BRPI0904528B1 - Método de conjugação de polissacarídeo capsular a uma proteína carregadora, para uso como antígeno vacinal contra bactérias encapsuladas, utilizando o reagente cloreto de 4-(4,6- dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolino (dmtmm) - Google Patents

Abstract

método de conjugação de polissacarídeo capsular a uma proteína carregadora, para uso como antígeno vacinal contra bactérias encapsuladas, utilizando o reagente cloreto de 4-(4, 6-dimetoxi-1 ,3,5-triazin-2-il) -4-metilmorfolino (dmt-mm). o qual consiste num método de conjugação entre polissacarídeo capsular e proteína para obtenção de antígeno vacinal, sendo que a etapa de conjugação é mediada pelo reagente cloreto de 4-(4,6-dimetoxi-l,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolino (dmt-mm) consistindo na inovação do processo de obtenção de antígenos vacinais.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a um método de conjugação do polissacarídeo capsular (PS) a uma proteína carregadora objetivando a produção do antígeno vacinal contra bactérias encapsuladas patogênicas empregando o cloreto de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4- metilmorfolino (DMT-MM)na etapa chave do processo de conjugação. A etapa chave do processo de conjugação consiste na ligação covalente do polissacarídeo capsular, previamente modificado quimicamente, a uma proteína. O emprego do DMT- MM como molécula ativadora nessa etapa é uma inovação que justifica esta patente.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0002] A cápsula é o envoltório externo da bactéria e é constituída de polissacarídeos de alto peso molecular que pode variar de 400.000 a 1 milhão de kDa. Esses polissacarídeos são polímeros cuja unidade básica é composta por 2 à 6 monossacarídeos que podem estar orto-acetilados ou ligados a grupos fosfatos ou glicerol. A estrutura química do polissacarídeo é a base para a classificação das bactérias encapsuladas em sorotipos ou sorogrupos. A cápsula é um importante fator de virulência pois protege a bactéria contra a fagocitose. Por esta razão, o polissacarídeo capsular livre ou conjugado a uma proteína, é o principal antígeno vacinal contra bactérias encapsuladas. O polissacarídeo livre como antígeno vacinal possui uma eficácia limitada pela característica antigênica dos polissacarídeos, que são antígenos independentes de células T (TI). Por ser um antígeno do tipo TI, o PS induz anticorpos de pouca duração, predominantemente IgM, anticorpos de baixa avidez e não é imunogênico para crianças abaixo de 2 anos. A conjugação covalente do PS a uma proteína transforma o PS em antígeno dependente de células T (TD). Por esta razão o polissacarídeo conjugado a uma proteína é uma vacina mais utilizada atualmente tendendo a substituir cada vez mais as vacinas de PS livres. Se de um lado estas vacinas são mais eficazes inclusive para crianças menores de 2 anos, todas as vacinas conjugadas são de alto custo devido à necessidade de inúmeras etapas para a sua produção quais sejam: cultivo da bactéria, purificação do PS e conjugação. Dentre essas etapas, a conjugação é um dos passos mais problemáticos devido à necessidade de várias reações químicas e ao baixo rendimento final. Assim, embora essas vacinas sejam amplamente utilizadas, principalmente nos países desenvolvidos, é necessário que se continue aperfeiçoando seus métodos de produção, barateando o seu custo para ampliar o uso inclusive nos países em desenvolvimento.

[0003] Entende-se por conjugação a obtenção de um composto covalente, neste caso, um composto covalente polissacarídeo - proteína. O processo de conjugação do polissacarídeo à proteína é constituído de várias reações químicas cujas principais são: 1. introdução de um grupo reativo na molécula do polissacarídeo que pode ser um grupamento amina, carboxila ou aldeído; 2. introdução de uma ponte de carbono de ligação entre o polissacarídeo e a proteína, geralmente chamada de molécula espaçadora, reação não essencial mas que pode aumentar o rendimento da reação 3. reação do polissacarídeo modificado com a proteína para finalmente se obter o conjugado. É importante frisar que após cada reação deve haver uma etapa de purificação para que o excesso de reagentes adicionados na reação anterior não interfira na reação subseqüente. Pela necessidade de várias etapas o rendimento final do processo de conjugação é em torno de 20 - 30% razão que se reflete no alto custo do produto e mais, o que justifica que novos métodos de conjugação sejam ainda intensamente pesquisados. Outro esclarecimento importante é que várias reações de conjugação utilizam na etapa 3, especificado à cima, uma molécula orgânica mais reativa do que as macromoléculas da reação, o polissacarídeo e a proteína, o que irá facilitar a reação abaixando a energia de ativação. Isso principalmente quando se trata de uma reação em que há a participação de um grupo carboxila da proteína, grupo este, de baixa reatividade para a obtenção de uma ligação covalente estável. A molécula mais utilizada para formar um intermediário capaz de diminuir a energia de ativação e permitir que a reação se processe é o hidrocloreto de (1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etil carbodiimida), EDAC (Schneerson R, et al. The Journal of Experimental Medicine 1980; 152:361-76). Na presente invenção a molécula empregada com a função de favorecer a reação do polissacarídeo modificado com a proteína é o cloreto de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4- metilmorfolino (DMT-MM). Cabe ressaltar que o emprego do DMT-MM como molécula ativadora para formação de um antígeno vacinal é uma inovação desta patente.

O ESTADO DA ARTE

[0004] São descritas diversas bactérias encapsuladas de importância em saúde pública como: Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Salmonella typhi etc... N. meningitidis, H. influenzae e S. pneumoniae são responsáveis por infecções graves como meningite, pneumonia, bacteremia e a S. typhi pela febre tifóide. Dado o alto índice de mortalidade e morbidade das infecções provocadas por esses microrganismos a vacinação é uma medida aconselhada pela OMS. Essas bactérias possuem um envoltório externo, a cápsula, constituído de polissacarídeos de alto peso molecular (PS). Esses polissacarídeos são polímeros cuja unidade básica (monômero) compreende entre 2 a 6 açúcares podendo conter também grupos fosfatos e glicerol. Pelo fato de ser o envoltório mais externo da bactéria e também por ser um importante fator de virulência, o PS é o antígeno mais utilizado em vacinas.

[0005] Por ser um antígeno do tipo timo independente, o PS induz anticorpos de pouca duração, predominantemente IgM, anticorpos de baixa avidez e não induzem resposta imune em crianças abaixo de 2 anos (Poolman, JT. Polysaccharides and membrane vaccines. Mizrahi, A. ed. Advances in biotechnological processes, vol. 13. Wiley-Liss N.Y., 5984, 1990). A conjugação covalente do PS a uma proteína transforma o PS em antígeno timo dependente e este conjugado induz anticorpos protetores em crianças abaixo de 2 anos. As primeiras vacinas conjugadas PS-proteína, foram as vacinas anti - H. influenzae tipo b (Hib), testadas e comercializadas nos anos 80 com grande sucesso utilizando como proteínas carregadoras o toxóide tetânico (TT), a toxina diftérica inativada (CRM197) e vesículas de membrana externa da N. meningitidis (Kniskern, P.J., Marburg, S. Conjugation: design, chemistry and analysis. In: Development and clinical uses of Haemophilus b conjugate vaccines. Ellis, RW, Granoff, DM. eds. Marcel Dekker, Inc, N.Y. 37-69, 1994). Devido ao grande sucesso das vacinas anti- Hib que foram as responsáveis por debelar as epidemias de meningite provocadas por H. influenzae tipo b nos Estados Unidos e em muitos países da Europa nos anos 60 e 70, surgiram no final do século passado outras vacinas conjugadas como a anti- meningocócica sorotipo C conjugada ao CRM197 (Costantino P, et al. Vaccine 1992; 10:691-198), vacina conjugada anti- meningocócica sorotipo A (Lee CH, et al. Vaccine 27:726732, 2009), vacina anti-pneumocócica heptavalente conjugada à proteína CRM197, (Black S, et al. Vaccine 2006; 24:S2 7980), a vacina anti-pneumocócica 13 valente (Patent Number(s): US2009130137-A1) e mais recentemente uma vacina anti-pneumocócica 11 valente conjugada a proteína D de H. influenzae (Nurkka A, et al. The Pediatric Infectious Disease Journal 2004; 23:1008-14).

[0006] Mais raro do que o uso de polissacarídeos capsular é o uso de O-sacarídeos extraídos de lipopolissacarídeos (LPS) e lipooligossacarídeos (LOS) de bactérias Gram negativas. O-sacarídeos são igualmente conjugados a proteínas utilizando os mesmos processos descritos para polissacarídeos capsulares.

[0007] Os métodos de conjugação mais utilizados nas vacinas atualmente comercializadas são três: (1) Oxidação de hidroxilas vicinais da molécula do PS a aldeído e reação com o ε-amino-grupo presente em resíduos de lisina da proteína com a conseqüente formação de uma base de Schiff. A dupla ligação da base de Schiff resultante desta reação é reduzida com a adição de cianoboroidreto de sódio com o intuito de formar uma espécie mais estável (Laferriere CA, et al. Vaccine 1997; 15: 179-186). (2) Ativação de hidroxilas vicinais do PS por brometo de cianogênio seguido da adição da diidrazida do ácido adípico (ADH), composto chamado de espaçador, contendo seis átomos de carbonos. O composto resultante, PS-ADH, reage com o grupo carboxila da proteína em uma reação intermediada por hidrocloreto de (1-[3- (dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida), EDAC (Schneerson R, et al. The Journal of Experimental Medicine 1980; 152:361-76). (3) O PS é ativado por uma série de reações: com ácido oxálico em hidróxido de N-tetrabutil amônio seguido de reação com carbonil diimidazol, 1,4-diaminobutano e cloreto de bromo acetila. A proteína é ativada com N-acetil- homocisteína-tiolactona e di-tiotreitol para a adição de grupos sulfidrila, que irá reagir com o grupamento bromoacetila do PS (Marburg S, et al. Journal of the American Chemical Society 1986; 108:5282-5287).

[0008] As vacinas conjugadas atualmente no mercado, com raras exceções, utilizam um dos dois métodos citados à cima, (1) e (2). Por exemplo: a Hiberix®(Polissacarídeo de H influenzae tipo b - Toxoide tetânico) é preparada pelo método (2); a vacina MCC®(Polissacarídeo sorotipo C de N. meningitidis - CRM197) é obtida pelo método (1). PREVENAR®, a vacina heptavalente anti-pneumocócica no qual o PS sorogrupos 4, 6B, 9V, 14, 8C, 19F, 23F estão ligados ao CRM197 o método utilizado é o (1). O método (3) é empregado exclusivamente pela Merck para a fabricação de vacinas cuja proteína é a membrana externa da N. meningitidis como a vacina de H. influenzae, PedvaxHIB®.

[0009] A reação do PS-aldeído com o ε- amino grupo da lisina como descrito no método (1) do sub-ítem acima, é uma reação lenta (de 7 a 10 dias) e de baixo rendimento. As desvantagens do método (2) descrito no sub-ítem acima são: o brometo de cianogênio é um reagente tóxico além de ser facilmente oxidável; o reagente hidrocloreto de 1-[3- (dimetilamino) propil]-3-etil carbodiimida (EDAC), cuja função é formar um intermediário de baixa energia de ativação, é uma molécula que sofre hidrólise facilmente e visto que a reação de conjugação tem que necessariamente ser feita em água esta instabilidade do composto afeta negativamente o rendimento da reação. Outro fato a ser destacado é a formação de subprodutos devido ao rearranjo estrutural do grupo O-acilisureia no grupo N-acilureia mais estável.

[0010] Recentemente, foram publicados alguns novos métodos: (4) ativação do PS com tetrafluoroborato de 1-ciano- 4-dimetilaminopiridina sendo que este PS ativado reage com a proteína (Shafer DE, et al. Vaccine 2000;18:1273-1281); (5) utilização de derivados de aminoxi que reagem com a proteína e este complexo com grupamentos aldeídicos do PS oxidado (Lees A, et al. Vaccine 2006; 24: 716-729); (6) oxidação do PS para obtenção de grupamentos aldeídicos; os resíduos de carboxilas da proteína são ativados com o reagente hidrocloreto de (1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etil carbodiimida)(EDAC), para serem ligadas à hidrazina. O composto proteína-hidrazina é ligado ao PS através do seu grupamento aldeído (patente P10402984-4). Os métodos (4), (5) e (6) resultam em melhor rendimento de conjugação. Entretanto, nenhum dos métodos assim especificados, (4), (5), foram ainda utilizados na produção de vacinas desconhecendo-se assim o rendimento em caso de produção em larga escala. O método descrito como (6) segundo seus inventores, poderá ser utilizado para a produção de vacina anti-meningicócica sorogrupo A (Lee CH, et al. Vaccine 2009; 27:726-732). Por este método obtém-se uma mistura de conjugados que diferem na quantidade de PS ligados à proteína e na resposta imune como demonstrado pelos próprios autores (Lee CH, et al. Vaccine 2009; 27:726-732).

OBJETIVO DA INVENÇÃO

[0011] O objetivo da invenção é um novo método de obtenção de antígenos conjugados para serem utilizados como antígeno vacinal, sendo a etapa chave e de inovação, a conjugação do polissacarídeo modificado com a proteína carregadora mediada pelo uso do agente ativante DMT-MM [cloreto de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4- metilmorfolino]. Este método envolve uma série de reações químicas descritas a seguir: 1) a reação do polissacarídeo, nativo ou hidrolisado, com metaperiodato de sódio para a geração de resíduos aldeídicos (PS-oxi). 2) reação do PS-oxi com hidrazida ou diaminas gerando PS-NH2. 3) reação do composto PS-NH2com grupos carboxilas presentes na proteína. Esta reação de conjugação é intermediada pelo cloreto de 4- (4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolino (DMT- MM). Entende-se por reação intermediada aquela na qual para se formar um composto covalente de alta energia de ativação, A-C (conjugado polissacarídeo-proteína), A (grupos carboxilas derivados da proteína) reagiria com B (DMT-MM), uma reação mais fácil de ocorrer (baixa energia de ativação) e o composto A-B (espécie ativada) reagiria com C (PS-ADH) obtendo-se A-C (conjugado polissacarídeo-proteína). Neste caso, a proteína reage com o DMT-MM e este intermediário irá reagir com o PS-NH2, conforme o esquema da figura 1.

[0012] O DMT-MM pode ser chamado de agente ativador, pois ativa os grupos carboxilatos, no nosso caso oriundos do ácido glutâmico ou do ácido aspártico presentes na proteína, para posterior ataque nucleofílico pelos grupos -NH2 presentes nas moléculas de PS-ADH (polissacarídeo ligado à diidrazida do ácido adípico)ou outros derivados da reação do PS-aldeído com diaminas.

[0013] Um dos primeiros relatos sobre o reagente DMT- MM foi efetuado por Kunishima (Kunishima M, et al. Tetrahedron Letters 1999; 40:5327-5330). Este reagente é usualmente empregado para formação de carboxamidas em reações com moléculas orgânicas pequenas (Kunishima M, et al. Tetrahedron 2001; 57:1551-1558).

[0014] Mais recentemente há trabalhos em que se empregaram o DMT-MM para ativação de grupos carboxilatos presentes em polissacarídeos com o objetivo de conjugá-los com moléculas orgânicas (Schlottmann SA, et al. Journal of Immunological Methods 2006; 309:75- 85) e (Farkas P, Bystricky S, Carbohydrate Polymers 2007; 68:187-190). Cabe ressaltar que este processo é diferente do proposto por nós porque estes artigos não usam o DMT-MM para a obtenção de vacinas, mas sim para preparação de conjugados utilizados como marcadores. Neste caso, o grupo carboxilato do polissacarídeo é conjugado com aminas de acordo com o artigo citado acima (Farkas P; Bystricky S et al.) ou com microesferas de luminex, um composto constituído de poliestireno, divinilbenzeno e ácido metacrílico. Portanto, o uso do DMT-MM para conjugados de polissacarídeos com proteínas, e, principalmente para uso como antígeno vacinal, é uma iniciativa desta patente.

[0015] E para melhor compreensão do presente invento, seguem em anexo as seguintes figura:

[0016] A figura 1 ilustra o esquema - Formação da ligação covalente entre o PS-NH2e a proteína mediada pelo DMT-MM.

[0017] A figura 2 traz a tabela onde são apresentados os resultados obtidos para as reações de conjugação do polissacarídeo modificado do Haemophilus influenzae tipo b (PRP-ADH) mediada por DMT-MM. Em que a: Reações feitas em H2O. Concentrações iniciais: PRP-ADH 30mg/mL e TT 24 mg/mL; DMT-MM 0,1M (concentração final); b: Tampão fosfato dibásico 10mM pH 7; c: Excesso de DMT-MM 0,2 M; e d: PRP-ADH liofilizado.

[0018] A figura 3 é o cromatograma da reação entre o polissacarídeo modificado do Haemophilus influenzae tipo b (PRP-ADH) e o toxóide tetânico mediada pelo DMT-MM. Coluna Sephacryl S-400, fase móvel NaCl 0,2M e o fluxo de trabalho 0,6 mL/min (reação 4 - tabela da figura 2).

[0019] A figura 4 representa o cromatograma da reação entre o polissacarídeo modificado do Haemophilus influenzae tipo b (PRP-ADH) e o toxóide tetânico efetuada com EDAC. Coluna Sephacryl S-400. Fase móvel: NaCl 02,M (0,6mL/min).

[0020] A figura 5 representa a cromatograma da reação entre PS6B e PspA mediada pelo DMT-MM. Coluna Phenyl Sepharose. Eluição em gradiente decrescente de sulfato de amônio de 1,0 - 0,0 M (linhas tracejadas do gráfico).

[0021] A Figura 6 representa a concentração de anticorpos anti-PRP. O grupo co-administrado consiste no PRP e TT não conjugados. Vacina Butantan: conjugado PRP-TT mediado pelo DMT-MM. Os asteriscos indicam diferenças estatisticamente significativas (**p <0,0001).

[0022] A Figura 7 representa o ensaio de opsonofagocitose.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0023] Descrevemos aqui um método novo onde o PS é oxidado para a obtenção de grupamentos aldeídicos e ligado a uma diidrazida com o objetivo de gerar uma ligação hidrazona, a qual, subseqüentemente, será reduzida com o emprego de NaBH4 (PS-ADH). O grupamento amínico do PS-ADH se ligará a carboxila da proteína em reação intermediada pelo reagente cloreto de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4- metilmorfolino (DMT-MM) em substituição ao hidrocloreto de 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida (EDAC), reagente utilizado no método denominado (2). Este método (2) descrito no item “O ESTADO DA ARTE” consiste na ativação de hidroxilas vicinais do PS por brometo de cianogênio seguido da adição da diidrazida do ácido adípico (ADH), sendo que o composto resultante, PS-ADH, reage com o grupo carboxila da proteína em uma reação intermediada pelo EDAC (Schneerson R, et al. The Journal of Experimental Medicine 1980; 152:36176). O reagente EDAC também é utilizado no método denominado (6) descrito no item “O ESTADO DA ARTE” deste relatório. Neste método o PS é oxidado para obtenção de grupamentos aldeídicos; os resíduos de carboxilas da proteína são ativados com o reagente EDAC)para serem ligadas à hidrazina e o composto proteína-hidrazina é ligado ao PS através do seu grupamento aldeído (patente P10402984-4). O reagente cloreto de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4- metilmorfolino (DMT-MM) é muito mais vantajoso por ser menos suscetível à hidrólise do que o hidrocloreto de 1-[3- (dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida (EDAC). Ou seja, o DMT-MM é mais estável em solução aquosa do que o EDAC utilizado pelos autores da patente.

[0024] Descrevemos a seguir a preparação de dois conjugados: 1. Polissacarídeo sorotipo b de H. influenzae com o toxóide tetânico; 2. Polissacarídeo sorotipo 6B de Streptococcus pneumoniae com a proteína de superfície A (PspA). EXEMPLO 1: Preparação do conjugado polissacarídeo capsular do Haemophilus influenzae tipo b (PRP) com o toxóide tetânico utilizando hidrocloreto de 1-[3- (dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida (EDAC) e cloreto de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolino (DMT- MM). Comparação entre os dois métodos.

[0025] O toxóide tetânico foi produzido no Instituto Butantan no setor de produção de Vacinas Anaeróbicas. O H. influenzae tipo b foi cultivado no laboratório de fermentação do Centro de Biotecnologia do Instituto Butantan em bioreator Bio Flo 2000 em meio contendo peptona de soja e extrato de levedura como fonte de nitrogênio, glicose como fonte de carbono, sais e fatores de crescimento (Takagi M, et al. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2006; 81:182-188).

[0026] O PS, o poli-ribosil-ribitol fosfato (PRP) foi purificado do sobrenadante do cultivo por precipitação fracionada com etanol, hidrólise de contaminantes por proteases e nucleotidase e ultrafiltração tangencial em membranas de corte nominal de 100 kDa (Millipore) na presença de deoxicolato de sódio para eliminar produtos de hidrólise de proteínas, ácidos nucléicos, e lipopolissacarídeos (Tanizaki MM, et al. Journal of Microbiological Methods 1996; 27:19-23). Este PS foi utilizado na sequência de reações a seguir:

[0027] Reação 1 -Oxidação do polissacarídeo: 50 mL do polissacarídeo capsular do H. influenzae tipo b (PRP) (10 mg/mL) foi oxidado com metaperiodato de sódio (NaIO4) 10mM em tampão fosfato dibásico 10 mM por 30 minutos a temperatura ambiente e no escuro. Após, adicionou-se 370 μL de glicerol para interromper a reação. A mistura reacional foi ultrafiltrada em sistema Labscale®contendo membrana Pellicon XL (PLCCC 5). O produto, chamado de PRP-Oxi, foi obtido em rendimento de 98%. Sendo a unidade básica do PRP, o ribosil-ribitol-fosfato, as hidroxilas vicinais se localizam no ribitol. A oxidação dos resíduos de ribitol resultam na quebra da cadeia do PS e as condições de oxidação foram estabelecidas para se obter o PRP fragmentado de tamanho em torno de 40 kDa contendo grupamentos aldeídicos nos dois terminais da molécula. A massa molar média do PS é determinada por cromatografia líquida empregando coluna de exclusão molecular (gel filtração) em sistema HPLC ou Akta prime. As colunas foram calibradas com Dextranas de diferentes massas molares (2000 kDa, 229 kDa, 70 kDa, 40 kDa e 10 kDa) e a fase móvel empregada foi NaCl 0,2 M (0,6 mL/min). A extensão da oxidação é medida por método colorimétrico na reação com o ácido bicinchonínico (BCA) (Tyllianakis EP, et at. Analytical Biochemistry 1994; 219:335-340).

[0028] Reação 2 - Reação do PS-oxi: 41 mL de uma solução aquosa de PRP oxidado (PRP-oxi, 9,5 mg/mL) foi incubada com diidrazida do ácido adípico (ADH) na proporção de 10 vezes o número de moles de aldeído (0,11 g) por 4 horas em fosfato de sódio dibásico 10 mM, pH 7,5. Após este período, adicionou-se 0,25 mL de uma solução de NaBH4 5 M em NaOH 0,2%. O produto obtido PRP-ADH foi purificado por cromatografia de exclusão molecular em Sephadex G-25. A massa molar média do PRP-ADH foi determinada em Sephacryl S-400 previamente calibrada. A extensão da reação do PRP-oxi com o ADH foi verificada pela reação com TNBS (Qi XY, et al. Analytical Biochemistry 1988; 175:139-144), no qual se determina o número de grupos NH2presentes. A partir desta etapa foram feitos dois experimentos diferentes de conjugação: a primeira utilizando o EDAC como intermediário (Reação 3a)e a segunda utilizando o DMT-MM como intermediário (Reação 3b).

[0029] Reação 3a - Conjugação com EDAC: 0,5 mL de PRP- ADH (30 mg/mL) foi incubado com TT (15mg) e 0,1 M de hidrocloreto de 1-[3-(dimetilamino)propil]-3- etilcarbodiimida (EDAC) por 4 horas em pH 7,5 (solução de fosfato de sódio dibásico 10 mM, NaCl 0,15 M). O conjugado foi purificado em sistema de cromatografia líquida Akta Prime com coluna Sephacryl S-400 e fase móvel NaCl 0,2 M (0,6 mL/min). O rendimento reacional obtido foi de 12%. A reação de conjugação (PRP-ADH com TT mediada por EDAC) também foi efetuada por tempo de reação maior (24 h), não sendo observado aumento no rendimento reacional.

[0030] Reação 3b - Conjugação com DMT-MM: Toxóide tetânico foi ativado com 0,1 M de cloreto de 4-(4,6-dimetoxi- 1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolino (DMT-MM) em água. Em seguida adicionou-se o PRP-ADH e a mistura reacional foi agitada por 24 horas (Tabela 1). O conjugado foi purificado em coluna de Sephacryl S-400 sendo que a fase móvel empregada NaCl 0,2 M (0,6 mL/min).

[0031] O conjugado deve ser purificado para eliminar o polissacarídeo e a proteína livre, assim como o excesso do EDAC ou do DTM-MM. Os experimentos utilizando o DMT-MM estão apresentados na Tabela 1 e o perfil de eluição de um desses conjugados está apresentado na Figura 1. Na figura 2 está o cromatograma da melhor condição de conjugação obtida por nós, com o emprego do EDAC.

[0032] O mesmo protocolo pode ser utilizado para obtenção de vacina conjugada para Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis ou outras bactérias encapsuladas (exemplo 2): EXEMPLO 2: Preparação do conjugado polissacarídeo capsular do Streptococcus pneumoniae sorotipo 6B com a proteína recombinante PspA utilizando cloreto de 4-(4,6- dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolino (DMT-MM).

[0033] A proteína recombinante PspA clonada e inserida em E. coli B121(DE3) usando o vetor pET-pspA1 foi cultivada e purificada pelo Laboratório de Fermentação do Centro de Biotecnologia do Instituto Butantan. A bactéria S. pneumoniae sorotipo 6B foi cultivada em biorreator Bio Flo 2000 e o PS6B, [α-D-Galp(1-3)-α-D-Glcp(1-3)-α-L-Rhap(1-4)- D-Ribitol-5-PO4], foi purificado do sobrenadante do cultivo conforme método descrito por nós (Gonçalves VM, et al. Biotechnology and Applied Biochemistry 2003; 37:283-287).

[0034] Nenhum dos principais polissacarídeos capsular dos diversos sorotipos do S. pneumoniae possui em sua estrutura açúcares não cíclicos, fazendo parte da cadeia principal, portanto previamente à reação de oxidação com o metaperiodato de sódio, com intuito de diminuir o tamanho do polissacarídeo, é necessário submeter o PS a uma hidrólise ácida com ácido clorídrico a 80°C. A concentração do ácido clorídrico e o tempo de hidrólise deverão ser determinados para cada sorotipo.

[0035] Reação 1 - Hidrólise do polissacarídeo: 25 mL do polissacarídeo capsular do S. pneumoniae sorotipo 6B (12 mg/mL) foi hidrolisado pela adição de HCl 0,5 M e aquecimento à 80° C sob refluxo e agitação durante 1 hora. A hidrólise foi interrompida pela adição de hidróxido de sódio até a neutralização (pH 7,5). Após a hidrólise, o tamanho do polissacarídeo foi determinado por cromatografia de gel filtração (Sephacryl S-400) seguindo as condições descritas acima no exemplo 1. O peso molecular resultante desse processo de hidrólise para o PS6B foi de 20 kDa, dentro da faixa de tamanho considerada ideal que se situa entre 10 a 90 kDa.

[0036] Reação 2 - Oxidação do polissacarídeo: 25 mL do polissacarídeo capsular do S. pneumoniae sorotipo 6B (10 mg/mL) foi oxidado com metaperiodato de sódio (NaIO4) 10 mM em tampão fosfato dibásico 10 mM por 30 minutos a temperatura ambiente e no escuro. A reação foi finalizada pela adição de 195 μL de glicerol. O PS6B oxidado foi purificado através de cromatografia de exclusão molecular em Sephadex G25, utilizando água como fase móvel e fluxo de 10 mL/min em sistema Akta prime. A extensão da oxidação foi medida por método colorimétrico na reação com o ácido bicinchonínico (BCA) (Tyllianakis EP, et at. Analytical Biochemistry 1994; 219:335-340).

[0037] Reação 3 - Reação do PS-oxi: 4 mL de uma solução aquosa de PS6B oxidado (10,0 mg/mL) foi incubada com diidrazida do ácido adípico (ADH) na proporção de 50 vezes o número de moles de aldeído (90 mg) por 24 horas em fosfato de sódio dibásico 10 mM, pH 7,5, acrescido de cianoboroidreto de sódio (NaBH3CN) na proporção de 50 vezes o número de moles de aldeído (32 mg). A reação foi cessada pela adição de 100 μL de uma solução 5M de boroidreto de sódio (NaBH4) em NaOH 0,2%.O produto obtido PS6B-ADH foi purificado por cromatografia de exclusão molecular em Sephadex G-25 utilizando água como fase móvel e fluxo de 10 mL/min em sistema Akta prime. A extensão da reação do PS6B-oxi com o ADH foi verificada pela reação com TNBS (Qi XY, et al. Analytical Biochemistry 1988; 175:139-144).

[0038] Reação 4 - Conjugação com DMT-MM: 20 mg de PspA (20 mg/mL) foi previamente ativado com 0,1 M de cloreto de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolino (DMT- MM) em tampão fosfato 10 mM e incubado com 10 mg de PS-ADH (10 mg/mL) por 24 horas. Para a eliminação do excesso de DMT-MM que não reagiu, a mistura reacional foi dialisada contra uma solução 0,1 M de NaCl e 10 mM de fosfato de sódio dibásico (pH 7,5). O conjugado foi purificado por cromatografia hidrofóbica em resina de Phenyl Sepharose 6 Fast Flow High Sub e eluído em gradiente decrescente de Sulfato de Amônio de 1,0 - 0,0 M. O perfil de eluição para essa reação de conjugação está apresentado na figura 5.

[0039] A reação descrita nesse exemplo 2 resultou na obtenção de dois conjugados que possuem diferente afinidade com a resina de Phenyl Sepharose conforme mostrado na figura 5. As porcentagens obtidas de PS6B-ADH livre e PS6B conjugado foi de 48,4% e 51,6% respectivamente. Já a relação em massa entre PspA e PS6B nos conjugados foi de 5,6 para o primeiro conjugado e de 2,2 para o segundo. Esse rendimento mostra-se bastante superior ao comumente observado, uma vez que, de forma geral, menos de 20% do PS ativado é capaz de se ligar efetivamente à proteína.

[0040] A análise qualitativa e quantitativa do PS6B foi efetuada pelo método de Fenol-Sulfúrico (Dische Z, Shettles LB. The Journal of Biological Chemistry 1948; 175:595-603). Já a análise qualitativa da eluição do PspA foi feita por leitura da absorbância em 280nm e a quantitativa pelo método colorimétrico na reação com o ácido bicinchonínico (BCA). Como parâmetro de comparação também foram injetados o PspA e o PS6B-ADH de partida.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FIGURAS

[0041] A figura 1 ilustra o esquema utilizado nesta patente com ênfase na formação da ligação covalente entre o PS-NH2e a proteína.

[0042] A figura 2 traz a tabela onde são apresentados os resultados obtidos para as reações de conjugação do polissacarídeo modificado do Haemophilus Influenzae tipo b (PRP-ADH) mediada por DMT-MM. Cabe destacar alguns parâmetros que foram avaliados: concentração de polissacarídeo (PRP-ADH), concentração da proteína (toxóide tetânico), tempo reacional e proporção entre os reagentes. Todas as reações foram feitas em água exceto onde estiver indicado. Pode-se observar pela análise da tabela da figura 2, que o aumento do tempo reacional de 5 para 24 horas apresentou um ligeiro aumento no rendimento reacional (reação 1 e 2). O melhor rendimento reacional foi obtido quando se empregou o polissacarídeo liofilizado que foi dissolvido na solução da proteína que estava em excesso (reação 6).

[0043] A figura 3 é o cromatograma da reação entre o PRP-ADH e o toxóide tetânico mediada pelo DMT-MM. Coluna de exclusão molecular (gel filtração) Sephacryl S-400 sendo a fase móvel NaCl 0,2M e o fluxo de trabalho 0,6 mL/min (reação 4 - tabela da figura 2). Como parâmetro de comparação também foram injetados o toxóide tetânico livre (TT) e o PRP-ADH de partida. A determinação do conteúdo de polissacarídeo foi efetuada empregando o método colorimétrico com orcinol sendo a leitura da absorbância em 668 nm. Já o conteúdo de proteína foi verificado pela leitura da absorbância em 280 nm.

[0044] A figura 4 representa o cromatograma da reação entre o PRP-ADH e o toxóide tetânico efetuada com EDAC. Coluna Sephacryl S-400. Fase móvel: NaCl 02,M (0,6mL/min).

[0045] Através da análise das figuras 3 e 4 fica evidenciado a superioridade da reação de conjugação mediada por DMT-MM nas condições por nós estudadas. Em ambos os casos, o produto, ou seja, o conjugado PRP-TT, que apresenta maior massa molar, é o primeiro pico do cromatograma (PRP- conjugação), pico que não existia no PRP-ADH antes da conjugação. Cabe ressaltar que também ocorreu mudança no perfil de eluição da proteína (toxóide tetânico).

[0046] A figura 5 representa a cromatograma da reação entre PS6B e PspA mediada pelo DMT-MM. Coluna Phenyl Sepharose. Eluição em gradiente decrescente de sulfato de amônio de 1,0 - 0,0 M (linhas tracejadas do gráfico).A mistura reacional foi acrescida de sulfato de amônio [(NH4)2SO4] suficiente para tornar a solução 1M com relação a esse sal. Em seguida, foi filtrada em membrana de corte 0,22 μm (Millipore) e purificada por cromatografia hidrofóbica em resina de Phenyl Sepharose 6 Fast Flow High Sub acoplada a um sistema Akta prime. Os primeiros 100 mL foram eluídos sob fluxo isocrático de 1 M de sulfato de amônio, seguido de 150 mL de eluição em gradiente decrescente de sulfato de amônio de 1,0 - 0,0 M. Terminado o gradiente, seguiu-se eluição com 100 mL de água. A figura 5 representa o perfil de eluição dessa cromatografia tanto para o PS6B como para o PspA.

DEFINIÇÕES

[0047] No âmbito deste pedido de patente são empregados por diversas vezes abreviaturas e termos cujas definições estão resumidas abaixo:

[0048] DMT-MM - refere-se ao agente ativador cloreto de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolino.

[0049] EDAC - refere-se ao agente ativador hidrocloreto de (1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida).

[0050] Processo de conjugação - refere-se à sequência de reações químicas necessárias para se obter o antígeno vacinal, o qual seja, polissacarídeo-proteína.

[0051] PS - refere-se ao polissacarídeo capsular.

[0052] PRP - refere-se ao polissacarídeo capsular poli- ribosil-ribitol fosfato.

[0053] PS-ADH - refere-se ao polissacarídeo capsular ligado a molécula espaçadora diidrazida do ácido adípico.

[0054] PS-oxi - refere-se ao polissacarídeo capsular oxidado.

[0055] PSpA - refere-se à proteína de superfície A do S. pneumoniae.

[0056] TT - refere-se à proteína toxóide tetânico

AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE INDUZIDA PELO CONJUGADO PRP-TT PRODUZIDO POR CONJUGAÇÃO ENVOLVENDO O AGENTE ATIVADOR DMT-MM EXEMPLO 1: CONJUGADO PRP-TT

[0057] 1) Esquema de Imunização: camundongos Balb/c fêmeas de 8 semanas (6 por grupo) foram imunizados por via subcutânea no 1°, 15° e 29° dia com 5 μg de PRP conjugado com o toxóide tetânico (PRP-TT) ou co-administrado com TT, em solução salina 0.9%. Animais imunizados com solução salina foram utilizados como controle. Foram realizadas sangrias retro-orbital nos dias 140, 280 e 420. Os soros dos camundongos foram estocados a -20 °C antes do uso. A concentração de anticorpos anti-PRP foi determinada empregando uma curva de calibração de anticorpo padrão. As concentrações de anticorpos anti-PRP obtidas (Figura 1) foram comparadas por Análise de Variância (ANOVA) fator único, seguido pelo teste de Tukey. Vacinas conjugadas contra Haemophilus influenzae tipo b com níveis de anticorpos anti- PRP >0,15μg/mL podem ser protetoras.

EXEMPLO 2: CONJUGADO PS6B-PspA

[0058] 1)Procedimento de Imunização: camundongos Balb/c fêmeas de 8 semanas (6 por grupo) foram imunizados por via intraperitoneal no 1°, 14° e 28° dia com 15 μg de PS6B conjugado ou co-administrado com PspA, em solução salina 0.9% acrescida de 50 μg de Al(OH)3como adjuvante (dose de 500 μL por camundongo). Animais imunizados com solução salina e Al(OH)3 foram utilizados como controle. Foi realizada sangria retro-orbital no 41° dia e o soro dos camundongos foi estocado a -20 °C antes do uso.

[0059] 2) Cepa de Streptococcus pneumoniae: a cepa 679/99 de Streptococcus pneumoniae (sorotipo 6B) foi fornecida pelo Instituto Adolfo Lutz (São Paulo, Brasil) e mantida em meio Todd-Hewitt (BD Biosciences, Franklin Lakes, N.J., USA) suplementado com 0.5% de extrato de levedura (THY) (Sigma Chemical Co., St Louis, MO., USA) contendo 10% de glicerol e estocada à -80 °C.

[0060] 3) Ensaio de Opsonofagocitose (OPA): os pools dos soros dos camundongos imunizados tiveram seu complemento inativado por incubação a 56 °C por 30 min. A cepa 679/99 de S. pneumoniae foi crescida em Todd-Hewitt até a concentração de aproximadamente 108 CFU/mL (DO600nm entre 0,4-0,5) e em seguida centrifugada por 10 min a 5000g e 4 °C. O pellet obtido foi lavado uma vez com PBS e ressuspendido com tampão Hank’s (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA). 100 μL da cepa ressuspendida (108 CFU/mL) foram incubados por 30 min à 37 °C na presença do pool dos soros em teste (previamente inativados) diluídos 1:16. Após incubação foi acrescido 10% de soro normal de camundongo como fonte de complemento e seguiu-se uma nova incubação à 37 °C por 30 min. Após lavagem com PBS foi realizada incubação com 4 x 105 células peritoneais em um volume final de 100 μL à 37 °C por 45 min sob agitação (220 rpm). As células peritoneais utilizadas nessa etapa foram coletadas através da lavagem do peritônio de camundongos com 5 mL de PBS gelado seguida de centrifugação a 1000g. Esses camundongos foram previamente estimulados (48 h antes do ensaio) com 10 μg de concanavalina (ConA) de Canavalia ensiformis (Sigma-Aldrich, St Louis, MO). Após os 45 min de incubação com células peritoneais, a reação foi interrompida por incubação em gelo durante 5 minutos. As amostras foram diluídas em PBS e semeadas em placas de ágar sangue. As placas foram incubadas à 37 °C, 5% CO2 e a contagem do número de bactérias viáveis foi feita após 20 h (Goulart C, et al. Vaccine. 2011; 29:1634-42).

[0061] 4) Resposta imune induzida pelo conjugado PS6B- PspA: a opsonofagocitose é considerada o mecanismo primário de defesa do organismo contra a doença pneumocócica (Tuomanen EI, et al. The New England Journal of Medicine 1999; 332:1280-4) e (Poolman JT. Vaccines 2004; 3:597-604). O ensaio de opsnofagocitose (OPA) apresenta um grande correlato de proteção (Schuerman L, et al. Vaccine 2007; 25:1962-8) e (Henckaerts I, et al. Vaccine 2007; 25:2518-27) sendo inclusive recomendado pela Organização Mundial da Saúde como ensaio para determinação da eficácia vacinal (Ekstrom N, et al. Infection and Immunity 2007; 75:1794800). Diante disso, a resposta imune induzida pelo conjugado PS6B-PspA foi avaliada por OPA. De acordo com a figura 1, observa-se que os macrófagos peritoneais, na presença do soro de camundongos imunizados com o conjugado, foram capazes de fagocitar o pneumococo, mostrando uma redução significativa no número de UFCs recuperadas quando comparado aos grupos controles.

[0062] A cepa pneumocócica 679/99 (sorotipo 6B) foi incubada com soro de camundongos imunizados com PS6B conjugado pelo método DMT-MM (Conj. PS6B -PspA), ou com PS6B co-administrado, ambos acrescidos de soro normal de camundongo como fonte de complemento. Os pneumococos opsonizados foram incubados com células peritoneais e plaqueados em ágar sangue. Soro de camundongos imunizados com salina e Al(OH)3 foi utilizado como controle. O número de UFCs recuperadas após 20 h foi comparado por Análise de Variância (ANOVA) fator único, seguido pelo teste de Tukey. Os asteriscos indicam diferenças estatisticamente significativas (*** p <0,0001). Os resultados são representativos de dois experimentos independentes.

Claims (8)

1. Método de conjugação de polissacarídeo capsular a uma proteína carregadora, para uso como antígeno vacinal contra bactérias encapsuladas, utilizando o reagente cloreto de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4- metilmorfolino (DMT-MM), caracterizado pelo fato de compreender a reação entre um polissacarídeo capsular (PS) e uma proteína mediada pelo ativador cloreto de 4-(4,6- dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolino (DMT-MM), em que a reação compreende as seguintes etapas: a) oxidação do polissacarídeo (PS) para a obtenção de grupamentos aldeídicos (PS-oxi) pelo emprego de um agente oxidante, tal como NaIO4; b) reação do PS-oxi (polissacarídeo oxidado) com uma diidrazida ou diamina na presença de cianoboroidreto de sódio; em que a ligação hidrazona gerada é subseqüentemente reduzida pela adição de boroidreto de sódio, e o produto resultante é denominado PS-NH2 ou PS-ADH quando do emprego da diidrazida do ácido adípico; e c) conjugação do grupamento amínico do PS (PS-NH2ou PS-ADH) à carboxila da proteína, em que a conjugação é intermediada pelo reagente cloreto de 4-(4,6-dimetoxi- 1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolino (DMT-MM); em que o polissacarídeo (PS) é modificado, quando na ausência de açúcares não cíclicos com hidroxilas vicinais na cadeia principal, pela hidrólise com ácido clorídrico a 80°C, e em que a concentração do ácido clorídrico e o tempo de hidrólise deverão ser determinados para cada polissacarídeo.

2. Método de conjugação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender a reação entre um polissacarídeo capsular modificado e uma proteína previamente ativada com cloreto de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5- triazin-2-il)-4-metilmorfolino (DMT-MM).

3. Método de conjugação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender a reação entre um PS capsular, contendo grupamentos carboxílicos, com cloreto de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4- metilmorfolino (DMT-MM) e uma proteína.

4. Método de conjugação, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o PS capsular é nativo ou modificado.

5. Método de conjugação, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o polissacarídeo capsular é obtido de bactérias encapsuladas tais como: meningococo, pneumococo, Haemophilus influenzae, Salmonella typhi e streptococo grupo B.

6. Método de conjugação, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato das proteínas serem selecionadas dentre: toxóide tetânico, toxóide diftérico, CRM 197, vesícula de membrana externa de N. meningitidis ou quaisquer novas proteínas utilizadas para melhorar a resposta imune da vacina.

7. Método de conjugação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato do uso como antígeno vacinal ser para a manufatura de uma vacina.

8. Método de conjugação, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato do uso como antígeno vacinal ser para a manufatura de uma vacina com ação via ativação específica do sistema imune.

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