BRPI0904528A2 - método de conjugação de polissacarìdeo capsular a uma protéina carregadora, para uso como antìgeno vacinal contra bactérias encapsuladas, utilizando o reagente cloreto de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolino (dmt-mm) - Google Patents

Abstract

MéTODO DE CONJUGAçãO DE POLISSACARìDEO CAPSULAR A UMA PROTEìNA CA1~REGADORA, PARA USO CONO ~NTìGENO VACINAL CONTRA BACTéRIAS ENCAPSULADAS, UTILIZANDO O REAGENTE CLORETO DE 4-(4, 6-DIMETOXI-1 ,3,5-TRIAZIN-2-IL) -4-METILMORFOLINO (DMT-MM), o qual consiste num método de conjugação entre polissacarídeo capsular e proteína para obtenção de antígeno vacinal, sendo que a etapa de conjugação é mediada pelo reagente cloreto de 4-(4,6-dimetoxi-l,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolino (DMT-MM) consistindo na inovação do processo de obtenção de antígenos vacinais.

Description

"método de conjugação de polissacarídeo capsular a umaproteína carregadora, para uso como antígeno vacinal contra

bactérias encapsuladas, utilizando o reagente cloreto de 4-(4 , 6-dimetoxi-l, 3 , 5-triazin-2-il) -4-metilmorfolino (dmt-mm) "

campo da invenção.

A presente invenção refere-se a um método deconjugação do polissacarideo capsular (PS) a uma proteínacarregadora objetivando a produção do antígeno vacinai contra bactérias encapsuladas patogênicas empregando ocloreto de 4-(4,6-dimetoxi-l,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolino (DMT-MM) na etapa chave do processo deconjugação. A etapa chave do processo de conjugaçãoconsiste na ligação covalente do polissacarideo capsular,previamente modificado quimicamente, a uma proteína. Oemprego do DMT-MM como molécula ativadora nessa etapa é umainovação que justifica esta patente.fundamentos da invenção

A cápsula é o envoltório externo da bactéria e é constituída de polissacarídeos de alto peso molecular quepode variar de 400.000 a 1 milhão de kDa. Essespolissacarídeos são polímeros cuja unidade básica écomposta> por 2 à 6 monossacarídeos que podem estar orto-acetilados ou ligados a grupos fosfatos ou glicerol. A estrutura química do polissacarideo é a base P^ra aclassificação das bactérias encapsuladas em sorotipos ousorogrupos. A cápsula é um importante fator de virulênciapois protege a bactéria contra a fagocitose. Por estarazão, o polissacarideo capsular livre ou conjugado a umaproteína, é o principal antígeno vacinai contra bactériasencapsuladas. 0 polissacarideo livre como antígeno vacinaipossui uma eficácia limitada pela característica antigênicados polissacarídeos, que são antígenos independentes decélulas T (TI) . Por ser um antígeno do tipo TI, o PS induzanticorpos de pouca duração, predominantemente IgM,anticorpos de baixa avidez e não é imunogênico paracrianças abaixo de 2 anos. A conjugação covalente do PS auma proteína transforma o PS em antíçfeno dependente decélulas T (TD). Por esta razão o polissacarideo conjugado auma proteína é uma vacina mais utilizada atualmentetendendo a substituir cada vez mais as vacinas de PSlivres. Se de um lado estas vacinas são mais eficazesinclusive para crianças menores de 2 anos, todas as vacinasconjugadas são de alto custo devido à necessidade deinúmeras etapas para a sua produção quais sejam: cultivo dabactéria, purificação do PS e conjugação. Dentre essasetapas, a conjugação é um dos passos mais problemáticosdevido à necessidade de várias reações químicas e ao baixorendimento final. Assim, embora essas vacinas sejamamplamente utilizadas, principalmente nos paísesdesenvolvidos, é necessário que se continue aperfeiçoandoseus métodos de produção, barateando o seu custo paraampliar o uso inclusive nos países em desenvolvimento.

Entende-se por conjugação a obtenção de um compostocovalente, neste caso, um composto covalente polissacarídeo- proteína. 0 processo de conjugação do polissacarídeo àproteína é constituído de várias reações químicas cujasprincipais são: 1. introdução de um grupo reativo namolécula do polissacarídeo que pode ser um grupamentoamina, carboxila ou aldeído; 2. introdução de uma ponte decarbono de ligação entre o polissacarídeo e a proteína,geralmente chamada de molécula espaçadora, reação nãoessencial mas que pode aumentar o rendimento da reação 3.reação do polissacarídeo modificado com a proteína parafinalmente se obter o conjugado. É importante frisar queapós cada reação deve haver uma etapa de purificação paraque o excesso de reagentes adicionados na reação anteriornão interfira na reação subseqüente. Pela necessidade devárias etapas o rendimento final do processo de conjugaçãoé em torno de 20 - 30% razão que se reflete no alto custodo produto e mais, o que justifica que novos métodos deconjugação sejam ainda intensamente pesquisados. Outroesclarecimento importante é que várias reações deconjugação utilizam na etapa 3, especificado à cima, umamolécula orgânica mais reativa do que as macromoléculas dareação, o polissacarídeo e a proteína, o que irá facilitara reação abaixando a energia de ativação. Issoprincipalmente quando se trata de uma reação em que há aparticipação de um grupo carboxila da proteína, grupo este,de baixa reatividade para a obtenção de uma ligaçãocovalente estável. A molécula mais utilizada para formar umintermediário capaz de diminuir a energia de ativação epermitir que a reação se processe é o hidrocloreto de (1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etil carbodiimida) , EDAC

(Schneerson R, et al. The Journal of Experimental Medicine1980; 152:361-76). Na presente invenção a moléculaempregada com a função de favorecer a reação dopolissacarideo modificado com a proteína é o cloreto de 4-(4, 6-dimetoxi-l,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolino (DMT-MM) . Cabe ressaltar que o emprego do DMT-MM como molécula ativadora para formação de um antígeno vacinai é umainovação desta patente.

O ESTADO DA ARTE

São descritas diversas bactérias encapsuladas deimportância em saúde pública como: Neisseria meningitidis,Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae,

Salmonella typhi etc... N. meningitidis, H. influenzae e S.pneumoniae são responsáveis por infecções graves comomeningite, pneumonia, bacteremia e a S. typhi pela febretifóide. Dado o alto índice de mortalidade e morbidade das infecções provocadas por esses microrganismos a vacinação éuma medida aconselhada pela OMS. Essas bactérias possuem umenvoltório externo, a cápsula, constituído depolissacarídeos de alto peso molecular (PS). Essespolissacarídeos são polímeros cuja unidade básica (monômero) compreende entre 2 a 6 açúcares podendo contertambém grupos fosfatos e glicerol. Pelo fato de ser oenvoltório mais externo da bactéria e também por ser umimportante fator de virulência, o PS é o antigeno maisutilizado em vacinas.

Por ser um antigeno do tipo timo independente, o PSinduz anticorpos de pouca duração, predominantemente IgM,anticorpos de baixa avidez e não induzem resposta imune emcrianças abaixo de 2 anos (Poolman, JT. Polysaccharides andmembrane vaccines. Mizrahi, A. ed. Advances inbiotechnological processes, vol. 13. Wiley-Liss N.Y., 59-84, 1990) . A conjugação covalente do PS a uma proteínatransforma o PS em antigeno timo dependente e esteconjugado induz anticorpos protetores em crianças abaixo de2 anos. As primeiras vacinas conjugadas PS-proteína, foramas vacinas anti - H. influenzae tipo b (Hib) , testadas ecomercializadas nos anos 80 com grande sucesso utilizandocomo proteínas carregadoras o toxóide tetânico (TT), atoxina diftérica inativada (CRM197) e vesículas demembrana externa da N. meningitidis (Kniskern, P.J.,Marburg, S. Conjugation: design, chemistry and analysis.In: Development and clinicai uses of Haemophilus bconjugate vaccines. Ellis, RW, Granoff, DM. eds. MareeiDekker, Inc, N.Y. 37-69, 1994). Devido ao grande sucessodas vacinas anti- Hib que foram as responsáveis por debelaras epidemias de meningite provocadas por H. influenzae tipob nos Estados Unidos e em muitos países da Europa nos anos60 e 70, surgiram no final do século passado outras vacinasconjugadas como a anti-meningocócica sorotipo C conjugadaao CRM197 (Costantino P, et al. Vaccine 1992; 10:691-198),vacina conjugada anti-meningocócica sorotipo A (Lee CH,et al. Vaccine 27: 726-732, 2009), vacina anti-pneumocócica heptavalente conjugada à proteína CRM197,(Black S, et al. Vaccine 2006; 24:S2 79-80), a vacina anti-pneumocócica 13 valente (Patent Number(s): US2009130137-A1)e mais recentemente uma vacina anti-pneumocócica 11 valenteconjugada a proteína D de H. influenzae (Nurkka A, et al.The Pediatrie Infeetious Disease Journal 2004; 23:1008-14).

Mais raro do que o uso de polissacarídeos capsularé o uso de O-sacarídeos extraídos de lipopolissacarídeos(LPS) e lipooligossacarídeos (LOS) de bactérias Gramnegativas. O-sacarídeos são igualmente conjugados aproteínas utilizando os mesmos processos descritos parapolissacarídeos capsulares.

Os métodos de conjugação mais utilizados nasvacinas atualmente comercializadas são três: (1) Oxidaçãode hidroxilas vicinais da molécula do PS a aldeído e reaçãocom o ε-amino-grupo presente em resíduos de lisina daproteína com a conseqüente formação de uma base de Schiff.

A dupla ligação da base de Schiff resultante desta reação éreduzida com a adição de cianoboroidreto de sódio com ointuito de formar uma espécie mais estável (Laferriere CA,et al. Vaeeine 1997; 15: 179-186). (2) Ativação dehidroxilas vicinais do PS por brometo de cianogênio seguidoda adição da diidrazida do ácido adípico (ADH), compostochamado de espaçador, contendo seis átomos de carbonos. 0composto resultante, PS-ADH, reage com o grupo carboxila daproteína em uma reação intermediada por hidrocloreto de (1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida), EDAC(Schneerson R, et al. The Journal of Experimental Medicine1980; 152:361-76). (3) 0 PS é ativado por uma série dereações: com ácido oxálico em hidróxido de W-tetrabutilamônio seguido de reação com carbonil diimidazol, 1,4-diaminobutano e cloreto de bromo acetila. A proteína éativada com 2\7-acetil-homocisteína-tiolactona e di- tiotreitol para a adição de grupos sulfidrila, que iráreagir com o grupamento bromoacetila do PS (Marburg S, etal. Journal of the American Chemical Society 1986;108:5282-5287).

As vacinas conjugadas atualmente no mercado, com raras exceções, utilizam um dos dois métodos citados àcima, (1) e (2) . Por exemplo: a Hiberix® (Polissacarideo deH influenzae tipo b - Toxoide tetânico) é preparada pelométodo (2) ; a vacina MCC® (Polissacarídeo sorotipo C de N.meningitidis - CRM197) é obtida pelo método (1). PREVENAR®, a vacina heptavalente anti-pneumocócica no qual o PSsorogrupos 4, 6B, 9V, 14, 8C, 19F, 23F estão ligados aoCRM197 o método utilizado é o (1) . 0 método (3) é empregadoexclusivamente pela Merck para a fabricação de vacinas cujaproteína é a membrana externa da N. meningitidis como avacina de H. influenzae, PedvaxHIB®.

A reação do PS-aldeído com o ε- amino grupo dalisina como descrito no método (1) do sub-ítem acima, é umareação lenta (de 7 a 10 dias) e de baixo rendimento. Asdesvantagens do método (2) descrito no sub-item acima são:o brometo de cianogênio é um reagente tóxico além de serfacilmente oxidável; o reagente hidrocloreto de 1—[3—(dimetilamino) propil]-3-etil carbodiimida (EDAC), cujafunção é formar um intermediário de baixa energia deativação, é uma molécula que sofre hidrólise facilmente evisto que a reação de conjugação tem que necessariamenteser feita em água esta instabilidade do composto afetanegativamente o rendimento da reação. Outro fato a serdestacado é a formação de subprodutos devidd ao rearranjoestrutural do grupo O-acilisureia no grupo N-acilureia maisestável.

Recentemente, foram publicados alguns novosmétodos: (4) ativação do PS com tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilaminopiridina sendo que este PS ativadoreage com a proteína (Shafer DE, et al. Vaccine2000;18:1273-1281); (5) utilização de derivados de aminoxique reagem com a proteína e este complexo com grupamentosaldeídicos do PS oxidado (Lees A, et al. Vaccine 2006; 24:716-729); (6) oxidação do PS para obtenção de grupamentosaldeídicos; os resíduos de carboxilas da proteína sãoativados com o reagente hidrocloreto de (l-[3-(dimetilamino)propil]-3-etil carbodiimida)(EDAC), paraserem ligadas à hidrazina. 0 composto proteína-hidrazina éligado ao PS através do seu grupamento aldeído (patenteΡ10402984-4). Os métodos (4), (5) e (6) resultam em melhorrendimento de conjugação. Entretanto, nenhum dos métodosassim especificados, (4) , (5), foram ainda utilizados naprodução de vacinas desconhecendo-se assim o rendimento emcaso de produção em larga escala. 0 método descrito como(6) segundo seus inventores, poderá ser utilizado para aprodução de vacina anti-meningicócica sorogrupo A (Lee CH,et al. Vaccine 2009; 27:726-732). Por este método obtém-seuma mistura de conjugados que diferem na quantidade de PSligados à proteína e na resposta imune como demonstradopelos próprios autores (Lee CH, et al. Vaccine 2009;27:726-732) .

OBJETIVO DA INVENÇÃO

O objetivo da invenção é um novo método de obtençãode antigenos conjugados para serem utilizados como antigenovacinai, sendo a etapa chave e de inovação, a conjugação dopolissacarídeo modificado com a proteína carregadoramediada pelo uso do agente ativante DMT-MM [cloreto de 4-(4, 6-dimetoxi-l,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolino]. Estemétodo envolve uma série de reações químicas descritas aseguir: 1) a reação do polissacarídeo, nativo ouhidrolisado, com metaperiodato de sódio para a geração deresíduos aldeídicos (PS-oxi). 2) reação do PS-oxi comhidrazida ou diaminas gerando PS-NH2. 3) reação do compostoPS-NH2 com grupos carboxilas presentes na proteína. Estareação de conjugação é intermediada pelo cloreto de 4-(4,6-dimetoxi-1, 3, 5-triazin-2-il)-4-metilmorfolino (DMT-MM).Entende-se por reação intermediada aquela na qual para seformar um composto covalente de alta energia de ativação,A-C (conjugado polissacarideo-proteina), A (gruposcarboxilas derivados da proteína) reagiria com B (DMT-MM),uma reação mais fácil de ocorrer (baixa energia deativação) e o composto A-B (espécie ativada) reagiria com C(PS-ADH) obtendo-se A-C (conjugado polissacarideo-proteina). Neste caso, a proteína reage com o DMT-MM e esteintermediário irá reagir com o PS-NH2, conforme o esquemada figura 1.

0 DMT-MM pode ser chamado de agente ativador, poisativa os grupos carboxilatos, no nosso caso oriundos doácido glutâmico ou do ácido aspártico presentes naproteína, para posterior ataque nucleofílico pelos grupos -NH2 presentes nas moléculas de PS-ADH (polissacarídeoligado à diidrazida do ácido adípico)ou outros derivados dareação do PS-aldeído com diaminas.

Um dos primeiros relatos sobre o reagente DMT-MMfoi efetuado por Kunishima (Kunishima M, et al. TetrahedronLetters 1999; 40:5327-5330). Este reagente é usualmenteempregado para formação de carboxamidas em reações commoléculas orgânicas pequenas (Kunishima M, et al.Tetrahedron 2001; 57:1551-1558).

Mais recentemente há trabalhos em que se empregaramo DMT-MM para ativação de grupos carboxilatos presentes empolissacarídeos com o objetivo de conjugá-los com moléculasorgânicas (Schlottmann SA, et al. Journal of ImmunologicalMethods 2006; 309:75- 85) e (Farkas Ρ, Bystricky S,Carbohydrate Polymers 2007; 68:187-190). Cabe ressaltar queeste processo é diferente do proposto por nós porque estesartigos não usam o DMT-MM para a obtenção de vacinas, massim para preparação de conjugados utilizados comomarcadores. Neste caso, o grupo carboxilato dopolissacarideo é conjugado com aminas de acordo com oartigo citado a cima (Farkas P; Bystricky S et al.) ou commicroesferas de luminex, um composto constituído depoliestireno, divinilbenzeno e ácido metacrílico.Portanto, o uso do DMT-MM para conjugados depolissacarídeos com proteínas, e, principalmente para usocomo antígeno vacinai, é uma iniciativa desta patente.

E para uma melhor compreensão do presente invento,seguem em anexo as seguintes figuras:

A figura 1 ilustra o esquema - Formação da ligaçãocovalente entre o PS-NH2 e a proteína mediada pelo DMT-MM.

A figura 2 traz a tabela onde são apresentados osresultados obtidos para as reações de conjugação dopolissacarideo modificado do Haemophilus influenzae tipo b(PRP-ADH) mediada por DMT-MM.

A figura 3 é o cromatograma obtido da reação deconjugação entre o polissacarideo modificado do Haemophilusinfluenzae tipo b (PRP-ADH) e o toxóide tetânico mediadapelo DMT-MM. Coluna Sephacryl S-400, fase móvel NaCl 0,2M eo fluxo de trabalho 0,6 mL/min (reação 4 - tabela da figura2) .A figura 4 representa o cromatograma da reação deconjugação entre o polissacarideo modificado do Haemophilusinfluenzae tipo b (PRP-ADH) e o toxóide tetânico efetuadacom EDAC. Coluna Sephacryl S-400. Fase móvel: NaCl 02,M(0, 6mL/min) .

A figura 5 representa a cromatograma da reaçãoentre PS6B e PspA mediada pelo DMT-MM. Coluna PhenylSepharose. Eluição em gradiente decrescente de sulfato deamônio de 1,0 - 0,0 M (linhas tracejadas do gráfico).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Descrevemos aqui um método novo onde o PS é oxidadopara a obtenção de grupamentos aldeidicos e ligado a umadiidrazida com o objetivo de gerar uma ligação hidrazona, aqual, subseqüentemente, será reduzida com o emprego de NaBH4 (PS-ADH). O grupamento aminico do PS-ADH se ligará acarboxila da proteína em reação intermediada pelo reagentecloreto de 4-(4,6-dimetoxi-l,3,5-triazin-2-il)-4-

metilmorfolino (DMT-MM) em substituição ao hidrocloreto de1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida (EDAC) ,reagente utilizado no método denominado (2) . Este método(2) descrito no item O estado da arte consiste na ativaçãode hidroxilas vicinais do PS por brometo de cianogênioseguido da adição da diidrazida do ácido adípico (ADH) ,sendo que o composto resultante, PS-ADH, reage com o grupo carboxila da proteína em uma reação intermediada pelo EDAC(Schneerson R, et al. The Journal of Experimental Medicine1980; 152:361-76). 0 reagente EDAC também é utilizado nométodo denominado (6) descrito no item O estado da arte.Neste método o PS é oxidado para obtenção de grupamentosaldeídicos; os resíduos de carboxilas da proteína sãoativados com o reagente EDAC)para serem ligadas à hidrazinae o composto proteína-hidrazina é ligado ao PS através doseu grupamento aldeído (patente P10402984-4). O reagentecloreto de 4-(4,6-dimetoxi-l,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolino (DMT-MM) é muito mais vantajoso por sermenos suscetível à hidrólise do que o hidrocloreto de 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida (EDAC). Ouseja, o DMT-MM é mais estável em solução aquosa do que oEDAC utilizado pelos autores da patente.

Descrevemos a seguir a preparação de doisconjugados: 1. Polissacarídeo sorotipo b de H. influenzaecom o toxóide tetânico; 2. Polissacarídeo sorotipo 6B deStreptococcus pneumoniae com a proteína de superfície A(PspA).

EXEMPLO 1: Preparação do conjugado polissacarídeocapsular do Haemophilus influenzae tipo b (PRP) com otoxóide tetânico utilizando hidrocloreto de 1—[ 3—(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida (EDAC) e cloretode 4-(4, 6-dimetoxi-l,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolino(DMT-MM). Comparação entre os dois métodos.

0 toxóide tetânico foi produzido no InstitutoButantan no setor de produção de Vacinas Anaeróbicas. 0 H.influenzae tipo b foi cultivado no laboratório defermentação do Centro de Biotecnologia do InstitutoButantan em bioreator Bio Flo 2000 em meio contendo peptonade soja e extrato de levedura como fonte de nitrogênio,glicose como fonte de carbono, sais e fatores decrescimento (Takagi M, et al. Journal of ChemicalTechnology and Biotechnology 2006/ 81:182-188).

O PS, o poli-ribosil-ribitol fosfato (PRP) foipurificado do sobrenadante do cultivo por precipitaçãofracionada com etanol, hidrólise de contaminantes porproteases e nucleotidase e ultrafiltração tangencial emmembranas de corte nominal de 100 kDa (Millipore) napresença de deoxicolato de sódio para eliminar produtos dehidrólise de proteínas, ácidos nucléicos, elipopolissacarideos (Tanizaki MM, et al. Journal ofMicrobiological Methods 1996; 27:19-23). Este PS foiutilizado na seqüência de reações à seguir:

1) Oxidação do polissacarideo: 50 mL dopolissacarídeo capsular do H. influenzae tipo b (PRP) (10mg/mL) foi oxidado com metaperiodato de sódio (NaIO4) IOmMem tampão fosfato dibásico 10 mM por 30 minutos atemperatura ambiente e no escuro. Após, adicionou-se 370 pLde glicerol para interromper a reação. A mistura reacionalfoi ultrafiltrada em sistema Labscale® contendo membranaPellicon XL (PLCCC 5) . O produto, chamado de PRP-Oxi, foiobtido em rendimento de 98%. Sendo a unidade básica doPRP, o ribosil-ribitol-fosfato, as hidroxilas vicinais selocalizam no ribitol. A oxidação dos resíduos de ribitolresultam na quebra da cadeia do PS e as condições deoxidação foram estabelecidas para se obter o PRPfragmentado de tamanho em torno de 40 kDa contendogrupamentos aldeídicos nos dois terminais da molécula. Amassa molar média do PS é determinada por cromatografialiquida empregando coluna de exclusão molecular (gelfiltração) em sistema HPLC ou Akta prime. As colunas foramcalibradas com Dextranas de diferentes massas molares (2000kDa, 229 kDa, 70 kDa, 40 kDa e 10 kDa) e a fase móvelempregada foi NaCl 0,2 M (0,6 mL/min) . A extensão da oxidação é medida por método colorimétrico na reação com oácido bicinchoninico (BCA) (Tyllianakis EP, et at.Analytical Biochemistry 1994; 219:335-340).

2) Reação do PS-oxi: 41 mL de uma solução aquosa dePRP oxidado (PRP-oxi, 9,5 mg/mL) foi incubada com diidrazida do ácido adipico (ADH) na proporção de 10 vezeso número de moles de aldeido (0,11 g) por 4 horas emfosfato de sódio dibásico 10 mM, pH 7,5. Após esteperíodo, adicionou-se 0,25 mL de uma solução de NaBH4 5 Mem NaOH 0,2%. O produto obtido PRP-ADH foi purificado por cromatografia de exclusão molecular em Sephadex G-25. Amassa molar média do PRP-ADH foi determinada em SephacrylS-400 previamente calibrada. A extensão da reação do PRP-oxi com o ADH foi verificada pela reação com TNBS (Qi XY,et al. Analytical Biochemistry 1988; 175:139-144), no qual se determina o número de grupos NH2 presentes. A partirdesta etapa foram feitos dois experimentos diferentes deconjugação: a primeira utilizando o EDAC como intermediário(3a) e a segunda utilizando o DMT-MM como intermediário(3b).

3a. Conjugação com EDAC: 0,5 mL de PRP-ADH (30mg/mL) foi incubado com TT (15mg) e 0,1 M de hidrocloretode 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida (EDAC) por4 horas em pH 7,5 (solução de fosfato de sódio dibásico 10mM, NaCl 0,15 Μ). O conjugado foi purificado em sistema decromatografia liquida Akta Prime com coluna Sepiiacryl 3-400e fase móvel NaCl 0,2 M (0,6 mL/min). 0 rendimentoreacional obtido foi de 12%. A reação de conjugação (PRP-ADH com TT mediada por EDAC) também foi efetuada por tempode reação maior (24 h), não sendo observado aumento norendimento reacional.

3b. Conjugação com DMT-MM: Toxóide tetânico foiativado com 0,1 M de cloreto de 4-(4,6-dimetoxi-l, 3, 5-triaz.in-2-il)-4-met ilmorf olino (DMT-MM) em água. Em seguidaadicionou-se o PRP-ADH e a mistura reacional foi agitadapor 24 horas (Tabela 1). O conjugado foi purificado emcoluna de Sephacryl S-400 sendo que a fase móvel empregadaNaCl 0,2 M (0,6 mL/min).

O conjugado deve ser purificado para eliminar opolissacarideo e a proteína livre, assim como o excesso doEDAC ou do DTM-MM. Os experimentos utilizando o DMT-MMestão apresentados na Tabela Ieo perfil de eluição de umdesses conjugados está apresentado na Figura 1. Na figura2 está o cromatograma da melhor condição de conjugaçãoobtida por nós, com o emprego do EDAC.O mesmo protocolo pode ser utilizado para obtençãode vacina conjugada para Streptococcus pneumoniae,Neisseria meningitidis ou outras bactérias encapsuladas(exemplo 2):

EXEMPLO 2: Preparação do conjugado polissacarideocapsular do Streptoeoecus pneumoniae sorotipo 6B com aproteína recombinante PspA utilizando cloreto de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolino (DMT-MM).

A proteína recombinante PspA clonada e inserida emE. eoli B121(DE3) usando o vetor pET-pspAl foi cultivada epurificada pelo Laboratório de Fermentação do Centro deBiotecnologia do Instituto Butantan. A bactéria S.pneumoniae sorotipo 6B foi cultivada em biorreator Bio Flo2000 e o PS6B, [a-D-Galp(l-3)-a-D-Glcp(l-3)-a-L-Rhap(l-4)-D-Ribitol-5-P04] , foi purificado do sobrenadante do cultivoconforme método descrito por nós (Gonçalves VM, et al.Bioteehnology and Applied Bioehemistry 2003; 37:283-287).

Nenhum dos principais polissacarídeos capsular dosdiversos sorotipos do S. pneumoniae possui em sua estruturaaçúcares não cíclicos, fazendo parte da cadeia principal,portanto previamente à reação de oxidação com ometaperiodato de sódio, com intuito de diminuir o tamanhodo polissacarideo, é necessário submeter o PS a umahidrólise ácida com ácido clorídrico a 80°C. A concentraçãodo ácido clorídrico e o tempo de hidrólise deverão serdeterminados para cada sorotipo.

1) Hidrólise do polissacarideo: 25 mL dopolissacarídeo capsular do S. pneumoníae sorotipo 6B (12mg/mL) foi hidrolisado pela adição de HCl 0,5 M eaquecimento à 80° C sob refluxo e agitação durante 1 hora.

A hidrólise foi interrompida pela adição de hidróxido desódio até a neutralização (pH 7,5). Após a hidrólise, otamanho do polissacarídeo foi determinado por cromatografiade gel filtração (Sephacryl S-400) seguindo as condiçõesdescritas acima no exemplo 1. O peso molecular resultantedesse processo de hidrólise para o PS6B foi de 20 kDa,dentro da faixa de tamanho considerada ideal que se situaentre 10 a 90 kDa.

2) Oxidação do polissacarídeo: 25 mL dopolissacarídeo capsular do S. pneumoníae sorotipo 6B (10mg/mL) foi oxidado com metaperiodato de sódio (NaIO4) 10mM em tampão fosfato dibásico 10 mM por 30 minutos atemperatura ambiente e no escuro. A reação foi finalizadapela adição de 195 pL de glicerol. 0 PS6B oxidado foipurificado através de cromatografia de exclusão molecularem Sephadex G25, utilizando água como fase móvel e fluxo de10 mL/min em sistema Akta prime. A extensão da oxidação foimedida por método colorimétrico na reação com o ácidobicinchonínico (BCA) (Tyllianakis EP, et at. AnalyticalBiochemistry 1994; 219:335-340).

3) Reação do PS-oxi: 4 mL de uma solução aquosa dePS6B oxidado (10,0 mg/mL) foi incubada com diidrazida doácido adípico (ADH) na proporção de 50 vezes o número demoles de aldeído (90 mg) por 24 horas em fosfato de sódiodibásico 10 mM, pH 7,5, acrescido de cianoboroidreto desódio (NaBH3CN) na proporção de 50 vezes o número de molesde aldeido (32 mg) . A reação foi cessada pela adição de100 yL de uma solução 5M de boroidreto de sódio (NaBH4) emNaOH 0,2%. O produto obtido PS6B-ADH foi purificado porcromatografia de exclusão molecular em Sephadex G-25utilizando água como fase móvel e fluxo de 10 mL/min emsistema Akta prime. A extensão da reação do PS6B-oxi com oADH foi verificada pela reação com TNBS (Qi XY, et al. Analytical Biochemistry 1988; 175:139-144).

4. Conjugação com DMT-MM: 20 mg de PspA (20 mg/mL)foi previamente ativado com 0,1 M de cloreto de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolino (DMT-MM) emtampão fosfato 10 mM e incubado com 10 mg de PS-ADH (10 mg/mL) por 24 horas. Para a eliminação do excesso de DMT-MM que não reagiu, a mistura reacional foi dialisada contrauma solução 0,1 M de NaCl e 10 mM de fosfato de sódiodibásico (pH 7,5). O conjugado foi purificado porcromatografia hidrofóbica em resina de Phenyl Sepharose 6 Fast Flow High Sub e eluido em gradiente decrescente deSulfato de Amônio de 1,0 - 0,0 Μ. 0 perfil de eluição paraessa reação de conjugação está apresentado na figura 5.

A reação descrita nesse exemplo 2 resultou naobtenção de dois conjugados que possuem diferente afinidade com a resina de Phenyl Sepharose conforme mostrado nafigura 5. As porcentagens obtidas de PS6B-ADH livre e PS6Bconjugado foi de 48,4% e 51,6% respectivamente. Já arelação em massa entre PspA e PS6B nos conjugados foi de5,6 para o primeiro conjugado e de 2,2 para o segundo. Esserendimento mostra-se bastante superior ao comumenteobservado, uma vez que, de forma geral, menos de 20% do PSativado é capaz de se ligar efetivamente à proteína.

A análise qualitativa e quantitativa do PS6B foiefetuada pelo método de Fenol-Sulfúrico (Dische Z, ShettlesLB. The Journal of Biological Chemistry 1948; 175:595-603).Já a análise qualitativa da eluição do PspA foi feita porleitura da absorbância em 280nm e a quantitativa pelométodo colorimétrico na reação com o ácido bicinchonínico(BCA). Como parâmetro de comparação também foram injetadoso PspA e o PS6B-ADH de partida.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FIGURAS

A figura 1 ilustra o esquema utilizado nestapatente com ênfase na formação da ligação covalente entre oPS-NH2 e a proteína.

A figura 2 traz a tabela onde são apresentados osresultados obtidos para as reações de conjugação dopolissacarídeo modificado do Haemophilus Influenzae tipo b(PRP-ADH) mediada por DMT-MM. Cabe destacar algunsparâmetros que foram avaliados: concentração depolissacarídeo (PRP-ADH), concentração da proteína (toxóidetetânico), tempo reacional e proporção entre os reagentes.Todas as reações foram feitas em água exceto onde estiverindicado. Pode-se observar pela análise da tabela da figura2, que o aumento do tempo reacional de 5 para 24 horasapresentou um ligeiro aumento no rendimento reacional(reação 1 e 2). 0 melhor rendimento reacional foi obtidoquando se empregou o polissacarideo liofilizado que foidissolvido na solução da proteína que estava em excesso(reação 6).

A figura 3 é o cromatograma da reação entre o PRP-ADH e o toxóide tetânico mediada pelo DMT-MM. Coluna deexclusão molecular (gel filtração) Sephacryl S-400 sendo afase móvel NaCl 0,2M e o fluxo de trabalho 0,6 mL/min(reação 4 - tabela da figura 2). Como parâmetro decomparação também foram injetados o toxóide tetânico livre(TT) e o PRP-ADH de partida. A determinação do conteúdo depolissacarideo foi efetuada empregando o métodocolorimétrico com orcinol sendo a leitura da absorbância em668 nm. Já o conteúdo de proteína foi verificado pelaleitura da absorbância em 280 nm.

A figura 4 representa o cromatograma da reaçãoentre o PRP-ADH e o toxóide tetânico efetuada com EDAC.Coluna Sephacryl S-400. Fase móvel: NaCl 02,M (0,6mL/min).

Através da análise das figuras 3 e 4 ficaevidenciado a superioridade da reação de conjugação mediadapor DMT-MM nas condições por nós estudadas. Em ambos oscasos, o produto, ou seja, o conjugado PRP-TT, queapresenta maior massa molar, é o primeiro pico docromatograma (PRP- conjugação), pico que não existia noPRP-ADH antes da conjugação. Cabe ressaltar que tambémocorreu mudança no perfil de eluição da proteína (toxóidetetânico).

A figura 5 representa a cromatograma da reaçãoentre PS 6B e PspA mediada pelo DMT-MM. Coluna PhenylSepharose. Eluição em gradiente decrescente de sulfato deamônio de 1,0 - 0,0 M (linhas tracejadas do gráfico) .Amistura reacional foi acrescida de sulfato de amônio[(NH4)2SO4] suficiente para tornar a solução IM com relaçãoa esse sal. Em seguida, foi filtrada em membrana de corte0,22 pm (Millipore) e purificada por cromatografiahidrofóbica em resina de Phenyl Sepharose 6 Fast Flow HighSub acoplada a um sistema Akta prime. Os primeiros 100 mLforam eluidos sob fluxo isocrático de 1 M de sulfato deamônio, seguido de 150 mL de eluição em gradientedecrescente de sulfato de amônio de 1,0 - 0,0 M. Terminadoo gradiente, seguiu-se eluição com 100 mL de água. A figura5 representa o perfil de eluição dessa cromatografia tantopara o PS6B como para o PspA.

DEFINIÇÕES

No âmbito deste pedido de patente são empregadospor diversas vezes abreviaturas e termos cujas definiçõesestão resumidas abaixo:

DMT-MM - refere-se ao agente ativador cloreto de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolino.EDAC - refere-se ao agente ativador hidrocloreto de (1—[3—(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida).

Processo de conjugação - refere-se à seqüência de reaçõesquímicas necessárias para se obter o antígeno vacinai, oqual seja, polissacarideo-proteina.

PS - refere-se ao polissacarideo capsular.

PRP - refere-se ao polissacarideo capsular poli-ribosil-ribitol fosfato.PS-ADH - refere-se ao polissacarideo capsular ligado amolécula espaçadora diidrazida do ácido adipico.PS-oxi - refere-se ao polissacarideo capsular oxidado.PSpA - refere-se à proteina de superfície A do S.pneumoniae.

TT - refere-se à proteína toxóide tetânico

Claims (8)

1. "MÉTODO DE CONJUGAÇÃO DE POLISSACARÍDEO CAPSULAR A UMAPROTEÍNA CARREGADORA, PARA USO CCMO ANTÍGENO VACINAL CONTRABACTÉRIAS ENCAPSULADAS, UTILIZANDO O REAGENTE CLORETO DE 4-(4 , 6-DIMETOXI-1, 3,5-TRIAZIN-2-IL) -4-METILMORFOLINO (DMT-MM)'', caracterizado pela reação entre um polissacarídeocapsular (PS) modificado quimicamente, quando necessário, euma proteína mediada pelo ativador cloreto de 4 — (4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolino (DMT-MM),sendo que as modificações do polissacarídeo compreendem asseguintes etapas:a) hidrólise do polissacarídeo (PS) com ácido clorídrico a-80°C, quando na ausência de açúcares não cíclicos comhidroxilas vicinais na cadeia principal; a concentração do ácido clorídrico e o tempo de hidrólise deverão serdeterminados para cada polissacarídeo;b) oxidação do polissacarídeo (PS) para a obtenção degrupamentos aldeídicos (PS-oxi)pelo emprego de um agenteoxidante como por exemplo NaIC>4;c) reação do PS-oxi (polissacarídeo oxidado) com umadiidrazida ou amina na presença de cianoboroidreto desódio; a ligação hidrazona gerada é subseqüentementereduzida pela adição de boroidreto de sódio, e o produtoresultante é denominado PS-NH2 ou PS-ADH quando do emprego da diidrazida do ácido adípico;d)conjugação pela reação do grupamento amínico do PSmodificado (PS-NH2 ou PS-ADH) à carboxila da proteína,reação intermediada pelo reagente cloreto de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolino (DMT-MM).

2.) "MÉTODO OE CONJUGAÇÃO DE POLISSACARÍDEO CAPSULAR A UMA.PROTEÍNA CARREGADORA, PARA USO COMO ANTíGENO VACINAL CONTRABACTÉRIAS ENCAPSULADASf UTILIZANDO O REAGENTE CLORETO DE 4-(4, 6-DIMETOXI-1, 3 , 5-TRIAZIN-2-IL) -4-METILMORFOLINO (DMT-MM)", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelareação entre um polissacarideo capsular modificado e umaproteína previamente ativada com cloreto de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolino (DMT-MM).

3.) "MÉTODO DE CONJUGAÇÃO DE POLISSACARÍDEO CAPSULAR A UMAPROTEÍNA CARREGADORA, PARA USO COMO ANTíGENO VACINAL CONTRABACTÉRIAS ENCAPSULADAS, UTILIZANDO O REAGENTE CLORETO DE 4-(4 , 6-DIMETOXI-1, 3 ,5-TRIAZIN-2-IL) -4-METILMORFOLINO (DMT-MM)" de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelareação entre um PS capsular, contendo grupamentoscarboxílicos, com cloreto de 4-(4,6-dimetoxi-l,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolino (DMT-MM)e uma proteína.

4.) "MÉTODO DE CONJUGAÇÃO DE POLISSACARÍDEO CAPSULAR A UMAPROTEÍNA CARREGADORA, PARA USO COMO ANTíGENO VACINAL CONTRABACTÉRIAS ENCAPSULADAS, UTILIZANDO O REAGENTE CLORETO DE 4-(4 , 6 -D IMETOXI -1, 3, 5-TRIAZIN-2-IL) -4-MET ILMORFOLINO (DMT-MM)", de acordo com as reivindicações de 1 a 3,caracterizado pelo emprego de PS capsular nativo oumodificado.

5.) "MÉTODO DE CONJUGAÇÃO DE POLISSACARÍDEO CAPSULAR A UMAPROTEÍNA CARREGADORAf PARA USO COMO ANTíGENO VACINAL CONTRABACTÉRIAS ENCAPSUIiADAS, UTILIZANDO O REAGENTE CLORETO DE 4-(4, 6-DIMETOXI-1, 3 , 5-TRIAZIN-2-IL) -4-METILMORPOLINO (DMT-MM)", de acordo com as reivindicações de 1 a 3,caracterizado pelo emprego de um polissacarideo capsularobtido de bactérias encapsuladas tais como: meningococo,pneumococo, Haemophilus influenzae, Salmonella typhi estreptococo grupo B.

6.) "MÉTODO DE CONJUGAÇÃO DE POLISSACARIDEO CAPSULAR A UMAPROTEÍNA CARREGADORAf PARA USO COMO ANTíGENO VACINAL CONTRABACTÉRIAS ENCAPSULADAS, UTILIZANDO O REAGENTE CLORETO DE 4-(4, 6-DIMETOXI-1, 3 , 5-TRIAZIN-2-IL) -4-METILMORFOLINO (DMT-MM)", de acordo com as reivindicações de 1 a 3,caracterizado pelo emprego de proteínas tais como: toxóidetetânico, toxóide diftérico, CRM 197, vesícula de membranaexterna de N. meningitidis ou guaisquer novas proteínasutilizadas para melhorar a resposta imune da vacina.

7.) "MÉTODO DE CONJUGAÇÃO DE POLISSACARIDEO CAPSULAR A UMAPROTEÍNA CARREGADORA, PARA USO COMO ANTÍGENO VACINAL CONTRABACTÉRIAS ENCAPSULADAS, UTILIZANDO O REAGENTE CLORETO DE 4-(4, 6 -D IMETOXI -1, 3,5-TRIAZIN-2-IL) - 4 -METILMORFOLINO (DMT-MM)", de acordo com as reivindicações 1 a 7, caracterizadopor o uso do antígeno vacinai produzido ser para amanufatura de uma vacina.

8.) "MÉTODO DE CONJUGAÇÃO DE POLISSACARIDEO CAPSULAR A UMAPROTEÍNA CARREGADORA, PARA USO COMO ANTÍGENO VACINAL CONTRABACTÉRIAS ENCAPSULADAS, UTILIZANDO O REAGENTE CLORETO DE 4-(4 , 6-DIMETOXI-1, 3,5-TRIAZIN-2-IL) -4-METILMORFOLINO (DMT-MM)", de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por ouso do antigeno vacinai produzido ser para a manufatura deuma vacina com ação via ativação especifica do sistemaimune.