BRPI0806114B1 - Processo de obtenção dos géis termorreversíveis contendo extrato padronizado de própolis e seu produto - Google Patents

Abstract

Gel. termorreversível de liberação sustentada contendo extrato padronizado de própolis (EPP-AF) e respectivo processo de fabricação, com atividade anti-séptica e cicatrizante para tratamento de queimaduras, lesões de pele e outros. Refere-se a presente invenção a um processo de obtenção de gel termorreversível de liberação sustentada contendo extrato padronizado de própolis (EPP-AF), aos géis propriamente ditos, suas características físicas, atividades e suas utilizações terapêuticas, sendo que o processo utiliza como matéria-prima, um co- polimero em bloco e o extrato padronizado de própolis, que assegura uma composição química e atividade biológica dentro dos limites de aceitabilidade especificados e estável em todos os lotes, garantindo a eficácia terapêutica frente as atividades antimicrobiana frente a microrganismos gram positivos e gram negativos, cicatrizante e regeneradora de tecidos, e ainda, a segurança das mesmas. Os géis termorreversíveis, que se apresentam sob a forma liquida quando a baixas temperaturas e na forma de gel quando a temperaturas mais elevadas (geleificação in situ), são usados no combate às doenças que se caracterizam por infecções microbianas, queimaduras e feridas, etc., tendo sido avaliados em fase pré-clínica e clínica, em função das atividades biológicas: atividade antimicrobiana frente a microrganismos gram negativos, gram positivos, antiinflamatória,(...).

Description

[001] Refere-se a presente invenção a um gel termorreversível contendo extrato padronizado de própolis (EPP-AF) para tratamento de queimaduras e outras lesões, que se caracterizam por danos à pele, infeccionadas ou não, em função das atividades biológicas propostas para o produto, quais sejam: atividade cicatrizante, antimicrobiana frente a microrganismos gram negativos e gram positivos, antioxidante, antimutagênica, antiinflamatória, analgésica, regeneradora de tecidos, podendo ser aplicado à área lesada diretamente na forma de gel ou na forma líquida quando a baixas temperaturas, sendo que no último caso, gelificando in situ.

[002] Ferimentos são uma das principais causas de morbidade e prejuízo da qualidade de vida e têm consumido parte substancial dos recursos de saúde em países desenvolvidos. A cada ano nos Estados Unidos, mais de 1,25 milhões de pessoas sofrem queimaduras, e 6,5 milhões têm úlceras cutâneas crônicas causadas por pressão, estase venosa, ou diabetes mellitus (CHABY, G. et al., 2008).

[003] Anualmente no Reino Unido 250 mil pessoas sofrem queimaduras, 175 mil são atendidas em unidades de emergência, 13 mil são hospitalizadas, 1.000 necessitam medidas de ressuscitação hidroeletrolítica, e 300 evoluem para óbito. Entretanto, os números são muito mais alarmantes nos países em desenvolvimento, por exemplo, o Nepal, onde a mortalidade pode atingir 17 vezes o índice britânico (VALE, 2005).

[004] Segundo a Sociedade Brasileira de Queimaduras, no Brasil acontece um milhão de casos de queimaduras a cada ano, 200 mil são atendidos em serviços de emergência, e 40 mil demandam hospitalização. As queimaduras estão entre as principais causas externas de morte registradas no Brasil, perdendo apenas para outras causas violentas, que incluem acidentes de transporte e homicídios. Estudo conduzido no Distrito Federal demonstrou taxa de mortalidade de 6,2% entre os queimados internados em hospital de emergência (VALE, 2005).

[005] As queimaduras são provocadas por agentes físicos (temperatura, radiação e eletricidade) e químicos (ácidos e álcalis), e encontram seu grau de gravidade na dependência direta do tempo de exposição ou concentração do agente causal (SOUZA, et al. 1990).

[006] A pele íntegra é a primeira e principal barreira contra a invasão bacteriana, mas em pacientes queimados a pele está destruída, e conseqüentemente o tecido subjacente exposto é um excelente meio para o desenvolvimento bacteriano (SOUZA, et al., 1990). A ferida ocasionada pela queimadura (proteína coagulada) é meio de cultura ideal para o desenvolvimento de bactérias. A ocorrência de infecções é, portanto, um dos maiores problemas em queimaduras, ressaltando-se que a septicemia está envolvida em cerca de 50% das mortes decorrentes de lesões por queimaduras. A densidade de microrganismos presentes na superfície cutânea é controlada por vários fatores, dentre os quais o pH ácido da superfície pela presença de ácidos graxos, que inibem a proliferação bacteriana. Porém, as queimaduras transformam a pele em ambiente seco e destroem as camadas queratinizadas contendo ácidos graxos, aumentando assim o pH, e favorecendo a proliferação de microrganismos.

[007] A importância clínica das lesões de pele tem suscitado por parte de vários laboratórios a obtenção de produtos no intuito de abreviar o período de cicatrização e promover o conforto do paciente, sobretudo, pelo alívio da dor. Entre estes produtos encontram-se soluções anti-sépticas, quimioterápicos, películas biológicas e também sintéticas, geralmente todas de uso tópico (CABRAL ET AL, 1987; WOUK et al., 1998).

[008] O tratamento de feridas crônicas envolve a aplicação de vários materiais (hidrocolóides, hidrogéis, membranas sintéticas ou biológicas) (WOJCIECHCZAJ et al. 2006; CZAJA, et al., 2007). Entretanto, a maior parte desses curativos são importados, apresentam elevado valor agregado, o que encarece consideravelmente o processo de tratamento. A tabela 01, parcialmente extraída de CZAJA, et al. (2007), apresenta algumas características de curativos de diferentes empresas, os quais têm sido comercializados nos dias de hoje.Tabela 01: Tratamentos de Pele para Queimaduras e Feridas Crônicas.

[009] Por muitas décadas o tratamento de afecções e/ou lesões da pele, agudas ou crônicas, vêm sendo realizado por meio de formas farmacêuticas convencionais como as pomadas, os cremes, as loções, os géis e as soluções tópicas. Estas formas correspondem aos produtos farmacêuticos mais prescritos e são conhecidos por promover liberação imediata do fármaco veiculado, além de seus efeitos físicos como protetores, cicatrizantes, umectantes e emolientes. Dessa forma, para manter o fármaco na concentração terapêutica torna-se necessário a administração reiterada. (CHIEN, 1992; ANSEL, 2000).

[0010] Assim, sistemas capazes de modificar a liberação do fármaco proporcionando a liberação em quantidades adequadas e em um determinado sítio estão sendo estudados, visto que possuem vantagens sobre os sistemas convencionais tais como a manutenção de níveis terapêuticos ótimos com mínimo de flutuações, a redução dos efeitos colaterais, a diminuição da freqüência de dosagem e o direcionamento do fármaco para sítios de ação específicos (MADAN, 1985).

[0011] MADAN (1985) define os sistemas de liberação sustentada como formas farmacêuticas que liberam rapidamente uma fração da dose total levando a uma resposta terapêutica rápida, e posteriormente mantém esta resposta por um período de tempo prolongado.

[0012] Para facilitar a veiculação do fármaco por diferentes vias de administração, formas farmacêuticas deverão ser formuladas e produzidas. Cada forma farmacêutica deve conter princípio ativo e também outras substâncias que permitam a obtenção do medicamento e proporcionem a administração e o alcance do efeito terapêutico desejado.

[0013] Os copolímeros de polioxietileno e polioxipropileno, conhecidos como Poloxamer ou Pluronic®, têm sido muito utilizados na indústria como agentes dispersores, estabilizadores para sistemas emulsivos e solubilizantes. Trata-se de um copolímero não-iônico constituído de cadeias de polioxietileno e polioxipropileno. Possui 70% de óxido de etileno e 30% de óxido de propileno e massa molecular correspondente à 12500 Daltons. A sua fórmula molecular é [HO(CH2-CH2-O) 106-(CH(CH3)-CH2-0)70-(CH2-CH2-0) 106H] podendo ser classificado quimicamente como um poliéter-álcool. O polímero possui caráter anfifílico, uma vez que possui uma cadeia de poli-óxido de propileno com caráter hidrofóbico e duas cadeias de poli-óxido de etileno com caráter hidrofílico. É um sólido branco com ponto de fusão correspondente a 56 °C, solúvel em água e capaz de formar um gel firme na concentração de 20% p/p a 25 °C (SCHMOLKA, 1972).

[0014] As soluções concentradas do copolímero apresentam geleificação termorreversível por ação da temperatura. Em solução aquosa a 20% p/p e com o aumento da temperatura, o copolímero agrega-se em micelas para minimizar a energia livre da solução e muitos estudos têm sido realizados na tentativa de elucidar esse processo de formação de micelas. Em temperaturas baixas (5 °C) o polímero existe como um unímero livre em solução aquosa e com o aumento da temperatura estabelece-se um equilíbrio entre unímeros e micelas. Em temperaturas mais altas, como a temperatura corporal (37 °C) formam-se agregados de micelas aumentando a viscosidade, que passa de uma solução para um gel firme. As micelas apresentam uma estrutura esférica, onde a cadeia central de óxido de polipropileno (OPP) localiza-se no interior da micela, devido ao seu caráter hidrofóbico, e as duas cadeias laterais de óxido de polietileno (OPE) localizam-se no exterior da micela devido ao seu caráter hidrofílico (CABANA et al., 1997). As propriedades de termorreversibilidade e a atoxicidade tem tornado estes copolímeros bastante atrativos na formulação de géis para aplicação tópica, transdérmica, parenteral, oftálmica, considerando a possibilidade destes modificarem a liberação.

[0015] As principais características de um substituto ideal da pele são: aderência, permeabilidade ao vapor de água, elasticidade, durabilidade, constituir uma barreira às bactérias, não ser antigênico, ter ação hemostática, ser de fácil aplicação e manuseio e, finalmente, ser de baixo custo (WOUK et al., 1998).

[0016] Infecções em feridas de queimaduras dificultam a cicatrização e a evolução para a cura. Vários estudos descrevem Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Enterobactérias como patógenos importantes em feridas cirúrgicas e de queimaduras. Muito embora, as infecções de ferimentos de queimaduras causadas por S. aureus são as mais comuns e frequentemente resultam em choque tóxico (BAGDONAS et al., 1993). Assim, terapia antibacteriana tópica assume papel decisivo no controle das infecções, pois a destruição vascular ocorrida nas lesões tem como conseqüências a diminuição dos mecanismos de defesa humoral e celular na área queimada, e ainda a redução da eficácia dos antibacterianos sistêmicos, pela redução do transporte dos antibióticos ao local da infecção.

[0017] Na terapia para queimaduras, já foram empregados: nitrato de prata, na forma de solução aquosa a 0,5%, iodopovidona, em pomadas a 10%, mafenida, na forma de creme a 10%p/v, ácido acético na concentração de 5% v/v, hipoclorito de sódio na concentração de 0,25%, clorexidina, na forma de creme a 0,2% p/p, gentamicina na forma de creme ou pomada a 0,1% p/p (DASS, et al. 1997), mas, merece destaque a nitrofurazona e a sulfadiazina de prata.

[0018] A nitrofurazona é usada em creme na concentração de 0,2% p/p, frente aos microrganismos Staphylococcus aureus, Escherichia coii, Enterobacter cloacae e Proteus spp, porém não possui atividade frente a Pseudomonas aeruginosa ou fungos. Esta substância ativa tem seu efeito reduzido na presença de sangue e matéria orgânica. Apresenta reações de sensibilização, em cerca de 0,5 a 2,0% dos pacientes, e isto às vezes, dentro de poucos dias da aplicação inicial. É utilizada para promover rápida cicatrização de ferimentos e locais de enxertos da pele e para a prevenção de aderências peritoniais. Já a sulfadiazina de prata, é empregada na concentração de 1% p/p, em emulsões tópicas óleo em água, apresentando consagrado uso na profilaxia e tratamento de infecções. Apresenta amplo espectro de ação, incluindo bactérias gram positivas e negativas, fungos, protozoários e vírus. Esta substância apresenta pouca solubilidade em água, apresentando limitada absorção. Em pH fisiológico se dissocia lentamente liberando a sulfadiazina e íons prata, que exercem sua ação separadamente. Com relação às reações adversas, 2,5% dos pacientes podem ser acometidos com sintomas que variam, como sensação de queimadura, urticária, prurido, nefrite, eritema multiforme, necrose cutânea e leucopenia (DASS, et al. 1997).

[0019] Nas últimas décadas foi possível observar um interesse cada vez maior pelas medicinas e terapias naturais. Os produtos obtidos de abelhas da espécie Apis mellifera como a própolis, têm apresentado grande aceitação, principalmente pelas suas propriedades terapêuticas.

[0020] A própolis é elaborada pelas abelhas a partir de resinas vegetais e exsudatos. As abelhas transportam esta matéria-prima para dentro da colméia e adicionam secreções próprias, com enzimas existentes em sua saliva (KOO & PARK, 1996; BURDOCK, 1998; CASTALDO & CAPASSO, 2002 ; RUSSO, et al. 2002). A própolis é uma substância resinosa, que possui coloração e consistência intimamente relacionada à flora visitada pelas abelhas (KOO & PARK, 1996) e a estação na qual é coletada (SANTOS, 2003).

[0021] A variação da composição química da própolis está relacionada com sua origem botânica, sendo também a proporção das substâncias dependente dessa variação, porém trabalhos de SFORCIN, et al{26 e 27] já demonstraram que as atividades antimicrobianas frente a Staphylococcus aureus e Escherichia coii, bem como a atividade imunomoduladora, não variaram com a época da colheita da mesma. De qualquer forma, as concentrações dos constituintes ativos merecem atenção e controle e desta forma, o emprego de extratos padronizados é item imprescindível para a obtenção de medicamentos de origem natural (BERRETTA, 2003).

[0022] A própolis tem sido usada como um agente terapêutico pela população mundial desde os tempos de Hipocrates. Já se sabe que o extrato etanólico de própolis apresenta algumas atividades farmacológicas, como a antimicrobiana, antiviral, antifúngica, antiinflamatória, anestésica e citostática. Um grande número de trabalhos têm demonstrado a atividade antimicrobiana da própolis contra vários microrganismos patogênicos [29], destaca-se também a atividade antifúngica, especialmente em relação a várias espécies de Candida, inclusive da C. albicans in vitro [30] e in vivo , como demonstrado nos trabalhos de candidíase oral em pacientes da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto (FORP-USP) [28] e em pacientes aidéticos [29].

[0023] Atualmente mais de 300 compostos, principalmente polifenóis, têm sido identificados como constituintes da própolis [28]. A maioria dos polifenóis são flavonóides, seguidos pelos ácidos fenólicos e ésteres, aldeídos, cetonas e outros (CASTALDO & CAPASSO, 2002). As propriedades farmacológicas da própolis são principalmente atribuídas a presença dos flavonóides. A opinião prevalecente é que a nítida atividade biológica dos flavonóides é, em parte, a capacidade de proteção contra ação agressiva dos radicais livres (RUSSO, et al. 2002).

[0024] As propriedades cicatrizantes do extrato de própolis em uso tópico foram demonstradas em coelhos albinos e ratos sem pêlo (ARVOUET-GRAND et al. 1993), onde se determinou que a concentração ideal de substância ativa para este fim é de 4% p/p, ou seja 5% p/p de extrato glicólico de própolis a 80% de substância ativa. A toxicidade subaguda e a irritação cutânea primária também foram investigadas, sendo que a DL50 foi maior do que 7,34 g/Kg e os animais não apresentaram irritação cutânea nas condições experimentais (ARVOUET-GRAND et al. 1993).

[0025] Mais especificamente, a presente invenção se refere ao produto, suas propriedades e aplicações, sendo: géis termorreversíveis de liberação sustentada contendo extrato padronizado de própolis (EPP-AF) para tratamento de queimaduras, feridas, acne e demais ferimentos que requeiram atividade antiséptica e cicatrizante, em função das atividades biológicas demonstradas para 0 produto nos estudos pré-clínicos e clínicos de eficácia e de segurança pré-clínica. Os géis "in questio" apresentam-se na forma física líquida quando a baixas temperaturas e gelificação "in situ" são estáveis física e quimicamente (marcadores característicos do extrato padronizado de própolis utilizado) comportamento reológico caracterizado como viscoelástico e cinética de liberação de pseudo ordem zero (Modelo Higuchi).

[0026] Para facilitar 0 entendimento da presente invenção são anexadas as seguintes figuras: - Figura 1: Perfil cromatográfico do extrato padronizado de própolis (EPP-AF) obtidos por CLAE: (1) ácido p-cumárico, (2) aromadendrina, (3) drupanin, (4) artepilin C e (5) baccharina. A análise cromatográfica realizada num tempo total de 60 minutos iniciou-se com um gradiente envolvendo mistura de ácido acético, acetato de amónio em metanol/água e acetonitrila, finalizando com 100% de acetonitrila com fluxo de 1,0 mL/min - Figura 2: Temperatura de transição sol-gel para as amostras estudadas: efeito da presença do extrato de própolis. - Figura 3: Valores de viscosidade em função de diferentes tensões de cisalhamento para as amostras; - Figura 4: Valores de viscosidade em função de diferentes temperaturas para as amostras; - Figura 5: Comportamento viscoelástico caracterizado pelo módulo elástico e módulo viscoso apresentado para as amostras; - Figura 6: Apresentação da freqüência de eritrócitos policromáticos micronucleados (PCEMNs) nos tratamentos agudo, subagudo e subcrônico; - Figura 7: Apresentação do tempo de cicatrização das queimaduras dos pacientes tratados; com a distribuição média dos pacientes (n=31, independente da quantidade de produto aplicado) por grupos (áreas) e tempo médio para cicatrização das áreas com pomada de furacin e gel termorreversível contendo extrato padronizado de própolis

[0027] Adicionalmente ainda é apresentado o anexo A com as seguintes fotografias: - Sequência 1 - Apresentação do corte histológico das áreas tratadas com géis termorreversíveis contendo Extrato padronizado de Própolis; apresentando processo cicatricial com 3 dias de tratamento, com gel a 2,4 e 3,6% de extrato seco de própolis, onde : A) Lesões tratadas com gel de própolis a 2,4%. Fechamento da lesão na região epitelial (1) e na região subcutânea (2) observa-se um grande número de fibroblastos sintetizando fibras colágenas (Cortes 6 μm corados com Tricrômico de Masson. Aumento de 100x) B) Lesões tratadas com gel de própolis a 2,4%. Na região subcutânea (2) observa-se aumento de fibras colágenas e um grande número de células em mitose (Cortes 6 μm corados com Tricrômico de Masson. Aumento de 400x); e C) Lesões tratadas com gel de própolis a 3,6%. Área do ferimento totalmente reconstruída, o epitélio (1) já se apresenta em várias camadas formando a região córnea. Na região subcutânea (2) observa-se fibras colágenas B (Cortes 6 μm corados com Tricrômico de Masson. Aumento de 400x). - Sequência 2 Exemplo da cicatrização das áreas tratadas com o gel termorreversível contendo extrato padronizado de própolis, com fotografias de área doadora do grupo III (membros inferiores) com espessura do enxerto de 8,0 milésimos de polegada e 10,9 mL do produto em uma tira de rayon numa área ocluida por 24 horas, onde (A) e (B) são o registro fotográficos após 48 horas da abertura do curativo, sendo 11A própolis, 11B furacin, 12A furacin, 12B própolis, 13A própolis e 13B furacin e (C) e (D) são fotos com 9 dias após cirurgia onde se percebe que as áreas contendo própolis (11a, 12B e 13 A) estão sem o rayon, demonstrando que houve reepitelização já no nono dia após a cirurgia, enquanto que as áreas contendo furacin (11B, 12a, 13B) ainda não se desprenderam, sinalizando que ainda não está cicatrizado.

[0028] O processo de obtenção dos géis termorreversíveis contendo extrato padronizado de própolis, um dos objetos da presente invenção, compreende as etapas de: (a) Caracterização física e química do Extrato Padronizado de Própolis na forma glicólica e na faixa de concentração de 27,0 a 33,0% p/v de resíduo seco, sendo a caracterização química realizada por cromatografia líquida de alta eficiência; (b) Dispersão do co-polímero em bloco na faixa de 1,0 a 20,0% em água purificada, sob agitação constante a frio ou a quente, após adequada hidratação do mesmo pelo período de até 48 horas; (c) O extrato glicólico padronizado de própolis é utilizado nas concentrações de 4,0 a 12,0% p/v, acrescidos de óleo de rícino hidrogenado e etoxilado 40OE, nas concentrações de 2,0 a 10,0% p/v, conforme o caso, adequadamente homogeneizados (fase A); (d) Após a adequada dispersão do co-polímero em água, adiciona-se ou não o conservante (conforme o caso) e homogeneíza-se (fase B); (e) Verte-se a fase B sobre a fase A (previamente resfriada ou aquecida conforme realizado com a dispersão do polímero), homogeneíza-se completamente; (f) mantendo a temperatura prévia (baixa ou alta), completa-se o volume com água purificada e homogeneíza-se completamente. (g) submete-se as preparações obtidas às análises físico-químicas e microbiológicas de qualidade para o produto assim obtido.

[0029] Os géis obtidos com a adição de EGP 30% em formulações constituídas pelo co-polímero em bloco, apresentaram-se límpidos, de coloração âmbar, na forma física líquida quando a baixas temperaturas, e geleificados, a temperatura controlada de 10 e 6 °C, para os géis contendo 2,4 e 3,6% p/v de extrato seco de própolis. Os estudos de caracterização reológica das formulações demonstraram que as amostras apresentaram propriedades viscoelásticas e que a liberação seguiu uma cinética de ordem-zero. As três preparações obtidas apresentaram estabilidade química, física e microbiológica, sendo a avaliação realizada durante seis meses, em câmara climática a 40 0 ± 2 °C e 75 ± 5% UR. As preparações devem apresentar atividade antimicrobiana frente a Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa, obtendo como concentração inibitória mínima, respectiva mente, 50 μg/mL e 200 pg/mL quando avaliadas por técnica de microdiluição em microplaca. Os géis não apresentam potencial genotóxico nos tratamentos agudo, sub-agudo e sub-crônico. E ainda, quando preparados de acordo com as Boas Práticas de Fabricação, apresentam contagem microbiana e fúngica dentro dos limites especificados, sendo eles: máximo de 104 UFC/g (unidades formadoras de colônias) para bactérias totais e máximo de 5 x 103 UFC/g para fungos totais, sendo que deverá estar isento de patógenos, conforme metodologia farmacopéica vigente.

[0030] Para as propostas da presente invenção, o produto poderá ser utilizado diretamente nas áreas afetadas na forma de gel quando em temperatura ambiente, ou na forma líquida, através de embalagens na forma de spray, por exemplo, quando a temperaturas baixas (frio). Ainda, o produto pode embeber gazes ou curativos como rayon, podendo ser aplicado nas queimaduras de até segundo grau ou terceiro, podendo a área lesada permanecer aberta ou fechada com outros curativos, como gaze para queimados, por até 24 horas. Além disso, poderá ser aplicado em feridas crônicas, na forma sol-gel, em acne ou lesões que requeiram a assepsia e cicatrização. Produto para uso tópico.

[0031] Em outra concretização particular da invenção, o gel poderá ser acrescido de outras concentrações de extrato padronizado de própolis, podendo ser aplicado para outras atividades terapêuticas, como em odontologia, cirurgia plástica, uso oral, dentre outras.

[0032] Vantajosa mente a presente invenção poderá ser empregada na indústria farmacêutica e cosmética, de modo superior aos demais produtos existentes no mercado, uma vez que a presente invenção foi avaliada quanto aos caracteres físico-químicos, microbiológicos e biológicos. Assim todos os exemplos apresentados foram estudados com o objeto da presente invenção, justificando-se assim todas as reivindicações.

EXEMPLOS EXEMPLO 1

[0033] Os géis termorreversíveis obtidos com a adição de EGP com teor de extrato seco de 27 a 30% em formulações constituídas pelo co-polímero em bloco, apresentaram-se límpidos, de coloração âmbar, na forma física líquida quando a baixas temperaturas, e geleificados, a temperatura controlada de 10 e 6 °C, apresentando-se com 2,4 e 3,6% p/v de extrato seco de própolis, estáveis física, química e microbiologicamente. Os produtos poderão ser utilizados diretamente nas áreas afetadas na forma de gel quando em temperatura ambiente, ou na forma líquida, através de embalagens na forma de spray, por exemplo, quando a temperaturas baixas (frio). Ainda, o produto pode embeber gazes ou curativos como rayon, podendo ser aplicado nas queimaduras de até segundo grau ou mais, podendo a área lesada permanecer aberta ou fechada com outros curativos, como gaze para queimados, por até 24 horas. Além disso, poderá ser aplicado em feridas crônicas, na forma sol-gel, em acne ou lesões que requeiram a assepsia e cicatrização, e além do uso farmacêutico, propõe-se ainda o uso na área cosmética, odontológica e veterinária. Os géis termorreversíveis são para uso tópico.

EXEMPLO 2

[0034] Caracterizou-se física e quimicamente as fórmulas estudadas, sendo que as mesmas foram avaliadas a reologia das preparações, viscosidade frente a diferentes graus de cisalhamento e temperatura, atividade antimicrobiana, estabilidade, estudos de eficácia pré-clínica, estudo de segurança pré-clínica e eficácia clínica.

[0035] A Identificação e a Quantificação dos marcadores químicos no extrato padronizado foi realizada por meio de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), conforme a seguinte metodologia: a) preparação das amostras: 100 μL do extrato padronizado de própolis da presente invenção são diluídos para 1 mL em metanol. b) tratamento prévio das amostras: centrifugação a 13000 rpm, durante 5 minutos e filtração em filtro de 45 mm. c) fase móvel: gradiente multilinear desenvolvido, apresentado na tabela a seguir: Tabela 2 - Gradiente multilinear de eluição para análise qualitativa em CLAE de extratos de própolis.

Onde Bomba A: 93,9% água + 0,8% de ácido acético + 0,3% de acetato de amónio + 5% metanol; Bomba B: acetronitrila Fluxo: 1 mL/min; Detecção: UV 280 e 320 nm.

[0036] Os tempos de retenção em minutos dos marcadores estudados nas matérias-primas e produtos acabados são: ácido cinâmico (5,9 min.); aromadendrina 4'-metil-éter (20,7 min.); drupanin (26,2 min.); isosakuranetina (35,6 min.), artepelin C (55,2 min) e baccharina (58,3 min).

[0037] Para comprovar que as formulações termorreversíveis contendo extrato padronizado de própolis (EPP-AF) da presente invenção resiste a condições drásticas de temperatura de umidade, iniciamos um estudo de estabilidade acelerado 40°C ± 2°C e UR de 75% ± 5%. O teste de estabilidade proposto, submete os produtos a condições de tensão que desafiam sua estabilidade, sendo uma ferramenta útil para predizer a viabilidade do produto (Rieger, 1996). A estabilidade dos extratos será avaliada de acordo com o programa de estabilidade proposto pela ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) na Resolução 391, de 9 de agosto de 1999, onde se propõe que as formulações sejam submetidas à estufa (40°C ± 2 - Umidade Relativa 75% ± 5) pelo período de seis meses sendo realizadas as análises em 0, 30, 60, 90 e 180 dias. Estas formulações, após a aplicação das condições de tensão, serão analisadas para detecção de alterações nas suas características físico-químicas, mediante os ensaios físicos e químicos, como a quantificação de seus marcadores.

[0038] Como já mencionado previa mente os produtos objetos da presente invenção, os géis termorreversíveis de liberação sustentada contendo Extrato Padronizado de Própolis (EPP-AF), foi proposto pela sua característica sol-gel, que proporciona utilização inédita de um produto para queimaduras na forma líquida pulverizada quando a baixas temperaturas, que geleifica "in situ" as entrar em contato com a pele (temperatura corporal), utilidade que proporciona analgesia pela propriedade física do produto, e atividade antimicrobiana e cicatrizante em função da inclusão do extrato padronizado de própolis (EPP-AF), um produto com aplicação inédita e surpreendente, que pode ainda ser empregado diretamente na temperatura ambiente na forma de um gel, podendo ser comercializado embalado em bisnagas ou outras apresentações.

[0039] Para sustentar as atividades biológicas propostas para os géis termorreversíveis contendo extrato padronizado de própolis (EEP-AF), um dos objetos da presente invenção, apresentamos os dados para algumas das atividades propostas, como a atividade antimicrobiana e cicatrizante.

EXEMPLO 3: Atividade Antimicrobiana

[0040] Para a avaliação da atividade antimicrobiana do extrato padronizado foi utilizado o método de difusão em ágar (KUJUMGIEV, 1999). Os microrganismos utilizados como teste são Micrococcus luteus - cepa ATCC 9341 e Staphylococcus aureus - cepa ATCC 25923. A atividade antimicrobiana é medida através da formação do halo de inibição sobre uma camada de ágar, após incubação por 72 horas a temperatura de 37°C.

[0041] Para a avaliação da atividade antimicrobiana das formulações termorreversíveis o método de difusão em ágar (KUJUMGIEV, 1999) não é adequado, já que as mesmas não se difundem adequadamente, oferecendo um falso resultado. Assim, determinou-se a concentração inibitória mínima (CIM) das fórmulas frente aos microrganismos Staphylococcus aureus - cepa ATCC 25923 e Pseudomonas aeruginosa, através de microdiluição em microplacas. A CIM foi determinada utilizando o reagente cloreto de trifeniltetrazólio, que cora na presença de células viáveis. Em microplacas esterilizadas de 96 orifícios foram depositados um total de 100 μL da mistura envolvendo: Müller Hinton Broth (DIFCO), soluções do gel contendo 3,6% de extrato seco de própolis (GEP) (diluições 1:2; 1:4 e 1:8) e suspensões dos microrganismos preparadas a aproximadamente 4,8 x 103 UFC/mL. Foi determinada a concentração inibitória mínima do gel que inibiu o crescimento em uma menor concentração, utilizando- se o método de microdiluição em microplaca (FURTADO et al., 2002; LAI et al., 2004; SILVA et al., 2004; ANDREWS, 2001), sendo obtido a CIM de 50 pg/mL para S. aureuse 200 μg/mL para P. aeruginosa.

EXEMPLO 4: Estudo da Atividade Cicatrizante "in vivo" - pré-clínico

[0042] Os produtos apresentados no exemplo 6 foram estudados, quanto à capacidade de cicatrização de feridas e queimaduras, em modelo experimental animal (ratos Wistar) frente aos controles. Foram estudados dois protocolos experimentais, sendo um com aplicação única do produto e outro com reaplicações de 12 em 12 horas. Os animais foram sacrificados com 3 dias de experimento para avaliação histológica das lesões, que foram efetuadas com auxílio de um punch. Um dos controles (sem aplicação de nenhum produto) foi acompanhado e seu sacrifício ocorreu quando da cicatrização aparente da lesão, que se deu com 7 dias de experimento. Os resultados encontrados mostraram que os produtos se mostraram eficazes na formação do tecido de reepitelização, sendo que se observou um tecido muito bem organizado e fechando em torno de 80% da lesão. Observamos que houve uma intensa proliferação de fibroblastos nas áreas lesadas, sugerindo que o processo cicatricial com a utilização deste produto se dá via estas células.

EXEMPLO 5: Análise do Potencial Mutagênico e citotoxicidade dos produtos - segurança pré-clínica

[0043] Os géis termorreversíveis foram estudados, quanto ao potencial mutagênico, em modelo de micronúcleos de células do sangue periférico de ratos wistar. Foram avaliados três protocolos, sendo em um deles aplicação única dos produtos, em outro sete dias de aplicação diária do produto e por último a aplicação diária do produto por 30 dias de estudo. As aplicações do produto foram feitas em região lesada com um punch, com dimensões conhecidas. Aplicaram-se os produtos, um controle negativo e um controle positivo empregando-se agente genotóxico (clastrogênico). Após a coleta do sangue dentro do período estipulado em cada experimento, foi efetuada contagem dos micronúcleos em 2.000 células (n=3). Os resultados encontrados mostraram que os géis termorreversíveis contendo extrato padronizado de própolis não apresentaram atividade mutagênica. Ainda, foi avaliado o índice de divisão celular (IDN) demonstrando que o mesmo não foi alterado, demonstrando que o produto não é citotóxico. Assim, podemos afirmar que os produtos estudados não apresentam potencial mutagênico nem citotoxicidade.

EXEMPLO 6: Avaliação do tempo de cicatrização de pacientes queimados - Pesquisa Clínica de Eficácia

[0044] Para comprovar a atividade cicatrizante dos géis termorreversíveis contendo extrato padronizado de própolis (EPP-AF) foi realizado Estudo Clínico de Eficácia comparando o mesmo com pomada de nitrofurazona (Furacin®). O estudo foi realizado na Unidade de Queimados do Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto - HCFMRP/USP. O produto foi aplicado em áreas doadoras de pacientes queimados, sendo que as mesmas simularam queimaduras de segundo grau. Para obtenção de tais áreas utilizou-se Dermátomo de Padget, com enxertos de pele com espessuras que variaram de 8 a 12 milésimos de polegada. As áreas tratadas abrangeram couro cabeludo, membros superiores e inferiores. A aplicação do produto foi realizada nas áreas doadoras no momento da cirurgia, sendo que o mesmo foi impregnado em rayon ou gaze. Estudou-se a atividade cicatrizante através do tempo necessário para a cicatrização das áreas. O curativo que se desprendeu primeiro, demonstrou cicatrização mais rápida. Assim, os resultados encontrados demonstraram que os géis termorreversíveis contendo extrato padronizado de própolis mostraram-se tão eficazes quanto o medicamento referência utilizado na unidade de queimados. Dados isolados mostraram que áreas tratadas com o gel de própolis cicatrizaram com 2 a 3 dias de antecedência dos tratados com o medicamento referência, dados que não mostraram diferença estatística, porém, com o aumento do número de pacientes tratados, é possível que se possa demonstrar diferença estatística a favor do produto termorreversível de liberação sustentada contendo própolis.

[0045] Seguem abaixo as tabelas com o resumo das caracterizações e testes efetuados: Tabela 3 - Caracterização do Extrato Padronizado de Própolis (EEP e EGP), utilizados no presente estudo. Os resultados correspondem a média de três determinações e estão expressos como a média ± desvio padrão).

Tabela 4: Valores de viscosidade (Pas) obtida em função das diferentes tensões de cisalhamento (1/s).

Tabela 5 - Resultados obtidos para a liberação da própolis (expressa no marcador DPB, em % de liberação) nas formulações desenvolvidas GEL 01, GEL 02 e GEL 03.

Tabela 6 - Parâmetros cinéticos calculados para avaliação do processo de liberação da própolis (expresso no marcador DPB) nas formulações desenvolvidas

Tabela 7 - Resultados obtidos na avaliação "in vitro" de atividade antimicrobiana através de técnica de difusão em ágar (mm) para os extratos avaliados e da concentração de própolis utilizada nos géis (n=3).

Tabela 8 - Valores das médias e desvios-padrão das freqüências de PCEMNs observados nos tratamentos agudo, subagudo e subcrônico para o gel contendo diferentes concentrações de própolis para queimadura.

As médias com letras diferentes diferiram estatisticamente entre si (p < 0,05). Tabela 9 - Porcentagem de PCEMNs e IDN (índice de divisão nuclear) obtidas em sangue periférico de ratos Wistar machos submetidos ao tratamento agudo, subagudo e crônico com géis contendo diferentes concentrações de própolis para queimadura, e seus respectivos controles.

Tabela 10 - Informações sobre a população utilizada no estudo dos medicamentos, furacin e gel termorreversível contendo 3,6% de extrato padronizado de própolis.

(*) Uma vez que todos os pacientes receberam o medicamento convencional (furacin) e o medicamento teste (gel termorreversível contendo 3,6% de extrato seco de própolis), a população foi a mesma para os dois grupos avaliados. Tabela 11 - Distribuição média dos pacientes por grupos (áreas), espessura média de pele retirada, quantidade de produto administrado e tempo médio para cicatrização nas áreas com pomada de furacin e gel termorreversível contendo extrato padronizado de própolis.

(*) média dos resultados utilizando o total de pacientes estudados (31), independente da quantidade de produto aplicado e a oclusão da área (10 mL e 20 mL do produto).

Claims (14)

1. Processo de obtenção dos géis termorreversíveis contendo extrato padronizado de própolis (EPP-AF), caracterizado por compreender as etapas de: (a) caracterizar física e quimicamente do Extrato Padronizado de Própolis (EPP-AF) na forma glicólica e na faixa de concentração de 27,0 a 33,0% p/v de resíduo seco, sendo a caracterização química realizada por cromatografia líquida de alta eficiência; (b) dispersar o co-polímero em bloco, poloxamer de fórmula molecular [HO(CH2-CH2-O)106-(CH(CH3)-CH2-O)70-(CH2-CH2-O)106H] e 12500 Daltons, na faixa de 1,0 a 20,0% em água purificada, sob agitação constante a frio ou a quente, após adequada hidratação do mesmo pelo período de até 48 horas; (c) utilizar o extrato glicólico padronizado de própolis nas concentrações de 4,0 a 12,0% p/v, acrescidos de óleo de rícino hidrogenado e etoxilado 40OE, nas concentrações de 2,0 a 10,0% p/v, conforme o caso, adequadamente homogeneizados (fase A); (d) após a adequada dispersão do co-polímero em água, adicionar ou não o conservante (conforme o caso) e homogeneizar (fase B); (e) verter a fase B sobre a fase A (previamente resfriada ou aquecida conforme realizado com a dispersão do polímero), homogeneizar completamente; (f) mantendo a temperatura prévia (baixa ou alta), completar o volume com água purificada e homogeneizar completamente. (g) submeter as preparações obtidas às análises físico-químicas e microbiológicas de qualidade para o produto assim obtido.

2. Produto obtido de acordo com processo conforme definido na reivindicação 1, caracterizado por se apresentar nas formas de géis obtidos com a adição do insumo extrato glicólico de própolis (EGP) na concentração de 27 a 33% de extrato seco, em formulações constituídas por um co-polímero em bloco poloxamer 407 de fórmula molecular [HO(CH2-CH2-O)106-(CH(CH3)-CH2- O)70-(CH2-CH2-O)106H] e 12500 Daltons na faixa de 1,0 a 20% apresentando- se límpidos, de coloração âmbar, na forma física líquida quando a baixas temperaturas, e geleificados, a temperatura controlada de 10 e 6°C, respectivamente, para os géis contendo 2,4 e 3,6% p/v de extrato seco de própolis no produto final (gel), e ainda, quando preparados, e por apresentar contagem microbiana e fúngica dentro dos limites especificados, sendo eles: máximo de 104 UFC/g (unidades formadoras de colônias) para bactérias totais e máximo de 5 x 103 UFC/g para fungos totais, sendo que deverá estar isento de patógenos.

3. Produto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a identificação e quantificação ocorrer por meio de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), que compreende a diluição de 100 μL do extrato padronizado de própolis, no caso de produto acabado, ou do extrato de própolis obtido da matéria-prima em aparelho de soxhlet e padronizado a 11% p/v de resíduo seco (no caso da análise da matéria-prima), previamente centrifugado a 13000 rpm, durante 5 minutos e filtrado em filtro de 45 mm, em metanol, sendo que a fase móvel utilizada compreende gradiente multilinear, onde é possível separar e quantificar os marcadores pesquisados nas matérias-primas e produtos acabados, sendo o ácido cinâmico, que apresenta tempo de retenção em 5,9 min.; aromadendrina 4'-metil-éter, com tempo de retenção em 20,7 min.; drupanin, com tempo de retenção em 26,2 min.; isosakuranetina, com tempo de retenção em 35,6 min.; artepelin C, com tempo de retenção em 55,2 minutos, e finalmente, a baccharina, com tempo de retenção em 58,3 minutos.

4. Produto de acordo com reivindicação 2, caracterizado por ainda se apresentar nas formas de géis obtidos com a adição do insumo extrato glicólico de própolis (EGP) na concentração de 27 a 33% de extrato seco, insumo este caracterizado por apresentar ainda 65,54 mg/ml de compostos fenólicos expressos como ácido gálico e 13,35 mg/ml de compostos flavonoides expressos como quercetina, ambos caracterizados por método espectrofotométrico, com variação aceitável de 30% em relação a esse valor nominal.

5. Produto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por reologicamente as amostras apresentarem propriedades viscoelásticas, com temperatura sol-gel, respectivamente, 10 e 6°C, para os géis contendo 2,4% e 3,6% de extrato seco de própolis no produto final.

6. Produto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por demonstrar liberação sustentada sendo que a liberação seguiu uma cinética de pseudo ordem-zero (Modelo de Higuchi).

7. Produto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por apresentar estabilidade química, física e microbiológica, por avaliação realizada durante seis meses, em câmara climática a 40 ° ± 2 °C e 75 ± 5% UR.

8. Produto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por apresentar atividade antimicrobiana frente a Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa, obtendo como concentração inibitória mínima, respectivamente, 50 μg/mL e 200 μg/mL quando avaliadas por técnica de microdiluição em microplaca.

9. Produto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por não apresentar potencial genotóxico nos tratamentos agudo, sub-agudo e sub- crônico, demonstrando a segurança do produto para as aplicações tópicas propostas na presente invenção.

10. Produto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por apresentar atividade cicatrizante em modelos em animais lesados com “punch” simulando queimaduras de segundo grau e ferimentos em geral.

11. Produto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por apresentar redução no tempo de cicatrização de áreas doadoras de pacientes queimados, simulando áreas queimadas de até segundo grau e ferimentos em geral.

12. Produto, conforme reivindicação 2, caracterizado por ser utilizado para produtos farmacêuticos, cosméticos, odontológicos e veterinários de uso externo.

13. Produto, conforme reivindicação 2, caracterizado por apresentar atividades anti-séptica, antimicrobiana, cicatrizante e permitir seu uso para tratamento e cicatrização de queimaduras, feridas, acne, lesões e ferimentos da pele e mucosas.

14. Produto, conforme reivindicação 2, caracterizado por poder ser utilizado diretamente nas áreas afetadas na forma de gel quando em temperatura ambiente, ou na forma líquida, através de embalagens na forma de spray, como quando a temperaturas baixas (frio), o produto pode embeber gazes ou curativos como rayon, podendo ser aplicado nas queimaduras de até segundo grau, podendo a área lesada permanecer aberta ou fechada com outros curativos, como gaze para queimados, podendo ainda ser aplicado em feridas crônicas, na forma sol-gel, em acne ou lesões que requeiram a assepsia e cicatrização, o dito produto é para uso tópico.

Images