BRPI0815990A2 - microescleródios isolados de um fundo entomopatogênico, composição contendo microescleródios de um fungo entomopatogênico, método para controle de insetos, método de produção a partir de um fungo entomopatogênico de uma concentração de microescleródios fúngicos tolerantes á dessecação - Google Patents

Abstract

MICROESCLERÓDIOS ISOLADOS DE UM FUNGO ENOMOPATOGÊNICO, COMPOSIÇÃO CONTENDO MICROESCLERÓDIOS DE UM FUNGO ENTOMOPATOGÊNICO, MÉTODO PARA CONTROLE DE INSETOS, MÉTODO DE PRODUÇÃO A PARTIR DE UM FUNGO ENTOMOPATOGÊNICO DE UMA CONCENTRAÇÃO DE MICROESCLERÓDIOS FÚNGICOS TOLERANTES À DESSECAÇÃO, microsclerotia de fungos entomopatogenicos, incluindo espécies metarhizium, espécies beauveria e espécies lecanicilllium, que podem ser produzidas; essas microsclerotias são eficazes para o controle de uma grande variedade de pestes de insetos, particularmente pestes de insetos que habitam o solo.

Description

q, 1/.35 ~ , "MICROESCLERÓDIOS ISQLAD.OS DE UM FUNGO ENTOMOPATOGÊNICO, COMPOSIÇÃO CONTENDO MICROESCLERÓDIQS DE UM FUNGO ENTOMOPATOGÊNICO, MÉTODO PARA CONTROLE DE INSETOS, MÉTODO DE PRODUÇÃO A PARTIR DE UM FUNGO 5' ENTOMOPATOGÊNICO DE UMA CONCENTRAÇÃO DE MICROESCLERÓDIOS FÚNGICOS TOLERANTES À DESSECAÇÃO" Descrição Fundame n t os' da Inve nção Campo. de lnv'enç'ão 10 A Invenção se r.ef ere a f0rma.çãQ de propagulos microsclerotiais. po.r fungcj s entomopatogênicos e o uso daquelas microsclerotias para q 'Cónt"ró'le dos insetos.

Descrição da Técnica Í5 pegticidas qjuímicos tem sido usados para controle de insetos e ervas daninhas por mal8 de 6 0 anos .

Assim, tem havido ínteresse em medidas de controle das pestes com base biológica sobe g} 20 desenvQlvimento da resistência a peste a muitos pesticidas químicos, j unto com preocupações püblicas. sobre impactos adve rsos cio uso di f undido ná saúde humana, seguranç a al imentar e o ambiente (Gillesppie and Moorhouse, 1989, Êlíotechnology of Fungi for Improving Plant growth, pp 8 5 - 25 123; mj ek, 1993, New options f or Insect Control u'sing Fungi, In, Pest Management : Biolo.gicalÍy Based Technologies, (R. D. Lumsden and j. Vaugn, eds . ) Ame r . Chern . Soc . , Washington, D . C.. ; Leathers et al. , 1994, j. Industrial

W 'b- - - 2/35 ,W « Micrõbiology 12 : 69-75.) .

No final do século 19, Met'chnikoff foi o primeiro a descrever irifeções Metarhizium anisctpliae "rnus.c a rdi ne "verde" no besouro de cereal, e 5 su'geriu o us"o cÍq mi cro rgan i smo como agent e de controle biológieo para insetos (Zimmerman et al. , 1995, Ciencia do Bigcontro1e e Tecnologia, 5: 527-30).

Est"udos subsequentes mostraram que um aplícação de espo"ros M. Anisopliae pod.eria matar os lO' besõuros de cereal e o gorgul.ho da beterraba através de irífç.cção direta. Os métodos de produção iniciais para este fungo se cancentraram rio us'o do inseto hospedeiro ou meios artificiais como veículo de crescimento para a produção d"e conídios do patógen.o.

15. A meta d'e buscar os insetos de solo como alvos de controle biológico versus insetos ná Eilaplana é tentadora. Entre estes alvos estão gorgulhos de raiz, larvas de solo, larvas de raiz, elaterídeos e moscas de fruta (Bruck, 2005, BiQlogical Control, 32:155-163; 20 Krueger & Roberts, 1997, Biolo'gical Control, 9:67-74; Chandler & Davící3on, 2005, journal of Economic Entomology, 98:1856-1862'; vanninen e outros, 1"'99, journal of Applied Entomology, 123:107-113; Kabaluk e outros, 2005, IOBC/wpr3 Bulletin, 28:109-115). A radiação UV, que pode resultar em 25 uma persimência muito curta nas superfícies da planta, é evitadà. A. chuva, que lava os conídios infecciosos da folha.gem lcigo após um.a aplicação, não é uma preocupação. As temperaturas do solo são moderadas pelo seu valor i3olador e

W + " 3/35 4 k I ma - á ümidade do solo acima do ponto de definhamen.to das plantas est.ão bem dentro da variação ótima para os mi"cro-organismos.

O fungo entomopatogênico MeMrhizium anisopliae foí registrado como inseticida 5' biológico para o controle de pestes de solo e insetos eríp'ticos nos Estados Unidos e em muitos outros países.

Relatou-se que o Metarhizium anisopliae infecta mais de 100 insetos, incluindo os insetos de solo listados: térmites subterrãrLeas (Reti culi termes e copto termes spp. ) , larvas do 10 mil'ho (Riabrotica spp) , gorgulho da videira (Otiorhynchus sulcatus) , larvas do besouro perfurador de rai z (Di aprepes .abbrevi a tus) , besouro j apQrlê8 (Popi1lia japonica) e j oaninhas (RhizDtrQgus majalis) (Krue'ger e outros , 1992, jõurnal of Invertebrate Pathology, 59: 5.4-60; Schwarz·, 1995.

15 Metãrhizium anisopliae for soil pest 'control. In Eliorational pest çontrol Agents; Formulation and DeÍivery, F .R. Hale & J. W, Barry, ed.s . , ACS Symposi um Series 5 95 , American Chemical S.ociety, wash.ington, D .C. p. 183-196; Krueger & Roberts , 1997 , ibid; Bruck, 2005, ibid) . O interesse 20 come-r'cial no LlSC) do M- anisopliae para controlar ínsetos de s.olo resultou no desenvolvimento de f'ormulaçães para ccmtrole de pestes granulares baseadas em pellets rniceliai.s ou coní'd.icis ptmduzidos c:om substrato sálido em um carreador nutrit ivo o-u não nutrit ivo ou fungo iiq próp.rio substrato 25 sõlido utilizado [Schwarz, 1995, ibid; Storey e outro3, 1990, Conidiat ion k.inetic.s of the microsclerotial granules of Metarhi zium ani sopIiae (Bio 1020) and its bíological activity against dif ferent soil ínsects.. Proce'edíngs of the m 4/35 q .~@ - Vth International Colloquium on Invertebrate Pathology and Miçro"bial Control, Adelaide, Austrália, p. 320-325; Andersch e -Qut ro's , 1'995, Patente dos Estados Unidos n° 5. 418'.164] , a Formulação mais p'rática sendo (3 pellet micelial. O fungo 5 nestas fo'rmnlações oranulares deve ríecessariamente crescer a part ir do carre-ador e reesporular para produzir c)s conídios.

intíecciosos. visto que qs propágulos de ínfecção (conídios) d'o: M. 'anisopliae devem entrar em contato e infectar o inseto h'ospede i ro, c) númercj , distribuição e persistênoia dos

1.0 cõnídios, produzidós p'elo Eungo em um carread'or 'granular, no 'solo, é' 'de extrema importância (Bruck, 2005, ibid; Hu & St.

Ledger, 2Q.02) . A aplicação prática destas formulações tem sido limitada por causa das características físicas CÍQ produto, impedindo c) uso em equ ipament o s agrícolas 15 convencionais , altos custos de produção e/ou validade prãtica ruim. Os pellets miceliais, tais como ob revelados na patente dos Estados Unídos 5 .4IB. 16.4, têm ger'almente uma validãde ruim a temperatura arhbíente ou dev.e.m ser liofi1izados, um p roce's so caro . Conídios, blastoesporo·s oll 20 micélio em alginato de sódio [Patente dos Estados Unidos

5.360.607,· Knudsen e outros, 1990, j. Eeon. Entomol. ,

83.(6) :2225-2228j Meyer 1994, Fund . Applied Nernatology, 17 (6): 563-567] têm sido comercializados, mas es'ta formulação é muito cara para uso geral em lavoAra3 e sofrem de pequ'ena 25 validade ern temperatura ambie.nte. Os conídios (produzidos em Eermentação de substrato sólido) ligados a urn cârreador gr-anular geralmente têm uma validadé pequena . Os grânulo.s de f erment ação de substrato sólido utilizados (tipicamente q

GW 5/35 ~R

W grãos. de arroz, cevada, trig,o), eonten.do furígo. residual apôs o cultivo de coníciiQs, não podem ser ap"licados utilizando-se equipamentos agrícolas convencionais nem podem ser imediatamente rnoídos no tamanho adequado sem matar o fungo, 5 Tnesmõ apesar de es"ta forinulação e8tar prQntamente dispQnível cõmo um subproduto da produção dos conídios.

pela persistência no" solo e em materiàl ve'getal em decomposição, muitos fungos patog.ênicos de plantas produzem escleródios, isto é, agregados de hifas 10 "cQrupactos que são altamente resistentes à dessecação. Estes propâgulos frequentemente servem como a estrutura de hibernação para q fungo (.Cooke, 1983, MorphQgenesi8 of scl'erotia. Iri "Fungal Differentiatíori: A Contemporary Syn'thesis"' Smith, J.E. , ed. pp 397-418. Marcél D'ekker, Inc., 15 Nova York, NY, EUA; Ccjey-Smith & Cooke, 1971, Survival and germination OE f ungal sclerotia. In " Annual Rêview cRÉ PhYtopatho1QgY" , Horsfall, J. G. , Baker, K. F. , Zen.trnyer, G.

A., eds. pp 65- 92. Annual Reviews Inc. , Palo Alto, CA, EUA) .

0.8 .microescleródíos (pequenas partículas esclerodiais , 200- 20 600' µm) de patógènos vegetais fúngicos como Co'lletotrichum trunca tum e Mycoleptodi scus terrestri s foram produzidos e'm alta concentração em f'ermentação de cultura líquida submers'a (jaekson & Schidler, 1995, Mycologieal Research, 99:879-884; She'árer & jackson, 2003, patente dos Estados Unidos n° 25 6.516.9.807) . Microescl'eródios destes patógenos de plantas daninhas têm demonstrado valor como propágulos persi stentes é '1Mêcciosos no solo e em ambient-es aquático.s (Shearer & jacksDn , 2006, Biological Control. 38:298-306; Boyette e

S Tw 6/35- ~" % .Q'útFQ$, 200'7, BioContr1ol '52 :413-4.26') . Entretanto, atê a presente data, mioroescleródios não têm s ido relatados por quaísquer pató'genos fúngicos de insetos.

Resumo da Invenção 5 NÔs de3cobrirnos agora a Íormação n"ova, at.é agora não descrita, de microesclerõdios por fungos ent.omopatogênicos, que são efetívos para o controle de r)e8tes .&- de insetos, bem como técnicas para a produção destes propágul-os de mícroesclerõdios. De acordo 10 com esta ãescoberta, microescleródios podem ser produzidos a partir de fungos entomopatogênicos incluindo a espécie Metarhiziuln, a espécie Beauveria e a espécie Lecanicillium.

Estes microescleródios são tolerantes a dessecação, s(jbrevívem a processos de baixo custo e secagem ao ar em 15 níveis de baíxa miidade, apres.entam excelente validade a temperatura ambiente, bern como sob r.efrigeração, e podem ser processados para tamanhos de formulação que sejam compatíveis com aplicadores de pesticida granular convencionâl. Êm uso, qs microescleródios apresentam 20 e'sporulação ern pro.fusão (produzindo portanto um grande número 'de ccmídios infecciosos para insetos) após a .reidratação, tal como no solo normal, e podem apresentar níve"is e taxas comparáveis OLl até mesmo maiores de infectivi'dade contra p'estes de in3etos em oomparação com 25 formulações granulares convencionais baseadas em cionídios.

De acordQ eom esta descQberta, um objetivo desta invenção é apresentar Eungos entomopatogênicos na forrría de propágu1çjs de rnicrQe.sc1er6dios.

m t W: 7/35 ~N % Um out rQ obj et ivo desta invenção é apreseI1tar propágulos de Mcroescleródios de fungos entomopatogênicos que sejam eficazes como agentes de c"ontrQle bÍolx5gico coritra pestes de inset? econorrlicamente 5 importantes.

Um outro objetivo desta invenção é apresentar propágulos microescleródios de Eungos entomopatogênícos que sejam tolerantes à desseeãção e estáveis para armazenagem, ao mesrno teüípo em que mantêm a 10 eficãcia como agentes de controle biológico. contra pestes d.e insetos.

Outros obj'etivos e vant-agens da invenção ficarão imediatarnente aparentes a p.artír da descrição abaixo.

15 Br"eve Descrição dos Desenhos a Figura 1 mostra a eficácia relativa de dois tipos de grânulos de Metarhizium anisopliae FS2 contra larvas Tetanops myopaeformis (larvas da mosca da beterraba) em um ensaio de incorporação de solo 20 como descríto no Exemplo 4. Os grânulos consistiam de grânulos contend'o microescleródios em malha 20/30 preparados a partir de fermentação líquida ou um carreador de grão de milho de malha 16/30 revestido com c.onídios, 25 usando aglutinante de mono-oleato de sorbitano de políaxietileno a 10% (Tween 80). Os grânulos foraW incoKporados em um scjio argíloso à taxa de 1,8 mg/g de solo e os solos subsequentemente

W :- 8/35 ^ m umedec idos até qs pont'os f inais de umidade desej ados co.m água . As atividades de água do solo" for.am de'terminadas após 4 8 horas usando um me.di dor de atividade de água seguindo as 5 instruções do fabricante . Cada t ra t ament o teve t rês réplicas de 10 lavras e o teste comò um todo foi replícado' duas vezes.

Des'crição Detalhada da Invenção C'onforme aqui utilizado, o JO 'termo "microescleródio"s" refere-se a pequenos corpos esclêrodiais que sãcj algum estado em rep-ouso dos Eungos. Os microescleródios são agregados de hifas estáveis, viávéis, algumas vezes rnelanizados e compactos do fungo. Os microescl-eródios, por si só, não são infecciosos, mas quando 15 reidratados, tal como por exposição a umida.de no solo ou dentro de fendas na casa de árvores, os microescleródios irão germínar de maneira hifal ou .e3pQrogenicamente para pro'duZir conídios qtie são itifecciosos para os insetos alvo.

Os microesclerõdias são extremamente tolerantes a 20 dessecação, são ca.pazes de germinar tanto esporogenicamente quanto vege t'at ivamente e também mantêm as capacidades inseticidas de sua6 formas nat ivas ou no rma i s (isto é, hifas, blastoesporos e/ou conídios do mesmo fungo entomopatogênico). Morfologicamente, os microescleródios 25 podem estar presentes corno urn grupo aglomerad0 de células. O term0 "inseticida" refere-se a um material ou mistura de materiais que induzern a mortalidade , i nt errompern ou impe dem .ò' c re.s·ciment çj , int erferem na metamorf ose ou outras f unções

:? '1'35 -C morf'ogênicas, efetuam esterilização ou interferern na reprodução dos insetos alvo . Os termos "c'ont rol ador " ou "controle do ínseto alvo" é usado no presente ins.trúmento significando que a população do inseto é redüz.ida, 5 principalme.nte através da mortalidade, a um nível que sej a signif icativa-mente maior do que uma população nã'o tratada.

"Mortalidâde significativa" é definida rio presente inistrumento como significando que a porcentagem de insetos que morrem dentro de um determinadõ 10' perÍõci9 de tempo apõs entrar em contato com o inseticida é .s'ígni ficat ivamente maiQr que o número de insetos que nã.o ent'ram em contato com çj inseticida que mo.rre durante o mesmo período de tempo, com base nas análises estatísticas padrão.

A i rrvenç ãcj aqui descrita é 15 eficaz para produzir microescleródios de qualque-r espécie, cepa ou variedade de fungos entomopatogên.icos do gênero Metarhi zium, apesar de ser tambêm pretendid'o que a invenção poss-a ser usada para produzir mi"croesc1eródios de e.spécies dos gêneros Beauveria ou Lecanicillium. As espécies 20 p-referidas para o uso no presente instrumento incluem Beauveria bassiana, Metarhizium flavoviridé e particulaFmerlte Metarhiz-ium anisopliae sensuo lato.

A produção dos microesclerõdios d'esta ínvenção é preferencialrnente 2'5 realizada em cultura líquida e a produção em larga escala é preferencíã1mente re,a1izada por fermentação de cultura líquida e.m tanque profundo. É vislumbrado também que meios áólidos de eultura podem ser utilizados. O meio líquido r 0 _ 10/35 \" usado na pre·paração do-s mi.croescleródios melanizados é crítico, p'ois a sua fcjrmação e rendimento são dependentes do me-io . De mane ira geral , meio.s líquidos tendo altas concentrações de carbono e nitrQgêrIio são necessários para 5 altos rendimentos de micrQegcler'ódios de M. anisopliae. Para uso no presente irlstrume!lto, .o meio corítém preferencialmente um'a Ílonte de nÍtrogênio a uma concentração entre 8, 1 gramas dè. folit.e de nitrogênio/litro e menos que SO g d'e fonte de nitro.g,ê·nio/iitro e uma f'onte de 'carbono a urua ccmcerítração 10 maiQr "que 2"0 g de carboidrato/litro, preferencialmente maior que 3.0 g de carboidrato/litro. As Eontes de nitro.gênio adequadas incluem, sem limitação, caseína hidro1isada, extrat.o de fungo, pro.teína d'e soj a hidrolisada, proteína de 3eTnente de algodão hidrolisada e proteína de glúten de milho 15 hidrQlisada. As f ontes de carbono adequadas incluem, sem limitação, carbciidra.tos incluindo glicose, frutose e sacarose e glicerol. Os meios de cultura líquida prèferidos p.ara uso no presente instrurnento forarn descritos por jackson ÍPatente dos Estados Unidos 5.968.808, cu j o cQnteúdQ é 20 ineorporado ao presente instrumento por referêvícia) . NÕs su-rpreendent emente descobrimos que os fungos entomop'atogênicos supr.acitados p roduz em microesclerõdios quando cultívados em cultura submersa no meio de jackson.

Este6 microescleródios não foram, até o momento, descritos a 25 part ir destes fungos . Em eontraste, espécies do f ungo ent amopat.ogêni co Pa ecilomyces produzem blastoesporos ao invés de ulicroescle-ródios quando cmlt ivados no mesmo meio sob as mesmas c.ondiç'ões. A fermentação pode ser realizada

W . q "'

11/3'5

.d utilizando-se técnicas de cultura de líquido' aeróbica's

'cónvenci0nais eom agitação e aeração.

A agitação é preferida para inibir o cre's.'cimento micelial na parede do vaso.

As temp.eraturas adequadas podem variar de aproximadamente 20°C

5 a aprQximadamente 32°C e c) pH variar de aproximadamente 4 a aproxiuíadamente 8. "jma vez que um crescimenta suficiente-mente forte do fungo tenha sido obtido,

noEmalment'e em aproximadamente 2-4 dias, os microescleródios

"cQme¢'am a se formar e a fermentaç'ãQ é então cont inuada até

10 que uma ccmcentração suficientemente alta dos microesclerÓdíos é obtida. 'Sem estar limitada a isto, em uma configuração preferida, a fermentação .eontinua até que uma gr-ande proporção &)3 Eungos viáveis na cultura (isto é, mais que 30k por peso) e mais prefer.eneialrnente até que uma

15 proporção predominante dos fungos viáveis na cultura (i3tQ é, mais que 50% por peso) esteja na forma de microesc1eródios.

Após q término da fermentação, os microescleródios podern ser recu,peradQs utilizando-se técnicas convencionais, tais c-omo filtração ou

20 'cientrifugação.

Os microescleródios podem ser secados, tal

Cqmj por secagem a ar, até um baixo nível de umidade e aEmazenados à temperatura ambiente ou ínferior.

Em urna configuração preferida, a biornassa recuper·ada da fermentação, após3 a secagem, irá conter

25 aproxim.adamente 1 x 106 ou mais mic'roescleródios pç)r

"grama de biomassa (corn base no peso 8eco da biomassa), particularmente no mínim'o 9 x lOg microescleródios por grama de biomassa.

·: 12/35 87 As formulações comerciais para uso como um. agente de controle biolõgico de insetos pode.m ser preparadas para microescleródios qu'e tenham sido cul'tiv-ados a partir de rneio de cultura como descrito acima.

5 C'omo uma questã.o prática, é vislumbrad'o qµe as formulações comêreiai s podem ser preparadas di retament.e da cultural, deste mod'o tornando óbvia a necessid'ade de quaisquer etapas de purificação. Apesar de cµ1turas líquidas poderem ser usadas diretamente, na configuração preferida a água é 10 removida das culturas para secagem parcial ou substancial como descrito acima, e a c.ultura seca quebrada ou moída em pequenas partículas adequadas para aplicação através de aplicadores de grânulos convencionais, usando técnicas convencionais na ·área. Para facilitar a aplicação e cj 15 pQsterio'r cre-scimento fúngico e conídiação, qs micFo'esclerôdi.os cultivados podem ser alternativamente formulados em um carreador ou veículo adequado, agmnomícamente aceitãvel, nutricionais ou inert-e para aplicação como pós-umedecíveis, pós, grânulos, iscas, 20 sQluções, concentrados emulsificáveis, emulsões, .concentrados em suspensão e sprays (aerossóis). Por exemplo, para aplicações d.e líquido, q"s microescleródios podem ser fc)rmuladQEj como uma suspensão ou emulsão. Nesta configuração, os carreadores preferidos incluem, sem 25 lirnitação, águas, tampões ou Óleos vegetais ou de plantam Em uma configuração preferida alternativa, pa'rticularmente adequada para ap"licações granulares sólidaa, q8 microescleródios podem ser íormulados com carreadores

W. 0dm 13/35 -< inertes sólidos ou diluentes COülO terra diatomácea, taicQ, argilà., vermiculita, CaCC > 3, grãos de milho em sabugo, gé'is de ,alginato, matrízes de amido ou polímeros sintétícos ou podem ser Ser incorporados em micropartículas Qu 5 mierocápisula.s de liberação controlada. O profissional qualifieado re.conhecerá que os fungos podem também ser forTnü1ados em combinação com aditivos convencionais tais cokíq agent-es de colagem ou aderen'tes, agentes e.mulaifícantes, surfactantes, espumas, umectantes ou agentes lO de umedecime.ntos, antioxidantes, protetores UV, aditivos nutrit'ivos, fertilizantes, inseticidas ou até mesmo com fungicidas que apre'sentam baixa toxicidade aos fungos dete.rminados. Para aplicação na casca ou mbertura de árvores- e plantas , os' microescleródios também são 15 preferencialmente formulados com um adjuvante micrQ8cópico Qu hidrofílico.

A quantidade absoluta dos microescleródios e sua concentração na composição final são selecionadas par'a p.ropç)rc i onar uma redução efetiva na 20 pop.ulação do inseto alvo em compara.ção com um controle não tratad.o. A quantidade real não é crítica e é uma furíção das consiçíerações p'ráticas, tais como as proprie'dades do veíc.ulo ou carreador, densidade da popula.ção d"o inseto alvo e o método e loeal de aplicação, e podem ser p ront ament e 25 determinadas pelo teste de rotina . Como q's micro'esclerÓdíos servern para p.rc>duzir e apresentar uma alta cxmcentrãção d'as conídias infeccío'sas para controla.r os irisetos alvo p'or intecção e morte, para f ins de formulação e aplicação, uma

.3 14/3'5 ¥ "quaAEidade ef icaz" é def inida co'mo 's igni f Lcando qualquer quant idade de microesclerÓdios suficiente para pFod.uzir põ'ste.riormente conídios suficientes no habitat alvo para infectar e matar c) inseto alvo em relação a' um con.trole não 5 t.ratradQ . par meio de exemplo e sem limitaçãQ a ístcj, é vi s lumbrado que formulações adequada s irão conter tipica'mente aproximadamente 1 x IOg ou mais microescleródios pof grarr1a de biomassa recuperada da cultura líquida (com base no peso se.co da biomassa) , preferencialmente nQ mínimo

1.0 1, 5 x I 07 mi croescleródios por grama de biomassa. Para aplioação a Iavouras em Fileiras típicas, sem Iimitação às 'mesmas, é ví slumbrad'o" que as taxas de apl icação adequadas são de 1 x 1 03 microesclerõdios por a'cre , aplicad'os em sulco .

15 Etti uso, os mi.croescleródiog desta i nvenç.ão podem ser aplicado's no local cjú nas proximidades dos insetos alvo ou na superEície das plantas a serem protegidas, por exemplo, na casca das árvores ou como um revestimento de semente, usando técnicas conve'ncionais.

20 Em uma ccmfiguração preferida, os rnicroes.cleródios são aplicados no solo ou a misturas de envasa-mento sem solo taís c'omo as us-adas em estufas, em nma forma granular. Dependendo do. inseto alvo, os microesclerõdios podem ser aplicados em campos agrícolas, pornares, estufas, jardins ou gramados, ou 25 nas proximídades de plantas arnamentaZs, ãrvores ou estr.uturas' comerciaís. ou residenciais.

Os microesclerõdios dos fungos ent.omopatogênicos desta invenção produzem qs propágulos

U mà 15/35 ji^ inEecciosos (conídios aéreos) 'eficazes para infeotar e matar uma ampla variedade de insetos economicamente importantes , particülarmente inset0s nascidos no solo, mas incluindo também a1gun3 insetos que re.sidem no solo e na copa das 5 árvore s . Sem limitaç.ão" a is,so, os insetcis que podem ser cont rol ad0s pelos mioroescleródios desta' invenção incíuem gorgulhos de rai z, vermes de raiz, elaterídeos, moscas de f rüt.a, lagartas de s0lo, vermes de raiz, térmites e formigas, partieularmente larva do milho (Diabrotica SPP) , 10 gorgu1hQ da vidéira (oti orhynchus sulcatus) , lavra do beslõuro pe'Ffurador de raiz (Diaprepes abbreviatus) , gorgulho da batata- doce (Cylas formi.carius) , lãrvas da mosca da beterraba (Tetanops myopaef ormi s) , larva de semente de repolho (DelÍ a radi cum) , larva de semente d.e cebola (Delia 15 antigua) , larva de 8emenLe de nabo- (Delia flo'ralis) , Iarva de semente de milho (Delia platura) , mosca-da-cenour.a (psila rosae) , besouro j aponês (Popillia japonieàl , j oaninha (Rhiz'otrogus majalis) , térmite subterrâne.o (R'etioulitermes e Copto termes spp. ) . Além disso, determinados insetcj3 que 20 vivem nas folhagens das árvores, especialmente que vivem rías cascas, podem ser controlados pelos microe'sc1eródio"3 desta invenção . Estes insetos incluem q besouro verde (Agrilus planipennis) , traça da uva (Lymant-rià dispar) e o gorgulho da nogueira pe.cã '(Curculio caryae) .

25 Os exemplos abaixo dest inam- se apenas a ilustrar adicionalmente a invenção e não dest inam- se a limítar o e.sc.opo da invènçãQ que é definida pelas reivindicações .

P m.

16/35 2 Exemplo 1 - Produção de microescleródios Nest'e exemplo nós av'ali amos diEerentes arribie'ntes nutricionais de cultura líquida e medimos o acúmu'1o de bi.o'massa e as produtivídades de 5 bastoesp'oros e microescleródios. A t'olerância a dessecação de microes'clerÓdios foi medida pela avaliação de sua capacidade de germinar vegetativamente e/ou esporogenicamente após reídratação .

Três cepas de Metarhizium 10 anisopliae var anisopliae ('Metchnikof'fl Sorokin fora.m usadas neste estudo: üma cepa comercial , F52 [ATCC 90448, (Earth Biosciences, ag.ora Novo.zyrne Biologi'cals, Salem, VA , reimolada de larvas de Tetanops myo'paeformis] , MA1200 (ATCC 62176, passado através de larvas de T.

15 myopaeformis) e TM109 (ARSEF5520 reisolada de larvas de T. myopaeformis) . Todos os isolados foram armazenados a -80"C em usda ARS NPARL e em USDA ars NCAUR.

As culturas de estoque de cada cepa de l!S.. anisopliae foram cultívadas ccjmo ísõlados de esporo únicos "em ágar de 20 dextrose de batata (PDA) por três semanas a temperaturas a.rnbiè'ntes. A placa esporulada foi cortada em plugs de ágar de 1 mm' e as eulturas de estoque destes plugs de ágar armazenadas em glÍ"cerol a :i-O% a -80"C. Os inóculos de conídiDs para experi.mentos de cultura líquido fíoram 25 produzidos pela inoculação de placas de pda com uma suspen,sãQ conidial a partir das culturas de estoque cc)nge1ada3 e o c.ultivo des'tas culturas a temperatura anibiente (-2.2"C) por 2-3 semanas. Todas as cultur'as líquidas

P ~ 17/35 vQ foram inoculadas a uma concent raç ão inícial de 5 x lOG cQnídiçjs por mL"' ca1dQ 'de çul'tura4 Os seis meios líquidos testados foram, compos'to3 de um uieio de sais ba8ais 5 suplèment a'dos com traços de metais, vit'arninas (jackson e' outl?os , 1997, Myco1ogi'caI Research, 101:35-41) e várias corrbinações de glicose e ca.seína hidroli sada de ácido e casaminoácidos. a solução de sai's basais defiríida usada em t'odas as cu'ltura3 líquidas continua (por litro de água 10 deiQnizada: KH,PC),, 4,0 g; CaCl, · 2H2O, 0, 8 g; MgSO, · 7H,,O, 0,6 g; FeSO, · 7H,O, 0,1 g; COC12 ' 6H,O, 37 mg; mso, 0 H,O, 16 mg;- Znso, '0 7H2O, 14 mg; t i amína , riboflavina, pAn'Eotenato, niacina, p i ri doxamína , ácido tiotico, 5 õo microgramas "cada; e ácido fólico, bic)tírLa, vitamina B12, 50 15 micro'g.ramas cada. Na Tabela 1, as quantidades de glicose e caseína hidrolisada de ácido e a correspondente ccmcentração de carbono e carbono em relação a riitrogênio são apresentadas para cada meio testado.As concentrações de carbono e qs cá1culos de quocientes de carbono ern relação a nitrogênio foram ba'seados em 40% de carbono em glicose e 53% de carbono, 8% de nitrogênío em caseína hidmlisada de ácido.

Todas as culturas foram cultivadas c:omo culturas de 100 mL em frascos Erlenmeyer de 250 mL abafado's a 28°C e 300 rpm em uma incubadora de agitador rotativo. Os frascos foram agítados manualmente frequentemen.te para inibir o crescim'ento micelial na parede .do. frasco. Em dois, quatro e oito dias após a inoculaçãQ,

S J8L35 2 'foram retirada.s amostras para medir o acúmulo de biomassa, ooncentr.ações de blastoesporos. "e concentrações de microeselerÓdios. Para cada experimento, foram retiradas amostras duplieadas de .cada Erasco em .cada data de 5 amostragem e foram usados três frascos repfieados para cada meio. Todos qs experimentos foram repetidos no mínimo duas ve zes .

Para medições de acúmulo de biomassa, 1 rnL de caldo de cultura integral foi coIetado de 10 frascos de cultur'a e a biom.assa Ííoi separada dos meios utilizadQ3 pqe filtração a vãcuo em díscos de filtro pré- pesados (Whatman GF/A, Maidstone, Inglaterra). O acíimula de .peso seco foi dete"r"minado por secagem da biomassa e disco de filtro a 60°C até um peso constante antes da medição. Para 15 determinar as concentrações de microescleródios, o caldo de cultura f'oi diluído apropriadamente e uma gota colocada em uma lâmina de vidro de Tniçro"sc6piQ, coberta com uma lamínula e c) número de microescleródios foi contado em 100 µLi. 05 microescle'rõdios Eoram contados quando compactms, algumas 20 xrezes qs agreçjados melanizados hifais erarn maiores que 200 ',jm Apenas microesc'leródios bem formados foram contados. O caldo" de "cultura foi diluído conforme apropriado para facilidade de contagem". Durante a amostragem do caldo de cultura, su'spensões de rnicroesclerádios foram constantemente 25 submetidas a vértice para assegurar a homogeneidade.

Após o cultivo das culturas de M. anisopliae por oito dias, terra diatomácea (HYFLO, Celite CQrp., Lompoc, CA) foi adicionada à biomassa fúngica

P 0 76 19/35 - e' eo.mbinada dos três frascos de c-ada tratame-nt.o -a uma concent-ração de 5 g de terra diatomâcea/1OO mlj de caldo de cultura. a mistura microescleródios-terra diatomácea foi fi'ltrada a vácuo erri um funil de Buchner usando papel filtro 5 Whatman n° 54. A torta do filtro foi quebrada por 'pulsação em um misturador (MINI PREP Plus, Cuisinart) e colocada em carnadas em bandejas de alumínio raêas e secadas ao ar durante a noite em uma cúpula de contençãQ biológica em operação. O teor de umidade da preparação de 10 microescleródio's-terra diato'mácea foi determinado com um analisador de umidade. Quando as Í!ormulaçõe·s de M.

anisõpliae estavam secas até um teor de umidade de 5%, elas foram embaladas a vácuo em sacos de polietileno sintético ccm um enibalador a vâcuo e armazenadas a 4°C. Após a 15 rei1dr'atação, os microescleródios de M. anisopliae germinaram de maneira hifal (fíormação em tubo de germes) e conidiados (massas de conídios produzidas n'a superfície do micro.esclerõdio). A viabilidade dos microescleródios (germinação hifal) e produção de esporos (germinação 20 esparogênica) toram determinados em preparaçÕes de microescleródios secos por borrifamento de 25 mg da formu1ação de microescleródios secos na superfície das placas de ágar de água. Duas p1aca3 de ágar de ágtia foram usa.das para cada trat-amento. Após um p'eríodo de incubação de 25 24 horas a 28°C, 100 microe3cleródios foram microscopicam.ente examínado8 e.m cada placa para germinação hifàl como umã me'dida de viabilidade. Para enumerar a pro.duç'ão de esporos, a incubação das placas de ágar de água a ¶ 20/35 .d f'oi continu'ada por oito dias' a 2'8"C'. Cada pIa'ca de âgar de água foi submersa com 5 mL de ãgua estêril e cis conídios foram desalo-jados dos microesclerÓdio's com um circuito estéril. Após c)3 conídios terern sido desalojados, o líquido 5 dis.ponível foi pipetado de cada placa e õ volume de líquido me.dido. Os conídios foram contados usando um hernacitômetro.

Para determinar o número de con'ídios de M. ani,"opliae produzidos por grama de fíormulação de microescleródios "'ecos, o número" de conídios cultivadõs IÕ por p'laca fQi dividido pelo peso da preparação de miQrQesclerõdios secos adícionad'a a cada placa (0,0·25 g).

Re8ultados O acúm-ulo de biomassa pelas três cepas de m. anisopliae seguiram o padrão previsto onde 15 os cultivãdos em meios que continham 8 g/L carbono produziam menores concentrações de biomassa em comparação ãque1e·s cultivados em meios corn 36 g/L carbono (Tabela 2). Quando comparando eultura's cultivadas em meios corri diferentes quocient'es de carbòno em relação a nitrogênio, c) acúmulo de 20 b.i'omãssa nào foi afetado pelo teor de nítrogênio para as cultiva'dos em meios corri uma concentração de earbono de 8 g/lj sugerind'o que o meiõ éra limit.ado ao cãrbono. Para todas as cepas de M. aniscpliae cultivadas em meíos contendo 36 g/L caEbonQ, c) aeiimulo de biQmas·sa fcjí signif icativamente maior 25 após cresciu|eríto de 4 e 8 dias para culturas cu1tiv:ada8 "em rneios de menor quociente de carbono em relação a nitrogênio (m.aior teor de nitragênio) , sugeri-n'do que o nitr.ogênio era l.imitador do cre'scimento. (Tabela 2) .

^' 21/35 ,Z A formação , rend iment o e melanização de microescleródics por M. anisopliae eram dependentes da cepa e o meio ('Tâbela 3). Enquanto a formação de microescleródios pode ser observada em todos çjs meios e 5 com todas à3 cepas de FL anisopliae, maiores corícentraçõ-es de microescler'ódios foram medidas nos días 4 e 8 apç53 a inoculação em meios ricos (36 g/jj carbono) pela cepa de M.

anisop1iae F42. No dia 8, meios ricos com quocíentes de earbono em relação a nítrogênio de 30:1 e 50:1 produziram 10 2,7 e 2,9 x 1Ú m.icroescleródios/@, respectivarnente (Tabela 3). O"s microescleródios formados pela cepa M. anisopliae F5·2 e.m meíoá com quociente de carbono erri relação ao nitrogênio de 5Q:I eram mais altamente raelanizadas em comparação com qs mícroescleródios formados em meios com maiores quocientes 15 'de cãrbono em relação ao nitrogênio.

A tolerância a dessecação dos microescleródios secados ao ar das culturas com 8 dias de idade demonstrou que todas as c'ulturas e cepas de M.

ani,aopliae produziram microescleródios que sobreviveram ao 20 pTQceE3so de secag'em sem perda signif icativa na viabilidade, exceto as c'ulturas cultivadas em meios tracos com baixo teor de nitrogênio [8 g/L carbona, quociente de carbono em 're.lação a nitrogênio de 50:1 (Tabela 4)]. A produção de conídios por microescleródios secados ao ar para todas' as 25 c'èpàs de M. anisopliae, independentemente dos me'ios, ÉQi maicir que 1 x 108 conídio3/g de f.ormulado seco (Tabela. 3).

Ern geral, as formulaç'ões de microescleródios s'ecos de meios ricos (meios 4, 5, 6) produziram maiores números de conídios

W ··^ 22/35 d em comp-aração com os Eormulados de microescleródios derlvados de meio.s com menores "concentr'ações de càrbOno'.

Alétn "disso, culturas de M.. anisopliae cu.ltivadas em meios ricos pro.duziram' mais biomassa (Tabela 2) , o que resultou e.m 5 maiores rendimentos de Eormulaçães de mieroescleródios secos .

Exemplcj 2 Avaliaçã.o dQ Cres'cimento Fúrlgic0 e Esporulação de Micrcyesc1erõdigsi em S'olos Diferentes ÍÓ O crescimento fúngico e éapQru1ação. àa cepa de l!à. anisopliae MA1200 a partir de grânulos de micro"esc1eródios produzidos dos meios 4, 5 e 6 foram avaliados em placas de solo ümido. Os grânulos foram pEeparados como descrito. anteriormente, peneirados para um 15 tamanho de partícula de 0,6-1,7 rnm e armazenados em sacos plást'icos lacrados a 5-7°C por n'ove meses antes do uso. Um solo argilosa de um campo de beterrabas em Sidney MT, um S."Ò:1Ò de b-arro argiloso coIetado de um campo de beterrabas pEÓximcj a St. Thomas, ND, e um solo de barro arenoso de 20 'Torrin'gton, WY, Eoram separadamente secados ao ar até um t'eoK de urQidade menor que 2"í, pulverizados e peneirados através de urna peneira de malha 20 (EUA) para um intervalo de tarnanho de partí.culas uniforme. A textura dci soiQ foi determinad.a por métod.o3 padrão (sheldrick e Wang, 1993, 25 Particle size distributiDn. In, soil Sampling aríd Metho.ds O:E Arla1ys.is, M.R. Carter, Ed. Can. Soc. Soil Scie'nce, Lewis Publishers, Boca Raton, fl, pp. 499-512). Todos os solos testados eram n'ão estéreis. Os três solos foram coIocados etn

^ 2313$ .a plac.as de Petri e umedecidos com ág,ua de osmose reversa para uma capacidade de c.ampo de '2 0 °)· (como anteri orment e de termin'ado para cada solo) . Grânulos contendo microescleródios de M. anisopliae de cada meio de produção 5 foram borriEados na süperfíc'ie de três placas replicadas de cada solo. As placas foram colocadas em sacos plásticos revedáveis e incubadas a 25°C. Os grânulos fg)ram visualmente examinados quanto ao crescimento fíingico e conídiação 3 e 7 días' apôs .

I.O' O crescimento fúngico e esporulação de cepas de M. anisopliae MAI200, F52 e TMI09 produzidas a partir do Meio 5 e grânulos baseados em grãos de milho de c'epa e de. M. anisopliae F52 (consulte os bioensaio8 abaixo) também foram avaliados em placas de solo 15 argiloso úrüidO. O solo argiloso não estéril foi o mesmo usado anteriormente. O protocolo de avalia.ção fo'i ç) descrito -anteriorme.nte, com observações vistíais diárias , a partir do Dia 3 . Resultados 20 Grànulos do Meio 4 (Quocíente 1'0:1 C:N, 36 g carbono/LÀ do Dia 3, o crescimento Eúngico compacto típico de M. anisopliae estava presente em todos os grânulos de microescleródios incubados nos três solos t.estadQs. Menos de 10% tinhãm uma coloração esverdead'a, 25' indiçat.iva da c.onidiação inicial. No Dia 7, os grânulos de microesclerÓdios foram amplãmente cobertos com um himênio fúngico, mas a conidiação nã'o foi destacada.

N E" 24/35 ..R Grânulos do Meio 5 (Quooiente 30:1 C:N, 36 g carbono/lj : no Dia 3, o crescim.ento' fúngico compacto. e a conidiação estavam preserítes em todos os grânulos ern todos qs três soicjs. Houve também uma pequena 5 qúantidade de c·rescimento m'ais ereto, filamentoso. No Dia 7, a conidiação inten'sa de M. anisopliae esteve presente em todos cjs grânulos, nos três solos Grânulos do Meio 6 (Quocíente 50 :1 C:N, 36 g carbono/lj) : no Dia 3, çj cre8cimentcj ftingico IO :foi :f raco e pontual rios solos de barro argiloso e harro arenoso. No s.olo de argíla, o crescimento fúngico foi muito esparso. No Dia 7, o crescimento íúngico e a conidiação verde típica ocorreu e'm essen.cialmente todos os grânulos em todos qs três solos. Apesar da extensão da conidíação não

1.5 ter sido quant ificada , os níveis de conidiação para os diversos s'olo's tes.tados' seguiram o padrão; SOIO de barro arenoso > scjio de barro argiloso > solo de argila.

No Dia 3, grânulos de mi.crQe8cleródios de MA1200, F52 e TM109 apresentaram 20 ereEcimentQ fúngico, ao c'.ontrário dos grânulos de grão de milhQ da,q cepas de M. anisopliae F52. Os grânulos da cepa TM109 tinham himênio compacto em suas superfícies com ãreas de conidiação proEusa. O crescímento nos grânulos das ce'pas F52 e MAI200 foi menos rebusto; os grânulos da cepa F52 25 t.inham conidiação mais visível do que a cepa MA120 0 . Houve muito pouc'o. cres"cimento nos çlrârlulQs de grão de milM da cepâ F52 co.m mais crescimento consist indo de fila'mentos miceliais e'spalhados simples. N,o Dia 4, a conidiação e8ta·va

6"" 25/35 -J vis.ivelmente em andamento com as cepas MA120 0 e TM109 em grânulos de gr-ão de milho, mas ausente dos grânulos de grão de milho inoculados com a cepa F5 2 . No Dia 5, tQcioS o's .grânulos de microesclerõdios de M. anisopliae t inharn 5 conidiação verde compacta profu3a. Em comparação com os grânulos de micro'escleródios, c's grânulos de grão de milho de todas as cepas de M. anisopliae testadas continuaram a ter crescimento fúngíco esparso e p"ouca conidiação até o Dia 7-8 (Figura 2). Após o D'ia 8, a esporulação se tornou mais ,10 mbustã, mas nunca atíngiu a mesma extensão visual dos grânulos de microescleród'ios.

Exemplo 3 Eficácia Relativa dos Grânulos de Microescleródios Produzída pelos Seis Meios no Exernplc 1 15i A eficácia biolôgica relativa dos grânulos de microe,scleródios produzidos pela cepa F52 em todQs os seis meios E.oi avaliada usando bioensaios. ba8eadQs no solo .com larvas do besouro da mosca da beterraba (.SBRM).

Oq grânulos (rrlalha 20/30) de F52 de tocÍO8 os seís meios 20 foram incorporados em um solo de argila seco, peneirado, não estéril, u8ando anteriorrnente à taxa de 14 mg de grânul.os/60 g de solo. Dois lotes de produção separados de grânulos foram avaliados. Os grânulos foram armazenados em sacos plásticos vedados a 5-9°C por sete meses antes do uso. Os 25 solos foram umedecidos com água de osmose reversa a um ponto final de 15% da capacidâde de campo (anteriormente determinada) e os potenciais de água det e rminados corn um medidor de umidade AQUALAB (Dec.agon Products , Pullman, WA) .

.'U m" 2'6/35 .iü" AS nmidades de solo res'ultantes foram de 0, 982-0, 983 Aw (- 2 , 3"2 a -2,47 MPa de potene ial de matri z ) , cuj as umidades eram suficientes p'ara crescimento' fúngico e esporulação. O ponto de murcha'mento permanente para a maioria das plantas é 5 íO,98i9 Aw. Um solo de conti:ole não tratado foi preparado si'mplesmente pelo umedecimento de uma alíquota adicional de solo, sern nenhum g rânulm , com a me sma quant i dade de água .

Cada solo tratado e de controle :Eoi então dispensado igualrriente ern três copos de 60 cc, corn tampa, plásticos, de 10 condimento. Os copos fo.ram vedados e colocados em uma camada de papel toalha umedecido com água (para manter a umidade) em um grande rec-ipiente plástico com tampa e incubados a 24°C. Apõs uma semana, os solos foram infestados com 10 larvas SBRM de terceiro instar por copo. Estas Iarvas foram 15 coletadas em eampo, em diapausa mas móveis e serrí alimentação, e havíam sido armazenadas em areia estéril úmid'a a 3-4"C por váríos meses antes do uso. Cada tratamento .foi repliQado três vezes. A mortalidade larval iíoi determinada semanalmente por três semanas. A cada Be"mana, 2Q todos ds cadáveres eram removidos e colocados a 95-100% de umidade por três dias para deduzir a presença de micose.

Dois lotes de produção separados foram aval.iados de.sta maneíra .

Para análises estatísticas de 25 dados. de bioensaio, todos os dados de mortalidade foram ajustadQs para controlar a mortalidade, quando neeessârio, pe.la aplicação da correção de Abbott (Abhott, 1925) e então sujeitados a transformação angular antes de análise

.e + 21/35 .d adieional. Os dados foram e-ntão sujeitados a ANOVA e teste de ,separação de meio HSD de Tukey quando os efe-itos significativo.s do tratamento foí:am identificados.

Resultados 5 Não houve difere-nças significativas na eficácia entre dois lotes de produção de grâ'n-ulos' de microescleródios para qualquer dos meios testadôs ern 1 e' 3 semana8 (F= 0,06, p = 0,83 para a Semana 1; F = 1,51 p = 0,34 para a Semana 3) e uma diferença pouco 10 s'igMticativa na Semana 2 (F= 23,94, p = 0,04), devido às mort.alidades dos grânulos de. microescleródios do Meio 1 serem significativamente diferentes entre os ãois lotes. A m-ortalidade de contr-ole para SBRM Eoi de 0% mesmo após três semanas. Qs dados sãcj apresentados na Tabela 5. Houve 1'5' 'diferenças sígni.ficativas entre as mortalidades iniciais dos grânulos produzidos nos seis Meios, em ambos c3s lotes, uma 8emana após os sQios tratados terem sido infestados com larvas (F' = 6,41, 5 df, p = 0,004 para o Ijpte E050509, e F = 4,94, 5 df, p = 0,0.11 para o Lote E050516). Quando os dados 2Q para ambos os lotes foram agrupados, os grânulos dos Nleios 4: e 5 estavam Mgnifícativamente melhores que o resto (HSD de TukeY, p=O,05). En1 três semanas apõs a ínfestação, as mortalidades das larvas atingiram 100% na maioria dos tratamentos corn as diferenças sígnificativas 25 entre os Meios 2-6 desaparecendo; os grânulos dQ Meio 1 apresentaram üm desempenho pior que o resto.

Exemp1"o 4

-t a 28/35' u Compàração de Eficácia de Grânulos de Microescleródios' com GTânulos de Carreador NutrÍtivo Convencional ein Dois Solos D'iferêntes Um bioensaio também foi 5 conduzido p"ara comparar os -grânulos de microescleródios da 'cepà F'52 do Mêio 5 com grânulos baseados em grão de milho maís convencionaís que têm sidQ usados em trabalho d'e iaboràtório e em t.estes de 'campo ccmtra o SBRM [jaronski e outros, 2.006, Challenges in using Metarhiziuln a'nisopliae f.or

1.'0 .CQMKQi oÍE Suaarb'eet Root Maggot, Tetanops myopaefo.rmis .

Bulletin 1OBC/wprs 30 (7) :119-124; Campbell e- outros, 2Ò06, Envi ronment al Ent omology . 35 (4) :986-991; jaronski & Campbell, 2006, 2'005 Sugarbeet Research and Ext.ens ion Reports. 36:185-189; Majurndar e ou.tros, 2006, 20'05 Sugarbeet 15 Research and Ext.ension Report s . 36: 222-227] . A avaliação f.oi condu:z ida em dois s"olos, um solo .de barro argiloso coletado de um canipo de beterrabas próximo a St . Thomas, ND, ê d Blç)lO de argila usado anteriormente. 'Os grânulos de grão de milho con3istiam de um carreador d-e grãos de milho de 20 malha 16/30 (Bünger Milling, St . Louis-, MO) revestido ccm Qonídios usando um aglutinante de TnonQ-Qleato de sorbitano de polioxietileno aquom a 10% (TWEEN 80). A c.oncentração alvo de conídios nestes grânulos foi de 1-2 x 10' conídios/grânulo. Estes grânulos baseados em grão d.e milho 25 foram rec-ém-preparados usando conídios secos produz·idos com fermentação de substrato sólido e refrigerados até ò uso. Os grânulos de microescleródios secos do Meio 5 fo.ram peneirado.Q em uuí taruanho de malha 20/32 antes do uso. Quando a* colocados 'em um arubienÊe suficienteme'nte úmido (Aw > 0,95) tal como ágar de água, scjio úmido ou papel filtra úmido, os grânulos de grão d-e- milho foram co'bertos c:om uma segunda geração de eQnídiQs dentro de 7-10 dias, enquanto que os 5 grânulos de microescleródios apresentaram esporulação em abundância dentro de 3-4 dias. O bio.ensaio Eoi conduzidç) 'como descrito anteriormente , mas com uma ta.xa de 112 rng de grâ'rLu1os/ 60 gramas de solo seco . Os solos foram hidratados pa.ra uma capac idade de campo de 15 % para cada solo . Este lÓ nível de umidade resultou em Aw medido de O,Si83 e 0,984 pa.ra cjs dois solos como determinado pelo medidor Aqualab. Três copo's replicados de 10 I-arvas cada fotjam u8ados para cada tratamento. As lavras SBRM forarn adicionadas apõs os solos te.rem sido incubados por uma semana a 25°C. As mo'rtalidades 15 larvais foram detemínadas apõs 1, 2 e 3 semanas, como descr'ito anteriormente.

Resultado3 Em s'o.los tanto de barro de argila quant.o de argíla, os grânulos de rnicroesclerÓdios do 20 Meio 5 apresentaram uma eficácia signif.icativamente maior do que os gr-ânulos de grão de m'ilho cob'ertos com conídios mais tradíciona'ís., A mortalidade do grânulo de microescleró.dia fcj i de 100% dentro de uma 3eman.a da 25 infestação do,s solos tratados com larvas (Tab'ela 6) .

No s.olo de argila, os grânulos baseados em grão de milho pro"vQ.caram apenas uma baixa mortalidade larvàl.

A .* Exemplo 4 lcQmparaçã"o de ÉE'icácía de grânulos de MicrQesclerúdi0s com Grânulos carreadores Nutrit ivos Convenci-çjnais e'rn DifeEentes Umídades do Solo 5 Bioensaios adieionais foram corIduzidog p.ara comparar os grânulos d'o Meio 5 com os grânulos do grão de milho em diversos níveis de umidade do solo. Os grânulos foram incorporados em' um solo de argila à taxa de 1, 8 mg/g de 8o1o e os soiQS pos teriQrmente 10 umedecidos até c) ponto final de umidade dese j ado com água .

Esses ensaios foram conduzídos como descrito anteriormente, com três copos' rep:licadQs de 10 larvas cada por tratamento, exceto pelo Eato de que o solo de argíla foi umedecido em 7 , 5% (Aw= '0,8'36), l'0'% (AW= 0, 919) , 15% (Aw= 0,983), 15 ou 20* (,Aw= :0, 9S'1) da Capacidade do Campo. Os níveis de umidade foram veríficados doí s dias após a in'9culaçãQ com c-onídios e hidratação usando um medidor de atividade de água AQUALAB (Decagon D.évices, Inc . ) . O ensaio inteiro foi replicado duas 20 ve-ze s . A mortalidade larvaL f c) i determinada pela amostragem destrutiv.a 3 8emranas depois. Qüài squer cadáverês sem fungos de esporulação erri seus exteriores foram retirados e incubados em alta umidade por três dias para indicar a presença de micose.

25 Resultados Quando a eficácia dos grânulos de microescleródios do Meici 5 foi comparada com os grânulos de grão de milho ern diversos ní've'is de umídade do so.lo, o r A

Á .r primeiro provocou uma mortalidade SBRM signiEícativamenLe rnaior em níveis de úmidade de 0,919 Aw e superiores (Figura 1). A mórtalidade larval foi de 100% x 20 e 30% para os grânulos baseados em grão de milho em nívei8 AW de 0,983 e 5 0,991. A ürna umid'ade de 0,919 unidades de atividade de água, a mortalidade larval da exposição aos grâríulos de microescle-ródios foi de 20% x 6% para os grânulos de grão de milhçn  mortalidade de controle foi menor que 10% em todos (js. níveis de umidade. No geral, os grânulcis de 1'0' micr9eBclerádios provocaram uma mortalidade muito maior nestes solo.s sub-saturados porque OS micr'Qesc1er:ódios produziram conídios ma i s infeceiosos} mais rápido do que a formulação de grânu1cj,s cònvencional. Estes dados enfatizam a 15 sup-eriDri'dade dos grânulos de microescleródias sobre s.ubs'trat'os nutritivos "contendo conídios.

É entendido que a descrição detalhada acima é apresentada meramente por meio de ilustração e que modificações e variações podem ser feitas 20 na mesma sem se afastar do espírito e escopo da invenção.

Tabela 1. Conce-ntraç.ão de carbono (g ITI) e quociente de carbono em relação a nitrogênio em culturas líquidas 'usadas para avaliar o crescimento e os rendimentms de diferentes cepas' de M. anisopliae.

Casaminoácidos c(g 1'1) C:N Glicose (g L"l) (g L"l) 8 10:1 10,0 10,0 — 30:1 16,6 3 ,4 8 — 2,0 8 50:1 18,0 µ 3à'35 m I

Q Continuação da Tabela 1 3"6 10:1 45,0 45,0 36 30:1 75,0 15,0 50:1 — 36 81,0 9,0 Tàbela 2. Comparação de diversos meios na produção de biom'assa por Metarhiziuin anisopliae em cultura líquida apás crescimento de 2, 4 e 8 dias lsolado de meio Metarhizium Cone de carbono Quociente de carbono Biomassa (mg/ml) anisopliae (g/O) em relação a nitrogênio

I Dia2 Dia 4 Dia 8

2.5a 55d = 1 8 10:1 2 8 30:1 2 .5a 4.5d j5.od Ma1200 3 8 50:1 1.5a 4.5d j4.4d 4 36 10:1 2.7a 22.2a j26.6a 5 36 30:1 3.5a 14.8b j18.9b 6 36 50:1 2.1a 1Q.QC j13.3c 8 10:1 I.1C 8,2d 3.2C 1 2 8 30:1 3.4a 5,4e 5.5C 3 8 50:1 1.7C 4. Oe 3 .5c E52 4 36 10:1 2 .0b,c 22.6a j33.oa 5 36 30:1 3.8a 19.7b j21.6b 6 36 '50:1 3.2a,b 11,8C j18.3b 1 8 10:1 0.8C 5.2C j4.5d 2 8 30:1 0.7C 3.1c,d j3.8d 3 8 50:1 Q.6C 2.2d j4.od TM109 4 36 10:1 1.Ob,c 12,7a,b j30.5a 5 36 30:1 1,7a 13 .7a j24.ob 6 36 50:1 1.5a,b 10.6b |14.0ç Para cada 1scAado, qs valores 5 médios seguidos por diferentes letras s'ão significativamente diferent.es usando HSD de Tukey-kramer. Os valores médios são de r ivados de seis valore's (3 expe'ri me ntos separados executados em duplicata para cada tratamento).

Tabela 3. Co1TlparaçãQ de div-ersos meios na produção de 10 microescleródios p.or Metarhiz.ium anisopli.ae em cultura líqtiida apCk crescímento de 2, 4 e 8 dias

QM .

33/35 à &, ^

O ísdado de meio MeMwzium ·. II €aban0 I|cam0nQ Conede em Nlação| Quoaente de MicròescLeródio5 (micr0esc|eròdiDs/mL x 10') anisop/iae I ©ID) I a nitrogênio Day 2 Day4 Day8 Ma 120oi 8 10:1 3.1a 10.6a,b 15 3a

2.7C 6.4b,c 2 I 8 I 30:1 I 05b 3 8 50:1 0.5b 2 ,4c 4.9C 4 36 l0:1 1.7a,b 5.7b,c 12,Oa,b 5 36 3ò1 2,3a,b 7.7b,c 9.3a,b,c 6 36 5ÕÍI Zia.b 15.3a 14.7a F521 8 ion Q.8b 10.5a 5.3b 2 8 30:1 1.7b 6.4a,b 11.7b 3 8 — 5Q:1 2."3b 5',Ob 8.5b 4 36 10:1 8.Qa 10.3a 9.3b 5 36 3éi 7.9a — 11,Oa 27.Oa e 36 5'0:1 9.5a 6.8a,b 29,Qa M11J91 8 10:1 O.Oa 2.Oa,b 1.2a 2 = 30:1 0.7à 1,2b 1.8a 3: 8 50:1 0.6a" 0,2b l.'Oa 4 36 '10:1 .0,2a 1.9a,b 5.3a = 30:1 2.Oa,b 3 ,7a 5' 0.5a 5 36 50ri Q.3a 4.9a 3 ,9a *Para cada isolado, os valores médios seguidos por di ferentes letras são signif icativamnte diferentes usando HSD de Tukey-kramr. Os valores médios SãQ derivados de 3eis valores (3 rimentos separados execut ãCÍQ8 em 5 duplicata para cada tratamento) .

Tabela 4. Avaliação da tolerância a dessecação e capacidade de produção de conídios de microescler6dios secados ao ar de Metarhizium anis.opliae Germinação lsolado de melo Meta:hz/um ,/. çârboncj Cone de Quociente carbono em re}ação de Geminação (% de miaüesderódios) hifal esporogênica (conidios/g de anisopliae ,(9/O) " a nitrogênb ' formulados secos x jQ7) ,10'1 lOOa 24.Ob '2 8 30:1 lOOa 29,5b 3 8 50:1 87b 28.Ob 4 36 10:1 lOOa 42.3b 5 36 30:1 lOOa 97 5a 6 36 50:1 99a 21.5b b 34/35

W I /' Cointinuação da Tabela 4 F52 1 8 10.1 99a 53.5b 2 8 30:i 96a 64,5b 3 8 50:1 99a 46.5b 4 36 10:1 iõ6à 114.5a 5 36 30:1 nõã 82.5a,b

82.3a.b Õ 36 50:i 97a tm1091 1 8 10:1 j85â,b 18,1b 2 8 30:1 |93a,b 15,4b 3 8 ,50:i |46b 16.Ob 4 36 10:1 j100a 81,3a,b 5 36 30:1 |1QOa 94.3a 6 36 50:i |i0Oa 63.Ba,b Para cada isolado, 013 valores médios seguidos por diferentes Ietras são significativamente d'iferente8 usandg} HSD de Tukey-Kramer. Os valores médiQ8 são derivados de quatro valores (2 experimentos separados 5 executados em duplicata para cada tratament.o).

Tabela 5. Mortalidade de larvas de Tetanops myopaeformis de terceiro instar expostas a sQiQs tratados cQm grânulo de microescletôdio, 1, 2 e 3 semanas apõs a ínfestaçãcn Grânulos de microescleródios de M,eta-rhiziun? anisopliae Cepa 10 F52 preparados de culturas líquidas pro-duzidas nos meios 1-6 |1 Semana |2 Semanas |3 Semanas Tratamento Mortalidade' Micose Mortalidade Micose Mortalidade Micose Teste 1 (Bate) ,h 050509) Meiol O°/q b - 23,3% b 71,4% 46,7?/, b 71,4% Melo 2 6,7% ab 50,0% 50% ab 100% 96,7% a 100°6 Meio 3 10l0Yj ab 66,7% 63,3% a 100% 100% a 100% Melo 4 36,7°6 a 100% 76,7% a iO0'6 100% a 100% Mdo 5 26,7% a 75% 56,7% a 100 % 96,7% a 1OO°/q Meio 6 5,7% ab 100% 70,0°6 a' 100 °/, 100% a 100'6 |Estmistjga anova !F=6,41,5dfp=0,00'4 |F=755,5df,p=0,à02 jF=19,9,5df, p<ÜO1 Teste 2 (.Bate) :h 050516)

e 3'5/35 r I

J Meio 1 |0,0°6 b 63,3% a 94,7°4 86,7% a 85,7°6 Continuaçào da Tabela 5 Meio 2 |(Í,7% b |100°4 76,7°6 a |81% 96,7% a |100% i Meio3 |0,0% b 53,3% a 81,3% 96,7% a 100% i Meío 4 26,7% a IOO'/q 7O'/, a 1OQ% 100'6 a poo% I Meio5 16,7% áb 8O°/, 70% a 100°t 90% a |100% i Meio 6 XOw3'63,jD 75% 73% a 100% 96,7°6 a 100% F= 0,93, 5d, p=ü9 Estatistica ANCA/A F=4,94, 5df, p = 0,011 F= 0,66, 5df, p= 0,66 *As' mortalidades são a média de três replicações e, se seguidas por uma letra diferente em uma coluna, são signif icativamente diferentes (.HSD de Tukey, p < 0, Q5) .

5 Tabela 6 . Mortalidade de larv.as de Tetanops myopaefQrmi s de terceiro instar exp0stas a solos tratados com grânulo de microesclerõdio, 1, 2 .e 3 semanas apÔs a ínfestação. As mortalidades sãcj a média de três replicaçÕes (SD) e, se seguidas por uma letra diferente em uma coluna, são 10 significatívamente diferentes (HSD de Tukey, P < 0,01) . A micose foi 100% entre todos qs cadáveres.

|MQrta|ida"de |SO.IÒ |Tratament0 |1 Semana |2 Semanas 3 Semanas I Não tratado |O°/, a |0% a O%a |Argi|a |Grãnulo de microesderódiòs |100% b |100% c 100% C Grãnuio de grào de mi|hQ 0% a 23.3% (i5.3%)b 26,7% (15,3%)b jNão (ratado |0% a |0% a 0% a j8arro de argila |Grãnuio de microescberódios |100% b |100% c 100% ç |Grãnulo de grão de milho |0% a jo%a Oq/j a

Claims (5)

REIVINDICAÇÕES

1. "MICROESCLERÓDIOS ISOLADOS DE UM FUNGO ENTOMOPATOGÊNICO", caracterizado pelo Eato de que o fungo entomopatogênico é selecionado a partir de um 5 grupo consistindo nas espécies Metarhizium, Beauveria e Lecanicillium. @

2. "MICROESCLERÓDIOS ISOLADOS DE UM FUNGO ENTOMOPATOGÊNICO", de acordo com o reivindicado em 1, caracterizado pelo fato de que lO o fungo entomopatogênico compreenda a espécie Metarhizium.

3. "MICROESCLERÓDIOS ISOLADOS DE UM FUNGO ENTOMOPATOGÊNICO", de acordo com o rei4indicado em 2, caracterizado pelo fato de que o fungo 15 entomopatogênico compreenda o Metarhizium anisopliae.

4. "MICROESCLERÓDIOS ISOLADOS DE UM FUNGO ENTOMOPATOGÊNICO", de acordo com o reivindicado em 1, caracterizado pelo fato de que o fungo 20 entomopatogênico seja signifiicativamente puro sob o ponto de vista biológico.

5. "COMPOSIÇÃO CONTENDO MICROESCLERÓDIOS DE UM FUNGO ENTOMOPATOGÊNICO", caracterizada pelo fato de que a composição contém 25 microescleródios de um fungo entomopatogênico selecionado a partir do grupo formado pelas espécies Metahizium, Beauveria e Lecanicillium com um portador agronomicamente aceitável no qual esses microescleródios germinem mediante reidratação,

Zormando hifas ou esporos para produzir conídios aéreos ineficazes.

6. "COMPOSIÇÃO CONTENDO MICROESCLERÓDIOS DE UM FUNGO ENTOMOPATOGÊNICO", de acordo 5 com o reivindicado em 5, caracterizada pelo fato de que o fungo entomopatogênico compreenda a espécie Metarhizium.

7. "COMPOSIÇÃO CONTENDO .. MICROESCLERÓDIOS DE UM FUNGO ENTOMOPATOGÊNICO", de acordo com o reivindicado em 6, caracterizada pelo fato de que c) lO funga entomopatogênico compreenda o Metarhizium anisopliae.

8. "COMPOSIÇÃO CONTENDO MICROESCLERÓDIOS DE UM FUNGO ENTOMOPATOGÊNICO", de acordo com o reivindicado em 5, caracterizada pelo fato de que o fungo entomopatogênico seja substancialmente pura.

15 9. "COMPOSIÇÃO CONTENDO MICROESCLERÓDIOS DE UM FUNGO ENTOMOPATOGÊNICO", de acordo com o reivincíicado em 5, caracterizada pelo fato de que os microescleródios estejam presentes em quantidade eficazes sob o aspecto inseticida.

20 IO. "COMPOSIÇÃO CONTENDO MICROESCLERÓDIOS DE UM FUNGO ENTOMOPATOGÊNICO", de acordo corn o reivindicado em 5, caracterizada pelo fato de que os microescleródios sejam produzidos por cultura líquida e estejam presentes na biomassa recuperada em uma concentração 25 de, pelo menos, cerca de lx106 microescleródios por grama de bíomassa.

ll. "MÉTODO PARA CONTROLE DE INSETOS", caracterizado pelo fato de que o método de uma quantíciade eíicaz 3/5 controle de insetos ocorre a través da aplicação no local de sob o ponto de vista microescleródios de um fungo entomopatoçênico selecionado a inseticicía de j partir de urn grupo Eormado pelas espécies Metarhizium, 5 Beauveria e Lecanicillium.

. 12. "MÉTODO PARA CONTROLE DE ·ã INSETOS", de acordo com c) reivindicaão em li, caracterizado pelo fato de que c) Eungo entomopatogênico compreenda a espécie Metarhizium.

lO 13. "MÉTODO PARA CONTROLE DE INSETOS", de acordo com o reivindicado em 12, caracterizado pelo fato de que q fungo entomopatogênico compreenda o Metarhizium anisopliae.

14. "MÉTODO PARA CONTROLE DE 15 INSETOS", de acordo com o reivindicado em ll, caracterizado pelo fato de que os insetos sejam selecionados a partir do grupo composto por gorgulhos da raiz, larva do solo, vaquinhas, lagartas rosca, moscas da fruta e larvas da mosca.

20 15. "MÉTODO PARA CONTROLE DE INSETOS", àe acordo com c) reivindicado em ll, caracterizado pelo fato de que esses insetos sejam selecionados a partir do grupo composto por térmites subterrâneos (Reticulitermes e Coptotermes spp. ), larvas do 25 milho {Diabrotica spp), gorgulho da videira {Otiorhynchus sulcatus), lagarta rosca (da família dos Elaterídeos), larvas do besouro perfurador de raiz (Diaprepes abbreviatus), larvas da mosca da beterraba (Tetanops myopaeformis), larvas das sementes de repolho/nabo/cebola/milho (Delia spp.), mosca-da-cenoura (Psila rosae), gorgulhos da batata doce (Cylas formicarius), Besouro japonês (Popillia japonica) e 5 joaninhas (Rhízotrogus majalis).

16. "MÉTODO PARA CONTROLE DE t . INSETOS", de acordo com o reivindicado em 14, caracterizado . pelo fato de que tal aplicação compreenda a aplicação dos microescleródios mencionados ao solo ou mistura àe plantio 10 para estufas.

17. "MÉTODO para CONTROLE DE INSETOS", de acordo com o reivinãicado em Il, caracterizado pelo fato de que esses insetos habitem Eolhagens ou cascas de árvores selecionados a partir do grupo composto peio 15 besouro verãe {Agrilus planipennis), traça da uva (Lymantria dispar) e gorgulho da nogueira-pecã (Curculio caryae).

18. "MÉTODO PARA CONTROLE de INSETC'S", de acordo com c) reivindicado em i7, caracterizado pelo fato de que os microescleródios sejam aplicados à casca 20 e à copa de plantas e árvores.

19. "MÉTODO DE PRODUÇÃO A

PARTIR DE UM FUNGO ENTOMOPATOGÊNICO DE UMA CONCENTRAÇÃO DE MICROESCLERÓDIOS FÚNGICOS TOLERANTES À DESSECAçÃO", caracterizado pelo fato de cornpreender as etapas de: a) 25 inoculação cíe um meio de cultura líquido contendo uma fonte cíe carbono e uma de nitrogênio com propágulos fúngicos de um fungo entomopatogênico a partir de um grupo composto por espécies cie Metarhizium, Beauveria e Lecanicillium. A fonte de nitrogênio contém uma concentração entre 8,1 e 50 gramas/litro e a origem cíe carbono contém uma concentração superior a 20 gramas/litro; b) íncubação dos propágulos por período suficiente para permitir a produção dos

5 microesclerÓdios; e C) coleta dos microescleródios

- resultantes. 'b .