BRPI0811492B1 - Method for producing an acidified dairy drink, acidified milk drink, and polyepeptide isolated with acidity desamidase - Google Patents

Description

“MÉTODO PARA PRODUZIR UMA BEBIDA LÁCTEA ACIDIFICADA, BEBIDA LÁCTEA ACIDIFICADA, E, POLIPEPTÍDEO ISOLADO COM ATIVIDADE DESAMIDASE” REFERÊNCIA A UMA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

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REFERÊNCIA A UM DEPÓSITO DE MATERIAL BIOLÓGICO

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CAMPO TÉCNICO A presente invenção se refere a um método para a produção de uma bebida láctea acidificada usando uma enzima a qual reduz o ponto isoelétrico das proteínas do leite. A invenção também se refere a uma nova enzima com atividade desamidase e uso da mesma na produção de uma bebida láctea acidificada.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO O mercado de bebidas lácteas acidificadas, o qual inclui bebidas lácteas fermentadas e iogurte líquido, tem crescido em todo o mundo e existe interesse na melhora da qualidade e economia deste produto.

Bebidas lácteas acidifícadas são geralmente produzidas pela mistura de leite acidifícado com uma solução de xarope de açúcar, e pela submissão da mistura a um tratamento de homogeneização. A acidificação pode ocorrer através da adição de uma substância química, tal como gluconodeltalactona (GDL), ou ela pode ser causada pela fermentação do leite com bebida láctea ácida. Entretanto, quando tais produtos são armazenados, a caseína, um ingrediente do leite, geralmente se precipita ou associa e agrega, e como resultado as bebidas tendem a separar de modo que o soro do leite líquido se acumula na superfície. Este processo, o qual é comumente referido como sinerese, reduz a qualidade das bebidas lácteas acidificadas.

Pectina, amido, amido modificado, CMC, etc. são geralmente usados como estabilizantes em bebidas lácteas acidificadas, porém devido ao custo relativamente alto de tais estabilizantes, existe interesse na descoberta de outras e, provavelmente, ainda melhores soluções. É, consequentemente, um objeto da invenção fornecer um método para a produção de uma bebida láctea acidificada estável onde a separação em coalho e soro durante o armazenamento é reduzida. O objetivo é fornecer um método alternativo para a estabilização para ou complementar ou substituir parcialmente o uso de estabilizantes usados na técnica hoje em dia.

Enzimas as quais são capazes de reduzir o ponto isoelétrico de proteínas de uma forma que não altere o comprimento da cadeia de aminoácidos da proteína são conhecidas na técnica. Por exemplo, enzimas removedoras de grupos amida as quais aumentam a carga negativa das proteínas atuando nos grupos amida para gerar grupo carboxila foram descobertas (EP976829, US6756221), A desamidação das proteínas do leite por tais enzimas é descrita (W02006075772, JP2003250460, W02002068671). Essas publicações ensinam que proteínas, por exemplo proteínas do leite, podem ser desamidadas para melhorar a faixa de propriedades quando as proteínas modificadas são usadas em itens alimentícios, por exemplo, produtos derivados do leite contendo tais proteínas modificadas são reportados como apresentando melhor sabor e textura. Entretanto, essas publicações não reportam nada sobre o uso das enzimas modificadoras de proteínas na produção de bebidas lácteas acidificadas. SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção descobriu surpreendentemente que a sinerese das bebidas lácteas acidificadas pode ser reduzida pela adição de uma enzima durante a produção do produto, o que reduz o ponto isoelétrico da caseína no leite.

Consequentemente, a presente invenção se refere a um método para a produção de uma bebida láctea acidificada, o referido método compreendendo: a) a acidificação de um substrato do leite compreendendo proteína do leite; e b) o tratamento com uma enzima com atividade modificadora de proteína a qual reduz o ponto isoelétrico da proteína do leite; em que o estágio b) é efetuado antes,durante ou depois do estágio a).

Além disso, os inventores identificaram uma enzima nova com atividade desamidase a qual é aplicável no método da invenção.

Em outro aspecto, a invenção consequentemente se refere a um polipeptídeo isolado com atividade desamidase, selecionado do grupo consistindo de: a) um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos a qual é pelo menos 91% idêntica à SEQ ID NO: 2, ou (ii) aminoácidos 133-318 dos mesmos; b) um polipeptídeo o qual é codificado por um polinucleotídeo o qual é pelo menos 90% idêntico à (i) SEQ ID NO: 1, ou (ii) nucleotídeos 397-954 dos mesmos; c) um polipeptídeo o qual é codificado por um polinucleotídeo cujo complemento hibridiza sob condições altamente estringentes com os nucleotídeos 397-954 da SEQ ID NO: 1; d) um polipetídeo o qual é codificado pelo plasmídeo contido em£. coli DSM 19445; e e) um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos modificada por substituição, eliminação e/ou inserção de um ou vários aminoácidos em (i) SEQ ID NO: 2 ou (ii) aminoácidos 133-318 dos mesmos.

BREVE DESCRIÇÃO DA FIGURA

Figura 1 mostra um gel IEF marcado com coomassie com caseína tratada com desamidase. As amostras a seguir forma carregadas no gel IEF (da esquerda): Raia 1: marcador IEF; Raia 2: caseína tratada com sobrenadante do clone da desamidase; Raia 3: caseína tratada com o sobrenadante preparado para carregar em IEF preparativo (esta amostra é diluída cerca de 4 vezes em comparação com a raia 2); Raias 4 a 11: caseína tratada com grupos de frações do IEF preparativo (grupo 4 (raia 7) contém a enzima desamidase); Raia 12 é o padrão de caseína. DESCOBERTA DETALHADA DA INVENÇÃO Bebidas lácteas acidificadas “Bebidas lácteas acidificadas” de acordo com a presente invenção, inclui quaisquer produtos bebíveis à base de substratos lácteos acidificados os quais podem ser produzidos de acordo com o método da invenção. A acidificação pode ocorrer devido à adição de uma substância química, tal como ácido lático, ácido cítrico ou gluconodeltalactona (GDL), ou isto pode ocorrer através da fermentação com microorganismo. Bebidas lácteas acidificadas incluem bebidas lácteas fermentadas e bebidas de iogurte líquido.

Bebidas lácteas acidificadas de acordo com a invenção são bebíveis no sentido de que elas estão na forma líquida e são consumidas como bebidas, isto é, elas são adequadas para serem bebidas ao invés de serem comidas com colher. “Na forma líquida” significa que os produtos estão no estado fluido da matéria, exibindo dessa forma uma pronta característica de fluxo. Deste modo, a forma de um líquido é geralmente determinada pelo recipiente que é preenchido por ele, ao contrário, por exemplo, de uma substância tipo gel, a qual é macia porém não fluidizante, tal com por exemplo iogurte ou pudim.

Uma bebida láctea acidificada de acordo com a presente invenção pode ter uma viscosidade a qual é menor do que 40 Pa (obtida em uma taxa de cisalhamento de 300 pr.s), preferivelmente menor do que 30 Pa, mais preferivelmente menor do que 20 Pa, e ainda mais preferivelmente entre 15 e 20 Pa em uma taxa de cisalhamento de 300 pr.s A viscosidade das bebidas lácteas acidificadas pode ser determinada da seguinte maneira: Princípio: este método se baseia na caracterização de textura por medição viscosimétrica (taxa constante). Através da medição de taxa constante, a viscosidade e a taxa de cisalhamento são registradas em função da taxa de cisalhamento. Os parâmetros selecionados e calculados a partir das curvas de fluxo são extraídos.

Materiais: Reômetro StressTech com sistema de medição CC 25 (“bop/cup”).

Procedimento: Antes do início das medições, as amostras devem ser ajustadas até a temperatura correta de 13°C.

Uma curva de fluxo é registrada através do aumento da deformação (taxa de cisalhamento: 0.2707 a 300 s'1) seguido por uma redução da deformação (taxa de cisalhamento: 300 a 0,2707 s'1).

Ajustes: Força normalr • Método: To Gab • Força de carga máxima: 10N • Início da medição quando a força normal estava abaixo de: 10N • Fim do tempo: 1000 s. • Altura da amostra aproximada: 1.000 mm Taxa de cisalhamento: • 21 estágios - para cima e para baixo: 0,2707 - 0,3304 -0,4923 - 0,7334 - 1 -2 - 4 - 6 - 10 - 25 - 50 - 75 - 100 - 125 - 150 - 175 - 200 - 225 - 250 - 275 - 300. • Tempo de atraso: 5 s. • Tempo de integração: 10 s.

Temperatura e tempo: • Tempo de equilíbrio: - • Manual: 1 repetição • Controle manual: 13°C

• Temperatura após a medição: 13°C

Posição avançada: • Resolução de posição: 85 y rad • Aproximação para o estado constante, intervalo +-: 0,010 • Resistência: 60% • Curva de referência: desligado Uma bebida láctea acidificada de acordo com a presente invenção pode ter um pH menor do que 4,6, preferivelmente menor do que 4,4, mais preferivelmente menor do que 4,2 e ainda mais preferivelmente pH de cerca de 4 ou menos. Em um aspecto, a bebida láctea acidificada tem um pH menor do que 3,8, tal como menor do que 3,6.

Uma bebida lacta acidificada de acordo com a invenção pode ter um teor de gordura de 0 a 2% preferivelmente menor do que 1,5%, menor do que 1%, menor do que 0,5% ou de cerca de 0,1% ou menos. A bebida lacta acidificada pode ter um conteúdo sem gordura sólido no leite menor do que 20%, preferivelmente menor do que 8,5%, menor do que 8%, menor do que 7,5%, menor do que 7%, menor do que 6,5%, menor do que 6% ou de cerca de 5%.

Uma bebida láctea acidificada de acordo com a invenção pode ter um teor de proteína no leite menor do que cerca de 8%, preferivelmente menor do que 4%, menor do que 3,5% ou menor do que 3%. Em um aspecto preferido, a bebida láctea acidificada tem um teor de proteína no leite de cerca de 2,5 até cerca de 3%. Em outro aspecto preferido, a bebida láctea acidificada tem um teor de proteína no leite menor do que 2%, preferivelmente um teor de proteína no leite de cerca de 1%.

Uma bebida láctea acidificada de acordo com a invenção pode ter uma vida prateleira maior do que 7 dias, preferivelmente maior do que 14 dias, mais preferivelmente maior do que 28 dias, tal como maior do que 3 meses.

Preferivelmente, a bebida láctea acidificada de acordo com a presente invenção tem maior estabilidade. A estabilidade pode ser determinada depois de ter armazenado a bebida láctea acidificada por um número apropriado de dias, através da medição da altura do soro do leite acumulado na superfície devido à sinerese. Ela também pode ser determinada depois da sinerese acelerada, tal como por centrifugação. Método para produzir uma bebida láctea acidificada Conforme mencionado acima, o método para produzir uma bebida láctea acidificada de acordo com a presente invenção compreende: a) a acidificação de um substrato do leite compreendendo proteína do leite; e b) o tratamento com uma enzima com atividade modificadora de proteína a qual reduz o ponto isoelétrico da proteína do leite; em que o estágio b) é efetuado antes,durante ou depois do estágio a). “Substrato de leite”, no contexto da presente invenção, pode ser qualquer material de leite bruto e/ou processado que possa ser submetido à acidificação de acordo com o método da invenção. Deste modo, substratos de leite úteis incluem, porém não estão limitados, às soluções/suspensões de qualquer leite ou produtos tipo leite compreendendo proteína do leite, tal como leite com baixo teor de gordura ou integral, leite desnatado, leitelho, leite em pó reconstituído, leite condensado, leite seco, leite desidratado, soro de leite, permeado de soro de leite, lactose, líquido mãe da cristalização da lactose, concentrado de proteína do soro do leite ou creme. Obviamente, o substrato do leite pode ser originado de qualquer mamífero.

Preferivelmente, o substrato de leite é uma solução/suspensão de lactose e mais preferivelmente o substrato é leite. Em uma modalidade preferida, o substrato de leite é uma solução aquosa de leite em pó desnatado. O substrato de leite compreende proteína do leite, por exemplo, caseína e proteína do soro de leite. “Proteína do leite! no contexto da presente invenção pode ser qualquer proteína que ocorra naturalmente no leite. Ao se referir à proteína do leite na bebida láctea acidificada, a proteína do leite inclui a proteína do leite enzimaticamente modificada. O termo “leite” é para ser entendido como a secreção láctea obtida pela ordenha de qualquer mamífero, tais como vacas, ovelhas, cabras, búfalos ou camelos.

Em uma modalidade, o substrato de leite pode ser mais concentrado do que leite cru e ele pode, portanto, ter um teor de proteína maior do que 5%, preferivelmente maior do que 6%, maior do que 7%, maior do que 8%, maior do que 9% ou maior do que 10%, e um teor de lactose maior do que 7%, preferivelmente maior do que 8%, maior do que 9% ou maior do que 10%.

Antes da acidifícação, o substrato de leite pode ser homogeneizado e pasteurizado de acordo com os métodos conhecidos na técnica. “Homogeneização”, conforme aqui utilizado, significa a mistura intensiva para obter uma suspensão ou emulsão solúvel. Se a homogeneização for efetuada antes da acidifícação, ela pode ser efetuada de modo a quebrar a gordura do leite em tamanhos pequenos de modo que ela não mais se separe do leite. Isto pode ser conseguido forçando o leite sob alta pressão através de pequenos orifícios. “Pasteurização”, conforme aqui utilizado, significa aquecer até e manter em uma temperatura alta especificada por um período de tempo especificado. Tal alta temperatura pode ser, por exemplo, de pelo menos 65°C, pelo menos 70°C, pelo menos 75°C, pelo menos 80°C, pelo menos 85°C, pelo menos 90°C ou pelo menos 95°C, e o substrato do leite pode ser mantido em tal alta temperatura, por exemplo, por pelo menos 15 s, pelo menos 20 s, pelo menos 30 s, pelo menos 5 minutos ou pelo menos 10 minutos. Tal pasteurização pode reduzir ou eliminar a presença de organismos vivos, tais como microorganismos, no substrato do leite. A pasteurização do substrato do leite pode também desnaturar totalmente ou parcialmente parte da proteína do leite. Se for efetuada depois do tratamento enzimático, a pasteurização também pode inativar a enzima. Um estágio de esfriamento rápido pode vir a seguir.

No método da presente invenção, o substrato do leite é acidificado. Tal acidificação pode ser uma acidificação química, tal como pela adição de um ácido, tal como ácido lático ou ácido cítrico ou gluconodeltalactona (GDL), a qual é um éster cíclico do ácido D-glucônico comumente usado para a acidificação de alimentos.

Em um aspecto preferido do método da invenção, a acidificação compreende a fermentação do substrato do leite com um microorganismo. “Fermentação”, no método da presente invenção significa a conversão dos carboidratos em alcoóis ou ácidos através da ação de um microorganismo. Preferivelmente, a fermentação no método da presente invenção compreende a conversão de lactose em ácido lático.

No contexto da presente invenção, “microorganismo” pode incluir qualquer bactéria ou fungo capaz de fermentar o substrato do leite.

Os microorganismos usados para a maior parte dos produtos de leite fermentados são selecionados do grupo de bactérias geralmente referido como bactérias do ácido lático. Conforme aqui utilizado, o termo “bactérias do ácido lático” designa uma bactéria gram-positiva, microaerófila ou anaeróbica a qual fermenta o açúcar com a produção de ácidos incluindo ácido lático como o ácido predominantemente produzido, ácido acético e ácido propiônico. As bactérias do ácido lático mais úteis industrialmente são encontradas na ordem dos “Lactobacillales”, a qual inclui Lactococcus spp., Streptococcus spp., Lactobacülus spp., Leuconostoc spp., Pseudoleuconostoc spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp., Enterococcus spp. e Propionibacterium spp. Adicionalmente, bactérias produtoras de ácido lático pertencentes ao grupo de bactérias anaeróbicas estritas, bifidobactérias, isto é, Bifidobacterium spp., as quais são frequentemente usadas como culturas de alimentos sozinhas ou em combinação com as bactérias do ácido lático são geralmente incluídas no grupo de bactérias do ácido lático.

Bactérias do ácido lático são geralmente fornecidas para a indústria leiteira ou como culturas congeladas ou liofilizadas para a propagação iniciadora da massa ou como culturas chamadas “Direct Vat Set” (DVS), tencionadas para a inoculação direta em um frasco de fermentação ou tanque para a produção de produtos laticínios, tal como uma bebida láctea acidificada. Tais culturas são geralmente referidas como “culturas de partida” ou “iniciadoras”.

Cepas de culturas de partida comumente usadas de bactérias do ácido lático são geralmente divididas em organismos mesofilicos com temperaturas de crescimento ótimas em cerca de 30°C e organismos termofílicos com temperaturas de crescimento ótimas na faixa de cerca de 40 até cerca de 45°C. Organismos típicos pertencentes ao grupo mesofílico incluem Lactococcus lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Pseudoleuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis, Lactobacülus casei subsp. casei e Lactobacülus paracasei subsp. paracasei. Espécies bacterianas do ácido lático termofílicas incluem como exemplos Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecium, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus e Lactobacillus acidophilus.

Também as bactérias anaeróbicas estritas pertencentes ao gênero Bifidobacterium incluindo Bifidobacterium bifidum e Bifidobacterium longum são comumente usadas como culturas iniciadoras de laticínios e são geralmente incluídas no grupo de bactérias do ácido lático. Adicionalmente, espécies de Propionibacteria são usadas como culturas iniciadoras de laticínios, particularmente na produção de queijo. Adicionalmente, organismos pertencentes ao gênero Brevibacterium são comumente usados como culturas iniciadoras de alimentos.

Outro grupo de culturas iniciadoras microbianas são culturas fungicas, incluindo culturas de leveduras e culturas de fungos filamentosos, as quais são particularmente usadas na produção de certos tipos de queijos e bebidas. Exemplos de fungos incluem Penicillium roqueforti, Penicillium candidum, Geotrichum candidum, Torula kefir, Saccharomyces kefir e Saccharomyces cerevisiae.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, o microorganismo usado para fermentação do substrato de leite é o Lactobacillus casei ou uma mistura de Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.

Processos de fermentação a serem usados na produção de bebidas lácteas acidificadas são bem conhecidos e a pessoa versada na técnica saberá como selecionar condições de processo adequadas, tais como temperatura, oxigênio, quantidade e características dos microorganismos, aditivos tais como, por exemplo, carboidratos, flavorizantes, minerais, enzimas (por exemplo, coalho e fosfolipase) e tempo de processo. Obviamente, as condições de fermentação são selecionadas de modo a suportar a realização da presente invenção, isto é, para obter um produto de leite fermentado adequado na produção de uma bebida láctea acidificada.

Em uma modalidade do método da presente invenção, um xarope é adicionado ao substrato do leite, seja antes ou depois da acidificação.

Em uma modalidade preferida, um xarope é adicionado ao substrato do leite após a acidificação, tal como depois da fermentação. “Xarope”, no contexto da presente invenção, é um ingrediente aditivo adicional que proporciona flavor e/ou doçura ao produto final, isto é, a bebida lacta acidificada. Ele pode ser uma solução compreendendo, por exemplo, açúcar, sacarose, glicose, açúcar líquido de frutose, aspartame, álcool de açúcar, concentrado de frutas, suco de laranja, suco de morango e/ou suco de limão. A mistura do substrato de leite acidificado e o xarope pode ser homogeneizada usando qualquer método conhecido na técnica. A homogeneização pode ser efetuada de modo a obter uma solução homogênea líquida a qual seja suave e estável. A homogeneização da mistura do substrato de leite acidificado e o xarope pode ser efetuada por qualquer método conhecido na técnica, tal como pela passagem forçada do leite sob altas pressões através de pequenos orifícios.

Em uma modalidade da invenção, água é adicionada ao substrato de leite acidificado, de modo que o substrato de leite fermentado e a mistura do substrato de leite acidificado, tal como o substrato de leite fermentado e água seja homogeneizada.

Em outra modalidade do método da invenção, a acidificação do substrato do leite ocorre devido à adição do xarope, o qual pode ser ácido, isto é, pela mistura do substrato do leite com xarope na forma, por exemplo, de concentrado de frutas, suco de laranja, suco e morango e/ou suco de limão.

Estágio b) do método da presente invenção compreende um tratamento enzimático. O tratamento enzimático pode ser efetuado antes do estágio a), isto é, o substrato do leite pode ser submetido ao tratamento enzimático antes da acidificação, tal como antes da adição do acidificante químico ou antes da inoculação com o microorganismo. O tratamento enzimático pode ser efetuado durante o estágio a), isto é, o substrato do leite pode ser submetido ao tratamento enzimático ao mesmo tempo em que estiver sendo acidificado. Em uma modalidade, a enzima é adicionada antes ou depois da inoculação do substrato do leite com um microorganismo, e a reação enzimática no substrato do leite ocorre ao mesmo tempo em que ele estiver sendo fermentado.

Altemativamente, o tratamento enzimático pode ser efetuado antes do estágio a), isto é, o substrato do leite pode ser submetido ao tratamento enzimático depois da acidificação. Se o substrato do leite acidificado for misturado e opcionalmente homogeneizado com o xarope, o tratamento enzimático pode ser efetuado antes ou depois disso. A enzima pode ser adicionada ao mesmo tempo ou depois do xarope, porém antes da homogeneização, ou ela pode ser adicionada depois do substrato de leite acidificado e o xarope terem sido misturados e homogeneizados.

Em uma modalidade preferida, o estágio b) é efetuado antes ou durante o estágio a). Em uma modalidade mais preferida, o substrato do leite é submetido à pasteurização antes do estágio a), e o tratamento enzimático é efetuado depois da pasteurização porém antes ou durante a acidificação, por exemplo, a enzima pode ser adicionada antes ou depois da inoculação com o microorganismo, e a reação enzimática pode ocorrer essencialmente ao mesmo tempo da fermentação.

Em uma modalidade ainda mais preferida, o substrato do leite é submetido à pasteurização antes do estágio a), e o tratamento enzimático é efetuado depois da pasteurização porém antes da acidificação. Em uma modalidade ainda mais preferida, outra pasteurização é efetuada depois do tratamento enzimático porém antes da acidificação, isto é, a pasteurização é efetuada antes e depois do estágio b), e o estágio a) é efetuado depois da segunda pasteurização. A enzima modificadora de proteínas é adicionada em uma quantidade adequada para conseguir o grau desejado de modificação de proteína sob as condições reacionais escolhidas. A enzima pode ser adicionada em uma concentração ente 0,0001 e 1 g/L de substrato de leite, preferivelmente ente 0,01 e 0,1 g/L de substrato de leite. O tratamento enzimático no processo da invenção pode ser efetuado pela adição da enzima ao substrato do leite e permitindo que a reação enzimática ocorra em um tempo de espera apropriado em uma temperatura apropriada. O tratamento enzimático pode ser efetuado sob condições escolhidas para adequar a enzima modificadora da proteína selecionada de acordo com os princípios bem conhecidos na técnica. O tratamento também pode ser efetuado através do contado do substrato do leite com uma enzima que tenha sido imobilizada. O tratamento enzimático pode ser efetuado em qualquer pH adequado, tal como, por exemplo, na faixa de 2 a 10, tal como em pH de 4 a 9 ou de 5 a 7. Ele pode ser preferido para deixar a enzima atuar em pH neutro do substrato do leite ou, se a acidificação for obtida devido à fermentação, a enzima pode atuar em pH neutro do substrato do leite durante o processo de fermentação, isto é, o pH irá gradualmente diminuir do pH neutro do substrato de leite não-fermentado até o pH do substrato do leite fermentado. O tratamento enzimático pode ser efetuado em qualquer temperatura apropriada, por exemplo, na faixa de 1 a 70°C, tal como de 2 a 60°C. Se o substrato do leite for acidificado devido à fermentação com um microorganismo, o tratamento enzimático poderá ser efetuado durante a fermentação, por exemplo, de 35 a 45°C.

Opcionalmente, depois de a enzima ter sido deixada atuar no substrato do leite, a proteína enzimática pode ser remoída, reduzida e/ou inativada por qualquer método conhecido na técnica.

Opcionalmente, outros ingredientes podem ser adicionados à bebida láctea acidificada, tal como corante; estabilizantes, por exemplo, pectina, amido, amido modificado, CMC, etc.; ou ácido graxos poli-insaturados, por exemplo, ácido graxos ômega-3. Tais ingredientes podem ser adicionados em qualquer momento durante o processo de produção, Istoé, antes ou depois da acidificação, antes ou depois do tratamento enzimático a antes ou depois da adição opcional de xarope.

Enzima com atividade modificadora de proteína No método da presente invenção, uma enzima é usada para reduzir o ponto isoelétrico da proteína do leite em bebidas lácteas acidificadas, reduzindo deste modo a sinerese durante a armazenagem. r E para ser entendido que no contexto do método da invenção, “proteína do leite” significa qualquer proteína do leite, isto é, qualquer proteína que ocorra naturalmente no leite. Deste modo, no método da presente invenção, o ponto isoelétrico de qualquer proteína do leite é reduzido. Em outras palavras, no método da presente invenção, uma enzima é usada para reduzir o ponto isoelétrico de pelo menos uma proteína do leite, isto é, pelo menos uma das proteínas que ocorre naturalmente no leite.

Deste modo, o método para produzir uma bebida láctea acidificada de acordo com a presente invenção em uma modalidade compreende: a) a acidificação de um substrato do leite compreendendo proteína do leite; e b) o tratamento com uma enzima com atividade modificadora de proteína a qual reduz o ponto isoelétrico da proteína do leite; em que o estágio b) é efetuado antes,durante ou depois do estágio a).

Em uma modalidade preferida, a proteína do leite é caseína.

Preferivelmente, a enzima a ser usada tem uma atividade a qual reduz o ponto isoelétrico da proteína de modo que não altera o comprimento da cadeia de aminoácidos da proteína, isto é, sem hidrolisar as ligações peptídicas na proteína e sem adicionar quaisquer novos aminoácidos na parte N-terminal ou C-terminal da cadeia de aminoácidos.

Em um aspecto da presente invenção, o ponto isoelétrico da proteína do leite é reduzido pela introdução de mais cargas negativas na proteína do leite em pH baixo. Tais cargas negativas podem ser adicionadas na superfície da proteína do leite, por exemplo, caseína.

Em um aspecto preferido do método da invenção, a enzima com atividade modificadora de proteína a qual reduz o ponto isoelétrico da proteína do leite é uma enzima a qual introduz cargas negativas adicionais na proteína de modo que ela não altere o comprimento da cadeia de aminoácidos da proteína, isto é, as cargas negativas adicionais não são introduzidas, por exemplo, pelo aumento do comprimento da cadeia de aminoácidos pela adição de mais aminoácidos (negativamente carregados) na parte C-terminal ou no N-terminal da cadeia de aminoácidos. As cargas negativas adicionais são preferivelmente introduzidas pela modificação das cadeias laterais dos aminoácidos na proteína. Em um aspecto preferido, tal modificação não compreende a reticulação da proteína. A enzima pode ter uma atividade a qual desamide grupos amida na proteína através da ação direta em tais grupos sem hidrolisar ligações peptídicas da proteína e sem reticular a proteína. A enzima pode, por exemplo, ser uma asparaginase, uma glutaminase, uma amidase ou uma desamidase.

Em um aspecto mais preferido, a enzima tem atividade desamidase. O termo “desamidase” se refere a uma enzima que catalisa a hidrólise da gama-amida do aminoácido glutamina ou asparagina incorporado em uma cadeia polipeptídica (proteína) e libera grupos carboxila e amônia de cadeias laterais. Tal enzima pode ser referida como uma peptidoglutaminase, proteína-desamidase, enzima desaminadora de proteína, proteína glutamina glutaminase, proteína glutamina amidoidrolase. O grupo de desamidases compreende porém não está limitado às enzimas atribuídas às subclasses EC 3.5.1.44 (descrito em Kikuchi, M, Hayashida, H., Nakano, E. e Sakaguchi, K. Peptidoglutaminase. Enzymes for selective deamidation of γ-amide of peptide-bound glutamine. Biochemistry 10 (1971 ) 1222-1229).

Enzimas com atividade modificadora de proteína a ser usadas no método da presente invenção podem ser de origem animal, vegetal ou microbiana. Enzimas preferidas são obtidas a partir de fontes microbianas, particularmente de um fundo filamentoso ou levedura, ou a partir de uma bactéria. A enzima pode, por exemplo, ser derivada a partir de uma cepa de A. niger, A. awamori, A. foetidus, A. japonicus, A. oryzae; Dictyostelium, por exemplo, D. discoideum; Mucor, por exemplo, M. javanicus, M. mucedo, M. subtilissimus; Neurospora, por exemplo, N. crassa; Rhizomucor, por exemplo R. pusillus; Rhizopus, por exemplo R. arrhizus, R. japonicus, R. stolonifer; Sclerotinia, por exemplo S. libertiana; Trichophyton, por exemplo T. rubrum; Whetzelinia, por exemplo W sclerotiorum; Bacillus, por exemplo B. megaterium, B. subtilis, B. pumilus, B. stearothermophilus; Chryseobacterium; Citrobacter, por exemplo C. freundii; Enterobacter, por exemplo E. aerogenes, E. cloacae Edwardsiella, E. tarda; Erwinia, por exemplo E. herbicola; Escherichia, por exemplo E. coli; Klebsiella, por exemplo K. pneumoniae; Proteus, por exemplo P. vulgaris; Providencia, por exemplo P. stuartii; Salmonella, por exemplo S. typhimurium; Serratia, por exemplo S. liquefasciens, S. marcescens; Shigella, por exemplo S. flexneri; Streptomyces, por exemplo S. violeceoruber; Yersinia, por exemplo Y. enterocolitica.

Em uma modalidade preferida, a enzima é bacteriana, por exemplo, da classe Flavobacteria, tal como da ordem Flavobacteriales, tal como da família Flavobacteriaceae, tal como de uma cepa de Chryseobacterium. Uma enzima preferida é uma desamidase com uma sequência a qual seja de pelo menos 50%, tal como de pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% idêntica com a SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.

Nova enzima com atividade desamidase Os presentes inventores identificaram uma nova enzima a partir de uma cepa de Chryseobacterium com atividade desamidase. A sequência de DNA da estrutura de leitura aberta do gene codificando a enzima é revelada em SEQ ID NO: 1. A sequência de aminoácidos da proteína codificada pelo gene é mostrada como SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 3 mostra a sequência N-terminal da desamidase ativa conforme foi determinado experimentalmente. SEQ ID NO: 4 mostra a sequência com 186 aminoácidos da enzima madura. A enzima madura tem um peso molecular de ~ 20 KDa, conforme foi determinado por SDS-PAGE. A SEQ ID NO: 5 mostra a sequência de DNA do gene que codifica a enzima sem a região codificadora do peptídeo de sinal.

Deste modo,um aspecto da presente invenção e refere a um polipeptídeo com atividade desamidase, selecionado do grupo consistindo de: a) um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos a qual é pelo menos 75%, preferivelmente pelo menos 80% ou pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 91%, pelo menos 95% ou pelo menos 97% idêntica à (i) SEQ ID NO: 2, ou (ii) aminoácidos 133-318 dos mesmos; b) um polipeptídeo o qual é codificado por um polinucleotídeo o qual é pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95% ou pelo menos 97% idêntico à (i) SEQ ID NO: 1, ou (ii) nucleotídeos 397-954 dos mesmos; c) um polipeptídeo o qual é codificado por um polinucleotídeo cujo complemento hibridiza sob condições altamente estringentes, preferivelmente condições de estringência muito alta com os nucleotídeos 397-954 da SEQ IDNO: 1; d) um polipetídeo o qual é codificado pelo plasmídeo contido em E. coli DSM 19445; e e) um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos modificada por substituição, eliminação e/ou inserção de um ou vários aminoácidos em (i) SEQ ID NO: 2 ou (ii) aminoácidos 133-318 dos mesmos. O polipeptídeo pode ser isolado. O termo “polipeptídeo isolado” conforme aqui utilizado se refere a um polipeptídeo o qual é pelo menos 20% puro, preferivelmente pelo menos 40% puro, mais preferivelmente pelo menos 60% puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 80% puro, mais preferivelmente pelo menos 90% puro e ainda mais preferivelmente pelo menos 95% puro conforme determinado por SDS-PAGE.

Em um aspecto preferido, um polipeptídeo da presente invenção tem uma sequência de aminoácidos a qual difere por dez aminoácidos, preferivelmente por cinco aminoácidos, mais preferivelmente por quatro aminoácidos, ainda mais preferivelmente por três aminoácidos, mais preferivelmente por dois aminoácidos, e ainda mais preferivelmente por um aminoácido da SEQ ID NO: 2 ou aminoácidos 133 a 318 dos mesmos.

Em outro aspecto preferido, um polipeptídeo da presente invenção compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou ma variante alélica da mesma; ou um fragmento seu que tenha atividade desamidase, o fragmento compreendendo pelo menos 100, tal como pelo menos 150 ou 200 aminoácidos. Em um aspecto mais preferido, o polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto preferido, o polipeptídeo compreende os aminoácidos 133 até 318 da SEQ ID NO: 2, ou uma variante alélica da mesma, ou um fragmento seu que tenha a atividade desamidase, o fragmento compreendendo pelo menos 100, tal como pelo menos 150 ou 200 aminoácidos. Em outro aspecto preferido, o polipeptídeo consiste da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou uma variante alélica da mesma; ou um fragmento seu que tenha atividade desamidase, o fragmento compreendendo pelo menos 100, tal como pelo menos 150 ou 200 aminoácidos. Em outro aspecto preferido, o polipeptídeo consiste dos aminoácidos 133 a 318 da SEQ ID NO: 2 ou uma variante alélica da mesma, ou um fragmento seu que tenha atividade desamidase, o fragmento compreendendo pelo menos 100, tal como pelo menos 150 ou 200 aminoácidos.

Uma “variante alélica” de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene. Uma variante alélica de um gene é qualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene ocupando o mesmo local cromossomal. Variação alélica surge naturalmente através da mutação, e pode resultar no polimorfismo pelas populações. As mutações do gene podem ser silenciosas (nenhuma alteração no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos com sequências de aminoácidos alteradas, isto é, variantes alélicas do polipeptídeo.

Polinucleotídeo codificando uma desamidase Outro aspecto da presente invenção se refere a um polinucleoídeo isolado codificando um polipeptídeo com atividade desamidase, selecionado do grupo consistindo de: a) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos a qual é pelo menos 75%, preferivelmente pelo menos 80% ou pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 91%, pelo menos 95% ou pelo menos 97% idêntica à SEQ ID NO: 2, ou (ii) aminoácidos 133 a 318 dos mesmos; b) um polinucleotídeo o qual seja pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95% ou pelo menos 97% idêntico à (i) SEQ ID NO: 1, ou (ii) nucleotídeos 397-354 dos mesmos; e c) um polinucleotídeo cujo complemento hibridiza sob condições altamente estringentes, preferivelmente condições de estringência muito alta com (i) SEQ ID NO: 1, (ii) nucleotídeos 397 a 954 da SEQ ID NO: 1, ou (iii) uma subsequência de (i) ou (ii). O termo “subsequência” é aqui definido como uma sequência de nucleotídeos com um ou mais nucleotídeos eliminados da extremidade 5’ e/ou 3’ da SEQ ID NO: 1 ou uma sequência homóloga da mesma. Uma subsequência da SEQ ID NO: 1 preferivelmente contém pelo menos 100 nucleotídeos contíguos, mais preferivelmente pelo menos 200, 300, 400 ou 500 nucleotídeos contíguos. Uma subsequência preferida consiste dos nucleotídeos 397 a 954 da SEQ ID NO: 1. Além disso, a subsequência pode codificar um fragmento polipeptídico o qual tenha atividade desaminase.

Para os propósitos da presente invenção, hibridização indica que a sequência nucleotídica ou de seu complemento hibridiza para uma sonda de ácido nucleíco marcada correspondendo à sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 1, da mesma fita complementar ou uma subsequência de qualquer uma dessas, sob condições de estringência alta a muito alta. Uma subsequência preferida consiste dos nucleotídeos 397 a 954 da SEQ ID NO: 1 ou da mesma fita complementar. Moléculas às quais a sonda de ácido nucleico hibridiza sob essas condições podem ser detectadas usando filme de raio-X.

Em um aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico é uma sequência de polinucleotídeos a qual codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 2, ou uma subsequência da mesma, tais como os aminoácidos 133 a 318, ou a fita complementar de qualquer um desses. Em outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico é a SEQ ID NO: 1 ou os nucleotídeos 397 a 954 dos mesmos, ou o complemento de qualquer um desses. Em outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico é a região codifícadora do polipeptídeo maduro da SEQID NO: 1 ou seu complemento.

Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, condições de estringência de alta a muito alta são definidas como pré-hibridização e hibridização a 42°C em 5x SSP, SDS 0,3%, 200 pg/mL de DNA de esperma de salmão desnaturado e cisalhado e 50% de formamida, após os procedimentos de Southern blotting padrões por 12 a 24 horas de modo ótimo (J. Sambrook, E. F. Fritsch, e T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque).

Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, o material carreador é finalmente lavado três vezes, cada uma por 15 minutos usando 2 x SSC, SDS 0,2% preferivelmente pelo menos a 65°C (alta estringência) ou mais preferivelmente pelo menos 70°C (estringência muito alta).

Em uma modalidade particular, a lavagem é efetuada usando 0,2 x SSC, SDS 0,2% preferivelmente pelo menos a 65°C (alta estringência) ou mais preferivelmente pelo menos 70°C (estringência muito alta). Em outra modalidade particular, a lavagem é efetuada usando 0,1 x SSC, SDS 0,2% preferivelmente pelo menos a 65°C (alta estringência) ou mais preferivelmente pelo menos 70°C (estringência muito alta).

Para sondas curtas as quais tenham cerca de 15 nucleotídeos até cerca de 70 nucleotídeos de comprimento, condições de estringência são definidas como pré-hibridização, hibridização e lavagem pós-hibridização em cerca de 5°C até cerca de 10°C abaixo do Tm calculado usando o cálculo de acordo com Bolton e McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390) em NaCl 0,9 M, Tris-HCl pH 7,6 0,09 M, EDTA 6 mM, NP-40 0,5%, lx solução de Denhardfs, pirofosfato e sódio 1 mM, fosfato de sódio monobásico 1 mM, ATP 0,1 mM e 0,2 mg de RNA de levedura por mL seguindo procedimentos de Southern blotting.

Para sondas curtas as quais são de cerca de 15 nucleotídeos até cerca de 70 nucleotídeos de comprimento, o material carreador é lavado uma vez em 6X SSC mais SDS 0,1% por 15 minutos e duas vezes cada por 15 minutos usando 6X SSC a 5°C até 10°C abaixo da Tm calculada.

Sob condições de hibridização contendo sal, a Tm efetiva é o que controla o grau de identidade necessário entre a sonda e o DNA ligado ao filtro para a hibridização bem sucedida. A Tm efetiva pode ser determinada usando a fórmula abaixo para determinar o grau de identidade necessário para dois DNAs para hibridizar sob várias condições de estringência.

Tm efetiva =81,5 + 16,6 (log M[Na+]) + 0,41 (G+C%) - 0,72 (% de formamida) (Ver www.ndsu.nodak.edu/instruct/mcclean/plsc731/dna/dna6.htm) O conteúdo e G+C da SEQ ID NO: 1 é de 39,3%. Para estringência média, a formamida é 35% e a concentração de Na+ para 5x SSPE é de 0,75 M. Aplicando esta fórmula a esses valores,a Tm efetiva é de 70,3°C.

Outra relação relevante é que um mau-emparelhamento de 1% de dois DNAs reduz a Tm em 1,4°C. Para determinar o grau de identidade necessário para dois DNAs hibridizarem sob condições de estringência média a 42°C, a fórmula a seguir é usada: %de homologia = 100 - [(Tm efetiva - temperatura de hibridização)/1,4] (Ver www.ndsu.nodak.edu/instruct/mcclean/plsc731/dna/dna6.htm).

Aplicando essa fórmula aos valores, o grau de identidade necessário para dois DNAs hibridizarem sob condições de média estringência a 42°C é de 100 - [(70,3 - 42)/1,4] - 79,8%.

Identidade de Sequência A relação entre duas sequências de aminoácidos é descrita pelo parâmetro “identidade” ou “homologia”. Para os propósitos da presente invenção, o alinhamento de duas sequências de aminoácidos á determinado pelo uso do programa Needle do pacote EMBOSS (Rice, P., Longden, I. e Bleasby, A. (2000) EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite. Trends in Genetics 16, (6) pp276 — 277; http://emboss.org) versão 2.8.0. O programa Needle implementa o algoritmo de alinhamento global descrito em Needleman, S. B. e Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453. A matriz de substituição usada é BLOSUM62, penalidade de abertura de intervalo é 10 e a penalidade de extensão de intervalo é 0,5. O grau de identidade ou homologia entre uma sequência de aminoácidos da presente invenção (“sequência da invenção” e uma sequência de aminoácidos diferente (“sequência estrangeira”) é calculado como o número exato de emparelhamentos em um alinhamento das duas sequências, dividido pelo comprimento da “sequência da invenção” ou o comprimento da “sequência estrangeira”, a que for a mais curta. O resultado é expresso em identidade porcentual.

Um emparelhamento exato ocorre quando a “sequência da invenção” e a “sequência estrangeira” têm resíduos de aminoácidos idênticos nas mesmas posições da sobreposição. O comprimento de uma sequência é a quantidade de resíduos de aminoácidos na sequência.

Em uma modalidade particular, a porcentagem de identidade de uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo com, ou para a SEQ ID NO: 2 é determinada i) pelo alinhamento das duas sequências de aminoácidos usando o programa Needle, com a matriz de substituição BLOSUM62, uma penalidade de abertura de intervalo de 10 e uma penalidade de extensão de intervalo de 0,5; ii) pela contagem da quantidade de emparelhamento exatos no alinhamento; iii) pela divisão da quantidade de emparelhamentos exatos pelo comprimento da mais curta das duas sequências de aminoácidos, e iv) pela conversão do resultado da divisão de iii) em porcentagem. A porcentagem de identidade para ou com outras sequências da invenção é calculada de modo análogo.

Para os propósitos da presente invenção, o grau de identidade entre duas sequências nucleotídicas é determinado pelo método de Wilbur-Lipman (Wilbur e Lipman, 1983, Proceedings of the National Academy of Science USA 80: 726-730) usando o software LASERGENE™ MEGALIGN™ (DNASTAR, Inc., Madison, WI) com uma tabela de identidade e os seguintes parâmetros de alinhamento múltiplo: penalidade de intervalo de 10 e penalidade de comprimento de intervalo de 10. Os parâmetros de alinhamento em pares são Ktuplo = 9, penalidade de intervalo = 3 e janelas = 20.

Vetores de expressão e células hospedeiras Ainda outro aspecto da invenção se refere aos constructos de ácido nucleico, vetores de expressão recombinantes e células hospedeiras recombinantes compreendendo os polinucleotídeos, e aos métodos para produzir tais polipeptídeos com atividade desamidase compreendendo (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante compreendendo um construto de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo sob condições que levem à produção do polipeptídeo; e (b) recuperação do polipeptídeo. O termo “construto de ácido nucleico”, conforme aqui utilizado, se refere a uma molécula de ácido nucleico, seja ela de fita simples ou dupla, a qual é isolada de um gene de ocorrência natural ou a qual é modificada para conter segmentos dos ácidos nucleico de modo que não possa existir de outra forma na natureza. O termo construto de ácido nucleico é sinônimo do termo “cassete de expressão”, quando o construto de ácido nucleico contém as sequências de controle necessárias para a expressão de uma sequência codificadora da presente invenção. O termo “sequências de controle” é aqui definido para incluir todos os componentes, os quais são necessários ou vantajosos para a expressão de um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser natural ou estrangeira à sequência nucleotídica codificando o polipeptídeo. Tais sequências de controle incluem, porém não estão limitadas, a uma líder, uma sequência de poliadenilação, uma sequência pró-peptídica, promotora, uma sequência de peptídeo de sinal e uma terminadora de transcrição. No mínimo, as sequências de controle incluem um sinal promotor, de transcrição e de parada de tradução. As sequências de controle podem ser fornecidas com ligantes com a finalidade de introduzir sítios de restrição específicos que facilitem a ligação das sequências de controle com a região codificadora da sequência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo. O termo “sequência codificante” significa uma sequência de nucleotídeo, a qual especifica diretamente a sequência de aminoácidos de seu produto proteico. Os limites da sequência codificante são geralmente determinados por uma estrutura de leitura aberta, a qual geralmente começa com o códon de partida ATG ou com códons de partida alternativos tais como GTG e TTG. A sequência codificante pode ser uma sequência de DNA, um DNAc ou uma sequência de nucleotídeo recombinante. O termo “expressão” inclui qualquer estágio envolvido na produção do polipeptídeo incluindo, porém sem se limitar, à transcrição, modificação pós-transcrição, tradução, modificação pós-tradução e secreção. O termo “vetor de expressão” é aqui definido como uma molécula de DNA linear o circular que compreende um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo da invenção, e a qual seja operativamente ligada aos nucleotídeos adicionais que proporcionam esta expressão. O termo “operativamente ligado” denota aqui uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada em relação à sequência codificante da sequência polinucleotídica de modo que a sequência de controle direcione a expressão da sequência codificadora de um polipeptídeo. O termo “célula hospedeira”, conforme aqui utilizado, inclui qualquer tipo celular o qual seja suscetível à transformação, transfecção, transdução e semelhantes com um construto de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção.

Fontes dos Polipeptídeos com atividade desamidase A sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 ou uma subsequência da mesma, assim como a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou um fragmento seu, pode ser usada para projetar uma sonda de ácidos nucleicos para identificar e clonar os polipeptídeos codificadores de DNA com atividade desamidase de cepas de diferentes gêneros ou espécies de acordo com os métodos bem conhecidos na técnica. Particularmente, tais sondas podem ser usadas para a hibridização com o genoma ou DNAc dos gêneros ou espécies de interesse, seguindo procedimentos de Southern blotting padrões, para identificar e isolar o gene correspondente ali. Tais sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a sequência como um todo, podem devem ser de pelo menos 14, preferivelmente pelo menos 25, mais preferivelmente pelo menos 35 e mais preferivelmente pelo menos 70 ou pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento. Por exemplo, a sonda de ácido nucleico pode ser de pelo menos 200 nucleotídeos, preferivelmente de pelo menos 300 nucleotídeos, mais preferivelmente de pelo menos 400 nucleotídeos ou mais preferivelmente de pelo menos 500 nucleotídeos de comprimento. Sondas ainda mais longas podem ser usadas, por exemplo, sondas de ácido nucleico as quais sejam de pelo menos 600 nucleotídeos, preferivelmente de pelo menos 700 nucleotídeos, mais preferivelmente de pelo menos 800 nucleotídeos, ou mais preferivelmente de pelo menos 900 nucleotídeos de comprimento. Sondas tanto de DNA quanto de RNA podem ser usadas. As sondas são tipicamente rotuladas para detectar o gene correspondente (por exemplo, com 32P, 3H, 35S, biotina ou avidina). Tais sondas são englobadas pela presente invenção.

Uma biblioteca de DNA genômico ou de cDNA preparada a partir de outros organismos de interesse pode ser varrida para DNAs os quais hibridizem com as sondas descritas acima e as quais codifiquem um polipeptídeo com atividade desamidase. DNA genômico ou diferente de tais outros organismos pode ser separado por eletroforese em gel e poliacrilamida ou agarose, ou outras técnicas de separação. DNAs das bibliotecas ou o DNA separado pode ser transferido para e imobilizado em nitrocelulose ou outro material carreador adequado. Para identificar um clone ou DNA o qual seja homólogo com a SEQ ID NO: 1 ou uma substância da mesma, o material carreador é usado em um Southern blot.

Um polipeptídeo da presente invenção pode ser obtido a partir de microorganismos de qualquer gênero. Para os propósitos da presente invenção, o termo “obtido de”, conforme usado juntamente com uma dada fonte, deve significar que o polipeptídeo codificado por uma sequência de nucleotídeos é produzido pela fonte ou por uma cepa na qual a sequência nucleotídica da fonte tenha sido inserida. Em um aspecto preferido, o polipeptídeo obtido de uma dada fonte é secretado extracelularmente.

Um polipeptídeo da presente invenção pode ser um polipeptídeo bacteriano, e preferivelmente ele pode ser obtido de ou obtenível a partir da classe Flavobacteria, mais preferivelmente da ordem Flavobacteriales e ainda mais preferivelmente da família Flavobacteriaceae. O polipeptídeo pode ser obtido de ou obtenível a partir de qualquer um dos gêneros Bergeyella, Capnocytophaga, Cellulophaga, Chryseobacterium, Coenonia, Dokdonia, Empedobacter, Flavobacterium, Gelidibacter, Ornithobacterium, Polaribacter, Psychroflexus, Psychroserpens, Riemerella, Saligentibacter, ou Weeksella, preferivelmente de Chryseobacterium.

Para as espécies acima mencionadas, a invenção engloba tanto o estado perfeito quanto o imperfeito, e outros equivalentes taxonômicos, por exemplo, anamorfos, independentemente do nome da espécie que eles possuem. As pessoas versadas na técnica irão prontamente reconhecer a identidade dos equivalentes apropriados.

Cepas dos gêneros mencionados acima são prontamente acessíveis ao público em várias coleções de cultura, tais como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

Além disso, os polipeptídeos da presente invenção podem ser identificados e obtidos de outras fontes incluindo microorganismos isolados da natureza (por exemplo, solo, compostos, água, etc.) usando as sondas acima mencionadas. Técnicas para isolar microorganismos de habitats naturais são bem conhecidas na técnica. O polinucleotídeo pode ser então obtido similarmente por varredura de uma biblioteca genômica ou de DNAc de outro microorganismo. Uma vez detectada uma sequência de polinucleotídeo codificando um polipeptídeo com a(s) sonda(s), o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado pelo uso de técnicas as quais são bem conhecidas pelas pessoas normalmente versadas na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Os polipeptídeos da presente invenção também incluem polipeptídeos fundidos ou polipeptídeos de fusão cliváveis nos quais outro polipeptídeo é fundido no N-terminal ou no C-terminal do polipeptídeo ou fragmento seu. Um polipeptídeo fundido é produzido pela fusão de uma sequência nucleotídica (ou uma porção da mesma) codificando outro polipeptídeo a uma sequência de nucleotídeos (ou uma porção da mesma) da presente invenção. Técnicas para a produção de polipeptídeos de fusão são conhecidas na técnica, e incluem a ligação das sequências codificantes codificando os polipeptídeos de modo que elas estejam em estrutura e que a expressão do polipeptídeo fundido esteja sob o controle do(s) mesmo(s) promotor(es) e terminador.

EXEMPLOS Exemplo 1 Solução SKMP 20 mL de água + 4,5 g de leite em pó desnatado (dispersibilidade imediata de Kerry) foram incubados a 50°C por 10 min antes do uso, de modo a obter uma solução homogênea.

Solução de açúcar 3,3 g de sacarose 10,5 g de glicose Esses açúcares foram adicionados a 46 mL de tampão de ácido lático 20 mM, pH 4,0 e incubados a 90°C por 5 min usando agitação e a seguir esfriados até 5°C.

Enzima Chryseobacterium desamidase purificada cromatograficamente (Exemplo 3), 0,9 mg/mL, foi diluída para produzir as concentrações finais indicadas nas Tabelas.

Procedimento A (Enzima adicionada antes da pasteurização) 250 pL de solução SKMP foram transferidos para tubos eppendorf. 20 pL de enzima ou água (controle) foram adicionados e a incubação foi efetuada por 120 min a 50°C. A solução foi incubada a 85°C por 30 min com 1000 rpm e daí em diante incubada a 43°C por 10 min com 1000 rpm. 30 pL de 4 U/I YF-3331 (cultura de cepa misturada contendo Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus de Chr. Hansen A/S, Dinamarca) foram adicionados e a incubação foi efetuada por 16 horas a 43°C.

Daí em diante as amostras foram incubadas a 0 - 5°C de banho de gelo/água por 20 min. 600 pL de solução de açúcar (banho de gelo) foram adicionados e sugados para cima e para baixo com uma pipeta cinco vezes. 500 pL de pérolas de vidro (5°C) foram adicionadas em cada tubo.

As amostras foram colocadas em um termomisturador de eppendorf a 5°C com 1400 rpm por 10 min.

As amostras foram colocadas a 5°C por 4 dias e a sinerese foi medida.

Procedimento B (enzima adicionada após a pasteurização) 250 pL de solução SKMP foram transferidos para tubos eppendorf e incubados por 120 min a 50°C. A solução foi incubada a 85°C por 30 min com 1000 rpm e daí em diante incubada a 43°C por 10 min com 1000 rpm. 30 pL de 4 U/I YF-3331 (cultura de cepa misturada contendo Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus de Chr. Hansen A/S, Dinamarca) + 20 pL de enzima ou água (controle) foram adicionados e a incubação foi efetuada por 16 horas a 43°C.

Daí em diante as amostras foram incubadas a 0 - 5°C em banho de gelo/água por 20 min. 600 pL de solução de açúcar (banho de gelo) foram adicionados e sugados para cima e para baixo com uma pipeta cinco vezes. 500 pL de pérolas de vidro (5°C) foram adicionadas em cada tubo.

As amostras foram colocadas em um termomisturador eppendorf a 5°C com 1400 rpm por 10 min.

As amostras foram colocadas a 5°C por 4 dias e a sinerese foi medida.

Procedimento C (enzima adicionada após a homogeneização) 250 pL de solução SKMP foram transferidos para tubos eppendorf e incubados por 120 min a 50°C. A solução foi incubada a 85°C por 30 min com 1000 rpm e daí em diante incubada a 43°C por 10 min com 1000 rpm. 30 pL de 4 U/I YF-3331 (cultura de cepa misturada contendo Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus de Chr. Hansen A/S, Dinamarca) foram adicionados e a incubação foi efetuada por 16 horas a 43°C.

Daí em diante as amostras foram incubadas a 0 - 5°C em banho de gelo/água por 20 min. 600 pL de solução de açúcar (banho de gelo) foram adicionados + 20 pL de enzima ou água (controle) e sugados para cima e para baixo com uma pipeta cinco vezes. 500 pL de pérolas de vidro (5°C) foram adicionadas em cada tubo.

As amostras foram colocadas em um termomisturador eppendorf a 5°C com 1400 rpm por 10 min.

As amostras foram colocadas a 5°C por 4 dias e a sinerese foi medida.

Os dados (determinações duplas) na Tabela 1 mostram uma sinerese reduzida quando desaminase é adicionada em comparação com o controle de água. O efeito mais predominante pode ser visto quando a enzima é adicionada depois da pasteurização.

Tabela 1 Desamidase Sinerese média Desvio (+/-) ug/mL mm mm Procedimento A

Adição antes da pasteurização 57 2,8 0,08 Água (Controle) 0 3,3 0,04 Procedimento B

Adição após a pasteurização 57 1,1 0,03 Água (Controle) 0 3,5 0,25 Procedimento C

Adição após a homogeneização 57 3,9 0,12 Água (Controle) 0 3,8 0,13 Experimento 2 Um experimento dose resposta foi feito de acordo com o Procedimento B conforme descrito no Exemplo 1.

Tabela 2 mostra um decréscimo na sinerese com aumento da concentração de desamidase.

Exemplo 3 Clonagem e produção de desamidase Clonagem e produção Chryseobacterium sp. foi isolado de uma amostra de solo da Antártica em 19 de janeiro de 1989. O gene desamidase foi amplificado por PCR com base nos iniciadores projetados das sequências de desamidases conhecidas. (No. Genbank Ace AB046594 (Eur J Biochem vol 268:1410-1421, 2001) e GenseqN Ace No AAZ49495 (EP976829)). A sequência obtida de tal produto é mostrada como a SEQ ID NO: 1. O peptídeo sinal do gene Savinase TM (a subtilisina protease de B. clausii) foi fundido por PCR na estrutura com o gene codificando a desamidase (SEQID NO: 5). O gene fundido foi integrado por recombinação homóloga no genoma do hospedeiro Bacillus subtilis. O construto do gene foi expresso sob o controle de um sistema promotor triplo (conforme descrito em WO 99/43835), consistindo dos promotores do gene da alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amyL), gene da alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ) e promotor de Bacillus thuringiensis crylIIA incluindo a sequência estabilizante. O gene codificando a cloranfenicol acetiltransferase foi usado como marcador. (Descrito, por exemplo, em Diderichsen et al., A useful cloning vector for Bacillus subtilis. Plasmid, 30, p. 312, 1993).

Transformantes resistentes ao cloranfenicol foram analisados por sequenciamento de DNA para verificar a sequência de DNA correta do construto. Um tal clone foi selecionado.

Fermentações do clone de expressão da desamidase foram efetuadas em uma mesa de agitação rotatória em frascos de emelmeyer com septo de 500 mL, cada um contendo 100 mL de meio LB (ou outro meio adequado para a fermentação de Bacillus subtilis) suplementado com 34 mg/L de cloranfenicol. O clone foi fermentado por 5 dias a 30°C.

Purificação da desamidase por IEF preparativo 50 mL do sobrenadante foram adicionados em alíquotas de 2,5 mL em colunas de filtração a gel PD10TM (Pharmacia) para remover o sal. 70 mL foram coletados das colunas de PD 10 TM (Pharmacia). A amostra foi preparada para separação por RotorforTM (Biorad). 59 mL de sobrenadante filtrado em gel foram misturados com 3 mL de anfólito Biolyte 3/10 (Biorad art 163 1112). O foco isoelétrico preparativo (IEF) foi efetuado conforme recomendado pelo fabricante. A amostra foi carregada no RotoforTM e submetida à eletroforese por 4 horas com efeito constante de 15W. Vinte frações obtidas por IEF preparativo foram avaliadas em SDS PAGE, e baseando-se nos padrões de bandas as frações foram reunidas. A atividade foi avaliada em caseína por um ensaio qualitativo, conforme descrito abaixo. Ensaio de desamidase qualitativo Caseína foi desamidada pela adição de 10 uL de amostra até 1 mL de caseína 1% em tampão Britten Robinson pH 7, seguido por incubação a 37°C por 1 h com agitação. A reação foi interrompida colocando a amostra em gelo.

A desamidação da caseína foi avaliada por IEF analítico. As amostras tratadas com enzima (e no controle de caseína não-tratado) foram misturadas 1:1 com uma solução de uréia 9 M, Triton X-100 2% para desnaturar as micelas de caseína. As amostras foram carregadas em Pharmacia IEF 3/10. O gel IEF foi submetido à eletroforese conforme recomendado pelo fabricante, seguido por marcação com coomassie para visualizar a proteína (Figura 1). As amostras a seguir foram carregadas no gel IEF (da esquerda) Raia 1: marcador IEF; raia 2: sobrenadante do clone de desamidase; Raia 3 é o sobrenadante preparado para o carregamento ao IEF preparativo (esta amostra é cerca de 4 vezes diluída em comparação com a raia 2); as raias 4 a 11 são reuniões de frações de IEF preparativo (reunião 4 (raia 7) contém a enzima desamidase); raia 12 é o padrão de caseína. DEPÓSITO DE MATERIAL BIOLÓGICO O material biológico a seguir foi depositado sob os termos do Tratado de Budapeste com Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1 B, D-38124 Braunschweig, Alemanha, e dado o número de acesso a seguir: A cepa foi depositada sob condições que asseguram que o acesso à cultura será disponível durante a pendência deste pedido de patente para um determinado pelas leis de patentes estrangeiras a serem intituladas para isso. O depósito representa uma cultura substancialmente pura da cepa depositada. O depósito é disponível conforme requerido pelas leis de patente estrangeiras em países em que as contrapartes do pedido em questão, ou da mesma progênie são depositados. Entretanto, deve ser entendido que a disponibilidade de um depósito não constitui uma licença para praticar a invenção em questão em detrimento dos direitos de patente garantidos por ação governamental.

REIVINDICAÇÕES

Claims (13)

1. Método para produzir uma bebida láctea acidificada, caracterizado pelo fato de compreender: a) a acidifícação de um substrato do leite compreendendo proteína do leite; e b) o tratamento com uma enzima com atividade modificadora de proteína a qual reduz o ponto isoelétrico da proteína do leite; em que o estágio b) é efetuado antes,durante ou depois do estágio a).

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a acidifícação compreende a fermentação com uma bactéria de ácido lático.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o estágio a) compreende acidifícação química.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o estágio b) é efetuado antes ou durante o estágio a).

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o substrato do leite é submetido à pasteurização antes do estágio a) e o estágio b) é efetuado depois da pasteurização.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o substrato do leite acidificado é misturado com um xarope e a mistura é submetida à homogeneização.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a bebida láctea acidificada está na forma líquida.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a bebida láctea acidificada tem uma viscosidade de menos do que 40 Pa em uma taxa de cisalhamento de 300 pr.s.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o substrato do leite tem um teor de proteína maior do que 5%.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a bebida láctea acidificada tem um teor de proteína do leite menor do que 3%.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a proteína do leite é caseína.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a enzima tem atividade desamidase.

13. Bebida láctea acidificada, caracterizada pelo fato de ser obtenível por qualquer uma das reivindicações precedentes.