BRPI0906641A2

BRPI0906641A2 - enriquecimento de dois estágios de dna fetal livre de célula em plasma materno

Info

Publication number: BRPI0906641A2
Application number: BRPI0906641A
Authority: BR
Inventors: Bischoff Farideh
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2008-01-30
Filing date: 2009-01-30
Publication date: 2019-09-10
Also published as: MX2010008374A; ES2389038T3; EP2245195A4; CA2713545A1; EP2245195A2; US20110183338A1; WO2009097511A3; EP2245195B1; WO2009097511A2; CN102016069A; RU2010135816A; JP2011510660A

Abstract

"enriquecimento de dois estágios de dna fetal livre de célula em plasma materno". a presente invenção refere-se a métodos para enriquecimento de ácido nucléico fetal em uma amostra biológica de um hospedeiro mater- no. são também providos métodos para detecção da presença ou ausência de marcadores em ácido nucléico fetal, de tumor ou neoplástico. os méto-dos podem incluir tratamento da amostra biológica com dnase e, opcional-mente, realização de amplificação de genoma integral nas amostras trata- das. a amostra biológica pode ser, por exemplo, uma amostra de sangue.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ENRIQUECIMENTO DE DOIS ESTÁGIOS DE DNA FETAL LIVRE DE CÉLULA EM PLASMA MATERNO”.

Embora DNA fetal esteja presente em plasma materno, os níveis são relativamente baixos para permitir análise genética pré-natal de rotina.

Sem ser limitado a nenhuma teoria, acredita-se que uma porção do DNA fetal esteja empacotada e então protegida de endonucleases do plasma. A presente invenção refere-se a uma nova técnica de enriquecimento que combina dois métodos distintos. Plasma separado è primeiro tratado com 1D DNase para diminuir eficazmente a porcentagem de fragmentes de DNA materno livre de célula uontaminantes. Aumento subsequente de sequências fetais é conseguido usando um método de amplificação total do genema (WGA) modificada.

Métodos: plasma foi isolado de sangue materno integral (a~24), 15 então tratado com concentrações altas de DNase. DNA tratado oom DNase foi mais processado usando o mini kit de extração de DNA Qiagen antes de um protocolo de WGA modificado para enriquecer fragmentos de DNA pequenos. Presença de sequências fetais foi confirmada usando PCR Taqman de tempo real (RT-PCR) para medir os niveis de sequências de β-GloPina e 20 DYS1,

Resultados: sequências de DNA fetal foram detectadas seguindo todos os tratamentos com DNase. Detecção correta de fetos masculinos foi conseguida em todas as amostras confirmadas ter um feto masculino (n~W) ambos antes e após WGA. Em adição a acertar a determinação do 25 gênero, as amostras (n~7) que foram submetidas à quantidade mais alta de

DNase, bem comc o protocolo WGA modificado, demonstraram enriquecimento signifíeante de sequências fetais, atingindo 50% de DNA fetal.

Conclusões: s resultados confirmam que DNA fetal em plasma é protegido e resistente à degradação do tratamento com DNase. Esses da30 dos preliminares também sugerem que um nível ótimo de tratamento com

DNase pude ser conseguido que permite rnaís enriquecimento usando WGA, A observação que DNase elimina sequências predomínantemente maternas.

sugere que DNA fetal livre de célula está empacotado díferenternente do par materno, permitindo enriquecimento diferenciai de sequências fetais.

INTRODUÇÃO

Diagnóstico genético pré-natal tem se baseado em procedimentos invasivos tal como arnnioeentese ou amostragem vílosa coriônica (CVS) (Chonon/c Ví/fous Sampling). Embora esses procedimentos tenham provido resultados confiáveis por muitos anos, eles ainda apresentam um ligeiro risco para o feto (1). Desde a constatação de ácidos nuciéícos livres de célula letais amplífioáveis em plasma materno (2), houve vários estudos com o objetivo de determinar o potencial para testes genéticos prè-natais não ínvasívos clínicos. Embora muitos desses estudos tenham mostrado grande promessa, as quantidades pequenas existentes de DNA fetal tornaram difioil implementar olíníoamente. Desta maneira, a requerente focou em apeifeiçoamento de métodos de isolamento e enriquecimento de DNA fetal. Sem desejar ser limitado a nenhuma teoria, acredita-se que esses nucleotídeos em circulação sejarn o resultado de células fetais sofrendo apopiose (3). A estabilidade relativa de DNA e RNA livres de célula em plasma, que é conhecido conter nucleases, sugere que esses ácidas nucléicos estão circulando dentro de vesículas ligadas à membrana formadas oamo um resultado do mecanismo de morte celular programada (4). Esses fragmentos de DNA fetal sâo também distinguíveis de fragmentos matemos com base no tamanho, fragmentos fetais geralmente menores (<300 pb) do que os fragmentos maternos (>500 pb) (5; Jorgez, C, e outros, 2007).

A requerente descreve um novo método de dois estágios para enriquecimento de fragmentos fetais. O primeiro estágio envolve tratamento de plasma materno total (contendo ambos os fragmentos de DNA materno e fetal) com DNase. Dado que os fragmentas fetais são mais estáveis e provavelmente empacotados por corpos apoptóticos ligados à membrana, a requerente toma como hipótese que tratamento com DNase esgotaria as sequências maternalmente derivadas no geral (não empacotedas). O segundo estágio envolve um protocolo de amplificação de genoma integral modificado (WGA) projetado para amplificar fragmentos rnenores, presumivelmente fetais.

MÉTODOS

Seguindo aprovação do IRB e consentimento informado escrito, um total de 24 amostras de sangue integral (10 gestações masculinas confirmadas, idade gestacíonaí média 18 1/7 semanas variando de 11 4/7 a 25 5 2/7 semanas; 12 gestações femininas confirmadas, idade gestacíonaí média 20 1/14 semanas variando de 9 6/7 a 37 4/7 semanas; e 2 controles não grávidos, 1 masculino e 1 feminino) foram coletadas, Para cada um, aproximadamente 30 ml de sangue retirado em tubos de teste ACD foram processados através da uma centrifugação inicial a 800 g por 10 minutes para se10 parar plasma da fração celular. A fração de plasma foi removida e centrifugada novamente a 16.000 g por 10 minutos para remover mais quaisquer partículas celulares contaminantes. Esta fração foi então congelada em alíquotas de 800 pi e mais tarde descongelada para processamento em batelada simultâneo. Cada 000 pl de amostra de plasma foram descongelados 15 em temperatura ambierde, então submetidas a tratamento com DNase (Promega, No. Cat. M6101) em várias concentrações (não tratada, 1 pL, 5 pL, 10 pL 30 pl de 1 unídade/pL). As amostras foram incubadas a 37* C per 1 hera antes da adição da solução de parada. As amestras foram em seguida submetidas à extração de DNA usando o Mini Kit Qiagen QIAamp Blood 20 (No. Cat. 51106) e eluidas em um volume final de 100 pl... Com pequenas modificações, e pratoculo para o Kii GenomePlex'*' Complete Wfio/e Genome A.mp/íf/oaãon (WGA) (Sigma, No. Cat. WGA2-50rxn) for seguido ern sete amostras de sangue materno (4 masculinas confirmadas e 3 femininas confirmadas). A requerente modificou o procedimento primeiro omitindo a íncu25 baç-ão de fragmentação sugerida pelo fabricante devido ao tamanho antecipado de sequências-alvo. Segunda, o número de ciclo na etapa de amplificação foi aumentado para 20 ao invés dos 14 sugeridos. Amostras amplificadas foram armazenadas a 4*C até análise de RT-PCR para detecção e quantificação de β-Globina (8GLQ354F: GTG CAC CIG ACl CCT GAG 30 GAG A. BGLO455R' CCT TGA TAC CAA CCT GCC CAG) (6) e DYS1 (DYS1F: TCC TGC TTA TCC AAA TTC ACC AT. DYS1R: ACT TCC CTC TGA CAT TAC CTG ATA ATT G) (7) (Applied Biosystems 7700, Foster City,

CA). O nivel de enriquecimento foi determinada com base em % de DNA fetal que foi calculada como uma razão de DYS1 para β-Globina. 8-Globina representa a quantidade total de DNA isolado, materno e fetal, enquanto nas gestações masculinas confirmadas DYS1 representa a quantidade de DNA 5 fetal presente na amostra,

RESULTADOS

Seguindo tratamentos iniciais corn DNase em amostras não grávidas de controle, ambos os níveis de β-Giobina a DYS1 diminuíram como uma função da quantidade de enzima adicionada. Cada uma foi eficazmente 10 eliminada através de tratamento com DNase. (Figura 1). Em amostras maternas, embora níveis detectavais de β-Giobina fossem menores, esses níveis foram persistentes apesar de tratamentos corn DNase mais pungentes (916,5 ± 91,2 Geq/ml para casos maternos masculinos e 610,5 ± 389,62 Geq/ml para casos maternos femininas). Nenhum nível de DYS1 falsa15 positivo foi detectado em qualquer uma das gestações femininas conhecidas. No entanto, dentre as gestações cam fetos masculinos conhecidos (n~10), houve uma detecção de 10039 de sequências de DYS1 em todos os incrementos de tratamento (Opr. 127,4 ± Geq/ml Ipr. 71,4 ± 57,3 Geq/ml, 5pí: 71 ± 58,6 Geq/ml, 10pl: 57,1 ± 46,6 Geq/ml, 30yl: 154 ± 179,6 20 Geq/ml).

WGA foi realizado em sete amostras maternas tratadas com DNAse (3 femininas e 4 masculinas). Embora as sequências fetais fossem detectadas em todas as amostras, níveis altos de sequências de DYS1 fetais forarn apenas observadas nas amestras que foram submetidas a 30 pl de 25 DNase (Opl: 1979 ± 2083,9 Geq/ml, 1pl: 1,62 ± 1,6 Geq/ml, 5pl: 723,5 ± 875,7 Geq/ml, 10pl: 0,83 ± 1,22 Geq/ml, 30pl: 7025 ±4381 Geq/ml). Então indicando que tratamentos com DNase mais adstringentes eram necessários para diminuir as sequências maternas (com base em β-Globína) até o ponto que elas não estivessem presentes em níveis que competissem com ampllfi30 cação de sequências de DYS1. Nas amostras que foram submetidas a 30 pl de DNase seguido pelo protocola de WGA modificado, a requerente foi capaz de obter um valor médio da 49,96% de DNA fetal. Nas amostras que não foram tratadas com DNase e apenas submetidas ao WGA modificado, o DNA fatal percentual média dentre as amostras foi 11,18%. As amostras que foram tratadas cam 1, 5, 10 plde 1 unidade/pl de DNAse tinham todas valores médios de 0,01%, 3,5% e 0,01% de DNA fetal respectivamente após 5 WGA. Antes do WGA as amostras tinham porcentagens variando de 0,05% a 0,17%.

DISCUSSÃO

Os resultados da requerente demonstram que DNA fetal livre de célula é resistente à degradação por DNase, apoiando a hipótese que DNA 10 fetal livre de célula é empacatado em vesículas ligadas à membrana. A requerente removeu eficazmente sequências maternas bem corno quaisquer sequências contaminanies que passam levar a resultados falso-posítivos. Os níveis de DNA fetal livre de célula persistem em amostras de paciente versus amostras de controle. Esta constatação confirma que as sequências fe15 tais são resistentes à degradação e protegidas ou empacotadas diferentemente das sequências maternas. Níveis de β-Glebína representam DNA total (materno e fetal), então falha em detectar digestão completa de β-Globina não é surpreendente dado que uma porção é provável ser fetal. Sequências fetais parecem ter uma característica molecular única, diferenciando-as de 20 sequências maternas e permitindo enriquecimento. Detecção da todos os casos masculinos e quaisquer falso-positivos sugere que tratamento com DNase tern uma nova aplicação em eliminação de sequências maternas iadesejadas que foram mais degradadas enquanto em circulação.

G Kit GenomePlex® Complete Whoie Genome Amplification .25 (Sigma-Aldrich) amplifica DNA genômico primeiro fragmentando o DNA e então Uganda uma sequência comum na extremidade que é usada para amplificar todos os fragmentos através de reação em cadeia da polimerase (ΡΟΗ). A requerente eliminou a etapa de fragmentação do procedimento para prevenir sequências maternas maiores de fragmentar para amplificação sub30 sequente. Isto provê potencialmente sequências fetais fragmentadas preexistentes pequenas e vantagem durante amplificação. WGA aumentou a razão fetal para materna em amostras que sofreram os tratamentos com DNaΟ se mais adstringentes. Antes do WGA, a % média de DNA fetal era <1% em todos os níveis de tratamento. No entanto, 503¾ de DNA fetal foram atingidos em amostras que sofreram 30 μΙ de DNase junto oom o protocolo de WGA modificado, sugerindo que este é um método viável de enriquecimento de 5 DNA fetal livre de célula em plasma materno. Com base em níveis de β·

Globina, DNase parece reduzir a quantidade de sequências maternas presentes na amostra, permitindo que sequências fetais sejam amplificadas. A degradação de ácidos nucléicos maternos previne competição durante amplificação de sequências fetais na reação de PCR. As amostras que sofre10 ram tratamentos com DNase mais suaves (1. 50. 10 pl) mostraram razão fetal para materna menor após WGA do que amostras que não foram tratadas com DNase, Uma explicação possível é que nessas amostras as sequências maternas maiores foram degradadas, mas não completamente eliminadas, na realidade substituindo a etapa de fragmentação do protocolo 15 de WGA original que permitiu amplificação mais eficiente das sequências maternas.

A requerente descreve uma combinação de métodos que permite que sejam superadas duas grandes complicações que têm limitado o teste genético de DN.A pré-natal não invasive: razão fetal para materna baixa e 20 quantidade pequena de DNA fetal. No geral, este novo processo de enriquecimento de dois estágios mostra grande potencial em enriquecimento seletivo seguido por amplificação.

REFERÊNCIAS

1. Tabor A. Philip d, Madsen M, Bang J, Obel EB, Ncrgaard Pe2.5 dersen B. Randomised controlled trial of genetic amniocentesis in 4606 low- risk women.. Lancet 1086:8493:1287-93.

2. Lo ¥M, Corbetta N, Chamberlain PF. Rai V. Sargent IL, Redman CW and Wainscoat OS. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet 1997;350:485-7.

3. Bischoff FZ, Lewis DE. Simpson JL. Cell-free fetal DNA in maternal blood, kinetics, source and structure. Human Reproductive Update

2004:11:59-67.

4. Orozco AF< Bischoff FZ, Horne C, Popek E, Simpson JL, Lewis DEL Hypoxia-induced membrane-bound apoptotio DNA particles: potential mechanism of fetal DNA in maternal plasma, Ann N ¥ Acad Sci, 2006;1075:57-62.

5. K.C. Allen Chan, Jun Zhang, Angela B,¥, Hui, Nathalie Wong,

Tze K. Lau, Tse N, Leung, Kwok-Wai Lo, Dolly W.S. Huang, and Y.M, Dennis Le, Size Distributions of Maternal and Fetal DNA in Maternal Plasma, Clinical C hemistry 2004 ;600:88-92.

Carolina J. Jorgez, Farideh Z, Bischoff. Improving Utility of Circuits fating DNA for Prenatal Genetic Testing? Fragment Size and Purify. 2007

6. y M Lo, M S Tein, T K Lau, C J Haines, T N Leung, P M Poon, J S Wainscoat, P J Johnson, A M Chang, and N M Hjelm. Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis. Am J Hum Genet. 1998: 62:768-75.

7. Tuangsit Wataganara, Erik LeShane, Antonio Farina, Geralyn

M. Messerlian, Thomas Lee. Jacob A, Canick, Diana W, Bianchi. Maternal Serum Cell-Free DNA Levels are Increased in Cases of Trisomy 13 but not 18, Hum Genet 2003;112:204-8

Claims

REIVINDICAÇÕES

1,. Método para enriquecimento de ácido nucléico fetal compreendendo:

tratamento de uma amostra biológica de um hospedeiro materno

5 contenda ácido nucléico fetal livre de célula com urna composição compreendendo um agente com atividade de DNase, em que uma primeira porcentagem do ácido nucléico fetal na amostra biológica antes do tratamento é menor do que uma segunda porcentagem de ácido nucléico fetal na amostra biológica após o tratamento.

10
2, Método de acorda com a reivindicação 1, em que a amostra biológica é uma amostra de sangue de um hospedeiro materna.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 . em que a amostra biológica é uma amostra de plasma ou soro de um hospedeiro materno.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o agente 15 com atividade de DNase é DNase.
5. Método de acorda com a reivindicação 1, em que o agente com atividade de DNase é DNase e a quantidade de DNase é de a partir de cerca de 10 a 200 unidade/pl,
6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a segunda 20 porcentagem è de a partir de cerca de 10% a 50%.
7. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a segunda porcentagem é pelo menos 10%, 20%, 30%, 40% ou 50%,
8. Método de acordo cam a reivindicação 1, em que uma primeira porcentagem de ácido nucléico materno na amostra biológica antes do

25 tratamento é maior do que uma segunda porcentagem do ácido nuclésoa materno na amostra biológica após tratamento..
9. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo ainda amplificação de ácido nucléico fetal na amostra biológica após o tratamento,

3u 10, Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo ainda amplificação de ácido nucléico fetal na amostra biológica após o tratamento através de um método de amplificação total do genoma (WGA).

11, Método de acordo com a reivindicação 10, em que o método WGA é conduzido sem incubação de fragmentação.

12. Mistura obtida através do método como definida na reivindicação 1.

5 13. Mistura obtida através do método como definido na reivindicação 1. em que a mistura contém pelo menos 10%, 20%. 30%, 40% ou 50% de ácido nucléico fetal,

14. Método para detecção da presença ou ausência de um marcador em ácido nucléico fetal compreendendo
10 tratamento de uma amostra biológica de um hospedeiro materna contendo ácido nucléico fetal livre de célula com uma composição compreendendo um agente com atividade de DNase, amplificação do ãddo nucléico fetal na amostra biológica após o tratamento, e
15 detecção da presença ou ausência de um marcador em ácido nucléico fetal durante ou após amplificação.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que a amostra biológica é uma amostra de plasma ou soro.
16. Método de acordo com a reivindicação 14, eru que o agente

20 é DNase.
17. Método de acordo com a reivindicação 14, em que a amplificação é conduzida através do método de amplificação fetal do genoma
18. Método de acordo com a reivindicação 17, em que o método

25 WGA é conduzido sem incubação de fragmentação.
19. Método de acordo com a reivindicação 14, em que a porcentagem de ácido nucléico fetal após a amplificação é pelo menos 10%. 20%, 30%, 4014 ou 50%.
20. Método para enriquecimento de ácido nucléico livre de célula

30 a partir de células apoptóticas ou neuróticas compreendendo:

tratamento de uma amostra biológica contendo ácido nucléico livre de célula a partir de células apoptóticas ou necróticas com uma camposição compreendendo um agente com atsvidade de DNase, em que a primeira porcentagem do ácido nucíéíco livre de célula a partir de células apoptòtícas ou necráticas antes do tratamento é menor do que uma segunda porcentagem de ácido nucléico livre de célula a partir de 5 células apoptóticas ou necróticas na amostra biológica após o tratamento.
21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que a amostra biológica é uma amostra de sangue, amostra de plasma ou amostra de soro, .
22, Método de acordo com a reivindicação 20, em que o agente cem atividade de DNase é DNase.

10
23, Método de acordo com a reivindicação 20, em que o agente com atividade de DNase é DNase e a quantidade de DNase è de partir de cerca de 10 a 200 unidade/pl.
24, Método de acordo com a reivindicação 20, em que o ácido nucléico livre de célula é a partir de células de tumor ou células neoplásticas.

15
25, Método de acordo com a reivindicação 20, compreendendo ainda amplificação de ácido nucléico livre de célula na amostra biológica após o tratamento através de um método de de amplificação total do genoma (VVG A)
26. Método para detecção da presença eu ausência de um mar20 nadar em um ácido nucléico de tumor ou neoplástico compreendendo'.

tratamento de uma amostra biológica contendo ácido nucléico livre de célula a partir de células de tumor ou neoplásticas com uma composição compreendendo um agente com atividade de DNase, amplificação de ácido nucléico livre de célula na amostra biológi25 ca apòs o tratamento, e detecção da presença ou ausência de um marcador em ácido nucléico de turno? ou neoplástíco durante ou após amplificação.
27. Método de acordo com a reivindicação .26, em que a amostra biológica è amostra de sangue, amostra de plasma ou amestra de soro,

30
28 Método de acordo com a reivindicação 26, em que o agente é DNase,
29, Método de acordo com a reivindicação 26. em que a amplifi cação o conduzida através do método da amplificação total da genoma fVVGA).
30. Método de acordo com a reivindicação 26. em que o método WGA á conduzido sem incubação de fragmentação.

Níveis de DNA seguindo tratamento com DNase do plasma. Os niveis de DNA são mostrados como DNA percentual restante após tratamento com Dnase (ajuste de tratamento 0 μ como ponto zero). As amostras testadas incluíam plasma de casos maternos feminino (painel A) e masculino (painel 8) confirmados que foram submetidas a 0,1, 5,10, 30 pl de DNase (1 unidade/μΙ).

Como controles, plasma masculino e feminina não-gráfiDo foi submetido a 0,1, 5.10 pl de DNase (1 unldade/pí).. Os gráficos representam dot blot com desvio padrão (barras). RT-PCR foi realizada para medir os níveis de β-Globina em circulação (Bgío) e DYS1 seguindo tratamento com DNase, % Restante após Tratamento % Restante após Tratamento

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300%

200%

150%

100%

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Feto Masculino (n~10)

Plasma Masculino Não-gràvído (n~ 1)