BRPI0811174B1 - METODO DE IDENTIFICAR EM UMA PLANTA DE CAPSICUM ANNUUM UM LOCAL DE CARACTERÍSTlCA QUANTITATIVA ("QTL") - Google Patents

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Abstract

método de identificar em uma planta de capsicum annuum um local de característica quantitativa ("qtl") a presente invenção refere-se às novas plantas de pimenta resistentes a insetos, e às sementes e frutas das referidas plantas. a presente invenção da mesma forma refere-se a métodos de fazer e usar tais plantas e suas frutas. a invenção também se refere aos marcadores e o uso dos mesmos na procriação assistida por marcador e para identificar a característica de resistência de inseto. em particular, a presente invenção fornece uma planta de capsicum annuum cultivada que é resistente, particularmente de forma intermediária resistente, às infestações de insetos da família thripidae e/ou o gênero bemisia, porém especialmente às infestações de bemisia tabaci e frankliniella occidentalis.

Description

MÉTODO DE IDENTIFICAR EM UMA PLANTA DE CAPSICUM ANNUUM UM LOCAL DE CARACTERÍSTICA QUANTITATIVA (QTL)
A presente invenção refere-se a novas plantas de pimenta resistentes a insetos, e às sementes e frutas das referidas plantas. A presente invenção da mesma forma refere-se a métodos de preparar e usar tais planta e suas frutas. A invenção também se refere a marcadores e ao uso dos mesmos na procriação assistida por marcador e para identificar a característica de resistência do inseto.
As pimentas mundialmente são uma colheita importante com um valor comercial calculado de cerca de 500 milhões de dólares por ano. As pimentas são Solanaceas do gênero Capsicum, que inclui as espécies Capsicum annuum, Capsicum frutescens e Capsicum chinense. Pimentas comerciais são diploides com n = 12 cromossomas. As pimentas são cultivadas e usadas por toda parte do mundo como pimentas de cheiro tal como o pimentão; ou como pimentas-malagueta picantes, pimentas jalapeno, e pimentas TABASCO®; ou como uma fonte de pós secos de várias cores tal como páprica. Os tipos de pimentas cultivadas podem ser diferenciados por cheiro forte, forma da fruta, cor e tamanho (vide, por exemplo, Patente US 6.498.287).
Frutas de pimenta, da mesma forma geralmente chamadas como pimentas, são altamente perecível. Elas são propensos à perda de água e enrugamento que as torna desagradáveis aos clientes. Plantas de pimenta são da mesma forma hospedeiras a várias doenças. Estas doenças reduzem a produção das colheitas, mas da mesma forma afetam o aparecimento das frutas, tornando-as inegociáveis. Em particular, os insetos causam danos à colheita significativos, resultando em perdas comerciais significativas. Em alguns casos, os insetos afetam diretamente as plantas ou as frutas, em outros casos eles agem como um vetor para vírus de planta. Normalmente, o dano de inseto reduz o crescimento da planta mas geralmente não mata a planta. O controle químico e a rotação da colheita podem ser usados para reduzir o dano causado por insetos, mas estas estratégias são caras e às vezes inconvenientes.
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Entre a peste de inseto que afeta as pimentas, a mosca branca Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) e várias espécies de tripes tal como Tripes da Flor Ocidental: Frankliniella occidentalis, Tripes da Cebola: Th ri ps tabaci, Tripes de Pimenta: Scirtothrips dorsalis, e Tripes do Melão: Thrips palmi são particularmente devastadores.
Há aproximadamente 5000 espécies descritas de tripes (insetos na Ordem Thysanoptera). As espécies que se alimentam em plantas maiores ocorrem principalmente na Família Thripidae. Esta família inclui as espécies de peste importantes que incluem pestes sérias de colheitas ornamentais, vegetais e fruta no campo e estufa. Alimentação e deposição de ovo por tripes resultam na distorção, descoloração, prateamento e bronzeamento das folhas e frutas de vegetais que reduzem seu valor de mercado. Algumas espécies de tripes são vetores de bunyaviruses (família Bunyaviridae, gênero Tospovirus, espécie tipo bronzeamento do tomateiro). Epidemias severas ocorrem anualmente no alimento, fibra, e colheitas ornamentais em regiões tropicais e subtropicais do mundo.
O tripes das flores ocidental (Frankliniella occidentalis) é uma peste de inseto oportunística em estufas que afetam severamente uma multidão de colheitas. Frankliniella occidentalis foi espalhada quase mundialmente durante as últimas duas décadas. Esta espécie de tripes é muito danificadora e difícil de controlar. Multiplica-se facilmente sobre a pimenta e cria danos físicos na planta, flores e frutas do estágio precoce do berçário até o final da colheita. As larvas e adultos alimentam-se nas células epidérmicas das folhas, brotos, flores e frutas. Elas afetam a pele da fruta e depreciam o valor comerciável. Colheitas de estufa de alto valor tais como vegetais são particularmente vulneráveis às perdas econômicas associadas com dano por tripes. Tripes é da mesma forma um vetor eficiente de um vírus devastador, o vírus de Tomato Spotted Wilt (TSWv) que cria perdas grandes para o cultivadores. As plantas infectadas apresentam mosaico forte e necrose sobre as plantas e frutas.
Tripes é difícil de controlar por produtos químicos visto que o inseto desenvolveu resistência à vários inseticidas usados durante os últiPetição 870170065661, de 04/09/2017, pág. 10/142
3/127 mos 15 anos. Sob condições de estufa, o uso de predadores biológicos, com Orius em condições quentes ou Amblyseius em condições mais frias que mantêm um nível baixo de tripes na colheita, é uma ampla expansão mas nem sempre uma prática suficiente.
Para a mosca branca, Bemisia tabaci , pelo menos dois biotipos foram descritos: o tipo B, idêntico a Bemisia argentifolii e o tipo Q.
Controle de Bemisia e tripes é particularmente difícil, da mesma forma por causa da ampla faixa de plantas hospedeiras. Espécies de Bemisia e tripes atacam uma ampla variedade de colheitas de vegetais incluindo tomate, feijões, pepinos, melões, melão amargo, pimenta-da-guiné, berinjela, abóbora pumpkin, abóbora squash e abobrinha. Capsicum pertence as colheitas mais seriamente afetadas.
Por causa dos danos na planta e fruta e a transmissão de um vírus devastador, há uma necessidade não atendida quanto a estratégias convenientes e economicamente sustentáveis de proteger colheitas de pimenta contra estas pestes. A resistência da planta hospedeira é uma boa estratégia de controle para Bemisia e tripes. É uma alternativa ambientalmente amigável para o uso de pesticidas e pode aumentar a eficiência de opções de controle biológicas e contribui para programas de administração de peste integrados bem sucedidos.
A presente invenção volta-se para esta necessidade fornecendose plantas de pimenta resistentes que são menos atrativas aos insetos e/ou capazes de resistir à infestação de inseto e/ou desenvolvimento tal como, por exemplo, oviposição e/ou desenvolvimento de pupas e desse modo estaria em um grau considerável protegido de infestações de inseto, particularmente de infestações da mosca branca Bemisia tabaci e/ou tripes.
A presente invenção fornece uma planta de Capsicum annuum cultivada que é resistente, particularmente de forma intermediária resistente, às infestações de insetos da família Thripidae e/ou do gênero Bemisia, porém especialmente às infestações de Bemisia tabaci e Frankliniella occidentalis.
Resistência às infestações de Bemisia ou planta resistente à
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4/127 Bemisia refere-se à capacidade das plantas resistirem ao ataque, infestação, ou colonização pelo inseto. O nível de resistência exibido por uma certa planta pode ser classificado, por exemplo, por meio de um Ensaio de Resistência do Inseto padronizado como descrito no exemplo 2A aqui abaixo usando uma escala de 1 -9 para avaliar a severidade da infestação.
Em uma modalidade, a invenção fornece uma planta de Capsicum annuum cultivada que é resistente, particularmente de forma intermediária resistente, às infestações de Bemisia, em que a referida resistência pode ser avaliada em um ensaio de resistência padrão, particularmente um ensaio como descrito no exemplo 2A abaixo, e em que um escore de resistência é obtido divergindo-se por não mais que 3 escalas, particularmente por não mais que 2 escalas, porém especialmente por não mais que 1 escala de um escore obtenível com uma planta de Capsicum annuum de linhagem 061M4387, a semente representativa da qual é depositada sob N° de Acessão NCIMB 41428, quando avaliada no mesmo ensaio a um nível estatisticamente significante e sob condições ambientais idênticas, particularmente sob a mesma pressão de inseto.
Em uma modalidade, uma planta Capsicum annuum resistente a Bemisia é contanto que seja capaz de resistir ao desenvolvimento de inseto, particularmente oviposição e/ou desenvolvimento de pupas na planta tal que o número de pupas nas folhas da planta determinado em um ensaio de resistência padrão, particularmente um ensaio como descrito no exemplo 2A abaixo, divirja por não mais que um fator de 20, particularmente por não mais que um fator de 15, mais particularmente por não mais que um fator de 10, ainda mais particularmente por não mais que um fator de 5, porém especialmente por não mais que um fator de 2, do número de pupas obtenível com uma planta de Capsicum annuum de linhagem 061M4387, a semente representativa da qual é depositada sob N° de Acessão NCIMB 41428, quando avaliada no mesmo ensaio a um nível estatisticamente significante e sob condições ambientais idênticas, particularmente sob a mesma pressão de inseto.
Em uma modalidade uma planta Capsicum annuum resistente a
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5/127 Bemisia é contanto que seja capaz de resistir ao desenvolvimento de inseto, particularmente oviposição e/ou desenvolvimento de pupas na planta para essencialmente a mesma extensão como uma planta Capsicum annuum de linhagem 061M4387, a semente representativa da qual é depositada sob N° de Acessão NCIMB 41428, quando avaliada no mesmo ensaio a um nível estatisticamente significante e sob condições ambientais idênticas, particularmente sob a mesma pressão de inseto.
Em uma modalidade, uma planta Capsicum annuum resistente a Bemisia é contanto que seja capaz de resistir ao desenvolvimento de inseto, particularmente oviposição e/ou desenvolvimento de pupas na planta, em que a referida resistência pode ser avaliada em um ensaio de resistência padrão, particularmente um ensaio como descrito no exemplo 2A abaixo, e em que um escore de resistência é obtido que é de pelo menos 2 escalas, particularmente pelo menos 3 escalas, mais particularmente pelo menos 4 escalas, porém especialmente pelo menos 5 escalas mais elevada que o escore de resistência obtido com uma variedade comercial suscetível padrão, tal como, por exemplo, Vergasa ou Bikingo, quando avaliado no mesmo ensaio a um nível estatisticamente significante e sob condições ambientais idênticas, particularmente sob a mesma pressão de inseto.
Em uma modalidade, é fornecida uma planta Capsicum annuum cultivada, a qual é resistente, particularmente de forma intermediária resistente, às infestações de tripes, especialmente às infestações de F. occidentalis, particularmente prevenindo-se dano de planta causado pela alimentação de tripes nas células epidérmicas de folhas, brotos, flores e frutas da plante Capsicum annuum, que resulta no prateamento, perda de cor de folha e deformações da fruta em desenvolvimento. A capacidade da planta de Capsicum de prevenir dano de alimentação causado por tripes pode ser avaliada em um ensaio de resistência padrão, particularmente um ensaio como descrito no exemplo 2B abaixo, determinando-se a extensão de dano de prateamento de acordo com uma escala que varia de 1-9.
Em uma modalidade da invenção, é fornecida uma planta de Capsicum annuum cultivada, que é resistente, particularmente de forma inPetição 870170065661, de 04/09/2017, pág. 13/142
6/127 termediária resistente, às infestações de tripes, particularmente às infestações de F. occidentalis, particularmente prevenindo-se dano de planta causado pela alimentação de tripes nas células epidérmicas de folhas, brotos, flores e frutas da planta de Capsicum annuum, em que a referida resistência pode ser avaliada em um ensaio de resistência padrão, particularmente um ensaio como descrito no exemplo 2B abaixo, e em que um escore de resistência é obtido divergindo-se por não mais que 2 escalas, particularmente por não mais que 1 escala, porém especialmente por não mais que 0,5 escala de uma contagem obtenível com uma planta de Capsicum annuum de linhagem 061M4387, a semente representativa da qual é depositada sob N° de Acessão NCIMB 41428, quando avaliada no mesmo ensaio a um nível estatisticamente significante e sob condições ambientais idênticas, particularmente sob a mesma pressão de inseto.
Em uma modalidade da invenção, a invenção fornece a planta de Capsicum annuum cultivada, que é resistente, particularmente de forma intermediária resistente, às infestações de tripes, particularmente às infestações de F. occidentalis, particularmente prevenindo dano de planta causado pela alimentação de tripes nas células epidérmicas de folhas, brotos, flores e frutas da planta de Capsicum annuum, em que a referida resistência pode ser avaliada em um ensaio de resistência padrão, particularmente um ensaio como descrito no exemplo 2B abaixo, e em que o dano de prateamento observado não diverge por mais que 8%, particularmente por mais que 5%, mais particularmente por mais que 2%, ainda mais particularmente por mais que 1%, porém especialmente por mais que 0,5%, do dano exibido em uma planta de Capsicum annuum de linhagem 061M4387, a semente representativa da qual é depositada sob N° de Acessão NCIMB 41428, quando avaliada no mesmo ensaio a um nível estatisticamente significante e sob condições ambientais idênticas, particularmente sob a mesma pressão de inseto.
Em uma modalidade da invenção, a invenção fornece planta de Capsicum annuum cultivada, que é resistente, particularmente de forma intermediária resistente, às infestações de tripes, particularmente às infestações de F. occidentalis, particularmente prevenindo dano de planta causado
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7/127 pela alimentação de tripés nas células epidérmicas de folhas, brotos, flores e frutas da planta Capsicum annuum, essencialmente no mesmo nível como uma planta de Capsicum annuum de linhagem 061M4387, a semente representativa da qual é depositada sob N° de Acessão NCIMB 41428, quando avaliada no mesmo ensaio a um nível estatisticamente significante e sob condições ambientais idênticas, particularmente sob a mesma pressão de inseto.
Em uma modalidade, é fornecida uma planta Capsicum annuum cultivada que é resistente, particularmente de forma intermediária resistente, às infestações de Bemisia e tripes, especialmente para infestações de Bemisia tabaci e F. occidentalis, particularmente prevenindo oviposição e/ou desenvolvimento de pupas de Bemisia e prevenindo dano de planta causado pela alimentação de tripes nas células epidérmicas de folhas, brotos, flores e frutas da planta de Capsicum annuum, respectivamente, em que a referida resistência pode ser avaliada em um ensaio de resistência padrão, particularmente um ensaio como descrito nos exemplos 2A e 2B abaixo, e em que, para Bemisia, um escore de resistência é obtido divergindo-se por não mais que 3 escalas, particularmente por não mais que 2 escalas, porém especialmente por não mais que 1 escala de um escore obtenível com uma planta de Capsicum annuum de linhagem 061M4387, a semente representativa da qual é depositada sob N° de Acessão NCIMB 41428, e, para tripes, um escore de resistência é obtido divergindo-se por não mais que 2 escalas, particularmente por não mais que 1 escala, porém especialmente por não mais que 0,5 escala de uma contagem obtenível com uma planta de Capsicum annuum de linhagem 061M4387, a semente representativa da qual é depositada sob N° de Acessão NCIMB 41428, quando avaliada no mesmo ensaio a um nível estatisticamente significante e sob condições ambientais idênticas, particularmente sob a mesma pressão de inseto.
Em uma modalidade, é fornecida uma planta Capsicum annuum cultivada, que é resistente, particularmente de forma intermediária resistente, às infestações de Bemisia e tripes, especialmente às infestações de Bemisia tabaci e F. occidentalis, particularmente prevenindo oviposição e/ou desenPetição 870170065661, de 04/09/2017, pág. 15/142
8/127 volvimento de pupas de Bemisia e prevenindo dano de planta causado pela alimentação de tripes nas células epidérmicas de folhas, brotos, flores e frutas da planta Capsicum annuum, respectivamente, essencialmente no mesmo nível como uma planta de Capsicum annuum de linhagem 061M4387, a semente representativa da qual é depositada sob N° de Acessão NCIMB 41428, quando avaliada no mesmo ensaio a um nível estatisticamente significante e sob condições ambientais idênticas, particularmente sob a mesma pressão de inseto.
Em uma modalidade, a presente invenção fornece planta de Capsicum annuum cultivada, que é resistente, particularmente de forma intermediária resistente, às infestações de Bemisia, em que a referida planta contém um genoma que compreende pelo menos um local de característica quantitativa (QTL) que contribui para a resistência à Bemisia, em particular Planta de Capsicum annuum cultivada que é resistente, particularmente de forma intermediária resistente, às infestações de Bemisia, em que a referida planta contém um genoma que compreende pelo menos um local de característica quantitativa (QTL) que contribui para a resistência à Bemisia, em que os referidos QTL ficam situados no cromossoma 3 e/ou cromossoma 5.
Em uma modalidade, a presente invenção fornece planta de Capsicum annuum cultivada, que é resistente, particularmente de forma intermediária resistente, às infestações de Bemisia, em que a referida planta contém um genoma que compreende pelo menos dois locais característicos quantitativos (QTL) que contribuem para a resistência à Bemisia, em que um primeiro QTL fica situado no cromossoma 3 e um segundo QTL fica situado no cromossoma 5.
Em uma modalidade, a presente invenção fornece planta de Capsicum annuum cultivada, que é resistente, particularmente de forma intermediária resistente, às infestações de tripes, em que a referida planta contém um genoma que compreende pelo menos um local de característica quantitativa (QTL) que contribui para a resistência à tripes, em particular Planta de Capsicum annuum cultivada que é resistente, particularmente de forma intermediária resistente, às infestações de tripes, em que a referida
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9/127 planta contém um genoma que compreende pelo menos um local de característica quantitativa (QTL) que contribui para a resistência à tripes, em que os referidos QTL ficam situados no cromossoma 5.
Em uma modalidade, a presente invenção fornece planta de Capsicum annuum cultivada que é resistente, particularmente de forma intermediária resistente, às infestações de Bemisia e tripes, em que a referida planta contém um genoma que compreende pelo menos um local de característica quantitativa (QTL) que contribui para a resistência à Bemisia e pelo menos um local de característica quantitativa (QTL) que contribui para a resistência à tripes, respectivamente. Em particular, a invenção refere-se a uma planta de Capsicum annuum cultivada, que é resistente, particularmente de forma intermediária resistente, às infestações de Bemisia e tripes como descrito aqui anteriormente, em que os referidos QTL que contribuem para a resistência à Bemisia ficam situados no cromossoma 3 e/ou cromossoma 5 e o referido QTL que contribui para a resistência à tripes fica situado no cromossoma 5.
Em uma modalidade, é fornecida uma planta Capsicum annuum cultivada, que é resistente, particularmente de forma intermediária resistente, às infestações de Bemisia e tripes, em que a referida planta contém um genoma que compreende locais característicos quantitativos (QTL) que contribuem para a resistência à Bemisia e tripes, em que um primeiro QTL que contribui para a resistência à Bemisia fica situado no cromossoma 3 e um segundo QTL que contribui para a resistência à Bemisia fica situado no cromossoma 5, e o referido QTL que contribui para a resistência à tripes fica situado no cromossoma 5.
Em uma modalidade, o QTL no cromossoma 5 é um único QTL que contribui para resistência tanto a Bemisia e quanto a tripes.
Em uma modalidade, os referidos QTL são obteníveis de uma planta que tem a base genética de linhagem 061M4387, particularmente de uma planta que tem a arquitetura ou base genética no QTL de linhagem 061M4387, porém especialmente de uma planta de linhagem 061M4387, a semente representativa da qual é depositada em NCIMB sob N° de Acessão
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10/127 NCIMB 41428, ou de uma progênie ou um antepassado da mesma que compreenda os referidos QTL.
Em uma modalidade adicional, a invenção refere-se a uma planta de Capsicum annuum cultivada de acordo com a invenção e como descrito aqui anteriormente, cuja planta contém um genoma que compreende pelo menos um local de característica quantitativa (QTL) que contribui para a resistência à Bemisia, em que o referido QTL é caracterizado por ser geneticamente ligado a pelo menos um local marcador, particularmente a pelo menos dois locais marcadores, mais particularmente a pelo menos três locais marcadores e ainda mais particularmente a pelo menos quatro locais marcadores, porém especialmente a pelo menos cinco e até seis locais marcadores, cujos locais marcadores estão no cromossoma 3 e cossegregam com a característica de resistência à Bemisia e podem ser identificados por um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR selecionado do grupo de par de iniciador 1 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 1 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 2, identificando o local marcador 1; par de iniciador 2 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 3 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 4, identificando o local marcador 2; par de iniciador 3 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 5 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 6, identificando o local marcador 3; par de iniciador 4 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 7 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 8, identificando o local marcador 4; par de iniciador 5 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 9 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 10, identificando o local marcador 5; e par de iniciador 6 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 11 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 12, identificando o local marcador 6; ou por qualquer outro local marcador que está estatisticamente correlacionado à característica de resistência à Bemisia.
Em uma modalidade, a invenção refere-se a uma planta de Capsicum annuum cultivada contendo um genoma que compreende pelo menos um local de característica quantitativa (QTL) que contribui para a resistência à Bemisia, em que o referido QTL é obtenível de uma planta de doador
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11/127 que tem a base genética de linhagem 061M4387, particularmente de uma planta que tem a arquitetura ou base genética no QTL de linhagem 061M4387, porém especialmente de uma planta de linhagem 061M4387, a semente representativa da qual é depositada em NCIMB sob N° de Acessão NCIMB 41428, ou de uma descendência ou um antepassado da mesma que compreende o referido QTL, cujo QTL na planta de doador é ligado geneticamente a pelo menos um local marcador, particularmente a pelo menos dois locais marcadores, particularmente a pelo menos três locais marcadores e particularmente a pelo menos quatro locais marcadores, particularmente a pelo menos cinco locais marcadores, particularmente a pelo menos seis locais marcadores, e até sete locais marcadores, cujos locais marcadores estão no cromossoma 3 e cossegregam com a característica de resistência à Bemisia e podem ser identificados por um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR selecionado do grupo de pares de iniciador 1 a 6 como determinado em SEQ ID NOS: 1 a 12.
Em uma modalidade, a invenção refere-se a uma planta de Capsicum annuum cultivada de acordo com a invenção e como descrito aqui anteriormente, cuja planta contém um genoma que compreende um local de característica quantitativa (QTL) que contribui para a resistência à tripes, em que o referido QTL é caracterizado por estar ligado geneticamente a pelo menos um local marcador, particularmente a pelo menos dois locais marcadores, particularmente a pelo menos três locais marcadores e particularmente a pelo menos quatro locais marcadores, particularmente a pelo menos cinco locais marcadores, particularmente a pelo menos seis locais marcadores, e até sete locais marcadores, cujos locais marcadores estão no cromossoma 5 e cossegregam com a característica de resistência à Bemisia e podem ser identificados por um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR selecionado do grupo de par de iniciador 7 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 13 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 14, identificando o local marcador 7; par de iniciador 8 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 15 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 16, identificando o local marcador 8; par de iniciador 9 representado por um iniciador
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12/127 dianteiro de SEQ ID NO: 17 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 18, identificando o local marcador 9; par de iniciador 10 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 19 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 20, identificando o local marcador 10; par de iniciador 11 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 21 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 22, identificando o local marcador 11; par de iniciador 12 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 23 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 24, identificando o local marcador 12, e par de iniciador 13 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 25 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 26, identificando o local marcador 13; ou por qualquer outro local marcador que está estatisticamente correlacionado à característica de resistência à Bemisia.
Em uma modalidade, a invenção refere-se a uma planta de Capsicum annuum cultivada contendo um genoma que compreende pelo menos um local de característica quantitativa (QTL) que contribui para a resistência à Bemisia, em que o referido QTL é obtenível de uma planta de doador que tem a base genética de linhagem 061M4387, particularmente de uma planta que tem a arquitetura ou base genética no QTL de linhagem 061M4387, porém especialmente de uma planta de linhagem 061M4387, a semente representativa da qual é depositada em NCIMB sob N° de Acessão NCIMB 41428, ou de uma descendência ou um antepassado da mesma que compreende o referido QTL, cujo QTL na planta de doador é ligado geneticamente a pelo menos um local marcador, particularmente a pelo menos dois locais marcadores, particularmente a pelo menos três locais marcadores e particularmente a pelo menos quatro locais marcadores, particularmente a pelo menos cinco locais marcadores, particularmente a pelo menos seis locais marcadores, e até sete locais marcadores, cujos locais marcadores estão no cromossoma 5 e cossegregam com a característica de resistência à Bemisia e podem ser identificados por um par de iniciadores de oligonucleotídeo de POR selecionado do grupo de pares de iniciador 7 a 13 como determinado em SEQ ID NOS: 13 a 26.
Em uma modalidade adicional, a invenção refere-se a uma planPetição 870170065661, de 04/09/2017, pág. 20/142
13/127 ta de Capsicum annuum cultivada de acordo com a invenção e como descrito aqui anteriormente, cuja planta contém um genoma que compreende pelo menos dois locais de característica quantitativa (QTL) que contribuem para a resistência à Bemisia, em que
a) um primeiro QTL é caracterizado por estar ligado geneticamente a pelo menos um local marcador, particularmente a pelo menos dois locais marcadores, mais particularmente a pelo menos três locais marcadores e ainda mais particularmente a pelo menos quatro locais marcadores, porém especialmente a pelo menos cinco e até seis locais marcadores, cujos locais marcadores estão no cromossoma 3 e cossegregam com a característica de resistência à Bemisia e podem ser identificados por um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR selecionado do grupo de par de iniciador 1 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 1 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 2, identificando o local marcador 1; par de iniciador 2 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 3 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 4, identificando o local marcador 2; par de iniciador 3 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 5 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 6, identificando o local marcador 3; par de iniciador 4 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 7 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 8, identificando o local marcador 4; par de iniciador 5 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 9 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 10, identificando o local marcador 5; e par de iniciador 6 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 11 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 12, identificando o local marcador 6; ou por qualquer outro local marcador no cromossoma 3 que está estatisticamente correlacionado à característica de resistência à Bemisia; e
b) um segundo QTL é caracterizado por estar ligado geneticamente a pelo menos um local marcador, particularmente a pelo menos dois locais marcadores, particularmente a pelo menos três locais marcadores e particularmente a pelo menos quatro locais marcadores, particularmen-
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14/127 te a pelo menos cinco locais marcadores, particularmente a pelo menos seis locais marcadores, e até sete locais marcadores, cujos locais marcadores estão no cromossoma 5 e cossegregam com a característica de resistência à Bemisia e podem ser identificados por um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR selecionado do grupo de par de iniciador 7 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 13 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 14, identificando o local marcador 7; par de iniciador 8 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 15 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 16, identificando o local marcador 8; par de iniciador 9 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 17 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 18, identificando o local marcador 9; par de iniciador 10 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 19 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 20, identificando o local marcador 10; par de iniciador 11 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 21 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 22, identificando o local marcador 11; par de iniciador 12 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 23 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 24, identificando o local marcador 12, e par de iniciador 13 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 25 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 26, identificando o local marcador 13, ou por qualquer outro local marcador no cromossoma 5 que está estatisticamente correlacionado à característica de resistência à Bemisia.
Em uma modalidade, a invenção refere-se a uma planta de Capsicum annuum cultivada contendo um genoma que compreende pelo menos dois locais de característica quantitativa (QTL) que contribuem para a resistência à Bemisia, em que os referidos QTL são obteníveis de uma planta de doador que tem a base genética de linhagem 061M4387, particularmente de uma planta que tem a arquitetura ou base genética no QTL de linhagem 061M4387, porém especialmente de uma planta de linhagem 061M4387, a semente representativa da qual é depositada em NCIMB sob N° de Acessão NCIMB 41428, ou de uma descendência ou um antepassado
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15/127 da mesma que compreende o referido QTL, cujo primeiro QTL está situado no cromossoma 3 na planta de doador e geneticamente ligado a pelo menos um local marcador, particularmente a pelo menos dois locais marcadores, particularmente a pelo menos três locais marcadores e particularmente a pelo menos quatro locais marcadores, particularmente a pelo menos cinco locais marcadores, particularmente a pelo menos seis locais marcadores, cujos locais marcadores estão no cromossoma 3 e cossegregam com a característica de resistência à Bemisia e podem ser identificados por um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR 1 a 6 como determinado em SEQ ID NOS: 1 a 12 e cujo segundo QTL fica situado no cromossoma 5 na planta de doador e geneticamente ligado a pelo menos um local marcador, particularmente a pelo menos dois locais marcadores, particularmente a pelo menos três locais marcadores e particularmente a pelo menos quatro locais marcadores, particularmente a pelo menos cinco locais marcadores, particularmente a pelo menos seis locais marcadores, e até sete locais marcadores, cujos locais marcadores estão no cromossoma 5 e cossegregam com a característica de resistência à Bemisia e podem ser identificados por um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR selecionado do grupo de pares de iniciador 7 a 13 como determinado em SEQ ID NOS: 13 a 26.
Em uma modalidade, a invenção refere-se a uma planta de Capsicum annuum cultivada de acordo com a invenção e como descrito aqui anteriormente, cuja planta contém um genoma que compreende pelo menos um local de característica quantitativa (QTL) que contribui para a resistência à tripes, em que o referido QTL é caracterizado por estar ligado geneticamente a pelo menos um local marcador, particularmente a pelo menos dois locais marcadores, particularmente a pelo menos três locais marcadores e particularmente a pelo menos quatro locais marcadores, particularmente a pelo menos cinco locais marcadores, particularmente a pelo menos seis locais marcadores, e até sete locais marcadores, cujos locais marcadores estão no cromossoma 5 e cossegregam com a característica de resistência à tripes e podem ser identificados por um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR selecionado do grupo de par de iniciador 7 representado por
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16/127 um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 13 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 14, identificando o local marcador 7; par de iniciador 8 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 15 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 16, identificando o local marcador 8; par de iniciador 9 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 17 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 18, identificando o local marcador 9; par de iniciador 10 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 19 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 20, identificando o local marcador 10; par de iniciador 11 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 21 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 22, identificando o local marcador 11; par de iniciador 12 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 23 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 24, identificando o local marcador 12, e par de iniciador 13 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 25 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 26, identificando o local marcador 13, ou por qualquer outro local marcador no cromossoma 5 que está estatisticamente correlacionado à característica de resistência à tripes.
Em uma modalidade, a invenção refere-se a uma planta de Capsicum annuum cultivada contendo um genoma que compreende pelo menos um local de característica quantitativa (QTL) que contribui para a resistência à tripes, em que o referido QTL é obtenível de uma planta de doador que tem a base genética de linhagem 061M4387, particularmente de uma planta que tem a arquitetura ou base genética no QTL de linhagem 061M4387, porém especialmente de uma planta de linhagem 061M4387, a semente representativa da qual é depositada em NCIMB sob N° de Acessão NCIMB 41428, ou de uma descendência ou um antepassado da mesma que compreende o referido QTL, cujo QTL na planta de doador é ligado geneticamente a pelo menos um local marcador, particularmente a pelo menos dois locais marcadores, particularmente a pelo menos três locais marcadores e particularmente a pelo menos quatro locais marcadores, particularmente a pelo menos cinco locais marcadores, particularmente a pelo menos seis locais marcadores, e até sete locais marcadores, cujos locais marcadores estão no cromossoma 5 e cossegregam com a característica de resistência à
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17/127 tripes e podem ser identificados por um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR selecionado do grupo de pares de iniciador 7 a 13 como determinado em SEQ ID NOS: 13 a 26.
Em uma modalidade, a presente invenção fornece planta de Capsicum annuum cultivada que é resistente, particularmente de forma intermediária resistente, às infestações de Bemisia e tripes, em que a referida planta contém um genoma que compreende pelo menos um local de característica quantitativa (QTL) que contribui para a resistência à Bemisia e pelo menos um local de característica quantitativa (QTL) que contribui para a resistência à tripes, respectivamente, em que o referido QTL que contribui para
a) resistência à Bemisia é caracterizado por estar ligado geneticamente a pelo menos um local marcador, particularmente a pelo menos dois locais marcadores, mais particularmente a pelo menos três locais marcadores e ainda mais particularmente a pelo menos quatro locais marcadores, porém especialmente a pelo menos cinco e até seis locais marcadores, cujos locais marcadores estão no cromossoma 3 e cossegregam com a característica de resistência à Bemisia e podem ser identificados por um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR selecionado do grupo de par de iniciador 1 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 1 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 2, identificando o local marcador 1; par de iniciador 2 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 3 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 4, identificando o local marcador 2; par de iniciador 3 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 5 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 6, identificando o local marcador 3; par de iniciador 4 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 7 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 8, identificando o local marcador 4; par de iniciador 5 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 9 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 10, identificando o local marcador 5; e par de iniciador 6 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 11 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 12, identificando o Io-
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18/127 cal marcador 6, ou por qualquer outro local marcador no cromossoma 3 que está estatisticamente correlacionado à característica de resistência à Bemisia; e
b) resistência à tripes é caracterizado por estar ligado geneticamente a pelo menos um local marcador, particularmente a pelo menos dois locais marcadores, particularmente a pelo menos três locais marcadores e particularmente a pelo menos quatro locais marcadores, particularmente a pelo menos cinco locais marcadores, particularmente a pelo menos seis locais marcadores, e até sete locais marcadores, cujos locais marcadores estão no cromossoma 5 e cossegregam com a característica de resistência à tripes e podem ser identificados por um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR selecionado do grupo de par de iniciador 7 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 13 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 14, identificando o local marcador 7; par de iniciador 8 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 15 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 16, identificando o local marcador 8; par de iniciador 9 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 17 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 18, identificando o local marcador 9; par de iniciador 10 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 19 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 20, identificando o local marcador 10; par de iniciador 11 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 21 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 22, identificando o local marcador 11; par de iniciador 12 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 23 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 24, identificando o local marcador 12, e par de iniciador 13 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 25 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 26, identificando o local marcador 13, ou por qualquer outro local marcador no cromossoma 5 que está estatisticamente correlacionado à característica de resistência à tripes.
Em uma modalidade, a presente invenção fornece planta de Capsicum annuum cultivada de acordo com qualquer das reivindicações an
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19/127 teriores que é resistente, particularmente de forma intermediária resistente, às infestações de Bemisia e tripes, em que a referida planta contém um genoma que compreende pelo menos um local de característica quantitativa (QTL) que contribui para a resistência à Bemisia e pelo menos um local de característica quantitativa (QTL) que contribui para a resistência à tripes, respectivamente, em que o referido QTL que contribui para
a) resistência à Bemisia é caracterizado por ser geneticamente ligado a
i) pelo menos um local marcador, particularmente a pelo menos dois locais marcadores, mais particularmente a pelo menos três locais marcadores e ainda mais particularmente a pelo menos quatro locais marcadores, porém especialmente a pelo menos cinco e até seis locais marcadores, cujos locais marcadores estão no cromossoma 3 e cossegregam com a característica de resistência à Bemisia e podem ser identificados por um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR selecionado do grupo de par de iniciador 1 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 1 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 2, identificando o local marcador 1; par de iniciador 2 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 3 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 4, identificando o local marcador 2; par de iniciador 3 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 5 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 6, identificando o local marcador 3; par de iniciador 4 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 7 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 8, identificando o local marcador 4; par de iniciador 5 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 9 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 10, identificando o local marcador 5; e par de iniciador 6 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 11 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 12, identificando o local marcador 6, ou por qualquer outro local marcador no cromossoma 3 que está estatisticamente correlacionado à característica de resistência à Bemisia; e/ou
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20/127 ii. pelo menos um local marcador, particularmente a pelo menos dois locais marcadores, particularmente a pelo menos três locais marcadores e particularmente a pelo menos quatro locais marcadores, particularmente a pelo menos cinco locais marcadores, particularmente a pelo menos seis locais marcadores, e até sete locais marcadores, cujos locais marcadores estão no cromossoma 5 e cossegregam com a característica de resistência à tripes e podem ser identificados por um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR selecionado do grupo de par de iniciador 7 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 13 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 14, identificando o local marcador 7; par de iniciador 8 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 15 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 16, identificando o local marcador 8; par de iniciador 9 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 17 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 18, identificando o local marcador 9; par de iniciador 10 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 19 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 20, identificando o local marcador 10; par de iniciador 11 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 21 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 22, identificando o local marcador 11; par de iniciador 12 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 23 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 24, identificando o local marcador 12, e par de iniciador 13 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 25 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 26, identificando o local marcador 13, ou por qualquer outro local marcador no cromossoma 5 que está estatisticamente correlacionado à característica de resistência à Bemisia; e
b) resistência à tripes é caracterizado por estar ligado geneticamente a pelo menos um local marcador, particularmente a pelo menos dois locais marcadores, particularmente a pelo menos três locais marcadores
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21/127 e particularmente a pelo menos quatro locais marcadores, particularmente a pelo menos cinco locais marcadores, particularmente a pelo menos seis locais marcadores, e até sete locais marcadores, cujos locais marcadores estão no cromossoma 5 e cossegregam com a característica de resistência à tripes e podem ser identificados por um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR selecionado do grupo de par de iniciador 7 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 13 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 14, identificando o local marcador 7; par de iniciador 8 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 15 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 16, identificando o local marcador 8; par de iniciador 9 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 17 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 18, identificando o local marcador 9; par de iniciador 10 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 19 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 20, identificando o local marcador 10; par de iniciador 11 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 21 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 22, identificando o local marcador 11; par de iniciador 12 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 23 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 24, identificando o local marcador 12, e par de iniciador 13 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 25 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 26, identificando o local marcador 13, ou por qualquer outro local marcador no cromossoma 5 que está estatisticamente correlacionado à característica de resistência à tripes.
Em uma modalidade, a presente invenção fornece planta de Capsicum annuum cultivada que é resistente, particularmente de forma intermediária resistente, às infestações de Bemisia e tripes, em que a referida planta contém um genoma que compreende pelo menos um local de característica quantitativa (QTL) que contribui para a resistência à Bemisia e pelo menos um local de característica quantitativa (QTL) que contribui para a resistência à tripes, respectivamente, em que os referidos QTL são obteníveis de uma planta de doador que tem a base genética de linhagem
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061M4387, particularmente de uma planta que tem a arquitetura ou base genética no QTL de linhagem 061M4387, porém especialmente de uma planta de linhagem 061M4387, a semente representativa da qual é depositada em NCIMB sob N° de Acessão NCIMB 41428, ou de uma descendência ou um antepassado da mesma que compreende os referidos QTL, e em que
a) um primeiro QTL que contribui para a resistência à Bemisia é ligado geneticamente na planta de doador a pelo menos um local marcador, particularmente a pelo menos dois locais marcadores, mais particularmente a pelo menos três locais marcadores e ainda mais particularmente a pelo menos quatro locais marcadores, porém especialmente a pelo menos cinco e até seis locais marcadores, cujos locais marcadores estão no cromossoma 3 e cossegregam com a característica de resistência à Bemisia e podem ser identificados por um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR selecionado do grupo de pares de iniciador 1 a 6 representado por um um iniciador dianteiro e um reverso como determinado em SEQ ID NOS: 1 a 12; e/ou
b) um segundo QTL que contribui para a resistência à Bemisia é ligado geneticamente na planta de doador a pelo menos um local marcador, particularmente a pelo menos dois locais marcadores, particularmente a pelo menos três locais marcadores e particularmente a pelo menos quatro locais marcadores, particularmente a pelo menos cinco locais marcadores, particularmente a pelo menos seis locais marcadores, e até sete locais marcadores, cujos locais marcadores estão no cromossoma 5 e cossegregam com a característica de resistência à Bemisia e podem ser identificados por um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR selecionado do grupo de pares de iniciador 7 a 13 representados por um um iniciador dianteiro e um reverso como determinado em SEQ ID NOS: 13 a 26; e.
c) um QTL que contribui para a resistência à tripes é ligado geneticamente na planta de doador a pelo menos um local marcador, particularmente a pelo menos dois locais marcadores, particularmente a pelo menos três locais marcadores e particularmente a pelo menos quatro locais
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23/127 marcadores, particularmente a pelo menos cinco locais marcadores, particularmente a pelo menos seis locais marcadores, e até sete locais marcadores, cujos locais marcadores estão no cromossoma 5 e cossegregam com a característica de resistência à tripes e podem ser identificados por um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR selecionado do grupo de pares de iniciador 7 a 13 representados por um um iniciador dianteiro e um reverso como determinado em SEQ ID NOS: 13 a 26.
Em uma modalidade, a presente invenção fornece planta de Capsicum annuum cultivada que é resistente, particularmente de forma intermediária resistente, às infestações de Bemisia e tripes, em que a referida planta contém um genoma que compreende pelo menos um local de característica quantitativa (QTL) que contribui para a resistência à Bemisia e pelo menos um local de característica quantitativa (QTL) que contribui para a resistência à tripes, respectivamente, em que os referidos QTL são obteníveis de uma planta de doador que tem a base genética de linhagem 061M4387, particularmente de uma planta que tem a arquitetura ou base genética no QTL de linhagem 061M4387, porém especialmente de uma planta de linhagem 061M4387, a semente representativa da qual é depositada em NCIMB sob N° de Acessão NCIMB 41428, ou de uma descendência ou um antepassado da mesma que compreende os referidos QTL, e em que o referido QTL que contribui para
a) resistência à Bemisia na planta de doador é geneticamente ligada a pelo menos um local marcador, particularmente a pelo menos dois locais marcadores, mais particularmente a pelo menos três locais marcadores e ainda mais particularmente a pelo menos quatro locais marcadores, porém especialmente a pelo menos cinco e até seis locais marcadores, cujos locais marcadores estão no cromossoma 3 e cossegregam com a característica de resistência à Bemisia e podem ser identificados por um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR selecionado do grupo de pares de iniciador 1 a 6 representado por um um iniciador dianteiro e um reverso como determinado em SEQ ID
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NOS: 1 a 12; e
b) resistência à tripes na planta de doador é geneticamente ligado a pelo menos um local marcador, particularmente a pelo menos dois locais marcadores, particularmente a pelo menos três locais marcadores e particularmente a pelo menos quatro locais marcadores, particularmente a pelo menos cinco locais marcadores, particularmente a pelo menos seis locais marcadores, e até sete locais marcadores, cujos locais marcadores estão no cromossoma 5 e cossegregam com a característica de resistência à tripes e podem ser identificados por um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR selecionado do grupo de pares de iniciador 7 a 13 representados por um um iniciador dianteiro e um reverso como determinado em SEQ ID NOS: 13 a 26.
Em uma modalidade da invenção, um ou mais iniciadores ou sondas, particularmente um ou mais pares de iniciador, porém especialmente um ou mais pares de iniciador consistindo em um iniciador dianteiro e um iniciador inverso, podem ser estabelecidos para identificar os locais marcadores de acordo com a invenção usando-se o referido um ou mais iniciadores ou sondas ou o referido um ou mais pares de iniciador, particularmente combinando-se os iniciadores dianteiros e reversos de SEQ ID NOS: 1-12 para resultar em um par de iniciador que permite identificar um ou mais dos locais marcadores no cromossoma 3, que cossegregam com a característica de resistência à Bemisia.
Em uma modalidade da invenção, um ou mais iniciadores ou sondas, particularmente um ou mais pares de iniciador, porém especialmente um ou mais pares de iniciador consistindo em um iniciador dianteiro e um iniciador inverso, podem ser estabelecidos para identificar os locais marcadores de acordo com a invenção usando-se o referido um ou mais iniciadores ou sondas ou o referido um ou mais pares de iniciador, particularmente combinando-se os iniciadores dianteiros e reversos de SEQ ID NOS: 13-26 para resultar em um par de iniciador que permite identificar um ou mais dos locais marcadores no cromossoma 5, que cossegregam com a característica de resistência tripes e/ou Bemisia.
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Da mesma forma compreendido pela presente Invenção são iniciadores e/ou sondas, particularmente pares de iniciador, porém especialmente pares de iniciador consistindo em iniciadores dianteiros e reversos que exibem uma sequência de nucleotídeo que é de pelo menos de 90%, pelo menos de 95%, pelo menos de 96%, pelo menos de 97%, pelo menos de 98%, ou pelo menos de 99% idêntica àquela determinada em SEQ ID NOS: 1-12 e em SEQ ID NOS: 13-26, respectivamente, e da mesma forma os pares de iniciador resultantes de uma combinação dos referidos iniciadores dianteiros e reversos.
Em particular, a característica de resistência à Bemisia de acordo com a invenção que reside no cromossoma 3 pode ser identificada por um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR selecionado do grupo de par de iniciador 1 representado por um iniciador dianteiro que tem pelo menos de 90%, particularmente pelo menos de 95%, particularmente pelo menos de 96%, particularmente pelo menos de 97%, particularmente pelo menos de 98%, particularmente pelo menos de 99% de identidade de sequência com a sequência descrita em SEQ ID NO: 1 e um iniciador inverso que tem pelo menos de 90%, particularmente pelo menos de 95%, particularmente pelo menos de 96%, particularmente pelo menos de 97%, particularmente pelo menos de 98%, particularmente pelo menos de 99% de identidade de sequência com a sequência descrita em SEQ ID NO: 2 identificando o local marcador 1; par de iniciador 2 representado por um iniciador dianteiro que tem pelo menos de 90%, particularmente pelo menos de 95%, particularmente pelo menos de 96%, particularmente pelo menos de 97%, particularmente pelo menos de 98%, particularmente pelo menos de 99% de identidade de sequência com a sequência descrita em SEQ ID NO: 3 e um iniciador inverso que tem pelo menos de 90%, particularmente pelo menos de 95%, particularmente pelo menos de 96%, particularmente pelo menos de 97%, particularmente pelo menos de 98%, particularmente pelo menos de 99% de identidade de sequência com a sequência descrita em SEQ ID NO: 4 identificando o local marcador 2; par de iniciador 3 representado por um iniciador dianteiro que tem pelo menos de 90%, particularmente pelo menos
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26/127 de 95%, particularmente pelo menos de 96%, particularmente pelo menos de 97%, particularmente pelo menos de 98%, particularmente pelo menos de 99% de identidade de sequência com a sequência descrita em SEQ ID NO: 5 e um iniciador inverso que tem pelo menos de 90%, particularmente pelo menos de 95%, particularmente pelo menos de 96%, particularmente pelo menos de 97%, particularmente pelo menos de 98%, particularmente pelo menos de 99% de identidade de sequência com a sequência descrita em SEQ ID NO: 6 identificando o local marcador 3; par de iniciador 4 representado por um iniciador dianteiro que tem pelo menos de 90%, particularmente pelo menos de 95%, particularmente pelo menos de 96%, particularmente pelo menos de 97%, particularmente pelo menos de 98%, particularmente pelo menos de 99% de identidade de sequência com a sequência descrita em SEQ ID NO: 7 e um iniciador inverso que tem pelo menos de 90%, particularmente pelo menos de 95%, particularmente pelo menos de 96%, particularmente pelo menos de 97%, particularmente pelo menos de 98%, particularmente pelo menos de 99% de identidade de sequência com a sequência descrita em SEQ ID NO: 8 identificando o local marcador 4; par de iniciador 5 representado por um iniciador dianteiro que tem pelo menos de 90%, particularmente pelo menos de 95%, particularmente pelo menos de 96%, particularmente pelo menos de 97%, particularmente pelo menos de 98%, particularmente pelo menos de 99% de identidade de sequência com a sequência descrita em SEQ ID NO: 9 e um iniciador inverso que tem pelo menos de 90%, particularmente pelo menos de 95%, particularmente pelo menos de 96%, particularmente pelo menos de 97%, particularmente pelo menos de 98%, particularmente pelo menos de 99% de identidade de sequência com a sequência descrita em SEQ ID NO: 10 identificando o local marcador 5; e par de iniciador 6 representado por um iniciador dianteiro que tem pelo menos de 90%, particularmente pelo menos de 95%, particularmente pelo menos de 96%, particularmente pelo menos de 97%, particularmente pelo menos de 98%, particularmente pelo menos de 99% de identidade de sequência com a sequência descrita em SEQ ID NO: 11 e um iniciador inverso que tem pelo menos de 90%, particularmente pelo menos de 95%,
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27/127 particularmente pelo menos de 96%, particularmente pelo menos de 97%, particularmente pelo menos de 98%, particularmente pelo menos de 99% de identidade de sequência com a sequência descrita em SEQ ID NO: 12 identificando o local marcador 6, ou por qualquer outro iniciador ou par de iniciador que identifica um local marcador no cromossoma 3 que está estatisticamente correlacionado à característica de resistência à Bemisia.
Em uma modalidade, a característica de resistência à tripes e/ou característica de resistência à Bemisia de acordo com a invenção que reside no cromossoma 5 pode ser identificada por um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR selecionado do grupo de par de iniciador 7 representado por um iniciador dianteiro que tem pelo menos de 90%, particularmente pelo menos de 95%, particularmente pelo menos de 96%, particularmente pelo menos de 97%, particularmente pelo menos de 98%, particularmente pelo menos de 99% de identidade de sequência com a sequência descrita em SEQ ID NO: 13 e um iniciador inverso que tem pelo menos de 90%, particularmente pelo menos de 95%, particularmente pelo menos de 96%, particularmente pelo menos de 97%, particularmente pelo menos de 98%, particularmente pelo menos de 99% de identidade de sequência com a sequência descrita em SEQ ID NO: 14, identificando o local marcador 7; par de iniciador 8 representado por um iniciador dianteiro que tem pelo menos de 90%, particularmente pelo menos de 95%, particularmente pelo menos de 96%, particularmente pelo menos de 97%, particularmente pelo menos de 98%, particularmente pelo menos de 99% de identidade de sequência com a sequência descrita em SEQ ID NO: 15 e um iniciador inverso que tem pelo menos de 90%, particularmente pelo menos de 95%, particularmente pelo menos de 96%, particularmente pelo menos de 97%, particularmente pelo menos de 98%, particularmente pelo menos de 99% de identidade de sequência com a sequência descrita em SEQ ID NO: 16, identificando o local marcador 8; par de iniciador 9 representado por um iniciador dianteiro que tem pelo menos de 95%, particularmente pelo menos de 96%, particularmente pelo menos de 97%, particularmente pelo menos de 98%, particularmente pelo menos de 99% de identidade de sequência com a sequência
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28/127 descrita em SEQ ID NO: 17 e um iniciador inverso que tem pelo menos de 95%, particularmente pelo menos de 96%, particularmente pelo menos de 97%, particularmente pelo menos de 98%, particularmente pelo menos de 99% de identidade de sequência com a sequência descrita em SEQ ID NO: 18, identificando o local marcador 9; par de iniciador 10 representado por um iniciador dianteiro que tem pelo menos de 90%, particularmente pelo menos de 95%, particularmente pelo menos de 96%, particularmente pelo menos de 97%, particularmente pelo menos de 98%, particularmente pelo menos de 99% de identidade de sequência com a sequência descrita em SEQ ID NO: 19 e um iniciador inverso que tem pelo menos de 90%, particularmente pelo menos de 95%, particularmente pelo menos de 96%, particularmente pelo menos de 97%, particularmente pelo menos de 98%, particularmente pelo menos de 99% de identidade de sequência com a sequência descrita em SEQ ID NO: 20, identificando o local marcador 10; par de iniciador 11 representado por um iniciador dianteiro que tem pelo menos de 90%, particularmente pelo menos de 95%, particularmente pelo menos de 96%, particularmente pelo menos de 97%, particularmente pelo menos de 98%, particularmente pelo menos de 99% de identidade de sequência com a sequência descrita em SEQ ID NO: 21 e um iniciador inverso que tem pelo menos de 90%, particularmente pelo menos de 95%, particularmente pelo menos de 96%, particularmente pelo menos de 97%, particularmente pelo menos de 98%, particularmente pelo menos de 99% de identidade de sequência com a sequência descrita em SEQ ID NO: 22, identificando o local marcador 11; par de iniciador 12 representado por um iniciador dianteiro que tem pelo menos de 90%, particularmente pelo menos de 95%, particularmente pelo menos de 96%, particularmente pelo menos de 97%, particularmente pelo menos de 98%, particularmente pelo menos de 99% de identidade de sequência com a sequência descrita em SEQ ID NO: 23 e um iniciador inverso que tem pelo menos de 90%, particularmente pelo menos de 95%, particularmente pelo menos de 96%, particularmente pelo menos de 97%, particularmente pelo menos de 98%, particularmente pelo menos de 99% de identidade de sequência com a sequência descrita em SEQ ID NO: 24, identificando
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29/127 o local marcador 12, e par de iniciador 13 representado por um iniciador dianteiro que tem pelo menos de 90%, particularmente pelo menos de 95%, particularmente pelo menos de 96%, particularmente pelo menos de 97%, particularmente pelo menos de 98%, particularmente 99% de identidade de sequência com a sequência descrita em SEQ ID NO: 25 e um iniciador inverso que tem pelo menos de 90%, particularmente pelo menos de 95%, particularmente pelo menos de 96%, particularmente pelo menos de 97%, particularmente pelo menos de 98%, particularmente pelo menos de 99% de identidade de sequência com a sequência descrita em SEQ ID NO: 26, identificando o local marcador 13; ou por qualquer outro iniciador ou par de iniciador que identifica um local marcador no cromossoma 5 que está estatisticamente correlacionado à característica de resistência à tripes e/ou Bemisia.
Em uma modalidade da invenção, iniciadores de oligonucleotídeo são abrangidos, particularmente pares de iniciador, porém especialmente pares de iniciador consistindo em um iniciador dianteiro e um reverso que exibe uma sequência de nucleotídeo que hibridiza para as sequências de nucleotídeo das sequências de iniciador dianteiro e reverso determinado em SEQ ID NOS: 1-12 mostradas na Tabela 10 e para as sequências de nucleotídeo das sequências de iniciador dianteiro e reverso determinado em SEQ ID NOS: 13-26 mostradas na Tabela 11, respectivamente, sob condições de severidade média, particularmente sob média a alta, particularmente sob alta.
Em uma modalidade, a invenção refere-se às sequências de oligonucleotídeo, particularmente às sequências de oligonucleotídeo que podem ser usadas como iniciadores e/ou sondas, particularmente aos pares de iniciador, porém especialmente aos pares de iniciador que consistem em um iniciador dianteiro e um reverso que exibe uma sequência de nucleotídeo que hibridiza para as sequências de nucleotídeo obteníveis usando-se um iniciador dianteiro e um reverso que exibe uma sequência de nucleotídeo que hibridiza para as sequências de nucleotídeo das sequências de iniciador dianteiro e reverso determinado em edido SEQ ID NOS: 1-12 mostradas na Tabela 10 e para as sequências de nucleotídeo das sequências de iniciador
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30/127 dianteiro e reverso determinado em SEQ ID NOS: 13-26 mostradas na Tabela 11, respectivamente, sob condições de severidade média, particularmente sob média a alta, particularmente sob alta.
Em outra modalidade da invenção, uma planta de Capsicum annuum cultivada é fornecida como descrito aqui anteriormente, em que a referida planta compreende um local de característica quantitativa (QTL) associado com resistência à Bemisia, cujo QTL é caracterizado por estar ligado geneticamente a pelo menos um local marcador, particularmente um local marcador no cromossoma 3, e em que o referido QTL é também definido por pelo menos um alelo marcador no referido pelo menos um local marcador ligado ao QTL, cujo alelo marcador é caracterizado pelo produto de amplificação de PCR de um iniciador de oligonucleotídeo ou par de iniciador selecionado do grupo de pares de iniciador 1-6 representados por iniciadores dianteiros e reversos de SEQ ID NOS: 1-12, incluindo pares de iniciador resultantes de uma combinação dos iniciadores dianteiros e reversos de SEQ ID NOS: 1-12, ou de qualquer outro iniciador ou par de iniciador que identifica um local marcador no cromossoma 3 que está estatisticamente correlacionado à característica de resistência à Bemisia, cujo produto de amplificação corresponde a um produto de amplificação obtenível da linhagem 061M4387 inata (NCIMB 41428) em uma reação de PCR com iniciadores idênticos obteníveis dos referidos pares de iniciador 1-6 contanto que o local marcador respectivo ainda esteja presente na referida planta de Capsicum.
Em particular, a planta de Capsicum annuum cultivada como descrito aqui anteriormente compreende um local de característica quantitativa (QTL) associado com resistência à Bemisia, cujo QTL é caracterizado por estar ligado geneticamente a pelo menos um local marcador, particularmente um local marcador no cromossoma 3, e em que o referido QTL é também definido por pelo menos um alelo marcador no referido pelo menos um local marcador ligado ao QTL, cujo alelo marcador é caracterizado pelo produto de amplificação de PCR de um par de iniciador de oligonucleotídeo selecionado do grupo de par de iniciador 1 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 1 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 2, identifiPetição 870170065661, de 04/09/2017, pág. 38/142
31/127 cando o local marcador 1; par de iniciador 2 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 3 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 4, identificando o local marcador 2; par de iniciador 3 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 5 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 6, identificando o local marcador 3; par de iniciador 4 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 7 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 8, identificando o local marcador 4; par de iniciador 5 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 9 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 10, identificando o local marcador 5; e par de iniciador 6 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 11 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 12, identificando o local marcador 6, cujo produto de amplificação corresponde a um produto de amplificação obtenível de linhagem 061M4387 inata (NCIMB 41428) em uma reação de PCR com pares de iniciador 1-6 identificados acima contanto que o local marcador respectivo ainda esteja presente na referida planta de Capsicum e/ou possa ser considerado um alelo da mesma.
Em outra modalidade da invenção, uma planta de Capsicum annuum cultivada é fornecida como descrito aqui anteriormente, em que a referida planta compreende um local de característica quantitativa (QTL) associado com resistência à Bemisia, cujo QTL é caracterizado por estar ligado geneticamente a pelo menos um local marcador, particularmente um local marcador no cromossoma 5, e em que o referido QTL é também definido por pelo menos um alelo marcador no referido pelo menos um local marcador ligado ao QTL, cujo alelo marcador é caracterizado pelo produto de amplificação de PCR de um iniciador de oligonucleotídeo ou par de iniciador selecionado do grupo de pares de iniciador 7-13 representados por iniciadores dianteiros e reversos de SEQ ID NOS: 13-26, incluindo pares de iniciador resultantes de uma combinação dos iniciadores dianteiros e reversos de SEQ ID NOS: 13-26, ou de qualquer outro iniciador ou par de iniciador que identifica um local marcador no cromossoma 5 que está estatisticamente correlacionado à característica de resistência à Bemisia, cujo produto de amplificação corresponde a um produto de amplificação obtenível de linhaPetição 870170065661, de 04/09/2017, pág. 39/142
32/127 gem 061M4387 inata (NCIMB 41428) em uma reação de PCR com iniciadores idênticos obteníveis de pares de iniciador 7-13 identificados acima contanto que o local marcador respectivo ainda esteja presente na referida planta de Capsicum e/ou possam ser considerados um alelo da planta.
Em particular, a planta de Capsicum annuum cultivada como descrito aqui anteriormente compreende um local de característica quantitativa (QTL) associado com resistência à Bemisia que QTL é caracterizado por estar ligado geneticamente a pelo menos um local marcador, particularmente um local marcador no cromossoma 5, e em que o referido QTL é também definido por pelo menos um alelo marcador no referido pelo menos um local marcador ligado ao QTL, cujo alelo marcador é caracterizado pelo produto de amplificação de PCR de um par de iniciador de oligonucleotídeo selecionado do grupo de par de iniciador 7 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 13 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 14, identificando o local marcador 7; par de iniciador 8 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 15 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 16, identificando o local marcador 8; par de iniciador 9 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 17 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 18, identificando o local marcador 9; par de iniciador 10 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 19 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 20, identificando o local marcador 10; par de iniciador 11 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 21 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 22, identificando o local marcador 11; par de iniciador 12 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 23 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 24, identificando o local marcador 12, e par de iniciador 13 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 25 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 26, identificando o local marcador 13, cujo produto de amplificação corresponde a um produto de amplificação obtenível de linhagem 061M4387 inata (NCIMB 41428) em uma reação de PCR com iniciadores idênticos obteníveis de pares de iniciador 7-13 identificados acima contanto que o local marcador respectivo ainda esteja presente na referida planta de Capsicum e/ou possa ser considerado um alelo da mesma.
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Em outra modalidade da invenção, uma planta de Capsicum annuum cultivada é fornecida como descrito aqui anteriormente, em que a referida planta compreende um local de característica quantitativa (QTL) associado com resistência à tripes, cujo QTL é caracterizado por estar ligado geneticamente a pelo menos um local marcador, particularmente um local marcador no cromossoma 5, e em que o referido QTL é também definido por pelo menos um alelo marcador no referido pelo menos um local marcador ligado ao QTL, cujo alelo marcador é caracterizado pelo produto de amplificação de PCR de um iniciador de oligonucleotídeo ou par de iniciador selecionado do grupo de pares de iniciador 7-13 representados por iniciadores dianteiros e reversos de SEQ ID NOS: 13-26, incluindo pares de iniciador resultantes de uma combinação dos iniciadores dianteiros e reversos de SEQ ID NOS: 13-26, ou de qualquer outro iniciador ou par de iniciador que identifica um local marcador no cromossoma 5 que está estatisticamente correlacionado à característica de resistência à tripes, cujo produto de amplificação corresponde a um produto de amplificação obtenível de linhagem 061M4387 inata (NCIMB 41428) em uma reação de PCR com iniciadores idênticos obteníveis de pares de iniciador 7-13 identificados acima contanto que o local marcador respectivo ainda esteja presente na referida plata de Capsicum e/ou possa ser considerado um alelo da mesma.
Em particular, a planta de Capsicum annuum cultivada como descrito aqui anteriormente compreende um local de característica quantitativa (QTL) associado com resistência à tripes, cujo QTL é caracterizado por estar ligado geneticamente a pelo menos um local marcador, particularmente um local marcador no cromossoma 5, e em que o referido QTL é também definido por pelo menos um alelo marcador no referido pelo menos um local marcador ligado ao QTL, cujo alelo marcador é caracterizado pelo produto de amplificação de PCR de um iniciador de oligonucleotídeo ou par de iniciador selecionado do grupo de par de iniciador 7 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 13 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 14, identificando o local marcador 7; par de iniciador 8 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 15 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 16,
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34/127 identificando o local marcador 8; par de iniciador 9 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 17 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 18, identificando o local marcador 9; par de iniciador 10 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 19 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 20, identificando o local marcador 10; par de iniciador 11 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 21 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 22, identificando o local marcador 11; par de iniciador 12 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 23 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 24, identificando o local marcador 12, e par de iniciador 13 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 25 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 26, identificando o local marcador 13, cujo produto de amplificação corresponde a um produto de amplificação obtenível de linhagem 061M4387 inata (NCIMB 41428) em uma reação de PCR com iniciadores idênticos obteníveis de pares de iniciador 7-13 identificados acima contanto que o local marcador respectivo ainda esteja presente na referida planta de Capsicum e/ou possa ser considerado um alelo da mesma.
Em uma modalidade da invenção, uma planta de Capsicum annuum cultivada é fornecida como descrito aqui anteriormente, em que a referida planta compreende pelo menos um local de característica quantitativa (QTL) associado com resistência à Bemisia e um local de característica quantitativa (QTL) associado com a resistência à tripes, respectivamente, cujos QTL são caracterizados por ser ligados geneticamente a pelo menos um local marcador cada, particularmente um local marcador no cromossoma 3 e cromossoma 5, respectivamente, e em que os referidos QTL são também definidos por pelo menos um alelo marcador a disse um local marcador ligado pelo menos
a) um primeiro QTL no cromossoma 3, cujo alelo marcador é caracterizado pelo produto de amplificação de PCR de um iniciador de oligonucleotídeo ou par de iniciador selecionado do grupo de pares de iniciador 1-6 representados por iniciadores dianteiros e reversos de SEQ ID NOS: 1-12, ou de qualquer outro iniciador ou par de iniciador que identifica um local marcador no cromossoma 3 que está estatisticamente
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35/127 correlacionado à característica de resistência à Bemisia, e
b) um segundo QTL no cromossoma 5, cujo alelo marcador é caracterizado pelo produto de amplificação de PCR de iniciador de oligonucleotídeo ou par de iniciador selecionado do grupo de pares de iniciador 713 representados por iniciadores dianteiros e reversos de SEQ ID NOS: 13-26, respectivamente, ou de qualquer outro iniciador ou par de iniciador que identifica um local marcador no cromossoma 5 que está estatisticamente correlacionado à característica de resistência à Bemisia e/ou tripes, incluindo pares de iniciador resultantes de uma combinação dos iniciadores dianteiros e reversos de SEQ ID NOS: 1-12 e de uma combinação dos iniciadores dianteiros e reversos de SEQ ID NOS: 13-26, respectivamente, cujo produto de amplificação corresponde a um produto de amplificação obtenível de linhagem 061M4387 inata (NCIMB 41428) em uma reação de PCR com iniciadores idênticos obteníveis dos referidos pares de iniciador 1-6 e 7-13, respectivamente, contanto que o local marcador respectivo ainda esteja presente na referida planta de Capsicum e/ou possa ser considerado um alelo da mesma.
Em particular, a planta de Capsicum annuum cultivada como descrito aqui anteriormente compreende um local de característica quantitativa (QTL) associado
a) com resistência à Bemisia, cujo QTL é caracterizado por estar ligado geneticamente a pelo menos um local marcador, particularmente um local marcador no cromossoma 3, e em que o referido QTL é também definido por pelo menos um alelo marcador no referido pelo menos um local marcador ligado ao QTL, cujo alelo marcador é caracterizado pelo produto de amplificação de PCR de um par de iniciador de oligonucleotídeo selecionado do grupo de par de iniciador 1 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 1 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 2, identificando o local marcador 1; par de iniciador 2 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 3 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 4, identificando o local marcador 2; par de iniciador 3 re
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36/127 presentado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 5 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 6, identificando o local marcador 3; par de iniciador 4 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 7 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 8, identificando o local marcador 4; par de iniciador 5 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 9 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 10, identificando o local marcador 5; e par de iniciador 6 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 11 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 12, identificando o local marcador 6, ou por qualquer outro local marcador no cromossoma 3 que está estatisticamente correlacionado à característica de resistência à Bemisia; e
b) com resistência à Bemisia e/ou tripes, cujo QTL é caracterizado por estar ligado geneticamente a pelo menos um local marcador, particularmente um local marcador no cromossoma 5, e em que o referido QTL é também definido por pelo menos um alelo marcador no referido pelo menos um local marcador ligado ao QTL, cujo alelo marcador é caracterizado pelo produto de amplificação de PCR de um par de iniciador de oligonucleotídeo selecionado do grupo de par de iniciador 7 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 13 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 14, identificando o local marcador 7; par de iniciador 8 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 15 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 16, identificando o local marcador 8; par de iniciador 9 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 17 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 18, identificando o local marcador 9; par de iniciador 10 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 19 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 20, identificando o local marcador 10; par de iniciador 11 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 21 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 22, identificando o local marcador 11; par de iniciador 12 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 23 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 24, identificando o local marcador 12, e par de iniciador 13 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 25 e
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37/127 um iniciador inverso de SEQ ID NO: 26, identificando o local marcador 13, ou por qualquer outro local marcador no cromossoma 5 que está estatisticamente correlacionado à característica de resistência à tripes e/ou Bemisia, em que cada produto de amplificação corresponde a um produto de amplificação obtenível de linhagem 061M4387 inata (NCIMB 41428) em uma reação de PCR com iniciadores idênticos obteníveis de pares de iniciador 1-6 e 7-13, respectivamente, identificados acima contanto que o local marcador respectivo ainda esteja presente na referida planta de Capsicum e/ou possa ser considerado um alelo da mesma.
Em uma modalidade, a invenção refere-se ao produto de amplificação obtenível em uma reação de PCR que envolve um iniciador de oligonucleotídeo ou par de iniciador selecionado do grupo de pares de iniciador 16 representados por iniciadores dianteiros e reversos de SEQ ID NOS: 1-12 e pares de iniciador 7-13 representados por iniciadores dianteiros e reversos de SEQ ID NOS: 13-26, respectivamente, incluindo pares de iniciador resultantes de uma combinação dos iniciadores dianteiros e reversos de SEQ ID NOS: 1-12 e SEQ ID NOS: 13-26, respectivamente, ou qualquer outro iniciador ou par de iniciador que identifica um local marcador no cromossoma 3 e/ou cromossoma 5, que está estatisticamente correlacionado à característica de resistência à Bemisia e/ou tripes, cujo produto de amplificação corresponde a um produto de amplificação obtenível de linhagem 061M4387 inata (NCIMB 41428) em uma reação de PCR com iniciadores idênticos obteníveis dos referidos pares de iniciador 1-6 e 7-13, respectivamente, ou combinação de pares de iniciador contanto que o local marcador respectivo ainda esteja presente na referida planta de Capsicum e/ou possa ser considerado um alelo da mesma.
Da mesma forma incluído é um polinucleotídeo que tem pelo menos de 90%, particularmente pelo menos de 95%, particularmente pelo menos de 96%, particularmente pelo menos de 97%, particularmente pelo menos de 98%, particularmente pelo menos de 99% de identidade de sequência com a sequência do referido produto de amplificação.
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Em uma modalidade da invenção, um polinucleotídeo é abrangido exibindo uma sequência de nucleotídeo que hibridiza para as sequências de nucleotídeo de um produto de amplificação obtenível em uma reação de PCR que envolve um par de iniciador de oligonucleotídeo selecionado do grupo de pares de iniciador 1-6 representados por iniciadores dianteiros e reversos de SEQ ID NOS: 1-12 e pares de iniciador 7-13 representados por iniciadores dianteiros e reversos de SEQ ID NOS: 13-26, respectivamente, incluindo pares de iniciador resultantes de uma combinação dos iniciadores dianteiros e reversos de SEQ ID NOS: 1-12 e SEQ ID NOS: 13-26, respectivamente.
Em uma modalidade específica, a invenção refere-se ao produto de amplificação obtenível em uma reação de PCR que envolve um par de iniciador de oligonucleotídeo selecionado do grupo de par de iniciador 1 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 1 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 2, identificando o local marcador 1; par de iniciador 2 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 3 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 4, identificando o local marcador 2; par de iniciador 3 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 5 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 6, identificando o local marcador 3; par de iniciador 4 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 7 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 8, identificando o local marcador 4; par de iniciador 5 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 9 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 10, identificando o local marcador 5; e par de iniciador 6 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 11 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 12, identificando o local marcador 6, cujo produto de amplificação corresponde a um produto de amplificação obtenível de linhagem 061M4387 inata (NCIMB 41428) em uma reação de PCR com iniciadores idênticos obteníveis dos referidos pares de iniciador 1-6 identificados acima contanto que o local marcador respectivo ainda esteja presente na referida planta de Capsicum.
Em outra modalidade específica, a invenção refere-se ao produto de amplificação obtenível em uma reação de PCR que envolve um par de
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39/127 iniciador de oligonucleotídeo selecionado do grupo de par de iniciador 7 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 13 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 14, identificando o local marcador 7; par de iniciador 8 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 15 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 16, identificando o local marcador 8; par de iniciador representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 17 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 18, identificando o local marcador 9; par de iniciador representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 19 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 20, identificando o local marcador 10; par de iniciador 11 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 21 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 22, identificando o local marcador 11; par de iniciador 12 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 23 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 24, identificando o local marcador 12, e par de iniciador 13 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 25 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 26, identificando o local marcador 13, cujo produto de amplificação corresponde a um produto de amplificação obtenível de linhagem 061M4387 inata (NCIMB 41428) em uma reação de PCR com iniciadores idênticos obteníveis dos referidos pares de iniciador 713 identificados acima contanto que o local marcador respectivo ainda esteja presente na referida planta de Capsicum.
O produto de amplificação de acordo com a invenção e descrito aqui anteriormente pode em seguida ser usado para gerar novos iniciadores ou sondas que podem ser usados para identificar um local marcador, particularmente um local marcador no cromossoma 3 e/ou 5, respectivamente, geneticamente ligado com um QTL associado com resistência à Bemisia e/ou tripes.
Em uma modalidade, a invenção refere-se a um marcador, particularmente a iniciadores ou sondas desenvolvidas de um produto de amplificação de acordo com a invenção e como descrito aqui anteriormente por métodos conhecidos na técnica.
Em uma modalidade da invenção, uma planta de Capsicum annuum cultivada de acordo com a invenção e como descrito aqui anteriormenPetição 870170065661, de 04/09/2017, pág. 47/142
40/127 te é fornecida, em que o referido alelo ou alelos associados com resistência à Bemisia é/são obtenível/eis da linhagem 061M4387, ou qualquer outra linhagem que tem a mesma arquitetura genética no QTL no cromossoma 3 e/ou cromossoma 5, a semente representativa da qual é depositada sob N° de Acessão NCIMB 41428, ou de uma descendência ou um antepassado da mesma que compreende o referido QTL, ou arquitetura de QTL.
Isto da mesma forma abrangería plantas onde os marcadores especificamente descritos aqui são recombinados e assim não mais presentes no genoma de planta.
Em uma modalidade da invenção, uma planta de Capsicum annuum cultivada de acordo com a invenção e como descrito aqui anteriormente é fornecida, em que o referido alelo associado com resistência à tripes é obtenível da linhagem 061M4387, ou de qualquer outra linhagem que tem a mesma arquitetura genética no QTL no cromossoma 5, a semente representativa da qual é depositada sob N° de Acessão NCIMB 41428, ou de uma descendência ou um antepassado da mesma que compreende o referido QTL, ou arquitetura de QTL.
Isto abrangería da mesma forma plantas onde os marcadores especificamente descritos aqui são recombinados e assim não mais presentes no genoma de planta.
Em um aspecto da invenção, a planta de Capsicum annuum cultivada de acordo com a invenção e como descrito aqui anteriormente é heterozigota para a característica de resistência à Bemisia e/ou tripes.
Em um aspecto da invenção, a planta de Capsicum annuum cultivada de acordo com a invenção e como descrito aqui anteriormente é homozigota para a característica de resistência à Bemisia e/ou tripes.
Em um aspecto da invenção, a planta de Capsicum annuum cultivada de acordo com a invenção e como descrito aqui anteriormente é homozigota para um local c (Blum e outros (2002) Genome, 45: 702-705) ou um alelo puni (Stewart e outros (2005) The Plant Journal, 42: 675-688) ou para um local c e um alelo puni.
Em ainda outro aspecto da invenção, a planta de acordo com a
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41/127 invenção e como descrito aqui anteriormente carrega a fruta que, na maturidade, pesa mais de 2 gramas ou é mais longa que 1 cm e tem um diâmetro maior que 0,5 cm e não mostra dano de alimentação causado por Bemisia e/ou tripes, quando a referida planta é geralmente cultivada sob condições de cultivo usadas por cultivadores na prática de colheita habitual, em campo aberto ou em estufa.
A planta de acordo com a invenção e como descrito aqui anteriormente pode ser uma planta de pimenta de cheiro, um pimentão, uma pimenta retangular grande, uma pimenta cônica, uma pimenta cônica longa ou uma pimenta tipo maciça. A fruta da referida planta pode ser uma fruta sempre-verde, amarelo, laranja, marfim ou vermelho.
A planta de acordo com a invenção pode ser uma planta de pimenta quente, por exemplo, uma pimenta ligeiramente picante usada para o mercado novo e para o processamento incluindo a longo, em forma de coração, tipo Ancho de polpa fina e a pimenta longo, de extremidade obtusa, de polpa fina, tipo toscana, a fruta da pimenta Malagueta ligeiramente mais picante com a densidade da polpa média e uma pimenta picante usada igualmente no mercado novo e para processamento incluindo a pimenta longa, Jalapeno de polpa espessa cilíndrica, a pequena, delgada, Serrano afunilada e a Cayenne de polpa fina, de forma irregular.
A planta de acordo com a invenção e como descrito aqui anteriormente pode ser uma inata, um diaploide ou uma híbrida e/ou macho estéril.
Em uma modalidade, a invenção refere-se ao material de planta obtenível de uma planta de acordo com a invenção e como descrito aqui anteriormente incluindo, mas sem ser limitado a estes, folhas, talos, raízes, flores ou partes de flor, frutas, pólen, óvulos, zigotos, sementes, mudas, culturas de tecido ou célula, ou qualquer outra parte ou produto da planta que ainda exibe o fenótipo resistente de acordo com a invenção, particularmente quando cultivado em uma planta.
A invenção também refere-se às partes da planta obteníveis de uma planta de acordo com a invenção e como descrito aqui anteriormente
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42/127 incluindo, mas sem ser limitadas a estes, semente de planta, órgãos de planta tais como, por exemplo, uma raiz, talo, folha, broto de flor, ou embrião, etc, óvulos, microporos de pólen, células de planta, tecido de planta, culturas de células de planta tais como, por exemplo, protoplastos, células de cultura de célula, células em tecidos de planta, pólen, tubos de pólen, óvulos, sacos embrionários, zigotos e embriões em vários estágios de desenvolvimento, etc.; que ainda exibem o fenótipo resistente de acordo com a invenção, particularmente quando cultivado em uma planta.
Em um aspecto, a invenção refere-se a um método para introduzir um alelo em um local de característica quantitativa (QTL) contribuindo para a resistência à Bemisia em uma planta de Capsicum annuum necessitando do referido alelo compreendendo:
a) obter uma primeira planta do gênero Capsicum de acordo com a invenção e como descrito aqui anteriormente, particularmente uma planta de Capsicum annuum, compreendendo
i) pelo menos um alelo marcador caracterizado pelo produto de amplificação de PCR, particularmente um produto de amplificação de PCR obtenível usando-se iniciadores de oligonucleotídeo de PCR ou um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR, particularmente pares de iniciador selecionados do grupo de par de iniciador 1 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 1 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 2, identificando o local marcador 1; par de iniciador 2 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 3 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 4, identificando o local marcador 2; par de iniciador 3 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 5 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 6, identificando o local marcador 3; par de iniciador 4 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 7 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 8, identificando o local marcador 4; par de iniciador 5 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 9 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 10, identificando o local marcador 5; e par de
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43/127 iniciador 6 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 11 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 12, identificando o local marcador 6; ou qualquer outro iniciador ou par de iniciador que identifica um local marcador no cromossoma 3 que está estatisticamente correlacionado à característica de resistência à Bemisia; ou ii) pelo menos um alelo marcador caracterizado pelo produto de amplificação de PCR, particularmente um produto de amplificação de PCR obtenível usando-se iniciadores de oligonucleotídeo de PCR ou um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR, particularmente pares de iniciador selecionados do grupo de par de iniciador 7 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 13 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 14, identificando o local marcador 7; par de iniciador 8 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 15 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 16, identificando o local marcador 8; par de iniciador 9 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 17 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 18, identificando o local marcador 9; par de iniciador 10 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 19 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 20, identificando o local marcador 10; par de iniciador 11 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 21 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 22, identificando o local marcador 11; par de iniciador 12 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 23 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 24, identificando o local marcador 12, e par de iniciador 13 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 25 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 26, identificando o local marcador 13; ou qualquer outro iniciador ou par de iniciador que identifica um local marcador no cromossoma 5 que está estatisticamente correlacionado à característica de resistência à Bemisia ou iii) uma combinação de i) e ii);
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b) cruzar a referida primeira planta do gênero Capsicum, particularmente uma planta de Capsicum annuum, com uma segunda planta de Capsicum annuum, em que a referida segunda planta de Capsicum annuum necessita do referido ácido nucleico; e
c) identificar uma planta resultante do cruzamento exibindo resistência aumentada a Bemisia e compreendendo o referido pelo menos um alelo marcador; ou, opcionalmente,
d) identificar uma planta resultante do cruzamento exibindo resistência aumentada a Bemisia e perdendo os referidos alelos marcadores identificados na etapa a).
Em um aspecto, a invenção refere-se a um método para introduzir um alelo em um local de característica quantitativa (QTL) contribuindo para a resistência à tripes em uma planta de Capsicum annuum necessitando do referido alelo compreendendo:
a) obter uma primeira planta do gênero Capsicum, particularmente uma planta de Capsicum annuum, compreendendo o pelo menos um alelo marcador caracterizado pelo produto de amplificação de PCR, particularmente um produto de amplificação de PCR obtenível usando-se os iniciadores de oligonucleotídeo de PCR ou um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR, particularmente pares de iniciador selecionados do grupo de par de iniciador 7 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 13 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 14, identificando o local marcador 7; par de iniciador 8 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 15 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 16, identificando o local marcador 8; par de iniciador 9 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 17 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 18, identificando o local marcador 9; par de iniciador 10 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 19 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 20, identificando o local marcador 10; par de iniciador 11 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 21 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 22, identificando o local marcador 11; par de iniciador 12 representado por um iniciador dianteiro de
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SEQ ID NO: 23 e um Iniciador Inverso de SEQ ID NO: 24, identificando o local marcador 12, e par de iniciador 13 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 25 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 26, identificando o local marcador 13; ou qualquer outro iniciador ou par de iniciador que identifica um local marcador no cromossoma 5 que está estatisticamente correlacionado à característica de resistência à tripes;
b) cruzar a referida primeira planta do gênero Capsicum, particularmente uma planta de Capsicum annuum, com uma segunda planta de Capsicum annuum, em que a referida segunda planta de Capsicum annuum necessita do referido ácido nucleico; e
c) identificar uma planta resultante do cruzamento exibindo resistência aumentada a tripes e compreendendo o referido pelo menos um alelo marcador; ou, opcionalmente,
d) identificar uma planta resultante do cruzamento exibindo resistência aumentada a Bemisia e perdendo os referidos alelos marcadores identificados na etapa a).
Em um aspecto, a invenção refere-se a um método para introduzir pelo menos um primeiro alelo em um local de característica quantitativa (QTL) contribuindo para a resistência à Bemisia e pelo menos um segundo alelo em um local de característica quantitativa (QTL) contribuindo para a resistência à e/ou a tripes Bemisia, em uma planta de Capsicum annuum necessitando dos referidos alelos compreendendo:
a) obter uma primeira planta do gênero Capsicum, particularmente uma planta de Capsicum annuum, compreendendo
i) pelo menos um alelo marcador caracterizado pelo produto de amplificação de PCR, particularmente um produto de amplificação de PCR obtenível usando-se os iniciadores de oligonucleotídeo de PCR ou um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR, particularmente pares de iniciador selecionados do grupo de par de iniciador 1 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 1 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 2, identifi
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46/127 cando o local marcador 1; par de iniciador 2 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 3 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 4, identificando o local marcador 2; par de iniciador 3 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 5 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 6, identificando o local marcador 3; par de iniciador 4 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 7 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 8, identificando o local marcador 4; par de iniciador 5 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 9 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 10, identificando o local marcador 5; e par de iniciador 6 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 11 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 12, identificando o local marcador 6; ou qualquer outro iniciador ou par de iniciador que identifica um local marcador no cromossoma 3 que está estatisticamente correlacionado à característica de resistência à Bemisia; e ii) pelo menos um alelo marcador caracterizado pelo produto de amplificação de PCR, particularmente um produto de amplificação de PCR obtenível usando-se os iniciadores de oligonucleotídeo de PCR ou um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR, particularmente pares de iniciador selecionados do grupo de par de iniciador 7 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 13 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 14, identificando o local marcador 7; par de iniciador 8 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 15 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 16, identificando o local marcador 8; par de iniciador 9 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 17 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 18, identificando o local marcador 9; par de iniciador 10 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 19 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 20, identificando o local marcador 10; par de iniciador 11 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 21 e um
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47/127 iniciador inverso de SEQ ID NO: 22, identificando o local marcador 11; par de iniciador 12 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 23 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 24, identificando o local marcador 12, e par de iniciador 13 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 25 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 26, identificando o local marcador 13; ou por qualquer outro iniciador ou par de iniciador que identifica um local marcador no cromossoma 5 que está estatisticamente correlacionado à característica de resistência à tripes e/ou Bemisia;
b) cruzar a referida primeira planta do gênero Capsicum, particularmente uma planta de Capsicum annuum, com uma segunda planta de Capsicum annuum, em que a referida segunda planta de Capsicum annuum necessita dos referidos ácidos nucleicos; e
c) identificar uma planta resultante do cruzamento exibindo resistência aumentada a Bemisia e/ou tripes, e compreendendo pelo menos dois alelos marcadores que cossegregam com a referida resistência ou, opcionalmente,
d) identificar uma planta resultante do cruzamento exibindo resistência aumentada a Bemisia e/ou tripes e perdendo os referidos alelos marcadores identificados na etapa a).
Em um aspecto, a invenção refere-se a um método para introduzir um QTL que contribui para a resistência à Bemisia em uma planta de Capsicum annuum necessitando do referido alelo compreendendo:
a) obter uma primeira planta do gênero Capsicum, particularmente uma planta de Capsicum annuum, cuja planta contém um genoma que compreende pelo menos um local de característica quantitativa (QTL) que contribui para a resistência à Bemisia, em que o referido QTL é caracterizado por estar ligado geneticamente a pelo menos um local marcador, particularmente a pelo menos dois locais marcadores, mais particularmente a pelo menos três locais marcadores e ainda mais particularmente a pelo menos quatro locais marcadores, porém especialmen
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48/127 te a pelo menos cinco e particularmente até seis locais marcadores, cujos locais marcadores estão no cromossoma 3 e cossegregam com a característica de resistência à Bemisia e podem ser identificados usando iniciadores de oligonucleotídeo de PCR ou um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR, particularmente pares de iniciador selecionados do grupo de par de iniciador 1 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 1 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 2, identificando o local marcador 1; par de iniciador 2 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 3 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 4, identificando o local marcador 2; par de iniciador 3 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 5 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 6, identificando o local marcador 3; par de iniciador 4 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 7 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 8, identificando o local marcador 4; par de iniciador 5 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 9 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 10, identificando o local marcador 5; e par de iniciador 6 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 11 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 12, identificando o local marcador 6; ou por qualquer outro local marcador no cromossoma 3 que está estatisticamente correlacionado à característica de resistência à Bemisia;
b) cruzar a referida primeira planta do gênero Capsicum, particularmente uma planta de Capsicum annuum, com uma segunda planta de Capsicum annuum, em que a referida segunda planta de Capsicum annuum necessita do referido ácido nucleico; e
c) identificar uma planta resultante do cruzamento exibindo resistência aumentada a Bemisia e compreendendo o referido QTL.
Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método para introduzir um QTL que contribui para a resistência à tripes em uma planta de Capsicum annuum necessitando do referido alelo compreendendo:
a) obter uma primeira planta do gênero Capsicum, particularmente uma planta de Capsicum annuum, cuja planta contém um genoma que
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49/127 compreende pelo menos um local de característica quantitativa (QTL) que contribui para a resistência à tripes, em que o referido QTL é caracterizado por estar ligado geneticamente a pelo menos um local marcador, particularmente a pelo menos dois locais marcadores, particularmente a pelo menos três locais marcadores e particularmente a pelo menos quatro locais marcadores, particularmente a pelo menos cinco locais marcadores, particularmente a pelo menos seis locais marcadores, e até sete locais marcadores, cujos locais marcadores estão no cromossoma 5 e cossegregam com a característica de resistência à tripes e podem ser identificados por um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR selecionado do grupo de par de iniciador 7 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 13 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 14, identificando o local marcador 7; par de iniciador 8 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 15 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 16, identificando o local marcador 8; par de iniciador 9 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 17 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 18, identificando o local marcador 9; par de iniciador 10 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 19 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 20, identificando o local marcador 10; par de iniciador 11 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 21 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 22, identificando o local marcador 11; par de iniciador 12 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 23 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 24, identificando o local marcador 12; e par de iniciador 13 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 25 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 26, identificando o local marcador 13, ou por qualquer outro local marcador no cromossoma 5 que está estatisticamente correlacionado à característica de resistência à tripes;
b) cruzar a referida primeira planta do gênero Capsicum, particularmente uma planta de Capsicum annuum, com uma segunda planta de Capsicum annuum, em que a referida segunda planta de Capsicum annuum necessita do referido ácido nucleico; e
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c) identificar uma planta resultante do cruzamento exibindo resistência aumentada a tripes e compreendendo o referido QTL.
Em um aspecto, a invenção refere-se a um método para introduzir QTL que contribui para a resistência à Bemisia e para resistência à tripes em uma planta de Capsicum annuum necessitando do(s) referido(s) alelo(s) compreendendo:
a) obter uma primeira planta do gênero Capsicum, particularmente uma planta de Capsicum annuum, cuja planta contém um genoma que compreende pelo menos um local de característica quantitativa (QTL) que contribui para
i) resistência à Bemisia, em que o referido QTL é caracterizado por estar ligado geneticamente a pelo menos um local marcador, particularmente a pelo menos dois locais marcadores, mais particularmente a pelo menos três locais marcadores e ainda mais particularmente a pelo menos quatro locais marcadores, porém especialmente a pelo menos cinco e particularmente até seis locais marcadores, cujos locais marcadores estão no cromossoma 3 e cossegregam com a característica de resistência à Bemisia e podem ser identificados usando iniciadores de oligonucleotídeo de PCR ou um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR, particularmente pares de iniciador selecionados do grupo de par de iniciador 1 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 1 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 2, identificando o local marcador 1; par de iniciador 2 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 3 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 4, identificando o local marcador 2; par de iniciador 3 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 5 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 6, identificando o local marcador 3; par de iniciador 4 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 7 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 8, identificando o local marcador 4; par de iniciador 5 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 9 e um iniciador
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51/127 inverso de SEQ ID NO: 10, identificando o local marcador 5; e par de iniciador 6 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 11 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 12, identificando o local marcador 6, ou por qualquer outro local marcador no cromossoma 3 que está estatisticamente correlacionado à característica de resistência à Bemisia; e ii) resistência à tripes, em que o referido QTL é caracterizado por estar ligado geneticamente a pelo menos um local marcador, particularmente a pelo menos dois locais marcadores, particularmente a pelo menos três locais marcadores e particularmente a pelo menos quatro locais marcadores, particularmente a pelo menos cinco locais marcadores, particularmente a pelo menos seis locais marcadores, e particularmente até sete locais marcadores, cujos locais marcadores estão no cromossoma 5 e cossegregam com a característica de resistência à tripes e podem ser identificados usando iniciadores de oligonucleotídeo de PCR ou um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR, particularmente pares de iniciador selecionados do grupo de par de iniciador 7 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 13 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 14, identificando o local marcador 7; par de iniciador 8 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 15 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 16, identificando o local marcador 8; par de iniciador 9 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 17 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 18, identificando o local marcador 9; par de iniciador 10 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 19 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 20, identificando o local marcador 10; par de iniciador 11 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 21 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 22, identificando o local marcador 11; par de iniciador 12 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 23 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 24, identi
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52/127 ficando o local marcador 12, e par de iniciador 13 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 25 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 26, identificando o local marcador 13, ou por qualquer outro local marcador no cromossoma 5 que está estatisticamente correlacionado à característica de resistência à tripes;
b) cruzar a referida primeira planta do gênero Capsicum, particularmente uma planta de Capsicum annuum, com uma segunda planta de Capsicum annuum, em que a referida segunda planta de Capsicum annuum necessita do(s) referido(s) ácido(s) nucleico(s); e
c) identificar uma planta resultante do cruzamento exibindo resistência aumentada a Bemisia e tripes, e compreendendo o referido QTL.
Em uma modalidade específica da invenção, a primeira planta de Capsicum annuum é uma planta que tem o antecedente genético, mas particularmente a arquitetura genética no local de resistência à Bemisia e/ou a tripes, da linhagem 061M4387, a semente representativa da qual é depositada sob N° de Acessão NCIMB 41428, ou uma descendência ou um antepassado da mesma, particularmente uma planta que tem a arquitetura ou base genética no QTL da linhagem 061M4387, ou uma descendência ou um antepassado da mesma, porém especialmente uma planta da referida linhagem 061M4387, ou uma descendência ou um antepassado da mesma.
Em outra modalidade específica da invenção, a identificação de uma planta de Capsicum exibindo resistência aumentada a Bemisia e/ou tripes e compreendendo um QTL de acordo com a invenção na etapa c) de quaisquer dos métodos descrito aqui anteriormente é realizada por avaliação fenotípica usando uma escala de classificação como descrito nos exemplos 2A e 2B, respectivamente, ou usando um marcador molecular de acordo com a invenção e como descrito aqui anteriormente, ou uma combinação do mesmo.
Em um aspecto, a invenção refere-se ao uso de um alelo ou um QTL obtenível de uma planta que tem o antecedente genético, mas particularmente a arquitetura genética no local de resistência à Bemisia e/ou a triPetição 870170065661, de 04/09/2017, pág. 60/142
53/127 pes, de linhagem 061M4387, a semente representativa da qual é depositada sob N° de Acessão NCIMB 41428, ou uma descendência ou um antepassado da mesma, particularmente de uma planta que tem a arquitetura genética no QTL que contribui para a resistência à Bemisia e/ou a tripes de linhagem 061M4387, ou uma descendência ou um antepassado da mesma, porém especialmente da referida linhagem 061M4387, ou uma descendência ou um antepassado da mesma, para conferir resistência à Bemisia e/ou a tripes em uma planta de Capsicum annuum necessitando do referido alelo associado com resistência à Bemisia e resistência à tripes, respectivamente.
A invenção também compreende uma planta de Capsicum annuum cultivada resistente, particularmente de forma intermediária resistente, a Bemisia, cuja planta é obtenível cruzando-se uma planta de Capsicum annuum suscetível a Bemisia com uma planta de linhagem 061M4387, a semente representativa da qual é depositada sob N° de Acessão NCIMB 41428, ou uma descendência ou um antepassado da mesma; e selecionando-se uma planta que compreende um QTL que pode ser identificado em uma reação de PCR por um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR que consiste em um iniciador dianteiro e um iniciador inverso que exibem uma sequência de nucleotídeo que é de pelo menos de 90%, particularmente pelo menos de 95%, particularmente pelo menos de 96%, particularmente pelo menos de 97%, particularmente pelo menos de 98%, particularmente pelo menos de 99% idêntica àquela determinada em SEQ ID NOS: de 1 a 12; ou por qualquer outro iniciador ou par de iniciador que identifica um local marcador no cromossoma 3 que está estatisticamente correlacionado à característica de resistência à Bemisia.
Em uma modalidade, a invenção fornece uma planta de Capsicum annuum cultivada resistente, particularmente de forma intermediária resistente, a tripes, cuja planta é obtenível cruzando-se uma planta de Capsicum annuum suscetível a tripes com uma planta de linhagem 061M4387, a semente representativa da qual é depositada sob N° de Acessão NCIMB 41428, ou uma descendência ou um antepassado da mesma; e selecionanPetição 870170065661, de 04/09/2017, pág. 61/142
54/127 do-se uma planta que compreende um QTL que pode ser identificado em uma reação de PCR por um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR que consiste em um iniciador inverso e um iniciador dianteiro que exibem uma sequência de nucleotídeo que é de pelo menos de 90%, particularmente pelo menos de 95%, particularmente pelo menos de 96%, particularmente pelo menos de 97%, particularmente pelo menos de 98%, particularmente pelo menos de 99% idêntica àquela determinada em SEQ ID NOS: de 13 a 26, ou por qualquer outro iniciador ou par de iniciador que identifica um local marcador no cromossoma 5 que está estatisticamente correlacionado à característica de resistência à tripes.
Em uma modalidade, a invenção fornece uma planta de Capsicum annuum cultivada resistente, particularmente de forma intermediária resistente, a Bemisia e tripes, cuja planta é obtenível cruzando-se uma planta de Capsicum annuum suscetível à Bemisia e/ou tripes com uma planta de linhagem 061M4387, a semente representativa da qual é depositada sob N° de Acessão NCIMB 41428, ou uma descendência ou um antepassado da mesma; e selecionando-se uma planta que compreende um QTL que pode ser identificado em uma reação de PCR por um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR que consistem em um iniciador dianteiro e um iniciador inverso que exibem uma sequência de nucleotídeo que é de pelo menos de 90%, particularmente pelo menos de 95%, particularmente pelo menos de 96%, particularmente pelo menos de 97%, particularmente pelo menos de 98%, particularmente pelo menos de 99% idêntica àquela determinada em SEQ ID NOS: de 1 a 12 e em SEQ ID NOS: de 13 a 26, respectivamente, ou por qualquer outro iniciador ou par de iniciador que identifica um local marcador no cromossoma 3 e no cromossoma 5 que está estatisticamente correlacionado à característica de resistência à tripes e Bemisia, respectivamente.
Em um aspecto, a invenção refere-se a um método de produzir a fruta de pimenta compreender:
a) cultivar a planta de Capsicum annuum cultivada resistente, particularmente de forma intermediária resistente, a Bemisia de acordo com a
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55/127 invenção e como descrito aqui anteriormente;
b) permitir a referida planta fixar a fruta; e
c) colher a fruta da referida planta.
Em um aspecto, a invenção refere-se a um método de produzir a fruta de pimenta, particularmente fruta de pimenta que é essencialmente livre de dano de alimentação causado por Bemisia e/ou tripes compreendendo,:
a) cultivar uma planta de Capsicum annuum cultivada resistente, particularmente de forma intermediária resistente, a tripes de acordo com a invenção e como descrito aqui anteriormente;
b) permitir a referida planta fixar a fruta; e
c) colher a fruta da referida planta.
Em um aspecto, a invenção refere-se a um método de produzir a fruta de pimenta, particularmente fruta de pimenta que é essencialmente livre de dano de alimentação causado por tripes compreendendo:
a) cultivando a planta de Capsicum annuum cultivada resistente, particularmente de forma intermediária resistente, a Bemisia e a tripes de acordo com a invenção e como descrito aqui anteriormente;
b) permitir a referida planta fixar a fruta; e
c) colher a fruta da referida planta.
Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método de produzir semente de pimenta compreendendo:
a) cultivar a planta de Capsicum annuum cultivada resistente, particularmente de forma intermediária resistente, a Bemisia de acordo com a invenção e como descrito aqui anteriormente;
b) colher a fruta da referida planta; e
c) extrair a semente da referida fruta.
Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método de produzir semente de pimenta compreendendo:
a) cultivar a planta de Capsicum annuum cultivada resistente, particularmente de forma intermediária resistente, a tripes de acordo com a invenção e como descrito aqui anteriormente;
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b) colher a fruta da referida planta; e
c) extrair a semente da referida fruta.
Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método de produzir semente de pimenta compreendendo:
a) cultivar a planta de Capsicum annuum resistente, particularmente de forma intermediária resistente, a Bemisia e a tripes de acordo com a invenção e como descrito aqui anteriormente;
b) colher a fruta da referida planta; e
c) extrair a semente da referida fruta.
Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método de produzir uma planta de pimenta que exibe resistência à Bemisia, em que a referida planta compreende um alelo associado com resistência à Bemisia em locais de característica quantitativa (QTL) contribuindo para a resistência à Bemisia localizados no cromossoma 3; particularmente a um QTL derivado da semente representativa da linhagem de Capsicum annuum 061M4387 da qual é depositada sob N° de Acessão NCIMB 41428, ou de uma descendência ou um antepassado da mesma que compreende os referidos QTL, compreendendo as etapas de:
a) fornecer uma planta de pimenta de recipiente suscetível aa Bemisia ou uma planta que não contêm um alelo de QTL que confere resistência às infestações de Bemisia;
b) fornecer uma planta de pimenta de doador que exibe resistência às infestações de Bemisia devido à presença do alelo de QTL de resistência no cromossoma 3;
c) cruzar a planta de recipiente e de doador para produzir plantas de descendência que segregam para a presença do alelo de QTL favorável;
d) avaliar o genoma de plantas de descendência para recombinações na região de QTL no cromossoma 3.
Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método de produzir uma planta de pimenta que exibe resistência à Bemisia, em que a referida planta compreende um alelo associado com resistência à Bemisia em locais de característica quantitativa (QTL) contribuindo para a resistência à
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57/127 tripes localizada no cromossoma 3 e/ou cromossoma 5; particularmente em um QTL derivado da linhagem de Capsicum annuum 061M4387, a semente representativa da qual é depositada sob N° de Acessão NCIMB 41428, ou de uma descendência ou um antepassado da mesma que compreende os referidos QTL, compreendendo as etapas de:
a) fornecer uma planta de pimenta de recipiente suscetível à Bemisia ou uma planta que não contêm um alelo de QTL que confere resistência às infestações de Bemisia;
b) fornecer uma planta de pimenta de doador que exibe resistência às infestações de Bemisia devido à presença do alelo de QTL de resistência no cromossoma 3 e/ou cromossoma 5;
c) cruzar a planta de recipiente e de doador para produzir as plantas de descendência que segregam para a presença do alelo de QTL favorável;
d) avaliar o genoma de plantas de descendência para recombinações na região do QTL no cromossoma 3 e/ou cromossoma 5.
Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método de produzir uma planta de pimenta que exibe resistência à tripes, em que a referida planta compreende um alelo associado com resistência à tripes em locais de característica quantitativa (QTL) contribuindo para a resistência à tripes localizada no cromossoma 5; particularmente a um QTL derivado da linhagem de Capsicum annuum 061M4387, a semente representativa da qual é depositada sob N° de Acessão NCIMB 41428, ou de uma descendência ou um antepassado da mesma que compreende os referidos QTL, compreendendo as etapas de:
a) fornecer uma planta de pimenta de recipiente suscetível a tripes ou uma planta que não contêm um alelo de QTL que confere resistência às infestações de tripes;
b) fornecer uma planta de pimenta de doador que exibe resistência às infestações de tripes devido à presença do alelo de QTL de resistência no cromossoma 5;
c) cruzar a planta de recipiente e de doador para produzir as plantas de
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58/127 descendência que segregam para a presença do alelo de QTL favorável;
d) avaliar o genoma de plantas de descendência para recombinações na região do QTL no cromossoma 5.
Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método de produzir uma planta de pimenta que exibe resistência à Bemisia e tripes, em que a referida planta compreende um alelo associado com resistência à Bemisia em locais de característica quantitativa (QTL) contribuindo para a resistência à Bemisia localizados no cromossoma 3 e um alelo associado com resistência à Bemisia e/ou de tripes em locais de característica quantitativa (QTL) contribuindo para a resistência à Bemisia e/ou a tripes localizados no cromossoma 5; particularmente um QTL localizado no cromossoma 3 e 5, respectivamente, derivado da semente representativa da linhagem de Capsicum annuum 061M4387 da qual é depositada sob N° de Acessão NCIMB 41428, ou de uma descendência ou um antepassado da mesma que compreende os referidos QTL, compreendendo as etapas de:
a) fornecer uma planta de pimenta de recipiente suscetível à Bemisia e/ou tripes ou uma planta que não contêm um alelo de QTL que confere resistência às infestações de Bemisia e/ou tripes;
b) fornecer uma planta de pimenta de doador que exibe resistência às infestações de Bemisia e/ou tripes devido à presença do alelo de QTL de resistência no cromossoma 3 e/ou 5, respectivamente;
c) cruzar a planta de recipiente e de doador para produzir plantas de descendência que segregam para a presença do alelo de QTL favorável;
d) avaliar o genoma de plantas de descendência para recombinações na região do QTL no cromossoma 3 e/ou 5.
Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método de produzir uma planta de pimenta que exibe resistência à Bemisia e/ou tripes de acordo com a invenção e como descrito aqui anteriormente, em que a referida planta de descendência é uma planta de uma população segregante produzida por autopolinização de uma planta F1 obtida do referido cruzamento na etapa c), ou cruzando uma planta F1 obtida do referido cruzamento com
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59/127 outra planta de pimenta.
Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método de produzir uma planta de pimenta que exibe resistência à Bemisia e/ou tripes de acordo com a invenção e como descrito aqui anteriormente, em que a população segregante obtida na etapa c) pode ser submetida a um ensaio de resistência padrão tal como, por exemplo, um ensaio de resistência como descrito nos Exemplos 2A e 2B, respectivamente.
Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método de produzir uma planta de pimenta que exibe resistência à Bemisia e/ou tripes de acordo com a invenção e como descrito aqui anteriormente, em que a avaliação da planta de descendência na etapa d) é para ser uma avaliação com base em marcador, que pode ser suportada realizando-se um ensaio de resistência tal como, por exemplo, um ensaio de resistência como descrito nos Exemplos 2A e 2B, respectivamente.
Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método de produzir uma planta de pimenta que exibe resistência à Bemisia e/ou tripes de acordo com a invenção e como descrito aqui anteriormente, em que a avaliação do genoma é realizada usando marcadores moleculares geneticamente ligados ao cromossoma 3 e/ou cromossoma 5, respectivamente.
Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método de produzir uma planta de pimenta que exibe resistência à Bemisia de acordo com a invenção e como descrito aqui anteriormente, em que a avaliação do genoma é realizada usando marcadores moleculares geneticamente ligados a pelo menos um marcador caracterizado pelo produto de amplificação de PCR de um iniciador de oligonucleotídeo de PCR ou um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR selecionado do grupo de pares de iniciador 1-6 representados por iniciadores dianteiros e reversos de SEQ ID NOS: de 1 a
12.
Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método de produzir uma planta de pimenta que exibe resistência à tripes de acordo com a invenção e como descrito aqui anteriormente, em que a avaliação do genoma é realizada usando marcadores moleculares geneticamente ligados a
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60/127 pelo menos um marcador caracterizado pelo produto de amplificação de PCR de um iniciador de oligonucleotídeo de PCR ou um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR selecionado do grupo de pares de iniciador 7-13 representados por iniciadores dianteiros e reversos de SEQ ID NOS: de 13 a 26.
Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método de produzir uma planta de pimenta que exibe resistência à Bemisia de acordo com a invenção e como descrito aqui anteriormente, em que plantas de descendência são identificadas e selecionadas as quais compreendem um segmento de genoma reduzido no QTL que ainda confere resistência à Bemisia, em que a ligação a pelo menos um alelo marcador em pelo menos um local marcador ligado ao QTL na planta de doador, cujo alelo marcador é caracterizado pelo produto de amplificação de PCR de um iniciador de oligonucleotídeo de PCR ou par de iniciador de oligonucleotídeo selecionado do grupo de pares de iniciador 1-6 representados por iniciadores dianteiros e reversos de SEQ ID NOS: de 1 a 12, foi interrompida.
Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método de produzir uma planta de pimenta que exibe resistência à Bemisia de acordo com a invenção e como descrito aqui anteriormente, em que as plantas de descendência são identificadas e selecionadas as quais compreendem um segmento de genoma reduzido no QTL que ainda confere resistência à Bemisia, em que a ligação a todos os alelos de marcador caracterizados pelo produto de amplificação de PCR de um iniciador de oligonucleotídeo de PCR ou par de iniciador de oligonucleotídeo selecionado do grupo de pares de iniciador 1-6 representados por iniciadores dianteiros e reversos de SEQ ID NOS: de 1 a 12, foi interrompida.
Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método de produzir uma planta de pimenta que exibe resistência à tripes de acordo com a invenção e como descrito aqui anteriormente, em que as plantas de descendência são identificadas e selecionadas as quais compreendem um segmento de genoma reduzido no QTL que ainda confere resistência à tripes, em que a ligação a pelo menos um alelo marcador em pelo menos um local
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61/127 marcador ligado no QTL na planta de doador, cujo alelo marcador é caracterizado pelo produto de amplificação de PCR de um iniciador de oligonucleotídeo de PCR ou par de iniciador de oligonucleotídeo selecionado do grupo de pares de iniciador 7-13 representados por iniciadores dianteiros e reversos de SEQ ID NOS: de 13 a 26, foi interrompida.
Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método de produzir uma planta de pimenta que exibe resistência à tripes de acordo com a invenção e como descrito aqui anteriormente, em que as plantas de descendência são identificadas e selecionadas as quais compreendem um segmento de genoma reduzido no QTL que ainda confere resistência à tripes, em que a ligação para todos os alelos de marcador caracterizados pelo produto de amplificação de PCR de um iniciador de oligonucleotídeo de PCR ou par de iniciador de oligonucleotídeo selecionado do grupo de pares de iniciador 7-13 representados por iniciadores dianteiros e reversos de SEQ ID NOS: de 13 a 26, foi interrompida.
Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método de produzir uma planta de pimenta que exibe resistência à Bemisia e/ou tripes de acordo com a invenção e como descrito aqui anteriormente, em que plantas que compreendem um segmento de genoma, particularmente um segmento de genoma reduzido no QTL que ainda confere resistência à Bemisia e/ou tripes são identificadas por uma avaliação com base em marcador ou realizando-se um ensaio de resistência ou por uma combinação de ambos, particularmente por uma avaliação com base em marcador, em que os marcadores são usados os quais ficam situados na região de QTL e são ligados geneticamente a pelo menos um local marcador, contanto que os referidos marcadores estejam segregando na mesma população.
Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método de identificar um local de característica quantitativa (QTL) que contribui para a resistência à Bemisia compreendendo usar em uma reação de PCR, um iniciador de oligonucleotídeo de PCR ou um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR selecionado do grupo de par de iniciador 1 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 1 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 2,
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62/127 identificando o local marcador 1; par de iniciador 2 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 3 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 4, identificando o local marcador 2; par de iniciador 3 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 5 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 6, identificando o local marcador 3; par de iniciador 4 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 7 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 8, identificando o local marcador 4; par de iniciador 5 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 9 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 10, identificando o local marcador 5; e par de iniciador 6 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 11 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 12, identificando o local marcador 6.
Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método de identificar um local de característica quantitativa (QTL) que contribui para a resistência à Bemisia compreendendo usar em uma reação de PCR, um iniciador de oligonucleotídeo de PCR ou um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR selecionado do grupo de par de iniciador 7 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 13 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 14, identificando o local marcador 7; par de iniciador 8 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 15 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 16, identificando o local marcador 8; par de iniciador 9 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 17 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 18, identificando o local marcador 9; par de iniciador 10 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 19 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 20, identificando o local marcador 10; par de iniciador 11 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 21 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 22, identificando o local marcador 11; par de iniciador 12 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 23 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 24, identificando o local marcador 12, e par de iniciador 13 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 25 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 26, identificando o local marcador 13.
Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método de identificar um local de característica quantitativa (QTL) que contribui para a rePetição 870170065661, de 04/09/2017, pág. 70/142
63/127 sistência à Bemisia compreendendo usar em uma reação de PCR
a) um iniciador de oligonucleotídeo de PCR ou um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR selecionado do grupo de par de iniciador 1 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 1 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 2, identificando o local marcador 1; par de iniciador 2 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 3 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 4, identificando o local marcador 2; par de iniciador 3 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 5 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 6, identificando o local marcador 3; par de iniciador 4 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 7 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 8, identificando o local marcador 4; par de iniciador 5 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 9 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 10, identificando o local marcador 5; e par de iniciador 6 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 11 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 12, identificando o local marcador 6; e
b) um iniciador de oligonucleotídeo de PCR ou um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR selecionado do grupo de par de iniciador 7 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 13 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 14, identificando o local marcador 7; par de iniciador 8 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 15 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 16, identificando o local marcador 8; par de iniciador 9 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 17 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 18, identificando o local marcador 9; par de iniciador 10 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 19 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 20, identificando o local marcador 10; par de iniciador 11 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 21 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 22, identificando o local marcador 11; par de iniciador 12 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 23 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 24, identificando o local marcador 12, e par de iniciador 13 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 25 e
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64/127 um iniciador inverso de SEQ ID NO: 26, Identificando o local marcador
13.
Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método de identificar um local de característica quantitativa (QTL) que contribui para resistência à tripes compreendendo usar em uma reação de PCR, um iniciador de oligonucleotídeo de PCR ou um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR selecionado do grupo de par de iniciador 7 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 13 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 14, identificando o local marcador 7; par de iniciador 8 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 15 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 16, identificando o local marcador 8; par de iniciador 9 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 17 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 18, identificando o local marcador 9; par de iniciador 10 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 19 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 20, identificando o local marcador 10; par de iniciador 11 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 21 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 22, identificando o local marcador 11; par de iniciador 12 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 23 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 24, identificando o local marcador 12, e par de iniciador 13 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 25 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 26, identificando o local marcador 13.
Em uma modalidade, a invenção refere-se a um QTL identificado por um método de acordo com a invenção e como descrito aqui anteriormente, cujo QTL contribui para a resistência à Bemisia e fica situado no cromossoma 3.
Em uma modalidade, a invenção refere-se a um QTL identificado por um método de acordo com a invenção e como descrito aqui anteriormente, cujo QTL contribui para a resistência à Bemisia e fica situado no cromossoma 5.
Em uma modalidade, a invenção refere-se a um QTL identificado por um método de acordo com a invenção e como descrito aqui anteriormente, cujo QTL contribui para a resistência à tripes e fica situado no cromossoPetição 870170065661, de 04/09/2017, pág. 72/142
65/127 ma 5.
Em uma modalidade, a invenção fornece uma planta de Capsicum annuum cultivada compreendendo um genoma que compreende pelo menos um QTL que contribui para a resistência à Bemisia, cujo QTL fica situado no cromossoma 3, em que o referido pelo menos um QTL pode ser identificado por um marcador molecular que está em desequilíbrio de ligação e/ou ligado a e/ou localizado na região de QTL, bem como um marcador que representa as mutações causais atuais subjacentes ao QTL, e assim exibe correlação estatística à característica fenotípica, cujos marcadores podem ser desenvolvidos usando os iniciadores de oligonucleotídeo como descrito em SEQ ID NO: de 1 a 12.
Em uma modalidade, a invenção fornece uma planta de Capsicum annuum cultivada compreendendo um genoma que compreende pelo menos dois QTL que contribuem para a resistência à Bemisia, cujos QTL ficam situados no cromossoma 3 e 5, em que o referido pelo menos dois QTL podem ser identificados por marcadores moleculares que estão em desequilíbrio de ligação e/ou ligados a e/ou localizados na região de QTL, bem como marcadores que representam as mutações causais atuais subjacentes ao QTL, e assim exibe correlação estatística para a característica fenotípica, cujos marcadores podem ser desenvolvidos usando os iniciadores de oligonucleotídeo como descrito em SEQ ID NO: de 1 a 12 e SEQ ID NOS: de 13 a 26, respectivamente.
Em uma modalidade, a invenção fornece uma planta de Capsicum annuum cultivada compreendendo um genoma que compreende pelo menos um QTL que contribui para a resistência à tripes, cujo QTL fica situado no cromossoma 5, em que o referido pelo menos um QTL pode ser identificado por um marcador molecular que está em desequilíbrio de ligação e/ou ligado a e/ou localizado na região de QTL, bem como um marcador que representa as mutações causais atuais subjacentes ao QTL, e assim exibe correlação estatística para a característica fenotípica, cujo marcador pode ser desenvolvido usando os iniciadores de oligonucleotídeo como descrito em SEQ ID NOS: de 13 a 26.
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Em uma modalidade, a invenção fornece uma planta de Capsicum annuum cultivada compreendendo um genoma que compreende pelo menos dois QTL que contribuem para a resistência à Bemisia e tripes, cujos QTL ficam situados nos cromossomas 3 e 5 e em que os referidos pelo menos dois QTL podem ser identificados por marcadores moleculares que estão em desequilíbrio de ligação e/ou ligados a e/ou localizados na região de QTL, bem como marcadores que representam as mutações causais atuais subjacentes ao QTL, e assim exibem correlação estatística para a característica fenotípica, cujos marcadores podem ser desenvolvidos usando os iniciadores de oligonucleotídeo como descrito em SEQ ID NO: de 1 a 12 e SEQ ID NOS: de 13 a 26, respectivamente.
Definições
As expressões e termos técnicos geralmente empregados dentro do escopo deste pedido são geralmente dados o significado aplicado a eles na técnica pertinente de cultivo e reprodução de planta se não de outra maneira indicado aqui abaixo.
Uma planta de Capsicum annuum cultivada é entendida dentro do escopo da invenção referir-se a uma planta que não está mais no estado natural, porém foi desenvolvida por cuidado humano e para uso e/ou consumo humano.
Como empregado nesta especificação e nas reivindicações anexadas, as formas singulares um, uma, e o, a incluem referentes plurais a menos que o contexto dite claramente de outra maneira. Desse modo, por exemplo, referência a uma planta inclui uma ou mais plantas, e referência a uma célula inclui misturas de células, tecidos, e similar.
Um alelo é entendido dentro do escopo da invenção referir-se a formas alternativas ou variantes de várias unidades genéticas idênticas ou associadas com formas diferentes de um gene ou de qualquer tipo de elemento genético identificável, que seja alternativo em herança uma vez que eles estejam situados no mesmo local em cromossomas homólogos. Tais formas alternativas ou variantes podem ser o resultado de polimorfismos de nucleotídeo único, inserções, inversões, translocações ou deleções, ou a
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67/127 consequência de regulamento de gene causado por, por exemplo, por modificação química ou estrutural, regulamento de transcrição ou modificação/regulamento pós-translacional. Em uma célula ou organismo diploide, os dois alelos de um determinado gene ou elemento genético tipicamente ocupam locais correspondentes em um par de cromossomas homólogos.
Um alelo associado com uma característica quantitativa pode compreender formas alternativas ou variantes de várias unidades genéticas que incluem aquelas que são idênticas ou associadas com um único gene ou genes múltiplos ou seus produtos ou até mesmo um rompimento de gene ou controlado por um fator genético que contribui com o fenótipo representado pelo referido QTL.
Como usado aqui, o termo alelo marcador refere-se a uma forma alternativa ou variante de uma unidade genética como definido aqui acima, quando empregado como um marcador para localizar locais genéticos que contêm alelos em um cromossoma que contribui com a variabilidade de características fenotípicas.
Como usado aqui, o termo reprodução, e variantes gramaticais do mesmo, refere-se a qualquer processo que gere uma progênie individual. As reproduções podem ser sexuais ou assexuais, ou qualquer combinação dos mesmos. Os tipos não-limitantes exemplares de procriações incluem cruzamentos, autopolinização, geração derivada de haploide dobrada, e combinações dos mesmos.
Como usada aqui, a frase população de procriação estabelecida refere-se a uma coleção de pares de procriação potenciais produzidos por e/ou empregados como progenitores em um programa de procriação; por exemplo, um programa de procriação comercial. Os membros da população de procriação estabelecida são tipicamente bem-caracterizados geneticamente e/ou fenotipicamente. Por exemplo, várias características fenotípicas de interesse poderíam ter sido avaliadas, por exemplo, sob diferentes condições ambientais, em múltiplos locais, e/ou em tempos diferentes. Alternativamente ou, além disso, um ou mais locais genéticos associados com expressão das características fenotípicas poderíam ter sido identificados e
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68/127 um ou mais dos membros da população de procriação poderíam ter sido genotipados com respeito ao um ou mais locais genéticos bem como com respeito a um ou mais marcadores genéticos que são associados com um ou mais locais genéticos.
Como usada aqui, a frase indivíduo diploide refere-se a um indivíduo que tem dois grupos de cromossomas, tipicamente um de cada de seus dois progenitores. Porém, é entendido que em algumas modalidades um indivíduo diploide pode receber seus grupos maternos e paternos de cromossomas do mesmo organismo único, tal como quando uma planta é autopolinizada para produzir uma geração subsequente de plantas.
Homozigoto é entendido dentro do escopo da invenção referirse aos tipos de alelos em um ou mais locais correspondentes em cromossomas homólogos.
Heterozigoto é entendido dentro do escopo da invenção referirse aos alelos distintos em um ou mais locais correspondentes em cromossomas homólogos.
Cruzamento reversível é entendido dentro do escopo da invenção referir-se a um processo no qual uma progênie híbrida é cruzada repetidamente de volta com um dos progenitores. Os progenitores recorrentes diferentes podem ser empregados em cruzamentos reversíveis subsequentes.
Local é entendido dentro do escopo da invenção referir-se a uma região em um cromossoma que compreende um gene ou qualquer outro elemento ou fator genético que contribua com uma característica.
Como usado aqui, local marcador refere-se a uma região em um cromossoma que compreende um nucleotídeo ou uma sequência de polinucleotídeo que esteja presente no genoma de um indivíduo e que esteja associado com um ou mais locais de interesse, os quais possam compreendem um gene ou qualquer outro elemento ou fator genético que contribua com uma característica. Local marcador também refere-se a uma região em um cromossoma que compreende uma sequência de polinucleotídeo complementar para uma sequência genômica tal como uma sequência de
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69/127 um ácido nucleico empregada como sondas.
Ligação genética é entendida dentro do escopo da invenção referir-se a uma associação de caracteres em herança devido ao local de genes em proximidade no mesmo cromossoma, medido através de percentual de recombinação entre os locais (centi-Morgan, cM).
Como usada aqui, a frase característica quantitativa refere-se a uma característica fenotípica que pode ser descrita numericamente (isto é, quantificada ou determinada). Uma característica quantitativa tipicamente exibe variação contínua entre indivíduos de uma população; quer dizer, diferenças no valor numérico da característica fenotípica são leves e classificam em cada outro. Frequentemente, a distribuição de frequência em uma população de uma característica fenotípica quantitativa exibe uma curva de distribuição normal (isto é, exibe uma distribuição normal entre dois extremos). No caso presente a característica quantitativa exibe variação contínua entre indivíduos de uma população em termos de resistência à insetos do gênero Bemisia e/ou da ordem Thysanoptera, cuja resistência é classificada por meio de um Ensaio de Resistência de Inseto padronizado que usa uma escala de 1 a 9 para avaliar a severidade da infestação. Uma característica quantitativa é tipicamente o resultado de um local genético que interage com o ambiente ou de locais genéticos múltiplos (QTL) interagindo entre si e/ou com o ambiente. Os exemplos de características quantitativas incluem altura e produção de planta.
Com a finalidade da presente invenção, o termo cossegregação refere-se ao fato que o alelo para a característica e o(s) alelo(s) para o(s) marcador(es) tendem a ser transmitidos juntos porque eles estão fisicamente mais próximos no mesmo cromossoma (recombinação reduzida entre eles por causa da sua proximidade física) resultando na associação não aleatória dos seus alelos como resultado da sua proximidade no mesmo cromossoma. Cossegregação também refere-se à presença de duas ou mais características dentro de uma única planta da qual pelo menos uma é conhecida por ser genética e que não pode ser explicada facilmente por casualidade.
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Como usado aqui, os termos local de característica quantitativa (QTL) e associação de característica de marcador referem-se a uma associação entre um marcador genético e uma região cromossômica e/ou gene que afeta o fenótipo de uma característica de interesse. Tipicamente, este é determinado estatisticamente; por exemplo, com base em um ou mais métodos publicados na literatura. Um QTL pode ser um de região cromossômica e/ou de um local genético com pelo menos dois alelos que diferencialmente afetam uma característica fenotípica (uma característica quantitativa ou uma característica qualitativa).
Como usado aqui, o termo arquitetura genética no QTL referese a uma região genômica que está estatisticamente correlacionada com a característica fenotípica de interesse e representa a base genética subjacente da característica fenotípica de interesse.
Como usado aqui, as frases sexualmente cruzado e reprodução sexual no contexto da matéria de assunto agora descrita refere-se à fusão de gametas para produzir progênie (por exemplo, por fertilização, tal como para produzir semente por polinização em plantas). Um cruzamento sexual ou fertilização cruzada é em algumas modalidades, a fertilização de um indivíduo por outro (por exemplo, polinização cruzada em plantas). O termo autopolinização refere-se em algumas modalidades à produção de semente por autofertilização ou autopolinização; isto é, pólen e óvulo são da mesma planta.
Como usado aqui, a frase marcador genético refere-se a uma característica do genoma de um indivíduo (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo ou polinucleotídeo que está presente no genoma de um indivíduo) que está associada com um ou mais locais de interesse. Em algumas modalidades, um marcador genético é polimórfico em uma população de interesse, ou o local ocupado pelo polimorfismo, dependendo do contexto. Os marcadores genéticos incluem, por exemplo, polimorfismos de nucleotídeo únicos (SNPs), indels (isto é, inserções/deleções), repetições de sequência simples (SSRs), polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição (RFLPs), DNAs amplificados polimórficos aleatórios (RAPDs), marPetição 870170065661, de 04/09/2017, pág. 78/142
71/127 cadores de sequência polimórfica amplificada clivada (CAPS), marcadores de Tecnologia de Disposições de Diversidade (DArT), e polimorfismos de comprimento de fragmento amplificado (AFLPs), entre muitos outros exemplos. Os marcadores genéticos podem, por exemplo, ser empregados para localizar locais genéticos que contêm alelos em um cromossoma que contribui para a variabilidade de características fenotípicas. A frase marcador genético pode referir-se da mesma forma a uma sequência de polinucleotídeo complementar para uma sequência genômica, tal como uma sequência de um ácido nucleico empregado como sondas.
Um marcador genético pode ser localizado fisicamente em uma posição em um cromossoma que está dentro ou fora do local genético com o qual está associado (isto é, é intragênico ou extragênico, respectivamente). Declarado de outro modo, considerando que marcadores genéticos são tipicamente empregados quando o local em um cromossoma do gene ou de uma mutação funcional, por exemplo, em um elemento de controle fora de um gene, que corresponde ao local de interesse não foi identificado e há uma taxa de não zero de recombinação entre o marcador genético e o local de interesse, a matéria de assunto agora descrita pode também empregar marcadores genéticos que sejam fisicamente os limites de um local genético (por exemplo, dentro de uma sequência genômica tal como a que corresponde a um gene, porém não-limitada a um polimorfismo dentro de um intron ou um éxon de um gene). Em algumas modalidades do assunto agora descrito, o um ou mais marcadores genéticos compreendem entre um e dez marcadores, e em algumas modalidades o um ou mais marcadores genéticos compreendem mais de dez marcadores genéticos.
Como usado aqui, o termo genótipo refere-se à constituição genética de uma célula ou organismo. O genótipo de um indivíduo para um conjunto de marcadores genéticos inclui os alelos específicos, para um ou mais locais de marcador genético, presente no haplotipo do indivíduo. Como é conhecido na técnica, um genótipo pode referir-se a um único local ou a locais múltiplos, se os locais estão relacionados ou não-relacionados e/ou ligados ou não-ligados. Em algumas modalidades, o genótipo de um indivíPetição 870170065661, de 04/09/2017, pág. 79/142
72/127 duo refere-se a um ou mais genes que estão relacionados pelo fato de que o um ou mais dos genes estão envolvidos na expressão de um fenótipo de interesse (por exemplo, uma característica quantitativa como definido aqui). Desse modo, em algumas modalidades um genótipo compreende um sumário de um ou mais alelos presentes dentro de um indivíduo em um ou mais locais genéticos de uma característica quantitativa. Em algumas modalidades, um genótipo é expressado em termos de um haplotipo (definido aqui abaixo).
Como usado aqui, o termo germoplasma refere-se à totalidade dos genótipos de uma população ou outro grupo de indivíduos (por exemplo, uma espécie). O termo germoplasma pode referir-se ao material de planta; por exemplo, um grupo de plantas que age como um repositor para vários alelos. A frase germoplasma adaptado refere-se aos materiais de planta de superioridade genética provada; por exemplo, para um determinado ambiente ou área geográfica, ao mesmo tempo em que as frases germoplasma não adaptado, germoplasma bruto, e germoplasma exótico referem-se aos materiais de planta de valor genético desconhecido ou não comprovado; por exemplo, para um determinado ambiente ou área geográfica; tal como, a frase germoplasma não adaptado refere-se em algumas modalidades aos materiais de planta que não fazem parte de uma população de procriação estabelecida e que não têm uma relação conhecida com um membro da população de procriação estabelecida.
Como usado aqui, os termos híbrido, planta híbrida, e progênie híbrida referem-se a um indivíduo produzido de progenitores geneticamente diferentes (por exemplo, a indivíduo geneticamente heterozigoto ou geralmente heterozigoto).
Como usada aqui, a frase híbrido F1 de cruzamento simples refere-se a um híbrido Fi produzido de um cruzamento entre duas linhagens inatas.
Como usado aqui, a frase linhagem inata refere-se a uma população geneticamente homozigota ou quase homozigota. Uma linhagem inata, por exemplo, pode ser derivada através de vários ciclos de procriaPetição 870170065661, de 04/09/2017, pág. 80/142
73/127 ções de irmãos/irmãs ou de autopolinização ou em produção diaploide. Em algumas modalidades, as linhagens inatas procriam de verdade para uma ou mais características fenotípicas de interesse. Um inato, indivíduo inato, ou progênie inata é um indivíduo amostrado de uma linhagem inata.
Como usado aqui, o termo linhagem diaploide, refere-se às linhagens inatas estáveis emitidas de outra cultura. Um pouco de grãos de pólen (haploide) cultivado em meio e circunstâncias específicas pode desenvolver plantinhas que contêm cromossomas n. Estas plantinhas são em seguida duplicadas e contêm cromossomas 2n. A progênie destas plantinhas é chamada diaploide e não está essencialmente segregando mais (estável).
Como usado aqui, o termo ligação, e variantes gramaticais do mesmo, refere-se à tendência de alelos em locais diferentes no mesmo cromossoma segregar junto mais frequentemente do que seria esperado por casualidade se sua transmissão fosse independente, em algumas modalidades como uma consequência de sua proximidade física.
Como usado aqui, o termo local refere-se a uma posição em um cromossoma (por exemplo, de um gene, um marcador genético, ou similar).
Como usado aqui, a frase ácido nucleico refere-se a qualquer filamento físico de unidades de monômero que possa ser correspondida a um filamento de nucleotídeos, incluindo um polímero de nucleotídeos (por exemplo, um polímero de DNA, cDNA ou RNA típico), oligonucleotídeos modificados (por exemplo, oligonucleotídeos que compreendem bases que não são típicas para RNA ou DNA biológico, tal como oligonucleotídeos 2-0metilados), e similares. Em algumas modalidades, um ácido nucleico pode ser de filamento único, filamento duplo, ou de multifilamento, ou combinações dos mesmos. A menos que de outra maneira indicado, uma sequência de ácido nucleico particular do material assunto agora descrito opcionalmente compreende ou codifica sequências complementares, além de qualquer sequência explicitamente indicada.
Como usada aqui, a frase característica fenotípica refere-se ao
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74/127 aparecimento ou outra característica detectável de um indivíduo, resultante da interação de seu genoma, proteoma e/ou metaboloma com o ambiente.
Como usada aqui, a frase resistência refere-se à capacidade de uma planta de restringir o crescimento e desenvolvimento de uma peste ou patógeno especificado e/ou o dano que eles causam quando comparado a plantas suscetíveis sob condições ambientais similares e pressão de peste ou patógeno. As plantas resistentes podem exibir alguns sintomas de doença ou podem danificar sob pressão de peste ou patógeno pesada.
Essencialmente dois níveis de resistência serão distinguidos. Resistência alta ou padrão refere-se a plantas que altamente restringem o crescimento e desenvolvimento da peste ou patógeno especificado sob pressão de peste ou patógeno normal quando comparado a contrapartes suscetíveis. Porém, estas plantas podem exibir alguns sintomas ou danos sob pressão pesada de peste ou patógeno.
Resistência moderada/intermediária refere-se às plantas que distraem insetos e/ou restringem o crescimento e desenvolvimento da peste ou patógeno especificado, ou amostram dano reduzido comparado às contrapartes suscetíveis, porém podem exibir uma maior faixa de sintomas ou dano comparada a plantas resistentes elevadas/padrão. As plantas moderadamente/de modo intermediário resistentes ainda mostrarão sintomas ou danos significantemente menos severos que plantas suscetíveis quando crescidas sob condições ambientais similares e/ou pressão de peste ou patógeno.
Como usado aqui, a frase suscetibilidade refere-se à inabilidade de uma planta adequadamente restringir o crescimento e desenvolvimento de uma peste ou patógeno especificado.
Como usado aqui, a frase resistência à Bemisia ou resistência à infestações de Bemisia ou planta resistente a Bemisia refere-se à capacidade de plantas resistirem ao ataque, infestação, ou colonização pelo inseto. O nível de resistência exibido por certa planta pode ser marcado, por exemplo, por meio de um Ensaio de Resistência de Inseto padronizado como descrito aqui no exemplo 2A abaixo empregando uma escala de 1 a 9
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75/127 para avaliar a severidade da infestação.
As plantas de escore 1 no referido Ensaio de Resistência de Inseto são completamente cobertas com pupas e pesadamente mofadas frequentemente tolhidas no crescimento, considerando que plantas de escore 9 são completamente livres de pupas e desse modo completamente resistentes. Uma variedade suscetível padrão (por exemplo, Vergasa F1 or Bikingo F1) é entendida para o propósito da presente invenção referir-se a uma planta que se classifica em um Ensaio de Resistência de Inseto como descrito no exemplo 2A entre 3 e 4 onde as plantas mostram muitas pupas (de 100 a 400/folha) que são densamente cheias na folha, geralmente acompanhada por mofo preto.
Uma planta resistente a Bemisia é entendida com a finalidade da presente invenção referir-se a uma planta que se classifica em um Ensaio de Resistência de Inseto padrão como descrito aqui no exemplo 2A abaixo em uma faixa dentre 6 e 9, incluindo 6 e 9.
Uma resistência moderada ou intermediária a infestações de Bemisia começa em um escore de 6 onde as plantas mostram um número baixo relativamente moderado de pupas (20-50/folha) que são mais regularmente distribuídas sobre as folhas. Em um escore 7 somente algumas pupas (5-20/folha) estão presentes, as quais são irregularmente espalhadas sobre a folha. As plantas de escore 8 mostram somente muito poucas pupas (de 1 a 5/folha) e não são afetadas notoriamente no crescimento ou desenvolvimento do fruto.
Desta maneira, com a finalidade da presente invenção, por uma planta sendo moderadamente ou de forma intermediária resistente a infestação de Bemisia, será entendida uma planta que se classifica na faixa dentre 6 e 8 em uma escala que varia de 1 a 9 determinada em um Ensaio de Resistência de Inseto padronizado como descrito aqui no exemplo 2A abaixo. Uma planta é entendida ser altamente resistente a Bemisia, se ela se classifica na faixa dentre 8 e 9, incluindo 9.
Como usada aqui, a frase resistência à tripes ou resistência à infestações de tripés ou plantas resistentes a tripés refere-se à capacidaPetição 870170065661, de 04/09/2017, pág. 83/142
76/127 de de plantas resistirem ao ataque, infestação, ou colonização pelo inseto. O nível de resistência exibido por certa planta pode ser classificado, por exemplo, por meio de um Ensaio de Resistência de Inseto padronizado como descrito no exemplo 2B aqui abaixo usando uma escala de 1 a 9 para avaliar a severidade da infestação julgada com base no dano de alimentação observado (prateamento).
As plantas de escore 1 no referido Ensaio de Resistência de Inseto mostram prateamento muito pesado com uma parte grande da folha danificada (>40% de prateamento), considerando que as plantas de escore 9 mostram nenhum dano de prateamento (0% de prateamento) e são desse modo completamente resistentes. Uma variedade suscetível padrão (por exemplo, Roxy F1 e/ou Snooker F1) é entendida para o propósito da presente invenção referir-se a uma planta que se classifica em um Ensaio de Resistência de Inseto como descrito no exemplo 2B entre 3 (de 11% a 20% de prateamento) e 4 (de 6% a 10% de prateamento) onde as plantas mostram manchas de prateamento muito grandes distribuídas sobre toda a folha.
Uma planta resistente a tripes é entendida com o propósito da presente invenção refere-se a uma planta que se classifica em um Ensaio de Resistência de Inseto padronizado como descrito aqui no exemplo 2B abaixo em uma faixa dentre 5 e 9, incluindo 5 e 9.
Uma resistência moderada ou intermediária para infestações de tripes começa em uma contagem de 5 onde as plantas mostram um número moderado de manchas mais regularmente distribuídas em cima das folhas (de 3% a 5% de prateamento). Em um escore de 7 as plantas mostram somente algumas manchas pequenas especialmente próximas da nervura central ou extremidade de folha (de 0,1% a 1% de prateamento). As plantas de escore 8 mostram somente manchas minúsculas e não são afetadas notoriamente no crescimento ou desenvolvimento de fruto (< 0,1% de prateamento).
Desta maneira, com a finalidade da presente invenção, por uma planta sendo moderadamente ou de forma intermediária resistente a infestação de tripes, será entendida uma planta que se classifica na faixa dentre
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77/127 e 8, particularmente entre 6 e 8, em uma escala que varia de 1 a 9 determinada em um Ensaio de Resistência de Inseto padronizado como descrito aqui no exemplo 2B abaixo. Uma planta é entendida ser altamente resistente a tripes, se ela se classifica na faixa dentre 8 e 9, incluindo 9.
Os termos cromossoma 3 e cromossoma 5 são pretendidos incluir, e desse modo usados aqui sinonimicamente com, os termos grupo de ligação 3 e 5 e/ou cromossoma equivalente do grupo de ligação 3 e 5, respectivamente.
Como usado aqui, o termo pluralidade refere-se a mais que um. Desse modo, uma pluralidade de indivíduos refere-se a pelo menos dois indivíduos. Em algumas modalidades, o termo pluralidade refere-se a mais que a metade do todo. Por exemplo, em algumas modalidades uma pluralidade de uma população refere-se a mais que a metade dos membros daquela população.
Como usado aqui, o termo progênie refere-se aos descendentes de um cruzamento particular. Tipicamente, progênie resulta da procriação de dois indivíduos, embora algumas espécies (particularmente, algumas plantas e animais hermafro ditas) possam ser autopolinizadas (isto é, a mesma planta age como o doador tanto de gametas macho quanto fêmea). Os descendente(s) pode(m) ser, por exemplo, do Fi, do F2, ou qualquer geração subsequente.
Como usada aqui, a frase característica qualitativa refere-se a uma característica fenotípica que é controlada por um ou alguns genes que exibem efeitos fenotípicos principais. Por causa disto, as características qualitativas são herdadas tipicamente simplesmente. Os exemplos em plantas incluem, porém não estão limitadas a, cor da flor, cor do fruto, e várias resistências de doença conhecidas tais como, por exemplo, resistência de mancha Bacteriana.
A seleção com base no marcador é entendida no escopo da invenção referir-se, por exemplo, ao uso de marcadores genéticos para detector de um ou mais ácidos nucleicos da planta, onde o ácido nucleico é associado com uma característica desejada para identificar plantas que carPetição 870170065661, de 04/09/2017, pág. 85/142
78/127 regam os genes para características desejáveis (ou indesejáveis), de modo que estas plantas possam ser empregadas (ou evitadas) em um programa de procriação seletiva.
O Marcador de Microssatélite ou SSRs (repetições de sequência simples) é entendido dentro do escopo da invenção referir-se a um tipo de marcador genético que consiste em numerosas repetições de sequências curtas de bases de DNA, que são encontradas em locais ao longo do genoma da planta e têm uma probabilidade de ser altamente polimórfica.
PCR (reação em cadeia de polimerase) é entendido dentro do escopo da invenção referir-se a um método de produzir quantidades relativamente grandes de regiões específicas de DNA ou subgrupo(s) do genoma, desse modo tornando possível várias análises que sejam com base nessas regiões.
Iniciador de PCR é entendido dentro do escopo da invenção referir-se a fragmentos relativamente curtos de DNA de filamento único empregado na amplificação de PCR de regiões específicas de DNA.
Fenótipo é entendido dentro do escopo da invenção referir-se a uma característica(s) distinguível de uma característica geneticamente controlada.
Polimorfismo é entendido dentro do escopo da invenção referirse à presença em uma população de duas ou mais formas diferentes de um gene, marcador genético, ou característica herdada ou um produto de gene obtenível, por exemplo, através de junção alternativa, metilação de DNA, etc.
Procriação seletiva é entendida dentro do escopo da invenção referir-se a um programa de procriação que usa plantas que possuem ou exibem características desejáveis como os progenitores.
Planta do verificador é entendida dentro do escopo da invenção referir-se a uma planta do gênero Capsicum usada para caracterizar geneticamente uma característica em uma planta a ser testada. Tipicamente, a planta a ser testada é cruzada com uma planta do verificador e a relação de segregação da característica na progênie do cruzamento é classificada.
Sonda como usada aqui refere-se a um grupo de átomos ou
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79/127 moléculas que é capaz de reconhecer e se ligar a uma molécula ou estrutura celular alvo específica e desse modo permitir a detecção da molécula ou estrutura alvo. Particularmente, sonda refere-se a uma sequência de DNA ou RNA rotulada que pode ser empregada para descobrir a presença de e quantificar uma sequência complementar por hibridização molecular.
O termo Hibridizar como usado aqui refere-se às condições de hibridização convencionais, preferivelmente às condições de hibridização na qual 5xSSPE, 1% de SDS, solução IxDenhardts é empregada como uma solução e/ou temperaturas de hibridização entre 35°C e 70°C, preferivelmente 65°C. Após a hibridização, a lavagem é preferivelmente realizada primeiro com 2xSSC, 1% de SDS e subsequentemente com 0,2xSSC em temperaturas entre 35°C e 75°C, particularmente entre 45°C e 65°C, porém especialmente a 59°C (relativo à definição de SSPE, SSC e solução de Denhardts, vide Sambrook e outros loc. cit.). As condições de hibridização de severidade elevada, por exemplo, como descrito em Sambrook e outros, supra, são particularmente preferidas. As condições de hibridização severas particularmente preferidas estão, por exemplo, presentes se a hibridização e lavagem ocorrem a 65°C como indicado acima. As condições de hibridização nãoseveras, por exemplo, com hibridização e lavagem realizadas a 45°C são menos preferidas e a 35°C ainda menos.
Homologia de sequência ou Identidade de sequência é aqui empregada alternadamente. O termo idêntico ou percentual de identidade no contexto de duas ou mais sequências de ácido nucleico ou proteína, refere-se a duas ou mais sequências ou subsequencias que são iguais ou têm um percentual especificado de resíduos de aminoácido ou nucleotídeos que são iguais, quando comparados e alinhados para correspondência de máxima, como medido empregando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequência ou através de inspeção visual. Se duas sequências que serão comparadas entre si diferirem em comprimento, a identidade de sequência refere-se preferivelmente à porcentagem dos resíduos de nucleotídeo da sequência mais curta que é idêntico com os resíduos de nucleotídeo da sequência mais longa. A identidade de sequência pode ser determinada conPetição 870170065661, de 04/09/2017, pág. 87/142
80/127 vencionalmente com o uso de programas de computador tal como o programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versão 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive Madison, Wl 53711). Bestfit utiliza o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, Advances em Applied Mathematics 2 (1981), 482-489, para encontrar o segmento que tem a identidade de sequência mais elevada entre duas sequências. Ao usar Bestfit ou outro programa de alinhamento de sequência para determinar se uma sequência particular tem, por exemplo, 95% de identidade com uma sequência de referência da presente invenção, os parâmetros são preferivelmente ajustados de modo que o percentual de identidade seja calculado sobre o comprimento total da sequência de referência e que os intervalos de homologia de até 5% do número total dos nucleotídeos na sequência de referência sejam permitidos. Ao usar Bestfit, os parâmetros opcionais denominados são preferivelmente deixados em seus valores presentes (básicos). Os desvios que aparecem na comparação entre uma determinada sequência e as sequências acima descritas da invenção podem ser causados, por exemplo, por adição, deleção, substituição, inserção ou recombinação. Uma tal comparação de sequência pode ser realizada preferivelmente da mesma forma com o programa fasta20u66 (versão 2.0u66, setembro de 1998 por William R. Pearson e a Universidade de Virgínia; vide também W.R Pearson (1990), em Methods in Enzymology 183, 63-98, exemplos anexos e http://workbench.sdsc.edu/). Para este propósito, os ajustes de parâmetros básicos podem ser empregados.
Outra indicação que duas sequências de ácido nucleico são substancialmente idênticas é que as duas moléculas hibridizam com cada outra sob condições severas. A frase: hibridizando especificamente para refere-se à ligação, duplexação, ou hibridização de uma molécula somente a uma sequência de nucleotídeo particular sob condições severas quando tal sequência está presente em uma mistura de DNA ou RNA complexa (por exemplo, celular total). Substancialmente liga(s) refere-se à hibridização complementar entre um ácido nucleico de sonda e um ácido nucleico-alvo e abrange más combinações menores que podem ser acomodadas reduzindoPetição 870170065661, de 04/09/2017, pág. 88/142
81/127 se a severidade dos meios de hibridização para alcançar a detecção desejada da sequência de ácido nucleico-alvo.
As condições de hibridização severas e condições de lavagem de hibridização severas no contexto de experiências de hibridização de ácido nucleico tal como hibridações do Sul e do norte são sequências dependentes, e são diferentes sob parâmetros ambientais diferentes. As sequências mais longas hibridizam especificamente em temperaturas mais altas. Um guia extenso para a hibridização de ácidos nucleico é encontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I capítulo 2 Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays Elsevier, Nova Iorque. Geralmente, condições de hibridização e lavagem altamente severas são selecionadas serem aproximadamente 5°C mais baixo do que o ponto de fusão térmico (T.sub.m) para a sequência específica a uma força iônica e pH definidos. Tipicamente, sob condições severas uma sonda hibridizará para sua subsequência-alvo, porém não para outras sequências.
O T.sub.m é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) na qual 50% da sequência-alvo hibridiza para uma sonda perfeitamente emparelhada. As condições muito severas são selecionadas para serem iguais ao T.sub.m para uma sonda particular. Um exemplo de condições de hibridização severas para hibridização de ácidos nucleicos complementares que têm mais de 100 resíduos complementares em um filtro em uma mancha do sul ou do norte é 50% de formamida com 1 mg de heparina a 42°C, com a hibridização sendo realizada durante a noite. Um exemplo de condições de lavagem altamente severas é 0,1 5M de NaCI a 72°C. durante aproximadamente 15 minutos. Um exemplo de condições de lavagem severas é uma lavagem de SSC de 0,2 vezes a 65°C, durante 15 minutos (vide, Sambrook, infra, para uma descrição de tampão de SSC). Frequentemente, uma lavagem de alta severidade é precedida por uma lavagem de baixa severidade para remover sinal de sonda de base. Um exemplo de lavagem de severidade média para um dúplex de, por exemplo, mais do que 100 nucleotídeos, é 1 vez
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82/127 de SSC a 45°C, durante 15 minutos. Um exemplo de lavagem de baixa severidade para um duplex, por exemplo, de mais do que 100 nucleotídeos, é 4-6 vezes SSC a 40°C durante 15 minutos. Para sondas curtas (por exemplo, cerca de 10 a 50 nucleotídeos), as condições severas tipicamente envolvem concentrações de sal menores que cerca de 1,0M de íon de Na, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração de íon de Na (ou outros sais) em pH 7,0 a 8,3, e a temperatura é tipicamente pelo menos cerca de 30°C. Condições severas podem ser obtidas da mesma forma com a adição de agentes desestabilizantes tal como formamida. Em geral, um sinal para relação de barulho de 2 vezes (ou mais elevado) do que aquela observada para uma sonda não-relacionada no ensaio de hibridização particular indica a detecção de uma hibridização específica. Os ácidos nucleicos que não hibridizam para cada outro sob condições severas ainda são substancialmente idênticos se as proteínas que eles codificam forem substancialmente idênticas. Isto ocorre, por exemplo, quando uma cópia de um ácido nucleico é criada usando a degeneração de códon máxima permitida pelo código genético.
Uma planta é qualquer planta em qualquer fase de desenvolvimento, particularmente uma planta de semente.
Uma célula de planta é uma unidade estrutural e fisiológica de uma planta, compreendendo um protoplasto e uma parede de célula. A célula de planta pode estar na forma de uma única célula isolada ou uma célula cultivada, ou como uma parte de unidade organizada mais elevada tal como, por exemplo, tecido de planta, um órgão de planta, ou uma planta inteira.
A cultura de célula planta significa culturas de unidades de planta tal como, por exemplo, protoplastos, células de cultura de célula, células em tecidos de planta, pólen, tubos de pólen, óvulos, sacos de embrião, zigotos e embriões em várias fases de desenvolvimento.
Material de planta refere-se às folhas, troncos, raízes, flores ou partes de flor, frutos, pólen, células de ovo, zigotos, sementes, cortes, culturas de célula ou tecido, ou qualquer outra parte ou produto de uma planta.
Um órgão de planta é uma parte distinta e visivelmente estrutuPetição 870170065661, de 04/09/2017, pág. 90/142
83/127 rada e diferenciada de uma planta tal como uma raiz, tronco, folha, broto de flor, ou embrião.
Tecido de planta como usado aqui, significa um grupo de células de planta organizadas em uma unidade estrutural e funcional. Qualquer tecido de uma planta em planta ou em cultura é incluído. Este termo inclui, porém não está limitado a, plantas inteiras, órgãos de planta, sementes de planta, cultura de tecido e qualquer grupo de células de planta organizadas em unidades estruturais e/ou funcionais. O uso deste termo junto com, ou na ausência de, qualquer tipo específico de tecido de planta como listado acima ou de outra maneira abrangido por esta definição não é pretendido ser exclusivo de qualquer outro tipo de tecido de planta.
A presente invenção refere-se a novas plantas de pimenta, particular a plantas Capsicum annuum, resistentes, particularmente de forma intermediária resistentes, a insetos, particularmente a insetos do gênero Bemisia e/ou da ordem Thysanoptera, mais particularmente a Bemisia tabaci (mosca branca) e/ou tripes mais particularmente Frankliniella occidentalis, também a sementes e frutos das referidas plantas. A presente invenção também refere-se aos métodos de fabricação e uso de tais plantas e seus frutos.
As plantas de acordo com a invenção podem ser obtidas cruzando dois ou mais genótipos parentais, pelo menos um dos quais pode ter um ou mais alelos, particularmente um ou mais alelos em QTL correspondente que contribui com a resistência à Bemisia e/ou tripés, cujo alelo(s) está/estão necessitando do outro genótipo parental ou que complementa o outro genótipo para obter uma planta de acordo com a invenção e como descrito aqui anteriormente. Se mais de um QTL contribui com a expressão da característica de resistência e os dois genótipos parentais originais não fornecem o conjunto inteiro de alelos, outras fontes podem ser incluídas na população de procriação. O outro genótipo parental pode contribuir com uma característica desejável incluindo qualidade de fruto exigida pelo mercado tal como, por exemplo, um peso na faixa de 180 gramas, forma maciça, pele lisa, cor vermelho, brilhante. Além da qualidade do fruto, características
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84/127 agronomicamente importantes tais como, por exemplo, uma boa arquitetura de planta, alta produtividade e resistências básicas a doenças tal como, porém não-limitado a, TMV (vírus em mosáico do tabaco) e TSWV (vírus do Bronzeamento do Tomateiro) são também características desejadas.
Estes genótipos parentais podem ser cruzados com um outro para produzir semente de progênie. Os genótipos parentais podem ser linhagens inatas desenvolvidas por autopolinização de plantas heterozigotas selecionadas de campos com polinização descontrolada ou aberta e empregando procedimentos de seleção periódicos. As plantas superiores são autopolinizadas e selecionadas em gerações sucessivas. Nas gerações sucessivas a condição de heterozigoto determina o modo para linhagens homogêneas como resultado de autopolinização e seleção. Com gerações sucessivas de procriação, a planta fica mais homozigoto e uniforme nas plantas de progênie. Tipicamente, cinco a sete ou mais gerações (F1 a F2; F3 a F4; F4 a F5) de seleção de genealogia e autopolinização podem ser praticadas para obter linhagens inatas que sejam uniformes em planta e características de semente e que permanecerão uniformes sob autofertilização continuada.
Durante a procriação, muitos alelos indesejáveis em locais heterozigotos serão substituídos por alelos mais favoráveis e os alelos nãofavoráveis ou não-desejados eliminados da progênie. Além disso, através de seleção com base em marcador o número de alelos favoráveis pode ser maximizado pelo fato de que mais alelos não-favoráveis são identificados e sucessivamente substituídos pelos alelos mais favoráveis.
Em um aspecto, a planta de acordo com a invenção pode ser obtida introgredindo-se a característica de resistência do inseto de uma planta antepassada, particularmente uma planta antepassada selvagem em uma planta de pimenta cultivada, particularmente uma planta de Capsicum annuum cultivada, mais particularmente uma planta de Capsicum annuum que é homozigota para um local c (Blum e outro (2002) Genome, 45: 702-705) ou um alelo puni (Stewart e outro (2005) The Plant Journal, 42: 675-688), ou para ambos os locais.
Em uma modalidade específica da invenção, o antepassado seiPetição 870170065661, de 04/09/2017, pág. 92/142
85/127 vagem, do qual a característica de resistência à Bemisia e/ou tripés pode ser obtida, é Capsicum annuum selvagem n° de acessão CGN16975 obtenível do Instituut voor de Veredeling van Tuinbouwgewassen (agora: Centro para Recursos Genéticos), Wageningen, Países Baixos. A característica de resistência do inseto de acordo com a presente invenção, que confere a uma planta que expressa esta característica, um nível intermediário de resistência às infestações de insetos do gênero Bemisia e/ou da ordem Thysanoptera, mais particularmente para Bemisia tabaci (mosca branca) e/ou tripes mais particularmente Frankliniella occidentalis, pode, na alternativa, ser obtida da linhagem Capsicum annuum 061M4387, uma amostra da qual foi depositado com NCIMB Ltd sob número de acessão NCIMB 41428, ou de uma descendência ou antepassado de linhagem 061M4387 compreendendo a característica de resistência à Bemisia e/ou a tripes.
Consequentemente, em uma modalidade específica da invenção, o genótipo parental que contribui para a(s) característica(s) de resistência é uma linhagem inata que tem as propriedades pertinentes da invenção da linhagem Capsicum annuum depositada 061M4387, isto é, substancialmente a mesma arquitetura de genoma no QTL associado com resistência à Bemisia e/ou tripes, amostras de semente da qual foram depositadas no dia 10 de agosto de 2006 com NCIMB sob número de acessão NCIMB 41428.
Em outra modalidade específica da invenção, o genótipo parental que contribui para a característica de resistência é um híbrido tendo as propriedades pertinentes da invenção da linhagem de Capsicum annuum depositada 061M4387, isto é, substancialmente a mesma arquitetura de genoma no QTL associado com resistência à Bemisia e/ou tripes, amostras de semente da qual foram depositadas no dia 10 de agosto de 2006 com NCIMB sob número de acessão NCIMB 41428.
Linhagem Capsicum annuum 061M4387 resultou de um cruzamento de acessão selvagem n° CGN 16975 obtenível do Centro para Recursos Genéticos, Wageningen, Países Baixos como o doador da característica de resistência com uma linhagem inata de Capsicum annuum. Descendência resistente a Bemisia e tripes deste cruzamento foi cruzada com linhagens
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86/127 inatas adicionais de antecedentes genéticos diferentes para obter finalmente a linhagem 061M4387.
Consequentemente, linhagem de Capsicum annuum 061M4387 ou qualquer outra linhagem de planta que contém a característica de resistência à Bemisia e/ou tripes da linhagem de Capsicum annuum 061M4387, pode ser usada como um material de fonte para introgredir a referida característica de resistência em qualquer antecedente genético desejado para obter uma planta de pimenta sendo altamente ou de forma intermediária resistente, particularmente de forma intermediária resistente, às infestações de insetos do gênero Bemisia e/ou da ordem Thysanoptera, mais particularmente a Bemisia tabaci (mosca branca) e/ou tripes mais particularmente Frankliniella occidentalis, pode também conter uma ou mais características desejáveis tais como características de qualidade de fruta exigidas pelo mercado tal como, por exemplo, um peso na faixa de 180 gramas, forma maciça, pele lisa, cor vermelho luminoso. Junto à qualidade da fruta, características agronomicamente importantes tal como, por exemplo, uma boa arquitetura de planta, produtividade alta e resistências básicas à doença tal como, mas não-limitada a, TMV (vírus em Mosáico do Tabaco) e TSWV (Tomato Spotted Wilt vírus) são também características desejadas.
Com base na descrição da presente invenção, a pessoa versada que está em posse da linhagem Capsicum annuum 061M4387, uma amostra da qual foi depositado com NCIMB Ltd sob número de acessão NCIMB 41428, ou de uma descendência ou antepassado do mesmo que contêm o QTL no cromossoma 3 associado com resistência à Bemisia e/ou o QTL no cromossoma 5 associado com a resistência à tripes e Bemisia, respectivamente, como descrito aqui acima, não tem dificuldade de transferir a característica de resistência à Bemisia e/ou a característica de resistência à tripes da presente invenção a outras plantas de pimenta de vários tipos usando técnicas de procriação bem-conhecidas na técnica. A característica da presente invenção pode, por exemplo, ser transferida para plantas de pimenta que produzem vários tipos ou formas, tais como pimentões, pimentas de cheiro, pimentas quentes, pimentas retangulares grandes, pimentas cônicas,
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87/127 incluindo pimentas cônicas longas, ou pimentas tipo maciça e de várias cores maduras, tal como sempre-verde, vermelho, amarelo, laranja ou marfim. Consequentemente, em uma modalidade, uma planta da presente invenção é uma planta de C. annuum capaz de resistir às infestações de Bemisia e/ou tripés, cuja planta é um pimentão ou pimenta de cheiro, uma pimenta quente, uma pimenta retangular grande, uma pimenta cônica ou uma pimenta cônica longa de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade, uma planta da presente invenção é capaz de produzir uma fruta de pimenta sempre-verde, vermelho, amarelo, laranja ou marfim. Em outra modalidade da invenção, as plantas de pimenta são crescidas para semente (híbrido) ou produção de pimenta comercial.
Consequentemente, em outra modalidade, a presente invenção descreve um método de transferir a característica de resistência à Bemisia e/ou a característica de resistência à tripes de acordo com a presente invenção para uma planta de pimenta que necessita da referida característica que compreende a) obter uma planta compreendendo a referida característica; b) cruzá-la com um planta que necessita da referida característica; c) obter plantas do cruzamento da etapa b); d) selecionar uma planta da etapa c) que seja capaz de resistir às infestações de Bemisia e/ou tripés de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade, o método também compreende e) cruzar novamente uma planta resultante da etapa d) com uma planta de pimenta, e f) selecionar uma planta de pimenta, que seja capaz de resistir às infestações de Bemisia e/ou tripes de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade, o método também compreende obter uma planta de pimenta inata que seja capaz de resistir às infestações de Bemisia e/ou tripes de acordo com a presente invenção e, em uma modalidade, o método também compreende o cruzamento da referida planta de pimenta inata a outra planta de pimenta para produzir uma planta de pimenta híbrida, que seja capaz de resistir às infestações de Bemisia e/ou tripés de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade, uma planta de pimenta é selecionada determinando-se o escore de resistência às infestações de Bemisia e/ou tripés, como descrito aqui. Em uma modalidade, a planta da etapa a) comprePetição 870170065661, de 04/09/2017, pág. 95/142
88/127 endendo a referida característica é a linhagem de Capsicum annuum 061M4387, uma amostra da qual foi depositada com NCIMB Ltd sob número de acessão NCIMB 41428, ou uma descendência ou antepassado da referida planta.
Em certas modalidades da invenção, um Ensaio de Resistência de Inseto padronizado é usado, tal como aquele descrito no exemplo 2 aqui abaixo, para determinar o nível de resistência das plantas de descendência resultantes de um dos cruzamentos anteriores e selecionar estas plantas de descendência para outra procriação, as quais são forma intermediária resistentes, às infestações de Bemisia e/ou tripes.
A presente invenção descreve uma planta de C. annuum obtenível por qualquer um dos métodos acima, em que a planta é capaz de resistir às infestações de Bemisia e/ou tripes como descrito aqui.
Em ainda outra modalidade, a presente invenção descreve um método de produzir uma planta que compreende a característica de resistência à Bemisia e/ou tripes de acordo com a presente invenção a uma planta de pimenta que necessita da referida característica compreendendo a) obter um planta compreendendo a referida característica; b) cruzá-la com uma planta que necessita da referida característica; c) obter plantas do cruzamento da etapa b); d) selecionar uma planta da etapa c) que é capaz de resistir às infestações de Bemisia e/ou tripes de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade, o método também compreende e) cruzar novamente uma planta resultante da etapa d) com uma planta de pimenta, e f) selecionar uma planta de pimenta que seja capaz de resistir às infestações de Bemisia e/ou tripes de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade, o método também compreende obter uma planta de pimenta inata que é capaz de infestações de Bemisia e/ou tripes de acordo com a presente invenção e, em uma modalidade, o método também compreende cruzar a referida planta de pimenta inata em outra planta de pimenta para produzir uma planta de pimenta híbrida, que é capaz de resistir às infestações de Bemisia e/ou tripes de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade, uma planta de pimenta é selecionada determinando-se o escore de rePetição 870170065661, de 04/09/2017, pág. 96/142
89/127 sistência às infestações de Bemisia e/ou tripes, como descrito aqui. Em uma modalidade, a planta da etapa a) compreendendo a referida característica é uma linhagem de Capsicum annuum 061M4387, uma amostra da qual foi depositada com NCIMB Ltd sob número de acessão NCIMB 41428, ou uma descendência ou antepassado da referida planta.
Em uma modalidade, a presente invenção descreve uma planta de C. annuum obtenível por qualquer um dos métodos acima, em que a planta é capaz de resistir às infestações de Bemisia e/ou tripes como descrito aqui.
Com base nos ensinamentos da presente invenção, uma pessoa versada pode projetar um programa para procurar fontes novas para uma característica, particularmente uma característica de resistência, porém especialmente uma resistência à insetos do gênero Bemisia e/ou da ordem Thysanoptera.
Em um aspecto da invenção, as plantas que expressam a característica de resistência à inseto e que exibem resistência, particularmente um nível intermediário de resistência, às infecções com insetos do gênero Bemisia, podem ser identificadas e selecionadas usando um teste resistente a Bemisia padronizado em uma taxa de resistência que é geralmente usada e reconhecida na técnica de procriação de pimenta.
Em particular, as plantas são plantadas e cultivaram de acordo com os procedimentos-padrão e transplantadas de acordo com um projeto especial.
As plantas são transplantadas em várias fileiras com um número fixo de plantas por fileira. Em cada fileira, um lado é usado como fileira espaIhadora e plantado com uma entrada suscetível ou, linhagem parental suscetível. A outra parte da fileira é plantada com as entradas a ser testadas quanto à resistência ao inseto. As entradas de teste são completamente randomizadas em cada dentre os vários blocos, com 1 ou mais plantas/entrada por bloco.
Desenvolvimento de Bemisia é monitorado na fileira espalhadora semanalmente ou quinzenalmente avaliando-se um número fixo de plantas
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90/127 na fileira espalhadora em posições equidistantes (por exemplo, planta 1, 38, 75, 112, 150) em cada fileira. As avaliações finais são feitas quando a infestação média das plantas espalhadoras monitoradas alcançou uma taxa de resistência de aproximadamente 4, que é quando as pupas são densamente comprimidas na folha em números de mais que 100/folha. Normalmente, este estágio é alcançado no momento quando as primeiras frutas estiverem amadurecendo (3-4 meses depois do transplante).
Os dados são analisados calculando-se as médias por entrada de teste e comparação com uma entrada suscetível (por exemplo, fileira espalhadora suscetível ou diferente). Uma múltipla comparação das médias (por exemplo, LSD) indica se as entradas de teste diferem-se mutuamente e de um controle suscetível.
Para avaliar a severidade, uma escala de 1-9 é usada (Tabela 1). O lado abaxial das folhas da planta é inspecionado e a média de aproximadamente 5 piores folhas afetadas são avaliadas de acordo com a escala de 1-9. Todas as plantas de teste são marcadas desta maneira.
Em um aspecto da invenção, as plantas que expressam característica de resistência à inseto e exibem resistência, particularmente um nível intermediário de resistência, às infecções com insetos da ordem Thysanoptera podem ser identificadas e selecionadas usando um teste resistente a tripes unificado resultante em uma taxa de resistência que é geralmente usada e reconhecida na técnica de procriação de pimenta.
Em particular, as plantas são plantadas e cultivadas de acordo com os procedimentos-padrão e transplantadas de acordo com um projeto especial.
Na alternativa, a procriação assistida por marcador pode ser empregada para identificar esses indivíduos onde os locais pertinentes da invenção, particularmente locais de QTL pertinentes da invenção, e/ou que locais de flanqueamento de marcadores ou locais de marcadores geneticamente ligados a estes, como descrito aqui antes de ter genótipos favoráveis, genótipos favoráveis particularmente homozigotos.
Em uma modalidade da invenção, resistência à infestação com
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Bemisia e/ou tripes é registrada na avaliação fenotípica.
Em outra modalidade, a seleção é baseada em marcadores moleculares que são ligados às características de interesse.
Em uma modalidade, a seleção é baseada em uma combinação de marcadores moleculares e avaliação fenotípica.
Seleção com base em marcador já pode ser usada nas fases precoces do desenvolvimento inato, frequentemente em combinação com métodos de avaliação que são em grande parte baseados em características fenotípicas que podem ser determinadas visualmente e são relacionados a índices de desempenho fundamentais tal como, por exemplo, vigor de planta, comprimento de internodos, ramificações, resistência de inseto tal como resistência às infestações de Bemisia e/ou tripes, resistências de vírus tal como TMV (vírus em Mosáico do Tabaco) e TSWV (vírus do Bronzeamento do Tomateiro), etc, que são pertinentes para a conveniência da planta a ser utilizada na produção híbrida comercial. A seleção pode ser da mesma forma com base em marcadores moleculares que podem ou não podem ser ligados às características de interesse.
Em particular, seleção com base em marcador pode ser aplicada em combinação com ou seguida por uma seleção fenotípica para identificar esses indivíduos onde todos os locais pertinentes da invenção descritos aqui antes de ter genótipos favoráveis homozigotos.
Há vários tipos de marcadores moleculares que podem ser usados na seleção com base em marcador incluindo, porém não-limitados a, polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP), amplificação aleatória de DNA polimórfica (RAPD), polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição amplificado (AFLP), repetições de sequência simples (SSR) e polimorfismos de nucleotídeo simples SNPs.
RFLP envolve o uso de enzimas de restrição para cortar o DNA cromossômico em sítios de restrição curtos específicos, polimorfismos resultam de duplicações ou deleções entre os sítios ou mutações nos sítios de restrição.
RAPD utiliza amplificação de reação em cadeia da polimerase
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92/127 de baixa severidade (PCR) com iniciadores simples de sequência arbitrária para gerar disposições específicas de cepa de fragmentos de DNA anônimos. O método requer apenas amostras de DNA minúsculos e analisa um número grande de locais polimórficos.
AFLP requer a digestão de DNA celular com enzima(s) de restrição antes de usar PCR e nucleotídeos seletivos nos iniciadores para amplificar fragmentos específicos. Com este método, o uso de técnicas de eletroforese para visualizar os fragmentos obtidos, até 100 locais polimórficos podem ser medidos por combinação de iniciador e apenas amostras de DNA pequenas são requeridas para cada teste.
Análise de SSR é baseado em sequências de microssatélites de DNA (repetição curta) que são amplamente dispersas ao longo do genoma de eucariotas, que são seletivamente amplificados para detectar variações em repetições de sequência simples. Apenas amostras de DNA minúsculas são requeridas para uma análise de SSR. SNPs usam ensaios de extensão de PCR que eficazmente recuperam as mutações pontuais. O procedimento requer pouco DNA por amostra. Um ou dois dos métodos anteriores podem ser usados em um programa de procriação de seleção com base em marcador típico.
O método mais preferido de alcançar a amplificação de fragmentos de nucleotídeo que atravessam uma região polimórfica do genoma de planta emprega a reação em cadeia da polimerase (PCR) (Mullis e outro, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263 273 (1986)), usando pares de iniciador envolvendo um iniciador dianteiro e um iniciador reverso que são capazes de cruzar às sequências proximais que definem um polimorfismo em sua forma de filamento duplo.
Métodos alternativos podem ser empregados para amplificar fragmentos, tal como a Ligase Chain Reaction (LCR) (Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:189 193 (1991)), que usa dois pares de sondas de oligonucleotídeo para exponencialmente amplificar um alvo específico. As sequências de cada par de oligonucleotídeos são selecionadas para permitir o par hibridizar em sequências limitantes do mesmo filamento do alvo. Tal
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93/127 hibridização forma um substrato para uma ligase dependente de modelo. Como com PCR, os produtos resultantes desse modo servem como um modelo em ciclos subsequentes e uma amplificação exponencial da sequência desejada é obtida.
LCR pode ser realizada com oligonucleotídeos que têm as sequências proximal e distal do mesmo filamento de um sítio polimórfico. Em uma modalidade, qualquer oligonucleotídeo será projetado para incluir o sítio polimórfico atual do polimorfismo. Em uma tal modalidade, as condições de reação são selecionadas tal que os oligonucleotídeos podem ser ligados juntos apenas se a molécula-alvo contém ou necessita do nucleotídeo específico que é complementar ao sítio polimórfico presente no oligonucleotídeo. Alternativamente, os oligonucleotídeos podem ser selecionados tal que eles não incluem o sítio polimórfico (vide, Segev, PCT Application WO 90/01069).
Um método adicional que pode ser empregado alternativamente é o Oligonucleotide Ligation Assay (OLA) (Landegren e outro, Science 241:1077 1080 (1988)). O protocolo de OLA usa dois oligonucleotídeos que são projetados para ser capazes de hibridizar para sequências limitantes de um único filamento de um alvo. OLA, como LCR, é particularmente adequado para a detecção de mutações pontuais. Ao contrário de LCR, porém, OLA resulta em linear em vez da amplificação exponencial da sequência-alvo.
Ainda outro método que pode alternativamente ser empregado é o Ensaio Invasor que usa uma endonuclease de ponta específica de estrutura (FEN) para clivar um complexo tridimensional formado por hibridização de oligonucleotídeos de sobreposição específicos de alelo para alvejar DNA contendo um sítio de polimorfismo de nucleotídeo simples (SNP). O anelamento do oligonucleotídeo complementar ao alelo de SNP na molécula-alvo ativa a divagem do oligonucleotídeo por cleavase, uma FEM termoestável. A divagem pode ser detectada por vários métodos diferentes. Geralmente, o produto de divagem ativa uma reação de divisão secundária em um cassete de transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) para liberar um sinal fluorescente. Alternativamente, a divagem pode ser detectada diretamente por uso de sondas de polarização de fluorescência (FP), ou
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94/127 por espectrometria de massa. A reação de divagem invasiva é altamente específica, tem uma baixa taxa de fracasso, e pode detectar quantidades de zeptomol de DNA-alvo. Enquanto o ensaio foi tradicionalmente usado para interrogar um SNP em uma amostra por reação, novos métodos com base em conta e fragmento foram testados para tornar este ensaio eficiente e preciso adaptável para multiplexação e genotipação de SNP de alto rendimento.
Nickerson e outros descreveram um ensaio de detecção de ácido nucleico que combina atributos de PCR e OLA (Nickerson e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 87:8923 8927 (1990)). Neste método, PCR é usada para alcançar a amplificação exponencial de DNA-alvo, que é em seguida detectada usando OLA.
Esquemas com base na ligação de dois (ou mais) oligonucleotídeos na presença de um ácido nucleico que tem a sequência do dioligonucleotídeo resultante, desse modo amplificando o dioligonucleotídeo, são da mesma forma conhecidos (Wu et al, Genomics 4:560 569 (1989)), e podem ser adaptados facilmente para o propósitos da presente invenção.
Em uma modalidade, um marcador molecular é um fragmento de DNA amplificado por PCR, por exemplo, um marcador de SSR ou um marcador de RAPD. Em uma modalidade, a presença ou ausência de um fragmento de DNA amplificado é indicativo da presença ou ausência da própria característica ou de um alelo particular da característica. Em uma modalidade, uma diferença no comprimento de um fragmento de DNA amplificado é indicativa da presença de um alelo particular de uma característica, e assim permite distinguir entre os alelos diferentes de uma característica.
Em uma modalidade específica da invenção, marcadores de repetição de sequência simples (SSR) são usados para identificar alelos pertinentes da invenção nas plantas de origem e/ou as antepassadas, bem como nas plantas de descendência resultantes de um cruzamento das referidas plantas de origem. Repetições de sequência simples são sequências de DNA repetidas, curtas e apresentam-se nos genomas de todos os eucariotas e consistem em vários a mais de cem repetições de um determinado motivo de nucleotídeo. Visto que o número de repetições presentes em um local
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95/127 particular no genoma diferem-se frequentemente entre as plantas, SSRs podem ser analisadas para determinar a ausência ou presença de alelos específicos.
Em outra modalidade da invenção, marcadores de SNP são usados para identificar alelos pertinentes da invenção na planta de origem e/ou antepassada da mesma, bem como nas plantas de descendência resultantes de um cruzamento das referidas plantas de origem.
Em um aspecto, a invenção refere-se a um marcador ou a um conjunto de dois ou mais marcadores e até 6 marcadores que compreendem um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR que consistem em um iniciador dianteiro e um iniciador inverso selecionados do grupo de par de iniciador 1 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 1 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 2, par de iniciador 2 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 3 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 4, par de iniciador 3 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 5 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 6, par de iniciador 4 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 7 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 8, par de iniciador 5 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 9 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 10, e par de iniciador 6 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 11 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 12, cujos iniciadores conduzem a um produto de amplificação em uma reação de PCR que exibe um peso molecular ou uma sequência de nucleotídeo, que é essencialmente idêntico ou pode ser considerado como um alelo aquele de um produto de amplificação de PCR correspondente obtenível da linhagem de Capsicum annuum 061M4387 em uma reação de PCR com o(s) par(es) de iniciador idêntico(s).
Qualquer outra combinação de iniciadores dianteiros e reversos selecionada do grupo de sequências de iniciador descrito em SEQ ID NOS: 1-12 pode da mesma forma ser usada em uma reação de PCR.
Em um aspecto, a invenção refere-se a um marcador ou a um conjunto de dois ou mais marcadores e até 7 marcadores que compreendem um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR que consistem em um
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96/127 iniciador dianteiro e um iniciador inverso selecionados do grupo de par de iniciador 7 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 13 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 14, identificando o local marcador 7; par de iniciador 8 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 15 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 16, identificando o local marcador 8; par de iniciador 9 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 17 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 18, identificando o local marcador 9; par de iniciador 10 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 19 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 20, identificando o local marcador 10; par de iniciador 11 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 21 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 22, identificando o local marcador 11; par de iniciador 12 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 23 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 24, identificando o local marcador 12, e par de iniciador 13 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 25 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 26, identificando o local marcador 13, cujos iniciadores conduzem a um produto de amplificação em uma reação de PCR que exibe um peso molecular ou uma sequência de nucleotídeo que é essencialmente idêntica ou pode ser considerado como um alelo àquele de um produto de amplificação de PCR correspondente obtenível da linhagem de Capsicum annuum 061M4387 em uma reação de PCR com o(s) par(es) de iniciador idêntico(s).
Qualquer outra combinação de iniciadores dianteiros e reversos selecionados do grupo de sequências de iniciador descrito em SEQ ID NOS: 13-26 pode da mesma forma ser usada em uma reação de PCR.
Em um aspecto, a invenção refere-se a um marcador ou como conjunto de dois ou mais marcadores e até 13 marcadores que compreendem um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR que consiste em um iniciador dianteiro e um reverso selecionado do grupo de par de iniciador 1 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 1 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 2, par de iniciador 2 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 3 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 4, par de iniciador 3 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 5 e um
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97/127 iniciador inverso de SEQ ID NO: 6, par de iniciador 4 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 7 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 8, par de iniciador 5 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 9 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 10, e par de iniciador 6 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 11 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 12, par de iniciador 7 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 13 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 14, identificando o local marcador 7; par de iniciador 8 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 15 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 16, identificando o local marcador 8; par de iniciador 9 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 17 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 18, identificando o local marcador 9; par de iniciador 10 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 19 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 20, identificando o local marcador 10; par de iniciador 11 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 21 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 22, identificando o local marcador 11; par de iniciador 12 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 23 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 24, identificando o local marcador 12, e par de iniciador 13 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 25 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 26, identificando o local marcador 13, cujos iniciadores conduzem a um produto de amplificação em uma reação de PCR que exibe um peso molecular ou uma sequência de nucleotídeo que é essencialmente idêntico ou pode ser considerado como um alelo àquele de um produto de amplificação de PCR correspondente obtenível da linhagem Capsicum annuum 061M4387 em uma reação de PCR com o(s) par(es) de iniciador idêntico(s).
Qualquer outra combinação de iniciadores dianteiros e reversos selecionados do grupo de sequências de iniciador descrito em SEQ ID NOS: 1-26 pode da mesma forma ser usada em uma reação de PCR.
Em outra modalidade da invenção, marcadores moleculares podem ser usados, que estão em desequilíbrio de ligação e/ou ligados a e/ou localizados na região de QTL no cromossoma 3 e cromossoma 5, respectivamente compreendendo um QTL que contribui para a resistência à Bemisia
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98/127 e tripes de acordo com a invenção, bem como marcadores que representam as mutações causais atuais subjacentes ao QTL, e desse modo exibe correlação estatística à característica fenotípica, cujos marcadores podem ser desenvolvidos usando os iniciadores de oligonucleotídeo como descrito em SEQ ID NO: 1-12 e SEQ ID NOS: 13 a 26, respectivamente.
Em uma primeira etapa, amostras de cDNA ou DNA são obtidas de material de planta adequado tal como tecido de folha extraindo-se DNA ou RNA usando técnicas conhecidas. Iniciadores que flanqueiam uma região que contém SSRs dentro do QTL pertinente da invenção descrito aqui antes ou dentro de uma região ligada a isto, são em seguida usados para amplificar a amostra de DNA usando o método de reação em cadeia de polimerase (PCR) bem conhecido por aqueles versados na técnica.
Basicamente, o método de amplificação de PCR envolve o uso de um iniciador ou um par de iniciadores que compreendem duas sequências de iniciador de oligonucleotídeo curtas que flanqueiam o segmento de DNA a ser amplificado ou sequências adaptadoras ligadas ao referido segmento de DNA. Ciclos repetidos de aquecimento e desnaturação do DNA são seguidos por anelamento dos iniciadores às suas sequências complementares em baixas temperaturas, e a extensão dos iniciadores anelados com DNA polimerase. Os iniciadores hibridizam para filamentos opostos das sequências de DNA-alvo. A hibridização refere-se ao anelamento de filamentos de DNA complementares, onde complementar refere-se à sequência dos nucleotídeos tal que os nucleotídeos de um filamento podem ligar-se com os nucleotídeos no filamento oposto para formar estruturas de filamento duplo. Os iniciadores são orientados de forma que a síntese de DNA pelo polimerase proceda bidirecionalmente pela sequência de nucleotídeo entre os iniciadores. Este procedimento dobra eficazmente a quantidade desse segmento de DNA em um ciclo. Porque os produtos de PCR são complementares a, e capazes de ligar-se aos iniciadores, cada ciclo sucessivo dobra a quantidade de DNA sintetizada nos ciclo anterior. O resultado deste procedimento é o acúmulo exponencial de um fragmento alvo específico, que é aproximadamente 2 <n>, onde n é o número de ciclos.
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Através da amplificação de PCR, milhões de cópias do segmento de DNA flanqueado pelos iniciadores são feitas. Diferenças no número de sequências repetidas ou inserções ou deleções na região que flanqueiam as referidas repetições, as quais ficam situadas entre os iniciadores de flanqueamento em alelos diferentes são refletidas em variações de comprimento dos fragmentos de DNA amplificados. Estas variações podem ser detectadas, por exdemplo, separando-se eletroforeticamente os fragmentos de DNA amplificados em géis ou usando-se sequenciadores capilares. Através da análise do gel ou perfil, pode ser determinado se a planta contém o alelo desejado em um estado homozigoto ou heterozigoto ou se os alelo desejado ou indesejado está ausente do genoma de planta.
Análise de marcador pode ser feita mais cedo no desenvolvimento da planta usando amostras de DNA extraídas do tecido de folha de plantas muito jovens ou de semente. Isto permite identificar plantas com uma composição genética desejável mais cedo no ciclo de procriação e descartar plantas que não contêm os alelos pertinentes da invenção, desejados antes de polinização desse modo reduzindo o tamanho da população de procriação assim e reduzindo as exigências de fenotipação.
Além disso, usando-se os marcadores moleculares, uma distinção pode ser feita entre plantas homozigotas que levam duas cópias do alelo pertinente da invenção, desejado em locais QTL pertinentes da invenção e plantas heterozigotas que levam apenas uma cópia e plantas que não contêm qualquer cópia do(s) alelo(s) favorável(véis).
Em uma modalidade da invenção, os locais marcadores podem ser identificados por um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR que consistem em um iniciador dianteiro e um iniciador inverso selecionado do grupo de par de iniciador 1 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 1 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 2, par de iniciador 2 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 3 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 4, par de iniciador 3 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 5 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 6, par de iniciador 4 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 7 e um iniciador inPetição 870170065661, de 04/09/2017, pág. 107/142
100/127 verso de SEQ ID NO: 8, par de jniciador 5 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 9 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 10, e par de iniciador 6 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 11 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 12, incluindo iniciadores de oligonucleotídeo que consistem em um iniciador dianteiro e um iniciador inverso que exibem uma sequência de nucleotídeo que compartilham entre 90% e 99%, particularmente entre 95% e 98% de identidade de sequência com as sequências de nucleotídeo dadas em SEQ ID NO: 1-12.
Em uma modalidade da invenção, os locais marcadores podem ser identificados por um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR que consistem em um iniciador dianteiro e um iniciador inverso selecionados do grupo de par de iniciador 7 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 13 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 14, identificando o local marcador 7; par de iniciador 8 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 15 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 16, identificando o local marcador 8; par de iniciador 9 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 17 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 18, identificando o local marcador 9; par de iniciador 10 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 19 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 20, identificando o local marcador 10; par de iniciador 11 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 21 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 22, identificando o local marcador 11; par de iniciador 12 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 23 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 24, identificando o local marcador 12, e par de iniciador 13 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 25 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 26, identificando o local marcador 13, incluindo iniciadores de oligonucleotídeo que consistem em um iniciador dianteiro e um iniciador inverso que exibem uma sequência de nucleotídeo que compartilha entre 90% e 99%, particularmente entre 95% e 98% de identidade de sequência com as sequências de nucleotídeo dadas em SEQ ID NO: 13-26.
Além disso podem ser usados dentro do escopo das moléculas de oligonucleotídeo da invenção tais como iniciadores ou sondas, particuPetição 870170065661, de 04/09/2017, pág. 108/142
101/127 larmente iniciadores que consistem em um iniciador dianteiro e um iniciador inverso que exibem uma sequência de nucleotídeo que hibridiza para as sequências de nucleotídeo das sequências de iniciador dianteiro e reverso dadas em SEQ ID NO: 1-12 mostradas na Tabela 10 e em SEQ ID NO: 13-26 mostradas na Tabela 11, ou às sequências de nucleotídeo que hibridizam para uma sequência que pode ser obtida usando-se sequências de iniciador inverso e dianteiro como determinado em SEQ ID NO: 1-12 e SEQ ID NO: 13-26, respectivamente, sob condições de severidade média, particularmente sob média a alto, particularmente sob altas.
Em particular, a reação de hibridização é realizada sob condições de severidade alta em que solução 5xSSPE, 1% de SDS, IxDenhardts é usada como uma solução e/ou temperaturas de hibridização estão entre 35°C e 70°C, e até 72°C, preferivelmente 65°C. Depois da hibridização, a lavagem é particularmente realizada primeiro com 2xSSC, 1% de SDS e subsequentemente com 0,2xSSC em temperaturas entre 35°C e 70°C, e até 72°C, particularmente a 65°C (relativo à definição de solução de SSPE, SSC e Denhardts ver Sambrook e outro loc. cit.).
Em um aspecto da invenção, marcadores podem ser desenvolvidos e usados, os quais não são descritos explicitamente aqui ou marcadores ainda também a ser identificados. Com base na informação fornecida neste pedido, será possível, para uma pessoa versada, identificar ou desenvolver marcadores não-explicitamente descritos porém ligados ao QTL ou ligados aos marcadores descritos. A pessoa versada sabe que outros marcadores podem fornecer pelo menos utilidade igual na seleção assitida por marcador.
A invenção, desse modo, da mesma forma refere-se a marcadores moleculares que estão em desequilíbrio de ligação e/ou ligados a e/ou localizados na região de QTL no cromossoma 3 e cromossoma 5, respectivamente compreendendo um QTL que contribui para a resistência à Bemisia e tripes de acordo com a invenção, bem como marcadores que representam as mutações causais atuais subjacentes ao QTL, e desse modo exibem correlação estatística à característica fenotípica, cujos marcadores podem ser
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102/127 desenvolvidos usando os iniciadores de oligonucleotídeo como descrito em SEQ ID NO: 1-12 e SEQ ID NOS: 13 a 26, respectivamente.
Os marcadores genômicos contíguos que indicam a localização do QTL no genoma são principalmente arbitrários ou não-limitantes. Em geral, a localização de um QTL é indicado por uma série contíguo de marcadores que exibem correlação estatística à característica fenotípica. Desse modo, é possível indicar a localização do QTL e a presença ou ausência do QTL (e com qual o fenótipo) por outros marcadores localizados dentro da região de QTL.
O número de marcadores potencialmente úteis está limitado mas pode ser muito grande, e uma pessoa versada pode facilmente identificar marcadores adicionais por aqueles descritos no pedido. Qualquer marcador que é ligado à resistência como descrito no pedido pode ser usado na seleção assistida por marcador.
Desse modo, os marcadores alternativos podem, portanto, ser desenvolvidos por métodos conhecidos pela pessoa versada e usados para identificar e selecionar plantas com um alelo ou um conjunto de alelos de um local ou locais de característica quantitativa de acordo com a presente invenção e como descrito aqui anteriormente.
Por exemplo, a sequência de nucleotídeo do produto de amplificação obtido na amplificação de PCR usando os pares de iniciador como indicado na Tabela 10 e Tabela 11, respectivamente, exibindo uma sequência de nucleotídeo como determinado em SEQ ID NO: 1-12 e SEQ ID NOS: 13-26, pode ser obtida por aqueles versados na técnica e novos iniciadores ou pares de iniciador projetados com base na sequência de nucleotídeo recentemente determinada do produto de amplificação de PCR. Além disso, os marcadores de acordo com a invenção e descritos aqui anteriormente podem estar posicionados em um mapa genético de pimenta ou outras espécies, em particular espécies de Solanaceae e marcadores conhecidos que mapeiam na(s) mesma(s) região(ões) homóloga(s) ou ortóloga(s) podem ser usados como ponto de partida para o desenvolvimento de novos marcadores.
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As sequências de nucleotídeo dos produtos de amplificação obtidos na amplificação de PCR usando os pares de iniciador como indicado na Tabela 10 e Tabela 11, respectivamente, exibindo uma sequência de nucleotídeo como determinado em SEQ ID NO: 1-12 e SEQ ID NOS: 13-26, ou parte das mesmas podem ser usadas da mesma forma como sondas de hibridização, por exemplo, para avaliar uma biblioteca de BAC, para identificar as sequências de nucleotídeo ligadas adicionais.
Consequentemente, os marcadores especificamente descritos na presente invenção podem da mesma forma ser usados na identificação e/ou desenvolvimento de marcadores novos e adicionais com o QTL de interesse, que por sua vez pode ser em seguida usado na procriação assitida por marcador e/ou a procura de recombinantes que flanqueiam o QTL, e/ou mapeamento superior, e/ou clonagem do QTL.
Há vários métodos ou abordagens disponíveis, conhecidos por aqueles versados na técnica, que podem ser usados para identificar e/ou desenvolver marcadores em desequilíbrio de ligação e/ou ligados a e/ou localizados na região de QTL, bem como marcadores que representam as mutações causais atuais subjacentes ao QTL. Sem ser completamente exaustivos, alguns métodos conhecidos por aqueles versados na técnica, incluem:
- uso de sequências/marcadores descrito em métodos de hibridização para identificar outra sequência na região de interesse: sequências de iniciador como descrito aqui e/ou sequências de marcador/gene (ou parte das mesmas) que podem ser determinadas usando as sequências de iniciador descritas aqui podem ser usadas como sondas (hibridização) no isolamento de genes/sequências de ácido nucleico flanqueando-se os marcadores e/ou ligadas e/ou associadas e/ou específicas para a região de QTL de uma amostra de ácido nucleico genômico e/ou amostra de RNA ou cDNA ou agrupamento de amostras (por exemplo, avaliação de recursos genômicos como bibliotecas de BAC ou avaliação de biblioteca de gDNA ou cDNA).
- uso de sequências/marcadores descrito em métodos de PCR para identificar outra sequência na região de interesse: sequências de iniciador como descrito aqui e/ou sequências de marcador/(candidato)gene (ou
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104/127 partes das mesmas) que podem ser determinadas usando as sequências de iniciador como descrito podem ser usadas como iniciadores de amplificação de (PCR) para amplificar um flanquamento de gene/sequência de ácido nucleico e/ou ligadas a e/ou associadas com e/ou específicas para a região de QTL de uma amostra de ácido nucleico genômico e/ou amostra de RNA ou cDNA ou agrupamento de amostras ou não isoladas de um tecido de planta específico e/ou depois do tratamento específico da planta e de capsicum ou principalmente qualquer outro organismo com homologia suficiente.
- uso de sequências/marcadores descrito em métodos de PCR para identificar outra sequência na região de interesse: as sequências/genes de nucleotídeo de um ou mais marcadores que podem ser determinados depois que os iniciadores internos para as referidas sequências de marcador puderem ser projetados e usados para também determinar sequências/genes de flanqueamento adicionais dentro da região de QTL e/ou geneticamente ligados e/ou associados com a característica.
- uso de sequências/marcadores descrito em métodos de mapeamento e/ou mapeamento comparativo para identificar marcadores na(s) mesma(s) região(ões) (posicionamento de QTL em outros mapas): baseado na informação posicionai e/ou informação de marcador como descrito aqui, marcadores, de qualquer tipo, podem ser identificados por métodos de mapeamento genético, eventualmente (se anteriormente necessário) posicionando-se os marcadores descritos (por extrapolação ou mapeamento genético com base em marcadores comuns por mapas) em mapa(s) genético(s) (densidade alta), e/ou mapa(s) de consenso ou genético(s) integrado(s). Marcadores já conhecidos e/ou novos marcadores geneticamente ligados e/ou posicionados nas imediações dos marcadores descritos e/ou região de QTL podem ser identificados e/ou obtidos e eventualmente usados em aplicações de procriação de MAS e/ou clonagem de QTL e/ou mapeamento(superior) de QTL.
- uso de sequências/marcadores descrito em métodos de 'insiloco' para identificar sequências/marcadores/(candidato)genes adicionais em região(ões) de QTL: sequências de iniciador como descrito aqui
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105/127 e/ou sequências de marcador/(candidato)gene (ou partes dos mesmos) que podem ser determinados usando as sequências de iniciador como descrito aqui ou com base em marcadores ligados podem ser usados em métodos 'in-silico' para procurar base de dados de proteína ou sequência (por exemplo, BLAST) para flanquamento (adicional) e/ou sequências/genes homólogos e/ou diversidade alélica (ambas sequências de cDNA e/ou genômicas ou ainda proteínas e ambas originando-se de capsicum e/ou qualquer outro organismo) geneticamente ligados e/ou associados com as características como descrito aqui e/ou localizados na região de QTL.
- uso de sequências/marcadores descrito em métodos de mapeamento físico (posicionamento de QTL em mapa físico ou sequência de genoma): sequências de genoma como descrito aqui e/ou sequências de gene/marcador (ou parte das mesmas) que podem ser determinadas usando as sequências de iniciador como descrito aqui ou usando outros marcadores geneticamente ligados aos marcadores descritos aqui e/ou localizados na região de QTL podem estar posicionados em um mapa físico e/ou sequência de genoma (inteira) principalmente de qualquer organismo com homologia suficiente para identificar sequências/marcadores/genes (candidato) aplicáveis em aplicações de procriação de MAS e/ou clonagem de QTL e/ou QTL(mapeamento superior).
- uso de sequências/marcadores descrito para posicionar QTL em outros mapas (físicos) ou genomas (espécies cruzadas, para pimenta outro Solanaceae como tomate e batata são de primeiro interesse, claro, mas espécies modelo como Arabidopsis podem ser de usadas): sequências de iniciador como descrito aqui e/ou sequências de gene/marcador (ou parte das mesmas) que podem ser determinadas usando as sequências de iniciador como descrito aqui podem ser usadas em genoma comparativo ou métodos de mapeamento de syntheny para identificar a região homóloga e sequências homólogas e/ou ortólogas/genes(candidato) geneticamente ligados e/ou posicionados na região de QTL e aplicáveis em aplicações de procriação de MAS e/ou clonagem de QTL e/ou QTL(mapeamento superior).
- uso de sequências/marcadores descrito para selecionar os in-
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106/127 divíduos apropriados que permitem a identificação de marcadores na região de interesse por métodos genéticos: sequências de iniciador e/ou marcadores como descrito aqui podem ser usados para selecionar indivíduos com alelos de QLT de contraste/diferentes que, por exemplo, em métodos de associação genética e/ou análise de segregante em volume (BSA, Michelmore e outro, 1991) podem ser usados para identificar marcadores/genes na região específica (região de QTL) de interesse e/ou associados ou geneticamente ligados às características descritas.
- uso de informação descrita para procurar genes candidato (positionais): a informação descrita pode ser usada para identificar genes candidato funcionais e/ou posicionais que podem ser associados com as de características descritas e/ou geneticamente ligadas.
Em uma modalidade, a invenção refere-se, portanto, a uma planta de Capsicum annuum cultivada compreendendo um genoma que compreende pelo menos um QTL que contribui para a resistência à Bemisia, em que QTL fica situado no cromossoma 3, em que o referido pelo menos um QTL pode ser identificado por um marcador molecular que exibe correlação estatística à característica fenotípica, cujo marcador pode ser desenvolvido de um segmento de DNA contendo o referido QTL por métodos conhecidos na técnica, cujo segmento é obtenível de uma planta que tem a base genética da linhagem 061M4387, particularmente de uma planta que tem a arquitetura ou base genética no QTL de linhagem 061M4387, porém especialmente de uma planta de linhagem 061M4387, a semente representativa da qual é depositada em NCIMB sob N° de Acessão NCIMB 41428, ou de uma descendência ou um antepassado da mesma que compreende o referido QTL, e definido por pelo menos um local marcador, particularmente a pelo menos dois locais marcadores, mais particularmente a pelo menos três locais marcadores e ainda mais particularmente a pelo menos quatro locais marcadores, porém especialmente a pelo menos cinco e até seis locais marcadores, cujos locais marcadores estão no cromossoma 3 e cossegregam-se com a característica de resistência à Bemisia e podem ser identificados por um iniciador de oligonucleotídeo de PCR ou um par de iniciadores de oligonucleoPetição 870170065661, de 04/09/2017, pág. 114/142
107/127 tídeo de PCR selecionado do grupo de par de iniciador 1 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 1 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 2, identificando o local marcador 1; par de iniciador 2 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 3 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 4, identificando o local marcador 2; par de iniciador 3 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 5 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 6, identificando o local marcador 3; par de iniciador 4 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 7 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 8, identificando o local marcador 4; par de iniciador 5 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 9 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 10, identificando o local marcador 5; e par de iniciador 6 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 11 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 12, identificando o local marcador 6.
Em uma modalidade, a invenção refere-se portanto a uma planta de Capcsicum annuum cultivado compreendendo um genoma que compreende pelo menos dois QTL que contribuem para a resistência à Bemisia, cujo QTL fica situado no cromossoma 3 e 5, em que o referido pelo menos dois QTL podem ser identificados por um marcador molecular que exibe a correlação estatística à característica fenotípica, cujo marcador pode ser desenvolvido de um segmento de DNA contendo o referido QTL por métodos conhecidos na técnica cujo segmento é obtenível de uma planta que tem a base genética da linhagem 061M4387, particularmente de uma planta que tem a arquitetura ou base genética no QTL da linhagem 061M4387, porém especialmente de uma planta de linhagem 061M4387, a semente representativa da qual é depositada em NCIMB sob N° de Acessão NCIMB 41428, ou de uma descendência ou um antepassado da mesma que compreende os referidos QTL, em que um primeiro QTL fica situado no cromossoma 3 na planta de doador e geneticamente ligado a pelo menos um local marcador, particularmente a pelo menos dois locais marcadores, particularmente a pelo menos três locais marcadores e particularmente a pelo menos quatro locais marcadores, particularmente a pelo menos cinco locais marcadores, particularmente a pelo menos seis locais marcadores, cujos locais marcadores esPetição 870170065661, de 04/09/2017, pág. 115/142
108/127 tão no cromossoma 3 e cossegregam-se com a característica de resistência à Bemisia e podem ser identificados por um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR 1 a 6 como determinado em SEQ ID NOS: 1 a 12 e em que um segundo QTL fica situado no cromossoma 5 na planta de doador e geneticamente ligado a pelo menos um local marcador, particularmente a pelo menos dois locais marcadores, particularmente a pelo menos três locais marcadores e particularmente a pelo menos quatro locais marcadores, particularmente a pelo menos cinco locais marcadores, particularmente a pelo menos seis locais marcadores, e até sete locais marcadores, cujos locais marcadores estão no cromossoma 5 e cossegregam com a característica de resistência à Bemisia e podem ser identificados por um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR selecionado do grupo de pares de iniciador 7 a 13 como determinado em SEQ ID NOS: 13 a 26.
Em uma modalidade, a invenção refere-se a uma planta de Capsicum annuum cultivada compreendendo um genoma que compreende pelo menos um QTL que contribui para a resistência à tripes, em que QTL fica situado no cromossoma 5, em que o referido pelo menos um QTL pode ser identificado por um marcador molecular que exibe correlação estatística à característica fenotípica, cujo marcador pode ser desenvolvido de um segmento de DNA contendo o referido QTL por métodos conhecidos na técnica, cujo segmento é obtenível de uma planta que tem a base genética de linhagem 061M4387, particularmente de uma planta que tem a arquitetura ou base genética no QTL de linhagem 061M4387, porém especialmente de uma planta de linhagem 061M4387, a semente representativa da qual é depositada em NCIMB sob N° de Acessão NCIMB 41428, ou de uma descendência ou um antepassado da mesma que compreende os referidos QTL, e definidos por pelo menos um local marcador, particularmente a pelo menos dois locais marcadores, mais particularmente a pelo menos três locais marcadores e ainda mais particularmente a pelo menos quatro locais marcadores, porém especialmente a pelo menos cinco e até seis locais marcadores, cujos locais marcadores estão no cromossoma 3 e cossegregam-se com a característica de resistência à Bemisia e podem ser identificados por um iniciaPetição 870170065661, de 04/09/2017, pág. 116/142
109/127 dor de oligonucleotídeo de PCR ou um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR selecionado do grupo de par de iniciador 7 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 13 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 14, identificando o local marcador 7; par de iniciador 8 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 15 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 16, identificando o local marcador 8; par de iniciador 9 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 17 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 18, identificando o local marcador 9; par de iniciador 10 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 19 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 20, identificando o local marcador 10; par de iniciador 11 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 21 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 22, identificando o local marcador 11; par de iniciador 12 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 23 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 24, identificando o local marcador 12, e par de iniciador 13 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 25 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 26, identificando o local marcador 13.
Em uma modalidade, a invenção refere-se portanto a uma planta de Capsicum annuum cultivada compreendendo um genoma que compreende pelo menos dois QTL que contribuem para a resistência à Bemisia e tripes, cujos QTL ficam situados nos cromossomas 3 e 5 e em que o referido pelo menos dois QTL podem ser identificados por um marcador molecular que exibe correlação estatística à característica fenotípica, cujo marcador pode ser desenvolvido de um segmento de DNA contendo o referido QTL por métodos conhecidos na técnica, cujo segmento é obtenível de uma planta que tem a base genética de linhagem 061M4387, particularmente de uma planta que tem a arquitetura ou base genética no QTL de linhagem 061M4387, porém especialmente de uma planta de linhagem 061M4387, a semente representativa da qual é depositada em NCIMB sob N° de Acessão NCIMB 41428, ou de uma descendência ou um antepassado da mesma que compreende os referidos QTL, em que um primeiro QTL fica situado no cromossoma 3 na planta de doador e geneticamente ligado a pelo menos um local marcador, particularmente a pelo menos dois locais marcadores, partiPetição 870170065661, de 04/09/2017, pág. 117/142
110/127 cularmente a pelo menos três locais marcadores e particularmente a pelo menos quatro locais marcadores, particularmente a pelo menos cinco locais marcadores, particularmente a pelo menos seis locais marcadores, cujos locais marcadores estão no cromossoma 3 e cossegregam-se com a característica de resistência à Bemisia e podem ser identificados por um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR 1 a 6 como determinado em SEQ ID NOS: 1 a 12 e um segundo QTL fica situado no cromossoma 5 na planta de doador e geneticamente ligado a pelo menos um local marcador, particularmente a pelo menos dois locais marcadores, particularmente a pelo menos três locais marcadores e particularmente a pelo menos quatro locais marcadores, particularmente a pelo menos cinco locais marcadores, particularmente a pelo menos seis locais marcadores, e até sete locais marcadores, cujos locais marcadores estão no cromossoma 5 e cossegregam com a característica de resistência à Bemisia e/ou tripes e podem ser identificados por um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR selecionado do grupo de pares de iniciador 7 a 13 como determinado em SEQ ID NOS: 13 a 26.
Os marcadores de acordo com a presente invenção podem ser usados na seleção assistida por marcador e/ou qualquer outro método em que plantas que têm ou não tem o QTL são traçadas. Os marcadores podem ser trans, ou cis marcadores. Um trans-marcador indica um polimorfismo resultante da introgressão de DNA exógeno (doador) no genoma de uma planta de recipiente, cujo polimorfismo é ligado em cis com o genoma de recipiente, isto é, ligado com o alelo oposto. Desse modo, cis marcadores são ligados com o alelo de interesse (alelo de QTL favorável do doador), enquanto trans-marcadores são ligados com o alelo oposto (do recipiente).
Para determinar a utilidade da linhagem inata e seu potencial para contribuir geneticamente à descendência híbrida, um cruzamento teste é feito com outra linhagem inata, e o descendência resultante fenotipicamente avaliado. Características que podem ser registradas geralmente envolvem características que estão relacionadas à forma da fruta e características da fruta tal como a fruta apontada ou não-apontada, picante ou não-picante, vermelho, amarelo ou laranja. Características da planta como comprimento
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111/127 de internodos, força de crescimento e ramificações são da mesma forma consideradas juntamente com a resistências a vírus específicas tal como TMV (vírus em Mosáico do Tabaco) e TSWV (vírus do Bronzeamento do Tomateiro).
Para genotipação, DNA de mapeamento por associação ou mapeamento por QTL é extraído de material de planta adequado tal como, por exemplo, tecido de folha. Em particular, tamanhos de folhas de uma pluralidade de plantas são coletados. Amostras de DNA são genotipadas usando uma pluralidade de SSRs polimórficos, SNPs ou qualquer outro tipo de marcador adequado abrangendo o genoma de pimenta inteiro.
Análise de ligação de dados genotípicos e fenotípicos pode ser realizada usando software-padrão tal como, por exemplo, o software QTLCartographer e PlabQTL. Introduções de planta e germoplasma podem ser avaliadas para os alelos nos QTLs correspondentes descritos na Tabela 10 e Tabela 11, respectivamente, com baseado na(s) sequência(s) de nucleotídeo do(s) marcador (es) no local/locais de marcador ligado(s) ao referido QTL ou qualquer outro marcador conhecido estar localizado no cromossoma 3 e cromossoma 5, respectivamente, e o peso molecular do(s) alelo(s) usando uma ou mais técnicas descritas aqui ou conhecidas por aqueles versados na técnica.
A sequência de ácido nucleico dos marcadores descritos, marcadores ligados ou o QTL da presente invenção pode ser determinada por métodos conhecidos pela pessoa versada. Por exemplo, uma sequência de ácido nucleico compreendendo o referido QTL ou uma parte de conferência de resistência do mesmo pode ser isolado de uma planta de doador resistente à Bemisia/Tripes fragmentando-se o genoma da referida planta e selecionando estes fragmentos alojando um ou mais marcadores indicativos do referido QTL. Subsequentemente, ou alternativamente, as sequências de marcador (ou partes das mesmas) indicativas do referido QTL podem ser usadas como iniciadores de amplificação (PCR), para amplificar (a) sequência(s) de ácido nucleico compreendendo o referido QTL para formar uma amostra de ácido nucleico genômica ou um fragmento de genoma obtido da
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112/127 referida planta. A sequência de nucleotídeo de QTL, e/ou de qualquer marcador adicional compreendido neste, pode ser obtida por métodos de sequenciamento-padrão.
A presente invenção, portanto, da mesma forma refere-se a uma sequência de ácido nucleico isolada (preferivelmente DNA mas não-limitado a DNA) que compreende um QTL da presente invenção, ou uma parte de conferência de resistência à Bemisia/Tripes do mesmo. Desse modo, os marcadores descritos podem ser usados para a identificação e isolamento de um ou mais marcadores ou genes de pimenta ou outras colheitas de legume, particularmente colheitas de Solanaceous que são ligadas e codificam resistência à Bemisia/Tripes.
A sequência de nucleotídeo de marcadores ligados adicionais ou o QTL da presente invenção pode da mesma forma ser solucionada, por exemplo, determinando-se a sequência de nucleotídeo de um ou mais marcadores associados com o QTL e projetando-se iniciadores para as referidas sequências de marcador que podem em seguida ser usadas para também determinar a sequência fora da referida sequência de marcador. Por exemplo, a sequência de nucleotídeo dos marcadores de SSR descrita aqui ou qualquer outros marcadores preditos na região de QTL e/ou ligados ao QTL pode ser obtida por sequenciamento do produto de amplificação de PCR dos referidos marcadores, bem conhecidos na técnica. Ou alternativamente usando as sequências de marcador em uma PCR ou como sondas de hibridização para identificar as sequências de nucleotídeo ligadas, por exemplo, mas não-limitadas por avaliação de BAC.
EXEMPLOS
Os Exemplos seguintes fornecem modalidades ilustrativas. Levando em conta a presente descrição e o nível geral de experiência na técnica, aqueles de experiência na técnica apreciarão que os seguintes Exemplos são destinados ser apenas exemplares e que numerosas mudanças, modificações, e alterações podem ser empregadas sem afastarem do escopo da matéria objeto agora reivindicada.
Exemplo 1: História de Procriação linhagem de procriação de pimenta
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061M4387
Usando um bioensaio quantitativo como descrito abaixo no exemplo 2 em combinação com as condições de crescimento apropriadas, uma acessão de Capsicum annuum selvagem foi identificada como uma fonte de resistência às infestações de tripes e de Bemisia tabaci. Sementes desta acessão selvagem com n° de acessão: CGN16975 e nome de acessão: CA 1979 foram obtidas do Instituut voor de Veredeling van Tuinbouwgewassen (agora Centro para Recursos Genéticos), Wageningen, Países Baixos. Uma população que segrega para a resistência à Bemisia e tripes foi criada cruzando esta planta de pimenta de doador com uma planta de pimenta de recipiente suscetível. Uma população de segregação que consiste em um total de 333 linhagens de DH foi criada para a identificação de um ou mais QTLs contribuindo para a resistência à Bemisia e tripes.
A fonte inicial de acessão selvagem de resistência CGN16975 foi cruzada com um Holandês inato de Syngenta selecionado em Westland (Os Países Baixos). A descendência de F3 deste cruzamento foi identificada como resistente, particularmente de forma intermediária resistente, à mosca branca (observação visual) em Almeria (Espanha).
Um cruzamento (BC1) foi gerado em seguida entre o F3 mencionado no parágrafo anterior e uma linhagem de Syngenta desenvolvida na Almeria. A descendência deste cruzamento, foi identificada como resistente, particularmente de forma intermediária resistente, à mosca branca e tripes (em Agadir-Marrocos; tripes - observações visuais) e usada para o próximo cruzamento (BC2).
O BC2 foi gerado com uma linhagem diaploide de Syngenta desenvolvida na Almeria (Espanha). Das famílias de planta no F2 deste cruzamento vários (=333) diaploides foram desenvolvidos para caracterizar a hereditariedade da característica de resistência à mosca branca e tripes. Entre elas, linhagem 061M4387, depositada com NCIMB sob N° de Acessão NCIMB 41428 mostrou ser de forma intermediária resistente às infestações de Bemisia tabaci e tripes.
Exemplo 2: Ensaio de Resistência
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2A Resistência á Bemisia. Protocolo de Teste
2A.1 Cultivo da Planta
As plantas foram semeadas e cultivadas de acordo com procedimentos-padrão.
Em particular, as plantas foram semeadas em, por exemplo, uma bandeja múltipla 77 (multipotes de 4,2x4,2x5,9 cm) preenchida com solo friável, bem-drenado, com um pH entre 6,5 a 7,5 e crescidas durante aproximadamente um mês em um túnel. As plantas foram fertilizadas com N 4,0-6,0 P 0,35-1,0, K 4,0-6,0 de EC2.
As plantas foram transplantadas de acordo com o projeto especial (vide abaixo) e cultivadas de acordo com os procedimentos-padrão. Durante a cultura da planta, as plantas precisam frequentemente ser protegidas contra parasitas diferente de Bemisia. O tratamento químico foi realizado com praguicidas que só têm um impacto menor no desenvolvimento da população de Bemisia.
2A.2 Inoculação e cultura de inseto
Para garantir um desenvolvimento estável e uniforme da população de Bemisia e obter condições de teste mais rigorosas, uma inoculação precoce das plantas com Bemisia foi realizada. Para isto, uma estufa de plástico pequena separada foi usada em que uma colheita de pimenta foi cultivada sob condições-padrão. A população de Bemisia naturalmente presente foi usada para inocular o material de teste.
Dois métodos podem ser usados para inoculação:
1) Uso de abóbora como uma planta de armadilha - mudas de 2-3 semanas de idade de abóbora foram colocadas na estufa de plástico pequena com a cultura de Bemisia durante 4-6 horas. Porque os adultos de Bemisia têm uma preferência forte para abóbora, eles irão se mover rapidamente para as mudas de abóbora. As plantas de abóbora com os adultos de Bemisia foram em seguida envolvidos cuidadosamente com uma sacola plástica e transferidos para o túnel experimental e homogeneamente liberados sobre as plantas. A inoculação começa aproximadamente 10d depois do transplante e pode ser prosseguida
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115/127 durante 1-2 semanadas quando necessário.
2) As mudas de pimenta jovens cultivadas em bandejas foram colocadas 4-5 dias antes do transplante na estufa de plástico pequena com a cultura de Bemisia que permite o adulto de Bemisia botar ovos nas plantas jovens. Daqui por diante, as plantas podem ser transplantadas para o bitúnel maior.
2A.3 Projeto Experimental
Um bitúnel grande em Agadir foi usado com com 8 filas de aproximadamente 2 x 150 plantas cada. Em cada fila, um lado foi usado como fileira espalhadora e plantado com uma entrada suscetível (F1 existente, por exemplo, Bikingo F1 ou Vergasa F1, ou, linhagem parental suscetível). A outra parte da fileira foi plantada com as entradas de teste. As entradas de teste foram randomizadas completamente em cada de pelo menos 7 blocos com 1 ou mais plantas/entrada por bloco.
2A.4 Coleta de Dados
O desenvolvimento de Bemisia foi monitorado na fileira espalhadora semanalmente ou quinzenalmente avaliando 5 plantas de fileira espalhadora em posições equidistantes (planta 1, 38, 75, 112, 150) em cada fileira. As avaliações finais foram feitas quando a infestação média das plantas espalhadoras monitoradas foi de aproximadamente 4 (tabela 1) normalmente no momento quando as primeiras frutas estão amadurecendo (3-4 meses depois do transplante).
Para avaliar a severidade, uma escala de 1-9 foi usada (Tabela 1). O lado abaxial das folhas da planta foi inspecionado e a média de aproximadamente 5 piores folhas afetadas foi avaliada de acordo com a escala 1-9. Todas as plantas de teste foram classificadas desta maneira.
Tabela 1: Escala de Avaliações para resistência WF.
Escala Descrição WF ##pupas1
9 nenhuma pupa 0
8 muito poucas pupas 1-5
7 algumas pupas irregulares espalhadas sobre a folha 5-20
6 20-50
número moderado de pupas mais regulares distribuídas sobre 50-100
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Escala Descrição WF ##pupas1
as folhas
4 100-200
3 muitas pupas, densamente aglomeradas sobre a folha (mofo preto presente) 200-400
2 400-700
1 planta completamente revestida com pupas e pesadamente mofada frequentemente tolhida no crescimento 700-1000
1:estimativa de ##pupas por folha: casos pupais vazios e pupas maduras
2A.5 Análise de Dados
Os dados foram analisados calculando-se as médias por entrada de teste e comparação com uma entrada suscetível (por exemplo, fileira es5 palhadora suscetível ou diferente). Uma comparação múltipla das médias (por exemplo LSD) indica se as entradas de teste diferem-se mutuamente e de um controle suscetível.
2A.6 Resultados
2A.6.1 Teste de Resistência
Tabela 2 mostra alguns dos resultados da avaliação de Bemisia
Agadir (Marrocos) da linhagem depositada 061M438 7 (contendo QTL1 (referido aqui como o QTL no cromossoma 3) e QTL2 (referido aqui como o QTL no cromossoma 5), vide exemplo 3), dois de seus antepassados e o doador de resistência. A história de procriação é explicada no exemplo 1. A linhagem depositada 061M4387 mostrou ser significativamente melhor sob pressões de inseto variantes, estações e condições comparadas às variedades suscetíveis padrão ou linhagens.
Tabela 2: Resultados de testes com linhagem depositada 061M4387 e alguns de seus antepassados.
Entrada Linhagem resistente Controle1 Susc. Teste Observação
CGN16975 (o doador) BC1F3 muito resistente * muito resistente * muito susc. * fonte 2002 * marcado visualmente na tentativa de procriação
CGN16975 (doador) Média n 8,8 20 Média 6,6 LSD2 0.4 Dezembro de 2002 pressão de inseto relativamente baixo
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Entrada Linhagem resistente Controle1 Susc. Teste Observação
BC1F4 8,5 20
linhagem depositada Média n Meio LSD
061M4387 8,0 7 4,2 1.2 Agosto de 2005 pressão de inseto moderada-alta
061M4387 6,4 7 3,0 1.5 Novembro de 2005 pressão de inseto muito alta
061M4387 6,7 20 3,8 0.6 Junho de 2006 pressão de inseto alta
061M4387 8,0 10 5,2 1.4 Fevereiro de 2007 pressão de inseto moderada
1Nas tentativas anteriores Vergasa F1, Bikingo F1 ou linhagens parentais (todas suscetíveis) são usadas como controle suscetível e como fileira espaIhadora.
2lntervalos de LSD (P < 0,05) são baseados em comparação às médias de muitas entradas incluídas na tentativa (não-mostrado).
2A.6.2 Identificação de QTL Associada com Resistência
Tabela 3 mostra os resultados de uma avaliação de um conjunto de 333 linhagens de DH desenvolvidas fora de um BC2F2 com a finalidade de identificação de QTLs associados com resistência (vide exemplos 1 e 3). Dois testes foram realizados nas linhagens DH: teste 1 foi plantado na primavera de 2005 e classificado em agosto, o segundo teste foi plantado em setembro de 2005 e classificado em novembro. A infestação média em agosto foi mais baixa comparada com a de novembro (Tabela 3). Na tentativa de novembro, algumas manchas na estufa tiveram uma pressão de inseto muito alta, como consequência que nenhum fenótipo seguro pode ser obtido. Essas manchas foram, portanto, excluídas da análise.
Dois QTLs (vide exemplo 3). O QTL (QTL1) no cromossoma 3 teve o valor LOD maior (até 50), o QTL (QTL2) no cromossoma 5 teve um valor LOD menor (até 5).
Com base no flanqueamento de marcadores, 69 linhagens de DH foram identificadas não tendo QTLs, 57 linhagens de DH só tiveram QTL1, 38 linhagens de DH só tiveram QTL2, e, 63 linhagens de DH possuíram QTL1 e QTL2 juntamente.
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O efeito de QTL1 estava em ambas as tentativas significante e calculado na tentativa de agosto, 1,3 unidades de escala e na tentativa de novembro, 1,9 unidade de escala (Tabela 3). Devido à infestação mais baixa em agosto, muitas linhagens classificadas em 7-8 alcançaram um teto que minimiza possivelmente as diferenças entre as linhagens. Na tentativa de novembro, as diferenças entre as linhagens foram maiores devido ao nível de infestação mais alto.
O efeito de QTL2 foi mais pronunciado na tentativa de agosto (unidade de escala de 0,6) comparado à tentativa de novembro.
Tabela 3: Resultados de uma avaliação de um conjunto de 333 linhagens de DH desenvolvidas fora de um BC2F2 com a finalidade de identificação de QTLs associados com resistência
nenhum QTL QTL1 QTL2 QTL1&2
Agosto 5,9a* 7,2c 6,5b 7,6d
Novembro 4,1a 6,0b 4,3a 6,1b
Média 5,0 6,6 5,4 6,8
*: letras similares não mostram nenhuma diferença estatística (LSD, P <
0,05) dentro de período de observação
2A.6.3 Teste de Efeito de QTL1 em 5 Famílias de BC3
Para calcular o efeito de QTL1 em famílias antecedentes diferentes, cinco BC3's foram feitos com 5 origens de AC diferentes e uma linhagem resistente derivada contendo QTL1. 556 linhagens de DH derivadas destes BC3's foram genotipadas para QTL1 e testadas em Agadir (Fevereiro de 2007, tabela 4) sob as mesmas condições previamente descritas. O efeito de QTL1 foi calculado em unidades de escala 1,8 - 2,3 para as famílias diferentes (Tabela 4) confirmando o efeito significante de QTL1 (ANOVA Bidirecional, Quadrado Médio QTL1 = 521,3, F = 698,7, P < 0,001, nenhuma interação entre a família e presença de QTL1).
Tabela 4: Efeito de QTL1 sobre a infestação de Bemisia em 5 famílias de BC3 testadas em Agadir Fevereiro de 2007.
Família Presença de QTL1
Média dif.
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Família Presença de QTL1 Média n dif.
1 nenhum QTL QTL1 5,2 7,0 51 46 1,8
2 nenhum QTL QTL1 4.7 6.8 47 38 2,0
3 nenhum QTL QTL1 5.2 7.3 60 145 2,1
4 nenhum QTL QTL1 4,9 7,2 37 57 2,2
5 nenhum QTL QTL1 4,9 7,3 42 33 2,3
total 556
2A.6.4 Teste do efeito de QTLs 1 e 2 sobre dano à Bemisia em um conjunto de 60 linhagens de PH derivadas de um cruzamento com CGN16975 de doador e duas linhagens de pimenta de elite.
A fonte inicial da acessão selvagem de resistência CGN16975 foi cruzada com duas linhagens elite (A e B). Destes dois F1 no total, 60 linhagens diaploides (34 de linhagem A e 26 de linhagem B) foram derivadas.
destas linhagens foram testadas na maior parte duas vezes (entre Dezembro de 2003 e Dezembro de 2004) para resistência à Bemisia.
Tabela 5: Efeito calculado de QTL 1 e 2 sobre a resistência à Bemisia em uma população de DH pequena derivada de F1 entre acessão selvagem CGN 16975 e 2 linhagens de pimenta elite. Dada a média de 2 testes.
nenhum QTL n=11 QTL1 n=17 QTL2 n=17 QTL1&2 n=13
média 4.0a* 5.9.0b 5.1ab 5.9b
* Letras similares não indicam nenhuma diferença significante (ANOVA, seguido por comparação de médias com o método Fisher's Least Significance Difference LSD, P < 0,05). * * significativamente diferente de nenhum QTL em P=0,06.
O efeito de QTL1 foi calculado em unidades de escala de aproximadamente 1,9 e o efeito de QTL 2 foi estimado em unidades de escala
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1,1 nestas populações.
2B Resistência à tripes - Protocolo de Teste
2B.1 Cultivo de Planta
As plantas foram semeadas em terra de turfa padrão e transplantadas depois de 14d em potes de 7x7x8xcm. As plantas foram crescidas em uma estufa a 20°C/18°C e 16h/8h dia/noite. Aproximadamente 1 mês depois da semeadura, as plantas foram transferidas para uma gaiola de 1x1x1 m revestida com uma malha de fibra sintética (0,07x0,27mm) impedindo os tripes de deixar a gaiola. Em cada gaiola, foram libertados 400-500 tripes. Isto foi repetido 1 semana depois para garantir uma pressão de inseto alta. Três a quatro semanas depois da primeira inoculação, a observação foi feita.
2B.2 Inoculação e Cultura de Inseto
Uma cultura viável de tripes foi mantida e usada para experiências de resistência.
Da cultura, 400-500 tripes (incluindo igualmente adultos e jovens) foram coletados em um fraconete com um dispositivo de aspiração de inseto padrão. O fraconete com tripes foi liberado subsequentemente na gaiola de teste. Depois da inoculação, a temperatura foi elevada para 24 °C contínua (dia/noite).
2B.3 Projeto Experimental
Em cada gaiola, um ou mais controles resistentes (preferivelmente CGN16975) e um ou mais controles suscetíveis (por exemplo Roxy F1 e/ou Snooker F1) foram colocados. No total, 57 plantas podem ser colocadas em uma única gaiola. As plantas (incluindo as plantas de controle) foram randomizadas para cada gaiola. As linhagens de DH testadas para Bemisia (vide Exemplo 1 acima) foram testadas quanto à resistência à tripes desta maneira. Sete experiências sucessivas foram realizadas para testar todas as 333 linhagens de DH com (máx.) 12 plantas por linhagem.
2B.4 Coleta de Dados
As avaliações finais foram feitas quando a infestação média das plantas de controle suscetíveis foi 3-4 (Tabela 6). Normalmente isto é alcanPetição 870170065661, de 04/09/2017, pág. 128/142
121/127 çado 3-4 semanas depois da inoculação.
Para avaliar o dano do prateamento, uma escala de 1-9 foi usada (Tabela 6). O lado abaxial das folhas da planta foi inspecionado e a média de aproximadamente 2-3 piores folhas afetadas foi avaliada de acordo 5 com a escala de 1-9. Todas as plantas de teste foram classificadas desta maneira.
Tabela 6: Escala de avaliação para dano por prateamento causado por Frankliniella occidentalis.
Escala Descrição do dano dos Tripes % de prateamento1
9 nenhum dano por prateamento 0
8 manchas minúsculas <0.1
7 algumas manchas pequenas especialmente próximas da veia mediana ou extremidade da folha 0,1-1
6 1-2
5 número moderado de manchas mais regulares distribuídas sobre as folhas 3-5
4 6-10
3 manchas prateadas muito grandes presentes distribuídas sobre a folha inteira 11-20
2 21-40
1 prateamento muito pesado, parte grande >40
da folha danificada
1: estimação do % de prateamento de 2-3 folhas mais afetadas
2B.5 Análise de Dados
Os dados foram analisados calculando-se os meios por entrada de teste e comparação com uma entrada suscetível (por exemplo, Roxy F1 e/ou Snooker F1). Uma comparação múltipla das médias (por exemplo, LSD) indicou se as entradas de teste diferem-se mutuamente e de um controle 15 suscetível.
2B.6 Resultados
2B.6.1 Teste de Resistência
Tabela 7 mostra como um exemplo, os resultados de CGN16975, dois controles suscetíveis (Roxy F1 e Snooker F1) e a linhagem
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122/127 depositada 061M4387 possuindo QTL1 e QTL2. Médias de 3 testes independente cada qual com aproximadamente 12 plantas/entrada são determinadas. A linhagem depositada mostrou significativamente menos prateamento comparado a duas linhagens de controle suscetíveis Snooker F1 e Roxy F1, porém, mais prateamento comparado ao CGN16975 de doador. Isto indica que a linhagem depositada tem um nível elevado de resistência comparado às variedades padrão.
Tabela 7: Resultados fenotípicos da linhagem depositada 061M4387, CGN16975 e duas variedades suscetíveis (Roxy F1 e Snooker F1).
Entrada n Prateamento*
Snooker F1 36 3,5a
Roxy F1 36 3,8a
061M4387 31 5,8b
CGN16975 36 7,3c
* Letras similares não indicam nenhuma diferença significante (ANOVA, seguido por comparação das médias com o método de Fisher's Least Significance Difference LSD, P < 0,05).
2B.6.2 Identificação de QTL Associada com Resistência à Tripes
A análise de QTL (vide exemplo 3) nas 333 linhagens de DH (vide exemplo 1) revelou um QTL no cromossoma 5, com um valor de LOD até 12. Este QTL estava situado na mesma região como QTL2 identificado no mapeamento de QTL de Bemisia (vide exemplo 2A.6).
O QTL para Bemisia no cromossoma 5 e o QTL para tripes ficam situados na mesma região cromossômica. Pode ser um único QTL com um efeito de ambos contra Bemisia e tripes ou dois QTLs ligados.
2B.6.3 Teste de Efeito de QTL2 em Danos por Tripes em um Conjunto de 333 Linhagens de DH Desenvolvidas Fora de um BC2F2
O efeito do QTL de tripes foi calculado similarmente como foi feito para Bemisia (vide 2A.6) com base no conjunto de 333 DH grande. O QTL mostrou um efeito significante da unidade de escala de aproximadamente 0,8 (Tabela 8).
Tabela 8: Efeito calculado de QTL 2 sobre dano por tripes (prateamento) em
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123/127 população de BC2F2 grande de 333 linhagens de DH (possíveis recombinantes foram excluídos).
nenhum QTL n=122 QTL2 n=91
Prateamwnro 4,5 5,3*
* Diferença significante (teste t, t=-8,29, P < 0,001).
2B.6.4 Teste do Efeito de QTL2 sobre Dano por Tripes em um Conjunto de 60 Linhagens de DH Derivadas de um Cruzamento com CGN16975 de Doador e Duas Linhagens de Pimenta Elite.
linhagens de DH do mesmo conjunto de 60 linhagens de DH derivadas da acessão CGN 16975 cruzada com duas linhagens elite (A e B, vide seção 2A.6.4) foram submetidas duas vezes a um teste de tripes e conferidas quanto à presença de QTL2.
QTI2 mostrou um efeito significante de 1,0 unidades de escala (Tabela 9) que está em um nível comparável como no conjunto de 333 DH grande descrito em 2B.6.3 (Tabela 8).
Tabela 9: Efeito calculado de QTL 2 sobre o dano por tripes (prateamento) em uma população de DH pequena derivada de F1 entre a acessão selvagem CGN 16975 e 2 linhagens de pimenta de elite.
nenhum QTL n=26 QTL2 n=27
Prateamento 4,3 5,3*
* Diferença significante (teste t, t=-3,86, P < 0,001).
Exemplo 3: Mapeamento de QTL
3.1 Mapeamento de QTL para resistência à Bemisia
Usando o bioensaio quantitativo descrito acima no exemplo 2A em combinação com condições de crescimento apropriadas, uma fonte de resistência à Bemisia foi identificada. Uma população que segrega para a resistência à Bemisia foi criada cruzando esta planta de pimenta de doador com uma planta de pimenta de recipiente suscetível. Uma população de segregação que consiste em um total de 333 linhagens de DH foi criada para a identificação de QTL que contribui para a resistência à Bemisia. O DNA foi extraído de uma agrupamento de folhas de 8 plantas individuais de cada
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124/127 linhagem de DH e as plantas de origem da população seguindo os protocolos-padrão. As origens da população foram avaliadas usando várias centenas de SSR's para identificar SSR's que são polimórficos entre as origens. Subsequentemente, a população de DH foi genotipada usando os marcadores de SSR polimórficos identificados. Com base nos dados de segregação desse modo obtidos, um mapa de marcador molecular foi preparado usando o software geralmente usado Mapmaker e Joinmap. Os marcadores representam regiões de genoma polimórficas entre as origens da população.
O mapeamento de QTL, isto é, análise de ligação de dados genotípicos e fenotípicos foi realizado usando o software QTLCartographer. QTLs foram identificados, os quais ficam situados em cromossomos diferentes incluindo um QTL no cromossoma 3, que foi demonstrado estar associado à resistência à Bemisia. O QTL é caracterizado por meios de marcadores posicionados no mapa genético e alelos marcadores de marcadores conhecidos por estar localizados na região de QTL. Desse modo, a localização da resistência de a/múltipla que confere sequências de DNA é/são estabelecida^). Detalhes de QTL associados com resistência à Bemisia, isto é, marcadores de flanqueamento e marcadores localizados na região de QTL são representados na Tabela 10.
3.2 Mapeamento de QTL para Resistência à Tripes
O método idêntico como descrito no exemplo 3.1 acima foi seguido para mapear o QTL associado com resistência à tripes.
Um QTL, que foi demonstrado estar associado à resistência à tripes foi identificado no cromossoma 5. O QTL é caracterizado por meio de marcadores posicionados no mapa genético e alelos marcadores de marcadores conhecidos por estar localizados na região de QTL. Desse modo, a localização da resistência de a/múltipla que confere sequências de DNA é/são estabelecidas. Detalhes do QTL associado com resistência à tripes, isto é, marcadores de flanqueamento e marcadores localizados na região de QTL são representados na Tabela 11.
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Tabela 10: Detalhes do QTL associado com resistência à Bemisia, isto é, marcadores de flanqueamento e marcadores localizados na região de QTL
Número de ID de Sequência de Iniciador R SEQ.ID.NO: 2 SEQ.ID.NO: 4 SEQ.ID.NO: 6 SEQ.ID.NO: 8 SEQ.ID.NO: 10 SEQ.ID.NO: 12
0 0 0 O 0 0 1
O 2 ω 0 U Í 0 CTGTi GCGA ATAG’
> < U rn
Φ Oí b Ό 0 0 o H CCGA GGCT 0 0 TTCA(
(D < 0
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Tabela 11: Detalhes do QTL associado com resistência à tripes, isto é, marcadores de flanqueamento e marcadores localizados na região de QTL
Número de ID de Sequência de Iniciador R SEQ.ID.NO: 14 4 SEQ.ID.NO: 16 6 SEQ.ID.NO: 18 8 SEQ.ID.NO: 20 0 SEQ.ID.NO: 22 2 SEQ.ID.NO: 24 4 SEQ.ID.NO: 26
Iniciador Reverso CAACAAACGAACCACA- ATGG GACCCCTGAAGAAC- CTCTC C CTTCTTGGAGGCAI I I IIG G GCGAGCTATTACAC- CGAAG G CCCAGATCTACCAAG- GAGTC C CGGGTACCAGATG- TAGGG G TACCTACATAC- CCCCACCC
Número de ID de Sequência de Iniciador F SEQ.ID.NO:13 3 SEQ.ID.NO: 15 5 SEQ.ID.NO: 17 7 SEQ.ID.NO: 19 9 SEQ.ID.NO: 21 1 SEQ.ID.NO: 23 3 SEQ.ID.NO: 25
Iniciador Dianteiro CIH GGAGGTAGCGGTATG G CCCGI I IACAAGCAAAGAG G TCTCTTGTCAGA- CACGTCG G TGTAGGATTA- CAAGAACATTATCG G TAGGTGGGAATA- CACTGGG G TCGGCCTGACTAGTATTGAC C ATCGTGAGGTGAGTACGAG
Local de MarcaMarca- dor ligador do 7 LM 2001 1 8 LM 2002 2 9 LM 2003 3 10 LM 2004 4 11 LM 2005 5 12 LM 2006 6 13 LM 2007
Cromossoma # LO LO LO LO LO LO 5?
Resistência à Bemisia/tripes QTL# CM CM CM CM CM CM CM
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DEPÓSITO
As requerentes fizeram um depósito com uma data eficaz de 10 de agosto de 2006 de pelo menos 2.500 sementes da linhagem de Capsicum annuum 061M4387 com o NCIMB Ltd, Ferguson Building, Craibstone 5 Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, Escócia, sob n° de acessão: NCIMB 41428.
A invenção anterior foi descrita em detalhes por meio de ilustração e exemplo para propósitos de clareza e entendimento. Entretanto, ficará óbvio que certas mudanças e modificações tais como mutações e modifica10 ções de gene simples, variantes somaclonais, os indivíduos variantes selecionados de populações grandes das plantas de inato presente e similares podem ser praticadas dentro do escopo da invenção, visto que limitadas apenas pelo escopo das reivindicações anexadas. Desse modo, embora a invenção anterior tenha sido descrita em algum detalhe neste documento, 15 ficará óbvio que mudanças e modificação podem ser praticadas dentro do escopo da invenção, visto que limitadas apenas pelo escopo das reivindicações anexadas.
Todas as referências citadas aqui são incorporadas por referência no pedido em suas totalidades.

Claims (2)

1. Método de identificar em uma planta de Capsicum annuum um local de característica quantitativa (QTL) que contribui para resistência à Bemisia caracterizado pelo fato de que compreende usar em uma reação de PCR
a) um iniciador de oligonucleotídeo de PCR ou um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR selecionado do grupo de par de iniciador 1 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 1 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 2, identificando o local marcador 1; par de iniciador 2 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 3 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 4, identificando o local marcador 2; par de iniciador 3 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 5 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 6, identificando o local marcador 3; par de iniciador 4 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 7 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 8, identificando o local marcador 4; par de iniciador 5 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 9 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 10, identificando o local marcador 5; e par de iniciador 6 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 11 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 12, identificando o local marcador 6, no cromossomo 3, que está estatisticamente correlacionado à característica de resistência à Bemisia; e/ou
b) um iniciador de oligonucleotídeo de PCR ou um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR selecionado do grupo de par de iniciador 7 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 13 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 14, identificando o local marcador 7; par de iniciador 8 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 15 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 16, identificando o local marcador 8; par de iniciador 9 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 17 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 18, identificando o local marcador 9; par de iniciador 10 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 19 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 20, identificando o local marcador 10; par de iniciador 11 representado por um
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2/2 iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 21 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 22, identificando o local marcador 11; par de iniciador 12 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 23 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 24, identificando o local marcador 12, e par de iniciador 13 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 25 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 26, identificando o local marcador 13, no cromossomo 5, que está estatisticamente correlacionado à característica de resistência à Bemisia.
2. Método de identificar em uma planta de Capsicum annuum um local de característica quantitativa (QTL) que contribui para a resistência à tripes caracterizado pelo fato de que compreende usar em uma reação de PCR um iniciador de oligonucleotídeo de PCR ou um par de iniciadores de oligonucleotídeo de PCR selecionado do grupo de par de iniciador 7 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 13 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 14, identificando o local marcador 7; par de iniciador
8 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 15 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 16, identificando o local marcador 8; par de iniciador
9 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 17 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 18, identificando o local marcador 9; par de iniciador
10 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 19 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 20, identificando o local marcador 10; par de iniciador 11 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 21 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 22, identificando o local marcador 11; par de iniciador 12 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 23 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 24, identificando o local marcador 12, e par de iniciador 13 representado por um iniciador dianteiro de SEQ ID NO: 25 e um iniciador inverso de SEQ ID NO: 26, identificando o local marcador 13, no cromossomo 5, que está estatisticamente correlacionado à característica de resistência à tripes.
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