TWI425089B - 具高活性之新穎纖維素酶 - Google Patents

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Description

具高活性之新穎纖維素酶
本發明大體上有關於纖維素酶，更特定而言，有關於具高度活性之新穎纖維素酶。
纖維素酶，纖維素(高度聚合之β-1,4-葡聚醣)-降解酶，一般包括纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase)(主要目標為結晶織維素)及內-1,4-β-內葡聚醣酶(主要目標為非結晶性織維素)。為了產生纖維素生物能源，鑑定出高活性纖維素酶以改善纖維素分解效率是很重要的。
在一方面，本發明有關於一種組成物，其包含：a)一第一纖維素酶，其包含一具有與SEQ ID NO：2至少95%、90%、85%、80%、75%或70%之序列同一性之胺基酸序列；及b)一第二纖維素酶，其包含一具有與SEQ ID NO：4至少95%、90%、85%、80%、75%、70%或65%之序列同一性之胺基酸序列。
另一方面，本發明有關於一種水解纖維素材料之方法。該方法包含暴露該纖維素材料至有效量之前述組成物。
另一方面，本發明有關於一種經分離之纖維素酶，其包含一具有與一選自由SEQ ID NO：2及4所構成之群組之胺基酸序列至少95%、90%、85%或80%同一性之胺基酸序列。
又另一方面，本發明有關於一種經分離之核苷酸序列，其編碼前述之纖維素酶。
又另一方面，本發明有關於一種表現一纖維素酶之重組載體，其包含：(a)至少一調控因子；及(b)一種編碼前述纖維素 酶之經分離之核苷酸序列，在轉譯框架中連結至該至少一調控因子。
又另一方面，本發明有關於一種經分離之纖維素酶，其自前述重組載體生成。
由較佳具體實施例之說明及隨後的圖式，將清楚呈現本發明之上述及其他態樣，雖然在不脫離本揭露內容新穎概念之精神與範圍下仍可做成變化例及修飾例。
附圖說明了本發明之一或多個具體實施例，並連同書面說明書，一起做為本發明原則的解釋。在可能的情況下，在全部圖式中使用相同的元件符號指涉相同或類似的元件。
本發明說明中之用詞通常具有在本技術領域中、在本發明內容中、及各用語所在之特定內容中的原始意義。某些用來描述本發明之詞彙將在以下或在發明說明書中討論，以對專門人員提供有關於本發明之描述的附加指南。為了方便，某些詞彙可能會以醒目標示，例如使用斜體及/或引號。醒目標示之使用並不影響一詞彙之範圍及意義；一詞彙之範圍及意義在同內容中係相同的，無論是否以醒目標示。可被理解的是，同樣的事情可用一種以上的方式說明。因此，可使用其他語言及同義字用於任何一或多個此處討論的詞彙，且一詞彙是否在此處被詳盡闡述或討論並不賦予任何特殊的意義。提供某些詞彙的同義字。一或多個同義字之敘述並不排除其他同義字之使用。在本發明說明書任一處，實例的使用包括此處所討論的任何詞彙的例子，係僅用於解說，並不限制本發明或舉例用辭彙之範圍及意義。同樣地，本發明並不受本發明說明書中所給的各種具體實施例。
除非另有定義，此處所有使用之技術及科學名詞具有與本發明所屬技術領域中熟習此藝者所一般性了解者相同的含意。如有矛盾的情形，以本文件(包括定義)為準。
本文所使用的「左右」、「約」或「大概」之用詞一般而言是 指在所給量或範圍之20%內、較佳為10%內、且更佳為5%內。此處所給的數值係大概的，意指即使沒有明確表達「左右」、「約」或「大概」之用詞，亦可以推斷。
「纖維素酶」乙詞是指一類可催化纖維素水解(cellulolysis，the hydrolysis of cellulose)之酶。基於催化反應的類型，纖維素酶有五個一般類型。內-纖維素酶打破內部鍵結以破壞纖維素的結晶結構並暴露個別纖維素多醣鏈。外-纖維素酶從內纖維素酶製造之曝露鏈之兩端切下2-4單位，造成四醣或雙醣，如纖維雙糖。有兩種主要的外-纖維素酶(或纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase)，縮寫為CBH)-一種從纖維素之還原端往前做用，一種從纖維素之非還原端往前做用。織維二糖酶或β -葡萄糖甘脢水解外-纖維素酶產物至個別單醣。氧化纖維素酶藉由自由基反應解聚纖維素，如纖維雙糖脫氫酶(受子)。纖維素磷酸酶使用膦酸鹽而非水來解聚纖維素。纖維素酶催化反應的三個類型為：(1)破裂存在於纖維素結晶結構中之非共價鍵交互作用(內-纖維素酶)；(2)水解個別纖維素纖維以將其碎成較小的糖(外-纖維素酶)；及(3)水解雙醣及四醣成葡萄糖(β -葡萄糖甘脢)。
「纖維素」乙詞是指一種具化學式(C6 H10 O5 )n 之有機化合物，其為一種多醣，數百至多於一萬之β (1→4)連結之D-葡萄糖單元之直鏈所構成。纖維素是綠色植物的主要細胞壁的結構成分。正在研究從能源作物轉換纖維素成生物燃料如纖維素乙醇做為替代能源來源。
「百分比同一性」乙詞是用來量化生物分子序列之間的同一性。就兩個自然發生的序列而言，百分比同一性係一事實性測量。此處所使用之「百分比序列同一性」等同於(相同殘基數除以兩個相比較之序列之平均長度)乘以100%。一查詢組中兩個不同序列之程度與兩者的演化距離相關。可線上使用NCBI BLASTX來獲得序列同一性。
本發明有關於發現兩種來自台灣白斑天牛甲蟲星天牛之纖維素酶。兩個纖維素酶都具有獨一無二之核苷酸序列，其與公共領 域揭露的所有基因有顯著不同(與所有公布於Discontinuous MegaBlast之基因有低於60%的相似性)。又，酶AmCel-5B是目前唯一從昆蟲鑑定出具外-纖維素酶活性之纖維素酶。
簡言之，本發明從台灣本土白斑天牛甲蟲，星天牛，中分離並選殖出不同糖苷水解酶家族(GHFs)之兩種新穎昆蟲內源性纖維素酶基因。經由在蠶中桿狀病毒表現及純化，製造出AmCel-45A而該蛋白質具有最強的內-聚葡萄糖酶活性。AmCel-5B具有較AmCel-45A高的結晶織維素水解活性。AmCel-5B係一獨一無二的纖維素酶，其含有內-聚葡萄糖酶、外-聚葡萄糖酶及某些半-纖維素酶活性。這些酶當與一般常用之商用纖維素酶合併時展現了強活性，其組合物在水解木質纖維素方面展現了較單獨使用CELLUCLAST® 1.5L時8倍強的活性。此發現在使用纖維素酶來製造生物能源之削減成本方面極為重要。因此，本發明在從稻桿，一種量多而先前被認為是廢物但能成為未來的潔淨能源的材料，產生生物能源方面具有極高的商用價值。
在一方面，本發明有關於一種組成物，其包含：a)一第一纖維素酶，其包含一具有與SEQ ID NO：2至少95%、90%、85%、80%、75%或70%之序列同一性之胺基酸序列；及b)一第二纖維素酶，其包含一具有與SEQ ID NO：4至少95%、90%、85%、80%、75%、70%或65%之序列同一性之胺基酸序列。
在本發明之一具體實施例中，該組成物包含：a)一第一纖維素酶，其包含一具有與SEQ ID NO：2至少95%、90%、85%或80%之序列同一性之胺基酸序列；及b)一第二纖維素酶，其包含一具有與SEQ ID NO：4至少95%、90%、85%、80%、75%、70%或65%之序列同一性之胺基酸序列。
在本發明之另一具體實施例中，前述之組成物可進一步包含至少一種金屬離子或一種抗氧化劑。
在本發明之另一具體實施例中，該組成物可進一步包含至少一附加商用纖維素酶。
另一方面，本發明有關於一種水解纖維素材料之方法。該方 法包含暴露該纖維素材料至有效量之前述組成物。
又另一方面，本發明有關於一種經分離之纖維素酶，其包含一具有與一選自由SEQ ID NO：2及4所構成之群組之胺基酸序列至少95%、90%、85%或80%同一性之胺基酸序列。
在本發明之一具體實施例中，該經分離之纖維素酶包含一具有與SEQ ID NO：2至少95%、90%、85%或80%之序列同一性之胺基酸序列。
在本發明之另一具體實施例中，該經分離之纖維素酶包含一具有與SEQ ID NO：4至少95%、90%、85%、80%、75%、70%，或65%之序列同一性之胺基酸序列。
在本發明之另一具體實施例中，該經分離之纖維素酶包含選自由SEQ ID NO：2及4所構成之群組之胺基酸序列。
又另一方面，本發明有關於一種經分離之核苷酸序列，其編碼如前述之纖維素酶。
在本發明之一具體實施例中，該經分離之核苷酸序列，其編碼如前述之纖維素酶，包含選自於SEQ ID NO：1及3之核苷酸序列。
又另一方面，本發明有關於一種表現一纖維素酶之重組載體，其包含：(a)至少一調控因子；及(b)一種編碼前述纖維素酶之經分離之核苷酸序列，在轉譯框架中連結至該至少一調控因子。
在本發明之一具體實施例中，該重組載體係桿狀病毒表現載體。
在本發明之另一具體實施例中，該表現一纖維素酶之重組載體：(a)至少一調控因子；及(b)一種前述之經分離之核苷酸序列，在轉譯框架中連結至該至少一調控因子。
又另一方面，本發明有關於一種經分離之纖維素酶，其自前述重組載體生成。
實例
無意限制本發明之範圍，有關於本發明之具體實施例之例示的器具，設備，方法及其等之相關結果提供如下。值得注意的是，標題或子標題可為便於閱讀方便而用於實例中，但不應限制本發明之範圍。再者，此處提出及揭露某些理論；然而，只要本發明是在根據本發明下實施而無考慮到特定理論或行為流程圖，不論這些理論正確與否，都不應限制本發明之範圍。
方法與材料
構築昆蟲cDNA庫及篩選候選基因
將白斑天牛甲蟲，星天牛，之幼蟲在乾燥冰上研磨並從整個樣本中分離出純mRNA。使用CREATORTM SMARTTM cDNA庫構築套組(Clontech)從mRNA中建立cDNA庫。基於GHF 45及GHF5真核纖維素酶之高度保守性的催化功能性區域來設計簡併引子。使用星天牛之總cDNA做為模板。使用簡併引子及DIG-dUTP來進行PCR放大以生成具DIG標記之雜交探針。這些探針被使用來偵測目標纖維素酶基因。含DIG陽性cDNA片段之菌落被進一步萃取、定序及分析。
昆蟲纖維素酶基因之5’端cDNAs(5’RACE)之迅速放大
使用SMARTTM RACE cDNA放大套組(Clontech)來放大目標cDNA之5’端。星天牛之mRNA做為第一股cDNA合成之模板。基於目標cDNA之序列設計基因專一性引子以放大5’片段。具編碼C末端多聚組氨酸標籤之附加序列的雙股全長cDNA被殖入具有SacI及NotI切點之BmNPV桿狀病毒轉移載體pBPxhE。該轉移載體pBPxhE含有一桿狀病毒強晚期啟動子(p pol；多角體啟動子)以驅動外來蛋白表現，亦含一般啟動子(hsp；熱休克啟動子)以驅動綠色螢光蛋白(GFP)表現做為重組標記。
在蠶幼蟲中表現重組AmCel-45A及AmCel-5B並純化
基於GFP表現來選擇重組病毒。以終點稀釋滴定經分離之 BmNPV重組病毒，並使用高滴度儲備溶液(108 p.f.u./ml)來感染細胞及幼蟲。將具重組病毒之來自第五蛻期第一天之家蠶幼蟲注射入第三腹部氣門血腔。在整個感染期間(3-4天)，幼蟲被飼養在桑葉上。為進行重組AmCel-45A及AmCel-5B之親和性層析法純化，以附加的N-苯硫脲收集被感染之蠶的體液。將溶液以4℃、13,000xg離心20分鐘，以移除細胞碎片。將上清液過濾以移除脂質。將濾液以原生結合緩衝液(native binding buffer)(50mM NaH2 PO4 ，300mM NaCl，pH 7.5)稀釋加至HisPur Cobalt樹脂(Pierce)做用整夜。以洗提緩衝液加上250mM咪唑將AmCel-45A洗提出，而在100mM咪唑部分可偵測到被洗提出之AmCel-5B。將這些收集到的部分透析並以濃縮器SPIN-X® 20-10k(CORNING®)濃縮。將蛋白質樣本與蛋白質樣本緩衝液混合，沸騰並進行12%SDS-PAGE。經電泳後，膠片被固定並以0.1%考馬斯亮藍R-250染色。為進行西方墨點法分析，將蛋白質進行墨點法並以His(6) 單株抗體(1：2500 v/v，Serotech)偵測，整夜於4℃。
AmCel-45A及AmCel-5B之生化特性
最佳溫度及熱穩定性。將AmCel-45A及Amcel-5B與1%(w/v)羧甲基纖維素(CMC；SIGMA®)在50mM檸檬酸緩衝液(pH 5.0)中培養，於溫度16℃、26℃、37℃、50℃、60℃及70℃。於16℃、26℃、37℃、50℃、60℃及70℃預培養12小時來進行熱穩定性。以1%CMC於50mM檸檬酸緩衝液中、pH 4.0、50℃來測定剩餘活性。以二硝基水楊酸(DNS)試劑方法來測量由這些反應產生之還原糖的量。
最佳pH及酸鹼容度。於50℃，以不同pH(pH 2.0-pH 10.0)之50mM緩衝液中之1%(w/v)羧甲基纖維素測定內葡聚醣酶。就pH容度，將經純化之酶以pH 2.0-pH 10.0之50mM緩衝液處理12小時，接著藉由DNS方法以1% CMC於50mM乙酸鹽緩衝液(pH 5.0)中於50℃測量剩餘活性。
化學品及金屬離子之影響。分別將數種化學品如EDTA、CaCl2 、CoCl2 、CuSO4 、MgCl2 、MnCl2 、ZnCl2 、NaN3 、DTT、2-巰乙醇及SDS，於濃度2mM及10mM，與1% CMC分析緩衝液(50mM檸檬酸緩衝液，pH 4.0)混合，50℃、1小時，接著測量總還原糖之量。
受質特異性。於最適條件(pH、溫度及附加化學品)，以1.0%不同纖維素受質，CMC、Avicel(SIGMA®)、大麥β-葡聚醣(SIGMA®)、木聚糖-樺木(SIGMA®)、木聚糖-燕麥木(Fluka)、濾紙(Whatman No.1)及經前處理之稻桿纖維(以酸蒸氣處理之稻桿，來自AS-BCST)來分析AmCel-45A及Amcel-5B。
昆蟲纖 維素酶及商用酶之協同組合
藉由在最適條件下混合總量100μg之AmCel-45A、AmCel-5B及CELLUCLAST® 1.5L組合及1%之經前處理之稻桿纖維24小時，來進行與商用纖維素酶混合物(CELLUCLAST® 1.5L；Novozyme)之協同活性分析。以13,000xg離心20分鐘來除去殘餘纖維素並藉由DNS方法分析總還原糖之濃度。
結果
本發明從台灣白斑天牛甲蟲星天牛之cDNA庫發現並選殖出兩種昆蟲纖維素酶基因，AmCel-45A及Amcel-5B。AmCel-45A cDNA之大小為717bps(包括一訊息序列及一終止密碼子)，而AmCel-5B cDNA之大小為978bps(圖1及2)。於NCBI MegaBLAST資料庫搜尋核苷酸序列之結果顯示，AmCel-45A最接近桑天牛之內-1，4-ß-內葡聚醣酶，有65%一致性，而AmCel-5B最接近黃星天牛(Psacothea hilaris)之內-1,4-β-內葡聚醣酶，有53%一致性。基於在NCBI蛋白質BLAST比較兩種新穎纖維素酶之經轉譯之胺基酸序列之結果，AmCel-45A最接近桑天牛(具77%一致性)及Phaedon cochleariae(具68%一致性)之昆蟲內源性內-1,4-β-內葡聚醣酶(圖3)；AmCel-5B最接近桑天牛(具53%一致性)及黃星天牛(具55%一致性)之昆蟲內源性纖維素酶(圖4)。基於種系分析，此兩種基因為昆蟲內源性纖維素酶基因，而非共生基因，且昆蟲纖維素酶形成一有別於其他真菌或細菌群體之子群。
將AmCel-45A及Amcel-5B cDNA進一步植入pBpxhE轉移載體(圖5)轉染以選擇並製造重組BmNPV。藉由感染蠶幼蟲，分別表現了AmCel-45A及Amcel-5B蛋白質並進一步純化。重組AmCel-45A具分子大小約35 kDa，而AmCel-5B具分子大小約37 kDa(圖6)。重組AmCel-45A及Amcel-5B於pH 4.0、50℃具有最佳的羧甲基纖維素(CMC)水解活性，此由DNS方法偵測之(圖7A-7B)。在不同高溫下(26℃-70℃)培養12小時後，AmCel-45A及Amcel-5B具有高度熱穩定性(圖7A-7B)。此外，在pH 2-pH 10下培養12小時後，AmCel-45A具有更廣的pH容度(圖7A-7B)。有意思的是，AmCel-45A及Amcel-5B之內-β-聚葡萄糖酶活性可在不同離子存在下時被增強，包括二價金屬離子Ca++ 、Co++ 、Cu++ 、Mg++ 、Mn++ 及Zn++ (圖9A及10A)。附加的抗氧化劑，包括DTT及2-巰乙醇(2-ME)，進一步增強了這些酶之活性(圖9B及10B)。其他抗氧化劑，包括β-胡蘿蔔素、葉黃素、茄紅素、蝦青素、維生素C、維生素E、生物類黃酮、花青素、兒茶素、穀胱甘肽、肌醇亦可能有功用。再者，本發明發現，上述離子及抗氧化劑之結合可進一步增強這些酶的活性。表2顯示，2mM Co2+ 及10mM二硫蘇糖醇(DTT，一種含shylhydryl之抗氧化劑)分別加上2mM Mn2+ ，可增強酶之功能。為了模仿消化道中之昆蟲纖維素酶混合物，發現協同加入AmCel-45A及Amcel-5B展現了水解經預處理稻桿之高度活性，且亦可刺激商用酶(例如，CELLUCLAST1.5L，Novozyme)在催化水解經預處理稻桿之活性(圖8)。表1顯示AmCel-45A，AmCel-5B及CELLUCLAST1.5L在不同受質之酶活性比較(AmCel-45A及Amcel-5B在pH 4.0、50℃進行；CELLUCLAST1.5L在pH 5.0、50℃進行，使用1%受質)。
以上所述本發明之例示用具體實施例的說明僅以圖解及描述為目的而呈現，並無意窮盡或限制本發明至所揭露的精確形式。依據上述教示可有許多修飾及變化例。
具體實施例及實例之選擇及說明係為了解釋本發明之原理及其實際應用，因此使熟悉本領域之技藝人士能利用本發明及多種具體實施例，並適於特定設想用途而做修飾。熟悉本發明所屬領域之技藝人士可明顯知道替代的具體實施例是可在不離本發明之精神或範疇下被做成的。據此，本發明之範圍係以所附之申請專利範圍所定義，而非前述說明，亦非此處描述之例示用具體實施例。
某些參考資料，其可能包含專利、專利申請案及各種文獻，在本發明說明中被引用及討論。這些參考資料的引用及/或討論盡為了闡明本發明說明，而並非承認這些參考資料為此處說明的本發明之「前案」。本說明書中所有引用之文獻以引用的方式併入本文中，猶如每獨立文獻或專利申請案被特定且獨立地指出以引用的方式併入。
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<211>　978
<212>　DNA
<213>　台灣白斑天牛甲蟲，星天牛
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<213>　台灣白斑天牛甲蟲，星天牛
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圖1顯示AmCel-45A cDNA(SEQ ID NO：1)之核苷酸序列及編碼之胺基酸序列(SEQ ID NO：2)，來自台灣白斑天牛甲蟲，星天牛(Anoplophora malasiaca)。
圖2顯示AmCel-5B cDNA(SEQ ID NO：3)之核苷酸序列及編碼之胺基酸序列(SEQ ID NO：4)，來自台灣白斑天牛甲蟲，星天牛。
圖3係一種系發生樹(或演化樹)，基於來自糖苷水解酶家族(GHF)45之纖維素酶之胺基酸序列，顯示了來自星天牛之AmCel-45A與來自桑天牛(Apriona germari)(天牛科)、Oncideres albomarginata chamela(甲蟲)及Phaedon cochleariae(甲蟲)之內-ß-1,4-聚葡萄糖酶相似(約65-80%胺基酸序列一致性)。
圖4係一種系發生樹(或演化樹)，基於來自糖苷水解酶家族(GHF)5之纖維素酶之胺基酸序列，顯示了來自星天牛之AmCel-5B與來自桑天牛(Apriona germari)(天牛科)、Oncideres albomarginata chamela(甲蟲)及Phaedon cochleariae(甲蟲)之內-ß-1,4-聚葡萄糖酶相似(約53-59%胺基酸序列一致性)。
圖5A-5B載體圖，其顯示了重建之pBpxhE質體，其包含AmCel-45A(圖5A)及AmCel-5B cDNA(圖5B)用於進一步應 用至桿狀病毒表現系統。轉移載體pBPxhE含有桿狀病毒強晚期啟動子(p pol；多角體啟動子)以驅動外來蛋白表現，亦含一般啟動子(hsp；熱休克啟動子)以驅動綠色螢光蛋白(GFP)表現做為重組標記。
圖6顯示表現於經桿狀病毒感染之蠶體液中之經純化之重組AmCel-45A及AmCel-5B的SDS-PAGE及西方墨點法分析結果。道1及3：經純化之AmCel-45A及濃縮蛋白。道2及4：經純化之AmCel-5B及濃縮蛋白。道5：AmCel-45A抗-His(6) 訊號；道6：AmCel-5B anti-His(6) 訊號。
圖7A顯示pH及溫度對AmCel-45A之活性及穩定性之影響。a，最佳溫度。b，熱穩定性。c，最佳pH。d，pH容度。
圖7B顯示pH及溫度對AmCel-5B之活性及穩定性之影響。a，最佳溫度。b，熱穩定性。c，最佳pH。d，pH容度。
圖8顯示昆蟲纖維素酶及CELLUCLAST® 1.5L在酶水解經預處理之稻桿的協同效果。所有進行的實驗皆用1%經預處理之稻桿纖維(亦即，酸蒸研究之稻桿)，總100μg之纖維素酶(昆蟲或/及商用)於pH4.0，50℃，24小時。
圖9顯示金屬離子及化學品對AmCel-45A活性之影響。圖9A中，化學品濃度分別為2mM(灰)及10mM(深灰)。將各酶活性規格化並以控制組之百分比表示，控制組為於1% CMC，50mM檸檬酸緩衝液，pH 4.0，50℃，1小時所測量者。圖9B顯示不同金屬離子對AmCel-45A活性在10mM DTT存在下之影響。離子濃度為2mM(灰)及10mM(深灰)。虛線代表控制組。
圖10顯示金屬離子及化學品對AmCel-5B活性之影響。圖10A中，化學品濃度分別為2mM(灰)及10mM(深灰)。將各酶活性規格化並以控制組之百分比表示，控制組為於1%CMC，50mM檸檬酸緩衝液，pH 4.0，50℃，1小時所測量者。圖10B顯示不同金屬離子對AmCel-5B活性在10mM DTT存在下之影響。離子濃度為2mM(灰)及10mM(深灰)。

Claims (19)

  1. 一種組成物，其包含：(a)一第一纖維素酶，其包含一具有與SEQ ID NO：2至少90%之序列同一性之胺基酸序列；及(b)一第二纖維素酶，其包含一具有與SEQ ID NO：4至少90%之序列同一性之胺基酸序列；其中第一纖維素酶及第二纖維素酶具有纖維素酶活性。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之組成物，其中第一纖維素酶包含一具有與SEQ ID NO：2至少95%之序列同一性之胺基酸序列。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之組成物，其中第二纖維素酶包含一具有與SEQ ID NO：4至少95%之序列同一性之胺基酸序列。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之組成物，其中第一纖維素酶具有SEQ ID NO：2之胺基酸序列。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之組成物，其中第二纖維素酶具有SEQ ID NO：4之胺基酸序列。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之組成物，其中第一纖維素酶具有SEQ ID NO：2之胺基酸序列，以及第二纖維素酶具有SEQ ID NO：4之胺基酸序列。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之組成物，進一步包含一或多種金屬離子及/或一或多種抗氧化劑，其中該金屬離子係選自由鈣(Ca2+ )、鈷(Co2+ )、錳(Mn2+ )及鋅(Zn2+ )所組成之群組，以及該抗氧化劑係選自由二硫蘇醣醇(DTT)及2-巰乙醇(2-ME)所組成之群組。
  8. 如申請專利範圍第1-7項中任一項所述之組成物，進一步包含至少一附加商用纖維素酶。
  9. 一種水解纖維素材料之方法，其包含： 暴露該纖維素材料至有效量之如申請專利範圍第1-8項中任一項所述之組成物。
  10. 一種經分離之纖維素酶，其包含一具有與一選自由SEQ ID NO：2及4所構成之群組之胺基酸序列至少90%同一性之胺基酸序列。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之經分離纖維素酶，其包含一具有與SEQ ID NO：2至少90%之序列同一性之胺基酸序列。
  12. 如申請專利範圍第10項所述之經分離之纖維素酶，其包含一具有與SEQ ID NO：4至少90%序列同一性之胺基酸序列。
  13. 如申請專利範圍第10項所述之經分離纖維素酶，其包含選自由SEQ ID NO：2及4所構成之群組之胺基酸序列。
  14. 一種經分離之核苷酸序列，其編碼如申請專利範圍第10-13項中任一項所述之纖維素酶。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之經分離之核苷酸序列，其編碼如申請專利範圍第13項所述之纖維素酶，包含選自於SEQ ID NO：1及3之核苷酸序列。
  16. 一種表現如申請專利範圍第10-13項中任一項所述之纖維素酶之重組載體，其包含：(a)至少一調控因子；及(b)一種編碼該纖維素酶之經分離之核苷酸序列，在轉譯框架中連結至該至少一調控因子。
  17. 如申請專利範圍第16項所述之重組載體，其中該載體係桿狀病毒表現載體。
  18. 如申請專利範圍第16項所述之之重組載體，其中該經分離之核苷酸序列包含選自於SEQ ID NO：1及3之核苷酸序列。
  19. 一種經分離之纖維素酶，其自如申請專利範圍第16項所述之重組載體生成。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US5677151A (en) * 1994-06-24 1997-10-14 Cornell Research Foundation, Inc. Thermostable cellulase from a thermomonospora gene

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Title
Lee SJ et al., "A novel cellulase gene from the mulberry longicorn beetle, Apriona germari: Gene structure, expression, and enzymatic activity", COMPARATIVE BIOCHEMISTRY AND PHYSIOLOGY B-BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY , vol.140, no.4, p.551-56 *

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