BRPI0806437A2 - métodos de detecção de auto-anticorpos para diagnóstico e caracterização de distúrbio - Google Patents

Abstract

MéTODOS DE DETECçãO DE AUTO-ANTICORPOS PARA DIAGNóSTICO E CARACTERIZAçãO DE DISTúRBIO. São providos métodos para detectar e/ou quantificar níveis de auto-anticorpos em indivíduos. São ainda providos métodos para diagnóstico e/ou caracterização de um distórbio associado com produção de auto-anticorpos. Em algumas configurações, o distúrbio diagnosticado e/ou caracterizado pode ser um câncer ou um distúrbio de infertilidade.

Description

"MÉTODOS DE DETECÇÃO DE AUTO-ANTICORPOS PARA DIAGNÓSTICO E CARACTERIZAÇÃO DE DISTÚRBIOS"

DESCRIÇÃO

PEDIDOS RELACIONADOS

O assunto revelado aqui reivindica o beneficio do Pedido de Patente Provisório Norte-Americano Número de Série 60/897.641, depositado em 26 de Janeiro de 2007; a revelação do qual é incorporada aqui por referência em sua totalidade.

INTERESSE GOVERNAMENTAL

Este assunto aqui revelado foi feito, em parte, com o suporte do Governo Norte-Americano de acordo com a concessão Número CA104651 concedida ao "National Câncer Institute". Dessa maneira, o Governo Norte-Americano tem certos direitos no assunto revelado aqui.

CAMPO TÉCNICO

0 assunto ora revelado se refere ao diagnóstico e caracterização de distúrbios em um indivíduo pela detecção de auto-anticorpos. Em especial, o assunto presentemente revelado se refere à utilização de antígenos, incluindo, em algumas configurações, antígenos isolados de exossomas produzidos pela célula, para detectar auto-anticorpos em indivíduos para o diagnóstico ou caracterização de câncer e/ou distúrbios da infertilidade e/ou outros distúrbios no indivíduo.

HISTÓRICO

Muitos distúrbios podem ser tratados e/ou prevenidos mais efetivamente se eles forem diagnosticados em um estágio inicial. Isto é especificamente verdadeiro em relação ao câncer. Por exemplo, câncer ovariano de Estágio I pode ser curado em 90% dos casos, enquanto a sobrevivência de cinco anos para pacientes com doença avançada (Estágios III e IV) é menor que 21%. Assim, prospectos para melhoramento significativo na sobrevivência ao câncer residem no diagnóstico precoce. Similarmente, outros distúrbios poderiam ser potencialmente diagnosticados precocemente e/ou o prognóstico para tratamentos poderia ser mais bem determinado se testes de diagnósticos iniciais mais sensíveis estiverem disponíveis. Como outro exemplo específico, distúrbios de infertilidade são notoriamente difíceis de diagnosticar e definir previamente a partir de dificuldades relatadas com o início ou manutenção até o fim de uma gravidez viável. Análises para diagnósticos mais sensíveis e específicas poderiam prover um diagnóstico melhor dos distúrbios de infertilidade e um prognóstico para tratamento de infertilidade.

Ensaios atuais de diagnóstico para muitos distúrbios, incluindo câncer, por exemplo, são baseados em antígeno e se apoiam na detecção de proteínas circulantes associadas com o distúrbio. Estes ensaios se baseiam na expressão, síntese, e liberação de proteínas específicas pelas células (por exemplo, células tumorais) tanto por secreção ativa ou dispersão como uma conseqüência da morte celular (tanto necrose quanto apoptose). Estas proteínas antigênicas devem "escapar" do local primário da doença, saturar a capacidade de processamento de antígeno dos componentes imunológicos do indivíduo, obter acesso na circulação, e atingir uma concentração de estado estável suficiente para ser detectada pelos imunoensaios baseados em enzima ou rádio rotulados. Estes eventos usualmente ocorrem muito após o estabelecimento inicial da doença (por exemplo, um evento de transformação neoplásica e desenvolvimento de focos de tumor).

Dessa maneira, ensaios atuais baseados em antigeno não podem verdadeiramente detectar estágios iniciais de um distúrbio de interesse. Para melhorar significativamente ensaios de diagnóstico de distúrbios de interesse, existe uma necessidade não atingida de uma nova abordagem para detecção de distúrbios que sejam mais sensíveis à presença de marcadores de doença no início do estabelecimento do distúrbio.

SUMÁRIO

Este sumário lista várias configurações do assunto presentemente revelado, e em muitos casos lista variações e permutações destas configurações. Este Sumário é meramente exemplificativo das numerosas e variadas configurações. A menção de uma ou mais características representativas de uma configuração dada é similarmente exemplificativa. Esta configuração pode tipicamente existir com ou sem a(s) característica(s) mencionada(s); similarmente, aquelas características podem ser aplicadas a outras configurações do assunto presentemente revelado, se listadas neste Sumário ou não. Para evitar excessiva repetição, este Sumário não lista ou sugere todas as combinações possíveis destas características.

Em algumas configurações do assunto presentemente revelado, é provido um método para detectar e/ou quantificar um nível de auto-anticorpos em um indivíduo. O método compreende, em algumas configurações, prover uma amostra biológica compreendendo ou suspeita de compreender auto-anticorpos de um indivíduo e contatar um antigeno com a amostra. 0 antigeno pode compreender um peptídeo imunorreativo de auto-anticorpo isolado de um exossoma. 0 método compreende ainda detectar e/ou quantificar um nível dos auto-anticorpos na amostra imunorreativa ao antigeno. Em algumas configurações, os auto-anticorpos estão associados com um câncer ou distúrbio de infertilidade.

O assunto presentemente revelado provê ainda em algumas configurações um método para diagnosticar um distúrbio associado com a produção de auto-anticorpo em um indivíduo. 0 método compreende em algumas configurações, prover uma amostra biológica compreendendo ou suspeita de compreender auto-anticorpos de um indivíduo e contatar um antigeno com a amostra. 0 antigeno pode compreender um peptídeo imunorreativo de auto-anticorpo isolado de um exossoma. 0 método compreende ainda detectar auto- anticorpos na amostra imunorreativa ao antigeno e comparar um nível de imunorreatividade de auto-anticorpo ao antigeno com um nível de referência para diagnosticar o distúrbio no indivíduo.

O assunto presentemente revelado provê ainda, em algumas configurações, um método para caracterizar um distúrbio associado com a produção de auto-anticorpo em um indivíduo. O método compreende, em algumas configurações, prover uma amostra biológica compreendendo auto-anticorpos de um indivíduo e contatar um antigeno com a amostra. 0 antigeno pode compreender um peptídeo imunorreativo de auto-anticorpo isolado de um exossoma. O método compreende ainda detectar os auto-anticorpos na amostra imunorreativa ao antigeno e quantificar um nível de imunorreatividade de auto-anticorpo ao antigeno para, portanto, caracterizar o distúrbio no indivíduo.

Em algumas configurações dos métodos para diagnóstico ou caracterização de distúrbios, o distúrbio é um câncer ou um distúrbio de infertilidade. Em algumas configurações dos métodos revelados aqui, o distúrbio é um câncer epitelial ou um adenocarcinoma. Adicionalmente, em algumas configurações, o antigeno compreende um peptideo de antigeno de câncer selecionado do grupo consistindo de p53, p63, p73, mdm-2, procatepsina-D, B23, C23, PLAP, cerB/HER2, NY-ESO-1, SCP1, SSX-1, SSX-2, SSX-4, HSP10, HSP27, HSP60, HSP90, GRP78, HoxA7, HoxB7, EpCAM, c-ras, mesotelina, survivina, uma mucina, cinase EGF, c-myc, nucleofosmina, e TAG 72. Em algumas configurações do método, o distúrbio é um distúrbio de infertilidade selecionado do grupo consistindo de insuficiência ovariana prematura (POF), sindrome do ovário policistico (PCOS), endometriose, pré-eclâmpsia, nascimento prematuro, restrição de crescimento intra-uterino, e perda recorrente de gravidez.

Em algumas configurações dos métodos, a amostra biológica compreende leite, sangue, soro, plasma, ascite, fluido cistico, fluido pleural, lágrimas, urina, saliva, tecido, ou combinações dos mesmos. Adicionalmente, em algumas configurações, o indivíduo é um mamífero.

Em algumas configurações dos métodos presentemente revelados, o exossoma é isolado de uma célula, que pode, em algumas configurações, ser uma célula cultivada. Em algumas configurações, a célula é uma célula de câncer, tal como, por exemplo, uma célula de câncer ovariano, uma célula de câncer cervical, uma célula de câncer da mama, uma célula de câncer endometrial, uma célula de câncer do cólon, uma célula de câncer da próstata, uma célula de câncer do pulmão, uma célula de melanoma, uma célula de câncer pancreático, ou uma célula de coriocarcinoma. Em algumas configurações especificas, a célula é uma célula UL-I, uma célula UL-2, uma célula UL-3, ou uma célula UL-6. Em algumas configurações especificas, a célula é uma célula placentária.

Em algumas configurações dos métodos presentemente revelados, a detecção compreende uma técnica selecionada do grupo consistindo de ELISA, RIA, imunoensaio múltiplo, imunoprecipitação e "Western blotting".

O assunto presentemente revelado provê ainda, em algumas configurações, um kit para detecção de auto-anticorpos em uma amostra. Em algumas configurações, o kit compreende um antigeno de peptideo imunorreativo de auto-anticorpo e um recipiente para conter o antigeno. 0 antigeno pode ser isolado de um exossoma em algumas configurações. Em algumas configurações, o antigeno é anexado a um suporte. Em algumas configurações, o suporte é uma lâmina de microtitulação, uma membrana (nitrocelulose, PVDF ou material similar), uma conta de poliestireno, um tubo de ensaio, ou uma haste de imersão. Em algumas configurações, o kit compreende a preparação de um anticorpo que se liga a um auto-anticorpo. Adicionalmente, em algumas configurações, a preparação de anticorpo compreende um rótulo detectável. Ainda adicionalmente, em algumas configurações, o rótulo detectável compreende um rádio-rótulo, uma enzima, uma biotina, um corante, um rótulo marcador fluorescente, um hapteno ou um rótulo luminescente.

Consequentemente é um objetivo do assunto presentemente revelado prover métodos de detecção de auto- anticorpos para diagnóstico e caracterização de distúrbios. Este objetivo é atingido total ou parcialmente pelo assunto presentemente revelado.

O objetivo do assunto presentemente revelado que foi apresentado aqui acima, e que é atingido total ou parcialmente pelo presente assunto revelado, outros objetivos e vantagens se tornarão evidentes aos técnicos no assunto após um estudo da descrição a seguir do assunto presentemente revelado, das Figuras, e dos Exemplos não limitativos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 é um gráfico mostrando a correlação de imunoglobulinas reativas a tumor em pacientes de câncer com o estágio de doença, comparado com controles normais que não apresentam tumores.

As Figuras 2A e 2B são fotografias mostrando a imunorreatividade de imunoglobulinas presentes no soro de pacientes de câncer ovariano representativo (2A = estágio II e 2B = estágio IV) com antigenos celulares derivados de epitélio ovariano normal (NO) e 3 linhagens de célula de tumor ovariano (ULl, UL3, e UL6). As caixas designam áreas de interesse.

As Figuras 3A-3D são uma série de fotografias mostrando análises eletroforéticas bidimensionais de diferenças de padrão de reconhecimento em pacientes respondendo à cisplatina. As Figuras 3A-3D apresentam uma porção das manchas 2D usando antigenos de UL-6 como alvos e soro de pacientes com adenocarcinoma cistico do ovário de Estágio IIIc. Os Pacientes A e B (Figuras 3A e 3B, respectivamente) responderam à cisplatina, enquanto os Pacientes C e D (Figuras 3C e 3D, respectivamente) falharam em responder. As Figuras 4A e 4B são gráficos mostrando perfis de arranjo de proteína de 2 pacientes de câncer ovariano. Proteínas celulares imunoprecipitadas de linhagens de célula de tumor ovariano UL-1 foram separadas por RP-HPLC e as proteínas foram ligadas a membranas MAGNAGRAPH. Proteínas imunorreativas foram identificadas por incubação dos poços com soro de pacientes de câncer ovariano, definidas como pixels determinados por densitometria.

A Figura 5 é uma ilustração de um padrão de imunorreatividade por auto-anticorpos reativos a tumor derivados de paciente.

A Figura 6 é um gráfico mostrando o percentual de soro de voluntárias femininas normais (controle), mulheres com doença ovariana benigna, e mulheres com câncer ovariano invasivo exibindo auto-anticorpos reativos com antígenos (listados na Tabela 1) em um arranjo de proteína.

A Figura 7 é uma série de fotografias mostrando microarranjos de proteína bruta demonstrando IgG reativa em mulheres com câncer ovariano de estágio inicial em relação a câncer ovariano de estágio avançado.

A Figura 8A é uma série de fotografias mostrando reatividade de anti-soro de paciente com câncer cervical com antígenos celulares. A Figura 8B é um gráfico mostrando reatividade de antígenos derivados de linhagens de célula de câncer cervical com soro de paciente.

A Figura 9 é uma série de fotografias e um gráfico mostrando o efeito de ácido retinóico na reatividade de antígenos solúveis liberados de células de câncer cervical. A Figura 10 é uma série de fotografias e um gráfico mostrando o efeito de ácido retinóico na reatividade de antigenos associados com as células liberados de células de câncer cervical.

A Figura 11 é uma série de gráficos mostrando a imunorreatividade de soro de diferentes pacientes com vários estágios de câncer, doença benigna, ou controles normais, contra diferentes antigenos de peptideo imunorreativo a auto-anticorpo.

A Figura 12 é uma série de gráficos mostrando a imunorreatividade de soro de indivíduos de controle e de pacientes com vários tipos diferentes de cânceres, contra diferentes antigenos de peptideo imunorreativo a auto-anticorpo.

A Figura 13 é uma série de fotografias mostrando diferenças em epítopos antigênicos em antigenos recombinantes contra antigenos naturais derivados de exossoma, contra soro de diferentes pacientes de câncer.

A Figura 14 é um gráfico mostrando resultados de ELISA de imunorreatividade de soro de paciente diagnosticado com endometriose de estágio I, II ou III em relação a controles normais, contra antigenos celulares derivados de compartimentos subcelulares do endométrio. Os antigenos foram isolados de frações da membrana, nucleares, e de citosol de células endometriais e acoplados a poços de lâminas de microtitulação.

A Figura 15 é uma série de fotografias mostrando "Western blotting" de antigenos celulares de endométrio e ovário reconhecidos por resposta humoral auto-reativa.

As Figuras 16A-16C são uma série de fotografias mostrando porções de reconhecimento imunológico representativo de antigenos de membrana endometrial separados por eletroforeses bidimensionais de soro de pacientes com endometriose de estágio II e III. As proteínas foram isoladas de Hec-IA, linhagem de célula de tumor endometrial. Proteínas de membrana solubilizadas (100 mg) foram carregadas a uma tira de foco isoelétrico de PH 3-10 e após operação, a tira foi aplicada à parte superior de um gel SDS-PAGE de acrilamida 10-20%. Após SDS-PAGE, as proteínas foram transferidas para nitrocelulose e analisadas por "imuno-blotting".

A Figura 17 é uma série de fotografias mostrando padrões de reatividade sorológica de soro obtido de mulheres diagnosticadas com distúrbios de infertilidade, em relação a antigenos celulares derivados do endométrio.

A Figura 18 é uma série de fotografias mostrando "Western blotting" demonstrando a presença de auto-anticorpos produzidos durante a gravidez por gestações de término normal e gestação de perda recorrente.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Os detalhes de uma ou mais configurações do assunto presentemente revelado são definidos na descrição abaixo.

Outras características, objetivos, e vantagens do assunto presentemente revelado ficarão aparentes a partir da descrição detalhada, exemplos e reivindicações. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes, e outras referências mencionadas aqui são incorporadas por referência em sua totalidade. Em caso de conflito, a presente especificação, incluindo as definições, prevalecerá.

De acordo com a convenção da lei de patentes já de longa data, os termos "um", "uma" e "o" significam "um ou mais" quando usados neste pedido, incluindo nas reivindicações.

A menos que mencionado de forma contrária, todos os números que expressam quantidades de ingredientes, condições de reação, e assim por diante, usados na especificação e nas reivindicações devem ser entendidos como sendo modificados em todos os casos pelo termo "aproximadamente". Consequentemente, a menos que indicado o contrário, os parâmetros numéricos definidos nesta especificação e reivindicações anexas são aproximações que podem variar dependendo das propriedades desejadas buscadas pelo assunto presentemente revelado.

Conforme usado aqui, o termo "aproximadamente", quando se referindo a um valor ou a uma quantidade de massa, peso, tempo, volume, concentração ou porcentagem, objetiva abranger variações, em algumas configurações, de ±20%, em algumas configurações de ±10%, em algumas configurações, de ±5%, em algumas configurações de ±1%, em algumas configurações de ±0,5%, e em algumas configurações de ±0,1% da quantidade especificada, visto que estas variações são apropriadas para aplicar o método revelado.

A menos que definido de forma diferente, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado conforme comumente entendido por técnicos no assunto à qual o assunto presentemente revelado pertence. Embora quaisquer métodos, dispositivos, e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na prática ou teste do assunto presentemente revelado, métodos, dispositivos, e materiais representativos são agora descritos.

Foi determinado que certos distúrbios são caracterizados pela produção de auto-anticorpos no indivíduo doente. Isto é, o sistema imunológico do indivíduo é estimulado a produzir anticorpos contra auto-antígenos (em oposição a antígenos estrangeiros, tais como antígenos únicos a um microorganismo invasor). Os antígenos aos quais os auto-anticorpos imunorreagem podem, em alguns casos, ter epítopos alterados devido a alterações na seqüência primária ou processamento pós-tradução (por exemplo, como pode ocorrer em câncer), mas também podem ser imunologicamente idênticos ao antígeno normal. Em ambos os casos, foi descoberto que a produção de auto-anticorpo pode estar correlacionada com a presença de um distúrbio e pode, ainda, prover informação para caracterização do distúrbio. 0 assunto presentemente revelado provê métodos novos para detectar e/ou quantificar níveis de auto-anticorpos em indivíduos, os quais podem estar correlacionados com a presença de um distúrbio no indivíduo e/ou com a caracterização do distúrbio. Por exemplo, em algumas configurações do assunto presentemente revelado, métodos são providos para diagnosticar e/ou caracterizar um câncer ou distúrbio de infertilidade em um indivíduo que está associado com a produção de auto-anticorpo.

I. Métodos Para Detectar e Quantificar Níveis de Auto-anticorpo

0 assunto presentemente revelado provê, em algumas configurações, métodos para detectar e/ou quantificar níveis de auto-anticorpos em um indivíduo. Estes métodos podem ser utilizados em algumas configurações para diagnosticar e/ou caracterizar distúrbios em indivíduos, cujos distúrbios estão associados com a produção de auto-anticorpo. Em algumas configurações os métodos compreendem prover uma amostra biológica compreendendo ou suspeita de compreender auto-anticorpos de um indivíduo e, então, contatar um antígeno com a amostra. 0 antígeno compreende um peptídeo imunorreativo a auto-anticorpo. 0 método, então, compreende detectar e/ou quantificar um nível de auto-anticorpos na amostra que são imunorreativas ao antígeno. Em algumas configurações, a amostra biológica pode compreender, por exemplo, leite, sangue, soro, plasma, ascites, fluido cístico, fluido pleural, saliva, lágrimas, urina, tecido, ou combinações dos mesmos.

Adicionalmente, em algumas configurações do assunto presentemente revelado, é provido um método para diagnosticar um distúrbio associado com a produção de auto- anticorpo em um indivíduo baseado na detecção de auto-anticorpos no indivíduo. Em algumas configurações, o método compreende prover uma amostra biológica compreendendo ou suspeita de compreender auto-anticorpos de um indivíduo; contatando um antígeno com a amostra, onde o antígeno compreende um peptídeo imunorreativo a auto-anticorpo; detectar os auto-anticorpos na amostra imunorreativa ao antígeno; e comparar um nível de imunorreatividade de auto-anticorpo ao antígeno com um nível de referência para diagnosticar o distúrbio no indivíduo.

Os termos "diagnosticar" e "diagnóstico" conforme usados aqui se referem a métodos através dos quais um técnico especialista pode estimar e ainda determinar se um indivíduo está sofrendo ou não de um distúrbio ou condição dada. 0 técnico especialista freqüentemente faz um diagnóstico com base em um ou mais indicadores de diagnóstico, tais como, por exemplo, um auto- anticorpo, a quantidade (incluindo a presença ou ausência) do qual seja indicativa da presença, gravidade, ou ausência da condição.

Juntamente com o diagnóstico, prognóstico clinico é também uma área de grande preocupação e interesse. É importante saber a gravidade do distúrbio (por exemplo, agressividade das células cancerígenas e probabilidade de recorrência do tumor) de modo a planejar a terapia mais eficiente. A medição de auto- anticorpos pode ser útil de modo a separar indivíduos com bons prognósticos que não necessitarão terapia adicional daqueles que muito provavelmente se beneficiariam de tratamentos mais intensivos.

Como tal, "fazer um diagnóstico" ou "diagnosticar", conforme usado aqui, também inclui fazer um prognóstico, que pode prover a previsão de um resultado clínico (com ou sem tratamento médico), selecionar um tratamento apropriado (ou se o tratamento seria efetivo), ou monitorar um tratamento atual e potencialmente mudar o tratamento, com base na medição de um auto-anticorpo de diagnóstico.

Adicionalmente, em algumas configurações do assunto presentemente revelado, determinação múltipla dos auto- anticorpos em relação ao tempo pode ser feita para facilitar o diagnóstico e/ou prognóstico. Uma alteração temporal nos níveis de auto-anticorpo pode ser usada para prever um resultado clínico, monitorar o progresso do distúrbio e/ou eficácia de terapias apropriadas direcionadas para o distúrbio. Nesta configuração, por exemplo, é possível esperar ver uma diminuição na quantidade de auto-anticorpos (e potencialmente um ou mais biomarcador(es) adicional (is), se monitorado) em uma amostra biológica com o decorrer do tempo durante o curso de terapia efetiva.

Correlacionar um nível, tal como um nível aumentado, de auto-anticorpos com um nível de referência ou "nível normal" para diagnosticar e/ou caracterizar um distúrbio se refere a uma comparação de níveis de auto-anticorpo (quantidades e/ou presença ou ausência) com níveis esperados (incluindo, mas não limitado a nenhum auto-anticorpo detectado) em um indivíduo isento do distúrbio. Uma alteração, tal como um aumento, em relação aos níveis normais se refere a um resultado que é alterado, por exemplo, aumentado, em mais que a margem de erro inerente da técnica de medição, quando comparando a amostra a uma amostra isenta de doença similar sob condições, de outro modo, comparáveis. Em algumas configurações, o nível aumentado de auto- anticorpos detectados no indivíduo de teste é aproximadamente de 10%, ou maior, em relação à presença "normal" em uma linha de base. Em algumas configurações um nível aumentado de auto- anticorpos detectados no indivíduo de teste de aproximadamente 20%, ou maior, em algumas configurações um nível aumentado de auto-anticorpos detectados no indivíduo de teste de aproximadamente 25%, ou maior, e em algumas configurações um nível aumentado de auto-anticorpos detectados no indivíduo de teste de aproximadamente 50%, ou maior, é uma presença aumentada de auto- anticorpos que pode ser correlacionada com a presença do distúrbio no indivíduo.

Adicionalmente, em algumas configurações do assunto presentemente revelado, é provido um método para caracterização de um distúrbio associado com produção de auto- anticorpo em um indivíduo. "Caracterização", conforme usado aqui, pode se referir à detecção da presença de um distúrbio ou determinação da gravidade de um distúrbio, tal como, por exemplo, a determinação do estágio de um câncer. Em algumas configurações, o método compreende prover uma amostra biológica compreendendo auto-anticorpos de um indivíduo; contatar um antígeno com a amostra, onde o antígeno compreende um peptídeo imunorreativo a auto-anticorpo; detectar os auto-anticorpos na amostra imunorreativa ao antígeno; e quantificar um nível de imunorreatividade de auto-anticorpo ao antígeno para, portanto, caracterizar o distúrbio no indivíduo.

Os termos "immunorreção" e "imunorreativo", conforme usados aqui e com relação à ligação a anticorpo, se referem à ligação específica pelas regiões variáveis de anticorpos a epítopos específicos de antígenos.

Os termos "peptídeo", "polipeptídeo" e "proteína", que são usados de forma intercambiável aqui, se referem a um polímero de 20 aminoácidos de proteínas, ou análogos de aminoácidos, independentemente de seu tamanho ou função. Embora "proteína" seja freqüentemente usada em referência a polipeptídeos relativamente grandes, e "peptídeo" seja freqüentemente usado em referência à polipeptídeos pequenos, o uso destes termos na técnica se sobrepõe e varia. 0 termo "polipeptídeo" conforme usado aqui se refere a peptídeos, polipeptídeos, e proteínas, a menos que mencionado o contrário. Os termos "proteína", "polipeptídeo" e "peptídeo" são usados de forma intercambiável aqui quando se referindo a um produto de gene. Dessa maneira, polipeptídeos exemplificativos incluem produtos de gene, proteínas de ocorrência natural, homólogos, ortólogos, parálogos, fragmentos e outros equivalentes, variantes, e análogos dos anteriores.

Em algumas configurações dos métodos revelados aqui, a detecção de auto-anticorpos na amostra pode incluir a ligação dos auto-anticorpos a um antigeno e, então, detecção tanto do evento de ligação quanto da presença do auto-anticorpo isolado da amostra biológica. Técnicas exemplificativas para detectar os auto-anticorpos incluem, mas não se limitam a ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), imunoensaio múltiplo, imunoprecipitação e "imuno-blotting" (incluindo, por exemplo, "Western blotting" e "dot-blotting").

Os vários métodos de imunodetecção úteis foram descritos na literatura cientifica, tal como Nakamura et al. (Em: "Handbook of Experimental Immunology" (4th Ed.), Weir et al. (eds), Vol. 1, Capitulo 27, Blackwell Scientific Publ. Oxford, 1987; incorporados aqui por referência). Imunoensaios, em seu sentido mais simples e direto, são ensaios de ligação. Imunoensaios exemplificativos incluem os vários tipos de ELISAs, RIAs, e imunoensaios múltiplos. Detecção imunoistoquímica usando seções de tecido também é especialmente útil. Entretanto, será prontamente observado que a detecção não está limitada a estas técnicas, e "Western blotting", "dot-blotting", análises FACS, reações de precipitina, e similares podem ser usadas em conexão com o assunto presentemente revelado.

De forma geral, com relação aos presentes métodos, métodos de imuno-ligação incluem a obtenção de uma amostra suspeita de conter um anticorpo e contatando a amostra com o antigeno (por exemplo, um peptideo imunorreativo de auto- anticorpo) de acordo com o presente assunto sob condições efetivas para permitir a formação de imunocomplexos.

Contatar a amostra biológica escolhida com o antigeno sob condições efetivas e por um período de tempo suficiente para permitir a formação de complexos imunes (complexos primários imunes) é geralmente uma questão de adicionar a composição à amostra e incubar a mistura durante um período de tempo suficientemente longo para que os anticorpos formem complexos imunológicos com os antígenos apresentados. Após este período, a mistura de antígeno-anticorpo pode ser lavada para remover quaisquer espécies de anticorpo ligado não especificamente, permitindo que apenas aqueles anticorpos especificamente ligados dentro dos complexos primários imunes sejam detectados.

De forma geral, a detecção da formação de imunocomplexo pode ser atingida através da aplicação de numerosas abordagens. Estes métodos são geralmente .baseados na detecção de um rótulo ou marcador, tal como quaisquer etiquetas ou rótulos radioativos, fluorescentes, biológicos ou enzimáticos de padrão usado na técnica. As Patentes Norte-Americanas referentes ao uso destes rótulos incluem 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149; 4.302.534; 4.366.241; 4.637.988; 4.786.594; 5.108.896; 5.229.302; 5.629.164 e 5.691.154, cada uma delas incorporada aqui por referência. Obviamente, é possível encontrar vantagens adicionais através do uso de um ligante de ligação secundária tal como um segundo anticorpo ou um arranjo de ligação de ligante biotina/avidina, como é conhecido na técnica.

Em algumas configurações, os complexos imunes primários podem ser detectados por um segundo ligante de ligação que tem afinidade de ligação para o antigeno ou para o anticorpo presente na amostra (tanto especificamente quanto não especificamente (por exemplo, reatividade à região Fc dos auto- anticorpos)). Nestes casos, o segundo ligante de ligação pode ser ligado a um rótulo detectável. O segundo ligante de ligação é, ele mesmo, freqüentemente um anticorpo, que pode, dessa maneira, ser denominado de anticorpo "secundário". Os complexos imunes primários são contatados com o ligante de ligação secundário rotulado, ou anticorpo, sob condições efetivas e durante um período de tempo suficiente para permitir a formação de complexos imunes secundários. Os complexos imunes secundários são, então, geralmente lavados para remover os anticorpos ou ligantes secundários rotulados não ligados, e o rótulo remanescente nos complexos imunes secundários é, então, detectado.

Outros métodos incluem a detecção de complexos imunes primários por uma abordagem de duas etapas. Um segundo ligante de ligação, tal como um anticorpo, que tem afinidade de ligação para o antigeno ou auto-anticorpo é usado para formar complexos imunes secundários, conforme descrito acima. 0 segundo ligante de ligação contém uma enzima capaz de processar um substrato para um produto detectável e, assim, amplificar o sinal em relação ao tempo. Após lavagem, os complexos imunes secundários são contatados com substrato, permitindo a detecção.

Imunodetecção competitiva pode também ser usada para detectar a presença de auto-anticorpos específicos para os antígenos de teste. Nesta técnica, um anticorpo rotulado é primeiramente incubado na solução com o antigeno. O sinal emitido pelo rótulo é medido. Isto é seguido pelo contato destes complexos de antígeno/anticorpo com uma amostra contendo ou suspeita de conter os anticorpos de interesse. Se a amostra tiver anticorpos específicos ao antigeno, eles se ligarão ao antigeno e competitivamente deslocarão o anticorpo rotulado. Isto pode ser detectado como uma queda na intensidade do sinal do rótulo.

Em algumas, mas não em todas as configurações do assunto presentemente revelado, os antígenos utilizados para capturar os auto-anticorpos da amostra biológica são isolados dos exossomas. O termo "isolado", conforme usado aqui quando aplicado a um polipeptídeo, denota que o polipeptídeo é essencialmente isento de outros componentes celulares ou exossomais com os quais ele é associado no estado natural.

Exossomas são vesiculas de origem endossomal que são secretadas no meio extracelular após fusão de corpos multivesiculares endossomais tardios com a membrana plasmática. Células de vários tipos de tecido demonstraram secretar exossomas, tais como células dendríticas, linfócitos B, células tumorais e mastócitos, por exemplo. Exossomas de diferentes origens exibem conjuntos discretos de proteínas e porções de lipídeo. Eles notavelmente contêm proteínas envolvidas na apresentação de antigeno e imunomodulação, sugerindo que os exossomas têm um papel na comunicação entre as células que conduz à modulação de respostas imunológicas. Na verdade, exossomas de células dendríticas (CD) pulsadas com peptídeos derivados de antígenos de tumor fazem surgir respostas antitumor em modelos de animal usando o tumor correspondente. Entretanto, exossomas derivados de células de câncer compreendendo antígenos de câncer demonstraram compreender polipeptídeos imunossupressores, tornando exossomas derivados de tumor não modificados indesejáveis e potencialmente inseguros para uso direto em vacinas.

Os exossomas do assunto presentemente revelado são bem adequados para a produção de antigenos que podem sofrer imunorreação com auto-anticorpos para capturar os auto-anticorpos de amostras biológicas de indivíduos devido ao fato de serem produzidos pelas células, ao invés de serem sintetizados artificialmente e, portanto, proverem antigenos que são "naturais". Isto é, os antigenos produzidos pelas células e encontrados no exossoma podem ser peptídeos de comprimento total que são processados (por exemplo, glicosilados) e dobrados pela célula até uma extensão similar aos antigenos experimentados pelas células imunológicas em um indivíduo. Como tal, os antigenos de exossoma podem ser utilizados em ensaios para detectar auto- anticorpos que podem estar presentes em indivíduos com distúrbios tais como, por exemplo, cânceres e distúrbios de infertilidade. Em algumas configurações, portanto, o um ou mais antigenos podem, cada um, compreender um antígeno de célula de câncer e/ou antígeno de distúrbio de infertilidade.

Exossomas utilizados para prover os antigenos usados nos métodos presentemente revelados podem ser isolados de células produtoras de exossoma. Em algumas configurações, a célula é uma célula cultivada, isto é, uma célula propagada ex vivo no meio de cultura. A célula cultivada pode ser, mas não necessariamente, imortalizada para facilitar a propagação contínua. Em algumas configurações, a célula é uma célula de câncer, tal como, por exemplo, uma célula de câncer originalmente isolada de um tumor e, então, propagada na cultura, como é geralmente conhecido na técnica. Em algumas configurações, a célula de câncer pode ser um câncer epitelial ou um adenocarcinoma. Por exemplo, em algumas configurações, a célula de câncer pode ser uma célula de câncer ovariano, uma célula de câncer cervical, uma célula de câncer da mama, uma célula de câncer endometrial, uma célula de câncer do cólon, uma célula de câncer da próstata, uma célula de câncer do pulmão, uma célula de melanoma, uma célula de câncer pancreático, ou uma célula de coriocarcinoma. Em algumas configurações, a célula é uma célula de cultura primária, tal como, por exemplo, uma célula placentária isolada de um indivíduo.

Em configurações específicas, a célula é uma linhagem de célula cultivada selecionada do grupo incluindo, mas não limitada a uma célula UL-1, uma célula UL-2, uma célula UL-3, e uma célula UL-6. Todas estas linhagens de célula de tumor ovariano humano primário foram estabelecidas nos laboratórios dos inventores, de mulheres com adenocarcinoma de cisto Estágio IIIc do ovário (designado UL-1, UL-2, UL-3, e UL-6) . UL-2 e UL-3 foram derivados de câncer ovariano hereditário, enquanto UL-1 e UL-6 foram derivados de cânceres espontâneos. Células UL-1 foram derivadas de uma mulher de 63 anos de idade, as células UL-2 foram derivadas de uma mulher de 34 anos, as células UL-3 foram derivadas de uma mulher de 42 anos, e as células UL-6 foram derivadas de um paciente do sexo feminino de 72 anos. Estas linhagens de célula são tumorigênicas em camundongos pelados, fazendo surgir tumores em camundongos pelados que são consistentes com adenocarcinomas de cisto. Estas linhagens de célula são todas positivas para EpCAM, PLAP, FasL, PD-L1 e MHC classe II. Em algumas configurações, os antígenos podem ser isolados para uso nos métodos revelados aqui pela colheita em um meio no qual as células são cultivadas e seletivamente removendo os exossomas do meio, tal como, por exemplo, por centrifugação. Os antigenos podem, então, ser isolados adicionalmente de antigenos, se desejado, por métodos de rotina de isolamento e purificação de proteína, como é geralmente conhecido na técnica.

Adicionalmente, com relação aos métodos de diagnóstico do assunto presentemente revelado, um indivíduo preferido é um indivíduo vertebrado. Um vertebrado preferido é de sangue quente; um vertebrado de sangue quente preferido é um mamífero. Um mamífero preferido é mais preferivelmente um ser humano. Conforme usado aqui, o termo "indivíduo" inclui tanto indivíduos humanos quanto animais. Dessa maneira, usos terapêuticos veterinários são providos de acordo com o assunto presentemente revelado.

Como tal, o assunto presentemente revelado provê o tratamento de mamíferos tais como humanos, assim como aqueles mamíferos de importância devido ao fato de estarem ameaçados, tais como tigres Siberianos; de importância econômica, tais como animais criados em fazendas para consumo por humanos; e/ou animais de importância social para os seres humanos, tais como animais de estimação ou mantidos em zoológicos. Exemplos destes animais incluem, mas não se limitam a: carnívoros tais como gatos e cães; suínos, incluindo porcos, capados, e porco do mato; ruminantes e/ou ungulados tais como gado, boi, ovelha, girafas, veado, cabras, bisão, e camelos; e cavalos. Também é provido o tratamento de pássaros, incluindo o tratamento daquelas espécies de pássaros que estão ameaçadas e/ou são mantidas em zoológicos, assim como aves comestíveis, e mais especificamente aves domesticadas, isto é, aves domésticas, tais como perus, frangos, patos, gansos, galinha d'angola, e similares, visto que são, também de importância econômica para os seres humanos. Dessa maneira, também é provido o tratamento de gado, incluindo, mas não limitado a, suínos domesticados, ruminantes, ungulados, cavalos (incluindo cavalos de corrida), aves comestíveis, e similares.

II. Métodos para Diagnosticar Cânceres

O assunto presentemente revelado provê ainda métodos para diagnosticar e caracterizar cânceres em indivíduos. Câncer é a segunda causa de morte nos Estados Unidos. Em 1999, foram estimadas 563.100 mortes por câncer e cada ano aproximadamente 1.222.000 novos casos de câncer são diagnosticados. Entre estes, cânceres de tumor sólido tais como pulmão, mama, próstata, e cânceres colorretais são os mais comuns. Diagnóstico e classificação de cânceres se baseiam na interpretação subjetiva tanto de informação clínica quanto histopatológica por observação, com o objetivo de classificar tumores em categorias geralmente aceitas com base no tecido de origem do tumor. Entretanto, a informação clínica pode ser incompleta ou errônea.

Ensaios de diagnósticos presentes para câncer são mais comumente baseados em antígeno. Estes ensaios se baseiam na expressão, síntese, e liberação de proteínas específicas por células de câncer tanto por secreção ativa quanto por dispersão ou como uma conseqüência da morte celular (tanto necrose quanto apoptose). Estas proteínas antigênicas devem "escapar" do local primário, saturar a capacidade de processamento de antigeno dos componentes imunológicos do indivíduo, obter acesso na circulação, e atingir uma concentração de estado estável suficiente para ser detectada por imunoensaios baseados em enzima ou rádio rotulados.

Estes eventos usualmente ocorrem muito após o início do evento de transformação neoplásica e desenvolvimento de focos de tumor.

Melhorias para detectar cânceres prematuramente têm estado voltadas principalmente à sensibilidade aumentada e capacidade elevada de resultado; entretanto, estes ensaios diagnósticos exibem várias limitações fundamentais. Antigenos circulantes não aparecem até muito após o estabelecimento do tumor, antígenos atuais não são específicos para câncer, e nenhum antigeno único é expresso em 100% de casos de câncer.

Recentemente, tem sido investigada a análise de padrões proteômicos de soro de pacientes como um método de detecção prematuro (Liotta et al., Gynecol Oncol 88:S25-S28, 2003). Infelizmente, essa abordagem baseada em espectrometria de massa (MS) possui várias desvantagens. Além do aparecimento retardado de antigeno circulante associado com sistemas de ensaio baseados em antigeno, análise proteômica de MS possui sensibilidade média com rendimentos diminuídos com proteínas de pesos moleculares mais elevados, ela não identifica estas proteínas marcadoras e necessita usar dispositivos analíticos sofisticados, ambas espectrometria de massa SELDI-TOF e ferramentas de bioinformática. Adicionalmente às diferenças de proteína associadas com câncer, padrões proteômicos de soro podem exibir variabilidade individual e os resultados desta "impressão digital de diagnóstico por MS" dependem da comparação com um "conjunto de treinamento" de soro e interpretação subseqüente dos padrões de resultado. Assim, existem assuntos de praticabilidade, reprodutibilidade, e padronização que necessitam ser resolvidos antes da análise proteômica de MS ser aplicada clinicamente.

A avaliação da competência imunológica de pacientes com câncer foi utilizada para determinar se o tumor já comprometeu a imunidade do hospedeiro, para identificar parâmetros imunes específicos que têm valor de prognóstico e prover uma linha de base para avaliação de imunoterapia (Hellstrom et al, EM: DeVita VT, Hellman S, e Rosenberg SA, eds. "Biologic therapy of câncer". Nova York; Lippincott, 1991: 35-52). Embora as funções celulares imunológicas estejam prejudicadas em muitos pacientes de câncer, incluindo, por exemplo, cânceres ovarianos, conforme definido pela falha em erradicar o tumor, estudos sugerem que o reconhecimento imunológico de antígenos de tumor permanece intacto. Auto-anticorpos reativos a tumor podem ser detectados prematuramente no desenvolvimento e progressão de tumores. Estudos indicaram a presença de imunoglobulinas reativas a tumor em pacientes de câncer, incluindo aqueles com melanoma (Merimsky et al, Tumor Biol 15:188-202, 1994), pulmão (Niklinska et al., Folia Histochem Cytobiol 39:51-56, 2001; Brichory et al. , Câncer Res 61:7908-7912, 2001), mama (Conroy et al. , Lancet 345:126, 1995; Barbouche et al. , Europ J. Clin Chem Clin Biochem 32:511-514, 1994), cabeça e pescoço (Vlock et al, Câncer Res 49:1361-1365, 1989) e cânceres ovarianos (Kutteh et al. , J Soc Gyneeol Invest 3:216-222, 1996; Taylor et al., Am J Reprod Immunol 6:179-184, 1984; Vogl et al. , Brit J Câncer 83:1338-1343, 2000). Os mecanismos subjacentes à indução de uma resposta humoral parecem ser multifacetados em pacientes de câncer, incluindo mutações de ponto resultantes em uma seqüência de aminoácido alterada (Jung e Schluesener, J Exp Med 173:273-276, 1991; Winter et al. , Câncer Res 52:4168-4174, 1992; Lubin et al, Câncer Res 53:5872-5876, 1993), expressão excessiva resultante de amplificação ou estabilidade aumentada de proteína (Peoples et al., Proc Natl Amer Sci USA 92:432-436, 1995; Labrecque et al. , Câncer Res 53:3468- 3471, 1993), modificações de pós-tradução alteradas (Kotera et al., "Humoral immunity against a tandem repeat epitope of human mucin muc-1 in sera from breast, pancreatic and colon câncer patients", Câncer Research. 54(11):2856-60, 1994; Andersson E. Henderikx P., Krambovitis E., Hoogenboom HR., Borrebaeck CA. "A tandem repeat of MUCl core protein induces a weak in vitro immune response in human B Cells". Câncer Immunology, Immunotherapy, 47 (5) :249-56, 1999; Chinni et al., Clin Câncer Res 3:1557-1564, 1997), ou erros no processamento. O aparecimento extracelular de proteínas intracelulares comumente resulta na geração de auto- anticorpos. Auto-anticorpos contra antígenos celulares anômalos, tais como c-myb, c-myc, p53, e p21ras foram encontrados em uma proporção significativa de pacientes de câncer, mesmo na ausência de antígenos circulantes detectáveis (Canevari et al., Annals Oncol 7:227-232, 1996; Yamamoto et al, Oncology 56:129-133, 1999; Abu-Shakra et al, Annals Rheum Dis 60:433-440, 2001). A detecção de anticorpos contra estas proteínas intracelulares no momento do diagnóstico parece estar associada com um prognóstico ruim. Em estudos anteriores analisando a indução de anticorpos autólogos a p53, respostas auto-imunes associadas com expressão excessiva de proteína tendem a ser direcionadas nos términos amino e carboxi. Em contraste, auto-anticorpos contra uma proteína relacionada, p73, parecem estar direcionados nos locais quentes interiores mutacionais. Em estudos animais experimentais usando tanto tumores espontâneos quimicamente induzidos ou transplantáveis, IgG reativo a tumor circulante pode ser demonstrado com bastante antecedência em relação a tumor palpável ou antígeno de tumor circulante.

Os presentes inventores e colegas desenvolveram previamente "tipos autólogos" para identificar a presença de IgG reativo a tumor e para definir padrões de reconhecimento antigênicos de pacientes de câncer como uma ferramenta de diagnóstico (Taylor e Doellgast, Analytical Biochemistry, 98:53- 59, 1979). Entretanto, até recentemente, a identificação molecular dos antígenos específicos que fazem surgir esta resposta humoral permanece indefinível.

Uma modificação recente de "tipificação autóloga" está sendo usada atualmente para analisar antígenos de tumor. A modificação, denominada SEREX, é a identificação de alvos de reconhecimento imunológico usando análise sorológica de bibliotecas de expressão de cDNA recombinante de tumores humanos (Old, J Exp Med 187:1163-1167, 1998). Esta técnica possui várias limitações, incluindo elevada reatividade cruzada com componentes bacterianos ou fagos, a co-expressão de cDNA derivado de tecido normal (incluindo células linfóides) presente dentro do tumor original e, visto que o cDNA é expresso em um sistema bacteriano, existe a ausência de modificações pós-tradução ligadas a câncer e processamento que ocorre dentro da célula tumoral, que pode resultar na perda de imunorreatividade destes alvos de proteína "engenheiradas". Técnicas de análise sorológica foram usadas para definir novos antigenos alvos para diagnóstico de câncer, mas existem deficiências que limitam sua utilidade. Alvos antigênicos atuais para detectar auto-anticorpos são proteínas do tipo selvagem recombinantes - por exemplo, a detecção de auto- anticorpos anti-p53 tem usado exclusivamente proteína p53 do tipo selvagem. 0 uso de proteínas do tipo selvagem elimina a detecção de auto-anticorpos contra locais quentes mutacionais. No caso de p53, a maioria dos estudos sugere ligação de auto-anticorpos aos términos amino ou carboxi. A falha de p53 do tipo selvagem recombinante para reagir com auto-anticorpos direcionados contra locais que sofreram mutação pode explicar a baixa freqüência de auto-anticorpos p53 em relação à freqüência de mutações de p53 em câncer ovariano.

O assunto presentemente revelado provê uma nova abordagem para diagnóstico de cânceres que está voltada para as limitações de técnicas anteriores discutidas acima. A nova aplicação de respostas humorais reativas a tumor de pacientes de câncer em arranjos de proteína revelados aqui, usando antigenos de proteína derivados de células tumorais "naturais" (por exemplo, derivados de exossomas de célula de câncer), provê uma abordagem inovadora e rápida para identificar o surgimento de alterações (por exemplo, mutações, truncações, e modificações pós-tradução) ligadas com o surgimento e progressão de câncer em indivíduos. Pacientes com doenças malignas desenvolvem fenômenos tipo auto- imunes como um resultado da geração de auto-anticorpos contra vários auto-antígenos, incluindo oncoproteínas, genes supressores de tumor, antigenos associados com proliferação, e antigenos de câncer/testiculo. Aberração em proteínas específicas que são partilhadas por pacientes com o mesmo tipo de tumor representa caminhos neoplásicos essenciais e estas alterações partilhadas podem ser utilizadas para o diagnóstico e caracterização de cânceres, incluindo a determinação de tipo e estágio do tumor.

Como tal, o assunto presentemente revelado provê, em algumas configurações, um método de diagnóstico de um câncer em um indivíduo. Em algumas configurações, o método compreende prover uma amostra biológica compreendendo ou suspeita de compreender auto-anticorpos de um indivíduo; contatar um antígeno com a amostra, onde o antígeno compreende um peptídeo imunorreativo de auto-anticorpo; detectar os auto-anticorpos na amostra imunorreativa ao antígeno; e comparar um nível de imunorreatividade de auto-anticorpo ao antígeno com um nível de referência para o diagnóstico de câncer no indivíduo.

Adicionalmente, em algumas configurações do assunto presentemente revelado, é provido um método para caracterizar um câncer associado com produção de auto-anticorpo em um indivíduo. Por exemplo, o câncer pode ser adicionalmente caracterizado pela detecção e/ou quantificação de auto-anticorpos em uma amostra de um indivíduo, tal como pela determinação de um estágio do câncer, com base em uma medição qualitativa do nível de auto-anticorpos específicos presentes na amostra. Em algumas configurações, o método compreende prover uma amostra biológica compreendendo auto-anticorpos de um indivíduo; contatar um antígeno com a amostra, onde o antígeno compreende um peptídeo imunorreativo de auto-anticorpo; detectar os auto-anticorpos na amostra imunorreativa ao antígeno; e quantificar um nível de imunorreatividade de auto-anticorpo ao antígeno para, portanto, caracterizar o câncer no indivíduo. Os Exemplos provêem detalhes adicionais de configurações adicionais para caracterização do estágio do câncer presente em um indivíduo.

Em algumas configurações dos métodos para diagnóstico e/ou caracterização de câncer em um indivíduo, o peptídeo imunorreativo a auto-anticorpo pode ser isolado de um exossoma.

O termo "câncer" se refere a todos os tipos de câncer ou neoplasmas ou tumores malignos encontrados em animais, incluindo leucemias, carcinomas e sarcomas. Exemplos de cânceres são câncer do cérebro, bexiga, mama, cérvix, cólon, cabeça e pescoço, rins, pulmão, pulmão das células não pequenas, melanoma, mesotelioma, ovário, próstata, sarcoma, estômago, útero e meduloblastoma.

Por "leucemia" entendem-se doenças amplamente progressivas, malignas dos órgãos formadores de sangue e é geralmente caracterizada por uma proliferação e desenvolvimento distorcidos de leucócitos e seus precursores no sangue e medula óssea. Doenças da leucemia incluem, por exemplo, leucemia não linfocítica aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia granulocítica aguda, leucemia granulocítica crônica, leucemia promielocítica aguda, leucemia de célula T adulta, leucemia aleucêmica, leucemia leucocitêmica, leucemia basofílica, leucemia de blastoma, leucemia bovina, leucemia mielocítica crônica, leucemia cutânea, leucemia embrionária, leucemia eosinofílica, leucemia de Gross, leucemia de células pilosas, leucemia hemoblástica, leucemia hemocitoblástica, leucemia histiocítica, leucemia da célula-tronco, leucemia monocitica aguda, leucemia leucopênica, leucemia linfática, leucemia linfoblástica, leucemia linfocitica, leucemia linfógena, leucemia linfóide, leucemia de células linfossarcomatosas, leucemia de mastócitos, leucemia megacariocitica, leucemia micromieloblástica, leucemia monocitica, leucemia mieloblástica, leucemia mielocitica, leucemia granulocitica mielóide, leucemia mielomonocitica, leucemia de Naegeli, leucemia de células plasmáticas, leucemia plasmacitica, leucemia promielocítica, leucemia da célula Rieder, leucemia de Schilling, leucemia de célula-tronco, leucemia subleucêmica, e leucemia de célula indiferenciada.

O termo "carcinoma" se refere a um novo crescimento maligno constituído de células epiteliais que tendem a infiltrar nos tecidos próximos e fazer surgir metástases. Carcinomas exemplificativos incluem, por exemplo, carcinoma acinar, carcinoma acinoso, carcinoma adenocistico, carcinoma adenóide cístico, carcinoma adenomatoso, carcinoma de córtex adrenal, carcinoma alveolar, carcinoma de célula alveolar, carcinoma de célula basal, carcinoma basocelular, carcinoma basalóide, carcinoma de célula basoescamosa, carcinoma bronquioloalveolar, carcinoma bronquiolar, carcinoma broncogênico, carcinoma cerebriforme, carcinoma colangiocelular, carcinoma coriônico, carcinoma colóide, carcinoma comedo, carcinoma corpus, carcinoma cribriforme, carcinoma em couraça, carcinoma cutâneo, carcinoma cilíndrico, carcinoma de célula cilíndrica, carcinoma ductal, carcinoma duro, carcinoma embrionário, carcinoma encefalóide, carcinoma "epiennoid", carcinoma epitelial adenóides, carcinoma exofítico, carcinoma ex úlcera, carcinoma fibroso, carcinoma gelatinoforme, carcinoma gelatinoso, carcinoma de célula gigante, carcinoma gigantocelular, carcinoma glandular, carcinoma de célula granulosa, carcinoma de matriz do pelo, carcinoma hematóide, carcinoma hepatocelular, carcinoma da célula de Hurthle, carcinoma hialino, carcinoma hipemefróide, carcinoma embrionário infantil, carcinoma in situ, carcinoma intra- epidérmico, carcinoma intra-epitelial, carcinoma de Krompecher, carcinoma da célula de Kulchitzky, carcinoma de células grandes, carcinoma lenticular, carcinoma lipomatoso, carcinoma linfoepitelial, carcinoma medular, carcinoma medular, carcinoma melanótico, carcinoma mole, carcinoma mucinoso, carcinoma muciparo, carcinoma mucocelular, carcinoma mucoepidermóide, carcinoma mucoso, carcinoma mixomatoso, carcinoma nasofaringeo, carcinoma em células de grãos de aveia, carcinoma ossificante, carcinoma osteóide, carcinoma papilar, carcinoma periportal, carcinoma pré-invasivo, carcinoma de célula espinhosa, carcinoma pultáceo, carcinoma celular renal dos rins, carcinoma de célula reserva, carcinoma sarcomatoso, carcinoma schneideriano, carcinoma cirroso, carcinoma escrotal, carcinoma de célula em anel de sinete, carcinoma simples, carcinoma microcelular, carcinoma solanóide, carcinoma de célula fusiforme, carcinoma de célula esferoidal, carcinoma esponjoso, carcinoma escamoso, carcinoma de célula escamosa, carcinoma de "string", carcinoma telangiectásico, carcinoma de telangiectasia, carcinoma de célula de transição, carcinoma tuberoso, carcinoma tuberoso, carcinoma verrucoso, e carcinoma viloso.

O termo "sarcoma" geralmente se refere a um tumor que é constituído de uma substância como o tecido conectivo embriônico e é, de forma geral, composto de células proximamente empacotadas embutidas em uma substância fibrilar ou homogênea. Sarcomas incluem, por exemplo, condrossarcoma, fibrossarcoma, linfossarcoma, melanossarcoma, mixossarcoma, osteossarcoma, sarcoma de Abemethy, sarcoma adiposo, lipossarcoma, sarcoma alveolar de partes moles, sarcoma ameloblástico, sarcoma botrióide, sarcoma cloroma, cório carcinoma, sarcoma embrionário, sarcoma do tumor de Wiln, sarcoma endometrial, sarcoma do estroma endometrial, sarcoma de Ewing, sarcoma fascial, sarcoma fibroblástico, sarcoma de célula gigante, sarcoma granulocitico, sarcoma de Hodgkin, sarcoma idiopático múltiplo pigmentado hemorrágico, sarcoma imunoblástico de células B, linfoma, sarcoma imunoblástico de células T, sarcoma de Jensen, sarcoma de Kaposi, sarcoma das células de Kupffer, angiossarcoma, leucossarcoma, sarcoma mesenquimoma maligno, sarcoma parosteal, sarcoma reticulocitico, sarcoma de Rous, sarcoma sorocistico, sarcoma sinovial, e sarcoma telangiectásico.

0 termo "melanoma" é usado para significar um tumor originário do sistema melanocitico da pele e outros órgãos. Melanomas incluem, por exemplo, melanoma lentiginoso das extremidades, melanoma amelanótico, melanoma benigno juvenil, melanoma de Cloudman, melanoma S91, melanoma de Harding-Passey, melanoma juvenil, melanoma lentiginoso maligno, melanoma maligno, melanoma nodular, melanoma subungueal, e melanoma superficial disseminante.

Cânceres adicionais incluem, por exemplo, Doença de Hodgkin, Linfoma não-Hodgkin, mieloma múltiplo, neuroblastoma, câncer da mama, câncer ovariano, câncer do pulmão, rabdomiossarcoma, trombocitose primária, macroglobulinemia primária, tumores de pequenas células do pulmão, tumores cerebrais primários, câncer do estômago, câncer do cólon, insulanoma pancreático maligno, carcinóide maligno, lesões pré-malignas da pele, câncer testicular, linfomas, câncer da tiróide, neuroblastoma, câncer esofágico, câncer do trato geniturinário, hipercalcemia maligna, câncer cervical, câncer endometrial, e câncer adrenal cortical.

Em algumas configurações, o câncer é um câncer epitelial ou um adenocarcinoma. Por exemplo, em algumas configurações, o distúrbio pode ser câncer ovariano ou câncer cervical que se originaram de tecidos epiteliais. Como um outro exemplo, em algumas configurações, o distúrbio pode ser um adenocarcinoma selecionado do grupo incluindo, mas não limitado a câncer ovariano, câncer cervical, câncer da mama, câncer endometrial, câncer do cólon, câncer da próstata, câncer do pulmão, melanoma, e câncer pancreático.

Em algumas, configurações, um ou mais antigenos pode ser selecionado para uso na detecção de auto-anticorpos que foram correlacionados com câncer (e em algumas configurações, um estágio especifico de câncer). Exemplos não limitativos de antigenos aos quais auto-anticorpos associados com cânceres são imunorreativos e que podem ser usados com os presentes métodos são listados na tabela abaixo.

Como um exemplo, peptideos de antigeno de câncer tais como membros da família das proteínas inibidoras de apoptose (IAP) (por exemplo, survivina) podem ser utilizados. Survivina é expressa na maioria dos adenocarcinomas pancreáticos (Sarela et al., "Expression of survivin, a novel inhibitor of apoptosis and cell cycle regulatory protein, in pancreatic adenocarcinoma". Br J Câncer, 18 de março de 2002; 86 (6) :886-92) .

Antigenos adicionais úteis com os presentes métodos incluem mucinas (por exemplo, CA125 (MUC-16), TAG-72, e MUC-I). Produção de mucina aumentada ocorre em muitos adenocarcinomas, incluindo câncer do pâncreas, pulmão, mama, ovário, cólon, e outros. 0 antigeno associado com o tumor MUC-I é expresso excessivamente e subglicosilado em adenocarcinomas humanos de diversas origens, tais como mama, ovário, e cólon (Henderikx et al. "Human single-chain Fv antibodies to MUC-I core peptide selected from phage display libraries recognize unique epitopes and predominantly bind adenocarcinoma". Câncer Res., 1 de outubro de 1998; 58 (19) :4324-32) . Adicionalmente, a glicoproteina associada com o tumor TAG-72 é expressa na maioria dos adenocarcinomas humanos, mas é raramente expressa na maioria dos tecidos normais (Yoon et al. "Construction, affinity maturation, and biological characterization of an anti-tumor-associated glycoprotein-72 humanized antibody". J Biol Chem. 17 de março de 2006; 281(11):6985-92).

Outros antigenos úteis com os presentes métodos incluem antigenos "cancer-testis" (por exemplo, NY-ESO-1, SSX-1, SSX-2, SSX-4, e SCP-1). Como um exemplo, foi demonstrado que expressão de antigeno "cancer-testis" em neoplasmas serosos ovarianos pode se correlacionar diretamente com seu grau de malignidade, por exemplo.

Antigenos adicionais úteis com os presentes métodos incluem proteínas de choque por calor (por exemplo, HSP27, HSP60, HSP90, e GRP78). Por exemplo, foi demonstrado que a expressão de HSPs é mais elevada em adenocarcinomas do pulmão. Adicionalmente, ambos HSP70 e HSP90 podem ter relação com a gênese e prognóstico de carcinoma endometrial. Vide também, por exemplo, Croute et al. "Expression of stress-related genes in a cadmium- resistant A549 human cell line." Journal of Toxicology & Environmental Health Part A. 68 (9) :703-18, 2005; Liang et al. "Mislocalization of membrane proteins associated with multidrug resistance in cisplatin-resistant câncer cell lines". Câncer Research. 63(18): 5909-16, 2003; Lee. "GRP78 induction in câncer: therapeutic and prognostic implications". Câncer Research. 67 (8) : 3496-9, 2007; e Lee et al. "GRP78 as a novel predictor of responsiveness to chemotherapy in breast câncer". Câncer Research. 66 (16) :7849-53, 2006.

Um outro exemplo de antígenos útil com os presentes métodos inclui mesotelina, que é um antígeno de diferenciação presente em células mesoteliais normais e expresso excessivamente em vários tumores humanos, incluindo mesotelioma e adenocarcinoma ovariano e pancreático (Hassan et al. "Mesothelin: a new target for immunotherapy." Clin Câncer Res. 15 de junho de 2004; 10(12 Pt l):3937-42; Baruch et al. "Immunocytochemical study of the expression of mesothelin in fine-needle aspiration biopsy specimens of pancreatic adenocarcinoma". Diagnostic Cytopathology. 35(3):143-7, 2007; Pu et al. "Utility of WT-1, p63, M0C31, mesothelin, and cytokeratin (K903 and CK5/6) immunostains in differentiating adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, and malignant mesothelioma in effusions". Diagnostic Cytopathology. 36(1):20-5, 2008; Argani et al. "Mesothelin is over expressed in the vast majority of ductal adenocarcinomas of the pancreas: identification of a new pancreatic câncer marker by serial analysis of gene expression (SAGE)". Clinicai Câncer Research. 7(12):3862-8, 2001; e Dennis et al. "Markers of adenocarcinoma characteristic of the site of origin: development of a diagnostic algorithm." Clinicai Câncer Research. 11 (10) :3766-72, 2005).

<table>table see original document page 39</column></row><table> <table>table see original document page 40</column></row><table>

III. Métodos para Diagnosticar Distúrbios de

Infertilidade

O assunto presentemente revelado provê ainda métodos para diagnosticar e caracterizar distúrbios de infertilidade em indivíduos. Distúrbios de infertilidade são uma condição médica comum, afetando aproximadamente 7,3 milhões de americanos todos os anos. É estimado que aproximadamente 10% a 15% dos casais que tentam conceber são incapazes de fazê-lo após um ano. Distúrbios de infertilidade incluem infertilidade feminina, que é um termo que os profissionais da área da saúde usam para mulheres que são incapazes de engravidar após pelo menos um ano de tentativas ou para aquelas que são capazes de engravidar, mas não conseguem levar a gestação até o fim. A maioria dos casos de infertilidade feminina resulta de problemas com a ovulação. Alguns dos distúrbios de infertilidade que afetam a fecundidade e fertilidade incluem insuficiência ovariana prematura (POF), na qual os ovários param de funcionar antes da menopausa natural, síndrome do ovário policístico (PCOS), onde os ovários podem não liberar um óvulo regularmente ou podem não liberar um óvulo viável, saudável, e patologias reprodutivas resultantes de endometriose. Outros distúrbios de infertilidade incluem endometriose, pré-eclâmpsia, nascimento prematuro, restrição de crescimento intra-uterino, e perda recorrente de gravidez.

No momento, profissionais da saúde diagnosticam infertilidade fazendo um trabalho que consiste da avaliação da situação da ovulação e um exame para identificar patologias do útero ou trompas de falópio ou outros fatores. Em muitos casos, diagnóstico clinico é atingido via eliminação de etiologias subjacentes comuns e após dois ciclos menstruais. A insuficiência reprodutiva, incluindo aborto recorrente espontâneo e outros distúrbios de infertilidade, pode resultar de múltiplas causas.

Mecanismos auto-imunes estão envolvidos nos distúrbios de infertilidade, tais como endometriose e insuficiência ovariana, e podem ser responsáveis pela patofisiologia de pré-eclâmpsia ou aborto espontâneo. Auto- anticorpos antiovarianos foram detectados em 33-61% das pacientes com infertilidade não explicada, sugerindo que esta patologia pode representar um estágio inicial de insuficiência ovariana auto- imune. Como em outras patologias auto-imunes (tais como diabetes mellitus tipo 1 e tireoidite), anticorpos antiovarianos podem aparecer meses ou anos antes do surgimento dos sintomas clínicos, assim eles poderiam prever insuficiência ovariana futura em mulheres com infertilidade não explicada.

Endometriose é uma doença que aflige até 10% de mulheres na idade reprodutiva e é caracterizada pelo crescimento regulado por hormônio de tecido endometrial fora do útero. Endometriose é conhecido como sendo uma causa de distúrbios de infertilidade feminina em 30-50% das mulheres afetadas. Foi sugerido que mecanismos auto-imunes podem estar envolvidos, e anticorpos contra auto-antigenos candidatos diferentes foram demonstrados nestes pacientes. Embora o mecanismo da infertilidade em endometriose não seja bem compreendido, foi demonstrado que endometriose está associada com auto-anticorpos e/ou outras doenças auto-imunes em até dois terços das pacientes. Foi relatada a presença de anticorpos antiendometriais em 100% e anticorpos antiovarianos em 62% das pacientes com endometriose.

O envolvimento de auto-imunidade foi também estudado em POF com a proporção geral de formas auto-imunes de POF sendo estimada entre 20-70%. O ovário humano pode ser o alvo de um ataque auto-imune em várias circunstâncias, incluindo várias doenças especificas ao órgão ou sistêmicas auto-imunes. Clinicamente, a disfunção ovariana decorrente freqüentemente resulta em POF, mas outras patologias envolvendo os ovários, tais como infertilidade não explicada, PCOS e endometriose foram associadas com auto-imunidade antiovariana. 0 diagnóstico de um mecanismo auto-imune nestas patologias tem se baseado na detecção de auto-anticorpos antiovarianos, mas recentemente atenção especial tem, também, sido colocada no componente celular da resposta auto-imune. Entretanto, pouco se sabe sobre os alvos moleculares dos efetores auto-imunes, e muitos poucos auto- antigenos foram formalmente identificados.

A detecção de auto-anticorpos direcionada contra vários alvos ovarianos suporta a hipótese de uma etiologia auto- imune de POF. Os relatórios iniciais sobre anticorpos antiovarianos incluíram principalmente pacientes com POF e uma doença auto-imune adrenal associada. Estes pacientes tinham anticorpos que reconheciam vários tipos de células produtoras de esteróide do córtex adrenal, testículo, placenta e ovário e foram denominados anticorpos de célula esteróide (SCA). A predominância de SCA era dependente das características clínicas: eles podiam ser detectados em aproximadamente 60% de pacientes de APS-I e 25- 40% de pacientes de APS-II, mas a predominância maior (78-100%) foi demonstrada em pacientes com POF. Foi também mostrado que 33- 43% das mulheres com ciclos normais com poliendocrinopatia e SCA desenvolveriam insuficiência ovariana dentro de 8-15 anos.

Uma outra causa comum de insuficiência reprodutiva é PCOS que é caracterizado por um estado anovulatório hiperandrogênico associado com uma série de sintomas clínicos e que afeta 5-10% das mulheres na idade reprodutiva. Embora PCOS, assim como ovários policísticos sem a síndrome, estejam relacionados com a desregulação hormonal, perturbações auto-imunes foram demonstradas. Características histopatológicas de ooforite auto-imune com um aspecto cístico associada com anticorpos de soro antiovariano foram relatadas. Vários investigadores se dirigiram à predominância de auto-anticorpos não específicos ao órgão e específicos ao órgão e demonstraram anticorpos antiovarianos em 50-60% de pacientes de PCOS. Tung relatou a produção de auto- anticorpos de oócito em um modelo murino resultando em insuficiência ovariana. Disfunção auto-imune em pacientes clinicamente assintomáticos também pode conduzir a abortos espontâneos recorrentes. Alguns abortos recorrentes têm, na verdade, um ou mais tipos de auto-anticorpos anormais. Anticorpos antifosfolipideos, anticorpos anti-DNA, e anticorpos antinucleares estavam implicados nos abortos recorrentes. Um mecanismo no aborto espontâneo é considerado ser trombose da vasculatura placentária e enfarte placentário, causados pela reação de auto-anticorpos contra P2-glicoproteína I, protrombina, e/ou anexina V. Uma outra causa possível é ligação direta de auto-anticorpos a células de citotrofoblasto, prejudicando a invasão de trofoblastos na decídua maternal e implantação por diferenciação preventiva a sincitiotrofoblasto.

O sistema imune demonstrou ter um papel significativo na patogênese de insuficiência ovariana prematura, síndrome do ovário policístico, endometriose, perda recorrente de gravidez, e outros distúrbios de infertilidade. 0 assunto presentemente revelado provê o uso de marcadores de imunorreatividade (por exemplo, auto-anticorpos associados com um distúrbio de infertilidade) como um auxiliar de diagnóstico para distúrbios de infertilidade, incluindo, mas não limitado a POF, PCOS, endometriose, pré-eclâmpsia, nascimento prematuro, restrição de crescimento intra-uterino, e perda recorrente de gravidez. Adicionalmente, a avaliação de auto-imunidade contra componentes específicos no trato reprodutivo, conforme provido pelo assunto presentemente revelado, é uma ferramenta de prognóstico para tratamentos da infertilidade.

Como tal, em algumas configurações do assunto presentemente revelado, é provido um método para diagnosticar um distúrbio de infertilidade em um indivíduo. Em algumas configurações, o método compreende prover uma amostra biológica compreendendo ou suspeita de compreender auto-anticorpos de um indivíduo; contatar um antígeno com a amostra, onde o antigeno compreende um peptídeo imunorreativo de auto-anticorpo; detectar os auto-anticorpos na amostra imunorreativos ao antígeno; e comparar um nível de imunorreatividade de auto-anticorpo ao antígeno com um nível de referência para diagnosticar o distúrbio de infertilidade no indivíduo.

Adicionalmente, em algumas configurações do assunto presentemente revelado, um método para caracterizar um distúrbio de infertilidade associado com produção de auto- anticorpo em um indivíduo é provido. Em algumas configurações, o método compreende prover uma amostra biológica compreendendo auto- anticorpos de um indivíduo; contatar um antígeno com a amostra, onde o antígeno compreende um peptídeo imunorreativo ao auto- anticorpo; detectar os auto-anticorpos na amostra imunorreativos ao antígeno; e quantificar um nível de imunorreatividade do auto- anticorpo ao antígeno para, portanto, caracterizar o distúrbio de infertilidade no indivíduo.

Por exemplo, em algumas configurações o distúrbio de infertilidade é um distúrbio selecionado do grupo incluindo, mas não limitado à insuficiência ovariana prematura (POF), síndrome do ovário policístico (PCOS), endometriose, pré- eclâmpsia, nascimento prematuro, restrição de crescimento intra- uterino, e perda recorrente de gravidez (aborto espontâneo). Adicionalmente, em algumas configurações, os auto-anticorpos detectados são imunorreativos a antígenos derivados do ovário, endométrio, placenta, ou combinações dos mesmos. Em algumas configurações dos métodos para diagnóstico e/ou caracterização de distúrbios de infertilidade em um indivíduo, o peptídeo imunorreativo a auto-anticorpo pode ser isolado de um exossoma. Em algumas configurações, o peptídeo imunorreativo a auto-anticorpo é um antígeno de peptídeo selecionado do grupo consistindo de: antígenos nucleares com pesos moleculares de aproximadamente 50kD e 80kD e antígenos de membrana com pesos moleculares de aproximadamente 10kD, 30kD, 45kD, 90kD e 125kD. 0 reconhecimento de proteínas de membrana é partilhado por todas as infertilidades; entretanto, reconhecimento de proteína nuclear parece ser único à endometriose.

IV. Kits para Detecção de Auto-anticorpos

Em configurações adicionais, o assunto presentemente revelado provê kits imunológicos para uso na detecção de auto-anticorpos em amostras biológicas. Estes kits podem, de forma geral, compreender um ou mais antígenos revelados aqui que podem imunorreagir com a amostra testada quanto aos auto- anticorpos. Em algumas configurações, os antígenos são isolados de exossomas, conforme revelado aqui. Mais especificamente, os kits de imunodetecção, dessa maneira, compreenderão, em recipiente(s) adequado(s), um ou mais antígenos de peptídeo imunorreativo de auto-anticorpo. Em algumas configurações, os kits compreendem ainda anticorpos que se ligam aos antígenos e/ou anticorpos que se ligam a outros anticorpos (por exemplo, auto-anticorpos de interesse) por meio, por exemplo, de porções Fc.

Em certas configurações, o antígeno pode ser provido ligado a um suporte sólido, tal como, por exemplo, uma matriz de coluna ou poço de uma placa de microtítulo, uma membrana (por exemplo, nitrocelulose, PVDF ou material similar), contas, ou hastes de imersão. Alternativamente, o suporte pode ser provido como um elemento separado do kit.

Os reagentes de imunodetecção do kit podem incluir rótulos detectáveis que estão associados, ou ligados, ao anticorpo de detecção dado ou ao próprio antigeno. Rótulos detectáveis que estão associados ou anexados a um ligante de ligação secundário são, também, considerados. Estes rótulos detectáveis incluem corantes, haptenos, moléculas

quimioluminescentes ou fluorescentes (rodamina, fluoresceina, proteína fluorescente verde, luciferase) , biotina, rotulação com rádio (3H, 35S, 32p, 14C, 131I) ou enzimas (fosfatases alcalinas, peroxidase de rábano picante).

Os kits podem, ainda, compreender padrões adequados de quantidades predeterminadas, incluindo tanto anticorpos quanto antígenos. Estes podem ser usados para preparar uma curva padrão para um ensaio de detecção.

Os kits do assunto presentemente revelado, independente do tipo, podem, de forma geral, compreender um ou mais recipientes nos quais os agentes biológicos são colocados e adequadamente divididos em alíquotas. Os componentes dos kits podem ser embalados tanto em meio aquoso quanto na forma Iiofilizada.

As composições do assunto presentemente revelado podem ser vantajosamente embaladas em um kit compreendendo o(s) reagente(s) ativo, um recipiente adequado, e ainda instruções de uso para o kit. 0(s) reagente(s) do kit pode (m) ser provido (s) como uma solução líquida, anexado a um suporte sólido ou como um pó seco. Quando o reagente é provido em uma solução liquida, a solução liquida pode ser uma solução aquosa. Quando o reagente provido é anexado a um suporte sólido, o suporte sólido pode ser meio cromatográfico, uma placa de teste tendo uma pluralidade de poços, ou um slide de microscópio. Quando o reagente provido for um pó seco, o pó pode ser reconstituído pela adição de um solvente adequado, que pode ser provido.

O recipiente dos kits pode, de forma geral, incluir pelo menos um poço de placa de microtítulo, slide, frasco, tubo de ensaio, frasco, garrafa, ou ainda seringa ou outro recipiente, no qual o antígeno possa ser colocado, e se desejado, adequadamente dividido em alíquotas. Onde um segundo ou terceiro ligante de ligação ou componente adicional for provido, o kit pode também, de forma geral, conter um segundo, terceiro ou outro recipiente adicional no qual este ligante ou componente pode ser colocado.

Os kits do assunto presente podem também, tipicamente, incluir um mecanismo para conter o recipiente do antígeno (s) e quaisquer outros recipientes de reagente em confinamento hermético para comercialização. Estes recipientes podem incluir injeção ou recipientes plásticos moldados por injeção nos quais os recipientes desejados são retidos.

EXEMPLOS

Os exemplos a seguir foram incluídos para ilustrar modos do assunto presentemente revelado. À luz da presente revelação e do nível geral de especialização na técnica, aqueles especializados observarão que os Exemplos a seguir objetivam apenas serem exemplificativos e que várias alterações, modificações, e mudanças podem ser empregadas sem se afastar do escopo do assunto presentemente revelado.

EXEMPLO 1

ASSOCIAÇÃO DE ANTICORPOS REATIVOS COM CÂNCER

Anticorpos auto-reativos foram ubiquamente demonstrados em todos os pacientes de câncer testados. 0 aparecimento dos auto-anticorpos reativos a tumor foi analisado em pacientes de câncer ovariano (n=28), e voluntárias do sexo feminino de idade correspondente sem a presença de tumores (n=32). A presença e reatividade de IgG dentro do soro de pacientes de câncer ovariano com antigenos celulares derivados de tumores ovarianos foram quantificadas por ELISA.

Antigenos celulares derivados de tumor de células de tumor ovariano UL-I, em crescimento de fase de registro, foram diluídos a 1:25 em um tampão de acoplamento consistindo de carbonato de sódio a 100 mM e NaCl a 0,5 M, pH 8,3. Alíquotas foram adicionadas a poços de uma placa de microtítulo Immulon4 de 96 poços e incubadas durante uma noite a 37°C. As placas foram bloqueadas com 5% de leite seco sem gordura e então incubadas com 200μ1 de soro, diluído a 1/200, de pacientes de câncer ovariano e controles normais de idade correspondente, durante uma noite a 4°C. As placas foram lavadas e incubadas com IgG anti-humano conjugado com peroxidase (diluído 1/5000) e a presença de anticorpo ligado foi determinada pela incubação dos poços com uma solução de tampão de citrato a 50 mM contendo OPD (0,4 mg/ml), medindo absorbância a 490nm.

Todos os pacientes com câncer ovariano exibiram um nível de auto-anticorpos, reconhecendo proteínas derivadas de tumor ovariano, significativamente maior que suas contrapartidas que não apresentavam câncer (p<0,0001). 0 nível de ligação de IgG observado no soro da população de controle representa um nível histórico. Nenhuma sobreposição na ligação de IgG a antígenos de tumor foi observada entre o paciente de câncer e os grupos de controle.

Visto que pacientes de câncer exibiram um nível intensificado de anticorpos reativos a tumor e o nível destes auto-anticorpos exibiu variabilidade significativa, comparações estatísticas foram feitas entre a absorbância relativa para estes IgG reativos a tumor e o estágio da doença. Dados sobre o nível de imunoglobulinas reativas com proteínas celulares da linhagem de célula de tumor ovariano UL-I foram separados por estágio de doença (Figura 1). Foi observado que o nível de IgG reativo aumenta com o estágio da doença. Soros de pacientes de câncer do estágio I (n=8) exibiram um aumento significativo acima do histórico de soros normais (n=32, p<0,001) ou soros de mulheres com doença ovariana benigna ( n—8, p<0,01). Nenhuma diferença significativa foi observada para imunorreatividade detectada em soro de tumores ovarianos e câncer ovariano do estágio I de baixo potencial de malignidade. O nível de imunorreatividade presente nos pacientes do estágio II (n=10) foi significativamente maior que o nível observado em pacientes do estágio I (p<0,001) e significativamente menor que aquele detectado nos soros de pacientes do estágio III (n=8, p<0,01). O nível de imunorreatividade presente em pacientes do estágio III foi significativamente menor que o nível observado em pacientes do estágio IV (n=8, p<0,001). Dessa maneira, pacientes de câncer ovariano exibem anticorpos reativos a tumor que estão correlacionados com o estágio da doença.

EXEMPLO 2

RECONHECIMENTO DE ALVOS ANTIGÊNICOS ESPECÍFICOS POR IgG REATIVO A TUMOR

Visto que diferenças quantitativas na reatividade de auto-anticorpos obtidos do soro de pacientes de câncer ovariano a antigenos de tumor ovariano poderiam ser demonstradas com base no estágio da doença, diferenças qualitativas foram, então, investigadas usando "Western blotting" e densitometria. Usando antigenos de proteína celular de 3 linhagens de célula de tumor ovariano (UL-1, UL-3, UL-6) no crescimento de fase de registro, a presença de componentes reativos com a resposta imune humoral de pacientes de câncer ovariano foi avaliada por "Western blotting" (Figura 2, manchas representativas). "Western blotting" foi realizado usando soro dos pacientes (diluído 1:100) como a fonte de anticorpos primários. A ligação de anticorpos derivados de paciente a antigenos derivados de célula tumoral foi visualizada usando IgG anti-humano conjugado com peroxidase, seguido por ECL. A imunorreatividade foi quantificada por densitometria. Diferenças nos antigenos reconhecidos e na intensidade daquele reconhecimento foram analisadas.

Dez (10) soros de Estágio I, dez (10) soros de Estágio II, dez (10) soros de Estágio III e doze (12) soros de Estágio IV foram analisados. Para todos os pacientes de câncer ovariano, estes "Western blotting" identificaram bandas múltiplas em peso molecular de 10 a 140kD, embora o número e a intensidade da interação imunológica tenham sido variáveis entre os pacientes. As intensidades variáveis de sinal no "imuno-blotting" se correlacionavam com o estágio da doença (pixels totais por faixa, correlação eficiente r=0,906).

Embora, no geral, pacientes de câncer de estágio avançado reconheceram mais bandas em intensidade maior, padrões de reconhecimento diferencial especifico do estágio foram observados no IgG de pacientes de câncer ovariano nestes "Western blotting". Adicionalmente às diferenças quantitativas relacionadas ao estágio, pacientes do estágio inicial exibiram reconhecimento único, intenso de vários antigenos com pesos moleculares maiores que 100kD (mostrado pela caixa no Painel A), enquanto pacientes de estágio avançado exibiram reconhecimento único de antigenos com pesos moleculares menores que 40kD (mostrados pela caixa no Painel B) . Como um controle, a reatividade de soro normal foi também testada contra estas proteínas, como foi a reatividade do soro de pacientes de câncer contra epitélio ovariano normal. Soro de controles femininos normais (sem a presença de tumor) falhou no reconhecimento de proteínas por "Western blotting", enquanto soro de paciente de câncer exibe reatividade apenas com umas poucas faixas no epitélio ovariano normal.

Visto que alguns antigenos são reconhecidos por soro do estágio inicial e continuam a serem reconhecidos por soro de pacientes avançados, isto demonstra que estas proteínas antigênicas são expressas inicialmente e sua expressão se mantém durante toda a progressão do tumor. Parece que algumas proteínas são reconhecidas apenas tardiamente na progressão do tumor, demonstrando sua alteração e/ou aparecimento tardios. Entretanto, visto que estas partilham reconhecimento entre pacientes, elas, dessa maneira, representam uma alteração comum nestes pacientes. Algumas proteínas antigênicas parecem ser preferencialmente reconhecidas no inicio, demonstrando o aparecimento de proteína alterada essencial de desenvolvimento de tumor inicial. A identificação destas proteínas alteradas de estágio específico provê uma visão adicional nas alterações essenciais para cada estágio de desenvolvimento e progressão do tumor.

O trabalho de outros investigadores usando tanto "Western blotting" quanto ELISA baseada em antígeno derivado de tumor detectou anticorpos reativos a tumor em todos os pacientes testados: entretanto, a avaliação do reconhecimento de proteínas antigênicas específicas não identificou um componente único em 100% dos pacientes, com a maioria das proteínas únicas sendo reconhecida em apenas 10-40% dos pacientes. Este reconhecimento limitado pode ser devido à maioria dos estudos sobre auto- anticorpos reativos a tumor usarem proteínas recombinantes (em muitos casos, proteínas do tipo selvagem) , que não têm modificações pós-tradução ligadas a câncer que podem modificar epítopos antigênicos, os quais podem subestimar o nível real de imunorreatividade. Respostas de auto-anticorpo a antígenos amplamente expressos em tecidos cancerígenos e normais parecem ser atribuíveis a mutações específicas de tumor ou a modificações pós- tradução. Embora auto-anticorpos reativos a tumor possam ser detectados em todos os cânceres, IgG reativa a tumor reconhecendo estes antígenos específicos de voluntários isentos de câncer é um evento raro (<1%) e no sistema de ensaio revelado presentemente eles não são detectados.

EXEMPLO 3 MARCADORES IDENTIFICANDO RESPONSIVIDADE TERAPÊUTICA

Visto que diferenças nos padrões de reatividade foram observadas entre os pacientes com doença avançada, a correlação entre estas diferenças e quimiorresistência foi examinada. A separação de componentes celulares por eletroforese 2D seguida por "Western blotting" permitiu a avaliação de algumas destas diferenças. Usando soro de pacientes que falharam em responder inicialmente à terapia com cisplatina e pacientes exibindo uma resposta inicial que permaneceram livres da doença por >12 meses, o reconhecimento de um agrupamento de 3 locais associados com a resistência à cisplatina foi identificado (Figura 3) . A utilização destes antigenos celulares como parte do arranjo de diagnóstico revelado aqui pode permitir a identificação prematura de tumores resistentes.

EXEMPLO 4

IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS ANTIGÊNICAS

RECONHECIDAS IN VIVO

Visto que as respostas humorais de pacientes estavam direcionadas contra proteínas ligadas a estágio específico associadas com tumores ovarianos, a identificação destes antigenos imunorreativos foi iniciada pelo desenvolvimento de um arranjo de proteína. Para minimizar o número de proteínas totais analisadas, proteínas imunorreativas foram isoladas por imunoprecipitação.

IgG foi isolada do soro de 3 mulheres com câncer ovariano de estágio avançado usando uma coluna de 1 ml HITRAP PROTEIN G-SEPHAROSE® (GE Healthcare). A fração IgG ligada foi eluída com tampão de eluição IMMUNPURE® (GE Healthcare), e monitoramento a 280nm. As frações contendo IgG foram agrupadas e concentradas e, então, acopladas a colunas HITRAP NHS™ (GE Healthcare), de acordo com as instruções do fabricante. Proteínas celulares de células de tumor ovariano UL-I foram solubilizadas e clarificadas. Alíquotas do IgG do paciente imobilizado foram incubadas com as preparações de proteína celular, durante uma noite a 4°C e, então, os complexos ligados foram eluídos. Estas proteínas celulares imunopurifiçadas foram fracionadas por cromatografia RP-HPLC em uma coluna 4,6x250 mm C8 (300μ). As frações resultantes foram secas por velocidade-vac e usadas para desenvolver um arranjo de proteína. A solução de proteína (2,5μ1) foi carregada manualmente em um local único. Uma amostra de Ig conjugada com peroxidase foi colocada em cada membrana como um controle positivo e para orientação do arranjo (indicado como faixa C nas Figuras 4A e 4B). Soro de pacientes de câncer ovariano de estágio avançado (diluído 1:100) foi incubado com as membranas durante uma noite a 4°C e membranas foram, então, incubadas com IgG anti-humano conjugado com peroxidase, visualizado por ECL. 0 filme resultante foi reproduzido e analisado usando software de análise da Kodak para reconhecimento de local e quantificação.

Cada paciente de câncer ovariano analisado reconheceu múltiplas proteínas; entretanto, todos os pacientes reconheceram algumas proteínas. Usando este sistema de arranjo, soro de controle (paciente livre de câncer) (n=10) falhou em reconhecer quaisquer alvos de proteína. Para identificar as proteínas específicas responsáveis por esta imunorreatividade observada com auto-anticorpos de pacientes, porções das proteínas correspondendo àquelas reconhecidas pelas respostas imunes humorais de pacientes de câncer ovariano foram submetidas à espectrometria de massa MALDI-TOF seguida por digestão de tripsina. Os peptideos resultantes fracionados por HPLC em uma coluna microcapilar de silica fundida (75χ200μπι, Polymicro Technologies, Inc.) e eluidas diretamente na fonte de ion de eletropulverização de um espectrômetro de massa triplo quádruplo (TSQ 70, Finnigan ΜΑΤ) usando um gradiente linear de 0 a 80% de acetonitrila em ácido acético a 0,1 M (sistema de envio de solvente 140 B). Espectros de massa foram obtidos para cada pico e os fragmentos de peso molecular resultantes para cada proteína foram comparados aos bancos de dados de outras proteínas conhecidas para identidade. Picos comuns adicionais (11, 19, 44 e 49) foram também analisados; entretanto, estas frações consistiam de proteínas múltiplas e o sequenciamento não pode ser diretamente obtido.

A presente metodologia pode identificar um grupo de antígenos reconhecidos apenas por pacientes com câncer ovariano (Figura 5). Os dados revelados aqui indicam a presença de componentes reativos que se correlacionam com a presença de doença, estágio, e quimiorresistência. Vários grupos propuseram que proteínas são expressas prematuramente no desenvolvimento de câncer e foi demonstrado que muitas destas fizeram surgir auto- anticorpos. Disis et al. ("Global role of the immune system in identifying câncer initiation and limiting disease progression". Journal of Clinicai Oncology. 23(35):8923-5, dezembro de 2005) demonstraram que pacientes de câncer montam respostas de anticorpo de soro a antígenos associados com tumor em um estágio inicial da doença. Auto-anticorpos contra p53 foram relatados em pacientes com cânceres ovariano, colorretal e oral de estágio inicial. As presentes descobertas indicam uma diferença significativa na imunorreatividade em relação a estágio, e mesmo reconhecimento de câncer de estágio inicial é distinto de doença ovariana normal e benigna. Esta diferença representa diferenças quantitativas (intensidade de ligação ou titulo) ao invés de diferenças qualitativas; entretanto, o desenho do arranjo de diagnóstico presentemente revelado permite a identificação da presença de auto-anticorpo e a quantificação de sua ligação (intensidade) . Dessa maneira, diferenças quantitativas na ligação de anticorpo reativo a tumor (intensidade) , que nós já demonstramos existir, provêem diferenciação adequada da situação e estágio de câncer para diagnóstico.

EXEMPLO 5

AVALIAÇÃO DE UM ARRANJO DE PROTEÍNA COM ALVO DE PROTEÍNA ESTABELECIDO

Usando anticorpos comerciais contra proteínas auto-antigênicas identificadas previamente pelos presentes inventores (Tabela 1) , proteínas foram isoladas de células de câncer ovariano UL-I solubilizadas por imunoprecipitação. Estas proteínas isoladas foram usadas para estabelecer um arranjo de proteína para definir a eficácia da presente abordagem. Estas proteínas celulares imunopurifiçadas foram usadas para desenvolver um arranjo de proteína, consistindo de 12 locais em um tamanho total de l,5x2cm. Cada uma das 12 soluções de proteína (2,5μ1) foi manualmente carregada em locais únicos. IgG conjugada com peroxidase foi colocada em cada membrana como um controle positivo e para orientação do arranjo. Soros de controles normais do sexo feminino (n=20), mulheres com doença ovariana benigna (n=20) e mulheres com câncer ovariano invasivo (n=20) a diluições de 1:100 foram incubados com as membranas durante uma noite a 4°C. As membranas foram, então, incubadas com IgG anti-humano conjugado com peroxidase e visualizadas por ECL. O filme resultante foi reproduzido e analisado usando software de análise Kodak para reconhecimento de local e quantificação. A absorbância maior que 900 pixels foi definida como positiva e o percentual de soros positivos para imunorreatividade foi comparado.

Soros de todas as mulheres com câncer ovariano invasivo reconheceram pelo menos 2/12 antigenos testados; entretanto, soros de controles e mulheres com doença benigna também exibiram reconhecimento significativo de pelo menos um antigeno. Em contraste, o reconhecimento de quatro ou mais destes antigenos está limitado a soros de mulheres com câncer ovariano invasivo. Definindo o reconhecimento de 4 ou mais antigenos como o corte produziu um ensaio com a capacidade de diferenciar entre pacientes com câncer ovariano invasivo e doença ovariana benigna com uma sensibilidade = 100%, uma especificidade = 76% e um valor preditivo positivo = 100%. Vide Figura 6.

<table>table see original document page 58</column></row><table> <table>table see original document page 59</column></row><table>

Tabela 1: Antigenos celulares isolados de células de câncer ovariano usados para o arranjo e o percentual de pacientes de câncer ovariano com auto-anticorpos contra cada proteína nos ensaios.

Para definir parâmetros adicionais, além da diferenciação de massas ovarianas benignas e malignas, proteínas adicionais derivadas de tumor foram examinadas. A Figura 7 apresenta uma imagem de 36 arranjos de proteína. Baseado nestes resultados, este formato de arranjo pode diferenciar reconhecimento de antígeno associado com câncer ovariano de estágio inicial em relação a câncer ovariano de estágio avançado. Os dados apresentados na Figura 7 são baseados em antígenos de uma única linhagem de célula de câncer ovariano (UL-I). Certos antígenos de outras linhagens de célula tumoral podem exibir reatividade mais intensa. Os antígenos ideais das diferentes linhagens de tumor ovariano, que exibem uma reação cruzada máxima entre todos os pacientes de câncer ovariano, podem ser especificamente determinados para uso no diagnóstico de doenças em estágio inicial.

EXEMPLO 6

AVALIAÇÃO DE UM ARRANJO DE PROTEÍNAS ISOLADAS DE DIFERENTES CÂNCERES

A tabela abaixo indica o layout de um arranjo, indicando os 20 antigenos isolados de 4 tipos diferentes de cânceres ovarianos (resultando em um total de 80 Ag) que foi avaliado quanto à capacidade para detectar auto-anticorpos em pacientes de câncer se comparado com controles. As quatro linhagens de células de câncer ovariano utilizadas foram A = UL-1, B= UL-2, C=UL-3, e D=UL-6, que são reveladas em detalhe na

Descrição Detalhada.

<table>table see original document page 60</column></row><table> Tabela 2: Layout de arranjo de antígenos para detecção de auto-anticorpos

Para câncer cervical, o soro de cada um dos dezesseis indivíduos a seguir foi avaliado para detectar a presença de anticorpos em resposta a proteínas isoladas das linhagens de célula de câncer cervical. Isto incluía doze indivíduos com câncer cervical (adenoescamoso, célula escamosa e adenocarcinoma), e quatro controles (indivíduos sem câncer cervical). A reatividade foi também avaliada após as culturas de células serem tratadas com ácido retinóico.

A maior reatividade foi detectada nas frações solúveis de todas as linhagens de célula (ME180, SiHa, CaSki e C33A) e foi estatisticamente significativa (p<0,05) (Figuras 8A e 8B). A menor reatividade foi detectada na fração de membrana de todas as linhagens de célula. A reatividade foi quantificada em pixels. No geral, CaSki (HPV 16 e 18) demonstrou a maior reatividade e quando comparada com outras linhagens de célula, tinha a maior reatividade nas frações exossomais e solúveis (p<0,05) . C33A, a linhagem de célula sem HPV, demonstrou a maior reatividade na fração de membrana. Mel80 (HPV-39) demonstrou a menor quantidade de reatividade.

Reconhecimento similar de antígenos foi detectado através de cada linhagem de célula. Houve reconhecimento diferencial de antígenos entre diferentes linhagens de célula. Os soros de controle não demonstraram qualquer reatividade.

Nos soros que foram tratados com ácido retinóico, ocorreu reatividade diminuída nos antígenos associados com célula solúvel (p<0,05) em todas as linhagens de célula (Figura 9). Reatividade aumentada foi observada com os antigenos associados com a célula. Isto foi detectado na fração de membrana de todas as linhagens de célula (p<0,05), a fração nuclear nas linhagens de célula C33A e SiHa (p<0,05), e a fração citosólica da linhagem de célula SiHa (P<0,05) (Figura 10).

EXEMPLO 7

AVALIAÇÃO DE ENSAIO DIAGNÓSTICO DE MÚLTIPLOS CÂNCERES DIFERENTES

Métodos para o Exemplo 7

Reconhecimento de alvos antigênicos específicos por IgG reativa a tumor. Visto que diferenças quantitativas na reatividade de auto-anticorpos obtidos dos soros de pacientes de câncer ovariano em relação a antigenos de tumor ovariano poderiam ser demonstradas com base no estágio da doença, diferenças qualitativas foram, então, investigadas usando teste ELISA para quantificar o nível de imunorreatividade com antigenos específicos. Exossomas foram isolados do meio condicionado de 3 linhagens de célula de tumor ovariano (UL-1, UL-3, UL-6) em crescimento de fase de registro.

Preparação de antigenos reativos específicos. Proteínas reativas para alvos do ensaio foram isoladas de exossomas purificados por cromatografia imunossorvente. Anticorpos comerciais para cada proteína de interesse foram obtidos. Estes anticorpos foram imobilizados em colunas HITRAP NHS™ de 1 ml (GE Healthcare), de acordo com as instruções do fabricante. Após centrifugação de exossoma a lOO.OOOxg, a conta foi solubilizada em Tris-HCl a 50 mM (pH7,5), contendo 0,3% SDS, ortovanadato de sódio a 2 mM, DTT a 200 mM, fluoreto de sódio a 1 mM, 1 μg/ml de leupeptina, 1 μg/ml de aprotinina, 1 μg/ml de pepstatina, e PMSF a 1 mM em gelo. 0 lisato foi sonicado e centrifugado a 10.000xg durante 15 minutos. As proteínas solubilizadas foram clarificadas por incubação com Proteína G-agarose (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) durante 1 hora. Este material de proteína solubilizada clarificada foi aplicado à coluna imunossorvente e incubado durante uma noite a 4°C. O material ligado foi lavado 3 vezes com PBS contendo 1% de Triton X-100 e as proteínas antigênicas específicas liberadas por 0,1 M glicina—HCl, pH 2,8, neutralizadas com Tris a 1 M. Esta preparação de antígeno foi aplicada a colunas MACROS PHERE GPC™ 150/60 (4, 6x500) (Grace, Deerfield, IL) equilibradas em TBS e isocraticamente processadas. Alíquotas dos eluatos foram avaliadas por "Western blotting" para confirmar a fração molecular apropriada. A fração de antígeno apropriada foi adicionalmente separada por cromatografia de RP-HPLC em uma coluna de 4,6x250 mm C8 (300μ). O pico da proteína foi seco por centrifugação a vácuo e ressuspenso em TBS e quantificado por ensaio de proteína.

Reatividade de auto-anticorpo definida por ELISA. Para definir o nível de reatividade de auto-anticorpos derivados de paciente em relação a exossoma derivado de tumor, um ensaio ELISA foi realizado. Proteínas isoladas de cada preparação imunossorvente foram diluídas a 1:25 em um tampão de acoplamento consistindo de carbonato de sódio a 100 mM e NaCl a 0,5 M, pH 8,3. Alíquotas (2μg/poço) foram adicionadas a poços de uma placa de microtítulo de 96 poços IMMULON4™ (Chantilly, VA) e incubadas durante uma noite a 37°C. As placas foram bloqueadas com 5% de leite seco sem gordura em PBS durante 1 hora e subseqüentemente lavadas três vezes com PBS mais 0,2% de Tween-20 e 5% de leite seco sem gordura. As placas foram, então, incubadas com 200μ1 de soro, diluído 1/100, de pacientes e controles normais, durante uma noite a 4°C. As placas foram lavadas e incubadas com IgG anti- humana conjugada com peroxidase (diluída a 1/5000) durante uma hora. Após lavagem, a presença de anticorpo ligado foi determinada por incubação dos poços com solução de tampão de citrato a 50 mM contendo o-fenilenodiamina diidrocloreto (0,4 mg/ml) (OPD, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) e medição de absorbância a 490nm.

Resultados para o Exemplo 7

Usando antígenos imunossorventes-purificados, placas de microtítulo para cada ensaio foram construídas. Soros de controles do sexo feminino normais (n=10), mulheres com doença ovariana benigna (n=10) e mulheres com câncer ovariano (n=10 para cada estágio I-IV) em diluições de 1:100 foram incubados com os poços em duplicata durante uma noite a 4°C. O poço foi lavado com TBS três vezes e, então, incubados com IgG anti-humano conjugado com peroxidase. A absorbância de cada poço foi medida a 490nm. A absorbância média de cada paciente foi determinada e registrada em gráfico.

A imunorreatividade para controles normais e mulheres com doença benigna estavam na linha de base e foram considerados negativos para todos os antígenos testados (Figura 11) . Cada ponto nos gráficos na Figura 11 representa a média para cada paciente. Em todos os casos, as médias para o grupo inteiro foram estatisticamente diferentes dos controles e casos benignos.

Para avaliar a utilidade dos métodos presentemente revelados como diagnósticos para câncer, de forma geral, este estudo foi repetido, exceto que soros de mulheres com cânceres pancreático, do pulmão, mama, e cólon avançados foram usados. Todos os pacientes de câncer testados pareceram gerar auto-anticorpos reconhecendo antigenos nucleofosmina, catepsina D, p53, e SSX. Apenas mulheres com câncer ovariano reconheceram fosfatase alcalina do tipo placentário (PLAP). Pacientes com câncer do pulmão e cólon reconheceram mais fortemente survivina (Figura 12) .

EXEMPLO 8

DEFININDO EPÍTOPOS ANTIGÊNICOS EM PROTEÍNAS RECOMBINANTES EM RELAÇÃO A PROTEÍNAS NATURAIS

Uma porção (2Cμg) de cada antigeno natural especifico e sua contrapartida recombinante foram separadas por eletroforese de gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE). Após eletroforese, as bandas foram visualizadas por mancha de Azul de Coomassie e cada banda foi extraída. Os géis foram equilibrados com tampão de operação SDS. Os pedaços de gel contendo as proteínas específicas foram aplicados ao poço de um gel de acrilamida a 20%. Os pedaços de gel foram picados em pedaços menores e inseridos no poço de amostra do gel de empilhamento para SDS-PAGE. Cem μl da solução de eletrodo foram adicionados aos pedaços de gel secos. Após incubação durante 1 h, 20 μl de tampão de amostra SDS diluído contendo 10 μl de protease de Staphylococcus aureus V8 (Pierce, Rockford, IL, USA) (0,1 μg/mL) em água deionizada foram sobrepostos na solução de amostra. Eletroforese foi realizada até a amostra e protease serem empilhadas no gel superior, e interrompida durante 1 hora para digerir a proteína. Eletroforese foi, então, continuada e os digeridos separados foram analisados por "eletro-blotting" em membrana de PVDF. As membranas foram, então, incubadas com soro de paciente, diluídas a 1:100, durante uma noite. Após lavagem 3X com TBS, as membranas foram incubadas durante 1 hora com IgG anti- humana conjugada com peroxidase como o anticorpo secundário. Os complexos imunes ligados foram visualizados por quimioluminescência intensificada (ECL, Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL).

Para p53, pacientes 1 e 3, ambos, reconheceram uma banda de peptídeo intermediária na proteína derivada de tumor, que não foi observada nos peptídeos da proteína recombinante (Figura 13). Para GRP78, todos os pacientes reconheceram 3-5 bandas de peptídeo adicionais na proteína derivada de tumor, que não foram observadas nos peptídeos da proteína recombinante (Figura 13) . Para nucleofosmina, todos os pacientes exibiram uma reatividade mais intensa com a proteína derivada de tumor em relação à proteína recombinante (Figura 13) . 0 paciente 2 reconheceu 3 bandas adicionais na nucleofosmina derivada de tumor e o paciente 3 reconheceu uma banda de peso molecular menor em comparação com a proteína recombinante. Estes resultados demonstram que as proteínas derivadas de tumor natural derivadas de exossomas exibem epítopos antigênicos adicionais comparados com proteínas recombinantes.

EXEMPLO 9

ENSAIOS DE DIAGNÓSTICO PARA DISTÚRBIOS DE INFERTILIDADE

Para quantificar o nível de imunorreatividade por auto-anticorpos derivados de pacientes de distúrbio de infertilidade, a presença e reatividade de IgG dentro dos soros de pacientes com endometriose contra antígenos celulares derivados de membrana endometrial, núcleo, e citosol, foram quantificadas por ELISA. Proteínas isoladas de cada fração subcelular foram diluídas a 1:25 em um tampão de acoplamento consistindo de carbonato de sódio a 100 mM e NaCl a 0,5 mM, pH 8,3. Alíquotas foram adicionadas a poços de uma placa de microtítulo de 96 poços IMMULON4™ (Chantilly, VA) e incubadas durante uma noite a 37°C. As placas foram bloqueadas com 5% de leite seco sem gordura em PBS durante 1 hora e subseqüentemente lavadas três vezes com PBS mais 0,2% de Tween-20 e 5% de leite seco sem gordura. As placas foram, então, incubadas com 200μl de soro, diluído 1/100, de pacientes e controles normais, durante uma noite a 4 °C. As placas foram lavadas e incubadas com IgG anti-humana conjugada com peroxidase (diluída a 1/5000) durante uma hora. Após lavagem, a presença de anticorpo ligado foi determinada por incubação dos poços com solução de tampão de citrato a 50 mM contendo diidrocloreto de o- fenilenodiamina (0,4 mg/ml) (OPD, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) e medição de absorbância a 490nm.

Amostras de soro foram obtidas de mulheres que estavam entre 21-34 anos de idade e foram diagnosticadas com infertilidade, resultando de endometriose, insuficiência ovariana prematura (POF) e perda recorrente de gravidez. Os indivíduos de controle eram do sexo feminino com idades correspondentes sem sintomas de dor, sem anomalias pélvicas e sem cirurgia pélvica anterior. Endometriose foi classificada de acordo com a classificação da xxAmerican Society for Reproductive Medicine (rASRM)" revisada. As amostras foram obtidas das xxDivisions of Reproductive Endocrinology and Infertility of the Greenville Health System and of the University of Louisville". Vinte e cinco espécimes foram obtidos de controles, 25 pacientes cada de mulheres com endometriose de Estágio II e endometriose de Estágio III, 18 pacientes apresentando perda recorrente de gravidez, e 11 pacientes com insuficiência ovariana prematura. As amostras foram coletadas de acordo com um consentimento informado analisado pelo "Human Studies committee at GHS and the University of Louisville". Amostras de sangue venoso foram obtidas em tubos heparinizados e o soro foi isolado após resfriamento. Os soros foram armazenados a - 70°C até o uso.

Embora variabilidade tenha sido observada, todos os pacientes com distúrbios de infertilidade testados exibiram um nivel significativo de auto-anticorpos, em contraste com pacientes de controle normal (p<0,0001). Visto que os pacientes exibiram um nivel intensificado de auto-anticorpos e o nivel destes auto- anticorpos exibiu variabilidade significativa, comparações estatísticas foram feitas entre a absorbância relativa para estas IgG e estágio de doença. Observou-se que o nível de IgG reativa aumentou com o estágio da doença, com soros de pacientes do estágio II exibindo um aumento significativo acima dos soros normais (p<0,001) (Figura 14). 0 nível de imunorreatividade presente no estágio III foi significativamente maior que aquele detectado nos soros de pacientes do estágio II (p<0,01) para todas as fontes de antígenos.

Para caracterizar a reatividade destes auto- anticorpos com antígenos do endométrio, amostras de soro de controles normais e de mulheres com endometriose (estágios II e III) foram analisadas adicionalmente por "Western blotting". "Imuno-blottings" representativos dos grupos de pacientes são apresentadas na Figura 15. Pacientes de controle (sem endometriose) falharam em exibir reconhecimento significativo de qualquer um dos antigenos celulares.

Pacientes com endometriose do estágio II exibiram reatividade intensa com antigenos celulares de ambos, endométrio e ovário. Dentro destes tecidos, a reação mais forte foi observada com antigenos das frações de membrana do endométrio, seguido por antigenos de membrana do ovário. Soros de pacientes com endometriose de Estágio III exibiram um padrão similar de reatividade; entretanto, mais intensidade foi observada com antigenos de membrana de todas as fontes. Com os antigenos de membrana endometrial, todos os pacientes com endometriose reconheceram proteínas a 80 e 140kD, enquanto pacientes com doença do estágio III reconheceram bandas adicionais a 10, 28, e 40kD. O reconhecimento comum da proteína de membrana de 140kD foi partilhado com antigenos de membrana ovariana. No geral, pacientes com endometriose também exibiram reconhecimento partilhado forte de proteínas de 90 e IOOkD, enquanto pacientes com doença do estágio III também reconheceram bandas adicionais a 50 e 78kD. Pouca reatividade foi observada com antigenos derivados do citosol.

Devido à intensidade da reatividade, a ligação de anticorpo foi adicionalmente analisada pela separação dos antigenos de membrana endometrial por eletroforese bidimensional (Figuras 16A e 16B). Esta abordagem permitiu a separação adicional dos antigenos de membrana. O nível aumentado de reatividade observado nos pacientes com endometriose de estágio III em relação à endometriose de estágio II parece resultar de reatividade aumentada com os mesmos componentes e do reconhecimento de componentes adicionais.

Baseado nas descobertas deste estudo, a avaliação de auto-anticorpos endometriais para proteínas celulares específicas e/ou supressão de ativação de NK pode servir como indicadores de diagnóstico de endometriose. A presença de auto- anticorpos reativos com antígenos de membrana endometrial específicos parece ser única ao desenvolvimento de endometriose e está correlacionada com o estágio da doença. A avaliação de ativação de NK sozinha pode não ser específica para uso de marcador de diagnóstico, mas juntamente com a presença de auto- anticorpos; elas podem prover a especificidade e sensibilidade para um diagnóstico definitivo de endometriose.

Para avaliar esta abordagem para diferenciar entre etiologias de infertilidade, o gabarito de arranjo de proteína consistiu de 34 locais com 4 locais de largura e 80 locais de comprimento em um tamanho total de 4x8c. Este gabarito foi usado como um guia para solução de local nas membranas MAGNAGRAPH (MSI). Para capturar proteínas nas membranas, o gabarito foi colocado em uma caixa leve e a membrana MAGNGRAPH colocada na parte superior do gabarito. Exossomas foram isolados das culturas de células endometriais Hec-IA. Os exossomas isolados foram solubilizados e, então, precipitados usando SSA a 0,25%. As proteínas exossomais precipitadas foram, então, ressuspensas em TBS e sonicadas. Esta solução de proteína foi, então, fracionada usando uma coluna de HPLC de fase reversa C18, eluindo com um gradiente de 0-100% de acetonitrila. Os 32 picos de proteínas resultantes foram concentrados e o solvente removido por centrifugação a vácuo. Cada proteína foi ressuspensa em TBS e a concentração de proteína foi determinada. Cada solução de proteína (0,25μ1) foi manualmente carregada em um local único. Cada solução de proteína foi diluída até uma concentração inicial de 100 μg/ml em azul de bromofenol (para acompanhamento). Para cada proteína, locais de 2ng foram feitos. As membranas foram bloqueadas com 5% de BSA em Tris-HCl a 0,1 M, pH 7,6, NaCl a 0,15 M (TBS) durante 1 hora na temperatura ambiente. As membranas foram, então, lavadas 3 vezes com TBS mais 0,1% de Tween-20 e 2 vezes com TBS. As membranas foram, então, armazenadas em sacos vedados e refrigeradas até o uso.

Para teste de diagnóstico, o ensaio foi realizado com soro. Diluições (1:100) de soros de pacientes conhecidos e controles normais férteis, não grávidas, foram testados usando os arranjos de proteína presentemente revelados para definir a diluição ideal de soro, combinado com diluições de proteína alvo, para identificar pacientes com infertilidade de etiologia específica. O arranjo de membranas foi lavado com TBS-Tween-20 antes do uso e diluições seriais de 10 dobras de soro de paciente serão feitas em TBS. Os soros diluídos serão incubados com as membranas durante uma noite a 4°C. As membranas foram lavadas 3 vezes com TBS mais 0,1% de Tween-20. A membrana foi, então, incubada com IgG anti-humano conjugado com peroxidase, lavada 3 vezes com TBS, e visualizadas por ECL. O filme resultante foi reproduzido com uma câmara Kodak D290 e analisado usando software de análise Kodak para reconhecimento de local e quantificação (Figura 17). Padrões distintos de imunorreatividade foram observados. Com base neste reconhecimento diferencial de antigenos de proteína endometrial, pacientes podem ser diferenciados e diagnosticados com distúrbios de infertilidade resultantes de endometriose em relação àqueles resultantes de insuficiência ovariana prematura.

Em uma abordagem similar, mulheres experimentando perdas recorrentes de gravidez foram também examinadas quanto à presença de auto-anticorpos contra antigenos derivados de placenta, usando "Western blotting" (Figura 18) . Gravidez resulta na produção de auto-anticorpos, que resultam da mudança normal de uma resposta imune Thl para Th2. Entretanto, mulheres com perda recorrente de gravidez exibiram tanto imunorreatividade geral aumentada quanto reconhecimento de componentes únicos. Pacientes assintomáticos, que subseqüentemente apresentaram perda recorrente de gravidez, reconhecem antigenos adicionais, em pesos moleculares menores que 45.000 Daltons e maiores que 130.000 Daltons.

REFERÊNCIAS

Abu-Shakra et al., Câncer and autoimmunity: autoimmune and rheumatic features in patients with malignancies. Annals Rheum Dis 60:433-440, 2001.

Barbouche et al., Prognostic significance of autoantibodies to laminin in the sera of breast câncer patients. Europ J Clin Chem Clin Biochem 32:511-514, 1994.

Brichory et al., Proteomics-based identification of protein gene product 9,5 as a tumor antigen that induces a humoral immune response in Iung câncer. Câncer Res 61:7908-7912, 2001. Canevari et al. , Revised anti-cancer serological response: Biological significance and clinicai implications. Annals Oncol. 7:227-232, 1996.

Chinni et al. , Cathepsin D and glucose-regulated protein 78 recognized by the humoral response of ovarian câncer patients. Clin Câncer Res 3:1557-1564, 1997.

Conroy et al. , Autoantibodies to 90kD heat-shock protein in sera of breast câncer patients. Lancet 345:126, 1995.

Hellstrom et al, Principies of tumor immunity: Tumor antigens. Em: DeVita VT, Hellman S. e Rosenberg SA, eds. Biologic therapy of câncer. New York: Lippincott, 1991: 35-52.

Jung e Schluesener, J. Exp Med 173:273-276, 1991.

Kotera Y et al., Humoral immunity against a tandem repeat epitope of human mucin muc-1 in sera from breast, pancreatic and colon câncer patients.

Kutteh et al., Immunologic characterization of tumor markers in human ovarian câncer cell lines. J Soc Gynecol Invest 3:216-222, 1996.

Labrecque et al., Analysis of the anti-p53 antibody response in câncer patients. Câncer Res 53:3468-3471, 1993.

Liotta et al., Proteomic patterns in sera serve as biomarkers of ovarian câncer. Gynecol Oncol 88:S25-S28, 2003.

Lubin et al., Analysis of p53 antibodies in patients with various cancers define B-cell epitopes of human p53: Distribution on primary structure and exposure on protein surface. Câncer Res 53:5872-5876, 1993.

Merimsky et al., Antigens and antibodies in malignant melanoma. Tumour Biol 15:188-202, 1994.

Nakamura et al., Handbook of Experimental Immunology (4th. Ed. ), Weir et al. (eds), Vol. 1, Chapter 27, Blackwell Scientific Publ., Oxford, 1987.

Niklinska et al, Strong association between p53 protein accumulation, serum antibodies, and gene mutation in non- small cell Iung câncer. Folia Histochem Cytobiol 39:51-56, 2001.

Old LJ, Chen YT: New paths in human câncer serology. J Exp Med 187:1163-1167, 1998.

Peoples et al., Breast and ovarian câncer specific cytotoxic T lymphocytes recognize the same HER2/neu- derived peptide. Proc. Natl Amer Sci USA 92:432-436, 1995.

Taylor and Doellgast, Quantitation of peroxidase- antibody binding to membrane fragments using column chromatography. Analytical Biochemistry, 98:53-59, 1979.

Taylor et al., Identification of antigenic components recognized by "membrane bound" antibodies from ovarian câncer patients. Am J Reprod Immunol 6:179-184, 1984.

Patente Norte-Americana Número 3.817.837.

Patente Norte-Americana Número 3.850.752.

Patente Norte-Americana Número 3.939.350.

Patente Norte-Americana Número 3.996.345.

Patente Norte-Americana Número 4.275.149.

Patente Norte-Americana Número 4.277.437.

Patente Norte-Americana Número 4.302.534.

Patente Norte-Americana Número 4.366.241.

Patente Norte-Americana Número 4.637.988.

Patente Norte-Americana Número 4.786.594. Patente Norte-Americana Número 5.108.896.

Patente Norte-Americana Número 5.229.302.

Patente Norte-Americana Número 5.629.164.

Patente Norte-Amerieana Número 5.691.154.

Vlock et al. , Ineidenee of serum antibody reaetivity to autologous head and neck câncer cell lines and augmentation of antibody reaetivity following acid dissociation and ultrafiltration". Câncer Res 49:1361-1365, 1989.

Vogl et al. , Autoimmunity against p53 predicts invasive câncer with poor survival in patients with ovarian mass. Brit J Câncer 83:1338-1343, 2000.

Winter et al. , Development of antibodies against p53 in Iung câncer patients appears to be dependent on the type of p53 mutation. Câncer Res 52:4168-4174, 1992.

Yamamoto et al. , Infrequent presence of anti-c- myc antibodies and absence of c-myc oncoprotein in sera from Iung câncer patients. Oncology 56:129-133, 1999.

Será entendido que vários detalhes do assunto presentemente revelado podem ser alterados sem se afastar do escopo do assunto presentemente revelado. Além do mais, a descrição anterior tem apenas objetivo ilustrativo, e não objetivo limitativo.

Claims (58)

1. Método para diagnóstico de um distúrbio associado com produção de auto-anticorpo em um indivíduo, caracterizado por compreender: (a) prover uma amostra biológica compreendendo ou suspeita de compreender auto-anticorpos de um indivíduo; (b) contatar um antígeno com a amostra, onde o antígeno compreende um peptídeo imunorreativo de auto-anticorpo isolado de um exossoma; (c) detectar auto-anticorpos na amostra imunorreativa ao antígeno; e (d) comparar um nível de imunorreatividade de auto-anticorpo ao antígeno com um nível de referência para diagnosticar o distúrbio no indivíduo.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é um câncer ou um distúrbio de infertilidade.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é um câncer epitelial ou uma adenocarcinoma.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o antígeno compreende um peptídeo de antígeno de câncer selecionado do grupo consistindo de um peptídeo da família de supressor de tumor, um peptídeo de ligação a ácido nucléico, um peptídeo anti-apoptótico, um peptídeo da família do oncogene, um peptídeo "homeobox", um peptídeo de antígeno de câncer de testículo, um peptídeo da família de proteína de choque ao calor, um precursor de enzima de peptídeo da família de enzima pro-lisossomal, PLAP, um peptídeo da família de molécula de adesão, um peptídeo relacionado com adesão, e um peptídeo da família da cinase.

5. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é um distúrbio da infertilidade selecionado do grupo consistindo de insuficiência ovariana prematura (POF), síndrome do ovário policístico (PCOS), endometriose, pré-eclampsia, nascimento prematuro, restrição de crescimento intra-uterino, e perda recorrente de gravidez.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica compreende leite, sangue, soro, plasma, ascite, fluído de cisto, fluído pleural, lágrimas, urina, saliva, tecido, ou combinações dos mesmos.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um mamífero.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o exossoma é isolado de uma célula.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula cultivada.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula cancerígena.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a célula cancerígena é uma célula de câncer ovariano, uma célula de câncer cervical, uma célula de câncer da mama, uma célula de câncer endometrial, uma célula de câncer do cólon, uma célula de câncer de próstata, uma célula de câncer do pulmão, uma célula de melanoma, uma célula de câncer pancreático, ou uma célula de coriocarcinoma.

12. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula UL-I, uma célula UL-2, UL-3, ou uma célula UL-6.

13. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula placentária.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a detecção compreende uma técnica selecionada do grupo consistindo de ELISA, RIA, imunoensaio múltiplo, imunoprecipitação e mancha "Western" ["Western blotting"].

15. Método para caracterização de um distúrbio associado com produção de auto-anticorpo em um indivíduo, caracterizado por compreender: (a) prover uma amostra biológica compreendendo auto-anticorpos de um indivíduo; (b) contatar um antígeno com a amostra, onde o antígeno compreende um peptídeo imunorreativo de auto-anticorpo isolado de um exossoma; (c) detectar os auto-anticorpos na amostra imunorreativa ao antígeno; e (d) quantificar um nível de imunorreatividade de auto-anticorpo ao antígeno para, portanto, caracterizar o distúrbio no indivíduo.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é um câncer ou um distúrbio de infertilidade.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é um câncer epitelial ou um adenocarcinoma.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o antigeno compreende um peptideo de antigeno de câncer selecionado do grupo consistindo de um peptideo de família de supressor de tumor, um peptideo de ligação de ácido nucléico, um peptideo anti-apoptótico, um peptideo da família do oncogene, um peptideo "homeobox", um peptideo de antigeno de câncer de testículo, um peptideo da família de proteína de choque de calor, um precursor de enzima de peptideo da família de enzima pro-lisossomal, PLAP, um peptideo da família de molécula de adesão, um peptideo relacionado com adesão, e um peptideo da família da cinase.

19. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é um distúrbio da infertilidade selecionado do grupo consistindo de insuficiência ovariana prematura (POF), síndrome do ovário policístico (PCOS) , endometriose, pré-eclampsia, nascimento prematuro, restrição de crescimento intra-uterino, e perda recorrente de gravidez.

20. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica compreende leite, sangue, soro, plasma, ascite, fluído de cisto, fluído pleural, lágrimas, urina, saliva, tecido, ou combinações dos mesmos.

21. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um mamífero.

22. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o exossoma é isolado de uma célula.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula cultivada.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula cancerígena.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a célula cancerígena é uma célula de câncer ovariano, uma célula de câncer cervical, uma célula de câncer da mama, uma célula de câncer endometrial, uma célula de câncer do cólon, uma célula de câncer de próstata, uma célula de câncer do pulmão, uma célula de melanoma, uma célula de câncer pancreático, ou uma célula de coriocarcinoma.

26. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula UL-I, uma célula UL-2, UL-3, ou uma célula UL-6.

27. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula placentária.

28. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a detecção compreende uma técnica selecionada do grupo consistindo de ELISA, RIA, imunoensaio múltiplo, imunoprecipitação e imuno-mancha ["imuno-blotting"].

29. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é um câncer e a caracterização do distúrbio compreende a determinação de um estágio do câncer.

30. Método para detectar e/ou quantificar um nível de auto-anticorpos em um indivíduo, compreendendo: (a) prover uma amostra biológica compreendendo ou suspeita de compreender auto-anticorpos de um indivíduo; (b) contatar um antigeno com a amostra, caracterizado pelo fato de que o antigeno compreende um peptideo imunorreativo de auto-anticorpo isolado de um exossoma; e (c) detectar e/ou quantificar um nivel de auto- anticorpos na amostra imunorreativa ao antigeno.

31. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que os auto-anticorpos estão associados com um câncer ou distúrbio da infertilidade.

32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o câncer é um câncer epitelial ou um adenocarcinoma.

33. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o antigeno compreende um peptideo de antigeno de câncer selecionado do grupo consistindo de um peptideo da família de supressor de tumor, um peptideo de ligação a ácido nucléico, um peptideo anti-apoptótico, um peptideo da família do oncogene, um peptideo "homeobox", um peptideo de antigeno de câncer de testículo, um peptideo da família de proteína de choque ao calor, um precursor de enzima de peptideo da família de enzima pro-lisossomal, PLAP, um peptideo da família de molécula de adesão, um peptideo relacionado com adesão, e um peptideo da família da cinase.

34. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é um distúrbio da infertilidade selecionado do grupo consistindo de insuficiência ovariana prematura (POF), síndrome do ovário policístico (PCOS) , endometriose, pré-eclampsia, nascimento prematuro, restrição de crescimento intra-uterino, e perda recorrente de gravidez.

35. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica compreende leite, sangue, soro, plasma, ascite, fluido de cisto, fluido pleural, lágrimas, urina, saliva, tecido, ou combinações dos mesmos.

36. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um mamífero.

37. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o exossoma é isolado de uma célula.

38. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula cultivada.

39. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula cancerígena.

40. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que a célula cancerígena é uma célula de câncer ovariano, uma célula de câncer cervical, uma célula de câncer da mama, uma célula de câncer endometrial, uma célula de câncer do cólon, uma célula de câncer de próstata, uma célula de câncer do pulmão, uma célula de melanoma, uma célula de câncer pancreático, ou uma célula de coriocarcinoma.

41. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula UL-I, uma célula UL-2, UL-3, ou uma célula UL-6.

42. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula placentária.

43. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a detecção compreende uma técnica selecionada do grupo consistindo de ELISA, RIA, imunoensaio múltiplo, imunoprecipitação e mancha "Western" ["Western blotting"].

44. Kit para detecção de auto-anticorpos em uma amostra, compreendendo um antigeno de peptideo imunorreativo de auto-anticorpo e um recipiente para conter o antigeno, caracterizado pelo fato de que o antigeno é isolado de um exossoma.

45. Kit, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o antigeno é anexado a um suporte.

46. Kit, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o suporte é uma placa de microtitulação, uma membrana, uma conta de poliestireno, um tubo de ensaio, ou uma haste de imersão.

47. Kit, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado por compreender uma preparação de anticorpo que se liga a um auto-anticorpo.

48. Kit, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que a preparação de anticorpo compreende um rótulo detectável.

49. Kit, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que o rótulo detectável compreende um rádio-rótulo, uma enzima, uma biotina, um corante, um rótulo marcador fluorescente, um hapteno ou um rótulo luminescente.

50. Método para diagnosticar um distúrbio de fertilidade em um indivíduo, caracterizado por compreender: (a) prover uma amostra biológica compreendendo ou suspeita de compreender auto-anticorpos de um indivíduo; (b) contatar pelo menos um antigeno com a amostra, onde o antigeno compreende um antígeno de peptídeo que liga auto-anticorpos associados com o distúrbio de infertilidade e é selecionado do grupo consistindo de antigenos nucleares com pesos moleculares de aproximadamente 50kD e 80kD e antigenos de membrana com pesos moleculares de aproximadamente 10kD, 30kD, 45kD, 90kD e 125kD; (c) detectar auto-anticorpos na amostra imunorreativa ao antigeno; e (d) comparar um nivel de imunorreatividade de auto-anticorpo ao antigeno com um nivel de referência para diagnosticar o distúrbio de infertilidade e/ou prever um risco para o desenvolvimento do distúrbio de infertilidade no indivíduo.

51. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o distúrbio da infertilidade é selecionado do grupo consistindo de insuficiência ovariana prematura (POF), síndrome do ovário policístico (PCOS), endometriose, pré-eclampsia, nascimento prematuro, restrição de crescimento intra-uterino, e perda recorrente de gravidez.

52. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica compreende leite, sangue, soro, plasma, ascites, fluído de cisto, fluído pleural, lágrimas, urina, saliva, tecido, ou combinações dos mesmos.

53. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que os auto-anticorpos são reativos ao ovário, endométrio, placenta, ou combinações dos mesmos.

54. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um mamífero.

55. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o antigeno é isolado de uma célula cultivada.

56. Método, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que a célula cultivada é uma célula placentária.

57. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o antigeno é isolado de placenta, ovário, endométrio, ou combinações dos mesmos.

58. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a detecção compreende uma técnica selecionada do grupo consistindo de ELISA, RIA, imunoensaio múltiplo, imunoprecipitação e mancha "Western" ["Western blotting"].