ES2525717T3 - Composición de hongos entomopatógenos y procedimiento de producción y aplicación, para el control de los insectos - Google Patents

Abstract

Microesclerotias aisladas de un hongo entomopatógeno seleccionado de entre el grupo consistente en las especies Metarhizium, tales como las consistentes en la Metarhizium flavoviride y la Metarhizium anisopliae, y las especies Lecanicillium.

Description

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DESCRIPCIÓN

Composición de ho ngos entomopatógenos y procedimiento de producción y apl icación, para e l control d e l os insectos 5 Antecedentes y trasfondo de la invención

Sector de la invención

La presente inve nción, se refi ere a la f ormación d e pr opágulos m icroescleróticos, me diante h ongos entomopatógenos y al uso de tales tipos de microesclerotia para el control de los insectos.

Descripción del arte anterior de la técnica

15 Los pesticidas químicos, se han ve nido utilizando para el control de los insectos y para el control d e la maleza o malas hierbas, durante un transcurso de tiempo de más de 60 años. El interés en el uso de medidas de base biológica, p ara el c ontrol d e las p lagas, se ha producido deb ido a l d esarrollo d e l a r esistencia de las pl agas, a muchos pesticidas químicos, conjuntamente con las inquietudes o preocupaciones a raízdel impacto desfavorable de la utilización ge neralizada de productos químicos, en la s alud h umana, en la seguri dad de los pro ductos alimenticios y en el entorno medioambiental (véase, a dicho efecto, lossiguientes trabajos: Gillespie y Moorhouse, 1989, Biotechnology of Fungi for ImprovingPlant Growth, - Biotenología de los hongospara laintensificación del crecimiento d e pla ntas -, pá ginas 85 - 125; Haj ek, 199 3, Ne w options for insect c ontrol using fu ngi, In, Pest Management: Biol ogically Ba sed T echnologies, - Nuevas opciones p ara el control de los insectos, medi ante l a utilización de hongos, en el control de las plagas : Tecnologías de base Biológica (R.D. Lumsdeny J. Vaugn, eds.)

25 Amer. Chem. Soc., Washington, D.C.; Leathers et al., 1994, J. Industrial Microbiology 12: 69 - 75). En el pasado siglo 19, Metchnikoff, fue la prim era persona en describir las in fecciones provocadas por el hongo "green muscardine" Metarhizium anisopliae , en los ronrones o abejorros de mayo de los cereales, y que s ugirió el uso de los microorganismos como un a gente de cont rol b iológico p ara l os i nsectos (Z immermann et al., 19 95, Bioco ntrol Science and Technology, - La ciencia y la tecnología del biocontrol -, 5 : 527 - 30). Subsiguientes estudios realizados con posterioridad, mostraban el hecho de que, una aplicación de las escoras de M. anisopliae, podían aniquilar a los abejorros de mayo o ronrones de los cereales, y el gorgojo de la remolacha azucarera, vía una infección directa. Los procedimientos iniciales de producción para este hongo, se centralizaron en el uso de i nsecto huésped del medio artificial, como vehículo de crecimiento para la producción de conidias del patógeno.

35 La elección de la búsqueda de los insectos que habitan en el suelo, como objetivo para el control biológico, versus insectos en el filopl ano, es tentadora. Entre estos objetivos o dianas, se encuentran los gorgojos de las raíces, las larvas del suelo, los gusanos de l as raíces o gusanos blancos, la mosca de la frut a, y las l ombrices de las raíces (Bruck, 2005, Biological Control, - Control Biológico -, 32: 155 - 163; Krueger y Roberts, 1997, Biological Control, 9: 67 - 7 4; Ch andler y D avidson, 20 05, J ournal of Eco nomic Entomo logy, 98: 1856 - 1 862; V anninen et a l., 19 99, Journal of Applied Entomology, 123: 107 - 113; Kabaluk et al., 2005, IOBC / wprs Bulletin, 28: 109 - 115). Se evita la radiación UV, la cual puede tener como resultado una persistencia muy corta sobre las superficies de la plantas. Las precipitaciones lluviosas, las cuales lavan a las conidias infecciosas, hacia fuera del follaje, corto tiempo después de la apl icación, no es pre ocupante. Las temperaturas del suelo, son mo deradas, de bido a su valor a islante, y las humedades del suelo, por encima de punto de marchitamiento permanente de las plantas, se encuentran asimismo,

45 también, dentro del rango óptimo, para los microorganismos.

El hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae, se ha registrado como un insecticida biológico, para el control de las plagas delos insectos que habitan en elsuelo y enigmáticos o crípticos , en los Estados Unidos de América, y muchos otros países. El ho ngo Metarhizium an isopliae, segú n se ha r eportado, infec ta a más de 1 00 ins ectos, incluyendo a los insectos que habitan en el suelo, de la siguiente lista: las termitas subterráneas (de las especies biológicas Reti culitermes y Coptotermes), los gus anos d e las raíces d el maíz (especie bio lógica Diabrotica), el gorgojo negro de la vid (Otiorhynchus sulcatus), el gorgojo de las raíces de los cítricos ( Diaprepes abbreviatus), los escarabajos japoneses (Popillia japonica), y el abejorro europeo (Rhizotrogus majalis)(Krueger et al., 1992, Journal of Invertebrate Pathology, - Diario de la patología de los invertebrados -, 59: 54 - 60; Schwarz, 1995. Metarhizium

55 anisopliae for soil pest control, - Metarhizium anisopliae para el controlde las plagas del suelo. EnBiorational Pest Control Agents; Formulation and Delivery, - En Agentes de control de las plagas bio-racionales -, F.R. Hale y J.W. Barry, eds., ACS Symposium Series 595, American Chemical Society, Washington, D.C. páginas 183 - 196; Krueger y Roberts, 1 997, a ntes c itados; Bruck, 2 005, antes cit ado). E l interés comerc ial e n l a utilización de l hongo M. anisopliae para e l co ntrol de los insectos que ha bitan e n e l su elo, ha da do c omo resulta do el de sarrollo de las formulaciones granulares para el control de las plagas, a base de gránulos miceliales producidos en cultivos líquidos,

o de conidias producidas en substratos sólidos, sobre un portador o soporte nutritivo o no nutritivo, u hongo, en el substrato sólido utilizado, en sí mismo (Schwarz, 1995, anteds citado; Storey et al., 1990, Conidiation kinetics of the microsclerotial granules of Metarhizium anisopliae, - La cinética de conidiación de los gránulos microescleróticos de Metarhizium anisopliae (Bio1020) y su actividad biológica contra diferentes insectos del suelo. Proceedings of the

65 Vth International Colloquium on Invertebrate Pathology and Microbial Control, - Debates del 5º Coloquio Internacional

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sobre las patologías de los invertebrados y el control microbiano -, Adelaide, Australia. páginas 320 - 325; Andersch et al., 19 95, Patente estadounidense U S nº 5. 418. 1 64), siendo, la formulación más práctica, el gránulo micelial. Los hongos, en estas formulaciones granulares, deben necesariamente crecer hacia fuera de portador o soporte y reesporular, para producir la conidia infecciosa. Puesto que, los propágulos (conidia) del hongo M. anisopliae, deben 5 contactar con insecto huésped, el número, la distribucióny la persistencia de las conidias, de la forma que ésta se producen med iante l os h ongos, sobre un portador o s oporte granular, en e l su elo, es de l a má xima imp ortancia (Bruck, 200 5, ant eriormente citado ; Hu y S t. Ledger, 2 002). La a plicación pr áctica d e estas formul aciones, se h a visto limitada, debido al hecho de la características físicas del producto, las cuales imposibilitan el uso en los equipos agrícolas convencionales, los altos costos de producción,y / o un escaso tiempo de vida de conservación, en la 10 práctica. Los gránulos miceliales, tales como los que se dan a conocer en la patente estadounidense U S 5. 418 164, tienen, de una forma general, un escaso tiempo de vida de conservación, a la temperatura ambiente, o éstos deben liofilizarse, lo cual representa un proceso caro. Las conidias (producidas en una fermentación de substrato sólido, unida a un portador o soporte granular tienen, de una forma general, un escaso tiempo de vida de conservación. Los gránulos de fermentación en substratos sólidos, usados (tratándose éstos, de una forma típica, de granos de arroz,

15 de granos de cebada, y de granos de trigos), los cuales contienen hongos residuales, después de la cosecha de las conidias, no pueden aplicarse mediante la utilización de equipos agrícolas convencionales, ni éstos tampoco pueden molerse fácilmente al tamaño apropiado, sin matar el hongo, incluso a pesar de que, esta formulación, se encuentre fácilmente disponible, como producto subproducto o producto secundario de la producción de las conidias.

20 Para la persistencia en el suelo y en el material de las plantas en descomposición, muchos hongos de patogénicos de l as pl antas, produc en esclerotias; a sa ber, los agregados hifálicos compactos, melanizados, l os cua les s on altamente resistentes a la desecación. Estos propágulos, sirven, a menudo, como la estructura de hibernación para los hongos (véanse, a dicho efecto los siguientes trabajos: Cooke, 1983, Morphogenesis of sclerotia, Morfogénesies de l as esc lerotias. En "F ungal D ifferentiation: A C ontemporary S ynthesis", - “Difer enciación fú ngica: Una síntes is

25 contemporánea” -, Smith, J.E., editores. Páginas 397 - 418. Marcel Dekker, Inc., New York, NY, U.S.A.; Coley-Smith y Cooke, 1971, Survival and germination of fungal sclerotia, - Supervivencia y germinación de esclerotias fúngicas -. En "Ann ual R eview of Ph ytopathology", - “Revista an nual de fitopatológia -, J. G., Baker, K. F., Z entmyer, G. A., editors. páginas 65 - 92. Ann ual Reviews Inc., Palo Alto, CA, U.S.A.). Se han pr oducido Microsclerotias (pequeñas partículas escleróticas, de 2 00 -600 µm) de pató genos de pl antas, fú ngicos, tales c omo l os c onsistentes e n el

30 Colletotrichum truncatum y el Mycoleptodiscus terrestres, en una alta concentración, en una fermentación de cultivo sumergida (Jackson y Schis ler, 199 5, M ycological Res earch, 99: 87 9 - 884; Sh earer y Jacks on, 2 003, Pate nte estadounidense U S nº 6. 569. 8 07). Las Microsclerotias de estos pat ógenos de p lantas co nsistentes en mal as plantas o m aleza, han mostrado un valor, como prop águlos infecciosos p ersistentes, e n los e ntornos medioambientales del suelo y acuáticos (Shearer y Jackson, 2006, Biological Control. 38 : 298 - 306; Boyette et al.,

35 2007, BioControl 52: 413 - 426). No obstante, hasta el momento actual, las microesclerotias, no se ha mencionado, para cualesquiera patógenos fúngicos de los insectos.

Resumen de la invención

40 Nosotros, los solicitantes, h emos desc ubierto, ahor a, el hech o cons istente en que, la hasta ahora no d escrita formación de microesclerotias, mediante hongos entomopatógenos, los cuales son efectivos para e l control d e las plagas d e ins ectos, así co mo las técn icas par a la producción de estos pro págulos micro escleróticos. En concordancia con este descubrimiento, la microescl erotia, pue de producirse me diante hon gos ento mopatógenos, incluyendo a las especies de Metarhizium y a las especies de Lecanicillium. Estas microesclerotias, son tolerantes a

45 la desecación, de un bajo coste de supervivencia, susceptibles de procesos de secado al aire con objeto de reducir los niveles de humedad, éstas exhiben un excelente tiempo de vida de conservación, a la temperatura ambiente, así como tambi én a temperatur as refriger adas, y pu eden procesarse a tamaños de f ormulación, lo s cuales s on compatibles c on a plicadores de p esticidas gran ulares del ti po co nvencional. En el us o, las mi croesclerotias, esporulan de una forma abundante (produciendo así, de este modo, un gran número de conidias infecciosas de los

50 insectos), al pr oducirse su re hidratación, tal y como sucede en u n suel o normal, y pueden e xhibir u nos niv eles y unas tasas q ue son com parables o inc luso ma yores, de in fectividad, contra las plagas de l os insectos, en comparación con la formulaciones granulares a base de conidias, del tipo convencional.

En concor dancia con este descubrimiento, es un objet o de la pres ente inv ención, el proporc ionar h ongos 55 entomopatógenos, en forma de propágulos microescleróticos.

Otro objeto de la presente invenc ión, es el de proporcionar pr opágulos de microesclerotia de ho ngos entomopatógenos, los cuales sean efectivos como agentes para el control biológico, contra las plagas de insectos de índole económicamente importante.

60 Un o bjeto a dicional d e l a pr esente i nvención, es l a consistente e n pr oporcionar pro págulos de m icroesclerotia d e hongos entomopatógenos, los cuales sean tolerantes a la desecación y que sean estables a la almacenaje, al mismo tiempo que retengan la eficacia como agentes de control biológico contra las plagas de los insectos.

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Es todavía otr o objeto adicional de la presenta invención, el prop orcionar un pr ocedimiento para la producción de propágulos d e microescler otia de ho ngos entomo patógeno, en un os a ltos rend imientos prod uctivos, en cultivos líquidos sumergidos. Otros objetos y ventajas de la pres ente invención, resultarán fácilmente evidentes a raíz de la descripción la cual se facilita abajo, a continuación.

5 Descripción resumida de los dibujos

La figura 1, muestra la eficacia relativa de dos tipos de gránulos de Metarhizium anisopliae F52, contra las larvas de Tetanops my opaeformis (Gusano de l a raí z de l a remo lacha azucarera) en el tercer estadi o, en un ens ayo de incorporación en un sue lo, t al y como se describe en el Ejem plo 4. Los gr ánulos, c onsistían e n g ránulos que contenían o bien ya sea microesclerotias de un tamaño de malla correspondiente a 20 / 30 mesh, preparados a partir de una fermentaciónlíquida, o bien ya sea un portador o soporte deharina o granulado de maíz deun tamañode malla correspondiente a 15 / 30 mesh, recubierto con una capa de conidias, mediante la utilización de un porcentaje del 10 % de un ligante de monooleato depolioxietilen sorbitán (TWWN 80). Los gránulos, se incorporaron en un

15 suelo de arcilla, a razón deuna tasa correspondiente a 1,8 mg / g de suel o y, subsiguientemente, se procedióa humedecer los suel os, a los deseados pu ntos de humedad, mediante l a utilizac ión d e agua. Las actividades d el agua en el suelo, se determinaron después de un transcurso de tiempo de 24 horas, mediante la utilización de un de un med idor d e la activida d d el ag ua, sigu iendo las instr ucciones pro porcionadas por par te del fabr icante. Ca da tratamiento, tuvo tres reproducciones de 10 larvas y, el test de ensayo en su totalidad, se repitió dos veces.

Descripción detallada de la invención

Tal y c omo se utiliz a a quí, en este do cumento de solicitud d e p atente, el tér mino “micr oesclerotia” ( o

microesclerotias, en plura l), se refiere a l os pequ eños c uerpos escler óticos, los cual es son al gunos estados en

25 reposo de los hongos. Las microesclerotias, son agregados hifálicos compactos, estables, viables y, algunas veces, melanizados, de los hongos. Las m icroesclerotias, en s í mismas, n o son infecciosas, pero, c uando éstas s e rehidratan, tal como por ejemplo, mediante la exposición ala humedad, en suelo, o en las grietas o hendiduras de los árb oles, l as microescl erotias, germin arán de u na form a hifál ica, o d e una form a e sporogénica, p ara pro ducir conidias, l as cuales son infecciosas para los i nsectos objetivizados como di ana. Las micro esclerotias, son extremadamente tolerantes a la desecación, éstas son capaces de geminar, tanto de una forma esporogénica, como de forma vegetativa, yasí mismo, también, retienen las capacidades insecticidas de sus formas nativa o normal (a saber, h ifas, blastoesporas, y / o con idias de los mismos ho ngos entomo patógenos) M orfológicamente, l as microesclerotias, pueden encontrase presentes como un grupo de aglomerados de células. El término “insecticida”, tal y como se utiliza aquí, en este documento de solicitud de patente, se refiere a un material, o a una mezcla de

35 materiales, los cuales inducen la mortalidad, interrumpen o impiden el crecimiento, interfieren con la metamorfosis, u otras funciones morfogénicas, efectúan una esterilización, o interfieren con la reproducción de los insectos los cuales se han objetivizado como diana. Los térmi nos “que c ontrola” o “que se efectúa un control del i nsecto objetivizado como diana”, tal y como se utiliza aquí, en este documento de solicitud de patente, pretende dar a entender el hecho de q ue, l a p oblación d e i nsecto, se re duce, pr incipalmente, med iante la m ortalidad, a un nivel e l cua l e s significativamente ma yor qu e el de un a p oblación no tratada. “Un a signific ante mort alidad” (o u na significativ a mortalidad), tal y como se define aquí, en este documento de solicitud de patente, pretende dar a entender el hecho de que, el porcentaje de los insecto que mueren, en período o transcurso de tiempo dado, después de haber entrado en contacto con el insecticida, es significativamente mayor que el correspondiente al número de insectos los cuales no han entrado en contacto con el insecticida y los cuales mueren, durante el mismo período o transcurso de tiempo,

45 en base a los análisis estadísticos estándar.

La invención que se descri be aquí, en este documento de solicitud d e p atente, es ef ectiva para pro ducir microesclerotias de cualesquiera especies, cepas, o variedad de hongos entomopatógenos, del género Metarhizium, si bien, no obstante, se concibe así mismo, también, el hecho de que, la presente invención, pueda utilizarse para producir microesclerotias de las especies del género Lecanicillium. Las especies preferidas, para su uso aq uí, en esta invención, incluyen a las especies de hongos consistentes en la especie Metarhizium flavoviride, y de una forma particular, en la especie Metarhizium anisopliae, sensuo lato (en su amplio sentido).

La pr oducción de micr oesclerotias en c oncordancia c on la pr esente i nvención, s e ll eva a c abo, d e un a form a

55 preferible, en un cultivo líquido, y la producción a gran escala, se lleva a cabo, de una forma preferible, mediante un proceso de fermentación de un cultivo líquido, en un depósito o tanque profundo. Se contempla así mismo, también, el hecho de que pueda utilizarse un medio de cultivo sólido. El medio liquido el cual se utiliza en la preparación de microesclerotias mela nizadas, es critica, d ebido al h echo de que, su formació n y su ren dimiento pro ductivo, dependen del medio. De una forma general, se necesita un medio líquido, el dual tenga unas altas concentraciones de car bono y de nitrógeno, con objeto de qu e p uedan obte nerse un os altos ren dimientos productivos de la s microesclerotias de M. anisopliae. Para su uso aquí, en esta invención, el medio, de una forma preferible, contiene una fuente de nitrógeno, a una concentración correspondiente a un valor comprendido dentro de unos márgenes situados entre los 8,1 gramos de fuente de nitrógeno / litro y menos de 50 gramos de fuente de nitrógeno / litro, y una fuente de carbono, a un valor de concentración correspondiente a un valor mayor de los 20 gramos de hidratos

65 de carbono / litro, siendo dicha concentración, deuna forma preferible, la correspondiente a un valormayor de 30

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gramos de hidratos de carbono / litro. L as fuentes de nitrógeno las cuales son apropiadas, incluyen, aunque no de una form a lim itativa en c uanto a éstas, a la cas eína hidrolizada, e l e xtracto de l evadura, l a pr oteína d e so ja hidrolizada, la semilla de algodón hidrolizada, y la proteína de gluten de maíz, hidrolizada. Las fuentes de carbono las cua les so n las apr opiadas, inclu yen, au nque no de u na forma l imitativa e n cua nto a éstas, a l os hidr atos d e 5 carbono, incluyendo a la glucosa, a la fructosa y a la sacarosa, y a la glicerina. Los medios de cultivo líquidos, para uso aquí, en esta invención, se describen por parte de Jackson (Patente estadounidense U S nº 5. 968. 808, cuyos contenidos, se incorporan aquí, en este documento de solicitud de patente, a título de refe rencia). Nosotros, los solicitantes, h emos descubierto, de u na forma sor prendente, el hec ho de qu e, los hongos entomopatógenos anteriormente mencionados, arrib a, pro ducen micr oesclerotias, cu ando éstos s e h acen cr ecer en un cultiv o sumergido, en el medio de Jackson. Estas microsclerotias, no se han descrito, hasta el momento presente, a partir de estos hongos. Como contraste de ello, las especies de los hongos entomopatógenos consistentes en la especie de h ongo Paecilomyces y la espec ie d e h ongo Beauveria producen b lastoesporas, e n lu gar d e mi crosclerotias, cuando éstos se hacen crecer en el mismo medio ybajo las mismas condiciones (F. E. Vega et al., 2003, World J. Microbiology & Biotech nology, 19: 36 3 - 36 8.). La ferment ación pu ede ll evarse a ca bo medi ante l a u tilización de

15 técnicas de c ultivo en líquidos, a eróbicas, del ti po c onvencional, me diante a gitación y a eración. Se prefi ere la agitación, con objeto de inhibir el crecimiento micelial en la pared del receptáculo. Las temperaturas las cuales son las adecuadas, pueden ser las correspondientes a un rango comprendido dentro de unos márgenes que van desde los aprox. 20 °C hasta los aprox. 32 °C, yel pH puede ser el correspondiente a un valor comprendido dentro unos márgenes que van desde un pH de aprox. 4 hasta un pH de aprox. 8. Una vez que se haya obtenido un crecimiento lo sufici entemente i ntenso del hongo, d e una form a u sual, e n un tr anscurso de ti empo de 2 – 4 días, las microesclerotia, empiezan a formarse y, la fermentación, se continúa, entonces, hasta que se haya obtenido una concentración lo suficientemente alta de las microsclerotias. Sin pretender vincularlo a ello, en una forma preferida de pres entación de la pr esente invenc ión, la fermentac ión, se continú a, hasta que una prop orción ma yor de l os hongos viables, en el cultivo (a saber, una proporción mayor de un porcentaje correspondiente a un 30 %, en peso),

25 se encuentre en forma de microesclerotias y, de una forma más preferible, hasta que una predominante proporción de los hongos viables en el cultivo (a saber, una proporción mayor de un porcentaje correspondiente a un 50 %, en peso) s e e ncuentre e n form a de micro esclerotias. A co ntinuación d e haberse c ompletado la ferm entación, l as microesclerotias, pued en re cuperarse me diante la utilización de té cnicas co nvencionales, tal es como l as consistentes e n el filtra do o en la centrifugación. Las m icroesclerotias, pueden s ecarse, tal como por ej emplo mediante sec ado al aire, a un red ucido nivel de temp eratura, y almacenarse a la te mperatura ambiente, o a un a temperatura inferior. En una forma preferida de presentación, la biomasa recuperada de la fermentación, después de haberse procedido a su secado, contendrá una cantidad correspondiente a un valor de 1 x 10 6 microesclerotias por gramo de bi omasa, o una cantidad mayor (en base al pe so en seco de la biomasa), siendo dicha cantidad, de un forma particular, la correspondiente a un valor de por lo menos 9 x 106 microesclerotias por gramo de biomasa.

35 Las formulaciones comerciales para su uso como agente de control de los insectos, puede prepararse a partir de microesclerotias las cuales se hayan recolectado a partir de medios de cultivo tales como los que se han descrito anteriormente, arriba. Desd e el punto de vista práctico, se prevé qu e, las formula ciones comerc iales, p uedan prepararse directamente a partir del cultivo, obviando, con ello, la necesidad de cualesquiera etapas de purificación. Mientras q ue, los cultiv os líq uidos pueden utilizars e dir ectamente, en la fo rma preferi da de pr esentación de l a presente invención, el agua, se elimina de los cultivos, hasta la consecución de un secado parcial o de un secado substancial, de la forma que se ha descrito anteriormente, arriba y, el cultivo seco, se fractura o de muele, para su conversión en pequeñas partículas, las cuales sean apropiadas para su aplicación mediante aplicadores de gránulos del tipo convencional, mediante la utilización de técnicas convencionales correspondientes al arte especializado de

45 la técnic a. C on o bjeto de facilitar l a a plicación y los subsig uientes crecimie nto fúngico y c onidiación, l as microesclerotias recol ectadas, pue den form ularse, de una fo rma a lternativa, en un por tador (so porte) o ve hículo nutricional o inerte, agronómicamente aceptable, para su aplicación como materias en polvo susceptibles de poderse humedecer o mojar, en materias polvorosas, en gránulos, en cebos o señuelos, ensoluciones, en concentrados emulsionables,, en emuls iones, en co ncentrados e n sus pensión, o en materias pr oyectables por pulverización (aerosoles o e sprays). Así, por ej emplo, pa ra las aplicaciones líquidas, las micr oesclerotias, p ueden formul arse como una suspensión o como una emulsión. En esta forma de presentación de la presente invención, los portadores

o soportes preferidos, incluyen, aunque no de una forma limitativa en cuanto a éstos, al agua, a los tampones, o a los aceites vegetales o de plantas. De un modo alternativo, en una forma de presentación preferida y alternativa de la pres ente i nvención, l a cual es particularmente apropiada para las apl icaciones granu lares sólid as, las

55 microesclerotias, pueden formularse con portadores (soportes) o diluyentes sólidos, tales como los consistentes en la tierra de diatomeas, el talco, la arcilla, la vermiculita, el CaCO3 (carbonato de calcio), la sémola de la mazorca de maíz, los geles de alginatos, las matrices de almidón, o los polímeros sintéticos, o bien, éstas, pueden incorporarse en micropartículas de liberación controlada del tipo convencional, o en microcápsulas de li beración controlada del tipo convencional. El profesional experto en el arte especializado de la técnica, reconocerá el hecho de que, los hongos, pueden también formularse en combinación con los aditivos convencionales, tales como los consistentes en los age ntes p egajosos o adhesivos, los age ntes emuls ionantes, los age ntes surfactantes o tens ioactivos, l as espumas, los agentes humectantes o agentes hidratantes, los antioxidantes, los protectores de los rayos UV, las aditivos nutritivos, fertilizantes, los insecticidas, o incluso con fungicidas los cuales exhiban una baja toxicidad para los hongos objetivizados como diana. Para la aplicación en la corteza o en la canopia de los árboles o de las plantas,

65 las micoresclerotias, se formulan, de una forma preferible, con un adyuvante higroscópico ó hidrofílico.

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La cantidad absoluta de la microesclerotias y su concentración en la composición final, se seleccionan de tal forma que, éstas, proporcionen una reducción efectiva en la población del insecto objetivizado como diana, si se compara con un co ntrol no tratado. La cantidad real, no es crítica, y ésta es u na función de las consideraciones prácticas,

5 tales como las consistentes en las propiedades del vehículo o portador (soporte), la densidad de la población del insecto objetivizado como diana, y el procedimiento y el sitio de aplicación y, ésta, puede determinarse fácilmente, mediante tests de ens ayo de rutina. Ya qu e, las microes clerotias de l a presente invención, sirven para producir y para suministrar una alta concentración de las conidias infecciosas, con objeto de controlar los insectos objetivizados como diana, mediante su infección y su muerte, los propósitos de la formulación y de la aplicación, la frase “cantidad efectiva”, se define como pretendiendo dar entender cualquier cantidad de microesclerotias, la cual sea suficiente como para producir, subsiguientemente, una cantidad suficiente de conidias, en el hábitat objetivizado como diana, como para infectar y para matar el in secto objetivizado como diana, c on relación un control no tratado. A título de ejemplo y sin pretender que sea limitativo, se concibe el hecho de que, la formulaciones apropiadas, contengan, de una forma típica, una c antidad correspondiente a un valor de 1 x 106, ó mayor, de m icroesclerotias por gramo de

15 biomasa reconvertida a partir del líquido de cultivo (en base al peso en seco de la biomasa), siendo dicha cantidad, de u na form a preferible, l a c orrespondiente a u n val or d e por l o me nos 1,5 x 1 07 microesclerotias por gam os d e biomasa. Para la aplicación a los cultivos en hileras, típicos, y sin pretender que se encuentre limitado a ello, se concibe el hecho deque, las tasas apropiadas para la aplicación, sean las correspondientes a un valor de 1 x 109 microesclerotias por acre, aplicadas en los surcos.

En el us o, las microescl erotias de l a pres ente inv ención, pued e ap licarse en e l loc us o punto de control d e lo s insectos objetivizados como diana, o en sus inmediaciones, o sobre las superficie de la planas a ser protegidas, tal como, por ejemplo, en la corteza de los árboles, o c omo capas de recubrimiento sobre las semillas, mediante la utilización de técnicas c onvencionales. E n un a forma preferida d e p resentación de la pr esente invenc ión, la s

25 microesclerotias, se aplican en el suelo, o mezclas de substratos exentos de tierra, tales como los que se utilizan en los invernaderos, en una forma granular. En dependencia de la plaga de los insectos objetivizada como diana, las microesclerotias, pue den aplicarse en los campos d e a gricultura, en l os hu ertos, e n los invernaderos o e n l os jardines o cés pedes de ést os, o en las i nmediaciones de las p lantas orname ntales, en lo árbo les, o en la s estructuras comerciales o residenciales.

Las micro esclerotias de los h ongos entom opatógenos de la pres ente i nvención, pro ducen pro gágulos infeccios os (conidias aéreas), los cuales son efectivospara infectary para matar a una amplia variedad de insectos los cuales son importantes desde el punto de vista económico, tratándose éstos, de una forma particular, de los insectos que nacen en el su elo, pero así mismo, tambié n, incluyendo a algunos insectos los cuales habitan en la tierra y en las 35 canopias. Sin pretender ligarlo a ninguna teoría, los insectos los cuales pueden controlarse con las microesclerotias de la presente invención, incluyen a los gorgojos de la raíces, a los gusanos de las raíces (gusanos blancos), a los gusanos laminadores, a las moscas de las frutas, a los gusanos o larvas del suelo, a los gusanos de las raíces, a las termitas, y a las hormigas, incluyendo, de una forma particular, al gusano del las raíces del maíz ( de la especie Diabrotica), al gorgojo negro de la vid (Otiorhynchus sulcatus), al g orgojo d e l as raíces de cítri cos (Diaprepes abbreviatus), al gorgojo de la patata du lce o boniato (Cylas formicarius), al gorgojo de las raíces de la remolacha azucarera (Tetanops myopaeformis), al gorgojo de la col o repollo ( Delia radicum), al gorg ojo de la cebolla (Delia antigua), al gorgojo del nabo (Delia floralis), al gorgojo del maíz de siembra (Delia platura), a la mosca (del moho) de la zanahoria (Psila rosae), al escarabajo japonés (Popillia japonica), al abejorro europeo (Rhizotrogus majalis), a las termitas subterráneas (de las especies Reticulitermes y Coptotermes ). De una forma adicional, ciertos insectos que

45 habitan e n las canop ias, de una forma especial, ci ertos i nsectos qu e h abitan en l a corteza, pu eden control arse mediante l as microesclerotias de la presente inv ención. Estos insect os, incluy en a las esp ecies de ins ectos consistentes en el escarabajo barrenador esmeralda del fresno (Agrilus planipennis), en la polilla o palomilla gitana (Lymantria dispar), y en el gorgojo de la pecana (Curculio caryae).

Los e jemplos los cu ales de facilita n a c ontinuación, pretenden únicamente i lustrar la i nvención de u na f orma adicional, y pretenden limitar el ámbito de la invención, la cual se define mediante las reivindicaciones anexas.

Ejemplo 1

55 Producción de Microesclerotias

En este ej emplo, nosotros, los s olicitantes, hem os pr ocedido a eva luar diferentes entor nos m edioambientales nutricionales de cultiv os líq uidos y a me diar la ac umulación d e l a b iomasa y los r endimientos pr oductivos de l as blastoesporas y de las microesclerotias. La tolerancia a la desecación de las microesclerotias, se midió mediante la evaluación su capacidad para germinar de una forma vegetativa y / o de una forma esporogénica, después de la rehidratación.

Se utilizaron, en este est udio, tres cepas de Metarhizium anisopliae var. anisopliae (Metchnikoff) Sorokin: una cepa comercial F52 (ATCC 90448, (de la firma Earth Biosciences, ahora, Novozyme Biologicals, Salem, VA, reaisladaa 65 partir de larvas de Tetanopsmyopaeformis), MA1200 (ATCC 62176, conducida mediante larvas de T. myopaeformis

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larvae), y TM109 (ARSEF5520, reaislada a partir de larvas de T. myopaeformis larvae). Todos los aisla mientos, se almacenaron a una temperatura de – 80 °C, en los laboratorios de investigación agrónoma consistentes en el centro USDA ARS NPARL y en el centro USDA ARS NCAUR. Se pr ocedió a hacer crecer cultivos Stock de cada cepa de

M. anisopliae, como aislamientos de esporas individuales, sobre agar dedextrosa de la patata (PDA – [del inglés,

5 potato dextrose agar] - ), durante un transcurso de tiempo de tres semanas, a la temperatura ambiente. Se procedió a cortar la pl aca esporulada en tampones de agar de 1 mm2, y los cu ltivos stock de estos tampon es de agar, se almacenaron en glicerol al 10 %, a una temperatura de – 80 °C. Los inóculos de conidias para los experimentos de cultivos líquidos, se produjeron mediante la inoculación de placas de PDA (agar de dextrosa de la patata), con una suspensión de conidias, procedentes de los cultivos stock congelados, y procediendo a hacer crecer estos cultivos, a la temperatura ambiente (~ 22 °C), durante un transcurso de tiempo de 2 – 3 semanas. Todos los cultivos líquidos, se inocularon a una concentración inicial correspondiente a un valor de 5 x 106 conidias ml-1, en el caldo de cultivo.

Los seis medios de cultivo los cuales se sometierona tests de ensayo, estaban compuestos por un medio de sales basales, suplementado con trazas de metales ( oligoelementos), vitaminas (Jackson et al., 1997, M ycological

15 Research, 101 : 35 - 4 1) y varias combinaciones de glucosa y de caseína hidrolizada ácida, y casaminoácidos. La solución de s ales b asales definida utilizada e n la tota lidad de l os cu ltivos líqu idos, c ontenía, p or litro de agua desionizada, la s sigu ientes c antidades d e l os comp uestos citados KH 2PO4, 4,0 g; C aCl2 • 2 H2O, 0 ,8 g; MgSO 4 • 7H2O, 0,6 g; FeSO4 • 7H 2O, 0.1 g; CoCl 2 • 6 H2O 37 mg; MnSO 4 • H 2O, 16 mg; Zn SO4 • 7H 2O, 1 4 mg; tiamina, riboflavina, pantotenato, niacina, piridoxamina, ácido tiótico (lipóico), 500 microgramos de cada uno de ellos; y ácido fólico, biotina, vitamina B12, 50 microgramos de cada uno de ellos. En la Tabla 1, se proporcionan, para cada medio expuesto a te st de ens ayo, las canti dades de gl ucosa y d e cas eína hidro lizada ácida, y la c orrespondiente concentración de c arbono y de c arbono co n res pecto a nitrógeno. Los cálc ulos d e l os factores d e rel ación de l carbono y del carbono con respecto a nitrógeno, estaban basados en unos valores correspondientes a un porcentaje del 4 0 % de c arbono en g lucosa y u n por centaje del 5 3 % de carbo no, un porce ntaje del 8 % de nitróge no en

25 caseína hidrolizada ácida.

Todos los cultivos, se hicieron crecer en cultivos de 100 ml en frascos (matraces) tamponados del tipo Erlenmeyer, de 250 ml de cap acidad útil , a una temp eratura de 2 8 °C y a u na v elocidad a ngular de 30 0 r. p. m., en una incubadora de agitación rotativa. Los matraces, se agitaron manualmente, de una forma frecuente, con objeto de inhibir el crecimiento micelial en las paredes de los matraces. Se procedió a extraer las muestras, después de unos transcurso de tiempo c orrespondientes a dos días, a c uatro días y a o cho días, post inoc ulación, con o bjeto d e mediar la acumulación de biomasa, las concentraciones de blastoesporas y las concentraciones de microesclerotias. Para cada experimento, se procedió a elaborar muestras por duplicado, procedentes de cada matraz, en cada fecha del muestreo, y se utilizaron tres matraces replicados, para cada medio. Todos los experimentos, se repitieron por lo

35 menos dos veces.

Con objeto de llevar a cabo las mediciones de la acumulación de la biomasa, se procedió a recolectar un ml de caldo de cultivo entero, procedente de los matraces de cultivo y, la biomasa, se separó del medio usado, mediante filtrado al vacío, sobre los discos de filtro previamente pesados (de la firma Whatman GF / A, Maidstone, Inglaterra). Se procedió a determinar la acumulación del peso en seco, procediendo a secar la biomasa y el disco de filtro, a u na temperatura d e 60 °C, a un p eso con stante, prev iamente a la medici ón. Co n objeto de determi nar las concentraciones de las micro esclerotias, se procedi ó a di luir el ca ldo d e cultivo, de u na forma apro piada, y s e emplazó una gota en un porta-objetos de vidrio de un microscopio, recubierto con un cubreobjetos, y se procedió a contar el número de m icroesclerotias, en un volumen de 100 micr olitros. Se proc edió a contar las microsclerotias,

45 cuando los agregados hifálicos, algunas veces melanizados, eran mayores de un tamaño correspondiente a un valor de 2 00 micró metros. Única mente se pr ocedió a co ntar l as microesc lerotias la s c uales estaba n bi en formadas. E l caldo de cultivo, se diluyó, de una forma apropiada, a efectos de facilitar el proceso de recuento. Durante el proceso de muestreo del caldo de cultivo, las suspensiones, se agitaron vorticialmente (formando remolinos), de una forma constante, con objeto de asegurar la homogeneidad.

Después de haber procedido a hacer crecer los cultivos de M. anisopliae, durante un transcurso de tiempo de ochos días, se procedió a añadir tierra de (de la firma HYFLO, Celite Corp., Lompoc, CA), a la biomasa fúngica combinada de los tres ma traces, en ca da uno de los tr atamientos, a una concentración correspondiente a un valor de 5 g de tierra de diatomeas / 100 ml de caldo de cultivo. La mezcla de microesclerotias – tierra de diatomeas, se filtró, bajo la

55 acción del vacío, en un embudo de Buchner, mediante la utilización de un filtro de papel del tipo Whatman Nº 54. Se procedió, a continuación, a desmenuzar la torta de filtrado, procediendo a procesarla enuna batidora – trituradora, (del tipo MINI PREP Plus, C uisinart), y ésta se estratificó en bandejas de aluminio de muy poca profundidad, y se secó, durante el transcurso de toda la noche, en una campana de confinamiento biológico. El contenido de humedad de la preparación de microsclerotias – tierra de diatomeas, se determinó mediante la utilización de un analizador de humedad. C uando las for mulaciones d e M. anisopliae se hu bieron seca do, a un conten ido de hum edad correspondiente a un porcentaje de aprox. un 5 %, éstas se envasaron al vacío, en bolsas sintéticas, de plástico, a base de polietileno, mediante una envasadora al vacío, y se almacenaron a una temperatura de 4 °C. Después de la rehidratación, las microesclerotias de M. anisopliae, germinaron de forma hífálica (formación de tubos de gérmenes) y éstas conidiacionaron (produjeron masas de conidias sobre la superficie de las microesclerotias). La viabilidad de

65 las microesclerotias (germinación hifálica), y la producción de esporas (germinación esporogénica), se determinaron en pr eparaciones d e micro esclerotias se cas, proce diendo a roc iarlas con 25 m g de una for mulación de microesclerotias secas, so bre la s uperficie de placas de agar de agua. Se utilizaron dos placas de agar de agua, para cada tratamiento. Después de un período de incubación de 24 horas, a una temperatura de 28 °C, se procedió a examinar las microesclerotias, de una forma microscópica, sobre cada placa, para la germinación hífálica, como

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5 una m edida de la vi abilidad. Con objeto d e en umerar la pr oducción d e esp oras, se procedió a co ntinuar con la incubación de placas de agar de agua,, durante un transcurso de tiempo de ocho días, a una temp eratura de 28 °C. Se proc edió a inu ndar ca da una de las pl acas d e a gar de a gua, con 5 ml d e agua estéril y, las conidias, s e desalojaron de las microesc lerotias, mediante un b ucle o l azo estéril. Después de haber procedido a desalojar las conidias, el líq uido disponible, se retiró mediante u na pipeta, de cada u na de las pl acas y se proce dió a medir el volumen de líquido. Las conidias, se contaron mediante la utilización de un hemocitómetro. Con objeto de determinar el número de conidias de M. anisopliae producidas por gramo de formulación de microesclerotias secas, se procedió a dividir el número de conidias recolectadas por placa, por el peso de la preparación de microesclerotias añadidas a cada una de las placas (0,025 g).

15 Resultados

La acumulación de biomasa mediante las tres cepas de M. anisopliae, seguido de modelo patrón pronosticado, se hicieron crecer en un medio el cual contenía una cantidad correspondiente a un valor de 8 g / l de carbono, produjo una concentraciones menores de biomasa, si se compara con las que se hicieron crecer en un medio que contenía una cantidad correspondiente a 36 g / l d e carbono (Tabla 2). Cuando se procede a comparar cultivos los cuales se han hecho cre cer en u n me dio co n factor es de re lación de carb ono con resp ecto a nitróge no, l os cuales s on diferentes, la acumulación de bi omasa, no se veía afectada por el c ontenido d e n itrógeno, par a a quéllos q ue s e habían hecho crecer en un medio con una concentración de carbono correspondiente a un valor de 8 g / l, sugiriendo ello el hecho de que, el medio, se encontraba limitado en cuanto a lo referente al carbono. Para todas las cepas de

25 M. anisopliae que se habían hecho crecer en un medio el cual contenía una cantidad de carbono, correspondiente a un valor de 36 g / l, laacumulación de biomasa, era significativamente mayor, después de unos transcursos de tiempo de crecimiento, correspondientes a 4 días y a 8 días, para los c ultivos que se habían hecho crecer en un medio con un menor factor de de relación de carbono con respecto a nitrógeno (es decir, con mayor contenido de nitrógeno), sugiriendo ello el hecho de que,, el nitrógeno, era limitativo del crecimiento (Tabla 2).

La formación, el rendimiento productivo y la melanización de la microesclerotias, mediante el hongo M. anisopliae, era dependiente de la cepa y dependiente del medio (véase, a dicho efecto, la Tabla 3). Mientras que, la formación de microesclerotias podía verse en todos los medios, y con todas las cepas de M. anisopliae, los más altos grados de concentración, se midieron en los días 4 y 8 post-inoculación, en un medio rico (correspondiente a una cantidad

35 de carbono de 36 g / l), mediante la cepa F52 de M. anisopliae. En el día 8, los medios ricos con unos altos factores de rel ación d e carbo no co n respecto a nitróge no, co rrespondientes unos val ores de 30 : 1 y de 50 : 1, proporcionaron, de una forma respectiva, unos rendimientos productivos de 2,7 x 105 microsclerotias / ml y de 2,9 x 105 microsclerotias / ml (vé ase, a dic ho efecto, la T abla 3). Las m icroesclerotias fo rmadas por la cep a d e M. anisopliae F52, en e l medio con un factor de relación de carbono con respecto a nitrógeno, correspondiente a un valor de 50 : 1, se melanizaron de una forma mayor, en comparación con las microesclerotias formadas en el medio con más altos factores de relación de carbono con respecto a nitrógeno.

La tolerancia a la desecación de las microesclerotias secadas al aire, procedentes de cultivos de 8 años de edad, mostraron el hecho de que, todos los cultivos y todas cepas del hongo M. anisopliae, produjeron microesclerotias,

45 las cuales sobrevivieron al proceso de secado, sin ninguna pérdida que fuera significativa en cuanto a lo referente a la viabilidad, y excepto en cuanto a lo referente a aquéllos cultivos, los cuales se habían hecho crecer en un medio débil, con un bajo contenido de nitrógeno [ 8 g / l de carbono, con un factor de relación carbono con respecto a nitrógeno corr espondiente a un val or de 5 0 : 1 (vé ase a dic ho efecto, la T abla 4) ]. La producción de co nidias, mediante las microesclerotias secadas al aire, era para todas la cepas de hongos de M. Anisopliae, de una forma independiente del m edio uti lizado, l a corr espondiente a un va lor ma yor de 1 x 10 8 conidias / g d e formul ación (elaboración) seca (véase, a dicho efecto, la Tabla 4).

De una forma general, las formulaciones (elaboraciones) de las microesclerotias procedentes de los medios ricos (medio 4, medio 5 y medio 6), produjeron cantidades numéricas mayores de conidias, cuando se procedía a hacer

55 una com paración con l os fo rmulados o elaboraciones d e micr oesclerotias d erivados de l os me dios con u nas concentraciones más bajas de carbono. De una forma adicional, los cultivos de M. anisopliae que se habían hecho crecer en medios ricos, produjeron una mayor cantidad de biomasa (véase, a dicho efecto, la Tabla 2), lo cual d io como resultado unos rendimientos productivos más altos de las formulaciones o elaboraciones de microesclerotias.

Ejemplo 2

Valoración de la excrecencia fúngica y de la esporulación de microesclerotias en diferentes suelos

Se procedió a evaluar la excrecencia (extensión) fúngicay la esporulación de la cepa de M. anisopliae MA1200, a 65 partir de gránulos microescleróticos producidos a p artir de los medios consistentes en el medio 4, e l medio 5 y el medio 6, en placas de suelos húmedos. Los gránulos, se prepararon de la misma forma que la que se ha descrito anteriormente, arriba, éstos se tamizaron a un valor de 0,6 mm – 1,7 mm de tamaño de partícula, y se almacenaron en bolsas de plástico selladas, a una temperatura correspondiente a un valor comprendido dentro de unos situados entre 5 °C – 7 °C, durante un transcurso de tiempo de 9 meses, previamente a la utilización de éstos. Se procedió a

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5 secar, d e u na forma s eparada, u n s uelo de ti po arcilloso pr ocedente de un c ampo de r emolachas azuc areras, situado en Sidney MT, un suelo arcilloso, limoso, recolectado de un campo de remolachas azucareras, situado en las cercanías de St. Thomas, ND, y un suelo arcilloso – limoso, procedente de Torrington, WY, secado por separado éste, el c ual s e rea lizó al aire, a u n co ntenido de humedad corr espondiente un porcentaje inf erior a un 2 %, procediéndose a pu lverizar y tamiz ar l os distintos s uelos, a través de un tamiz de 20 mes h (U. S.), para la

10 consecución de un rango de tamaño de partícula uniforme. La textura del suelo, se determinó mediante la utilización de procedimientos estándar (Véase, a dicho efecto, el trabajo de Sheldrick y Wang, 1993, Particle size distribution, -Distribución d el tama ño de partícula -, e n Soi l Sam pling a nd M ethods of An alysis, - Muestreo de su elos y procedimientos de análisis -, M. R. Carter, Ed. Can. Soc. Soil Science, Lewis Publishers, Boca Raton, FL, páginas 499 - 512). Todos los suelos sometidos a tests de ensayo, resultaron se no estériles. Se procedió a emplazar los tres

15 sólidos, en pl acas de Petri, y éstos se hu mectaron, con agua som etida a osmosis i nversa, a un a capaci dad d e campo correspondiente a un porcentaje del 20 % (según se había determinado previamente para cada suelo). Los gránulos que contenían las microesclerotias de M. anisopliae procedentes de cada medio de producción, se rociaron sobre la su perficie de las tre s placas d e replica dos d e cada sue lo. Se proce dió, a co ntinuación, a empl azar la s placas e n b olsas d e p lástico rese llables, y éstas se inc ubaron a u na temper atura de 25 °C. Los grán ulos, s e

20 examinaron de una forma visual, en cuanto a lo referente a la excrecencia fúngica y a la conidiación, 3 días y 7 días después

Se procedió así mismo, también, a la evaluación de la excrecencia fúngicay a la esporulación de las cepas de M. anisopliae MA1200, F52 y TM109, producidas a partir del Medio 5 y de los gránulos a base de arenilla o sémola de

25 maíz de la cepa de M. anisopliae F52 (véanse, a dicho efecto, los bioensayos que se facilitan abajo, a continuación), en pl acas d e suelo arcillo, húmed as. El suelo arcilloso estéril, er a el mismo q ue el qu e se h abía util izado anteriormente. El protocolo de la evaluación, era tal y como el que se ha descrito previamente, con observaciones visuales diarias, las cuales se iniciaron en el día 3.

30 Resultados

Medio 4 (factor de relación C : N = 10 : 1, 36 g de carbono / l), gránulos: En el día 3, se encontrabapresente una excrecencia fúngica típica de M. anisopliae, en todos los gránulos de microescleróticos incubados en los tres suelos sometidos a test de ensayo. Se produjo una cantidad menor a un porcentaje del 10 %, indicativa de una conidiación

35 inicial. En el día 7, los gránulos microescleróticos, se encontraban extensamente cubiertos por un himenio fúngico pero, la condición, no era prominente.

Medio 5 (factor de relación C : N = 30 : 1, 36 g de carbono / l), gránulos: En el día 3, se encontrabapresente una excrecencia fú ngica comp acta y una co nidiación, en l a t otalidad de los grán ulos de los tres su elos. Existía as í

40 mismo, también, un pequeño crecimiento filamentoso más erecto. En el día 7, se encontraba presente una intensa conidiación de M. anisopliae, en todos los gránulos en la totalidad de los tres suelos.

Medio 6 (factor de relación C : N = 50 : 1, 36 g de carbono / l), gránulos: En el día 3, se encontrabapresente una excrecencia fúngica, la cualera débil e irregular (con manchas irregulares), en los suelos arcillosos, limosos, y en

45 los suelos arenosos, limosos. En el suelo de arcilla, la excrecencia fúngica, era muy escasa y dispersa. En el día 7, la excrecencia fúngica, y la conidiación verde típica, había acontecido en, esencialmente, la totalidad de los gránulos de los tres suelos. Mientras que, no se había procedido a cuantificar la extensión de la conidiación, los niveles de conidiación para los varios suelos sometidos a test de ensayo, siguieron el modelo patrón; suelo arcilloso limoso> suelo arenoso limoso > suelo arcilloso.

50 En el día 3, l os gránulos microescleróticos de MA1200, F52 y TM109, tenían excreciones fúngicas, de una forma distinta a los que sucedía con los gránulos de sémola de maíz la cepa de M. anisopliae F52. Los gránulos de la cepa TM109, tenían u nos himenios c ompactos en sus s uperficies, c on unas áre as de co nciliación profus a. L as excrecencias, en gránulos de las cepas F52y MA1200, eran menos robustas; los gránulos de la cepa F52, tenían

55 una conidiación más visible que la correspondiente a la cepa MA1200. Hubo una excrecencia muy pequeña, en los gránulos de s émola de m aíz que te nían la cep a F 52, c onsistiendo, el ma yor crec imiento, e n ca pas de mic elas simples, dispersas y diseminadas. En el día 4, la conidiación, era visible y se encontraba en curso, con las cepas de Ma1200 y T M109, s obre los grán ulos d e s émola d e maí z, pero ésta s e enc ontraba ausente, e n lo s grán ulos d e sémola de maíz inoculada con la cepa F52. En el día 5, todos los gránulos microescleróticos de M. anisopliae, tenían

60 una c onidiación verd e, comp acta y profus a. En compar ación c on l os gr ánulos micr oescleróticos, los grán ulos de sémola de m aíz, de todas l as cep as d e M. aniso pliae sometidas a test de ens ayo, contin uaron tenie ndo un a excrecencia fú ngica y una pequeña co nidiación, h asta lo s días 7 – 8 (véase, a dicho efecto, l a F igura 2). Subsiguientemente al día 8, la esporulación, se convirtió en más robusta, pero ésta, nunca logró alcanzar la misma extensión visual que la correspondiente a los gránulos microescleróticos.

65 9 Ejemplo 3

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Eficacia relativa de los gránulos microescleróticos producidos mediante el sexto Medio, en el Ejemplo 1

5 La eficacia biológica relativa de los gránulos microescleróticos producidos por la c epa F52, en los s eis medios, se evaluó mediante la utilización de bioensayos a base de suelos, con larvas de gusanos de la raíz de la remolacha azucarera (SBRM - [del inglés, sugarbeet root maggots] - ). Se procedió a incorporar gránulos (de 20 / 30 mesh), de la cepa F32, procedente de los seis medios, al interior de de un suelo de arcilla, no estéril, tamizado, que se había utilizado previamente a una tasa correspondiente a un valor de 14 mg de gránulos / 50 g de suelo. Se evaluaron dos lotes de producción de gránulos, por separado. Los gránulos, se habían almacenado en bolsas de plástico, selladas, a un a temper atura corr espondiente a un valor d e 5 ° C – 9 °C, d urante un tra nscurso de ti empo de 7 m eses, previamente a proceder a s u uso. L o suelos, se hum edecieron con agua sometida a osmosis inversa, a u n punto final de un 15 % de Capacidad de Campo (el cual se había determinado previamente), y los potenciales de agua, se determinaron con la ayuda de medidor de humedad de la marca AQUALAB (de la firma Decagon products, Pullman,

15 WA). Las mezclas de suelo resultantes, eran de 0,982 – 0,983 Aw (- 2,32 a – 2,47 MPa de potencial mátrico) (Aw = actividad de agua), humedades éstas, las cuales eran suficientes para la excrecencia fúngica yla esporulación. El punto de marchitación permanente, para la mayoría de las plantas, es el correspondiente a un valor de 0,989 Aw. Se procedió a preparar un suelo de control, no tratado, simplemente, humectando (hidratando) un alícuoto adicional de suelo, sin ningún gránulo, con la misma cantidad de agua. Se procedió, a continuación, a dispensar el suelo tratado y el suelo de control, de un a forma ig ualitaria, en tres copas de co ndimento, d e p lástico, provist as de t apa. Las capas, se sellaron y se emplazaron en un paño o toalla de una capa humedecida con agua (con objeto de mantener la humedad) en un recipiente contenedor de plástico, provisto de tapa, y éstas se incubaron, a una temperatura de 24 °C. Después de un transcurso de tiempo de 1 semana, se procedió a infestar los suelos, con 10 larvas de SBRM (gusanos d e l a raíz de l a re molacha az ucarera) e n el te rcer estadi o, p or capa. Esta s larvas, se rec olectaron p or

25 campos, en estado de diapausa, todavía motil y no alimentándose y, éstas, se habían almacenado en arena estéril, húmeda, a un temperatura correspondiente a un valor situado en 3 °C – 4 °C, durante un transcurso de tiempo de varios meses, previamente a su uti lización. Cada uno de los tratamientos, se rep itió un número de tres vec es. La mortalidad de las l arvas, s e determinó s emanalmente, durante un tra nscurso de ti empo de tres se manas. C ada semana, se procedió a retirar todos los cadáveres y, éstos, se emplazaron a una humedad relativa correspondiente a un valor comprendido dentro de unos márgenes situados entre un 95 % - 100 % d e alta humedad, durante un transcurso detiempo de tres días, con objeto de elicitarla presencia de micosis. Se procedió a evaluar, de esta misma forma, dos lotes separados de producción.

Para los análisis esta dísticos de d atos de bi omasa, se procedió a aj ustar todos l os datos d e mor talidad, para

35 controlar la mortalidad, cuando fuera necesario, mediante la aplicación de la corrección de Abbott (Abbott, 1925) y, a continuación, éstos se some tieron a u na transformación angular, antes de proc eder a los análisis adicionales. Los datos, se sometieron, a continuación, a tests de ensayo de separación media de ANOVA y de HSD de Tukey (HSD = del ing lés, dif erencia hon estamente significativa), cuando se hubieron ide ntificado l os efectos s ignificativos d el tratamiento.

Resultados

No hubieron diferencias significativas en cuanto a lo referente a la eficacia, entre los dos lotes de producción de gránulos micr oescleróticos, para cu alesquiera d e lo s medios tra tados, en unos transcurs os de tiemp o 45 correspondientes a 1 semanaya 3 semanas (F = 0,06, p = 0,83, para la semana 1; F = 1,51 p = 0,34 para la semana 3), yuna diferencia apenas significativa en la semana 2 (F = 23,94, p = 0,04), debido a las mortalidades procedentes de los gránulos microescleróticos del Medio 1, las cuales eran significativamente diferentes entre los dos lotes. La mortalid ad de control, para los SBRM (gusanos de l a raí z de la rem olacha azucarera), era de un porcentaje del 0 %, incl uso desp ués d e un transc urso de tiem po d e tres seman as. Los dat os, se enc uentran recopilados en la Tabla 5. Existían unas diferencias significativas, entre las mortalidades tempranas de los gránulos producidos en el medio seis, en ambos lotes, una semana después de que, los suelos, se hubieron infestado con larvas (F = 6,41, 5 df, p = 0,004 para el Lote E050509, y F = 4,94, 5 df, p = 0,011 para el Lote E050516). Cuando se procedió a agrupar los dados para ambos lotes, los gránulos del Medio 4, y del Medio 5, eran significativamente mejores que los correspondientes al resto (HSD de Tukey, P = 0,05). A los tres días de spués de la infestación, las

55 mortalidades de las larvas, habían alca nzado un porc entaje d el 100 % en l a m ayoría d e l os tratamient os, desapareciendo las diferencias significativas entre los medios 2 – 6; los gránulos del Medio 1, proporcionaron unos rendimientos productivos más bajos que los correspondientes al resto.

Ejemplo 4

Comparación de la eficaci a de los grá nulos microescleróticos con gr ánulos de por tador (soportes) nutritivos convencionales, en dos suelos diferentes

Se procedió a llevar a cabo un bioensayo, con objeto de comparar los gránulos microescleróticos de la cepa F52, del 65 Medio 5, con gránulos a ba se de sém ola de maíz, del ti po más co nvencional, los c uales se h abían utiliz ado en

imagen10

trabajos de l aboratorio y en ensa yos de campo, contra el SBRM (gus ano d e la raíz de la remo lacha azuc arera) (Jaronski et al., 2006, Challenges in using Metarhizium anisopliae for control of Sugarbeet Root Maggot, Tetanops myopaeformis, - Retos e n l a util ización d e Metar hizium anis opliae p ara el co ntrol del g usano de la raíz de la remolacha azu carera, T etanops m yopaeformis -. Bull etin IOBC / wprs 3 0 (7) : 1 19 - 1 24; Cam pbell et al., 20 06, 5 Environmental Entomology, - Entomología medioambiental -. 35 (4) : 986 - 991; Jaronski & C ampbell,2006, 2005 Sugarbeet Research and Extension Reports, - Investigación de la remolacha azucarera y reportes de extensión - .

36 : 1 85 - 1 89; Majum dar et al., 20 06, 2 005 S ugarbeet Research and Exte nsion Reports. 36 : 22 2 - 2 27). L a evaluación, s e llev ó a ca bo en dos s uelos, un sue lo arc illoso – limoso, recol ectado de u n cam po d e rem olachas azucareras en las inmediaciones de St. Thomas, ND, y el suelo de arcilla utilizado anteriormente. Los gránulos de sémola de maíz, consistían un portad or o soporte d e sémola de maíz de un tamaño d e partícula de 1 6 / 30 mesh, (Bunger Milling, St. Louis, MO), recubierto con conidias, mediante la utilización de un ligante acuoso de monooleato de polioxietilen sorbitán (TWEEN 80), al 10 %. La concentración objetivizada como diana de las conidias, en estos gránulos, era la correspondiente a un valor de 1 – 2 x 1 05 conidias / gránulo. Estos gránulos a base de sémola, se prepararon r ecientemente, mediante la utilización de c onidias sec as, pro ducidas mediante la f ermentación d e

15 substratos sólidos, y se refrigeraron hasta su uso. Los gránulos microescleróticos secos del Medio 5, se tamizaron a un tamañ o d e 20 / 32 mesh, previ amente a su utilización. Cu ando éstos s e empl azaron en un e ntorno medioambiantal lo suficiente húmedo (Aw > 0,95), tal como el cons istente en agar de agua, suelo húmedo, o papel de filtro húmedo, los gránulos de sémolade maíz, se cubrieron con una segunda generación de conidias, en un transcurso de tiempo de 7 – 10 días, mediante que, los gránulos microescleróticos, esporularon profundamente, en un tra nscurso de ti empo d e 3 – 4 días. Los bioensayos, se ll evaron a ca bo de l a forma q ue s e h a d escrito anteriormente, arriba, p ero, con una tasa correspondiente a un v alor de 112 m g de gránulos / 60 gamos de s uelo seco. Los suelos, se hidrataron a un valor correspondiente a un porcentaje del 15 % de Capacidad de Campo, para cada uno de los suelos. Este nivel de humedad, tuvieron como resultado unos valores medidos de Aw de 0,983 y 0,984, para los dos suelos, según se determinó mediante un dispositivo de medición del tipo “Aqualab meter”. Para

25 cada tratami ento, se utilizaron tres c opas de re plicación, de 10 larv as, cada u na de ellas. Las l arvas d e SB RM (gusano d e la raíz de la rem olacha azuc arera), se aña dieron d espués de qu e, los su elos, se hu bieron inc ubado, durante un tra nscurso d e tie mpo de 1 sem ana, a u na te mperatura de 24 °C. Las mo rtalidades de l as larvas, s e determinaron después de unos transcursos de tiempo correspondientes a 1, 2, y 3 semanas, de la forma que se ha descrito anteriormente, arriba.

Resultados

En ambos tip os de sue los, el suel o de arcilloso – l imoso y el su elo de arci lla, l os grán ulos m icroescleróticos procedentes d el Me dio 5, te nían u na eficacia si gnificativamente m ayor que la c orrespondiente a al grán ulo de

35 sémola de maíz, cubierto con con idia, más tradicio nal. La mortali dad d el grá nulo micro esclerótico, era la correspondiente a un porcentaje correspondiente a un porcentaje del 100, dentro de un transcurso de tiempo de 1 semana de los suelos tratados, infestados con larvas (véase, a dicho efecto la Tabla 6). En el suelo de arcilla, los gránulos a b ase de sémo la de maíz, provocaro n únic amente un a mortali dad corr espondiente a un pe queño porcentaje de la mortalidad de las larvas.

Ejemplo 4

Comparación de la eficacia de los gránulos microescleróticos con gránulos de soportes nutritivos convencionales, a diferentes humedades del suelo

45 Se proce dió a llevar a ca bo bioe nsayos a dicionales, con objeto de co mparar l os gr ánulos micro escleróticos de sémola de maíz, a distintas humedades del suelo. Los gránulos, se incorporaron en un suelo de arcilla, a una tasa correspondiente a un valor de 1,8 mg / g de suelo, y subsiguientemente, éstos se humidificaron al deseado punto final de humedad, con agua. Estos ensayos, se llevaron a cabo de la forma que se ha descrito anteriormente, arriba, con 3 copas de replicado, con 10 larvas cada una de ellas, por tratamiento, excepto en cuanto al hecho consistente en que, el suelo de arcilla, se humedeció a unos porcentajes correspondientes a un valor del 7,5 % (Aw = 0,919), del 15 % (Aw= 0,983, ó del 20 % (Aw = 0,991) de Capacidad de Campo. Los niveles de humedad, se verificaron dos días después de la inoculación con conidias e hidratación, mediante la utilización de un dispositivo de medición de la actividad de agua, del tipo AQUALAB (Decagon Devices), Inc.). El ensayo en su totalidad, se replicó dos veces.

55 La mortalidad de las larvas se determinó mediante muestreo destructivo, 3 semanas después. Se procedió a retirar cualesquiera cadáveres sin hongos de esporulación sobre sus exteriores, y éstos se incubaron a un alto porcentaje de humedad, durante un transcurso de tiempo de tres días, con objeto de evidenciar la presencia de micosis.

Resultados

Cuando se pr ocedió a com arcar la eficac ia de los gr ánulos micro escleróticos d el Medi o 5, con lo s gránu los de sémola de maíz, a diversos niveles dehumedad del suelo, el primero, provocó una mortalidad de SBRM (gusanos de la r aíz de l a remolacha azucarera), la c ual era significativamente mayor, a u nos niveles correspondientes a un valor de 0 ,919 A w y por e ncima (vé ase, a dich o efec to, la F igura 1). La mortal idad de l as la rvas, era l a

65 correspondiente a un porcentaje del 100 %, en comparación con la correspondiente a unos porcentajes del 20 % y

imagen11

5 de maíz. La mortalidad de control, era la correspondiente a un porcentaje inferior a un 10 %, pera todos los niveles de hum edad. En total, los gránu los micro escleróticos, prov ocaron un t an alto porcentaje de mortalidad, en estos suelos infrasaturados, debido al hec ho de que, las micr oesclerotias, produjeron más conidias infecciosas, de u na forma más ráp ida q ue l a corr espondiente a la formul ación de grá nulos c onvencionales. Estos datos, acentú an l a superioridad de los gránulos microescleróticos, con respecto a los substratos nutritivos que contenían conidias.

10 Tabla 1

Concentración de carbono (g L-1) y factor de relación de carbono con respecto al nitrógeno, en los cultivos líquidos utilizados para la valoración del crecimiento y los rendimientos productivos de diferentes cepas de M. anisopliae.

15

C (g L-1)

C : N Glucosa (g L-1) Casaminoácidos (g L-1)

8

10 : 1 10,6 10,0

8

30 : 1 16,6 3,4

8

50 : 1 18,0 2,0

36

10 : 1 45,0 45,0

36

30 : 1 75,0 15,0

36

50 : 1 81,0 9,0

Tabla 2

Comparación de varios medios en la producción de biomasas, mediante Metarhizium anisopliae en un cultivo líquido, 20 después de 2 días, de 4 días y de 8 días de crecimiento.

Metarhizium anisopliae Aislamiento Medio

Concentración de carbono (g/l) Factor de relación del carbono con respecto al nitrógeno Biomasa (mg / l)

Día 2

Día 4 Día 8

Ma 1200 1

8 10 : 1 2,5 a 5,5 d 3,8 d

2

8 30 : 1 2,5 a 4,5 d 5,0 d

3

8 50 : 1 1,5 a 4,5 d 4,4 d

4

36 10 : 1 2,7 a 22,2 a 26,6 a

5

36 30 : 1 3,5 a 14,8 b 18,9 b

6

36 50 : 1 2,1 a 10,0 c 13,3 c

F 52 1

8 10 : 1 1,1 c 8,2 d 3,2 c

2

8 30 : 1 3,4 a 5,4 e 5,5 c

3

8 50 : 1 1,7 c 4,0 e 3,5 c

4

36 10 : 1 2,0 b, c 22,6 a 33,0 a

5

36 30 : 1 3,8 a 19,7 b 21,6 b

6

36 50 : 1 3,2 a, b 11,8 c 18,3 c

TM109 1

8 10 : 1 0,8 c 5,2 c 4,5 d

2

8 30 : 1 0,7 c 3,1 c, d 3,8 d

3

8 50 : 1 0,6 c 2,2 d 4,0 d

4

36 10 : 1 1,0 b, c 12,7 a, b 30,5 a

5

36 30 : 1 1,7 a 13,7 a 24,0 b

6

36 50 : 1 1,5 a, b 10,6 b 14,0 c

Para ca da uno de l os ais lamientos, los v alores med ios, se guidos p or d iferentes letras, son si gnificativamente diferentes, mediante la utilización de HSD de Turkey – Kra mer. Los val ores medios, se derivan de 6 v alores (3 experimentos por separado, llevados a cabo por duplicado, para cada tratamiento).

Tabla 3 25 Comparación de varios medios en la producción de microesclerotias, mediante Metarhizium anisopliae en un cultivo líquido, después de 2 días, de 4 días y de 8 días de crecimiento. 12

imagen12

Metarhizium anisopliae Aislamiento Medio

Concentración de carbono (g/l) Factor de relación del carbono con respecto al nitrógeno Biomasa (microesclerotias / ml x 104)

Día 2

Día 4 Día 8

Ma 1200 1

8 10 : 1 3,1 a 10,6 a, b 15,3 a

2

8 30 : 1 0,5 b 2,7 c 6,4 b, c

3

8 50 : 1 0,5 b 2,4 c 4,9 c

4

36 10 : 1 1,7 a, b 5,7 b, c 12,0 a, b

5

36 30 : 1 2,3 a, b 7,7 b, c 9,3 a,b, c

6

36 50 : 1 2,1 a, b 15,3 a 14,7 a

F 52 1

8 10 : 1 0,8 b 10,5 a 5,3 b

2

8 30 : 1 1,7 b 6,4 a, b 11,7 b

3

8 50 : 1 2,3 b 5,0 b 8,5 b

4

36 10 : 1 8,0 a 10,3 a 9,3 b

5

36 30 : 1 7,9 a 11,0 a 27,0 a

6

36 50 : 1 9,5 a 6,8 a, b 29,0 a

TM109 1

8 10 : 1 0,0 a 2,0 a, b 1,2 a

2

8 30 : 1 0,7 a 1,2 b, 1,8 a

3

8 50 : 1 0,6 a 0,2 b 1,0 a

4

36 10 : 1 0,2 a 1,9 a, b 5,3 a

5

36 30 : 1 0,5 a 2,0 a, b 3,7 a

6

36 50 : 1 0,3 a 4,9 a 3,9 a

Para cada uno de los aislamientos, los valores medios, seguidos por diferentes letras, son significativamente diferentes, mediante la utilización de HSD de Turkey – Kramer. Los valores medios, se derivan de 6 v alores (3 experimentos por separado, llevados a cabo por duplicado, para cada tratamiento).

Tabla 4

Evaluación de la tolerancia a la desecacióny de la capacidad de producción de conidias de microesclerotias de Metarhizium anisopliae secadas al aire.

Metarhizium anisopliae Aislamiento Medio

Concentración de carbono (g/l) Factor de relación del carbono con respecto al nitrógeno Geminación hifálica (% de microoesclerotias)) Germinación esporogénica (conidias / g de formulado seco x 107)

Ma 1200 1

8 10 : 1 100 a 24,0 b

2

8 30 : 1 100 a 29,5 b

3

8 50 : 1 87 b 28,0 b

4

36 10 : 1 100 a 42,3 b

5

36 30 : 1 100 a 97,5 a

6

36 50 : 1 99 a 21,5 b

F 52 1

8 10 : 1 99 a 53,5 b

2

8 30 : 1 96 a 64,5 b

3

8 50 : 1 99 a 46,5 b

4

36 10 : 1 100 a 114,5 a

5

36 30 : 1 100 a 82,5 a, b

6

36 50 : 1 97 a 82,3 a, b

TM109 1

8 10 : 1 85 a, b 18,1 b

2

8 30 : 1 93 a, b 15,4 b

3

8 50 : 1 46 b 16,0 b

4

36 10 : 1 100 a 81,3 a, b

5

36 30 : 1 100 a 94,3 a

6

36 50 : 1 100 a 63,8 a, b

imagen13

Para cada uno de los a islamientos, los va lores medios, seguidos por diferentes letras, s on significativamente diferentes, mediante la utilización de HSD de Turkey – Kramer. Los valores medios, se derivan de 6 valores (3 experimentos por separado, llevados a cabo por duplicado, para cada tratamiento).

Tabla 5

Mortalidad de l as larvas de Tetanops myopaeformis en el tercer estadio, expuestas a suelos tratados con gránulos microescleróticos, despu és d e 1 unos trans cursos de ti empo de 1 sem ana, de 2 sema nas y d e 3 se manas p ostinfestación. Gránulos de microesclerotias de la cepa F 52 de Metarhizium anisopliae, preparada a partir de cultivos líquidos producidos en los medios 1 – 6.

1 semana

2 semanas 3 semanas

Tratamiento

Mortalidad* Micosis Mortalidad* Mico sis Mortalidad* Mico sis

Test de ensayo 1 (Lote 050509)

Medio 1

0 % b - 23,3 % b 71,4 % 46,7 % b 71,4

Medio 2

6,7 % a b 50,0 % 50 % a b 100 % 96,7 % a 100 %

Medio 3

10,0 % a b 66,7 % 63,3 % a 100 % 100 % a 100 %

Medio 4

36,7 % a 100 % 76,7 % a 100 % 100 % a 100 %

Medio 5

26,7 % a 75 % 56,7 a 100 % 96,7 % a 100 %

Medio 6

6,7 % a b 100 % 70,0 % a 100 % 100 % a 100 %

Estadística ANOVA

F= 6,41, 5 d f p = 0,004 F = 7, 55, 5 d f, P = 0,002 F = 19,9, 5 d f, P < 0,001

Test de ensayo 2 (Lote 050516)

Medio 1

0,0 % b 63,3 % a 94,5 % 86,7 % a 85,7 %

Medio 2

6,7 % b 100 % 76,7 % a 81 % 96,7 % a 100 %

Medio 3

0,0 % 53,3 % a 81,3 % 96,7 % a 100 %

Medio 4

26,7 % a 100 % 70 % a 100 % 100 % a 100 %

Medio 5

16,7 % a b 80 % 70 % a 100 % 90 % a 100 %

Medio 6

13,3 % a b 75 % 73 % a 100 % 96,7 % a 100 %

Estadística ANOVA

F= 4,94, 5 d f p = 0,011 F = 0,66, 5 d f, P = 0,66 F = 0,93, 5 d f, P = 0,49

Las mortalidades son la media de tres r eplicados y, si éstas se si guen de diferentes letras en una columna, éstas son significativamente diferentes (HSD de Turkey, p < 0,05).

10

Tabla 6 Mortalidad de l as larvas de Tetanops myopaeformis en el tercer estadio, expuestas a suelos tratados con gránulos microescleróticos, despu és d e 1 unos trans cursos de ti empo de 1 sem ana, de 2 sema nas y d e 3 se manas p ost

15 infestación. Las mortalidades son la media de tres replicados (SD) y, si éstas se siguen de diferentes letras en una columna, éstas son si gnificativamente diferentes (HSD de Turkey, p < 0,05). La mic osis, era de un porcentaje del 100 %, entre la totalidad de los cadáveres.

Mortalidad

Suelo

Tratamiento 1 semana 2 semanas 3 semanas

Arcilla

No tratado 0 % a 0 % a 0 % a

Gránul

o microesclerótico 100 % b 100 % c 100 % c

Gránulo de sémola de maíz

0 % a 23,3 % (15,3 % ) b 26,7 % (15,3 % ) b

Arcilloso – limoso

No tratado 0 % a 0 % a 0 % a

Gránul

o microesclerótico 100 % b 100 % c 100 % c

Gránulo de sémola de maíz

0 % a 0 % a 0 % a

Claims (9)

1. imagen1

   REIVINDICACIONES

   1.- Microescl erotias a isladas de u n h ongo entomo patógeno s eleccionado de entre el gr upo cons istente e n las especies Metarhizium, tales como las c onsistentes en la Metarhizium flavoviride y la Metarhizium anisopliae, y las 5 especies Lecanicillium.
2. 2.- Las micr oesclerotias a isladas de la r eivindicación 1, en d onde, el cita do hongo entomopatógeno, es

   substancialmente biológicamente puro.

   10 3.-Una c omposición, la c ual comprende una cantidad insecticidamente efectiva d e microesclerotias secas de un hongo entomo patógeno, seleccionado de e ntre el grupo c onsistente e n l as esp ecies Metarhizium, tales como las consistentes en la Metarhizium flavoviride, o la Metarhizium anisopliae, y las especies Lecanicillium, con un portador agronómicamente ac eptable, microesc lerotias éstas, l as cuales, germ inan h ifálicamente, o esp orogénicamente, después de la rehidratación, para producir un conidia aérea, infectiva.

   15 4.- La composición de la reivindicación 3, en donde, el citado hongo entomapatógeno, es substancialmente puro.
3. 5.- La compos ición d e la rei vindicación 3, en do nde, las citadas micro esclerotias, se produc en me diante cultiv o líquido, y éstas se encu entran pres entes en la biomasa recup erada, en un a conc entración d e por lo m enos

   20 aproximadamente 1 x 106 microesclerotias por gramo de biomasa.
4. 6.- Un procedimiento para el control de los insectos, el cual comprende la aplicación al locus de los citados insectos, una cantidad insecticidamente efectiva demicroesclerotias de un hongo entomopatógeno, seleccionado de entre el grupo consistente en las especies Metarhizium, tales como la Metarhizium flavoviride y la Metarhizium anisopliae, y

   25 las especies de Lecanicillium.
5. 7.- El pr ocedimiento de la reivindicación 6, en do nde, los cita dos ins ectos, se s eleccionan de entre el grupo consistente en los gorg ojos de las raíce s, los gusan os del suel o, los gusa nos d e las raíces, los gus anos laminadores, las moscas de la fruta, y los gorgojos de las raíces.

   30 8.- El pr ocedimiento de la reivindicación 6, en do nde, los cita dos ins ectos, se s eleccionan de entre el grupo consistente e n las termitas s ubterráneas ( especies Retic ulitermes y Coptotermes), los gusanos de l as raíces de l maíz (de las espec ies Diabrotica), a l os gorgojos negros de la vid (Otiorhynchus sulcatus), a l os gus anos laminadores (larvas de la familia Elateridae), a los gorgojos de las raíces de los cítricos (Diaprepes abbreviatus), a

   35 los gorgojos de las raíces de la remolacha azucarera (Tetanops myopaeformis), a los g orgojos de l a col o rep ollo / del na bo / d e la c ebolla / del maíz de sie mbra ( especies Delia), a las moscas (d el moho) de l a z anahoria ( Psila rosae), a los gorgojos de la patata dulce (Cylas formicarius), a los escarabajos japoneses (Popillia japonica), y a los abejorros europeos (Rhizotrogus majalis).

   40 9.- El pr ocedimiento de la reivindicación 7, en d onde, la citada aplicación, comprende la aplicación de las citadas microesclerotias al suelo, o a una mezcla de cultivo sin suelo, de invernadero.
6. 10.- El proce dimiento d e la r eivindicación 6 , en dond e, los citados ins ectos, son inse ctos que ha bitan de ntro de l follaje de las plantas o en las cortezas de los árboles, seleccionados de entre el grupo consistente en el escarabajo

   45 barrenador es meralda de l fresno ( Agrilus pla nipennis), e n la po lilla o p alomilla gitan a ( Lymantria d ispar), y en el gorgojo de la pecana (Curculio caryae), de una forma preferible, en donde, las citadas microesclerotias, se aplican a la corteza y a la canopia de las plantas y de los árboles.
7. 11.- Uso de una canti dad isectici damente efectiva de microesc lerotias secas proced entes de un ho ngo

   50 entomopatógeno sel eccionado de entre el grupo co nsistente en l as espec ies Metarhizium, tales como las consistenes e n l a es pecie Metarhizium fl avoviride, o la esp ecie Meta rhizium a nisopliae, para el c ontrol de l os insectos, en donde, los citados insectos, se seleccionan, de una forma preferible, de entre el grupo consistente en los gorgojos de las raíces, los gusanos del suelo, los gusanos de las raíces, los gusanos laminadores, las moscas de la fruta, y los gorgojos de las raíces.

   55 12.- El uso de la reivindicción 11, en donde, los citados insectos, se seleccionan de entre el grupo consistente en las termitas subterráneas (especies Reticulitermes y Coptotermes), los gusanos de las raíces del maíz (de las especies Diabrotica), a los gorgojos negros de la vid (Otiorhynchus sulcatus), a los gusanos laminadores (larvas de la familia Elateridae), a l os gorgojos de las raíces de los cítricos (Diaprepes abbreviatus), a los g orgojos de l as raíces de l a

   60 remolacha azucarera (Tetanops myopaeformis), a los gorgojos de la col o repollo / del nabo / de la cebolla / del maíz de siembra (especies Delia), a las moscas (del moho) de la zanahoria (Psila rosae), a los gorgojos de la patata dulce (Cylas for micarius), a los e scarabajos japoneses ( Popillia j aponica), y a los ab ejorros euro peos (Rhizotrogus majalis).

   15

   imagen2
8. 13.- El uso d e la reivi ndicación 1 2, en d onde, la cita da apl icación, compre nde l a aplic ación de las citada s microesclerotias al suelo, o a una mezcla de cultivo sin suelo, de invernadero.
9. 14.- El uso de la reivindicación 11, en donde, los citados insectos, son insectos que habitan dentro del follaje de las

   5 plantas o en las cortezas de los árboles, seleccionados de entre el grupo consistente en el escarabajo barrenador esmeralda del fresno (Agrilus planipennis), en la po lilla o pal omilla gitana (Lymantria dispar), y en el gorgojo de la pecana (Curculio caryae), de una forma preferible, en donde, las citadas microesclerotias, se aplican a la corteza y a la canopia de las plantas y de los árboles.

   10 15.- Un pr ocedimiento p ara la pro ducción, a partir d e u n ho ngo enotomopatógeno, de u na form ulación la cu al comprenda una alta concentración de microesclerotias fúngicas tolerantes a l a desecación, el cual comprende las etapas de:

   a) inoc ular u n medi o de culti vo líqui do, el c ual com prende una fuent e de carbon o y u na fuente d e nit rógeno co n

   15 progágulos fú ngicos de un hongo enomopatógeno sel eccionado de e ntre el gru po consiste nte en las especies Metarhizium, tales como las consistentes en las especies Metarhizium flavoviride, ó Metarhizium anisopliae, y las especies Lecanicillium, te niendo, l a cit ada fuente de nit rógeno, u na c oncentación c omprendida dentro de nos márgenes situ ados e ntre 8,1 gramos / litro y 50 gramos / l itro, y t eniendo, l a c itad fu ente d e carbono, una concentración mayor de 20 gramos / litro;

   20 b) inc ubar los prop águlos durante un tra nscurso de ti empo s uficiente como para permitir l a p roducción de microesclerotias; c) recolectar las microesclerotias resultantes; y d) formular una formulación, la cual contenga una cantidad insecticidamente efectiva de aproximadamente 1 x 106 ó mayor, de microesclerotias por gramo de peso en seco de biomasa, recuperada del cultivo líquido

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