BRPI0813550B1

BRPI0813550B1 - Composto derivado fluorescente de poliaminas, seu processo de síntese e seu uso

Info

Publication number: BRPI0813550B1
Application number: BRPI0813550-9A
Authority: BR
Inventors: Jean-Philippe Annereau; Jean-Marc Barret; Yves Guminski; Thierry Imbert
Original assignee: Pierre Fabre Medicament
Priority date: 2007-07-26
Filing date: 2008-07-28
Publication date: 2019-10-15
Also published as: TWI444199B; US8569011B2; CA2694474C; JP2015038114A; ZA201001347B; BRPI0813550A2; JP5889987B2; AR067687A1; CN101809007B; WO2009013360A9; WO2009013360A1; MX2010001030A; EP2183230B1; JP5698533B2; CA2694474A1; MY149523A; BRPI0813550B8; AU2008278978B2; HK1147479A1; FR2919287A1

Abstract

composto derivado fluorescente de poliaminas, seu processo de síntese e seu uso a presente invenção refere-se a novos derivados fluorescentes de poliaminas que possuem um grupo benzoxadiazol, ao processo de preparação dos mesmos e à utilização dos mesmos a título de ferramentas de diagnóstico que permitem colocar em evidência o sistema de transporte das poliaminas nas células cancerosas e, portanto, selecionar os pacientes portadores de tais tumores tendo em vista adaptar o tratamento dos mesmos. esses derivados correspondem à fórmula (1) ou a um sal farmaceuticamente aceitável desse último, na qual: r1 representa um ou vários grupos no2 na posição 4 ou 6, ou então um grupo so2ph, so2nme2, so2nh2, so3h, r2 representa um hidrogênio, uma alquila com c1-6, uma benzila, um grupo perfluoralquila, os valores de a, b, c, podem ser de 2 a 5, independentemente uns dos outros e representam encadeamentos alquilenos que separam os grupos aminados, e os valores de d e e podem ser independentemente o ou 1.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para COMPOSTO DERIVADO FLUORESCENTE DE POLIAMINAS, SEU PROCESSO DE SÍNTESE E SEU USO.

A marcação das biomoléculas e o acompanhamento dos fenômenos biológicos demandam a elaboração de sondas fluorescentes que se tornaram ferramentas incontornáveis para os estudos estruturais e funcionais dos meios biológicos.

Uma sonda fluorescente é uma molécula conjugada, composta por um grupamento fluorforo ou fluorcromo ligado de modo covalente a um grupamento que tem propriedades de interações específicas com o ambiente biológico adequado. Essa sonda fluorescente possui a propriedade de absorver a energia luminosa que lhe é endereçada a um comprimento de onda bem definido, que constitui assim a fase de excitação, e depois de restituir essa energia sob a forma de luz fluorescente, chamada fase de emissão. Assim, depois de excitação, uma vez que a energia do fóton foi absorvida, a molécula se encontra em um estado eletronicamente excitado, e retorna então para o estado de energia fundamental emitindo para isso um fóton. Essa emissão de fóton, fenômeno de fluorescência, é feita a um comprimento de onda ligeiramente superior ao comprimento de onda de excitação. É possível então registrar um espectro de fluorescência que é específico da molécula.

É então possível localizar uma sonda fluorescente em um meio biológico com o auxílio de microscópios de fluorescência ou de um citômetro em fluxo excitando para isso a preparação a um comprimento de onda apropriado.

Existe uma grande escolha de fluorcromos, como por exemplo, os derivados de fluoresceína ou de rodamina. Todos não são adaptados ao acompanhamento biológico. As características essenciais são: os valores dos comprimentos de onda de excitação e de emissão para que o estudo seja realizável, um coeficiente de extinção adaptado à concentração da sonda utilizada para o estudo, o rendimento quântico que permite que se tenha um sinal importante sem perda de energia e estável no tempo, quer dizer que possui uma meia-vida bastante longa no estado excitado.

Além disso, é desejável que o fluorforo selecionado participe o menos possível a reações químicas em seu ambiente no decorrer da medição, o que levaria a uma perda de suas propriedades de fluorescência, quer dizer uma perda do sinal.

Os derivados que têm um esqueleto benzoxadiazol, chamados também benzofuranos, possuem propriedades de fluorescência exigidas. Os valores dos comprimentos de ondas utilizados para a excitação e a emissão, assim como a qualidade do fenômeno em intensidade e estabilidade, estão ligados à estrutura do composto, e de seus substituintes. Esses derivados são conhecidos, os estudos de fluorescência em função de seus substituintes assim como sua preparação são descritos (J. Chem. Soc. Perkin Trans 2, 1998, 2165, J. Chem. Soc. Perkin Trans 2, 1999, 569).

Derivados fluorescentes benzoxadiazóis para um uso biológico foram estudados (Anal. Chim. Acta, 2005, 550, 173, Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003, 13, 1717, Luminescence, 2002, 17, J. Med. Chem. 1999, 42, 3101).

O câncer é ainda uma das principais causas de mortalidade do mundo ocidental. Os meios de luta que são a prevenção, a cirurgia, a radioterapia, a imunoterapia e a quimioterapia ainda não permitem, em numerosos casos, erradicar a doença.

As razões desse insucesso repousam em parte na dificuldade de identificar a célula tumoral e de tratá-la seletivamente sem danificar demais o tecido são.

As moléculas híbridas conjugadas benzoxadiazóis - poliaminas permitem responder a essa problemática.

De fato, a célula cancerosa necessita para sua proliferação de um grande número de elementos biológicos indispensáveis entre os quais estão presentes as poliaminas (espermina, espermidina, putrescina). As poliaminas são indispensáveis para qualquer célula em proliferação. Em situação normal, a síntese endógena de poliamina basta para a célula, mas no caso das células cancerosas, um aporte exógeno de poliaminas com o auxílio de um transporte ativo é na maior parte das vezes necessário. Assim, a colocação em evidência desse transporte ativo permite detectar as células cancerosas e acompanhar a progressão das mesmas em termo de crescimento e de disseminação. No entanto, o transportador de poliamina, nas células humanas, não é, hoje, identificado ao nível molecular. O único método para demonstrar sua presença é, portanto, utilizar uma sonda reconhecida por esse transportador que, se acumulando para isso na célula, prestará contas da atividade do transportador.

O transportador de poliaminas é um complexo proteico do qual a estrutura não é conhecida nos detalhes.

Esse transportador desempenha um papel de importação intracelular das poliaminas naturais que são a putrescina, a espermidina e a espermina.

Essas poliaminas são essenciais para o desenvolvimento e para o crescimento celular. O metabolismo intracelular provê normalmente às necessidades da célula sã. Esse metabolismo fornece essas poliaminas a partir dos aminoácidos que a célula possui. A arginina se transforma em ornitina, a ornitina sofre uma descarboxilação para fornecer a putrescina. Essa putrescina (C4) pode se alongar de uma cadeia em C3 graças a uma adenosina metionina, seguido de descarboxilação, fornecendo a espermidina. Essa última pode de novo se alongar de um motivo em C3 graças também a um outro resíduo metionina, fornecendo a espermina.

Essas poliaminas também podem se degradar por oxidação com poliaminaoxidases, a assim se transformar de novo em espermidina e putrescina.

Se o mecanismo intracelular é perturbado, por uma disfunção qualquer (ex: célula cancerosa), o metabolismo intracelular não é mais suficiente para as necessidades da célula, assim ela vai se prover no exterior em poliaminas.

É aqui que o transportador de poliamina intervém. Ele desempenha um papel de alimentação e de regulação.

No caso por exemplo do composto do exemplo 27 de pedido de patente WO 2005/100363: o motivo estrutural epipodofilotoxina enxertado na espermina não parece modificar o reconhecimento do transportador de poliaminas o que permite internalizar o composto na célula tumoral, que ulteriormente desempenhará seu papel de agente citotóxico. Do mesmo modo as sondas fluorescentes que possuem um motivo poliamina serão reconhecidas pelo transportador de poliaminas.

Existe, no entanto, entre o grupo de linhagens celulares estudadas em cancerologia, uma variabilidade na expressão do transportador de poliaminas. Com o auxílio das sondas de diagnóstico, é possível identificar antecipadamente (antes de tratamento antitumoral) as células que serão sensíveis ao tratamento e aquelas que não o serão.

Quanto mais forte for a fluorescência intracelular, mais a célula em questão será sensível ao tratamento com um anticanceroso tomado como alvo (por exemplo, o composto do exemplo 27 do pedido de patente WO 2005/100363).

A presente invenção se refere, portanto, a compostos constituídos por um motivo poliamina ligado a um motivo benzoxadiazol substituído, portador da fluorescência que podem ser utilizados como tais sondas. De fato, a parte poliamina dessas moléculas será reconhecida pelo sistema de transporte das poliaminas e a molécula será internalizada dentro da célula cancerosa, enquanto o motivo portador da fluorescência será detectado pelos sistemas de análise clássicos em meio biológico, permitindo assim selecionar os tumores que expressam o sistema de transporte das poliaminas.

A colocação em evidência desse sistema de transporte das poliaminas nas células permite, portanto, selecionar os pacientes portadores de tumores suscetíveis de ser cuidados por qualquer composto anticanceroso vetorizado pelo sistema de transporte das poliaminas, qualquer que seja o mecanismo de ação.

Assim, poderá ser revelado nos tumores retirados por biopsias ou nas células leucêmicas retiradas por punção nos pacientes hospitalizados em questão, uma fluorescência proporcional à expressão do transportador de poliamina. Os pacientes portadores desses tumores poderão então ser selecionados a fim de ser tratados preferencialmente com os compostos anticancerosos vetorizados na direção do sistema de transporte das poliaminas, estando por isso assegurados de bem melhores chances de resposta ao tratamento.

A patente US n° 6,172,261 e Anal. Chim. Acta, 1983, 149, 305 descrevem poliaminas ligadas a grupos fluorforos. Mais especialmente B. R. Ware descreve em Langmuir (1988, 4, 458) um derivado de espermina com um grupo benzoxadiazol, cuja fórmula é dada abaixo, e sua utilização como derivado fluorescente de poliamina no estudo de sua interação com oligonucleotídeos.

Do mesmo modo, Ohba em (Tetrahedron, 2007, 63, 37-54) descreve um derivado de putrescina com um grupo benzoxadiazol cuja fórmula é dada abaixo:

Mas, nenhuma dessas publicações menciona a utilização dos derivados de poliamina-benzoxadiazol para colocar em evidência as células tumorais que expressam o sistema de transporte das poliaminas.

A presente invenção se refere a novos derivados fluorescentes constituídos por um motivo poliamina no qual é ligado um motivo portador da fluorescência, o benzoxadiazol substituído, seu processo de preparação e sua utilização para a colocação em evidência do sistema de transporte das poliaminas dentro das células. Ela também se refere à utilização dos mesmos para a seleção dos tumores que expressão o sistema de transporte das poliaminas assim como a utilização dos mesmos na seleção de pacientes portadores de tais tumores.

Esses derivados correspondem à fórmula 1 seguinte:

₃N-^o^z Formulai ou um sal farmaceuticamente aceitável desse último, na qual:

Ri representa um ou dois grupos NO2 na posição 4 e/ou 6, ou então um grupo SO₂Ph, SO₂NMe₂, SO₂NH₂, SO₃H;

a cadeia poliamina pode estar na posição 5, 6 ou 7;

R₂ representa um hidrogênio, uma alquila com C-|._6> uma benzila, um grupo perfluoralquila;

os valores de a, b, c podem ser de 2 a 5, independentemente uns dos outros, e representam encadeamentos alquilenos que separam os grupos aminados;

os valores de d e e podem ser independentemente de 0 ou 1, mas não podem representar ao mesmo tempo o valor 0;

com a condição de que, quando e = 0, então R₂ não pode representar um hidrogênio; e com exceção do composto para o qual R-, = 4-NO₂, R₂ = H, a = 3, b = 4, c = 3ed = e = 1.

Os compostos da presente invenção podem estar sob a forma de sais de adição minerais ou orgânicos.

Na presente invenção, entende-se por farmaceuticamente aceitável o que é útil na preparação de uma composição farmacêutica que é geralmente seguro, não-tóxico e nem biologicamente nem de outro modo não desejável e que é aceitável para uma utilização veterinária assim como farmacêutica humana.

Por sal farmaceuticamente aceitável de um composto, entende-se designar na presente invenção sais que são farmaceuticamente aceitáveis, como definido aqui, e que possuem a atividade farmacológica dese7 jada do composto parente.

Por sal de adição, entende-se mais especialmente, no sentido da presente invenção, um sal de adição de um ácido mineral ou orgânico.

A título de exemplo, podem ser citados os sais de adição ácidos formados com ácidos minerais tais como o ácido clorídrico, o ácido bromídrico, o ácido sulfúrico, o ácido nítrico, o ácido fosfórico e similares; ou formados com ácidos orgânicos tais como o ácido acético, o ácido benzenossulfônico, o ácido benzoico, o ácido canforassulfônico, o ácido cítrico, o ácido etanossulfônico, o ácido fumárico, o ácido glucoeptônico, o ácido glucônico, o ácido glutâmico, o ácido glicólico, o ácido hidroxinaftoico, o ácido 2hidroxietanossulfônico, o ácido láctico, o ácido maleico, o ácido málico, o ácido mandélico, o ácido metanossulfônico, o ácido mucônico, o ácido 2naftalenossulfônico, o ácido propiônico, o ácido salicílico, o ácido succínico, o ácido dibenzoil-L-tartárico, o ácido tartárico, o ácido p-toluenossulfônico, o ácido trimetilacético, o ácido trifluoracético e similares.

Por 4-NO2, entende-se, no sentido da presente invenção, um grupo NO2 (nitro) na posição 4.

Por alquila, entende-se, no sentido da presente invenção, uma cadeia hidrocarbonada saturada, linear ou ramificada, que compreende de 1 a 6 átomos de carbono. Em especial, pode se tratar de um grupo metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, terc-butila, isobutila, pentila ou ainda hexila.

Por perfluoralquila, entende-se, no sentido da presente invenção, um grupo alquila tal como definido acima no qual todos os átomos de hidrogênio foram substituídos por átomos de flúor.

Vantajosamente, R1 representa um ou dois grupos NO2 na posição 4, e/ou 6, e mais especialmente um grupo NO₂ na posição 4.

Mais especialmente, a presente invenção se refere aos compostos nos quais:

- R1 = 4-NO₂, R2 = alquila com C-i-6, a = 3, b = 4, c = 3, d = e = 1,

- R1 = 4-NO2, R2 = H ou alquila com C-j-e, a = 0, b = 4, c = 3, d =

0, e = 1, . r₁ = 4-NO2, R2 = H ou alquila com C-|.₆, a = 0, b = 3, c = 4, d =

0, e = 1, ou

- R-ι = 4-NO₂, R₂ = alquila com C-ι-β, a = 4, b = 0, c = 0, d = 1, e = 0.

Ainda mais especialmente a invenção se refere aos compostos seguintes:

• O N-(3-Aminopropil)-N'-{3-[metil-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol4-il)-amino]-propil}-butano-1,4-diamina que corresponde ao composto de fórmula 1 para o qual Rí = 4-NO₂, R₂ = Metila, a = 3, b = 4, c = 3, d = e = 1, • O N-(3-Aminopropil)-N'-metil-N'-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol4-il)-butano-1,4-diamina que corresponde ao composto de fórmula 1 para o qual Rí = 4-NO₂, R₂ = Metila, a = 0, b = 4, c = 3, d = 0, e = 1, • O N-(3-Aminopropil)-N'-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-il)butano-1,4-diamina que corresponde ao composto de fórmula 1 para o qual Ri = 4-NO₂, R₂ = H, a = 0, b = 4, c = 3, d = 0, e = 1, • O N*1*-{3-[metil-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-il)-amino]propil}-butano-1,4-diamina que corresponde ao composto de fórmula 1 para o qual Ri = 4-NO₂, R₂ = Metila, a = 0, b = 3, c = 4, d = 0, e = 1, • O N*1*-[3-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-il)-amino]-propil]butano-1,4-diamina que corresponde ao composto de fórmula 1 para o qual Rí = 4-NO₂, R₂ = H, a = 0, b = 3, c = 4, d = 0, e = 1, e • O N*1*-Metil-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-il)- butano-1,4diamina que corresponde ao composto de fórmula 1 para o qual Rí = 4-NO₂, R₂ = Metila, a = 4, b = 0, c = 0, d = 1, e = 0.

A invenção também se refere a um processo de síntese dos compostos de fórmula 1 caracterizado pelo fato de que ele compreende as etapas a), b) e c) seguintes:

a) Acoplamento de um derivado de benzoxadiazol de fórmula 2 ^R3

R1-ZL >%

Formula 2 na qual

Ri representa um ou 2 grupos NO2 na posição 4 e/ou 6 ou então um grupo SO₂Ph, SO₂NMe₂, SO₂NH₂₁ SO₃H; e vantajosamente um grupo NO₂ na posição 4;

R₃ representa um substituinte halogênio móvel na posição orto ou para do grupo R1, com uma poliamina de fórmula 6, na posição 5, 6 ou 7, quer dizer em orto ou para do grupo R-ι, na qual P representa um grupo protetor das funções amina e onde a, b, c, d, e e têm as mesmas significações que aquelas dadas precedentemente.

Fórmula 6

Os grupamentos protetores P podem ser grupamentos BOC (terciobutiloxicarbonila) cliváveis em meio ácido (HCI ou ácido trifluoracético (TFA)) se o grupo R1 = NO₂. Se o benzoxadiazol possui grupamentos sulfonil ou sulfamido, então p pode ser um grupamento protetor de tipo benziloxicarbonila clivável por hidrogenólise.

No decorrer dessa reação de acoplamento a poliamina reage com 0 benzoxadiazol por substituição do halogênio por tratamento com uma base em um solvente inerte.

Mais especialmente, o composto de fórmula 2 é o 4-nitro-7clorobenzoxadiazol.

Mais especialmente ainda, o solvente inerte é a acetonitrila e a base o carbonato de Césio.

Os diferentes benzoxadiazóis são descritos nas publicações seguintes: J. Chem. Soc. Perkin Trans 2, 1998, 2165, J. Chem. Soc. Perkin Trans 2, 1999, 569.

Exemplos de derivados poliamina, os derivados espermina protegidos por 3 grupos benziloxicarbonila ou terciobutiloxicarbonila, são descritos na publicação: (Tet. Let. 1998, 39, 439).

b) O composto proveniente da reação de acoplamento a) é alqui lado por um halogeneto de alquila na presença de uma base em um solvente inerte. Utilizar-se-á preferencialmente o THF (tetraidrofurano) como solvente.

De maneira preferencial, se utilizará como base o hidreto de sódio ou um carbonato alcalino.

De maneira preferencial também, se utilizará o THF como solvente.

c) O composto proveniente da etapa b) é em seguida desprotegido em meio ácido em temperatura ambiente para obter os compostos de fórmula 1.

De maneira preferencial essa etapa de desproteção é feita no ácido clorídrico ou no ácido trifluoracético.

A presente invenção se refere também à utilização dos compostos de fórmula 1 seguinte:

ou um sal farmaceuticamente aceitável desse último, na qual:

Ri representa um ou dois grupos NO₂ na posição 4 e/ou 6, ou então um grupo SO2Ph, SO2NMe2, SO2NH2, SO3H;

a cadeia poliamina pode estar na posição 5, 6 ou 7;

R₂ representa um hidrogênio, uma alquila com C1-6, uma benzila, um grupo perfluoralquila;

como sonda fluorescente de diagnóstico para a colocação em evidência dos tumores que expressam o sistema de transporte das poliaminas.

Vantajosamente, R₂ não representará um hidrogênio quando e = 0.

Vantajosamente, Ri representa um ou dois grupos NO₂ na posição 4 e/ou 6, e mais especialmente um grupo NO₂ na posição 4.

Mais especialmente os compostos de fórmula 1 úteis como sonda fluorescente de diagnóstico se referem aos compostos nos quais:

- Ri = 4-NO₂, R₂ = alquila com Ci_6, a = 3, b = 4, c = 3, d = e = 1,

- Ri = 4-NO₂, R₂ = H ou alquila com C1-6, a = 0, b = 4, c = 3, d =

0, e = 1,

- R-ι = 4-NO₂, R₂ = H ou alquila com C-|.₆, a = 0, b = 3, c = 4, d = 0, e = 1, ou

- Ri = 4-NO₂, R₂ = alquila com Ci_₆, a = 4, b = 0, c = 0, d = 1, e = 0.

Ainda mais especialmente os compostos de fórmula 1 se referem aos compostos seguintes:

• O N-(3-Aminopropil)-N'-{3-[metil-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol4-il)-amino]-propil}-butano-1,4-diamina que corresponde ao composto de fórmula 1 para o qual R-ι = 4-NO₂, R₂ = Metila, a = 3, b = 4, c = 3, d = e = 1, • O N-(3-Aminopropil)-N'-metil-N'-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol4-il)-butano-1,4-diamina que corresponde ao composto de fórmula 1 para o qual R-ι = 4-NO₂, R₂ = Metila, a = 0, b = 4, c = 3, d = 0, e = 1, • O N-(3-Aminopropil)-N'-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-il)butano-1,4-diamina que corresponde ao composto de fórmula 1 para o qual Ri = 4-NO₂, R₂ = H, a = 0, b = 4, c = 3, d = 0, e = 1, • O N*1*-{3-[metil-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-il)-amino]propil}-butano-1,4-diamina que corresponde ao composto de fórmula 1 para o qual Ri = 4-NO₂, R₂ = Metila, a = 0, b = 3, c = 4, d = 0, e = 1, • O N*1*-[3-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-il)-amino]-propil]butano-1,4-diamina que corresponde ao composto de fórmula 1 para o qual Ri = 4-NO₂, R₂ = H, a = 0, b = 3, c = 4, d = 0, e = 1, e • O N*1*-Metil-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-il)- butano-1,4diamina que corresponde ao composto de fórmula 1 para o qual Ri = 4-NO₂, R₂ = Metila, a = 4, b = 0, c = 0, d = 1, e = 0.

Os exemplos seguintes descrevem os diferentes estágios para a preparação dos compostos da invenção e não são de nenhuma maneira limitativos.

Exemplo 1: Síntese do N-(3-aminopropil)-N'-{3-ímetil-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-il)-amino1-propil}-butano-1,4-diamina.

A síntese desse composto de fórmula 1 é realizada de acordo com o esquema seguinte:

Estágio 1: Preparação da triBOC espermina de fórmula 3 (Bioorg. Med.

Chem. 2002, 10, 2397).

NH,

Fórmula 3 g de espermina são colocados em solução em 300 mL de CH₂CI₂, e resfriados a 0°C. Adicionam-se gota a gota 23,8 mL de trifluoracetato de etila em solução em 50 mL de CH₂CI₂. A solução sob agitação é deixada 1 hora em seguida em temperatura ambiente. O resíduo obtido é cole tado em 600 mL de THF, introduz-se aí 140,28 mL de trietilamina. Uma solu ção de 174,78 g de BOC2O em 200 mL de THF é então introduzida mantendo-se a temperatura a 20°C. A agitação em temperatura ambiente é mantida ainda três horas, e depois 0 meio de reação é derramado sobre água e extraído com o éter isopropílico. Depois de decantação, secagem em sulfato de sódio, filtração e evaporação, a solução orgânica é evaporada. O resíduo obtido é então coletado em 900 mL de uma mistura MeOH/H₂O 8/2. Adicionam-se 192,6 g de carbonato de Césio e leva-se tudo em refluxo durante três horas. Depois de evaporação do metanol sob pressão reduzida, adiciona-se água e extrai-se com éter isopropílico. Decanta-se a fase orgânica, e depois introduz-se nessa fase orgânica ácido clorídrico 0,5 N. Deixa-se decantar. Aparecem 3 fases. A fase do meio sob a forma oleosa contém o produto esperado sob a forma de cloridrato. Decanta-se essa fase, e depois ela é coletada com CH2CI2, e seca-se em sulfato de sódio. Depois de filtração e evaporação, obtêm-se 54 g do cloridrato da triBOC espermina sob a forma de um óleo incolor utilizado diretamente na etapa seguinte (Rdt = 50%). CCM SiO₂: CH₂CI₂-MeOH-NH₄OH (90-10-10) Rf = 0,5.

Estágio 2: Condensação com o fluorforo

5,39 g do óleo obtido no estágio 1 são colocados em solução em 100 mL de acetonitrila, de 6,42 g de carbonato de Césio e de 2 g de 4-cloro7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol sob agitação. A mistura é levada em refluxo durante uma hora. O meio de reação é fixado em sílica e o solvente é evaporado. O resíduo sólido é colocado no topo de coluna de cromatografia rápida, e eluído com um gradiente que parte do heptano puro à mistura heptanoAcOEt (50-50). Obtêm-se então 4,4 g (66%) de um óleo vermelho. CCM: SiO₂ Heptano/AcOEt (50-50) Rf = 0,3. SM (APCI) m/z = 666,3 (MH+); ¹H RMN (CDCI3): 8,47 (d, 1H, J = 8Hz, H₅), 7,96 (m, 1H, NH), 6,17 (d, 1H, J = 8Hz, H₆), 3,53 (m, 2H, NHCH₂), 3,38 (m, 2H, CH₂NH), 3,10-3,21 (m, 8H, NCH₂), 1,92 (m, 2H, CH₂), 1,66 (m, 2H, CH₂), 1,43-1,51 (m, 31H, CH₂₁ t-Bu). Estágio 3: Alquilação em R₂. Preparação do éster terciobutílico do ácido (3{t-butoxicarbonil-[4-(t-butoxicarbonil-3{-[metil-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4il)-amino]-propil}-amino)-butil]-amino}-propil)-carbâmico de fórmula 5.

O composto obtido no estágio precedente (4,4 g) é dissolvido em

150 mL de acetonitrila, na presença de 4 g de carbonato de Césio e 2,05 mL de iodeto de metila. O meio de reação é agitado em temperatura comum durante quatro horas. O meio é fixado em sílica por evaporação do solvente e depois cromatografado em uma coluna rápida de diâmetro 50 mm. Por eluição em gradiente a partir do heptano puro à mistura heptaho-AcOEt (5050), obtém-se 4,2 g de um óleo vermelho (RDT = 93%). CCM: Heptano/AcOEt (30-70) Rf = 0,4. SM (ESI) m/z = 680,4 (MH+); ¹H RMN (DMSO): 8,48 (d, 1H, J = 8Hz, H₅), 6,40 (d, 1H, J = 8Hz, H₆), 3,47 (m, 2H, NHCH₂), 3,33 (s, 3H, NCH₃), 3,24 (m, 2H, CH₂NH), 3,15 (m, 2H, NCH₂), 3,08 (m, 4H, NCH₂), 2,88 (m, 2H, NCH₂), 1,91 (m, 2H, CH₂), 1,54 (m, 2H, CH₂), 1,36 (m, 31H, CH₂, t-Bu).

Estágio 4:

4,2 g do composto do estágio precedente são dissolvidos em 20 mL de uma solução 4M de HCI no dioxano e mantidos três horas sob agitação em temperatura comum. O precipitado alaranjado cloridrato é então filtrado, enxaguado com metanol e depois com éter etílico. Depois de secagem sob pressão reduzida, obtém-se 2,8 g (92%) de sal do N-(3aminopropil)-N'-{3-[metil-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-il)-amino]-propil}butano-1,4-diamina de fórmula 1. F = 260°C. SM (ESI) m/z = 380,2 (MH+); ¹H RMN (D₂O): 8,50 (d, 1H, J = 8Hz, H₅), 6,41 (d, 1H, J = 8Hz, H₆), 4,27 (m, 2H, NHCH₂), 3,54 (s, 3H, NCH₃), 3,11- 3,27 (m, 10H, CH₂NH), 2,26 (m, 2H, CH₂), 2,11 (m, 2H, CH₂), 1,82 (m, 4H, CH₂).

Do mesmo modo, os compostos de fórmula 1 nos quais d = 0, e = 1 e b = 3, c = 4 ou então b = 4 e c = 3, podem ser preparados de acordo com a mesma metodologia utilizando-se a espermidina diprotegida. Os diferentes métodos utilizados para preparar essas poliaminas protegidas de fórmula 6 (P = benziloxicarbonila ou então terciobutiloxicarbonila) são ou descritos no pedido de patente WO 2005/100363, ou indicados nas publicações mencionadas.

Exemplo 2: Síntese da N-1-(7-Nitrobenzof1,2,51oxadiazol-4-il1butano-1,4diamina.

νο₂

Esse composto é descrito na publicação de Ohba & al seguinte: (Tet. 2007, 63, 3754).

Ele é sintetizado de acordo com a presente invenção pelo processo seguinte:

Estágio 1:

Levar em refluxo 30 minutos, em 5 mL de acetonitrila, uma mistura constituída por 200 mg de 4-cloro-7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol e por 190 mg de éster terciobutílico do ácido (4-aminobutil)-carbâmico, e 320 mg de carbonato de Césio. Depois de resfriamento o meio é vertido na água e extraído com acetato de etila. Decantar e secar a fase orgânica em sulfato de sódio. Filtrar e evaporar sob pressão reduzida. Uma cromatografia rápida em sílica eluída com um gradiente do heptano puro ao acetato de etila puro em 30 minutos, permite isolar depois de evaporação 280 mg (rdt 80%) do éster terciobutílico do ácido [4-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-ilamino)-butil]carbâmico sob a forma de um óleo. CCM SiO₂: Heptano-AcOET (30-70), Rf = 0,5. SM (ESI) m/z = 352,1 (MH+); ¹H RMN (DMSO): 9,55 (s, 1H, NH), 8,50 (d, 1H, J = 8Hz, H₅), 6,83 (m, 1H, NH), 6,42 (d, 1H, J = 8Hz, H₆), 3,47 (m, 2H, NHCH₂), 2,96 (m, 2H, CH₂NH), 1,66 (m, 2H, CH₂), 1,48 (m, 2H, CH₂), 1,36 (s, 9H, t-Bu).

Estágio 2:

280 mg do carbamato obtido no estágio precedente são colocados em solução em 15 mL de cloreto de metileno e 2 mL de ácido trifluoracético, e depois agitados durante 15 minutos em temperatura ambiente. Depois de evaporação, o resíduo oleoso obtido é cristalizado no éter isopropílico. Isolam-se 150 mg (rdt 51%) de trifluoracetato de N-1(7nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-il]butano-1,4-diamina. CCM SiO₂: CH₂Ci₂MeOH-NH₄OH (90/10/1), Rf = 0,7. SM (ESI) m/z = 252,1 (MH+); ¹H RMN (DMSO): 9,54 (s, 1H, NH), 8,53 (d, 1H, J = 8Hz, H₅), 7,70 (s, 2H, NH₂), 6,44 (d, 1H, J = 8Hz, H₆), 3,50 (m, 2H, NHCH₂), 2,84 (m, 2H, CH₂NH), 1,59-1,76 (m, 4H, CH₂CH₂).

Exemplo 3: Síntese da N-(3-Aminopropil)-N'-[3-(7-metilbenzo[1,2,51-

Estáqio 1:

250 mg de triBOC espermina obtida no estágio 1 do exemplo 1 são colocados para reagir com 100 mg de dimetilamida do ácido 4fluorbenzo[1,2,5]oxadiazol-4-sulfônico na presença de 0,17 mL de trietilamina em 10 mL de acetonitrila sob agitação em temperatura comum durante 30 minutos. O meio de reação é derramado sobre água acidificada com HCI e extraído com acetato de etila. Depois de decantação e lavagem da fase orgânica com água saturada de NaCI, a solução é secada em NaSO₄, filtrada e evaporada. Obtêm-se 250 mg de um óleo amarelo (Rdt = 84%). SM (ESI) m/z = 728,5 (MH+); ¹H RMN (DMSO): 7,83 (d, 1H, J = 8Hz, H₅), 6,30 (d, 1H, J = 8Hz, H₆), 3,35 (m, 2H, NHCH₂), 2,68 (s, 6H, NMe₂), 3,23 (m, 2H, CH₂N), 3,14 (m, 6H, CH₂N), 2,87 (m, 2H, NCH₂), 1,86 (m, 2H, CH₂), 1,55 (m, 2H, CH₂), 1,36 (m, 31H, CH₂, t-Bu).

Estágio 2:

250 mg do composto protegido precedentemente obtido são agitados em temperatura ambiente durante 30 minutos em 2 mL de acido trifluoracético e 10 mL de CH₂CI₂. Depois de evaporação, cristaliza-se com um rendimento quantitativo 260 mg de trifluoracetato de N(3-aminopropil-N'-[3(7-metilbenzo[1,2,5]oxadiazol-4-ilamino)-propil]butano-1-4-diamina no éter isopropílico, com traços de acetona. SM (ESI) m/z = 428,3 (MH+); ¹H RMN (DMSO): 7,84 (d, 1H, J = 8Hz, H₅), 6,37 (d, 1H, J = 8Hz, H₆), 2,85-3,05 (m, 12H, NHCH₂), 2,70 (s, 6H, NMe₂), 2,00 (m, 2H, CH₂), 1,90 (m, 2H, CH₂), 1,62 (s, 4H, CH₂).

Exemplo 4: Estudo farmacolóqico

1. Seletividade das sondas em relação às células tumorais.

As células provenientes de biópsias são dissociadas mecanicamente na presença ou não de tripsina de acordo com a constituição do tecido considerado. As células hematopoiéticas são separadas isoladas de acordo com os métodos de preparação clássicos das células sanguíneas. Uma vez isoladas em um tempo suficientemente curto para assegurar a viabilidade das células estudadas, as células são colocadas em presença da sonda tal como sintetizada, por exemplo, nos exemplos 1 a 3 e deixadas incubadas no meio de cultura recomendado para o tecido considerado na presença de aminoguanidina. A aminoguanidina permite evitar a desnaturação in vitro das poliaminas. Se procederá na ausência de soro (rico demais em poliamina e portanto fonte de erro de medição). Uma incubação de uma a quatro horas é suficiente e permite uma detecção da fluorescência por imunoquímica ou por citometria em fluxo escolhendo-se os comprimentos de onda de excitação e de emissão compatíveis com o substituinte da sonda fluorescente. Essa análise é realizada por um citômetro em fluxo ou por histoquímica de acordo com uma metodologia padrão excitando-se, no estudo abaixo a sonda obtida no exemplo 1, o N-(3-aminopropil)-N'-{3-[metil-(7nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-il)-amino]-propil}-butano-1,4-diamina com uma fonte de 488 nm e medindo-se a emissão de fluorescência a 525 nm. Nesse mesmo exemplo, células A549 derivadas de um tumor humano de um câncer do pulmão não de pequenas células foram testadas em comparação com células MRC-5 provenientes de um pulmão são e disponíveis comercialmente junto a bancos de linhagens celulares.

Resultados:

A figura 1 anexa dá as imagens obtidas por um microscópio de fluorescência padrão das células cultivadas em lâmina. Ela mostra uma incorporação bem superior da sonda do exemplo 1 nas células tumorais (Figura 1A) do que nas células provenientes de tecidos sãos (Figura 1B). Esse diferencial foi também confirmado por citometria em fluxo.

Esse resultado confirma o interesse de utilizar os compostos da presente invenção como sonda fluorescente de diagnóstico que permite se lecionar os tumores elegíveis para um tratamento com um composto anticanceroso vetorizado pelo transportador de poliaminas.

2. Preditividade da resposta aos agentes anticancerosos vetorizados na direção do sistema de transporte das poliaminas.

A fim de comparar a incorporação das sondas tais como descritas acima e assim demonstrar o caráter preditivo da resposta aos agentes vetorizados na direção do sistema de transporte das poliaminas, uma medição da citotoxicidade por um método padrão (aqui a medição do ATP residual com o auxílio do kit ATPlite da empresa Perkin-Elmer) foi realizada. Se utilizará um composto anticanceroso derivado da epipodofilotoxina cuja penetração intracelular depende do transportador de poliamina, tal como o composto descrito no exemplo 27 do pedido de patente WO 2005/100363 e a título de referência, a etoposida, uma epipodofilotoxina não vetorizada. Esses 2 compostos têm o mesmo mecanismo de ação sobre as células cancerosas: são ambos inibidores da topoisomerase 2.

Um grupo de linhagens leucêmicas foi testado a fim de prestar conta da incorporação de sonda, aqui aquela descrita no exemplo 1, em referência à sensibilidade a um agente vetorizado tal como o composto do exemplo 27 do pedido de patente WO 2005/100363 e em comparação com a etoposida não vetorizada. Depois de 72 horas de incubação com o composto do exemplo 27 do pedido de patente WO 2005/100363 ou a etoposida, a citotoxicidade é avaliada com o auxílio do kit ATPlite. As células de mesma linhagem foram também incubadas na presença da sonda descrita no exemplo 1, e foram analisadas por citometria em fluxo. A intensidade de fluorescência medida a 525 nm foi acompanhada de 0 a 1 hora 30 minutos e a inclinação da variação de intensidade foi calculada.

Resultados:

Em um primeiro tempo a comparação da citotoxicidade do composto do exemplo 27 do pedido de patente WO 2005/100363 e da etoposida de modo de ação similar, permitiu, pelo estabelecimento de uma relação dos IC50, identificaras leucemias para as quais a vetorização tinha um papel preponderante na eficácia do composto.

Para o conjunto das linhagens testadas, a capacidade de incorporar a sonda fluorescente, caracterizada pela fluorescência medida por citometria de fluxo é também medida.

Esses resultados são dados na tabela 1 seguinte:

Tabela 1

Linhagem celular	Citotoxicidade da Etoposida ΙΟ₅₀(μΜ)	Citotoxicidade do composto do exemplo 27 de WO 2005/100363 IC₅₀(μΜ)	Relação de IC₅o Etoposida/composto do exemplo 27 de WO 2005/100363	Atividade de transporte das poliaminas*
CEM	0,06	0,003	20	421
BL-4	0,4	0,009	44	164
BLUE-1	1	0,1	10	58
U-937	0,4	0,04	10	33
KG-1	5	5	1	17

* Unidade arbitrária de intensidade de fluorescência: (intensidade das células na presença de sonda) - (intensidade das células na ausência de sonda).

Aparece claramente que a intensidade de fluorescência é a mais forte nas células para as quais a vetorização é também importante.

Em conclusão, o fato de medir a incorporação da sonda permite predizer uma melhor eficácia e uma melhor seletividade antitumoral de um composto anticanceroso tal como o composto do exemplo 27 do pedido de patente WO 2005/100363. Esses resultados demonstram que o acompanhamento da incorporação da sonda permite identificar células leucêmicas que dispõem de um grande transporte ativo das poliaminas, e consequentemente que são suscetíveis de ser tratadas eficazmente pelos compostos anticancerosos vetorizados pelo transportador de poliaminas.

O diferencial obtido por citometria em fluxo é comparável àquele visualizado por histoquímica. É possível realizar um teste mais simples só medindo para isso a fluorescência em um tempo dado. Isso foi verificado realizando-se essa medição de fluorescência depois de 1 hora 30 minutos de incubação somente. Isso pode apresentar uma vantagem em um quadro hospitalar para trazer uma resposta rápida à seleção de células respondedo20 ras.

Por extensão, tais medidas podem se aplicar a blastos de pacientes retirados por retirada de sangue ou punção de medula no decorrer das análises de rotina. A medição da intensidade de fluorescência será realizada 5 por um procedimento de rotina por citometria de fluxo ou histoquímica em todos os hospitais que dispõem de uma plataforma de citologia e/ou de anatomopatologia.

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Uso de um composto de fórmula geral 1:

ou um sal farmaceuticamente aceitável desse último, na qual:

Ri representa um ou dois grupos NO2 na posição 4 e/ou 6;

a cadeia poliamina pode estar na posição 5, 6 ou 7;

R2 representa um hidrogênio, uma alquila com C1-6, uma benzila, um grupo perfluoralquila;

os valores de d e e podem ser independentemente de 0 ou 1 mas não podem representar ao mesmo tempo o valor 0;

dito uso sendo caracterizado pelo fato de ser como sonda fluorescente de diagnóstico para a colocação em evidência dos tumores que expressam o sistema de transporte das poliaminas.

2. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula geral 1:

ou um sal farmaceuticamente aceitável desse último, na qual:

R1 representa um ou dois grupos NO2 na posição 4 e/ou 6; a cadeia poliamina pode estar na posição 5, 6 ou 7;

Petição 870190058117, de 24/06/2019, pág. 9/20

com a condição de que, quando e = 0, então R2 não pode representar um hidrogênio; e com exceção do composto para o qual Ri = 4-NO2, R2 = H, a = 3, b = 4, c = 3 e d = e = 1.

3. Composto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que Ri = 4-NO2, R2 = alquila com C1-6, a = 3, b = 4, c = 3, d = e = 1.

4. Composto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que Ri = 4-NO2, R2 = H ou alquila com C1-6, a = 0, b = 4, c = 3, d = 0, e = 1.

5. Composto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que Ri = 4-NO2, R2 = H ou alquila com C1-6, a = 0, b = 3, c = 4, d = 0, e = 1.

6. Composto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que Ri = 4-NO2, R2 = alquila com C1-6, a = 4, b = 0, c = 0, d = 1, e = 0.

7. Composto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de ser o N-(3-Aminopropil)-N'-{3-[metil-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-il)amino]-propil}-butano-1,4-diamina, no qual:

Ri = 4-NO2, R2 = Metila, a = 3, b = 4, c = 3, d = e = 1.

8. Composto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de ser o N-(3-Aminopropil)-N'-metil-N'-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-il)butano-1,4-diamina, no qual:

Ri = 4-NO2, R2 = Metila, a = 0, b = 4, c = 3, d = 0, e = 1.

9. Composto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de ser o N-(3-Aminopropil)-N'-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-il)-butano1,4-diamina, no qual:

Petição 870190058117, de 24/06/2019, pág. 10/20

Ri = 4-NO2, R2 = H, a = 0, b = 4, c = 3, d = 0, e = 1.

10. Composto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de ser o N*1*-{3-[metil-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-il)-amino]propil}-butano-1,4-diamina, no qual:

Ri = 4-NO2, R2 = Metila, a = 0, b = 3, c = 4, d = 0, e = 1,

11. Composto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de ser o N*1*-[3-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-il)-amino]-propil]butano-1,4-diamina, no qual:

R1 = 4-NO2, R2 = H, a = 0, b = 3, c = 4, d = 0, e = 1.

12. Composto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de ser o N*1*-Metil-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-il)- butano-1,4diamina, no qual:

R1 = 4-NO2, R2 = Metila, a = 4, b = 0, c = 0, d = 1, e = 0.

13. Processo de síntese de um composto de fórmula 1, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:

a) Acoplamento de um derivado de benzoxadiazol de fórmula 2

R1-ZL

Fórmula 2 na qual R1 representa um ou 2 grupos nitro na posição 4 e/ou 6;

R3 representa um substituinte halogênio móvel na posição 7, com uma poliamina de fórmula 6 na qual P representa um grupamento protetor das funções amina e onde a, b, c, são compreendidos entre 2 e 5, independentemente uns dos outros, e onde d e e podem ser independentemente 0 ou 1;

Fórmula 6

Petição 870190058117, de 24/06/2019, pág. 11/20

b) Alquilação do composto proveniente da reação de acoplamento

a) com um halogeneto de alquila na presença de uma base em um solvente inerte; e

c) desproteção do composto proveniente da etapa b) em meio

5 ácido em temperatura ambiente para obter o composto de fórmula 1.