BRPI0806114A2 - gel termorreversìvel de liberação sustentada contendo extrato padronizado de própolis ( epp -af) e respectivo processo de fabricação, com atividade anti- séptica e cicatrizante para tratamento de queimaduras, lesões de pele e outros - Google Patents

Abstract

Gel. termorreversível de liberação sustentada contendo extrato padronizado de própolis (EPP-AF) e respectivo processo de fabricação, com atividade anti-séptica e cicatrizante para tratamento de queimaduras, lesões de pele e outros.Refere-se a presente invenção a um processo de obtenção de gel termorreversível de liberação sustentada contendo extrato padronizado de própolis (EPP-AF), aos géis propriamente ditos, suas características físicas, atividades e suas utilizações terapêuticas, sendo que o processo utiliza como matéria-prima, um co- polimero em bloco e o extrato padronizado de própolis, que assegura uma composição química e atividade biológica dentro dos limites de aceitabilidade especificados e estável em todos os lotes, garantindo a eficácia terapêutica frente as atividades antimicrobiana frente a microrganismos gram positivos e gram negativos, cicatrizante e regeneradora de tecidos, e ainda, a segurança das mesmas. Os géis termorreversíveis, que se apresentam sob a forma liquida quando a baixas temperaturas e na forma de gel quando a temperaturas mais elevadas (geleificação in situ), são usados no combate às doenças que se caracterizam por infecções microbianas, queimaduras e feridas, etc., tendo sido avaliados em fase pré-clínica e clínica, em função das atividades biológicas: atividade antimicrobiana frente a microrganismos gram negativos, gram positivos, antiinflamatória, cicatrizante e regeneradora de tecidos, podendo ser empregado como produtos de uso tópico para tratamento de queimaduras, ferimentos, acne, lesões de pele em geral, na indústria farmacêutica, cosmética, odontológica e veterinária. Sob apresentações diversificadas como na forma líquida, emplastros, géis, spray, dentre outras em função de sua característica de termorreversibilidade.

Description

Gel termorreversível de liberação sustentada contendo extrato padronizado deprópolis (EPP-AF) e respectivo processo de fabricação, com atividade anti-sépticae cicatrizante para tratamento de queimaduras, lesões de pele e outros.

Refere-se a presente invenção a um gel termorreversívelcontendo extrato padronizado de própolis (EPP-AF) para tratamento de queimaduras eoutras lesões, que se caracterizam por danos à pele, infeccionadas ou não, em funçãodas atividades biológicas propostas para o produto, quais sejam: atividade cicatrizante,antimicrobiana frente a microrganismos gram negativos e gram positivos, antioxidante,antimutagênica, antiinflamatória, analgésica, regeneradora de tecidos, podendo seraplicado à área lesada diretamente na forma de gel ou na forma líquida quando a baixastemperaturas, sendo que no último caso, gelificando in situ.

Ferimentos são uma das principais causas de morbídade eprejuízo da qualidade de vida e têm consumido parte substancial dos recursos de saúdeem países desenvolvidos. A cada ano nos Estados Unidos, mais de 1,25 milhões depessoas sofrem queimaduras, e 6,5 milhões têm úlceras cutâneas crônicas causadas porpressão, estase venosa, ou diabetes mellitus (CHABY, G. et al., 2008).

Anualmente no Reino Unido 250 mil pessoas sofremqueimaduras, 175 mil são atendidas em unidades de emergência, 13 mil sãohospitalizadas, 1.000 necessitam medidas de ressuscitação hidroeletrolítica, e 300evoluem para óbito. Entretanto, os números são muito mais alarmantes nos países emdesenvolvimento, por exemplo, o Nepal, onde a mortalidade pode atingir 17 vezes oíndice britânico (VALE, 2005).

Segundo a Sociedade Brasileira de Queimaduras, no Brasilacontece um milhão de casos de queimaduras a cada ano, 200 mil são atendidos emserviços de emergência, e 40 mil demandam hospitalização. As queimaduras estão entreas principais causas externas de morte registradas no Brasil, perdendo apenas paraoutras causas violentas, que incluem acidentes de transporte e homicídios. Estudoconduzido no Distrito Federal demonstrou taxa de mortalidade de 6,2% entre osqueimados internados em hospital de emergência (VALE, 2005).

As queimaduras são provocadas por agentes físicos(temperatura, radiação e eletricidade) e químicos (ácidos e álcalis), e encontram seugrau de gravidade na dependência direta do tempo de exposição ou concentração doagente causai (SOUZA, et al. 1990).

A pele íntegra é a primeira e principal barreira contra ainvasão bacteriana, mas em pacientes queimados a pele está destruída, econseqüentemente o tecido subjacente exposto é um excelente meio para odesenvolvimento bacteriano (SOUZA, et al., 1990). A ferida ocasionada pela queimadura(proteína coagulada) é meio de cultura ideal para o desenvolvimento de bactérias. Aocorrência de infecções é, portanto, um dos maiores problemas em queimaduras,ressaltando-se que a septicemia está envolvida em cerca de 50% das mortesdecorrentes de lesões por queimaduras. A densidade de microrganismos presentes nasuperfície cutânea é controlada por vários fatores, dentre os quais o pH ácido dasuperfície pela presença de ácidos graxos, que inibem a proliferação bacteriana. Porém,as queimaduras transformam a pele em ambiente seco e destroem as camadasqueratinizadas contendo ácidos graxos, aumentando assim o pH, e favorecendo aproliferação de microrganismos.

A importância clínica das lesões de pele tem suscitado porparte de vários laboratórios a obtenção de produtos no intuito de abreviar o período decicatrização e promover o conforto do paciente, sobretudo, pelo alívio da dor. Entre estesprodutos encontram-se soluções anti-sépticas, quimioterápicos, películas biológicas etambém sintéticas, geralmente todas de uso tópico (CABRAL ET AL., 1987; WOUK et al., 1998).

O tratamento de feridas crônicas envolve a aplicação devários materiais (hidrocolóides, hidrogéis, membranas sintéticas ou biológicas)(WOJCIECHCZAJ et al. 2006; CZAJA, et al., 2007). Entretanto, a maior parte dessescurativos são importados, apresentam elevado valor agregado, o que encarececonsideravelmente o processo de tratamento. A tabela 01, parcialmente extraída deCZAJA, et al. (2007), apresenta algumas características de curativos de diferentesempresas, os quais têm sido comercializados nos dias de hoje.

Tabela 01: Tratamentos de Pele para Queimaduras e Feridas Crônicas.

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Por muitas décadas o tratamento de afecções e/ou lesõesda pele, agudas ou crônicas, vêm sendo realizado por meio de formas farmacêuticasconvencionais como as pomadas, os cremes, as loções, os géis e as soluções tópicas.

Estas formas correspondem aos produtos farmacêuticos mais prescritos e sãoconhecidos por promover liberação imediata do fármaco veiculado, além de seus efeitosfísicos como protetores, cicatrizantes, umectantes e emolientes. Dessa forma, paramanter o fármaco na concentração terapêutica torna-se necessário a administraçãoreiterada. (CHIEN, 1992; ANSEL, 2000).

Assim, sistemas capazes de modificar a liberação dofármaco proporcionando a liberação em quantidades adequadas e em um determinadosítio estão sendo estudados, visto que possuem vantagens sobre os sistemasconvencionais tais como a manutenção de níveis terapêuticos ótimos com mínimo deflutuações, a redução dos efeitos colaterais, a diminuição da freqüência de dosagem e odirecionamento do fármaco para sítios de ação específicos (MADAN, 1985).

MADAN (1985) define os sistemas de liberação sustentadacomo formas farmacêuticas que liberam rapidamente uma fração da dose total levandoa uma resposta terapêutica rápida, e posteriormente mantém esta resposta por umperíodo de tempo prolongado.

Para facilitar a veiculação do fármaco por diferentes vias deadministração, formas farmacêuticas deverão ser formuladas e produzidas. Cada formafarmacêutica deve conter princípio ativo e também outras substâncias que permitam aobtenção do medicamento e proporcionem a administração e o alcance do efeitoterapêutico desejado.

Os copolímeros de polioxietileno e polioxipropileno,conhecidos como Poloxamer ou Pluronic®, têm sido muito utilizados na indústria comoagentes dispersores, estabilizadores para sistemas emulsivos e solubilizantes. Trata-sede um copolímero não-iônico constituído de cadeias de polioxietileno e polioxipropileno.

Possui 70% de óxido de etileno e 30% de óxido de propileno e massa molecularcorrespondente à 12500 Daltons. A sua fórmula molecular é [HO(CH2-CH2-0)106-(CH(CH3)-CH2-0)70-(CH2-CH2-0)106H] podendo ser classificado quimicamente comoum poliéter-álcool. O polímero possui caráter anfifílico, uma vez que possui uma cadeiade poli-óxido de propileno com caráter hidrofóbico e duas cadeias de poli-óxido de etilenocom caráter hidrofílico. É um sólido branco com ponto de fusão correspondente a 56 0C1solúvel em água e capaz de formar um gel firme na concentração de 20% p/p a 25 0C(SCHMOLKA, 1972).

As soluções concentradas do copolímero apresentamgeleificação termorreversível por ação da temperatura. Em solução aquosa a 20% p/p ecom o aumento da temperatura, o copolímero agrega-se em micelas para minimizar aenergia livre da solução e muitos estudos têm sido realizados na tentativa de elucidaresse processo de formação de micelas. Em temperaturas baixas (5 0C) o polímero existecomo um unímero livre em solução aquosa e com o aumento da temperatura estabelece-se um equilíbrio entre unímeros e micelas.

Em temperaturas mais altas, como atemperatura corporal (37 0C) formam-se agregados de micelas aumentando aviscosidade, que passa de uma solução para um gel firme. As micelas apresentam umaestrutura esférica, onde a cadeia central de oxido de polipropileno (OPP) localiza-se nointerior da micela, devido ao seu caráter hidrofóbico, e as duas cadeias laterais de óxidode polietileno (OPE) localizam-se no exterior da micela devido ao seu caráter hidrofílico(CABANA et al., 1997). As propriedades de termorreversibilidade e a atoxicidade temtornado estes copolímeros bastante atrativos na formulação de géis para aplicaçãotópica, transdérmica, parenteral, oftálmica, considerando a possibilidade destesmodificarem a liberação.

As principais características de um substituto ideal da pelesão: aderência, permeabilidade ao vapor de água, elasticidade, durabilidade, constituiruma barreira às bactérias, não ser antigênico, ter ação hemostática, ser de fácilaplicação e manuseio e, finalmente, ser de baixo custo (WOUK et al., 1998).

Infecções em feridas de queimaduras dificultam acicatrização e a evolução para a cura. Vários estudos descrevem Staphylococcus aureus,Pseudomonas aeruginosa e Enterobactérias como patógenos importantes em feridascirúrgicas e de queimaduras. Muito embora, as infecções de ferimentos de queimadurascausadas por S. aureus são as mais comuns e freqüentemente resultam em choquetóxico (BAGDONAS et al., 1993). Assim, terapia antibacteriana tópica assume papeldecisivo no controle das infecções, pois a destruição vascular ocorrida nas lesões temcomo conseqüências a diminuição dos mecanismos de defesa humoral e celular na áreaqueimada, e ainda a redução da eficácia dos antibacterianos sistêmicos, pela redução dotransporte dos antibióticos ao local da infecção.

Na terapia para queimaduras, já foram empregados: nitratode prata, na forma de solução aquosa a 0,5%, iodopovidona, em pomadas a 10%,mafenida, na forma de creme a 10%p/v, ácido acético na concentração de 5% v/v,hipoclorito de sódio na concentração de 0,25%, clorexidina, na forma de creme a 0,2%p/p, gentamicina na forma de creme ou pomada a 0,1% p/p (DASS, et al. 1997), mas,merece destaque a nitrofurazona e a sulfadiazina de prata.

A nitrofurazona é usada em creme na concentração de0,2% p/p, frente aos microrganismos Staphylococcus aureus, Escheriehia eoli,Enterobaeter eloaeae e Proteus spp, porém não possui atividade frente a Pseudomonasaeruginosa ou fungos. Esta substância ativa tem seu efeito reduzido na presença desangue e matéria orgânica. Apresenta reações de sensibilização, em cerca de 0,5 a2,0% dos pacientes, e isto às vezes, dentro de poucos dias da aplicação inicial. Éutilizada para promover rápida cicatrização de ferimentos e locais de enxertos da pele epara a prevenção de aderências peritoniais. Já a sulfadiazina de prata, é empregada naconcentração de 1% p/p, em emulsões tópicas óleo em água, apresentando consagradouso na profilaxia e tratamento de infecções. Apresenta amplo espectro de ação, incluindobactérias gram positivas e negativas, fungos, protozoários e vírus. Esta substânciaapresenta pouca solubilidade em água, apresentando limitada absorção. Em pHfisiológico se dissocia lentamente liberando a sulfadiazina e íons prata, que exercem suaação separadamente. Com relação às reações adversas, 2,5% dos pacientes podem seracometidos com sintomas que variam, como sensação de queimadura, urticária, prurido,nefrite, eritema multiforme, necrose cutânea e Ieucopenia (DASS, et al. 1997).

Nas últimas décadas foi possível observar um interessecada vez maior pelas medicinas e terapias naturais. Os produtos obtidos de abelhas daespécie Apis mellifera como a própolis, têm apresentado grande aceitação,principalmente pelas suas propriedades terapêuticas.

A própolis é elaborada pelas abelhas a partir de resinasvegetais e exsudatos. As abelhas transportam esta matéria-prima para dentro da colméiae adicionam secreções próprias, com enzimas existentes em sua saliva (KOO & PARK11996; BURDOCK, 1998; CASTALDO & CAPASSO, 2002 ; RUSSO, et al. 2002). Aprópolis é uma substância resinosa, que possui coloração e consistência intimamenterelacionada à flora visitada pelas abelhas (KOO & PARK, 1996) e a estação na qual écoletada (SANTOS, 2003).

A variação da composição química da própolis estárelacionada com sua origem botânica, sendo também a proporção das substânciasdependente dessa variação, porém trabalhos de SFORCIN, et al.[26 e 27] jádemonstraram que as atividades antimicrobianas frente a Staphyloeoeeus aureus eEseheriehia eoli, bem como a atividade imunomoduladora, não variaram com a época dacolheita da mesma. De qualquer forma, as concentrações dos constituintes ativosmerecem atenção e controle e desta forma, o emprego de extratos padronizados é itemimprescindível para a obtenção de medicamentos de origem natural (BERRETTA, 2003).

A própolis tem sido usada como um agente terapêutico pelapopulação mundial desde os tempos de Hipócrates. Já se sabe que o extrato etanólicode própolis apresenta algumas atividades farmacológicas, como a antimicrobiana,antiviral, antifúngica, antiinflamatória, anestésica e citostática. Um grande número detrabalhos têm demonstrado a atividade antimicrobiana da própolis contra váriosmicrorganismos patogênicos [29], destaca-se também a atividade antifúngica,especialmente em relação a várias espécies de Candidal inclusive da C. albicans in vitro[30] e in vivo , como demonstrado nos trabalhos de candidíase oral em pacientes daFaculdade de Odontologia de Ribeirão Preto (FORP-USP) [28] e em pacientes aidéticos [29].

Atualmente mais de 300 compostos, principalmentepolifenóis, têm sido identificados como constituintes da própolis [28], A maioria dospolifenóis são flavonóides, seguidos pelos ácidos fenólicos e ésteres, aldeídos, cetonas eoutros (CASTALDO & CAPASSO, 2002). As propriedades farmacológicas da própolissão principalmente atribuídas a presença dos flavonóides. A opinião prevalecente é quea nítida atividade biológica dos flavonóides é, em parte, a capacidade de proteção contraação agressiva dos radicais livres (RUSSO, et al. 2002).

As propriedades cicatrizantes do extrato de própolis em usotópico foram demonstradas em coelhos albinos e ratos sem pêlo (ARVOUET-GRAND etal. 1993), onde se determinou que a concentração ideal de substância ativa para este fimé de 4% p/p, ou seja 5% p/p de extrato glicólico de própolis a 80% de substância ativa. Atoxicidade subaguda e a irritação cutânea primária também foram investigadas, sendoque a DL5O foi maior do que 7,34 g/Kg e os animais não apresentaram irritação cutâneanas condições experimentais (ARVOUET-GRAND et al. 1993).

Mais especificamente, a presente invenção se refere aoproduto, suas propriedades e aplicações, sendo: géis termorreversíveis de liberaçãosustentada contendo extrato padronizado de própolis (EPP-AF) para tratamento dequeimaduras, feridas, acne e demais ferimentos que requeiram atividade anti-séptica ecicatrizante, em função das atividades biológicas demonstradas para o produto nosestudos pré-clínicos e clínicos de eficácia e de segurança pré-clínica. Os géis "in questio"apresentam-se na forma física líquida quando a baixas temperaturas e gelificação "insitu", são estáveis física e quimicamente (marcadores característicos do extratopadronizado de própolis utilizado) comportamento reológico caracterizado comoviscoelástico e cinética de liberação de pseudo ordem zero (Modelo Higuchi).

Para facilitar o entendimento da presente invenção sãoanexadas as seguintes figuras:

- Figura 1: Perfil cromatográfico do extrato padronizado de própolis (EPP-AF) obtidos porCLAE: (1) ácido p-cumárico, (2) aromadendrina, (3) drupanin, (4) artepilin C e (5)baccharina. A análise cromatográfica realizada num tempo total de 60 minutos iniciou-secom um gradiente envolvendo mistura de ácido acético, acetato de amônio emmetanol/água e acetonitrila, finalizando com 100% de acetonitrila com fluxo de 1,0mL/min

- Figura 2: Temperatura de transição sol-gel para as amostras estudadas: efeito dapresença do extrato de própolis.

- Figura 3: Valores de viscosidade em função de diferentes tensões de cisalhamento paraas amostras;

- Figura 4: Valores de viscosidade em função de diferentes temperaturas para asamostras;

- Figura 5: Comportamento viscoelástico caracterizado pelo módulo elástico e móduloviscoso apresentado para as amostras;

- Figura 6: Apresentação da freqüência de eritrócitos policromáticos micronucleados(PCEMNs) nos tratamentos agudo, subagudo e subcrônico;

- Figura 7: Apresentação do tempo de cicatrização das queimaduras dos pacientestratados; com a distribuição média dos pacientes (n=31, independente da quantidade deproduto aplicado) por grupos (áreas) e tempo médio para cicatrização das áreas compomada de furacin e gel termorreversível contendo extrato padronizado de própolis

Adicionalmente ainda é apresentado o anexo A com asseguintes fotografias:

Seqüência 1 - Apresentação do corte histológico das áreas tratadas com géistermorreversíveis contendo Extrato padronizado de Própolis; apresentando processocicatricial com 3 dias de tratamento, com gel a 2,4 e 3,6% de extrato seco de própolis,onde : A) Lesões tratadas com gel de própolis a 2,4%. Fechamento da lesão na regiãoepitelial (1) e na região subcutânea (2) observa-se um grande número de fibroblastossintetizando fibras colágenas (Cortes 6 μητι corados com Tricrômico de Masson. Aumentode 100x) B) Lesões tratadas com gel de própolis a 2,4%. Na região subcutânea (2)observa-se aumento de fibras colágenas e um grande número de células em mitose(Cortes 6 pm corados com Tricrômico de Masson. Aumento de 400x); e C) Lesõestratadas com gel de própolis a 3,6%. Área do ferimento totalmente reconstruída, oepitélio (1) já se apresenta em várias camadas formando a região córnea. Na regiãosubcutânea (2) observa-se fibras colágenas B (Cortes 6 μιτι corados com Tricrômico deMasson. Aumento de 400x).

Seqüência 2 -: Exemplo da cicatrização das áreas tratadas com o gel termorreversívelcontendo extrato padronizado de própolis, com fotografias de área doadora do grupo Ill(membros inferiores) com espessura do enxerto de 8,0 milésimos de polegada e 10,9 mLdo produto em uma tira de rayon numa área ocluida por 24 horas, onde (A) e (B) são oregistro fotográficos após 48 horas da abertura do curativo, sendo 11A própolis, 11Bfuracin, 12A furacin, 12B própolis, 13A própolis e 13B furacin e (C) e (D) são fotos com 9dias após cirurgia onde se percebe que as áreas contendo própolis (11a, 12B e 13 A)estão sem o rayon, demonstrando que houve reepitelização já no nono dia após acirurgia, enquanto que as áreas contendo furacin (11B1 12a, 13B) ainda não sedesprenderam, sinalizando que ainda não está cicatrizado.

O processo de obtenção dos géis termorreversíveiscontendo extrato padronizado de própolis, um dos objetos da presente invenção,compreende as etapas de:

(a) Caracterização física e química do Extrato Padronizado de Própolis na forma glicólicae na faixa de concentração de 27,0 a 33,0% p/v de resíduo seco, sendo a caracterizaçãoquímica realizada por cromatografia líquida de alta eficiência;

(b) Dispersão do co-polímero em bloco na faixa de 1,0 a 20,0% em água purificada, sobagitação constante a frio ou a quente, após adequada hidratação do mesmo pelo períodode até 48 horas;

(c) O extrato glicólico padronizado de própolis é utilizado nas concentrações de 4,0 a12,0% p/v, acrescidos de óleo de rícino hidrogenado e etoxilado 400E, nasconcentrações de 2,0 a 10,0% p/v, conforme o caso, adequadamente homogeneizados(fase A);

(d) Após a adequada dispersão do co-polímero em água, adiciona-se ou não oconservante (conforme o caso) e homogeneíza-se (fase B);

(e) Verte-se a fase B sobre a fase A (previamente resfriada ou aquecida conformerealizado com a dispersão do polímero), homogeneíza-se completamente;

(f) mantendo a temperatura prévia (baixa ou alta), completa-se o volume com águapurificada e homogeneíza-se completamente.

(g) submete-se as preparações obtidas às análises físico-químicas e microbiológicas dequalidade para o produto assim obtido.

Os géis obtidos com a adição de EGP 30% em formulaçõesconstituídas pelo co-polímero em bloco, apresentaram-se límpidos, de coloração âmbar,na forma física líquida quando a baixas temperaturas, e geleificados, a temperaturacontrolada de 25 °C, para os géis contendo 2,4 e 3,6% p/v de extrato seco de própolis.

Os estudos de caracterização reológica das formulações demonstraram que as amostrasapresentaram propriedades viscoelásticas e que a liberação seguiu uma cinética deordem-zero. As três preparações obtidas apresentaram estabilidade química, física emicrobiológica, sendo a avaliação realizada durante seis meses, em câmara climática a40 0 ± 2 0C e 75 ± 5% UR. As preparações devem apresentar atividade antimicrobianafrente a Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa, obtendo comoconcentração inibitória mínima, respectivamente, 50 pg/mL e 200 pg/mL quandoavaliadas por técnica de microdiíuição em microplaca. Os géis não apresentam potencialgenotóxico nos tratamentos agudo, sub-agudo e sub-crônico. E ainda, quandopreparados de acordo com as Boas Práticas de Fabricação, apresentam contagemmicrobiana e fúngica dentro dos.limites especificados, sendo eles: máximo de 104 UFC/g(unidades formadoras de colônias) para bactérias totais e máximo de 5 χ 103 UFC/g parafungos totais, sendo que deverá estar isento de patógenos, conforme metodologiafarmacopéica vigente.

Para as propostas da presente invenção, o produto poderáser utilizado diretamente nas áreas afetadas na forma de gel quando em temperaturaambiente, ou na forma líquida, através de embalagens na forma de spray, por exemplo,quando a temperaturas baixas (frio). Ainda, o produto pode embeber gazes ou curativoscomo rayon, podendo ser aplicado nas queimaduras de até segundo grau ou terceiro,podendo a área lesada permanecer aberta ou fechada com outros curativos, como gazepara queimados, por até 24 horas. Além disso, poderá ser aplicado em feridas crônicas,na forma sol-gel, em acne ou lesões que requeiram a assepsia e cicatrização. Produtopara uso tópico.

Em outra concretização particular da invenção, o gel poderáser acrescido de outras concentrações de extrato padronizado de própolis, podendo seraplicado para outras atividades terapêuticas, como em odontologia, cirurgia plástica, usooral, dentre outras.

Vantajosamente a presente invenção poderá ser empregadana indústria farmacêutica e cosmética, de modo superior aos demais produtos existentesno mercado, uma vez que a presente invenção foi avaliada quanto aos caracteres físico-químicos, microbiológicos e biológicos. Assim todos os exemplos apresentados foramestudados com o objeto da presente invenção, justificando-se assim todas asreivindicações.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1

Os géis termorreversíveis obtidos com a adição de EGPcom teor de extrato seco de 27 a 30% em formulações constituídas pelo co-polímero embloco, apresentaram-se límpidos, de coloração âmbar, na forma física líquida quando abaixas temperaturas, e geleificados, a temperatura controlada de 25 0C, apresentando-secom 2,4 e 3,6% p/v de extrato seco de própolis, estáveis física, química emicrobiologicamente. Os produtos poderão ser utilizados diretamente nas áreas afetadasna forma de gel quando em temperatura ambiente, ou na forma líquida, através deembalagens na forma de spray, por exemplo, quando a temperaturas baixas (frio). Ainda,o produto pode embeber gazes ou curativos como rayon, podendo ser aplicado nasqueimaduras de até segundo grau ou mais, podendo a área lesada permanecer abertaou fechada com outros curativos, como gaze para queimados, por até 24 horas. Alémdisso, poderá ser aplicado em feridas crônicas, na forma sol-gel, em acne ou lesões querequeiram a assepsia e cicatrização, e além do uso farmacêutico, propõe-se ainda o usona área cosmética, odontológica e veterinária. Os géis termorreversíveis são para usotópico.

EXEMPLO 2

Caracterizou-se física e quimicamente as fórmulasestudadas, sendo que as mesmas foram avaliadas a reologia das preparações,viscosidade frente a diferentes graus de cisalhamento e temperatura, atividadeantimicrobiana, estabilidade, estudos de eficácia pré-clínica, estudo de segurança pré-clínica e eficácia clínica.

A Identificação e a Quantificação dos marcadores químicosno extrato padronizado foi realizada por meio de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência(CLAE), conforme a seguinte metodologia:

a) preparação das amostras: 100 μί do extrato padronizado de própolis da presenteinvenção são diluídos para 1 mL em metanol.

b) tratamento prévio das amostras: centrifugação a 13000 rpm, durante 5 minutos efiltração em filtro de 45 mm.

c) fase móvel: gradiente multilinear desenvolvido, apresentado na tabela a seguir:

Tabela 2 - Gradiente multilinear de eluição para análise qualitativa em CLAE de extratosde própolis.

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Onde Bomba A: 93,9% água + 0,8% de ácido acético + 0,3% de acetato de amônio + 5%metanol; Bomba B: acetronitrila

Fluxo: 1 mL/min; Detecção: UV 280 e 320 nm.

Os tempos de retenção em minutos dos marcadoresestudados nas matérias-primas e produtos acabados são: ácido cinâmico (5,9 min.);aromadendrina 4'-metil-éter (20,7 min.); drupanin (26,2 min.); isosakuranetina (35,6min.), artepelin C (55,2 min) e baccharina (58,3 min).

Para comprovar que as formulações termorreversíveiscontendo extrato padronizado de própolis (EPP-AF) da presente invenção resiste acondições drásticas de temperatura de umidade, iniciamos um estudo de estabilidadeacelerado 40°C ± 2°C e UR de 75% ± 5%. O teste de estabilidade proposto, submete osprodutos a condições de tensão que desafiam sua estabilidade, sendo uma ferramentaútil para predizer a viabilidade do produto (Rieger, 1996). A estabilidade dos extratos seráavaliada de acordo com o programa de estabilidade proposto pela ANVISA (AgênciaNacional de Vigilância Sanitária) na Resolução 391, de 9 de agosto de 1999, onde sepropõe que as formulações sejam submetidas à estufa (40°C ± 2 - Umidade Relativa75% ± 5) pelo período de seis meses sendo realizadas as análises em 0, 30, 60, 90 e180 dias. Estas formulações, após a aplicação das condições de tensão, serãoanalisadas para detecção de alterações nas suas características físico-químicas,mediante os ensaios físicos e químicos, como a quantificação de seus marcadores.

Como já mencionado previamente os produtos objetos dapresente invenção, os géis termorreversíveis de liberação sustentada contendo ExtratoPadronizado de Própolis (EPP-AF), foi proposto pela sua característica sol-gel, queproporciona utilização inédita de um produto para queimaduras na forma líquidapulverizada quando a baixas temperaturas, que geleifica "in situ" ao entrar em contatocom a pele (temperatura corporal), utilidade que proporciona analgesia pela propriedadefísica do produto, e atividade antimicrobiana e cicatrizante em função da inclusão doextrato padronizado de própolis (EPP-AF), um produto com aplicação inédita esurpreendente, que pode ainda ser empregado diretamente na temperatura ambiente naforma de um gel, podendo ser comercializado embalado em bisnagas ou outrasapresentações.

Para sustentar as atividades biológicas propostas para osgéis termorreversíveis contendo extrato padronizado de própolis (EEP-AF), um dosobjetos da presente invenção, apresentamos os dados para algumas das atividadespropostas, como a atividade antimicrobiana e cicatrizante.

EXEMPLO 3: Atividade Antimicrobiana

Para a avaliação da atividade antimicrobiana do extratopadronizado foi utilizado o método de difusão em ágar (KUJUMGIEV, 1999). Osmicrorganismos utilizados como teste são Micrococcus Iuteus - cepa ATCC 9341 eStaphylocoeeus aureus - cepa ATCC 25923. A atividade antimicrobiana é medida atravésda formação do halo de inibição sobre uma camada de ágar, após incubação por 72horas a temperatura de 37°C.

Para a avaliação da atividade antimicrobiana dasformulações termorreversíveis o método de difusão em ágar (KUJUMGIEV, 1999) não éadequado, já que as mesmas não se difundem adequadamente, oferecendo um falsoresultado. Assim, determinou-se a concentração inibitória mínima (CIM) das fórmulasfrente aos microrganismos Staphylocoeeus aureus - cepa ATCC 25923 e Pseudomonasaeruginosa, através de microdiluição em microplacas. A CIM foi determinada utilizando oreagente cloreto de trifeniltetrazólio, que cora na presença de células viáveis. Emmicroplacas esterilizadas de 96 orifícios foram depositados um total de 100 μΙ_ da misturaenvolvendo: Müller Hinton Broth (DIFCO), soluções do gel contendo 3,6% de extratoseco de própolis (GEP) (diluições 1:2; 1:4 e 1:8) e suspensões dos microrganismospreparadas a aproximadamente 4,8 χ 103 UFC/mL. Foi determinada a concentraçãoinibitória mínima do gel que inibiu o crescimento em uma menor concentração, utilizando-se o método de microdiluição em microplaca (FURTADO et al., 2002; LAI et al., 2004;SILVA et al., 2004; ANDREWS, 2001), sendo obtido a CIM de 50 pg/mL para S. aureus e200 Mg/mL para P. aeruginosa.

EXEMPLO 4: Estudo da Atividade Cicatrizante "in vivo" - pré-clínico

Os produtos apresentados no exemplo 6 foram estudados,quanto à capacidade de cicatrização de feridas e queimaduras, em modelo experimentalanimal (ratos Wistar) frente aos controles. Foram estudados dois protocolosexperimentais, sendo um com aplicação única do produto e outro com reaplicações de 12em 12 horas. Os animais foram sacrificados com 3 dias de experimento para avaliaçãohistológica das lesões, que foram efetuadas com auxílio de um punch. Um dos controles(sem aplicação de nenhum produto) foi acompanhado e seu sacrifício ocorreu quando dacicatrização aparente da lesão, que se deu com 7 dias de experimento. Os resultadosencontrados mostraram que os produtos se mostraram eficazes na formação do tecidode reepitelização, sendo que se observou um tecido muito bem organizado e fechandoem torno de 80% da lesão. Observamos que houve uma intensa proliferação defibroblastos nas áreas lesadas, sugerindo que o processo cicatricial com a utilizaçãodeste produto se dá via estas células.

EXEMPLO 5: Análise do Potencial Mutagênico e citotoxicidade dos produtos - segurançapré-clínica

Os géis termorreversíveis foram estudados, quanto aopotencial mutagênico, em modelo de micronúcleos de células do sangue periférico deratos wistar. Foram avaliados três protocolos, sendo em um deles aplicação única dosprodutos, em outro sete dias de aplicação diária do produto e por último a aplicaçãodiária do produto por 30 dias de estudo. As aplicações do produto foram feitas em regiãolesada com um punch, com dimensões conhecidas. Aplicaram-se os produtos, umcontrole negativo e um controle positivo empregando-se agente genotóxico(clastrogênico). Após a coleta do sangue dentro do período estipulado em cadaexperimento, foi efetuada contagem dos micronúcleos em 2.000 células (n=3). Osresultados encontrados mostraram que os géis termorreversíveis contendo extratopadronizado de própolis não apresentaram atividade mutagênica. Ainda, foi avaliado oíndice de divisão celular (IDN) demonstrando que o mesmo não foi alterado,demonstrando que o produto não é citotóxico. Assim, podemos afirmar que os produtosestudados não apresentam potencial mutagênico nem citotoxicidade.

EXEMPLO 6: Avaliação do tempo de cicatrização de pacientes queimados - PesquisaClínica de Eficácia

termorreversíveis contendo extrato padronizado de própolis (EPP-AF) foi realizadoEstudo Clínico de Eficácia comparando o mesmo com pomada de nitrofurazona(Furacin®). O estudo foi realizado na Unidade de Queimados do Hospital das Clínicas deRibeirão Preto - HCFMRP/USP. O produto foi aplicado em áreas doadoras de pacientesqueimados, sendo que as mesmas simularam queimaduras de segundo grau. Paraobtenção de tais áreas utilizou-se Dermátomo de Padget, com enxertos de pele comespessuras que variaram de 8 a 12 milésimos de polegada. As áreas tratadasabrangeram couro cabeludo, membros superiores e inferiores. A aplicação do produto foirealizada nas áreas doadoras no momento da cirurgia, sendo que o mesmo foiimpregnado em rayon ou gaze. Estudou-se a atividade cicatrizante através do temponecessário para a cicatrização das áreas. O curativo que se desprendeu primeiro,demonstrou cicatrização mais rápida. Assim, os resultados encontrados demonstraramque os géis termorreversíveis contendo extrato padronizado de própolis mostraram-setão eficazes quanto o medicamento referência utilizado na unidade de queimados. Dadosisolados mostraram que áreas tratadas com o gel de própolis cicatrizaram com 2 a 3 diasde antecedência dos tratados com o medicamento referência, dados que não mostraramdiferença estatística, porém, com o aumento do número de pacientes tratados, é possívelque se possa demonstrar diferença estatística a favor do produto termorreversível deliberação sustentada contendo própolis.

Seguem abaixo as tabelas com o resumo dascaracterizações e testes efetuados:

Tabela 3 - Caracterização do Extrato Padronizado de Própolis (EEP e EGP), utilizadosno presente estudo. Os resultados correspondem a média de três determinações e estãoexpressos como a média ± desvio padrão).

<table>table see original document page 14</column></row><table>Tabela 4: Valores de viscosidade (Pas) obtida em função das diferentes tensões decisalhamento (1/s).

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Tabela 5 - Resultados obtidos para a liberação da própolis (expressa no marcador DPB1em % de liberação) nas formulações desenvolvidas GEL 01, GEL 02 e GEL 03.

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* SEM: Erro padrão da média (± )n=2

Tabela 6 - Parâmetros cinéticos calculados para avaliação do processo de liberação daprópolis (expresso no marcador DPB) nas formulações desenvolvidas GEL 01, GEL 02 eGEL 03.

Modelo Estudado

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Tabela 7 - Resultados obtidos na avaliação "in vitro" de atividade antimicrobiana atravésde técnica de difusão em ágar (mm) para os extratos avaliados e da concentração deprópolis utilizada nos géis (n=3).

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As médias com letras diferentes diferiram estatisticamente entre si (p < 0,05).Tabela 9 - Porcentagem de PCEMNs e IDN (índice de divisão nuclear) obtidas emsangue periférico de ratos Wistar machos submetidos ao tratamento agudo, subagudo ecrônico com géis contendo diferentes concentrações de própolis para queimadura, eseus respectivos controles.

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Tabela 10 - Informações sobre a população utilizada no estudo dos medicamentos,furacin e gel termorreversível contendo 3,6% de extrato padronizado de própolis.

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(*) Uma vez que todos os pacientes receberam o medicamento convencional (furacin) e omedicamento teste (gel termorreversivel contendo 3,6% de extrato seco de própolis), apopulação foi a mesma para os dois grupos avaliados.

Tabela 11 - Distribuição média dos pacientes por grupos (áreas), espessura média depele retirada, quantidade de produto administrado e tempo médio para cicatrização nasáreas com pomada de furacin e gel termorreversivel contendo extrato padronizado deprópolis.

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(*) média dos resultados utilizando o total de pacientes estudados (31), independente daquantidade de produto aplicado e a oclusão da área (10 mL e 20 mL do produto).

Claims (13)

1. Processo de obtenção dos géis termorreversíveiscontendo extrato padronizado de própolis (EPP-AF), caracterizado por compreender asetapas de:(a) Caracterização física e química do Extrato Padronizado de Própolis (EPP-AF) naforma glicólica e na faixa de concentração de 27,0 a 33,0% p/v de resíduo seco, sendo acaracterização química realizada por cromatografia líquida de alta eficiência;(b) Dispersão do co-polímero em bloco na faixa de 1,0 a 20,0% em água purificada, sobagitação constante a frio ou a quente, após adequada hidratação do mesmo pelo períodode até 48 horas;(c) O extrato glicólico padronizado de própolis é utilizado nas concentrações de 4,0 a-12,0% p/v, acrescidos de óleo de rícino hidrogenado e etoxilado 400E, nasconcentrações de 2,0 a 10,0% p/v, conforme o caso, adequadamente homogeneizados(fase A);(d) Após a adequada dispersão do co-polímero em água, adiciona-se ou não oconservante (conforme o caso) e homogeneíza-se (fase B);(e) Verte-se a fase B sobre a fase A (previamente resfriada ou aquecida conformerealizado com a dispersão do polímero), homogeneíza-se completamente;(f) mantendo a temperatura prévia (baixa ou alta), completa-se o volume com águapurificada e homogeneíza-se completamente.(g) submete-se as preparações obtidas às análises físico-químicas e microbiológicas dequalidade para o produto assim obtido.

2. Produto, de acordo com processo objeto da reivindicação-1, caracterizado por se apresentar nas formas de géis obtidos com a adição do insumoEGP na concentração de 27 a 33% de extrato seco em formulações constituídas por umco-polímero em bloco, apresentando-se límpidos, de coloração âmbar, na forma físicalíquida quando a baixas temperaturas, e geleificados, a temperatura controlada de 25 0C,para os géis contendo 2,4 e 3,6% p/v de extrato seco de própolis no produto final (gel). Eainda, quando preparados de acordo com as Boas Práticas de Fabricação, apresentam contagem microbiana e fúngica dentro dos limites especificados, sendo eles: máximo de-104 UFC/g (unidades formadoras de colônias) para bactérias totais e máximo de 5 χ 103UFC/g para fungos totais, sendo que deverá estar isento de patógenos, conformemetodologia farmacopéica vigente.

3. Produto, de acordo com a reivindicação 2 e processo deprodução caracterizado conforme reivindicação 1, caracterizado pelo fato daidentificação e quantificação ocorrer por meio de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência(CLAE), que compreende a diluição de 100 μΙ_ do extrato padronizado de própolis, nocaso de produto acabado, ou do extrato de própolis obtido da matéria-prima em aparelhode soxhlet e padronizado a 11% p/v de resíduo seco (no caso da análise da matéria-prima), previamente centrifugado a 13000 rpm, durante 5 minutos e filtrado em filtro de-45 mm, em metanol, sendo que a fase móvel utilizada compreende gradiente multilinear,onde é possível separar e quantificar os marcadores pesquisados nas matérias-primas eprodutos acabados, sendo o ácido cinâmico, que apresenta tempo de retenção em 5,9min.; aromadendrina 4'-metil-éter, com tempo de retenção em 20,7 min.; drupanin, comtempo de retenção em 26,2 min.; isosakuranetina, com tempo de retenção em 35,6 min.;artepelin C, com tempo de retenção em 55,2 minutos, e finalmente, a baccharina, comtempo de retenção em 58,3 minutos.

4. Produto, de acordo com a reivindicação 2 e processo deprodução conforme reivindicação 1, caracterizado reologicamente demonstrando que asamostras apresentaram propriedades viscoelásticas, com temperatura sol-gel,respectivamente, 10 e 6°C, para os géis contendo 2,4% e 3,6% de extrato seco deprópolis no produto final.

5. Produto, de acordo com a reivindicação 2 e processo deprodução conforme reivindicação 1, caracterizado por demonstrar liberação sustentadasendo que a liberação seguiu uma cinética de pseudo ordem-zero (Modelo de Higuchi).

6. Produto, de acordo com a reivindicação 2 e processo deprodução conforme reivindicação 1, caracterizado por apresentar estabilidade química,física e microbiológica, por avaliação realizada durante seis meses, em câmara climáticaa 40 0 ± 2 0C e 75 ± 5% UR.

7. Produto, de acordo com a reivindicação 2 e processo deprodução conforme reivindicação 1, caracterizado por apresentar atividadeantimicrobiana frente a Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa, obtendocomo concentração inibitória mínima, respectivamente, 50 pg/mL e 200 Mg/mL quandoavaliadas por técnica de microdiluição em microplaca.

8. Produto, de acordo com a reivindicação 2 e processo deprodução conforme reivindicação 1, caracterizado por apresentar potencial genotóxiconegativo nos tratamentos agudo, sub-agudo e sub-crônico, demonstrando a segurançado produto para as aplicações tópicas propostas na presente invenção.

9. Produto, de acordo com a reivindicação 2 e processo deprodução conforme reivindicação 1, caracterizado por apresentar atividade cicatrizanteem modelos em animais lesados com "punch" simulando queimaduras de segundo graue ferimentos em geral.

10. Produto, de acordo com a reivindicação 2 e processo deprodução conforme reivindicação 1, caracterizado por apresentar redução no tempo decicatrização de áreas doadoras de pacientes queimados, simulando áreas queimadas deaté segundo grau e ferimentos em geral.

11. Produto, conforme reivindicações 1 e 2, caracterizadopor ser utilizado para produtos farmacêuticos, cosméticos, odontológicos e veterináriosde uso externo.

12. Produto, conforme reivindicações 1 e 2, caracterizadopor apresentar atividades anti-séptica, antimicrobiana, cicatrizante e permitir seu usopara tratamento e cicatrização de queimaduras, feridas, acne, ferimentos de modo gerale demais patologias que requeiram a atividade antimicrobiana e cicatrizante.

13. Produto, conforme reivindicações 1 e 2, caracterizadopor poder ser utilizado diretamente nas áreas afetadas na forma de gel quando emtemperatura ambiente, ou na forma líquida, através de embalagens na forma de spray,por exemplo, quando a temperaturas baixas (frio). Ainda, o produto poderá embebergazes ou curativos como rayon, podendo ser aplicado nas queimaduras de até segundograu, podendo a área lesada permanecer aberta ou fechada com outros curativos, comogaze para queimados, por até 24 horas. Além disso, poderá ser aplicado em feridascrônicas, na forma sol-gel, em acne ou lesões que requeiram a assepsia e cicatrização.Produto para uso tópico.