteraram-se do seu estado natural em virtude da separação da sequência de ácido nucleico de alguns ou todas das sequências de ácido nucleico ocorrem naturalmente com as quais ele se associa na natureza.

Tal como aqui utilizado, a respeito de elementos de sequência de ácido nucleico, derivado de se refere ao isolamento de um elemento de sequência de ácido nucleico objetivado usando uma ou mais técnicas de biologia molecular conhecidas a incluindo aqueles versados na técnica, mas não limitado a, clonagem, subclonagem, amplificação por PCR, síntese in vitro, e assim por diante. O termo derivado de se aplica tanto ao modificado como o natural (ou tipo selvagem) elementos de sequência de ácido nucleico. Em caso de elementos de sequência de ácido nucleico nativos, derivado de se refere ao isolamento de um elemento de sequência de ácido nucleico

21/66 objetivadosem a introdução de um ou mais inserções, eliminações, ou substituições aos elementos de sequência de ácido nucleico alvos como é encontrado na natureza outra do que aqueles que pode ser necessário acrescentar às extremidades 5' e 3' do elemento isolado para facilitar a clonagem. Em 5 caso de elementos de sequência de ácido nucleico modificados, derivado de também incluiría a introdução de uma ou mais inserções, eliminações ou substituições da sequência tipo selvagemou nativa.

Um construto genético pode conter um marcador selecionável para determinar a transformação de uma célula hospedeira. O marcador se10 lecionável pode estar presente no Xyr1 ou outro construto genético ou o marcador selecionável pode ser um ácido nucleico isolado separado que é co-transformado com o construto genético. As escolhas de marcadores selecionáveis são bem conhecidas àqueles versado na técnica e incluem genes (sintético ou natural) que conferem às células transformadas a capacidade 15 de utilizar um metabólito que não é normalmente metabolizado pelo micróbio (por exemplo, o A. nidulans amdS acetamidase de codificando de gene e conferição da capacidade de crescer na acetamida como a única fonte de nitrogênio) ou resistência antibiótica (por exemplo, o Escherichia coli hph fosfotransferase da beta da higromicina de codificando de gene e conferição 20 de resistência à higromicina). Se a cepa hospedeira necessita de um gene funcional para o marcador escolhido, então aquele gene pode ser usado como um marcador. Os exemplos de tais marcadores incluem trp, pyr4, pyrG, argB, leu, e assim por diante. A cepa hospedeira correspondente, por isso, teria de estar necessitando de um gene funcional que corresponde ao 25 marcador escolhido, isto é, faltando na expressão de trp, pyr, arg, leu e assim por diante.

Um construto genético pode conter um terminador transcricional que é funcional na célula hospedeira, como seria conhecido de alguém com habilidade na técnica. O terminador transcricional pode ser posicionado ime30 diatamente à jusante de uma região de codificação. A prática da invenção não é reprimida pela escolha do terminador transcricional que é suficiente para direcionar a terminação da transcrição por uma polimerase de RNA na

22/66 célula hospedeira.

A célula fúngica pode ser modificada com construtos genéticos adicionais para melhorar ou reduzir a expressão e a secreção de um ou mais proteínas homólogas ou heterólogas. Por exemplo, a célula fúngica pode ser modificada para expressar sobre uma enzima de beta-glicosidase de acordo com a Patente dos Estados Unidos N°. 6.015.703. A célula hospedeira também pode ser modificada para produzir uma mistura otimizada de componentes de celulase e componentes acessórios Publicação dos Estados Unidos co-pendente de acordo com Al 2008/0057541 dos Estados Unidos e o Pedido de Patente dos Estados Unidos N° 60/969.046. Por exemplo, a célula fúngica pode ser modificada com construtos um ou mais genéticos compreendendo um gene que codifica um operacionalmente de enzima de celulase ligado a um promotor regulado por um fator de transcrição de Xyr1, tais como um promotor de uma celulase ou gene de xilanase. A prática da presente invenção não é limitada por os construtos genéticos adicionais que dirigem a expressão e a secreção das proteínas um ou mais homólogas ou heterólogas foram introduzidos anteriormente a, simultaneamente com, ou posteriormente à modificação que resulta na sobreexpressão de um Xyr1 ou fator de transcrição equivalente ao Xyr1.

Tais construtos genéticos que codificam para a expressão e a secreção de uma proteína outra do que um Xyr1 ou fator de transcrição equivalente ao Xyr1, também compreendem uma sequência de sinal de secreção. Tal como aqui utilizado, uma sequência de sinal de secreção é uma sequência de ácido nucleico que codifica um presente de sequência de peptídeo na terminação de amina de uma proteína secretada que dirige a entrada da proteína no retículo endoplasmático (ER); o sinal de secreção pode ser posteriormente rachado da proteína secretada madura por um sinal de peptidase.

O fungo filamentoso hospedeiro modificado usado no processo de fermentação da presente invenção pode ser parcialmente ou completamente deficiente na produção de uma ou mais enzimas de hemicelulase, tais como xilanases, beta-xilosidases, arabinofuranosidases, mananases, alfa-

23/66 glucuronidases, esterases de acetilxilano, ou uma combinação dos mesmos. O fungo filamentoso hospedeiro modificado adicionalmente sobreexpressa um Xyr1 ou fator de transcrição equivalente ao Xyr1. Contudo, deve entender-se que o fungo filamentoso hospedeiro modificado pode ser feito parcialmente ou completamente deficiente na expressão de uma ou mais enzimas de hemicelulase antes de, simultâneo com, ou subsequente à modificação que resulta na sobreexpressão do Xyr1 ou fator de transcrição equivalente ao Xyr1.

Por parcialmente ou completamente deficiente na expressão uma ou mais enzimas de hemicelulase, se deseja significar que a mistura de celulase secretada pelo fungo filamentoso hospedeiro modificado exibe de aproximadamente 50 % a aproximadamente uma redução de 100 % na proporção relativa de pelo menos um componente de hemicelulase comparando com a proporção relativa do mesmo componente de hemicelulase em uma mistura de celulase produzida por um hemicelulase correspondente fungo filamentoso parental deficiente quando cultivado condições sob idênticas de composição do meio, temperatura, pH, densidade de célula e idade da cultura. Por exemplo, o fungo filamentoso hospedeiro modificado pode exibir redução de 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou de 100 % na proporção relativa de uma ou mais enzimas de hemicelulase quanto à proporção relativa do mesmo componente de hemicelulase em uma mistura de celulase produzida pela hemicelulase correspondente fungo filamentoso parental deficiente quando cultivado as condições sob idênticas da composição média, temperatura, pH, densidade de célula e idade da cultura.

Quando usado no contexto de determinar a proporção de uma enzima de hemicelulase em uma mistura de celulase, um hemicelulase o fungo filamentoso parental deficiente é um fungo filamentoso que não foi geneticamente modificado para exibir uma deficiência parcial ou completa na expressão do mesmo uma ou mais enzimas de hemicelulase de cuja expressão se fez que o fungo filamentoso hospedeiro modificado seja parcialmente ou completamente deficiente.

24/66

A deficiência parcial ou completa na expressão de uma ou mais enzimas de hemicelulase pode ser atingida de diversos modos diferentes conhecidos a um de normalmente versado na técnica. Por exemplo, mutações podem ser introduzidas em um ou mais genes de hemicelulase (inserção, eliminação, ou ambos) no fungo filamentoso hospedeiro modificado. Em um exemplo não limitante, o fungo filamentoso hospedeiro modificado contém a eliminação do gene que codifica xilanase 2 ou beta-xilosidase 1, ou eliminação dupla de ambos.

A deficiência parcial ou completa na expressão de uma ou mais enzimas de hemicelulase também pode ser atingida modificando a expressão ou a função de um regulador transcricional específico para a hemicelulase funcional. Em caso de reguladores positivos ou ativadores, a sequência de gene de codificando pode ser eliminada ou alterada a para produzir um regulador com a atividade reduzida. Em caso de reguladores negativos ou repressores, o gene de codificando pode ser sobreexpressado ou alterado para produzir um regulador com a atividade realçada. Por exemplo, a sequência de codificação do gene regulador transcricional específico para a hemicelulase pode ser modificado pela inserção, a eliminação ou ambos e/ou o gene que codifica o regulador transcricional específico para a hemicelulase também podem conter substituições de aminoácido que modificam a função de proteína para reduzir ou melhorar a atividade de ligação do seu DNA, a sua interação com outros reguladores transcricionais, a sua localização nuclear e assim por diante.

A eliminação de uma sequência de ácido nucleico pode ser atingida pelo projeto de um construto que inclui sequências da própria sequência de ácido nucleico alva no construto, mas na forma alterada. Após a transformação do construto no hospedeiro de expressão, a recombinação então ocorre com a sequência de ácido nucleico alva alterada, resultando na inserção da sequência alterada para interromper a sequência nativa de ácido nucleico. Com a sua sequência interrompida, o gene alterado na maioria dos casos será traduzido para uma proteína não funcional, ou não traduzido em absoluto. Um exemplo de um método que pode ser usou para eliminar uma

25/66 sequência de ácido nucleico alva de uma célula hospedeira inclui, mas não é limitado a, métodos descritos na Patente dos Estados Unidos N° 5.298.405, que é incorporada aqui pela referência.

A deficiência de hemicelulase também pode ser atingida por mutagênese química ou física (por exemplo UV) e seleção de células de não produção de hemicelulase. Além disso, as células deficientes de hemicelulase podem ser isoladas em consequência de mutações espontâneas que naturalmente ocorrem ou pelo silenciamento herdado de gene da hemicelulase.

Um construto genético pode conter sequências adicionais entre vários elementos de ácido nucleico como descrito aqui. Estas sequências, que podem ser naturais ou sintéticas, podem resultar na adição de um ou mais dos aminoácidos à proteína codificada pelo construto. A prática da invenção não é reprimida pela presença de sequências de DNA adicionais entre vários elementos de ácido nucleico de construtos genético presente na célula hospedeira.

A prática da presente invenção não é reprimida pelo método de introduzir os construtos genéticos na célula hospedeira. Os métodos de introduzir o construto de DNA em uma célula hospedeira são familiares para aqueles versados na técnica e incluem, mas não são limitados a, tratamento de células bacterianas ou protoplastos fúngicos com cloreto de cálcio para enfraquecer as membranas da célula, a adição do polietileno glicol para permitir a fusão de membranas na célula, a despolarização de membranas da célula pela eletroporação, ou o arremesso do DNA através da parede da célula e membranas via o bombardeio de microprojétil com uma pistola de partícula.

Meio de Cultura

No processo de fermentação de acordo com a presente invenção, o meio de cultura compreende uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio (ou tanto inorgânico como orgânico na natureza), e outros minerais essenciais e nutrientes como conhecido por uma pessoa com habilidade na técnica. As fontes de nitrogênio orgânicas, tais como aminoácidos e peptídeos também podem ser utilizados como fontes de carbono; contudo, estas

26/66 fontes orgânicas de nitrogênio não estão incluídas no cálculo da fonte de carbono fornecida à célula hospedeira durante o processo de fermentação.

Em uma primeira modalidade, a fonte de carbono fornecida às células fúngicas no processo de fermentação da presente invenção compreende o carboidrato derivado da hemicelulose (HDC). Tal como aqui utilizado, o termo que o carboidrato derivado da hemicelulose ou HDC se referem a um ou mais oligossacarídeo ou dissacarídeo ou monossacarídio que pode ser liberado pela despolimerização química ou a despolimerização enzimática da hemicelulose e que pode ser utilizado pelo micróbio hospedeiro de crescimento, produção de enzima ou ambos. Os exemplos não limitantes de HDC incluem xilo-oligossacarídeos, arabinoxilo-oligossacarídeos, D-xilose, xilobiose, L-arabinose, D-galactose de D-manose e combinações dos mesmos. Por exemplo, o HDC contém o D-xilose e/ou o L-arabinose. O HDC representa de aproximadamente 60 % em peso a aproximadamente 100 % em peso da fonte de carbono alimentada às células fúngicas durante o processo de fermentação. Por exemplo, o HDC pode representar 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 ou 100 % em peso ou qualquer quantidade entre os mesmos, das fontes de carbono alimentadas às células fúngicas durante o processo de fermentação. Por exemplo, o HDC pode representar de aproximadamente 80 % a aproximadamente 100 % da fonte de carbono alimentada às células fúngicas durante o processo de fermentação.

Em uma segunda modalidade, a fonte de carbono fornecida às células fúngicas no processo de fermentação da presente invenção compreende de açúcar derivado de álcoolda hemicelulose (HDSA), o glicerol e/ou a glicose. Tal como aqui utilizado, o termo hemicelulose de açúcar derivado de álcool ou HDSA se referem a um ou mais açúcares derivados de álcoois que pode ser derivado do oligo, di, ou monossacarídio liberado pela despolimerização química ou a despolimerização enzimática da hemicelulose e que pode ser utilizado pelo micróbio hospedeiro de crescimento, produção de enzima ou ambos. Os exemplos não limitantes de HDSA incluem xilitol, manitol, arabinitol, galactitol e combinações dos mesmos. Preferivelmente, o HDSA é xilitol ou arabinitol. O HDSA representa de aproximadamente 25 % em

27/66 peso a aproximadamente 100 % em peso da fonte de carbono alimentada às células fúngicas durante o processo de fermentação. Por exemplo, o HDSA pode representar 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 ou 100 % em peso ou qualquer quantidade entre os mesmos, das fontes de carbono alimentadas às células fúngicas durante o processo de fermentação. Por exemplo, o HDSA pode representar de aproximadamente 80 % a aproximadamente 100 % da fonte de carbono alimentada às células fúngicas durante o processo de fermentação. Além de HDSA, a fonte de carbono também contém aproximadamente 0 % em peso de um carboidrato que induz a celulase e de aproximadamente 0 % em peso a aproximadamente 75 % em peso de glicose, glicerol ou uma combinação dos mesmos.

Além de HDC ou HDSA, a fonte de carbono fornecida ao processo de fermentação da presente invenção também compreende de aproximadamente 0 a aproximadamente 3 % em peso, ou qualquer quantidade entre os mesmos, de um carboidrato que induz a celulose (CIC). Tal como aqui utilizado, o termo carboidrato de indução da celulose ou CIC se refere a um ou mais oligossacarídeo ou dissacarídeo que levam à indução para a produção de celulase pela célula hospedeira. Por indução, se deseja significar o acendimento da expressão de um ou mais genes da celulase em resposta ao CIC. Os exemplos não limitantes de carboidratos que induzem a celulase incluem a celulose, a lactose, o celobiose, o soforose, o genciobiose, e uma combinação dos mesmos. Carboidrato que induz a celulase (CIC) pode ser produzido por conversão enzimática de celulose com uma ou mais enzimas de celulase a dímeros de glicose ligados por ligação beta. Alternativamente, um xarope de glicose de alta concentração pode ser condensado quimicamente ou enzimaticamente para formar as misturas dos dímeros de glicose. Por exemplo, a reação de condensação de converter a glicose em CIC pode ser catalisado pelo ácido diluído e executado em temperaturas acima 120-150°C, ou por beta-glicosidase ou enzimas de celulase em temperaturas mais moderadas de aproximadamente 40-70°C (Publicação dos Estados Unidos US2004/0121446A1).

Além de HDC e CIC, de aproximadamente 0,1 a aproximada

28/66 mente 40 % em peso, ou qualquer quantidade entre os mesmos, da fonte de carbono fornecida à célula hospedeira durante o processo de fermentação pode compreender um ou mais a glicose, o glicerol, açúcar derivado de álcoois (tal como xilitol ou arabinitol), ácidos orgânicos (tais como ácido acético ou ácido glucurônico) ou outras fontes de carbono que podem ser utilizadas pela célula hospedeira. Por exemplo, de aproximadamente 0,1, 0,2, 0,5, %, ou qualquer quantidade entre os mesmos, do carbono total fornecido à célula hospedeira durante o processo de fermentação podem compreender um ou mais entre a glicose, o glicerol, açúcar derivado de álcoois (tal como xilitol ou arabinitol), ácidos orgânicos (tais como ácido acético ou ácido glucurônico) ou outras fontes de carbono que podem ser utilizadas pela célula hospedeira.

Uma pessoa com habilidade na técnica está ciente de que outros nutrientes, vitaminas e minerais podem ser acrescentados ao meio de fermentação para melhorar o crescimento e a produção de enzima da célula hospedeira. Estes outros componentes do meio pode ser acrescentados antes de, simultaneamente com, ou após, a inoculação da cultura com a célula hospedeira.

Produção de Misturas de Celulase

As misturas de celulase são tipicamente produzidas submetendo-se uma cultura fúngica ativamente crescente ao meio (sólido ou líquido) contendo muito pouco ou nada de glicose e um carboidrato indutor de celulase, bem como outros nutrientes necessários para o crescimento celular, em temperaturas e pH conveniente para a célula hospedeira. No processo de fermentação de acordo com a presente invenção, as misturas de celulase são produzidas submetendo-se uma cultura ativamente crescente de um fungo filamentoso hospedeiro modificado sobreexpressando um Xyr1 ao meio (sólido ou líquido) compreendendo uma fonte de carbono contendo de aproximadamente 60 % em peso a aproximadamente 100 % em peso carboidrato derivado da hemicelulose e de aproximadamente 0 % em peso a aproximadamente 3 % em peso de um carboidrato que induz a celulase ou

29/66 em um meio compreendendo uma fonte de carbono contendo de aproximadamente 25 % em peso a aproximadamente 100% em peso de um álcool de açúcar derivado da hemicelulose, carboidrato de aproximadamente 0 % que induz a celulase e de aproximadamente 0 % em peso a 75 % em peso de 5 glicose, glicerol ou uma combinação dos mesmos.

Expressão de celulases pode ser detectados ao nível de transcrição por técnicas conhecidas daqueles normalmente versados na técnica, incluindo, mas não limitado a, hibridização de Northern blot ou PCT em tempo real quantitativo (qRT-PCR; ver o Exemplo 1.3). Expressão da proteína 10 de celulase pode ser detectada por vários métodos conhecidos daqueles versados na técnica incluindo ensaios de atividade de enzima ou imunodetecção de proteína. Os exemplos não limitantes de atividade e métodos de imunodetecção de misturas de celulase são fornecidos no Exemplo 7.

As fermentações líquidas submersas de Tríchoderma e fungos fi15 lamentosos relacionados são tipicamente conduzidas como uma batelada, batelada alimentada ou processo contínuo. Em um processo de batelada, todos os materiais necessários, com a exceção do oxigênio de processos de aerobic, são colocados em um reator na partida da operação e a fermentação é permitida para prosseguir até a realização, em que ponto o produto é 20 colhido. Em uma fermentação de batelada, a fonte de carbono pode ser acrescentou ao meio de fermentação antes de ou simultaneamente com a inoculação.

Em um processo de batelada alimentada, a cultura é alimentada continuamente ou em sequência com um ou mais componentes do meio 25 com a remoção do fluido de cultura. Em um processo contínuo, o meio fresco é fornecido e o fluido de cultura é removido continuamente por taxas volumetricamente iguais para manter a cultura em uma taxa de crescimento constante. Nos casos de batelada alimentada ou operações contínuas, a fonte de carbono também pode ser fornecida continuamente ou intermiten30 temente durante o processo de fermentação. Preferivelmente, a taxa de alimentação está entre 0,2 e 2,5 g de carbono/L de cultura/h ou qualquer quantidade entre os mesmos. Mais preferivelmente, a taxa de alimentação está

30/66 entre 0,4 e 1,6 g de carbono/L de cultura/h, ou qualquer quantidade entre os mesmos.

O processo de fermentação da presente invenção pode ser transportado em uma temperatura de aproximadamente 20°C a aproximadamente 35°C, ou qualquer temperatura entre os mesmos, por exemplo de aproximadamente 25°C a aproximadamente 30°C, ou qualquer temperatura entre as mesmas, ou de 20, 22, 25, 26, 27,28, 29, 30, 32, 35°C, ou qualquer temperatura entre as mesmas.

O processo de fermentação da presente invenção pode ser executado em um pH de aproximadamente 3,0 a 6,5, ou qualquer pH entre os mesmos, por exemplo de aproximadamente pH 3,5 a pH 5,5, ou qualquer pH entre os mesmos, por exemplo de aproximadamente pH 3,0, 3,2, 3,4, 3,5,

5,8, 6,0, 6,2, 6,5 ou qualquer pH entre os mesmos.

O processo de fermentação da presente invenção pode ser executado durante o período de 3 a 30 dias, ou qualquer quantidade entre os mesmos, por exemplo, entre 3 e 10 dias, ou qualquer quantidade entre os mesmos, entre 4 e 8 dias, ou qualquer quantidade entre os mesmos, ou de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 dias, ou qualquer quantidade entre os mesmos.

O processo de fermentação da presente invenção pode ser executou em culturas de pelo menos 1 litro, por exemplo de aproximadamente de 1 a aproximadamente 400.000 litros, ou qualquer quantidade entre os mesmos, por exemplo, 10 a aproximadamente 400.000 litros, ou qualquer quantidade entre os mesmos, 1.000 a aproximadamente 200.000 litros, ou qualquer quantidade entre os mesmos, ou 10.000 a aproximadamente 200.000 litros, ou qualquer quantidade entre os mesmos, ou de aproximadamente 1, 10, 50, 100, 200, 400, 600, 800, 1000, 2000, 4000, 6000, 8000

10.000, 15.000, 20.000, 25.000, 30,000,35,000, 40.000, 45.000, 50.000,

55.000, 60.000, 65.000, 70.000, 75.000, 80.000, 85.000, 90.000, 95.000,

100.000, 150.000, 200.000, 300.000, 400.000 litros de volume, ou qualquer quantidade entre os mesmos.

31/66

O processo de fermentação da presente invenção pode ser executou aerobicamente, na presença de oxigênio, ou anaerobicamente, na ausência de oxigênio. Preferivelmente, o processo é executado aerobicamente.

A seguinte fermentação, a mistura de celulase assim produzida pode ser usado diretamente, ou mistura de celulase pode ser separado das células fúngicas, por exemplo por filtração ou centrifugação. Os solutos baixo moleculares, tais como os componentes não consumidos do meio de fermentação podem ser removidos pela ultrafiltração. A mistura de celulase talvez concentrada, por exemplo, por evaporação, precipitação, sedimentação ou filtração. Produtos químicos, tais como glicerol, sacarose, sorbitol e assim por diante podem ser acrescentados para estabilizar a enzima de celulase. Outros produtos químicos, tais como benzoato de sódio ou sorbato de potássio, podem ser acrescentados à mistura de celulase para evitar o crescimento de contaminantes microbianos.

O processo de fermentação da presente invenção pode produzir uma mistura de celulase contendo pelo menos sobre a proteína mais secretada de 2 vezes do que um processo correspondente no qual a fonte de carbono contém só HDC e é executada usando uma cepa fúngica que não foi modificada ou selecionada para a expressão aumentada de um Xyr1 ou fator de transcrição equivalente ao Xyr1. Por exemplo, o processo descrito aqui pode produzir 2,5 a aproximadamente 10 vezes mais, ou qualquer quantidade entre os mesmos, por exemplo aproximadamente 2,5, 2,6, 2,8, 3,0, 3,2,

vezes mais proteína secretada, ou qualquer quantidade entre os mesmos ou mais de 10 vezes mais proteína secretada, do que um processo correspondente no qual a fonte de carbono contenha somente HDC e é executada usando uma cepa fúngica que não foi modificada ou selecionada para a expressão aumentada de um Xyr1 ou fator de transcrição equivalente ao Xyr1. Assim, o processo de fermentação pode ser caracterizado por possuir de aproximadamente 2 vezes, por exemplo, de aproximadamente 5 vezes, ou qualquer quantidade entre os mesmos, aumenta na produtividade específica

32/66 (q_p) em termos de mg da celulase secretada produzida/g biomassa/h do que um processo correspondente no qual a fonte de carbono contém somente HDC e é executada usando uma cepa fúngica que não foi modificada ou selecionada para a expressão aumentada de um Xyr1 ou fator de transcrição 5 equivalente ao Xyr1. Um aumento na produtividade específica para a produção de proteína na presença da quantidade variada de HDC, carboidrato de indução de celulose (CIC), ou tanto HDC como CIC como descrito aqui, é mostrado na Tabela 2.

33/66

Perfil de fermentação	x =£ $5 σ> F 5) a. F cr e	41,68	43,66 I	i 34,97	45,74	7,22	5,35	29,00	o co CO	23,32	CD σ> co	7,75	16,75	15,18	5,54	26,61	20,49	5,43	23,95	23,05	13,55	16,79	co
qp médio, \ mg/g/h	22,42	19,46	I 20,62	22,98	3,05 I	3,07	21,60	m LO o CM	13,71	CO CO	1,73	11,67	10,21	1,37	15,38	13,58	2,53	15,84	12,78	I 7,35	12,14	1,06
Biomassa final, g/L	14,29	13,87	[ 14,14	13,77	38,79	37,34	16,00	o r-	22,31	V o LD CO	34,55	25,60	27,25	37,48	23,26	22,08	32,67	19,74	25,15	8,46	20,35	55,33
Proteína final, g/L	37,44	32,42	30,41	34,31	L 5.θ3	8,24	35,20	CO o LO CO	28,21	l·σ>	7,91	31,87	21,78	3,34	29,11	27,8	6,07	32,65	27,31	| 14,97	27,50	2,50
pa e Alimentação da fermentação	Alimentação da fermentação	65% de glicose + 35% CICa	100% xilose	Φ ω ο c Ιο 2 ¢0 O O	50% glicose/ 25%glicerol/ 25% xilose	50% glicose/ 25%glicerol/ 25% xilose	H2	100% xilose
xyn2	t.selv.	t.selv. |	t.selv.	t.selv.	t.selv.	t.selv.	t.selv.	> 0) ω	t.selv.	> Φ ω	t.selv.	t.selv.	t.selv.	t.selv. I	t.selv.	t.selv.	t.selv.	t.selv.	t.selv.	t.selv.	t.selv.	t.selv.
Informação da Ce	>> X	t.selv.	t.selv. j	+ k— >» X	+ V“ k— >» X	t.selv. I	t.selv.	+ V k_ X	+ k— X	+ V k— >5 X	> Φ (0 M—·	t.selv.	+ k— X	4- k_ X	t.selv.	+ X	+ >ϊ X	t.selv.	+ v~ >s X	+ k_ >» X	I t.selv. |	+ k— X	t.selv.
Cepa	P285-6	P285-6 ]	P692B	P692B	P285-6	P285-6	P692B	m CM CD CD D_	P692A	CD 1 LO 00 CM CL	P285-6	P692B	P692B	P285-6	P692B	P692B	P285-6	P692B	P692B	| RutC30	I O CO O · =5 CO cr cr	| RutC30
	Fermentação n°	2404	3964	3796	3963	I 3685	3951	3684	O LO σ> CO	4254	O O O 'T	3735 ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________I	3734	3980	4217 I	4042	4086	4218	4043	4087	I 4279	4280	I 4073

34/67

Perfil de fermentação	qp max, mg/g/h	21,05	23,33	CO CO CO	I 18'9 I	19,74	19,92	18,54	12,05	29,61	29,91
qp médio, mg/g/h	13,44	15,45	χ- ΙΟ co	2,39 I	10,95	10,55	9,95	6,04	15,72	20,89
Biomassa final, g/L	31,70 L. .	26,57	29,86	40,35	28,11	27,00	! 27,51	11,61 ’ I	7,60	13,84
Proteína final, g/L	35,13 I	37,38	7,66	x— cd	25,15	24,13	| 22,92	15,17	27,13	39,47
pa e Alimentação da fermentação	Alimentação da fermentação		50% glicose/ 25%glicerol/ 25% xilose
xyn2	t.selv.	t.selv.	t.selv.	1 CM C >> X	xyn2-	xyn2-	1 CM C >S X	t.selv.	t.selv.	t.selv.
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Cepa	RutC30- R3	RutC30- R3	M2C38	P491P I	P1194E	P1194F	P1197B	RutC30- R3	P692B	I P692B
	Fermentação n°	4074	4255	4258	| 4101	4120	4121	I 4122	4403	4404	I 4417

^a CIC para estas fermentações induzia o compreendendo de coquetel, como uma função de carboidrato total, 56 % de genciobiose, 14 % de soforose, 6% de celobiose, 10 % de trealose, 6 % de maltotriose, 4 % de glicose e 14 % de outros carboidratos

35/66

Misturas de Celulase

O processo de fermentação da presente invenção produz uma mistura de celulase. Tal como aqui utilizado, uma mistura de celulase é uma mistura compreendendo componentes de celulase, componentes de hemicelulase e outra proteína secretada pelo fungo filamentoso hospedeiro modificado durante o processo de fermentação. A mistura de celulase produzida pelo processo de fermentação compreende de aproximadamente 40 a aproximadamente 100 componentes de celulase de % em peso em relação o presente de proteína total na mistura de celulase. Por exemplo, os componentes de celulase podem representar de aproximadamente 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 % em peso da proteína total na mistura de celulase, ou qualquer quantidade entre os mesmos. A proporção relativa de componentes de celulase em misturas de celulase produzidas por fungos filamentosos hospedeiros modificados usando o processo de fermentação da presente invenção é mostrada na Tabela 3.

Tal como aqui utilizado, o termo componente de celulase ou componentes de celulase inclui endoglicanases (E.C. 3.2.1.4), celobioidrolases (E.C. 3.2.1.91), beta-glicosidases (E.C. 3.2.1.21), e misturas das mesmas. Os termos componente de celulase ou componentes de celulase também incluem outras proteínas, tais como swolleninas, que estão envolvidas em ou realçam a degradação enzimática da celulose. Deve entender-se que a prática da presente invenção não é limitada pela identidade do componente de celulase na mistura de celulase. Os componentes de celulase são parte de uma mais ampla família de enzimas referidas como glicosilidrolases. As glicosilidrolases são divididas em famílias diferentes e são listadas no banco de dados de Enzimas Ativas para Carboidrato (Coutinho, P.M & Henrissat, B., 1999; também ver: afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/). Este banco de dados e a nomenclatura são familiares para aqueles versados na técnica. Os componentes da celulase que são o mais comumente encontrados como membros de famílias de glicosilidrolase 1, 3, 5, 6, 7, 12, 45 ou 61. Como ele se relaciona à mistura de celulase nativa produzida por T. reesei, o termo componente de celulase se refere a alguns ou todos dos seguintes: celobi-

36/66 oidrolase 1 (Cel7A), celobioidrolase 2 (Cel6A), endoglicanase 1 (Cel7B), endoglicanase 2 (Cel5a), endoglicanase 3 (Cel 12A), endoglicanase 4 (Cel61 A), endoglicanase 5 (Cel45A), beta-glicosidase 1 (CeDA) e beta-glicosidase 2 (CeBB), Cipl e Swollenina.

As enzimas envolvidas nos hemiceluloses de degradação entregam-se a aqui como hemicelulases ou componentes de hemicelulase (revisto em Saha, B.C. (2003). As hemicelulases incluem, mas não são limitados a, endo-xilanases (E.C. 3.2.1.8), beta-xilosidases (E.C. 3.2.1.37), alfaarabinofuranosidases (E.C. 3.2.1.55), alfa-glucuronidases (E.C. 3.2.1.139), esterases de acetilxilano (E.C. 3.1.1.72), esterases ácidos ferúlicos (E.C. 3.1.1.73), beta-mananases (E.C. 3.2.1.78), e a beta-mannosidases (3.2.1.15). Os xilanos são os hemiceluloses mais abundantes. O termo xilanases ou componentes de xilanase tal como aqui utilizado se refere a enzimas que têm o endo-xilanase, o exo-xilanase ou a atividade de betaxilosidase. As xilanases podem pertencer a famílias de glicosilidrolase 3, 5, 10 e 11. Como ele se relaciona à mistura de celulase nativa produzida por T. reesei, o termo xilanase ou componentes de xilanase se refere a alguns ou todas das seguintes enzimas de Trichoderma reesei: beta-xilosidase 1 (Bxl1), beta-xilosidase 2 (Bxl2), xilanase 1 (Xyn1), xilanase 2 (Xyn2), xilanase 3 (Xyn3) e xilanase 4 (Xyn4).

37/66 (Λ Ο ω ο 4—» C <υ Ε CT5 σ> ο Ο) C Ξ3

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Composição da enzima secretada (% em peso de proteína total)	o Φ Φ CO Ό ω o X 1 CO 4—· Φ m	X”		7,7	I 20,0	4,0	4,5		f
Φ ω CO c _ço X	6,4 |	-sr CD	21,5	I 14·6	10,9	10,2
Φ ω _ço 3 Φ O	52,9	t 71,5	47,5	I 29,5	62,6	58,6	59,0	82,3
Informação da Cepa e Alimentação da fermentação	Fonte de carbono		25% açúcar/ 50% glicose/ 25% glicerol
xyn2	t.selv.	t.selv.	t.selv.	xyn2-	xyn2-	xyn2-	xyn2-	t.selv.
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Cepa	RutC30-R3 |	RutC30-R3 |	M2C38	| P491P	P1194E	P1194F	P1197B	RutC30-R3 _
	Fermentação n°	4074	4255	4258	| 4101	4120	4121	4122	4403

lativa de celulase é a soma das concentrações das celulases Cel7A, Cel7B, Cel6A e Celõa e a concentração relativa de xilanase é a soma da concentração do xyn1 e xilanases xyn2, como mostrado na atividade de hidrólise de Parente de Figura 12. ^c Proporção relativa (em % em peso total de proteína) de beta-xilosidase determinada como no Exemplo 7.2. ^d Realtivo a substrato de lignocelulósico pré-tratado como descrito no Exemplo 5.4.

ΙΟ

39/66

Hidrólise de Substratos Celulósicos.

O usando produzido da mistura de celulase do processo de fermentação da presente invenção é útil para a hidrólise da celulase ou um substrato de celulósico. Pelo termo de celulósico de substrato, se deseja significar qualquer substrato derivado de biomassa de planta e compreendendo de celulose, incluindo, mas não limitado a, pré-tratou matérias - primas de lignocelulósico para a produção de etanol ou outros altos produtos de valor, forragem, produtos inúteis florestais, tais como polpa e lascas de madeira, e tecidos. A atividade das misturas de celulase produzidas pelo processo de fermentação da presente invenção no matéria - prima de lignocelulósico pré-tratado é apresentada na Tabela 3.

A enzima de celulase produzida pelo processo de fermentação da presente invenção pode ser usado para a hidrólise de enzimático de um matéria - prima de lignocelulósico pré-tratado. Uma matéria-prima de lignocelulósico pré-tratado é um material da origem de planta que, antes do prétratamento, contém a celulose de pelo menos 20 % (em peso seca), mais preferivelmente a celulose maior do que de aproximadamente 30 %, mesmo mais preferivelmente celulose maior do que 40 %, e lignina de pelo menos 10 % (em peso seca), mais tipicamente pelo menos 12 % (em peso seca) e foi submetida a processos físicos e/ou químicos para tornar a fibra mais acessível e/ou receptiva às ações de enzimas de celulolítico. Os exemplos não limitantes de processos de pretratamento incluem o tratamento químico de uma matéria-prima de lignocelulósico com o ácido sulfúrico ou sulfuroso, ou outros ácidos; amônia, cal, hidróxido de amônio, ou outro álcali; etanol, butanol, ou outros solventes orgânicos; ou a água pressurizada (Ver Patentes dos Estados Unidos N^os. 4.461.648, 5.916.780, 6.090.595, 6.043.392, 4.600.590; Weil et al., 1997, Appl. Biochem. Biotechnol. 681: 21-40, e Ohgren, K., et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. Spring (121-124): 10551067; que são incorporados aqui pela referência).

Por exemplo, o substrato celulósico pode ser incubado com a enzima de celulase produzida usando os métodos descritos aqui, em uma concentração de aproximadamente de 1 a aproximadamente 200 g celulose

40/66 por L de mistura de reação, ou qualquer quantidade entre, por exemplo, de aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, ou qualquer quantidade entre as mesmas, e com uma dosagem de celulase de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 mg de proteína por g de celulose, ou qualquer quantidade entre as mesmas, por exemplo, de aproximadamente 0,1, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 mg de proteína/g celulose, ou qualquer quantidade entre os mesmos. A mistura de reação pode ser incubada durante aproximadamente 4 horas a aproximadamente 120 horas, ou qualquer quantidade entre as mesmas, em uma temperatura de aproximadamente 30°C a aproximadamente 60°C, ou qualquer temperatura entre os mesmos, por exemplo de aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60°C ou qualquer temperatura entre os mesmos, e em um pH de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 7,0, ou qualquer pH entre os mesmos, por exemplo um pH de aproximadamente 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 ou qualquer pH entre os mesmos. Após a incubação, os produtos de reação, incluindo carboidratos derivados da hemicelulose, carboidratos que induzem a celulase, glicose, e/ou oligossacarídeos podem ser usados para o processamento adicional, por exemplo como um substrato para produzir etanol, butanol, açúcar derivado de álcoois, ácido láctico, ácido acético, ou os produtos finais pode ser concentrados e purificados usando métodos padrão tal como conhecido na técnica.

Em suma, a presente invenção fornece processos de fermentação altamente produtivos que produzem enzimas de celulase com um baixo teor de hemicelulase útil para a hidrólise de substratos celulósicos.

A descrição acima não está destinada a limitar a invenção reivindicada por qualquer maneira. Além disso, a combinação discutida de características não podería ser absolutamente necessária para a solução invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Cepas hospedeiras para clonagem e expressão de fator de transcrição de Xyr1.

Exemplo 1.1: cepas hospedeiras de Trichoderma para a sobreexpressão do

41/66 fator de transcrição Xyr1.

As cepas de Tríchoderma reesei hospedeiras usadas para a sobreexpressão do fator de transcrição xyr1 são RutC30, P285-6aux e P491P6.

A cepa RutC30 (ATCC N°56765) foi isolada como um derivado de alta produção de celulase da cepa progenitora QM6A (Montenecourt e Eveleigh, 1979). As cepas de hiperprodução de celulase foram geradas de RutC30 por mutação casual e/ou seleção. A cepa M2C38 foi isolada baseada na sua capacidade de produzir maiores zonas de clareamento do que RutC30 em ágar-ágar em meio mínimo contendo 1 % celulose de ácido inchada e 4 gL'¹ 2-desoxiglicose. Depois, a M2C38 foi submetido a mutagênese casual adicional e a cepa BTR213 isolada pela seleção no meio de lactose contendo 0,2 pg/mL carbendazima.

A cepa P285-6aux é um derivado da cepa BTR213 contendo uma eliminação nos do gene (cel5a) codificando endoglicanases 2 e também falta da capacidade de crescer no meio que necessita de uridina. A eliminação do gene da endoglicanases 2 foi atingida pela transformação da cepa BTR213 com o vetor p^AEG2-hph-TV3 mostrado na Figura 1. A região de codificação do gene Cel5a no p^AEG2-hph-TV3 foi substituída por uma cassete de resistência à higromicina na qual o gene de fosfotransferase de higromicina (hph) é operacionalmente ligado ao promotor do gene do T. reesei pgk e o terminador transcricional dos celobioidrolases do gene da T reesei 1 (como descrito na Patente dos Estados Unidos N°. 6.015.703). A cassete de resistência da higromicina é flanqueada em aproximadamente 2,8 KBs e 2,4 KBs da gene endoglicanase 2 nas extremidades 5' e 3', respectivamente, para permitir a recombinação homóloga dentro dos endoglicanases 2 lugar no genoma do T. reesei. BTR213 de cepa foi transformado com p^AEG2-hphTV3, que tinha sido linearizado por digestão com o endonuclease de restrição Xbal, usando PEG - método de transformação de protoplasto mediado como descrito no Exemplo 4. Os transformantes foram selecionados no meio PDA contendo 20 U/mL da higromicina. A eliminação dos endoglicanases 2 gene foi confirmado pela hibridização tipo Southern usando a endoglicanase

42/66 sequência de codificação como uma sonda (figuram IB). Apyr4 auxotrofo da cepa P285-6 (cepa P285 - 6aux), deficiente na produção de uracila, foi isolado baseado na capacidade de crescer em agar-agar de meio mínimo complementado com a uridina de 5 mm e 0.15 % (p/v) de 5 flúor - orotic ácido.

A Cepa P491P6 é um derivado da cepa M2C38 contendo uma eliminação no gene da xilanase 2 e também necessita da capacidade de crescer no meio que necessita de uridina. A eliminação do gene da xilanase 2 foi atingida pela transformação da cepa M2C38aux5, um auxotrofo pyr4 de M2C38 selecionado para a capacidade de crescer em agar-agar de meio mínimo contendo 5 uridina de mM e 0,15 % (p/v) ácido 5-fluoro-orótico, com o vetor pXBG2-pyr4-DR mostrado na Figura 2. A região de codificação do xilanase 2 gene em pXBG2-pyr4-DR foi substituída por uma grande inserção compreendendo o gene da T. reesei cel3a (codificando a beta-glicosidase 1) no qual o gene N. crassa pyr4 flanqueado por Repetições Diretas foi inserido. As sequências repetidas diretas foram amplificadas por PCR usando gene de tetraciclina como um padrão (671 bp - 990 bp) e depois os iniciadores: DR1-F GCGTGCTGCTAGCGCTATATGC (SEQ ID N°: 28), DR1-R GGCCTGGTACCATACCCACG (SEQ ID N°: 29), DR2-F GCGTGCTGGTACCGCTATATGC (SEQ ID N°: 30) e DR2-R GGCCTGCTAGC ATACCCACG (SEQ ID N°: 31). A cassete de repetição direta cel3A-pyr4 em pXBG2-pyr4-DR é flanqueada por aproximadamente 2,1 KBs e 1,9 KBs do xilanase 2 gene nas extremidades 5' e 3', respectivamente, para permitir a recombinação homóloga dentro da xilanase 2 lugar no genoma do T. reesei. A cepa M2C38aux5 foi transformada com pXBG2-pyr4-DR que tinha sido linearizado com a enzima de restrição de Cia 1 usando método de transformação de protoplasto mediado por PEG como descrito no Exemplo 4. Transformante foram selecionados em agar-agar médio mínimo como descrito no Exemplo 4. Todo o estável transformante foi avaliado para a eliminação do xilanase 2 gene por PCR amplication de iniciadores de usando de DNA genômicos complementares ao xilanase 2 codificação (dados não mostrados). Para verificar a incapacidade de produzir o xilanase 2 proteína, todos trans

43/66 formantes foram cultivados em Tríchoderma micro - meio de cultura com o xilose como descrito no Exemplo 5.1. A proteína secretada total (10 pg) foi separada em SDS de 12 % - a PÁGINA, transferida para membrana PVDF e anticorpos de usando submetidos ao imunoblot levantou contra o xilanase 2. A ausência da banda específica xyn2 nas amostras de proteína secretadas totais de algumas cepas transformantes confirmou a eliminação bem sucedida do gene xyn2 (Fig 2B). Apyr4 auxotrofo da cepa P491P (cepa P491P6) deficiente na produção de uracila foi isolado baseado na capacidade de crescer em agar-agar de meio mínimo complementado com a uridina de 5 mm e 0.15 % (p/v) do ácido 5-fluoro-orótico

Exemplo 2: produção de enzima e níveis de expressão de reguladores transcricionais, xyr1 e ace1, em fermentações de Tríchoderma sobre alimentos diferentes.

A cepa do T reesei P59G foi usada para a avaliação de proteína, produção de biomassa, q_p e os níveis de expressão óicbhl (celobioidrolase 1), xyr1 (regulador de xilanase 1) e ace1 (ativador da celulase 1) cultivado na fermentação de batelada alimentada em fontes de carbono diferentes. A cepa P59G de é uma cepa geneticamente modificada da cepa BTR213 (descrito no Exemplo 1) que produz e secreta altos níveis da betaglicosidase codificado por T reesei bgl1 como descrito em Patente dos Estados Unidos N°. 6.015.703.

Exemplo 2.1: Fermentações em açúcares de pentose com CIC.

Os esporos de Tríchoderma de estoques de 15 % de glicerol congelado (-80°C) da cepa P59G foram inoculados em placas de Petri padrão de 85 mm contendo ágar-ágar de dextrose de batatas (PDA). Estas placas foram incubadas em 28°C durante 3-5 dias para atingir um crescimento confluente de esporos verdes frescos. Para preparar o inóculo para a prova de fermentação, os esporos de uma placa PDA única foram transferidos para 2 L, abafou o frasco Erlenmeyer contendo 750 mL de líquido meio de Berkley (pH 5,5) complementado com 5,1 g/L milho seco de maceração e 10 g/L glicose. Os frascos foram incubados em 28°C durante 3 dias usando um agitador orbital (Modelo G-52 New Brunswick Scientific Co) girando a

44/66

100 rpm.

Berklev Media de Frascos

Componente	g/L
(NH4)2SO4	10,4
kh2po4	2,0
MgSO4.7H2O	0,31
CaCI2.2H2O	0,53
Maceração de milho seco	5,1
Glicose	10
Elementos traço*	1 mL/L

*A solução de elementos traço contém 5 g/L FeSO₄ 7H₂O; 1,6 g/L MnSO₄ H₂O; 1.4 g/L ZnSO₄-7H₂0.

Os teores de um frasco de inóculo foram transferidos para um vaso de fermentação de escala poiloto de 14 L (Modelo MF114 New Brunswick Scientific Co) ajustado com 10 L de Meio Experimental Inicial (pH 5,5). O vaso foi corrido no arquivo de lote até que a glicose no meio fosse esvaziada. Neste ponto, a fonte de carbono foi acrescentada, em uma base contínua, de um estoque era de 35,5 % p/v de corpos sólidos dissolvidos na água. As bombas peristálticas foram usadas para liberar a fonte de carbono em uma taxa de alimentação de 0,4 gramas de carbono por litro de cultura por hora. Os parâmetros operacionais tanto durante a batelada como durante as porções de batelada alimentada da corrida foram: misturar por agitação de agitador em 500 rpm, injeção de ar padrão em 8 litrospor minuto, e uma temperatura de 28°C. O pH de cultura foi mantido em 4,0-4,5 durante o crescimento da batelada e o pH 3,5 durante a produção de celulase usando um controlador automatizado conectado a uma sonda de pH online e uma bomba que permite a adição de uma solução de hidróxido de amônio a 10 %. Periodicamente, amostras de 100 mL do caldo foram retiradas para análise de proteína e biomassa. O tempo de fermentação total está tipicamente entre 96-144 horas.

45/66

Meio Inicial para Fermentações em Batelada Alimentada

Componente	g/L
(NH4)2SO4	2,20
kh2po4	1,39
MgSO4.7H2O	0,70
CaCI2.2H2O	0,185
Maceração de milho seco	6,0
Glicose	13,00
Elementos traço*	0,38 mL/L

*A solução de elementos traço contém 5 g/L FeSO₄.7H₂O; 1,6 g/L MnSO₄ H₂O; 1,.4 g/LZnSO₄ ,7H₂O.

O teor de biomassa do caldo de cultura foi determinado usando alíquotas de 5 - 10 ml_ que tinha sido pesadas, filtradas a vácuo através de filtros de microfibra de vidro, e secas em forno a 100°C durante 4 a 24 horas. A concentração da biomassa foi determinada de acordo com a equação abaixo.

. , . . „. papel de filtro seco e torta (g) - filtra a massa (g) x densidade de caldo (g/mL) x 1000 (mL/L)

A biomassa (g/L) = ---------------------51-------------21---- --------------------------massa de amostra molhada (g)

A concentração de proteína do filtrado de cultura foi determinada usando o ensaio de Bradford. A intensidade em cor modifica-se na tintura de G-250 Azul Brilhante Coomassie, que forma a base deste ensaio, foram quantificados por medições de absorvância usando espectrofotômetro em 595 nm. O controle de ensaio padrão usado foi uma mistura de celulase de composição e concentração conhecidas. A produtividade específica, q_p, foi expressada como mg de proteína produzida por grama da biomassa por hora da fermentação.

Trichoderma reesei perfis de fermentação da cepa P59G com várias fontes de carbono é mostrado na Figura 1. Como esperado, a quantidade da proteína total produzida durante 164 horas em um coquetel que induz a celulase (CIC) é significativamente mais alta do que aquela produzida em fermentações em xilose ou em arabinose com a celobiose a 2 %. Ao contrário a produção da biomassa foi significativamente mais alta no açúcar de pentose e resultou na produtividade de baixa especificidade durante o

46/66 curso da fermentação (Tabela 4). A produção da celulase na hemicelulose derivada de carboidrato (HDC) pode ser melhorada por adições de 8 a 15 % de CIC aos alimentos (Tabela 4).

Tabela 4: Produção de proteína e biomassa pelo T. reesei P59G em diferentes tipos de alimentação.

Cepa	Fonte de carbono	Proteína, g/L	Biomassa, g/L	qp médio, mg/g/L	qp max, mg/g/L
Cepa	Fonte de carbono
P59G	65% Glicose/ 35% CICa	36,95	18,49	21,74	41,77
P59G	98% Xilose + 2% Celobioseb	15,84	35,65	6,47	11,16
P59G	98% Arabinose + 2% Celobioseb	10,71	32,94	4,44	11,01

a - média de cinco fermentações b - média de duas fermentações

Exemplo 2.2: níveis de expressão de xyr1, ace1 e cel7a em diferentes fontes de carbono.

As amostras de biomassa foram obtidas nas fermentações acima no momento do ponto de 72 horas após indução de celulase. As amostras de fermentação foram filtradas através de papel de microfibra de GF/A, lavado com a água estéril e congeladas no nitrogênio líquido. Os micélios congelados foram esmagados moídos em nitrogênio líquido e o RNA total foi extraído usando o procedimento delineado no kit de Isolamento de RNA Strategene (VWR Cat.N° CA99900-134). O RNA foi quantificado usando uma conversão de OD₂₆onm = 1,0 represnetando uma concentração de 40 pg/mL. A primeira fita cDNA foi preparada usando exatamente 10 pg de RNA total de cada amostra transformante. RNA foi misturado com 1,5 pL de 100 μΜ de iniciador AncT (Invtrogen), 2 pL de dNTP 25 mM (cada um dNTP de 6,25 mM) e feito até 25 pL com RNase e água livre de DNAse de GIBCO. A mistura de RNA foi aquecida em 65 °C durante 5 minutos e logo rápidamente resfriada em um banho de gelo durante 2 minutos. A esta mistura, 8 pL de 5X tampão de primeira fita (Invitrogen), 4 pL de 0,1M DTT (Invtrogen) e 1 pL

47IQQ do RNasein (Invitrogen) foram acrescentados. Os tubos foram misturados e incubados em 42°C durante 2 minutos. Depois disto, 2 μΙ_ do SuperScriptll (Invitrogen) foi acrescentado. A reação de síntese foi continuada em 42°C durante 60 minutos de todas as amostras. A primeira fita cDNA foi guardada 5 em -20°C.

Os níveis de expressão de genes que codificam reguladores transcricionais xyr1 e ace1 e o seu gene de objetivo cbh1 foram determinados por PCR em tempo real quantitativo (qRT-PCR) usando sistema de qRTPCR da Strategene MX3000P. Todos os reagentes de qRT-PCR, exceto os 10 iniciadores específicos para o amplicon, foram comprados de Stratagene e usaram de acordo com as instruções do fabricante. A medição de níveis de transcrição foi determinada usando o método de curva padrão. As curvas padrão foram construídas para um gene de referência constitutivamente expressado que codifica fator de transporte nuclear 2 (Ntf-2) e para cada um 15 dos xyr1, ace1 e amplicons cel7a (cbh1) usando os iniciadores indicados na Tabela 5 (SEQ ID de 1 a 8). Para a geração de curvas padrão, de todas as alíquotas iguais coletaram-se as amostras de cDNA foram juntadas, diluíram-se 1:10, 1:100 e 1:1000 na água estéril e usaram para qRT-PCR como se segue. Para determinar o nível de transcrição relativo de cada gene cD20 NA, as amostras diluídas foram também diluídas 1:2 20 e 2 pL aliquotado em triplicata em uns 96 poços tabela de qRT-PCR microbem placa. A cada um poço, 18 pL de mistura de Green MasterSYBR que contém: 2XBrilliant SYBRGreen (10 pL), 1/500 diluição (0.75pL) da tintura de referência ROX, 10 pmol contendo quantidade igual de iniciadores avançados e reversos (1 25 pL) e 6.25 pL de água GIBCO foram acrescentados. O perfil de PCR consistiu das seguintes etapas: I) 1 ciclo de 15 minutos em 25°C, 10 minutos em 95°C; II) 40 ciclos dos de 30 segundos em 95°C; de 20 segundos em 55°C; de 20 segundos em 72°C; III) 1 ciclo de 1 minuto em 95°C; de 30 segundos em 55°C; de 30 segundos em 95°C. A análise dos dados foi executada co30 mo descrito no Stratagene MX3000P manual para converter o ciclo fracionário no qual exponencial produzido é confiantemente detectado (Ct) para copiar o número. As curvas padrão foram traçadas para cada gene para medir

48/66 o número de cópia. Estes valores então foram normalizados ao gene de referência Ntf-2. O valor final é o nível de expressão relativo do gene alvo em relação ao gene de referência.

Tabela 5: lista de iniciadores usados para qRT-PCR:

SEQ ID	Nome do iniciador	Sequência de iniciadores
1	Ntf2F	ACAGAGTTGGCATTGTAGACAGCG
2	Ntf2R	CGAGTAAAGCACACAAACCGCCAA
3	Xyr1 qPCR iniciador direto	AGCCAGATTCTCGAGTTTGACCCT
4	Xyr1 qPCR iniciador reverso	GCAAGCTTCGTGTGCCCTAACAAT
5	Ace1 qPCR iniciador direto	AGAAGGAAATGGACCGCCACATCA
6	Ace1 qPCR iniciador reverso	AGTTCGACTCACGCTTCGACTTGT
7	Cbh1 qPCR iniciador direto	TACTCTGGCAACGAAGCTCAACGAT
8	Cbh1 qPCR iniciador reverso	GCCACAGCATGTTGGCGTAGTAA

Os níveis de expressão do gene cbh1 em 98 % de xilose +2 % de celobiose, ou 98 % de arabinase + 2 % de celobiose são mais baixos do que com 65% de glicose + 35% de CIC (Figura 3). Isto está em correlação com (Tabela 4) de perfis de produção de proteína e os níveis de expressão do Xyr1 de ativador transcricional que codifica gene (Figura 3). Ao contrário 10 os níveis de transcrição do regulador transcricional negativo ace1 são independentes da fonte de carbono fornecida à fermentação (Figura 3). Sem desejar ser ligado pela teoria, é possível que os níveis mais baixo do Xyr1 de regulador transcricional positivo sejam o fator restritivo de taxa que resulta em celulase mais baixo e produção de proteína total em HDC.

Exemplo 3: Clonagem de Trichoderma reesei gene xyr1.

Exemplo 3.1: Isolamento de DNA genômico do Trichoderma reesei e amplificação do xyr1.

Para o isolamento de DNA genômico, esporos do T. reesei coletados de uma placa agar-ágar de dextrose de batatas (PDA) foram inocula

49/66 dos em 50 mL do Caldo de Dextrose de Batatas (PDB) (Difco). As culturas foram agitadas em 200 rpm durante 2-3 dias em 28°C. O micélio foi filtrado por uns círculos de fibra de vidro (GFA) (Fisher Cat. N°09-804-424) e lavado com água fria, deionizada. As tortas fúngicas foram congeladas em nitrogênio líquido e esmagados em um pó com um gral pré-congelado e pilão; 0,5 g da biomassa em pó foram resuspensos em 5 mL do tampão contendo 100 mM Tris, 50 mM EDTA, pH 7,5 e dodecil sulfato de sódio de 1 % (SDS). O lisado foi centrifugado (5000G por 20 minutos em 4°C) para peletizar os resíduos celulares. O sobrenadante foi extraído com 1 volume do tampão TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) fenol saturado seguido da extração com 1 volume de fenol;cloroformio: álcool isoamílico saturado pelo tampão (25:24:1). DNA genômico foi precipitado da solução acrescentando 0.1 volumes de acetato de sódio de 3 M, pH 5.2 e 2.5 volumes de etanol de 95 % frio. Após incubação por pelo menos 1 h em -20°C, o DNA foi peletizado pela centrifugação (5000g para 20 minutos em 4°C), enxaguado com 10 etanol a 70 % de mL, seco pelo ar e resuspenso em 1 mL do tampão de TE. O RNA foi digerido pela adição de Ribonuclease A (Sigma-Aldrich) (concentração final de 0.1 mg/mL) e incubação em 37°C durante 1 hora. A Ribonuclease foi removida extraindo com 1 volume do fenol saturado em tampão e 1 volume do tampão fenol saturado:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1). O DNA foi precipitado com 0,1 volumes de acetato de sódio 3 M, pH 5,2 e 2,5 volumes de etanol frio a 95 %, peletizado pela centrifugação, enxaguaram com o etanol de 70 %, seco pelo ar e resuspenso em 50 pL do tampão TE. A concentração de DNA foi determinada medindo a absorvância da solução em 260 nm (p. C1 em Sambrook.et al, 1989).

Um fragmento de DNA compreendendo a codificação de sequência do xyr1 e terminador nativo (SEQ ID N°: 23) foi amplificado do DNA genômico do T. reesei Platinum ® Taq DNA polimerase (Invitrogen) e seguido dos iniciadores: amplificação de iniciador direto Xyr1 CATATGTTGTCCAATCCTCTCCG (SEQ ID N°:9) e amplificação de iniciador reverso Xyr1 GCGGCCGCGGTACCTACAGCCATGCTCATCGTGC (SEQ ID N°: 10). Os sítios de restrição de Ndel e Kpnl-Notl foram acrescentados nas extremida-

50/66 des 5' e 3' da codificação de sequência xyr1 e fragmento de terminador nativo, respectivamente. O PCR foi executado de acordo com o protocolo de fabricante de enzima com uma temperatura de recozimento de iniciador de 60°C e 4 minutos de tempo de extenção para 30 ciclos. Os produtos de reação de PCR então foram corridos em 1 % gel de agarose de TAE e um amplicon de 3,5 KBs foram extraído em gel usando Wizard SV Gel e Sistema de Limpeza de PCR (Promega).

Exemplo 3.2: Construção dos plasmídios.

O produto de PCR contendo a região de codificação de xyr1 (SEQ ID N°:24) foi ligado no pGEM ®-T Easy Vector (Promega) gerando pGEM-xyrf-t. O promotor beta-xilosidase induzível 1 (Pbxll, SEQ ID 26) foi amplificado do T. reesei DNA genômico usando Platinum® Taq DNA polimerase (Invitrogen) e os seguintes iniciadores: amplificação de iniciador direto Pbxll 5 'GGTACCCAATTGAGAGCTTGTCTGCCTTGATTACCATCC-S' (SEQ ID N°: 13) e amplificação de iniciador reverso 5' AAGCTTGCGGCCGCCATATGCGTCCGGCTGTCCTTCAATGG-S' (SEQ ID N°: 14). Estes iniciadores também acrescentaram Kpn1 e os sítios de restrição Ndel-Notl-Hindlll foram introduzidos nas extremidades 5' e 3', respectivamente, dos fragmentos promotores amplificados. A reação de PCR foi executada de acordo com as recomendações de fabricante de enzima com uma temperatura de recozimento de iniciador de 51,5°C e 2,5 minutos de tempo de extenção para 30 ciclos. O Pbxl de 1,5 KBs o produto de PCR de foi purificado usando o Wizard SV Gel e Sistema de limpeza de PCR (Promega) e clonado no pGEM ®-T Easy Vector (Promega) resulta na geração do vetor pGEM-Pbxl1. Após digestão deste vetor com as enzimas de restrição Kpnl e Hindlll, o Pbxl 1 fragmento promotor foi extraído em gel o usando do Wizard SV Gel e Sistema de limpeza de PCR (Promega) e clonado nos sítios correspondentes de pUCI19 vetor que gera pUCI \9-? plasmídio de bxl1. O plasmídio pGEM-xyr1-t foi digerido com Ndel e enzimas de restrição Kpnl, o fragmento xyr1 foi separado por gel de agarose eletrophoresis e gel extraído usando Wizard SV Gel e Sistema de Limpeza de PCR (Promega).

51/66

O fragmento foi clonado em sítios correspondentes de pUC119-Pbxl1 de geração de plasmídio pUC 119-Pbxl1-xyr1-t plasmídio.

O cassete de marcador selecionável conferindo resistência à higromicina foi isolado de pHPT136 (descrito na Patente dos Estados Unidos N°. 6.015.703) com enzimas de restrição Xhol e BgHI. O fragmento Ppgkhph-Tcb/rt foi purificado em gel e ligado nos sítios Xhol e BamHI do vetor pSP72 gerando o vetor pSP-hph. O pUCI19-Pbxl-xyr1-t foram digeridos com a enzima de restrição Kpnl e fragmento de aprox. 5,0 kb contendo cassete de expressão xyr1 foi purificado em gel e ligado no sítio Kpnl de pSP-hph vetor para gerar o pSP-bxl:xyr7-hph vetor de transformação do T. reesei (Figura 4A).

O vetor de transformação PPbxl-xyr1-pyr4 do T. reesei foi gerado como se segue. Plasmídio pNcBgl-NSN (r) * (descrito em Patente dos Estados Unidos N°. 7.456,005) contendo o gene pyr4 da Neurospora crassa foi parcialmente digerido com a enzima de restrição Kpnl. O plasmídio de 6.2kb linearizado foi eletroforeticamente separado no gel de agarose de 1 % e purificado usando o Wizard SV Gel e Sistema de Limpeza de PCR (Promega). O fragmento Pbxl-xyr1-t foi isolado após digestão completa de pUCI19-Pbxl-xyr1-t com enzima de restrição Kpnl e purificação de gel como descrito acima. O cassete de expressão xyr1 5.0 KBs foram ligados no pNcIBgl-NSN (r) * linearizado gerando o vetor de transformação final pPbxl:xyr1-pyr4 (Fig. 4A).

Exemplo 4: Geração de fungo filamentoso hospedeiro modificado sobreexpressando fator de transcrição de Xyr1.

O vetor de transformação pPbxl-xyr1-pyr4 foi introduzido em cepas do T. reesei P285-6aux e P491P6 e o vetor de transformação pPSbxl:xyr1-hph foram introduzidos na cepa tipo selvagemRutC30 usando PEG método de transformação de protoplasto mediado. Aproximadamente 5 x 10⁶ esporos de esporos de cepa selecionados foram plaqueados para o celofane estéril colocado em PDA complementado com 5 uridina de mM e incubados durante 20 horas em 30°C. Os discos de celofane com micélios foram transferidos para 10 mL de uma solução de preparação de protoplasto contendo

52/66

7.5 g/L Driselase e 4 beta-glucanase g/L (InterSpex Products Inc, Cat. N° 0465-1 e 0439-2, respectivamente) em tampão de fosfato de potássio de 50 mM, pH 6.5 contendo sulfato de amônio de 0.6 M (Tampão P). Os micélios foram digeridos durante 5 horas em 28°C com a agitação doce em 60 rpm.

Os protoplastos foram coletados pela centrifugação em 1000-1500 x g para 10 minutos na temperatura ambiente e lavados com 5 ml_ do Tampão P. A pílula foi resuspensa em 1 mL do tampão STC (sorbitol de 1.2 M, 10 mM CaCI₂, 10 mM Tris-HCL, pH 7.5), separado de micélios não digeridos pela filtração através de 60 MIRACLOTH ™ estéril e coletado em um tubo de mi10 crocentrifugadora estéril. Para a transformação, 0,1 mL da suspensão de protoplastos (aproximadamente 5 x 10⁶ protoplastos) foi combinado com 10 pg do vetor de linearizado DNA, e 25 pL da solução de PEG (PEG 4000 de 25 %, 50 mM CaCfe, 10 mM Tris-HCI, pH 7,5). Os protoplastos com DNA foram incubados no gelo de 30 minutos então 1 mL da solução de PEG foi 15 acrescentado e a mistura incubada para 5 minutos na temperatura ambiente.

A mistura de transformação foi diluída com 2 mL de sorbitol a 1,2 M na solução de PEG.

Quatro alíquotas de 0,75 mL da mistura de transformação com plasmídio pPbxl-xyr/-pyr4 e protoplastos da cepa P285-6aux ou P491P6 20 foram acrescentados em 25 mL do meio de ágar-ágar MMSS fundido (veja abaixo) esfriou a aproximadamente 47-50°C e a suspensão de protoplastos foi vazada sobre ágar-ágar de MM (veja abaixo). As placas foram incubadas em 30°C até que o crescimento de colônia fosse visível. Transformante foram transferidos para placas individuais contendo ágar-ágar de MM e permi25 tidos para esporular. Os esporos foram coletados e plaqueados na alta diluição em agar-agar de MM para isolar o homocarionte transformante, que então foram plaqueados para PDA (Difco) e incubados em 30°C para esporulação e análise genética subsequente.

Quatro alíquotas de 0,75 mL da mistura de transformação com 30 protoplastos RutC30 e plasmídio vSP-bxl.xyrf-hph foram acrescentadas em 25 mL do meio PDA esfriado a aproximadamente 47-50°C e a suspensão de protoplastos foi vazada em 150 placas de Petri de diâmetro de mm. Após 5

53/66 incubação h em 30°C, 25 mL do meio de cobertura contendo 80U/mL da higromicina foram acrescentados. As placas foram incubadas em 30°C até que o crescimento de colônia fosse visível. Transformante foram transferidos para placas individuais contendo ágar-ágar de PDA com 40 U/ml da higromi5 cina para seleção secundária. O estável isolado transformante foi transferido para o meio PDA e permitido para esporular. Os esporos foram coletados e plaqueados na alta diluição em PDA com 40 U/mL da higromicina para isolar o homocarionte transformante, que então foram plaqueados para PDA (Difco) e incubados em 30°C para esporulação e análise genética subsequente.

Meio mínimo (MM) ágar-ágar:

Componente*	Quantidade para 1L de meio
KH2PO4	10g
(NH4)2SO4	6g
Na3Citrato.2H2O	3g
FeSO4.7H2O	5 mg
MnSO4.7H2O	1,6 mg
ZnSO4.7H2O	1,4 mg
CaCI2.2H2O	2 mg
Agar	20 g
20% Glicose f.s.	50 ml
1 M MgSO4.7H2O f.s.	4 mL
	pH para 5,5

Componente	Concentração final
Glicose	10 g/L
Xilose	10 g/L
Celobiose	2,5 g/L
Sulfato de amônio	6 g/L
3xNa.Citrato di-hidratado	3 g/L
KH2PO4	10 g/L
MgSO4.7H2O	4 mM
CaCI2.2H2O	2 mg/L

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Componente	Concentração final
ZnSO4.7H2O	1,4 mg/L
FeSO4.7H2O	5 mg/L
MnSO4.7H2O	1,6 mg/L

*0 ágar-ágar MMSS contém os mesmos componentes que ágar-ágar MM mais o sorbitol de 1,2 M, 4 mM MgSO₄, 1 g/L YNB (base nitrogenada de levedura sem Aminoácidos da DIFCO. Cat. N° 291940) e 0,12 g/L aminoácidos (-Ura DO Complemento da CLONTECH. Cat No.8601-1).

Exemplo 5: caraterização genética de fungos filamentosos hospedeiros modificados

Exemplo 5.1: Confirmação de integração de vetor em genoma do T. reesei

A presença ou a ausência do cassete de expressão Pbxl:xyrí em fungos filamentosos hospedeiros modificados isolados foram avaliadas por PCR em amostras de DNA genômicas isoladas usando iniciadores específicos como descrito abaixo. Para o mitoticamente de extração de DNA genômico estável transformante foram esporulados em agar-agar de Dextrose de Batatas. Os esporos foram coletados recobrindo as placas PDA com 1 mL do meio de caldo de Dextrose de Batatas (PDB) e germinaram pela incubação em 30°C para 24-36 h sem agitação. Os micélios foram centrifugados em 10.000 rpm em uma microcentrífuga e sobrenadante descartado. As pílulas foram resuspensas em 0.25 mL do tampão de lise de RNA (Stratagene kit de isolamento de RNA Cat. N° 400800) e o volume igual de pérolas de vidro foi acrescentado a cada suspensão de célula. Os tubos de microcentrifugadora foram agitados em vortex com a velocidade máxima de 3 minutos para tosquiar os micélios. Um volume igual de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico foi acrescentado e os tubos de microcentrifugadora agitados em vortex por 30 segundos. Finalmente, 0,4 mL do tampão de TE, o pH 7,5 foi acrescentado e os tubos de microcentrifugadora agitados em vortex para de 30 segundos. A fase aquosa foi separada pela microcentrifugação em 13.000 rpm de 10 minutos e transferida para tubos frescos. O DNA genômico foi precipitado acrescentando 1/10 volume de 3M acetato de sódio (pH 5,2) e 2,5 volumes de etanol de 100 %. DNA foi peletizado pela centrifuga-

55/66 çâo em 13.000 rpm de 10 minutos. Pellers foram lavados com o etanol de 70 %. seco em temperatura ambiente e logo dissolvido em 30-40 pL de água estéril contendo RNaseA (0,005 mg/mL). Um microlitro de DNA genômico foi usado em seguintes reações de PCR.

A análise de PCR do DNA genômico isolado de fungos filamentosos hospedeiros modificados putativos foi usada para confirmar a integração do P&t.-xyrf cassete de expressão. O PCR foi executado usando iniciador direto bxl-xyr1 TTGAGCGCAGCATCACTGTGTAGA (SEQ ID N°: 17) e iniciador reverso bxl-xyr1 AACGGATCTGCGTCTGTGTCTGAT SEQ ID N°: 18. Foi usado o GoTaq polimerase de DNA (Promega) com uma temperatura de recozimento de 55°C 1.5 minutos de tempo de extensão de 30 ciclos de amplificação. Os transformantes positivos foram identificados pela amplificação de alguns produtos de PCR de 1 KB contendo cassetes de expressão de Pbx.xyrí de DNA genômico. Nenhum produto de PCR de 1 kb foi detectado para cepas parentais P285-6aux (Figura 4B), RutC30 e P491P6 (dados não mostrados) indicando a ausência de cepas de DNA recombinante. As P692B, P692A, RutC30-R3, P1194E, P1194F, P1197B foram identificadas como positivas quando se modificou o fungo filamentoso hospedeiro e selecionou para a análise adicional.

Exemplo 5.2: Níveis de expressão de xyr1 e genes da (hemi)celulase.

Para determinar níveis de transcrição Xyr1 e selecionar genes da (hemi)celulase, o RNA total foi isolado de micélios de fungos filamentosos hospedeiros modificados e cepas parentais cultivadas no meio de Crescimento Líquido.

Meio de crescimento líquido:

Componente Concentração Final

Glicose 10 g/L Xilose 10 g/L

Celobiose 2.5 g/L Sulfato de amônio xNa-citratodihidratado

Componente g/L g/L

Concentração Final

56/66

KH2PO4	10 g/L
MgSO4.7H2O	4 mM
CaCI2,2H2O	2 mg/L
ZnSO4 ,7H2O	1.4 mg/L
FeSO4.7H2O	5 mg/L
MnSO4.H2O	1.6 mg/L

Os tubos de cultura contendo 5 mL do meio de Crescimento Líquido foram inoculados com esporos de fungos filamentosos hospedeiros modificados e sacudidos em 30°C durante 4 dias. A biomassa foi filtrada a10 través de papel de microfibra GF/A, lavado com a água estéril e congelada no nitrogênio líquido. O isolamento de RNA e reações de qRT-PCR foi executado como descrito no Exemplo 2.2. Os pares de iniciadores usados para a avaliação de níveis de transcrição de genes xyr1, cel7a, cel7b, xyn1, xyn2 e bxl1 são listados na Tabela 6.

Tabela 6: Os iniciadores usados para a análise de qRT-PCR de fungos filamentosos hospedeiros modificados sobreexpressando fator de transcrição Xyr1 e fungos filamentosos parentais.

SEQ ID	Nome do iniciador	Sequência de iniciadores
1	Ntf2F	ACAGAGTTGGCATTGTAGACAGCG
2	Ntf2R	CGAGTAAAGCACACAAACCGCCAA
3	Xyr1 qPCR iniciador direto	AGCCAGATTCTCGAGTTTGACCCT
4	Xyr1 qPCR iniciador reverso	GCAAGCTTCGTGTGCCCTAACAAT
5	Ace1F	AGAAGGAAATGGACCGCCACATCA
6	Ace1R	AGTTCGACTCACGCTTCGACTTGT
7	Cbh1 qPCR iniciador direto	TACTCTGGCAACGAAGCTCAACGAT
8	Cbh1 qPCR iniciador reverso	GCCACAGCATGTTGGCGTAGTAA
11	Cel7b qPCR iniciador direto	ATCACCCGCAAGTACCAGCAAA
12	Cel7b qPCR iniciador reverso	CTGGCTGTTGTCGTTCCAAATGCT

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SEQ ID	Nome do iniciador	Sequência de iniciadores
15	Xyn1 qPCR iniciador direto	TCATCAACTTCTCGGGCAGCTACA
16	Xyn1 qPCR iniciador reverso	AGGTGCCAAAGTTCTCGACGATGT
19	Xyn2 qPCR iniciador direto	ACGGCTACTTCTACTCGTACTGGA
20	Xyn2 qPCR iniciador reverso	TGTAGCTGCCCGAGAAGTTGATGA
21	Bxl1 qPCR iniciador direto	TATACGGCCATGCTGTTTGTTCGC
22	Bxl1 qPCR iniciador reverso	TGGAAGAGTGACCAGGCTTGATGT

Todos os fungos filamentosos hospedeiros modificados testados contendo cassete de expressão de Pbxl.xyrf mostraram o aumento pelo menos de 2 vezes em níveis de transcrição xyr1 quando cultivado em uma fonte de carbono compreendendo glicose, HDC (xilose) e CIC (celobiose) em relação xyr1 níveis de transcrição nos fungos filamentosos parentais correspondentes cultivados com a mesma fonte de carbono. Por exemplo, os fungos filamentosos hospedeiros modificados, cepas P692B e RutC30-R3, produziram níveis mais altos pelo menos de 2 vezes da transcrição xyr1 quando cultivado em 100 % de xilose e 100% de arabinose comparando com os seus fungos filamentosos parentais, cepas P285-6 e RutC30 (As Figuras 5A e B). Isto resultou no aumento significante em cel7a, cel7b e níveis de transcrição xyn1 nas cepas de sobreexpressão de Xyr1 em relação aqueles na cepa parental correspondente quando a fonte de carbono de fermentação foi HDC de 100 % (xilose ou arabinose). O efeito mais brando da sobreexpressão xyr1 foi observado aos níveis de transcrição de bxl1 e xyn1.

Exemplo 6: Efeito da sobreexpressão do xyr1 na produção de celulase por fungos filamentosos hospedeiros modificados.

Os tipos diferentes de fontes de carbono (por exemplo glicose + CIC, 100% de xilose, 100% de arabinose e uma mistura de 50% em peso de glicerol, 25 % em peso de glicose e 25% em peso de xilitol) foram usados em 14 fermentações L. Todas as fermentações e a avaliação do q_p, biomas-

58/66 sa e produção de proteína foram executadas como descrito no Exemplo 2.1. As cepas do T. reesei altamente produtivas na glicose + CIC normalmente produzem 30-45 g/L da proteína total durante 160-180 horas em 14 fermentação de escala poiloto L. O máximo q_p é conseguido em aproximadamente 40-60 horas de tempo de fermentação e declínios no fim da fermentação. As cepas parentais, P285-6, P491P e RutC30, mostraram indicadores de desempenho de fermentação habituais na glicose + CIC (Tabela 2) que sugere que a introdução da transcrição adicional do gene xyr1 sob controle o promotor oibxll não afetou significativamente a expressão de genes da celulase sob estas condições. Contudo, desde que a extra transcrição Xyr1 em P692B é expressada sob o controle do promotor bxl1, e o gene bxl1 é pobremente expressado durante a fermentação na glicose + CIC como uns alimentos, é possível que os níveis de expressão do fator de transcrição xyr1 não aumentassem significativamente e, assim, não foi suficiente aumentar a produção de celulase.

O máximo q_p e a quantidade da proteína total (em g/L) produzido pelos fungos filamentosos hospedeiros modificados, cepas P692B, P692A, RutC30-R3, P1197 B, P1194E e P1194F, durante as fermentações no 100% de xilose aumentaram aproximadamente de 4 e 3 vezes em comparação com aqueles dos fungos filamentosos parentais correspondentes, cepas P285-6, RutC30 e P491P, respectivamente (Tabela 2). Além disso, os fungos filamentosos hospedeiros modificados acumularam significativamente menos biomassa em fermentações com o 100% de xilose como fonte de carbono do que os seus fungos filamentosos parentais correspondentes (Tabela 2).

Os benefícios semelhantes de q_p aumentado e rendimento de proteína foram observados quando os fungos filamentosos hospedeiros modificados, cepas P692A e RutC30-R3, foram cultivados em outro HDC (100% de arabinose ou uma mistura com 50% em peso de glicerol/25 % em peso de glicose e 25% em peso de xilitol) como fonte de carbono sobre o seu respetivo fungo filamentoso parental, cepas P285-6 e RutC30 (Tabela 2). Em alguns exemplos, como quando o arabinose foi usado como o carbono aze-

59/66 dado, o processo de fermentação com o fungo filamentoso hospedeiro modificado (cepa P692A) produziu mais, não menos, biomassa do que o processo com o fungo filamentoso parental correspondente (cepa P285-6) além da realização de rendimentos de proteína mais altos (Figura 10). Isto manifesta 5 em uma média mais alta q_p, indicando que a sobreexpressão de xyr1 ativa não só a expressão de genes da celulase em culturas alimentadas com o arabinose, mas também um metabolismo mais eficaz total do arabinose.

Exemplo 7: Análise de celulase e componentes de hemicelulase em misturas de celulase produzida por fungos filamentosos hospedeiros modificados so10 breexpressando Xyr1.

Exemplo 7.1: Determinação das proporções relativas de celulase e misturas componente de celulases de hemicelulase produzidas em fermentações de batelada alimentada de 14L.

As concentrações relativas (% em peso da proteína secretada 15 total) de quatro componentes de celulase (Cel7A, Cel6A, Cel7B, Cel5a) e os dois componentes de xilanase, (Xyn1 e Xyn2) foram determinadas por ELISA. Os filtrados de cultura de fermentações de 14 L e padrões componentes purificados foram diluídos de 0,01 a 10 pg/mL na solução salina tamponada de fosfato, pH 7,2 (PBS) e incubados durante a noite a 4°C em microplacas 20 (Coadjuvante EIA N° 9018). Estas placas foram lavadas com PBS contendo

Tween-20 de 0,1 % (PBS/Tween) e logo incubados em PBS contendo albumina de soro bovina de 1 % (PBS/BSA) durante 1 hora na temperatura ambiente. Os poços da microplaca bloqueados foram lavados com PBS/Tween. Os antisoros policlonais de coelho específicos para Cel7A, Cel6A, Cel7B, 25 Cel5a, Xyn1 e Xyn2 foram diluídos em PBS/BSA, acrescentados a microplacas separadas e incubados por 2 horas na temperatura ambiente. As placas foram lavadas e incubadas com um anticorpo de anticoelho de cabra ligado ao peroxidase de rábano bravo (Sigma N°A6154), diluiu 1/2000 em PBS/BSA, durante 1 hora na temperatura ambiente. Após lavagem, a tetra30 metilbenzidina foi acrescentada a cada placa e incubada por 30 minutos na temperatura ambiente. A absorvância em 360 nm foi medida em cada um poço e convertida na concentração de proteína usando curvas padrão de

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Cel7A, Cel6A, Cel7B, Cel5a, Xyn1 e Xyn2. A concentração de cada componente foi expressada como os por cento de massa do componente como uma fração da proteína secretada total. Em uma maneira de analisar estes resultados, as concentrações de Cel7 A, Cel6A, Cel7B e Cel5 A foram so5 madas em cada respetiva enzima e coletivamente referem como a celulase na Tabela 3. Similarmente as concentrações de Xyn1 e Xyn2 foram somadas em cada respetiva enzima e coletivamente referem como o Xilanase na Tabela 3. O uso destes termos não contém que não há outras proteínas secretadas, que não foram testadas para aqui por ELISA, que também pode 10 considerar-se a celulase ou o xilanase.

Os resultados de ELISA são apresentados nas Figuras 9B, 10B e 11B. Estes resultados mostram a proporção relativa (% em peso da proteína secretada total) de Cel7A, Cel6A, Cel7B, Cel5a, Xyn1 e Xyn2 na mistura de celulase produzida em processos de fermentação usando hospedeiro 15 modificado ou fungos filamentosos parentais com a fonte de carbono compreendendo HDC ou CIC. A proporção relativa de celulase representativo (Cel7A+Cel6A+Cel7B+Cel5a) e xilanase representativo (Xyn 7+Xyn2) em % em peso da proteína secretada total é mostrada na Tabela 3.

A proporção relativa de componentes de celulase produzidos pe20 los fungos filamentosos parentais, cepas que P285-6 e RutC30, durante em uma processo de fermentação onde a fonte de carbono compreendeu só HDC foi 3-a de 5 vezes mais baixo quando em comparação com isto produziu em um processo de fermentação onde a fonte de carbono compreendeu a glicose + CIC (As Figuras 9B e 10B e a Tabela 3). Particularmente, a pro25 porção de xilanase (Xyn1 + Xyn2) aumentada de aproximadamente 2 % em peso de proteína secretada total em glicose + CIC a aproximadamente 35 % em peso em HDC (As Figuras 9B, 10B e a Tabela 3).

A sobreexpressão de xyr1 nos fungos filamentosos hospedeiros modificados (cepas P692B e RutC30-R3) resultou aumentos de 1,5 a 3 ve30 zes na produção de componentes de celulase (Cel7A, Cel6A, e Cel7B) em fermentações com 100% de xilose ou arabinose sobre a produção de componentes de celulase pelo fungo filamentoso parental correspondente (cepa

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Ρ285-6 e RutC30) nas mesmas fontes de carbono (Figuras 9B e 10B e a Tabela 3). Além disso, a proporção relativa de componentes de celulase na mistura de celulase produzida por fungos filamentosos hospedeiros modificados sobreexpressando xyr1 (treina P692B e RutC30-R3) reduzido menos 5 marcadamente, e a proporção do xilanase aumentou menos marcadamente quando a fonte de carbono fornecida ao processo de fermentação foi 100% de arabinose ou xilose comparando com a mistura de celulase produzida pelas mesmas cepas em uma glicose usada em processo de fermentação + CIC como a fonte de carbono (Figuras 9B e 10B e a Tabela 3).

As fermentações em açúcar puro e mistura de glicerol como uma fonte de carbono revelaram que a produção da hemicelulase significativamente diminuiu quando a 50 % de glicose/25 % de glicerol/25% de xilitol foi usada como uma fonte de carbono em comparação com o produzido na 50 % de glicose/25 % de glicerol/25 % de xilose como uma fonte de carbono 15 (Tabela 3, a Figura 9B).

Exemplo 7.2: Teor de beta-xilosidase em misturas de celulase produzidas por hospedeiros modificados e fungos filamentosos parentais.

A concentração relativa da beta-xilosidase foi calculada usando

Agilent Bioanalyzer 2100 usando Kit de Proteína 230 como descrito no pro20 tocolo do fabricante. A beta-xilosidase, como % em peso da proteína total, produzida em cada fermentação é indicada na Tabela 3. Como esperado todos os fungos filamentosos parentais (cepas P285-6, RutC30 e P491P) misturas de celulase produzidas com uma alta proporção relativa de betaxilosidase em processos de fermentação usando HDC como uma fonte de 25 carbono. Fungos filamentosos hospedeiros modificados sobreexpressando xyr1 (cepa P692B, RutC30-R3, P1194E, P1194F e P1197B) misturas de celulase produzidas com até proporções relativas mais baixas de 15 vezes de proporções de beta-xilosidase em fermentação processada usando o mesmo HDC que as fontes de carbono (Tabela 3). Contudo, a proporção relativa de 30 Cel 74A (xiloglucanase) nestas misturas de celulase (produzida pelos fungos filamentosos hospedeiros modificados) aumentou até 12 % em peso da proteína total enquanto esta proteína não foi detectada em misturas de celulase

62/66 produzidas pelos fungos filamentosos parentais correspondentes cultivados em todos os tipos de fontes de carbono testadas (dados não mostrados).

Fungos filamentosos hospedeiros modificados (cepas P692B e RutC30-R3), quando cultivado na fermentação processa no qual a fonte de carbono foi 50% em peso de glicerol/25 % em peso de glicose/25% em peso de xilitol, misturas de celulase produzidas com proporções relativas também reduzidas da beta-xilosidase em comparação com processos de fermentação nos quais a fonte de carbono foi o 100% de xiiose ou 50% em peso de glicerol/25 % em peso de glicose/25% em peso de xiiose (Tabela 3).

Exemplo 8: A atividade de hidrólise de celulose de misturas de celulase produzida por fungos filamentosos hospedeiros parentais e modificados.

A atividade de hidrólise de celulose de misturas de celulase produzidas por funi filamentoso hospedeiro modificado sobreexpressão xyr1 e correspondência parental filamentoso em processos de fermentação usando fontes de carbono diferentes foi avaliada como descrito no Pedido de Patente dos Estados Unidos N° 11/846.653. A mistura de celulase produzida de cada processo de fermentação foi testada no ensaio de hidrólise de celulose misturado de 0,25 mL. As misturas de celulase foram diluídas no tampão citrato contendo benzoato de sódio de 0,5 %, completaram com uma preparação de beta-glicosidase de Aspergillus niger e incubados com a palha de trigo pré-tratada de ácido. O pré-tratamento foi executado segundo Foody, Patente dos Estados Unidos N°. 4.461.648. A incubação foi em 50°C por 24 horas e o nível de conversão de celulose visado foi maior do que 70 %. A atividade das misturas de celulase foi calculada determinando a quantidade da enzima necessária para conseguir o nível de conversão de celulose visada. A atividade associada com misturas de celulase produzidas por fermentações de fungos filamentosos hospedeiros modificados parentais (cepas P285 - 6, P692A e P692B) foi normalizada à atividade de hidrólise de celulose de misturas de celulase produzidas pelos fungos filamentosos parentais (cepa P285-6) glicose usando + CIC como fonte de carbono (fermentação número 2404). Similarmente a atividade associada com misturas de celulase produzidas por fermentações de fungos filamentosos hospedeiros parentais

63/66 e modificados (cepas RutC30, RutC30-R3, M2C38, P491P, P1194E, P1194F e P1197B) foi normalizada à atividade de hidrólise de celulose de misturas de celulase produzidas pelos fungos filamentosos parentais (cepa RutC30) glicose usando + CIC como fonte de carbono (fermentação número 4279). Estes resultados mencionam-se como ‘Atividade Relativa' nas Figuras 9 A, 11 A e 12 A e na Tabela 3.

Um pequeno aumento na atividade da mistura de celulase produzida por P692B (fermentação números 3796 e 3963) foi observado, em relação à atividade da mistura de celulase P285-6, quando a glicose + CIC foi usada como a fonte de carbono da fermentação (Figura 9a e a Tabela 3). Isto provavelmente reflete uma leve melhora na composição de celulase em relação a proteína secretada total como discutido no Exemplo 7.1.

Em consequência da proporção significativamente aumentada de componentes de celulase na proteína de mistura de celulase produzida por cepa P692B em processos de fermentação usando 100% de xilose ou arabinose, a atividade de hidrólise de celulose aumentada de 4 e de 2 vezes respectivamente em comparação com aquela de mistura de celulase produzida pela cepa parental P285-6 em um processo de fermentação semelhante (Figura 9A e a Tabela 3).

Similarmente a composição de celulase melhorada produzida pela cepa que P692B em uma processo de fermentação no qual a fonte de carbono compreendeu xilitol em vez de correlatos de xilose com até o aumento de 2 vezes na atividade de hidrolisando de celulose da mistura de celulase produzida por este fungo filamentoso hospedeiro modificado comparando com aquela da mistura de celulase produzida pelo fungo filamentoso parental (cepa P285-6) em processos de fermentação semelhantes, (tabela 3 e a Figura 9A).

A eliminação do xilanase 2 na cepa P491P não modificou a proporção relativa de componentes de celulase nas misturas de celulase em comparação com isto nas misturas de celulase produzidas pela sua cepa de pais M2-C38. Isto é provável devido ao pH de fermentação quieto no qual principalmente o xilanase 1 é expressado. Contudo, como observado com

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Ρ692Β e RutC30-C3 modificou fungos filamentosos hospedeiros, a sobreexpressão do Xyr1 possivelmente resulta na perda do pH a expressão dependente e ambos os xilanases são produzidos na abundância semelhante. Também, a eliminação de xyn2 na presença da sobreexpressão de Xyr1 resultou em aproximadamente aumento de 3 vezes na proporção de componentes de celulase na mistura de celulase e assim, melhorou a atividade da celulase (Tabela 3).

Também, a ausência da diferença significante na proporção de componentes de celulase nas misturas de celulase produzidas por cepas M2-C38 e cepas P491P foi refletida na celulase semelhante atividade hidrolítica. A sobreexpressão do Xyr1 na presença da eliminação xyn2 aumentou a atividade da celulase até de 2 vezes nas misturas de celulase produzidas pelas cepas de hospedeiro filamentoso fúngico modificadas P1194E, P1194F e P1197B transformante em comparação com aquela das misturas de celulase produzidas por cepas parentais M2-C38 e P491P.

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Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Processo de fermentação de batelada alimentada ou contínua para a produção de uma mistura de celulase, caracterizado pelo fato de que compreende:

   (a) a transformação de um fungo filamentoso hospedeiro com um construto genético Xyr1 de SEQ ID NO: 24, no qual uma sequência de ácido nucleico que codifica o fator de transcrição Xyr1 de Tríchoderma reesei está operacionalmente ligada a SEQ ID NO: 26, uma sequência de ácido nucleico promotora do gene da beta-xilosidase I de Tríchoderma reesei·, (b) a seleção daqueles transformantes da etapa (a) contendo o construto genético Xyr1; e (c) o cultivo dos transformantes selecionados na etapa (b) em um meio compreendendo uma fonte de carbono, em que a fonte de carbono contém de 60% em peso a 100% em peso de um carboidrato derivado de hemicelulose selecionado do grupo consistindo de D-xilose, xilooligossacarídeos, L-arabinose ou combinações dos mesmos, e de 0% em peso a 3% em peso de um carboidrato indutor de celulase selecionado do grupo consistindo de celulose, soforose, celobiose, lactose, genciobiose, ou combinações dos mesmos para produzir uma mistura de celulase;

   em que o processo de fermentação produz pelo menos 10 g/L da mistura de celulase, os componentes de celulase representam pelo menos 40% da proteína total na mistura de celulase, e a mistura de celulase exibe pelo menos 1,7 vezes mais atividade da celulase do que uma mistura de celulase produzida pelo fungo filamentoso hospedeiro quando cultivado no mesmo meio.
2. 2. Processo de fermentação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de transformação também compreende a modificação de um ou mais genes no dito fungo filamentoso hospedeiro que codifica uma enzima hemicelulase selecionada do grupo consistindo de xilanases, beta-xilosidases, alfa-arabinofuranosidases, betamananases, alfa-glucuronidases, esterase de acetilxilano e uma combinação dos mesmos, para que o dito fungo filamentoso hospedeiro seja deficiente

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   2/3 na expressão de uma ou mais enzimas hemicelulase.
3. 3. Processo de fermentação, de acordo com a reivindicação de 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que apresenta um aumento de pelo menos 2 vezes na produtividade específica (q_P) em relação a um processo equivalente que utiliza o fungo filamentoso hospedeiro.
4. 4. Processo de fermentação, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o fungo filamentoso hospedeiro é uma espécie de Trichoderma, Hypocrea, Aspergillus, Humicola, Fusarium. Penicillium, Neurospora, Phanerochaete, Agaricus, Chaetomium, ou Magnaporthe.
5. 5. Processo de fermentação de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o fungo filamentoso hospedeiro é Trichoderma reesei ou Hypocrea jecorína.
6. 6. Processo de fermentação, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o meio compreende uma ou mais fontes de carbono adicionais selecionadas dentre o grupo consistindo em glicerol, um ou mais açúcares de álcool, um ácido orgânico e combinações dos mesmos.
7. 7. Processo de fermentação, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a fonte de carbono contém 0% em peso de carboidrato de indução da celulase.
8. 8. Processo de fermentação de batelada alimentada ou contínua para a produção de uma mistura de celulase, caracterizado pelo fato de que compreende:

   (a) a transformação de um fungo filamentoso hospedeiro com um construto genético Xyr1 de SEQ ID NO: 24, no qual uma sequência de ácido nucleico que codifica o fator de transcrição Xyr1 de Trichoderma reesei está operacionalmente ligada a SEQ ID NO: 26, uma sequência de ácido nucleico promotora do gene da beta-xilosidase I de Trichoderma reesei·, (b) a seleção daqueles transformantes da etapa (a) contendo o construto genético Xyr1; e (c) o cultivo dos transformantes selecionados na etapa (b) em

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   3/3 um meio compreendendo uma fonte de carbono, em que a fonte de carbono contém de 25% em peso a 100% em peso de xilitol ou arabinitol, 0% em peso de um carboidrato que induz a celulase selecionado do grupo consistindo de celulose, soforose, celobiose, lactose, genciobiose, ou combinações dos 5 mesmos, e de 0% em peso a 75% em peso de glicose, glicerol ou combinação dos mesmos, para produzir uma mistura de celulase;

   em que o processo de fermentação produz pelo menos 10 g/L da mistura de celulase, os componentes de celulase representam pelo menos 40% em peso da proteína total na mistura de celulase, e a mistura de 10 celulase exibe pelo menos 1,7 vezes mais atividade da celulase do que uma mistura de celulase produzida pelo fungo filamentoso hospedeiro quando cultivado no mesmo meio.
9. 9. Processo de fermentação, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a fonte de carbono contém de 0% em peso a 15 25% em peso de glicerol e de 0% em peso a 50% em peso de glicose.

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