ES2310134B1 - Composicion fitosanitaria que comprende un hongo entomopatogeno perteneciente a la especie b. bassiana y triturados o fragmentados de datiles, metodo de elaboracion y uso de la misma. - Google Patents

Composicion fitosanitaria que comprende un hongo entomopatogeno perteneciente a la especie b. bassiana y triturados o fragmentados de datiles, metodo de elaboracion y uso de la misma. Download PDF

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Abstract

Composición fitosanitaria que comprende un hongo entomopatógeno perteneciente a la especie B. bassiana y triturados o fragmentados de dátiles, método de elaboración y uso de la misma.
La presente invención se refiere a una composición fitosanitaria a base de subproductos agrícolas de palmáceas y de hongos entomopatógenos (agentes de control biológico) con el objetivo de reducir las poblaciones de insectos que atacan a las palmeras.

Description

Composición fitosanitaria que comprende un hongo entomopatógeno perteneciente a la especie B. bassiana y triturados o fragmentados de dátiles, método de elaboración y uso de la misma.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a una composición fitosanitaria a base de subproductos agrícolas de palmáceas y de hongos entomopatógenos (agentes de control biológico) con el objetivo de reducir las poblaciones de insectos que atacan a las palmeras.
Estado de la técnica anterior
El continuo crecimiento de la población humana requiere la búsqueda de nuevos caminos para incrementar la producción de alimentos. Una forma de conseguir este objetivo es la reducción de las pérdidas en cultivos agrícolas provocadas por organismos que producen enfermedades y plagas. Uno de los métodos más utilizados para contrarrestar los males causados en los cultivos por los insectos es el uso de agroquímicos. Estos productos tienen un rol muy importante en la reducción de los daños económicos en los vegetales. Sin embargo, la elevada toxicidad de algunos de ellos, su residualidad y mal manejo han llevado a un replanteamiento de las tácticas de control biológico de plagas, que ha dado lugar al desarrollo de bioinsecticidas que incluyen tanto bacterias, como virus y hongos entomopatógenos, como sustancias tóxicas naturales producidas por microorganismos con un menor impacto medio ambiental.
Los hongos entomopatógenos ofrecen posibilidades muy interesantes para el control biológico porque, además de los daños directos que son capaces de causar a sus huéspedes, pueden formar epizootias que se extienden entre sus poblaciones. Este interés por los hongos entomopatógenos se despertó desde el conocimiento de su patogenicidad hace unos 100 años, siendo inicialmente utilizados en la lucha contra plagas de insectos aunque sin resultados satisfactorios, lo que supuso el desarrollo y uso masivo de los insecticidas químicos. Los abusos en el uso de los plaguicidas y los peligros que ello comporta, han despertado el interés en el uso de los hongos para el control de plagas de insectos.
Entre los géneros que están siendo estudiados para su uso en el desarrollo práctico como micoinsecticidas, se deben destacar Beauveria, Metarhizium, Lecanicillium (= Verticillium) (Moore y Prior, (1993) Biocontrol News and Information 14, 31-40), Cordyceps y Paecilomyces. Dentro del género Beauveria, la especie Beauveria bassiana tiene un amplio rango de huéspedes (Knudsen et al. (1990) Journal of Economic Entomology 83, 2225-2228) y produce micotoxinas detectables en medio de cultivo, que al ser inoculadas en larvas de gusanos de seda causan hinchazón y rigidez.
Para la obtención de masa de hongos para su uso como bioinsecticidas, es necesario su crecimiento eficiente hongos medios de cultivo determinados que varían en función del la especie de que se trate. En la práctica, los sustratos sólidos más corrientes usados para la producción de hongos entomopatógenos como M. anisopliae son productos primarios de la agricultura, aunque además de productos primarios, se están desarrollando como de medios de cultivo algunos subproductos de la agricultura ya que suponen costes de producción mínimos.
Así, Mycotech Corporation (USA) desarrolló un cultivo en medio sólido sobre un sustrato de partículas de almidón donde se desarrollan hongos entomopatógenos. Se han desarrollado otros medios basados en productos agrícolas diversos como mezclas de salvado húmedo, harina de maíz y agua y otros medios compuestos por cubierta de semilla de algodón en polvo, salvado húmedo, harina de maíz y agua. Se ha investigado la aplicación de subproductos naturales como la corteza de coníferas, el agua de coco (subproducto agrícola) o el mesocarpo de almendra (Lopez-Llorca, L. V. y Carbonell, T. (1998). Canadian Journal of Microbiology 44, 86-90) para la producción de hongos antagonistas.
Generalmente, la producción de especies como M. anisopliae, B. bassiana, L. lecanii y otros deuteromicetos, se basa en la fermentación de granos de arroz pelados y esterilizados (sin pulir). Sobre este sustrato es común obtener rendimientos que van del 10 al 12% en masa fúngica, lo que equivale aproximadamente a 10^{9} conidios/g de arroz (Alves, 1986. Editora Manole, Sao Paulo, Brasil, pp. 311-323). Estos sustratos suelen aplicarse directamente en el suelo para controlar plagas de insectos subterráneos. Otros sustratos alternativos, como granos de maíz y soja o patata, se han ensayado con unos rendimientos inferiores a los obtenidos con el arroz (Mendoça et al. (1991) Biological Control of Locusts and Grasshoppers, Lomer, C. J. i Prior, C. (eds.), Wallingford, U.K., pp. 239-244).
El patrón de crecimiento mostrado por los hongos filamentosos en sustratos sólidos, en el que buena parte del micelio se desarrolla en los espacios libres entre las partículas, hace que una reducida disponibilidad de ellos (rápidamente colonizables), pueda llegar a ser un factor limitante, incluso bajo condiciones de óptimo intercambio gaseoso. Resulta, entonces, claro el efecto que tiene el tamaño de la partícula sobre los rendimientos finales. Cuando las circunstancias lo hacen necesario es posible recurrir a diferentes clases de pre-tratamiento del sustrato para incrementar su accesibilidad y/o disponibilidad.
Explicación de la invención
Los autores de la presente invención han desarrollado una composición fitosanitaria a base de subproductos agrícolas de palmáceas y de hongos entomopatógenos (agentes de control biológico) con el fin de reducir las poblaciones de insectos que atacan a las palmeras, preferentemente la palmera datilera (en adelante, "la composición o producto formulado"). Para el desarrollo de esta composición se ensayaron diferentes géneros de hongos (Beauveria, Lecanicillium, etc.) con la composición y se llevaron a cabo multitud de ensayos con diferentes cepas pertenecientes a dichos géneros.
De este modo, se obtuvo una composición con una alta virulencia contra insectos plaga de palmera, en concreto contra el picudo rojo (Rhynchophorus ferrugineus), siendo eficaz tanto contra larvas como contra adultos de esta especie, y generando una mortalidad del 100% en periodos de exposición cortos.
De este modo, la composición constituye una forma eficaz de bioinsecticida que además, debido sus características de conservación, almacenamiento y modo de producción, permite su escalado a nivel industrial y presenta una serie de ventajas, las cuales se comentan a continuación:
\sqbullet
permite reducir el número de insectos plaga en las palmeras y afines, sin causar daño a la propia planta ni a otros organismos que pueden ser beneficiosos para las plantas,
\sqbullet
permite aumentar el tiempo de supervivencia del hongo en el medio gracias a los nutrientes que les aporta el sustrato sobre el que crecen (mayor viabilidad),
\sqbullet
los hongos que forman parte de esta composición pueden resistir más tiempo las condiciones adversas del medio,
\sqbullet
la utilización de los hongos junto con el sustrato en el que crecen facilita su aplicación en el campo para que actúen contra sus respectivos insectos diana,
\sqbullet
permite el reciclado de subproductos agrícolas (sustratos sobre los que se crece el hongo y que forman parte de la composición de la presente invención).
Así, la presente invención se refiere a una composición fitosanitaria que comprende un hongo entomopatógeno perteneciente a la especie B. bassiana y subproductos de palmera. En una realización preferida, el hongo entomopatógeno perteneciente a B. bassiana, es seleccionado de cualquiera de las cepas con número de depósito CBS121096 (cepa 193) y CBS121097 (cepa 203), depositadas en la colección Holandesa, "Centraalburean voor Schimmercultures (CBS)".
En otra realización aun más preferida de este aspecto de la invención el subproducto de palmera, preferentemente dátiles o smillas, y más preferentemente triturados, procede de Phoenix dactylifera. En otra realización preferida de este aspecto de la invención la composición puede comprender además hojas de palmáceas, preferentemente de la especie Chamaerops humilis. Las hojas de las palmáceas como Chamaerops humilis son subproductos agrícolas más pobres que las semillas de P. dactylifera debido a que las capas de cera presentes en las hojas, impiden que el hongo se nutra de ellas. Estos subproductos proporcionan superficie al hongo para crecer, a diferencia de las semillas de P. dactylifera que aportan además nutrientes, resultado así su combinación ventajosa.
Esta composición fitosanitaria, que en una realización todavía más preferida comprende polvo procedente de la trituración de las semillas, permite proteger a las plantas de los ataques producidos por insectos plaga, tales como el picudo rojo (Rhynchophorus ferrugineus).
Un segundo aspecto de la invención se refiere al método para la obtención de la composición fitosanitaria que comprende:
a.
fragmentar o triturar los subproductos de palmera, preferentemente dátiles o semillas, y más preferentemente procedentes de la especie P. dactylifera.
b.
crecer el hongo entomopatógeno en el producto del paso a), preferentemente de la especie B. bassiana, y más preferentemente pertenecientes a cualquiera de las cepas 203 y 193.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el método comprende además un paso de esterilización de los subproductos de palmera, que puede realizarse antes o después de la fragmentación o trituración.
Un tercer aspecto de la invención se refiere a una cepa seleccionada de cualquiera de las cepas 203 y 193.
Un cuarto aspecto de la invención se refiere al uso de la composición fitosanitaria de la invención el control biológico de plagas de insectos, preferentemente de picudo rojo.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Definiciones
Beauveria bassiana: es una especie perteneciente a la subdivisión Deuteromycetes. Las colonias de este hongo pueden tener un color blanquecino hasta amarillento, dependiendo del medio donde se siembre. La célula codiógena tiene forma globosa con cuello en zig-zag. Los conidios son hialinos y globosos.
Breve explicación de las figuras
Figura 1: Tiempo letal medio (LT_{50}) de larvas de C. dimidiatus después de haber estado en contacto con: el producto formulado con B. bassiana (F+Bb), el formulado sin B. bassiana (F-Bb).
Figura 2: Cadáver de C. dimidiatus parasitado por B. bassiana después de haber estado en contacto con el formulado.
Figura 3. LT_{50} de larvas de 30 días de Rhynchophorus ferrugineus en contacto con colonias de las cepas 203, 193 y 119 de B. bassiana en placas de medio de cultivo comercial agar extracto de maíz. Se observa que las cepas 203 y 193 resultan ser altamente patógenas para el picudo, a diferencia de la cepa 119 que por contra si había resultado altamente patogénica para larvas de otros insectos como el lepidóptero Galleria mellonella y el coleóptero parásito de raíces de palmeras C. dimidiatus.
Figura 4. Bioensayos (LT_{50}) realizados en larvas de entre 7 y 10 días de Rhynchophorus ferrugineus con los 2 formulados de Beauveria bassiana (cepas 203, 193). En los 10 días que duró el ensayo, no se pudo calcular la LT_{50} de los controles.
Figura 5. Bioensayos (LT_{50}) realizados en larvas de 30 días de Rhynchophorus ferrugineus con los 2 formulados de Beauveria bassiana (cepas 203, 193). En los 10 días que duró el ensayo, no se pudo calcular la LT_{50} de los controles.
Figura 6. Bioensayos (LT_{50}) realizados en adultos de Rhynchophorus ferrugineus con los 2 aislados de Beauveria bassiana (cepas 203, 193) en placas de medio de cultivo comercial agar extracto de maíz. En los 20 días que duró el ensayo no se pudo calcular la LT_{50} de los controles.
Figura 7. Bioensayos (LT_{50}) realizados en adultos de Rhynchophorus ferrugineus con los 2 formulados de Beauveria bassiana (cepas 203, 193). En los 20 días que duró el ensayo no se pudo calcular la LT_{50} de los formulados control.
Figura 8. Efecto de la temperatura de almacenamiento en la viabilidad (A) (% germinación) y patogenicidad (B) (LT_{50}) de B. bassiana tras 20, 60 y 180 días de almacenamiento del producto formulado.
Figura 9. Efecto de la humedad de almacenamiento en la viabilidad (A) (% germinación) y patogenicidad (B) (LT_{50}) de B. bassiana tras 20, 60 y 180 días de almacenamiento del producto formulado.
Figura 10. Viabilidad del producto formulado con B. Bassiana aplicado en suelo. A) Presencia de B. bassiana (Bb) y otros hongos (Otros) en productos formulados (F) tras 3 mes de enterramiento en suelos con (S) y sin esterilizar (NS). B) Análisis de la patogenicidad de B. bassiana (Bb) en productos formulados (F), tras 3 mes de enterramiento en suelos con (S) y sin esterilizar (NS), mediante la medición de la presencia de cadáveres de G. mellonella.
Exposición detallada de la invención
La presente invención tiene por objeto desarrollar un método que permita reducir el número de insectos plaga en las palmeras y afines sin causar daño a la propia planta ni a otros organismos que pueden ser beneficiosos para las plantas, además de aumentar la supervivencia de los hongos entomopatógenos que van a actuar como agentes de control biológico.
Así, la presente invención se basa en el empleo de la combinación de hongos, como agentes de control biológico, y subproductos de la agricultura, en concreto semillas de la palmera datilera, preferentemente secas (sin uso agrícola), con el fin de que los hongos crecidos sobre este sustrato puedan resistir más tiempo las condiciones adversas del medio, además de facilitar su aplicación en el campo.
El material sobre el que crecerán los hongos agentes de control biológico es cualquier subproducto de palmáceas (semillas, hojas, etc.), preferentemente de Phoenix dactylifera. Y el agente de control biológico es B. bassiana, preferentemente cualquiera de las cepas 193 y 203.
Los resultados de los ensayos realizados han demostrado que el producto formulado es altamente patogénico para las plagas de picudo rojo (R. ferrugineus) y coleóptero nitidúlido (C. dimidiatus), reduciéndose en varios días el tiempo letal medio (LT_{50}) de estas especies en comparación con el propio hongo inoculado sin sustrato vegetal. Esta mortalidad en el picudo rojo (sobre todo en las larvas) es muy superior a la obtenida en trabajos anteriores realizados por Martín-Molina et. al. (2001) utilizando B. bassiana. Dichos autores inoculaban sin sustrato una cepa comercial de este hongo (Naturalis-L de Troy Biosciences Inc., descrita para moscas blancas y pulgones, no para coleópteros) no aislada de picudos infectados de manera natural por B. bassiana, como es el caso que nos ocupa, por lo que obtenían porcentajes de mortalidad en larvas inferiores al 25%.
En un estudio muy reciente de Gindin et al. (Gidin et al. (2006) Phytoparasitica 34(4), 370-379.), utilizando los entomopatógenos B. bassiana y Metarhizium anisopliae aislados de huéspedes distintos a R. ferrugineus, obtienen mortalidades menores a las de esta patente para larvas de picudo rojo de entre 7-12 días, inoculándolas con una suspensión de 20 millones de conidios por mililitro de estos hongos:
-
LT_{50} (B. bassiana aislado Gindin et al.) = 5,8-6,5 días
-
LT_{50} (M. anisopliae aislado Gindin et al.) = 3,5-5 días
-
LT_{50} (B. bassiana de la presente invención aislado de R. ferrugineus sobre semillas de P. dactylifera) = 1,75-2,5 días
En este citado estudio los autores hacen uso de un producto formulado, basado en granos de arroz, como producto primario de la agricultura, para espolvorearlo sobre las hembras de picudo rojo y comprobar su fertilidad, no la patogenicidad directa del mismo. Por contra, el método de la presente invención, que además aprovecha un residuo abundante del cultivo de la palmera, ha demostrado ser patogénico por contacto y/o ingestión para las larvas (jóvenes y de 30 días) e incluso para adultos de R. ferrugineus.
A su vez, en campo se ha demostrado que el producto formulado de la presente invención (la composición de la invención) con las semillas de palmera sobrevive durante 2 meses aplicado cerca del meristemo apical de las palmeras encaperuchadas. Además, se ha comprobado que no solamente el producto es eficaz en fresco, sino que se demuestra que resiste diferentes condiciones de almacenamiento (varias temperaturas y humedades) durante al menos 2 meses, y también enterrado en diferentes muestras de suelo sin perder viabilidad ni patogenicidad en los diferentes casos.
Ejemplos de realización
A continuación se muestran una serie de ensayos realizados por los inventores, que tienen por objeto poner de manifiesto efectividad de la invención y en ningún caso limitarla.
Ejemplo 1 Método de producción y formulación de los hongos entomopatógenos sobre subproductos de palmeras, y analisis patogenenicidad del mismo 1.1. Esterilización e inoculación de los subproductos agrícolas
Para la elaboración del producto formulado, se emplearon semillas de palmera datilera secas y sin orificios, que indicasen el ataque de alguna plaga secundaria que hubiera deteriorado la semilla. Primeramente, las semillas de P. dactylifera se fragmentan, puesto que B. bassiana crece mejor entre los huecos que aparecen por el interior de las mismas, para lo que se utilizó una trituradora que funcionaba en seco con dos ruedas dentadas metálicas que fragmentan las semillas en trozos de pequeño tamaño (8x8 mm). Una vez obtenidos los fragmentos de semilla, seleccionando su tamaño por tamizado, se procedió a su esterilización.
Los fragmentos de semillas de palmera datilera se dispusieron en vasos de precipitados de 100 ml, conteniendo cada uno de ellos 10 gramos de semillas fragmentadas de P. datylifera, que se sumergieron en agua destilada durante 30 minutos para su saturación. Posteriormente, se esterilizaron en autoclave de vapor durante 90 min a 130°C, eliminando el agua de saturación del sustrato. El material vegetal esterilizado se colocó en placas Petri estériles y se dejó reposar durante 2-3 horas para eliminar cualquier compuesto volátil que pudiese inhibir el crecimiento del hongo entomopatógeno.
Las placas con 10 g de sustrato vegetal se inocularon con 100 conidios (por vaso) extraídos en agua destilada estéril, de una colonia joven (de 9 días aproximadamente), del hongo entomopatógeno en medio de cultivo artificial CMA (agar extracto de maíz).
Posteriormente, las placas se incubaron entre 20 y 30°C, preferentemente a 25°C en oscuridad durante dos semanas para que el hongo creciese sobre el sustrato. Posteriormente se llevó a cabo el secado al aire hasta peso constante de los fragmentos de semillas de P. dactylifera inoculados. Para ello, se dispusieron placas de Petri abiertas con sustrato fresco en una campana extractora durante 24 h. Una vez secos los sustratos se almacenaron en las mismas placas de Petri donde se produjeron, quedando así el producto formulado en condiciones para su utilización.
1.2. Producción y viabilidad de los formulados
Una vez secados los subproductos agrícolas con el hongo inoculado, se procedió al estudio de la producción y viabilidad de hongos entomopatógenos.
Dos semanas después de la inoculación de los subproductos con el hongo se recogieron los conidios o esporas de cada placa Petri, dejando agitar trozos de los sustratos inoculados en 50 ml de agua destilada estéril durante 25 minutos a 200 r.p.m. Tras la agitación se filtró la suspensión de conidios por muselina estéril y posteriormente por lana de vidrio estéril para separar de la suspensión de conidios del sustrato. El cálculo de la producción se estimó mediante el número de conidios por gramo de sustrato, para lo cual se determinó el número de conidios/ml de las suspensiones de esporas en una cámara de Neubauer.
Para conocer la cantidad exacta de conidios que se produjeron a partir del inóculo inicial, se midió el volumen de suspensión recogido de cada una de las placas con una probeta estéril, para finalmente estimar el número de conidios por gramo de sustrato.
Por otro lado, la viabilidad de los conidios producidos se estimó por germinación en placas Petri con CMA. Se realizaron diluciones de la suspensión original de conidios para ajustar el inóculo y se sembraron 100 conidios por placa con CMA. Tres días después de la inoculación se contaron las colonias que aparecieron en cada placa.
En la tabla siguiente (Tabla 1), aparecen datos de producción y viabilidad de inóculo de B. bassiana producido en placas con CMA (medio de cultivo comercial) y sobre fragmentos de semillas de P. dactylifera (producto formulado).
TABLA 1 Producción (conidios. g^{-1} sustrato) y viabilidad (porcentaje de germinación de conidios) de Beauveria bassiana producido sobre CMA (medio de cultivo comercial) y sobre fragmentos de semilla de palmera (formulado)
1
Como se aprecia existe un aumento de la producción (\chi^{2} = 8.436, P< 0.05) de B. bassiana cuando se formula sobre semillas de palmera datilera respecto al medio de cultivo comercial CMA.
1.3. Patogenicidad del producto formulado
La patogenicidad de los hongos entomopatógenos crecidos sobre las semillas de palmera se estimó mediante dos ensayos realizados sobre larvas del lepidóptero Galleria mellonella de estadio L5.
En el primero de los ensayos se agitó una muestra de un 1 g de producto formulado a 200 r.p.m. durante 25 min. con 50 ml de agua destilada estéril. A partir de esta muestra cada larva de Galleria mellonella fue inoculada con 4x10^{4} conidios en 20 \mul de agua destilada estéril aplicados con una micropipeta.
En un segundo ensayo de patogenicidad se añadió 1 g del producto formulado a placas Petri estériles, sobre las que se dispusieron 10 larvas de G. mellonella. Posteriormente, las placas se incubaron a 25°C, anotándose cada dos días el número de larvas muertas, hasta que se alcanzó la mortalidad de al menos la mitad de las larvas de cada placa (LT_{50}). Este ensayo se realizó por triplicado (3 placas).
Como control de ambos experimentos, se estimó la patogenicidad sobre G. mellonella de las semillas de P. dactylifera no inoculadas (se les añadió agua destilada estéril en lugar de conidios de B. bassiana), que se colocaron en placas Petri. Alternativamente, las larvas se inocularon con agua obtenida de la agitación (200 r.p.m. durante 25 min) de 1 g de semillas de P. dactylifera en 50 ml de agua destilada estéril.
En los ensayos, se comprobó que las larvas de G. mellonella tienen una mortalidad natural (LT_{50}) de unos 20 días, es decir, que a los 20 días muere el 50% de la población sin tratar. Al poner en contacto las larvas con fragmentos de semillas de dátil sin hongo, la LT_{50} no presenta diferencias significativas con el control de larvas sin tratar (Tabla 2). Las larvas inoculadas directamente con el hongo entomopatógeno muestran una LT_{50} de unos 7 días, que es significativamente menor que la LT_{50} de larvas sin tratadas con agua de semillas sin inocular. Sin embargo, las larvas que han estado en contacto con el producto formulado con el hongo, muestran una LT_{50} aún menor, es decir, en muy poco tiempo muere la mitad de la población de larvas por placa (entre 1 y 2 días). Además, al estudiar los cadáveres de estas larvas, se comprobó cómo el 100% presentan el hongo en su cuerpo, lo que demuestra que éste ha sido la razón de su muerte. Por tanto, los ensayos demuestran que el producto formulado es altamente patogénico para este insecto.
TABLA 2 Patogenicidad de B. bassiana producida en semillas de P. dactylifera sobre larvas de G. mellonella. Se incluyen también los controles (C)
2 
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1.4. Análisis de la patogenicidad del producto formulado con B. bassiana sobre plagas de palmera en laboratorio
Para mostrar la patogenicidad del producto formulado con semillas de palmera sobre un insecto plaga real de palmera, éste se puso en contacto con larvas del coleóptero radicícola Carpophilus dimidiatus, que ataca a las raíces de palmeras jóvenes. También se realizaron experimentos similares sobre el picudo rojo de las palmeras (Rhynchophorus ferrugineus).
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1.4.1. Análisis de la patogenicidad de B. bassiana frente al coleóptero radicícola Carpophilus dimidiatus
Se extrajeron las larvas de C. dimidiatus que se encontraban en el interior de las raíces de P. dactylifera, donde habían hecho galerías y se colocaron (5 larvas por placa, con 3 réplicas) en placas de Petri con el producto formulado. Se añadió a cada placa un tratamiento distinto:
1)
Dos gramos del formulado de B. bassiana (3 réplicas)
2)
Dos gramos del formulado pero sin hongo (3 réplicas)
3)
Las 5 larvas solas en la placa (3 réplicas)
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Posteriormente, se anotó el día en que morían las larvas (para calcular el tiempo letal medio -LT_{50}-, que es el tiempo en que tarda a morir el 50% de la población de insectos) (Fig. 1), se esterilizaron los cadáveres en superficie para depositarlos en cámaras húmedas y se comprobó si la muerte de C. dimidiatus había sido debida al hongo entomopatógeno. Después los cadáveres se depositaron en CMA con rosa de bengala y antibióticos para ver si aparecía la colonia del entomopatógeno hongo en los tratamientos con B. bassiana.
Las larvas de C. dimidiatus en contacto con el producto formulado con B. bassiana, murieron hacia al tercer día de dejarlas en la placa (LT_{50} = 2,37 \pm 0,41 días). Después de examinar los cadáveres, el 100% mostraba el hongo en el interior (Fig. 2).
Las larvas en contacto con las semillas control, es decir, sin B. bassiana, murieron después de 13-14 días (LT_{50} = 8,66 \pm 0,60 días). Ninguna larva presentó el hongo una vez incubadas en cámara húmeda.
Los controles (larvas sin alimento y en una placa de Petri), murieron después de 11-12 días (LT_{50} = 11,17 \pm 0 días). B. bassiana no se aisló de ninguno de los cadáveres de estas larvas.
Estadísticamente se observaron diferencias significativas entre los 2 tratamientos y el control (H[9,2] = 7,20, p<0.05), por tanto, el producto formulado con B. bassiana tiene realmente un tiempo letal medio menor que el control, lo que supone que es efectivo frente a estas larvas que atacan a las palmeras jóvenes.
1.4.2. Análisis de la patogenicidad de B. bassiana frente al coleóptero barrenador Rhynchophorus ferrugineus
En un primer estadio de este análisis se llevó a cabo un estudio de la patogenicidad de un elevado número cepas de B. bassiana como potenciales agentes patógenos de Rhynchophorus ferrugineus, para lo que se utilizaron como diana larvas de 30 días de este coleóptero barrenador y medio CMA (medio de laboratorio que permite el óptimo crecimiento del hongo).
A partir de estos experimentos, se desecharon cepas de baja patogenicidad para el picudo rojo (ejemplo: cepa 119 o CBS 121098, depositada en Holanda, "Centraalburean voor Schimmercultures") y se seleccionaron las cepas 193 y 203, que habían resultado ser las más patogénicas (Fig. 3), para su formulación en material vegetal. La elevada patogenicidad de estas cepas formuladas se pudo comprobar (Fig. 4) mediante los resultados de LT_{50} ofrecidos por los bioensayos de patogenicidad realizados sobre larvas jóvenes (7-10 días) de R. ferrugineus.
Por otro lado, los mismo ensayos de patogenicidad con estas cepas formuladas, fueron realizados con larvas de 30 días, donde el tiempo letal medio fue de unos 3 días (Fig. 5) con el formulado. Mientras en los controles (larvas en contacto con las semillas sin inocular con el hongo entomopatógeno) las larvas permanecieron vivas durante al menos 10 días.
Seguidamente, se realizó un estudio comparativo de la patogenicidad de las cepas 203 y 193 crecidas sobre subproductos de palmera (Fig. 7) y un medio de cultivo de laboratorio óptimo para B. bassiana como CMA (Fig. 6), con el objeto de demostrar que la patogenicidad se mantenía independientemente del sustrato empleado. Para llevar a cabo estos ensayos se dispusieron adultos de picudo rojo en placas de Petri (de 9 cm de diámetro), que contenían el producto formulado con la cepa ha ensayar, 203 ó 193. Se utilizaron 18 adultos (2 por placa de Petri) repartidos en 3 réplicas, y 18 adultos para el control o testigo. En cada placa de Petri se añadieron 2,75 g del producto formulado con B. bassiana (los controles son los fragmentos de semilla pero sin hongo inoculado). Los adultos se introducían en las placas durante 30 minutos en los cuales contactaban con el producto formulado. Pasado este tiempo se trasladaba cada individuo por separado a una cámara húmeda (placa con papel de filtro estéril humedecido con 700 \mul de agua destilada estéril) durante 12 horas. Después de las cuales se pasaban los individuos a placas nuevas con papel de filtro estéril humedecido con 600 \mul de agua destilada estéril. Como las placas no se sellaban, cada 2 días se añadían 300 \mul de agua destilada estéril para evitar la desecación de los insectos. Se comprobó que no había diferencias estadísticas en las LT_{50} de los ensayos con los 2 aislados y sus formulados (Tabla 3).
TABLA 3
4
En esta tabla se presentan los valores de LT_{50} de los ensayos en el laboratorio con adultos de R. ferrugineus con el aislado 193, 203 y sus formulados. Para la realización de la estadística se asumió una significación del 95%. Se obtuvo un resultado que indicaba que no había diferencias entre los diferentes tratamientos.
Además, aunque se comprobó que el tiempo letal medio para los adultos (entre 8 y 10 días) fue superior que para las larvas (menos de 3 días), éste resultó significativamente menor que el de controles (producto formulado sin el hongo -Fcontrol-) para insectos en dicho estadio de desarrollo.
Ejemplo 2 Uso y aplicación del producto formulado en subproductos de palmeras para el control biológico de plagas de insectos de las mismas
Para el uso y aplicación del producto formulado es conveniente realizar una modificación en su elaboración para mejorar su aplicación en campo, que consiste en la adición del polvo resultante de la trituración de las semillas. Esto permite que las esporas de los hongos entomopatógenos adheridas a las partículas de polvo puedan ser transportadas más fácilmente por el viento a todas las partes de la palmera donde se aplique el producto formulado. Una vez producido el producto formulado con el hongo correspondiente, se pueden aplicar aproximadamente unos 100 g del mismo en el cogollo de palmeras infestadas por los insectos plaga.
Una vez aplicado el producto formulado, la palmera puede encaperucharse para favorecer la humedad y por tanto la acción del hongo (a la vez que esto se realiza para la obtención de palma blanca) durante un periodo de unos 2 meses, tras el cual se extraen los fragmentos de semilla y se estudia si el hongo ha sobrevivido a este periodo, si ha perdido o no patogenicidad, a la vez que se revisa si la población de insectos plaga se ha visto mermada por la presencia del producto.
A continuación se describe cómo se obtiene el producto formulado modificado y cómo se aplica como ejemplo en palmeras infestadas por insectos.
2.1. Modificación de la producción del formulado para su aplicación en el campo
Tal y como se ha comentado anteriormente, una manera de elaborar el formulado y que mejora la dispersión de las esporas del hongo en el campo se obtuvo empleando el polvo que resultaba de triturar las semillas secas. Para ello se pesaron 100 g de semillas de palmera, fragmentadas en trozos de entre 1x1 mm y 10x10 mm, preferentemente de 5x5 mm en la trituradora de plásticos, y 25 g de polvo que provenía de la fragmentación de las semillas. Se dejaron toda la noche los 100 g de fragmentos de semillas en agua destilada para que se saturaran. Los 25 g de polvo de semilla se dejaron sobre papel de aluminio para esterilizarlos en el autoclave de vapor. Se esterilizaron durante 90 min, a 121°C, tanto los matraces con los fragmentos como los sobres con el polvo.
Se dejó enfriar todo el material esterilizado durante 24 horas por si había quedado alguna espora no inactivada y, pasado este tiempo, se volvió a esterilizar todo en idénticas condiciones y a enfriarlo de nuevo. Una vez frío, se añadió el polvo esterilizado a cada matraz con los 100 g de fragmentos y ambos se mezclaron. Cuando ya estaba preparado el sustrato (fragmentos de semilla+polvo de semilla), se extrajeron los conidios de B. bassiana de colonias en CMA de 10 días. Se inoculó cada matraz con 10^{7} conidios/5 ml para cada hongo. Se dejó incubar durante 10 días, agitando los matraces cada 2 días para repartir el inóculo fúngico de forma homogénea sobre todos los fragmentos. El formulado fresco resultaba listo para ser aplicado en las palmeras. Alternativamente se podía realizar un paso previo a la aplicación en campo, que consistía en secar el formulado hasta alcanzar una humedad del 39% (Humedad= 39,47 \pm 1,70%).
2.2. Viabilidad del producto formulado con B. bassiana en condiciones de almacenamiento y aplicado en el suelo 2.1.1. Almacenamiento del producto
Para comprobar la viabilidad del producto formulado en condiciones de almacenamiento se realizaron análisis después de mantenerlo almacenado hasta 180 días a diferentes temperaturas y humedades. Estos estudios demostraron que las semillas de palmera datilera formuladas con B. bassiana eran capaces de mantener al hongo vivo al menos durante 2 meses a -20, 4, 25 y 40°C, con una humedad inferior al 45% y sin perder ni viabilidad ni patogenicidad respecto a los controles sin almacenar (Figs. 8 y 9).
Los resultados de patogenicidad mostraron que a los 20 días de almacenamiento a las temperaturas de -20, 4 y 25°C, el producto formulado con B. bassiana presentó una patogenicidad significativamente mayor (\chi^{2}=9.90, P<0.05) que la correspondiente al control sin almacenar. Los mismos resultados se obtuvieron a 60 días de almacenamiento (\chi^{2}=9.57, P<0.05).
2.1.2. Aplicación del producto formulado en el suelo
Para comprobar la viabilidad del producto formulado y comprobar el efecto de los factores bióticos sobre el formulado al ser sometido a condiciones más adversas, que aquéllas derivadas de su almacenamiento (Ejemplo 2.1.1), éste fue enterrado durante 3 meses en placas Petri bajo suelo artificial (Art.) o suelo natural (Nat.), esterilizado (S) y sin esterilizar (NS), procedente de diferentes muestras recogidas de zonas de la provincia de Alicante.
Tras los 3 meses se incubaron los fragmentos de semilla en medio de cultivo (CMA) para después anotar si B. bassiana era viable y qué otros hongos podían aparecer sobre el sustrato. Por otro lado, para determinar su patogenicidad se pusieron en contacto larvas de G. mellonella con el producto formulado (con o sin B. bassiana) desenterrado y se anotó el tiempo letal medio.
Cuando se sembraron las semillas desenterradas en CMA se observó que presentaban B. bassiana viable en todos los casos, y además con pocos hongos contaminantes, sobre todo cuando el formulado provenía de suelos esterilizados. La viabilidad de B. bassiana resultó ser del 100% tras los 3 meses de enterramiento, tanto en suelos esterilizados como no esterilizados, aunque a veces, en los no esterilizados aparecían algunas colonias de otros hongos contaminantes como Fusarium, Rhizopus, Alternaria...(Otros) pero que no llegaban a desplazar nunca a B. bassiana (Fig. 10A).
La patogenicidad sobre larvas de G. mellonella resultó ser similar a la del producto sin enterrar, y el 100% de las larvas utilizadas ensayadas con formulados enterrados en suelo (esterilizado o no) presentó parasitismo por el hongo (Fig. 10B).

Claims (9)

1. Composición fitosanitaria que comprende un hongo entomopatógeno perteneciente a la especie B. bassiana y triturados o fragmentados de dátiles o semillas de palmera, preferentemente de la especie Phoenix dactylifera.
2. Composición fitosanitaria según la reivindicación anterior, donde el hongo entomopatógeno es seleccionado de cualquiera de las cepas con número de depósito CBS121096 (cepa 193) y CBS121097 (cepa 203).
3. Composición fitosanitaria según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende además polvo de semillas.
4. Método para la elaboración de la composición según la reivindicación 1 que comprende:
a.
Fragmentar o triturar dátiles o semillas de palmera, preferentemente de la especie Phoenix dactylifera.
b.
Inocular el producto del paso a) con un hongo entomopatógeno de la especie B. bassiana.
5. Método según la reivindicación anterior donde, previamente a la inoculación del hongo a los fragmentos de las semillas o los dátiles de palmera, se adiciona polvo procedente de la trituración de dichas semillas.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5 donde el hongo entomopatógeno es seleccionado de cualquiera de las cepas con número de depósito CBS121096 (cepa 193) y CBS121097 (cepa 203).
7. Hongo entomopatógeno seleccionado de cualquiera de las cepas con número de depósito CBS121096 (cepa 193) y CBS121097 (cepa 203).
8. Uso de la composición fitosanitaria según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para el control biológico de plagas.
9. Uso según la reivindicación 8 donde la plaga es Rhynchophorus ferrugineus.
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