BRPI0800585B1

BRPI0800585B1 - composições farmacêuticas do peptídeo des-[asp1]-[ala1]-angiotensina-(1-7) e uso do peptídeo des-[asp1]-[ala1]-angiotensina-(1-7)

Info

Publication number: BRPI0800585B1
Application number: BRPI0800585A
Authority: BR
Inventors: José Ferreira Anderson; Augusto Souza Dos Santos Robson; Dario Sinisterra Ruben
Original assignee: Univ Minas Gerais
Priority date: 2008-02-13
Filing date: 2008-02-13
Publication date: 2019-10-22
Also published as: BRPI0800585B8; US20130183367A1; CN102124023A; US9974825B2; EP2264048A2; BRPI0800585A2; EP2264048B1; WO2009100513A3; EP2264048A4; WO2009100513A2

Abstract

peptídio des-[asp1i-[ala1 ]- agonista da angiotensina-(1-7) e composições farmacêuticas para tratamento de doençasa presente invenção relaciona-se ao uso do peptidio des-[asp1]-[aia1j- angiotensina-( 1-7) (ala^1^-arg^2^-vai^3^-tyr^4-llle^5^-his^6^-pro^7^) e/ou compostos relacionados como agentes vasculoprotetores e cardioprotetores em mamíferos. a invenção compreende ainda a obtenção de composições contendo des-[asp^1^]-[ala^1^)-angiotensina-(1-7) e/ou compostos relacionados e seu uso em métodos para tratamento ou prevenção de doenças.

Description

“COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS DO PEPTÍDEO DES-[ASP¹][ALA¹]-ANGIOTENSINA-(1-7) E USO DO PEPTÍDEO DES-[ASP¹]-[ALA¹]ANGIOTENSINA-(1-7)”

A presente invenção relaciona-se a composições farmacêuticas contendo o peptídio Des-[Asp']-[Ala']-Angiotensina-(1-7) (Ala-Arg-Val³Tyr⁴-Ile⁵-His⁶-Pro⁷) e ao uso de tal peptídeo para preparação de medicamentos vasculoprotetores e cardioprotetores em mamíferos, para o tratamento de doenças ou desordens que incluem hipertensão primária ou secundária, hipertensão vascular renal, aterosclerose, injúria por isquemia e reperfusão, infarto agudo do miocárdio, insuficiência cardíaca congestiva aguda ou crônica, hipertrofia ventricular esquerda, hipertrofia vascular, hiperaldosteronismo primário e secundário, diabetes, diabetes neuropática, glomerulonefrite, escleroderma, esclerose glomerular, insuficiência renal, terapia em transplante de órgãos, retinopatia diabética, nefropatias, angioplastias e disfunção erétil.

O octapeptídeo vasoativo angiotensina II (Ang II), considerado como principal membro ativo do sistema renina-angiotensina (SRA), apresenta um papel central na fisiologia e patofisiologia da regulação cardiovascular. O sucesso terapêutico dos inibidores da enzima conversora de angiotensinogênio (ECA) e dos bloqueadores do receptor AT1 como drogas vasculoprotetoras e cardioprotetoras remete ao importante do papel da Ang II na patofisiologia da aterosclerose e hipertensão. Outros peptídeos, menos caracterizados, da família da angiotensinas incluem angiotensina III, angiotensina IV e angiotensina-(1-7) [Ang-(1-7)]. Estes peptídeos apresentam efeitos adicionais ou antagônicos aos efeitos da Ang II. A angiotensina IV é um agonista do receptor AT4 e propicia ação vasodilatadora e inibição de proliferação celular. A Ang-(1-7) possui ações freqüentemente opostas às atribuídas a Ang II, como, vasodilatação, efeito anti-arritmogênico e inibição da proliferação celular, sendo atualmente

Petição 870190053306, de 11/06/2019, pág. 4/28

2/18 considerada como principal contra-regulador dos efeitos cardiovasculares da Ang II. Recentemente, foi identificado o receptor acoplado a proteínas G, Mas, como sendo o receptor para Ang-(1-7).

Os receptores acoplados a proteínas G (GPCRs) apresentam sete seqüências de 22 a 24 resíduos de aminoácido hidrofóbicos que formam sete alfa hélices transmembranares. As hélices transmembranares são conectadas por alças compostas por resíduos de aminoácidos hidrofílicos, sendo a maior alça entre a quarta e quinta hélices na porção extracelular. Outra grande alça liga as hélices cinco e seis na porção intracelular. A porção carboxi-terminal do receptor situa-se na região intracelular e a amino-terminal na porção extracelular. É sabido que a alça entre as hélices cinco e seis, assim como a porção carboxi-terminal, são as regiões responsáveis pela interação do receptor com a proteína G. Atualmente, as proteínas G tem sido identificadas como Gq, Gs, Gi e Go.

Em condições fisiológicas, os GPCRs permanecem em equilíbrio na membrana celular em dois diferentes estados ou conformação: estado inativado ou estado ativado. Um receptor no estado inativado torna-se inabilitado de promover a transdução intracelular de sinais e assim de produzir uma resposta biológica. Quando a conformação do receptor, tornando-o ativado, este promove a transdução intracelular de sinais e produz uma resposta biológica. Fisiologicamente, esta mudança de conformação é induzida pela interação de uma molécula ao receptor. Diferentes tipos de moléculas biológicas podem se ligar a receptores específicos, como por exemplo, peptídeos, hormônios e lipídios, e assim promover uma resposta celular. A modulação de respostas celulares específicas é de grande interesse no tratamento de doenças, e vários agentes químicos agem em GPCRs no tratamento de diversas doenças.

O protooncogene Mas, que codifica uma proteína GPCR (Mas), foi primeiramente detectado in vivo devido suas propriedades tumorogênicas a

Petição 870190053306, de 11/06/2019, pág. 5/28

3/18 qual foram originadas a partir de rearranjos da região flanqueadora 5'. (Young, D. et al., Cell 45:711-719 (1996)). Estudos subseqüentes indicaram que as propriedades tumorogênicas do Mas parecem ser insignificantes.

Originalmente acreditava-se que a Ang II era o ligante para o receptor Mas (Jackson et al., Nature 335:437-440 (1988)). Entretanto, foi determinado, subseqüentemente, que as respostas intracelulares ao cálcio em células transfectadas com o receptor Mas somente ocorreu em células que co-expressavam o receptor de Ang II (Ambroz et al. Biochem. Biophys. Acta 1133:107-111 (1991)). Outros experimentos demonstraram um possível papel para o receptor de Mas em modular a sinalização intracelular dos receptores de Ang II após a estimulação pela Ang II (von Bohlen und Halbech et al., J. Neurophysiol. 83:2012-2020 (2000)). Além disso, Dong et al. relataram que tanto Angiotensina I (Ang I) quanto Ang II não apresentaram afinidade de ligação com o receptor de Mas, sendo que, somente um peptídeo chamado NPFF apresentou afinidade pelo receptor, embora razoavelmente fraca (EC50 about 400 nM) (Dong et al., Cell 106:619-632 (2001)).

Recentemente foi demonstrado que a Ang-(1-7) (Asp¹-Arg²-Val³-Tyr⁴Ile⁵-His⁶-Pro⁷) é um ligante de alta afinidade para o receptor Mas (Kd = 0.33 nM) (Santos, R.A.S. et o al., PNAS 100:8258-8263 (2003)), podendo apontar a um possível papel para o receptor de Mas no regulamento da pressão de sangue e na produção do trombo.

O RAS consiste em uma série das reações enzimáticas que culminam na geração de Ang II no plasma e em vários tecidos incluindo o coração e rins. Após ser liberado pelas células justaglomerulares nas arteríolas renais aferentes, a renina promove a geração do decapeptídeo inativo Ang I através da quebra do angiotensinogênio, que é sintetizado e liberado pelo fígado (Hackenthal E., et al. Physiol. Rev.70:1067-1116 (1990), Tanimoto k., et al. J Biol. Chem. 269:31,334-31,337 (1994)). A ação

Petição 870190053306, de 11/06/2019, pág. 6/28

4/18 peptidase da enzima conversora de angiotensina (ECA) converte Ang I no octapeptídeo Ang II. Existem duas isoformas ECA descritas: (a) ECA somática, que contém dois domínios homólogos a partir de uma duplicação gênica dentro de uma repetição. Cada um com um sítio catalítico funcional; e (b) ECA testicular, que contém somente o domínio do C-terminal como sítio catalítico (Turner A.J., and Hooper N.M., Trends. Pharmacol. Sci. 23:177-183 (2002)). Distantemente da visão clássica do SRA, novos aspectos foram recentemente descobertos, revelando a complexidade deste sistema.

Primeiramente, Ang II tecidual pode ser gerada a partir de enzimas não relacionadas à ECA (Wei C.C., et al. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 282:H2254-2258 (2002)). Outro aspecto, é que a ECA pode clivar e inativar outros peptídeos como bradicinina e Kallidin, que são potentes vasodilatadores que contrabalanceiam os efeitos da Ang II (Turner A.J., and Hooper N.M., Trends. Pharmacol. Sci. 23:177-183 (2002)). Recentemente, foi descoberta uma nova enzima, componente do SRA, ECA2, que pode metabolizar vários peptídeos do SRA (Donoghue et al. Circ. Res. 87:E1-E9 (2000). A ECA 2 pode clivar a Ang I (na porção C terminal) e gerar o peptídeo inativo Ang-(1-9) que, posteriormente, pode ser convertido no peptídeo vasodilatador Ang-(1-7) pela ECA ou por outras peptidases (Donoghue et al. Circ. Res. 87:E1-E9 (2000). Mais importante a ECA2 pode diretamente clivar a Ang II (na porção C terminal) gerando Ang-(1-7).

As ações cardiovasculares e baroreflexo promovidas pela Ang-(1-7) são relatadas como contra-reguladoras às ações da Ang II. No entanto, a Ang II, agindo via receptor AT1 causa vasoconstrição e o aumento simultâneo na pressão sanguínea, Ang-(1-7) via receptor Mas promove vasodilatação e conseqüente diminuição da pressão de arterial (Santos, R. A. S. et al., Regul. Pept. 91 :45-62(2000)).

Petição 870190053306, de 11/06/2019, pág. 7/28

5/18

Tem sido demonstrado que a Ang-(1-7) possui efeito vasodilatador em diversos leitos vasculares, incluindo artérias coronárias de cão e porco, aorta de rato e artéria mesentérica de felino. Também tem sido demonstrado que a infusão crônica de Ang-(1-7) promove redução da pressão arterial média de ratos espontaneamente hipertensos e ratos Dahl sensíveis a sal. Outros estudos demonstraram que a Ang-(1-7) pode bloquear a vasoconstrição promovida pela Ang II em artérias humanas isoladas e vasoconstrição antagonizada na circulação pela Ang II em humanos normotensos. Vasodilatação direta promovida pela Ang-(1-7) na mesma extensão na circulação basal tem sido observada em pacientes normotensos e hipertensos. Embora o mecanismo ainda esteja indefinido, tem sido demonstrado que o efeito vasodilatador da bradicinina é potencializado pela Ang-(1-7).

Várias ações da Ang-(1-7) são antagonizadas pelo antagonista cAlptiwn dn γαραπΊπγ ria Αππ-/'1-71 /A^rE-ArnLx/aE-TvrLllALMi^LO-Ala⁷! /Aseletivo do receptor da Ang-(1-7) (Asp -Arg -Val -Tyr -Ile -His -D-Ala ) (A779) que age como antagonista do receptor Mas. Entretanto, alguns efeitos promovidos pela Ang-(1-7) são somente parcialmente revertidos pelo A-779 (Silva, D. M. R. et al., Peptides 28 :702-707 (2007). Além disso, vários estudos têm demonstrado que Ang-(1-7) pode interagir com ECA, AT1 e com receptores relacionados ao receptor AT2, sugerindo a existência de outros sítios de interação para Ang-(1-7).

Recentemente, estudos desenvolvidos em nosso laboratório apontaram a possível existência de um novo subtipo de receptor para Ang(1-7), uma vez que, a vasodilatação promovida pela Ang-(1-7) em aorta de ratos Sprague-Dawley foi bloqueada pelo do receptor Mas, D-pro7-Ang-(17) (Asp¹-Arg²-Val³-Tyr4-Ile⁵-His⁶-D-Pro⁷), mas não foi bloqueada pelo A-779 (Silva, D. M. R. et al., Peptides 28 :702-707 (2007).

Trabalhos recentes têm demonstrado que a Ang II pode ser processada em Des-[Asp¹]-[Ala¹]-Angiotensina II (Ala1-Ang II) por uma

Petição 870190053306, de 11/06/2019, pág. 8/28

6/18 descarboxilação pós-translacional do resíduo aminoácido aspártico em alanina. A afinidade da Ala¹-Ang II pelo receptor AY ou AT₂ não difere substancialmente da Ang II. Entretanto, a atividade pressora da Ala¹-Ang II em camundongos tipo selvagem é apenas uma fração da atividade da Ang II (Jankowski, V. et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 27:297-302 (2007)). Não foi mencionado neste estudo a existência do peptídeo Des-[Asp¹][Ala¹]-Angiotensina-(1-7) (Ala¹-Arg²-Val³-Tyr⁴-lle⁵-His⁶-Pro⁷), peptídeo processado pela descarboxilação do resíduo aminoácido aspártico em alanina, ou seus possíveis efeitos biológicos, assim como aplicações para tratamento de doenças.

As ciclodextrinas são da família dos oligossacarideos cíclicos que incluem seis, sete ou oito unidades de glucopiranose. Devido a interações estéricas, as ciclodextrinas, CDs, formam uma estrutura cíclica na forma de cone truncado com uma cavidade interna apoiar. Trata-se de compostos quimicamente estáveis que podem ser modificados de maneira regioseletiva.

As ciclodextrinas (hospedeiros) formam complexos com várias moléculas hidrófobas (convidados) incluindo as mesmas de forma completa ou em parte na cavidade. As CDs têm sido usadas para a solubilização e encapsulação de drogas, perfumes e aromatizantes como descrito por (Szejtli, J., Chemical Reviews, (1998), 98, 1743-1753; Szejtli, J., I. Mater. Chem., (1997), 7, 575-587).

Conforme estudos detalhados de toxicidade, mutagenecidade, teratogenecidade e carcinogenecidade sobre as ciclodextrinas, descritos em [Rajewski, R.A., Stella, V., J. Phannaceutical Sciences, (1996), 85, 1142-1169], essas se apresentam com baixa toxicidade, em especial da hidroxipropil-p-ciclodextrina, como relatado em (Szejtli, J. Cyclodextrins: Properties and aplications. Drug Investig., (1990) 2(suppl. 4):11-21). Exceto

Petição 870190053306, de 11/06/2019, pág. 9/28

7/18 para altas concentrações de alguns derivados, que provocam danos aos eritrócitos, estes produtos em geral não acarretam riscos à saúde.

As CDs são moderamente solúveis em água, metanol e etanol e prontamente solúveis em solventes polares apróticos, como o dimetil sulfóxido, dimetilformamida, N ,N -dimetilacetamida e piridina.

Numerosos trabalhos existem na literatura sobre os efeitos do aumento da solubilidade em água de convidados pouco solúveis em água, usando as ciclodextrinas via compostos de inclusão, assim como uma discussão da estabilidade dos complexos de inclusão, essas caraterísticas fisico-químicas foram bem descritas em Szejtli, J., Chemical Reviews, (1998),98, 1743-1753. Szejtli, J., J. Mater. Chem., (1997),7,575- 587. As ciclodextrinas podem ser usadas para a obtenção de formulações farmacêuticas com peptídeos e/ou proteínas visando melhorar sua estabilidade e biodisponibilidade.

Dessa maneira a presente invenção usou a estratégia da formação de compostos supramoleculares entre o peptídeo Des-[Asp1]-[Ala1]AnnintAn<;ina-ri-71 /AlaLArn^-X/aP-TvrLlIp^MiQ^-Prn⁷! a aq cidnrlAYtrinaQ Angiotensina-(1-7) (Ala -Arg -Val -Tyr -Ile -His -Pro ) e as ciclodextrinas, como exemplo de uma composição farmacêutica usada no tratamento ou prevenção de doenças. Estas doenças ou desordens incluem, por exemplo, doenças vasculares ou cardiovasculares como hipertensão primária ou secundária, hipertensão vascular renal, aterosclerose, injúria por isquemia e reperfusão, infarto agudo do miocárdio, insuficiência cardíaca congestiva aguda ou crônica, hipertrofia ventricular esquerda, hipertrofia vascular, hiperaldosteronismo primário e secundário, diabetes, diabetes neuropática, glomerulonefrite, escleroderma, esclerose glomerular, insuficiência renal, terapia em transplante de órgãos, retinopatia diabética, nefropatias, angioplastias e disfunção erétil.

Petição 870190053306, de 11/06/2019, pág. 10/28

8/18

Além das ciclodextrinas, também são utilizados polímeros biodegradáveis, polímeros mucoadesivos e géis como dispositivos de liberação controlada do peptídeo Des-[Asp¹]-[Ala¹]-Angiotensina-(1-7).

Vários polímeros já foram testados em sistemas de liberação controlada. Muitos em função de suas propriedades físicas, tais como: poli(uretanos) por sua elasticidade, poli(siloxanos) ou silicones por ser um bom isolante, poli(metil- metacrilato) por sua força física, poli(vinil álcool) por sua hidrofobicidade e resistência, poli(etileno) por sua dureza e impermeabilidade (Gilding, D.K. Biodegradable polymers. Biocompat. Clin. Implat. Mater. (1981) 2:209-232).

Entretanto, para uso em humanos, o material deve ser quimicamente inerte e livre de impurezas. Alguns dos materiais utilizados em sistemas de liberação são: poli(2-hidroxi-etilmetacrilato), poliacrilamida, polímeros na base de ácido lático (PLA), na base de ácido glicólico (PGA), e os respectivos co-polímeros, (pLGA) e os poli(anidridos) tais como os polímeros na base de ácido sebásico PSA e os co-polímeros com polímeros mais hidrofóbicos.

Algumas patentes descrevem o uso de peptídeos da Angiotensina (17), como na patente PI0105509-7 (WO03039434A2, WO03039434A3),

Millán, Dos Santos et. al. (2003) na qual relata a caracterização do processo de preparação de formulações do peptídeo Angiotensina-(1-7) e seus análogos, agonistas e antagonistas usando as ciclodextrinas, seus derivados, lipossomas e os polímeros biodegradáveis e/ou misturas desses sistemas e/ou dos produtos derivados, que podem ser utilizados no tratamento de diversas patologias como hipertensão arterial, outras doenças cardiovasculares e suas complicações, feridas, queimaduras, eritemas, tumores, diabetes melitus, dentre outras.

Como também a patente WO2007000036, Dos Santos et al. (2006) que descreve o uso do receptor Mas acoplado a proteína G, agonistas e

Petição 870190053306, de 11/06/2019, pág. 11/28

9/18 antagonistas, como modulador da atividade apoptótica para estudo, prevenção e tratamento de doenças.

No entanto a presente invenção é caracterizada pelo uso do peptídeo Ala1-Ang-(1-7) e/ou compostos relacionados, por exemplo, como agente vasculoprotetor ou cardioprotetor em mamíferos. A invenção ainda compreende composições contendo o peptídeo Ala1-Ang-(1-7) e/ou compostos relacionados e seus usos em métodos para tratamento ou prevenção de doenças e desordens. Estas doenças incluem, por exemplo, distúrbios cardiovasculares, hipertensão primária ou secundária, hipertensão renal vascular, aterosclerose, injúria por isquemia e reperfusão, infarto agudo do miocárdio, insuficiência cardíaca congestiva aguda ou crônica, hipertrofia ventricular esquerda, hipertrofia vascular, hiperaldosteronismo primário e secundário, diabetes, neuropatia diabética, glomerulonefrite, escleroderma, esclerose glomerular, falência renal, terapia de transplante de órgãos, retinopatia diabética, neuropatia, angioplastia e disfunção erétil.

A principal relevância da presente invenção é baseada na observação que o peptídeo Des-[Asp1]-[Ala1]-Angiotensina-(1-7) (Ala1Ang-(1-7)) (Ala¹-Arg²-Val³-Tyr4-Ile⁵-His⁶-Pro⁷) promove vasodilatação independente do receptor Mas e receptor AT2 em anéis de aorta de camundongos do tipo selvagem, camundongos com deleção do receptor Mas e camundongos com deleção do receptor AT2. Além do mais, o peptídeo Des-[Asp1]-[Ala1]-Angiotensina-(1-7) promove inibição da ECA.

O peptídeo Des-[Aps1]-[Ala1]-Angiotensina-(1-7) (Ala¹-Arg²-Val³-Tyr⁴Ile⁵-His⁶-Pro⁷) pode ser sintetizado usando a estratégia de síntese em fase sólida, Fmoc/t-butil, conforme CHAN & WHITE, 2000 (CHAN, W.C & WHITE, P.D. Fmoc solid-phase peptide synthesis. A practical approch. Oxford University Press; 2000).

Petição 870190053306, de 11/06/2019, pág. 12/28

10/18

Opcionalmente a Des-[Aps1]-[Ala1]-Angiotensina-(1-7) pode ser produzida a partir da descarboxilação do resíduo aminoácido aspártico formando o resíduo alanina do peptídeo Angiotensina-(1-7) (Ang-(1-7)) (Asp¹-Arg²-Val³-Tyr⁴-Ile⁵-His⁶-Pro⁷) ou a partir da clivagem do resíduo fenilalanina da porção N-terminal do peptídeo Des-[Aps1]-[Ala1]AnnintpnQina II rAla¹-Arn²-\/al³-Tvr⁴-llA⁵-Hk⁶-Prn⁷-Php⁸^ Angiotensina II (Ala -Arg -Val -Tyr -Ile -His -Pro -Phe ).

A Ala1-Ang-(1-7) e/ou compostos relacionados são úteis para tratar e prevenir doenças vasculares ou cardiovasculares, mas não se limita a doenças como, doenças cardiovasculares, hipertensão primária ou secundária, hipertensão renal vascular, aterosclerose, injúria por isquemia e reperfusão, infarto agudo do miocárdio, insuficiência cardíaca congestiva aguda ou crônica, hipertrofia ventricular esquerda, hipertrofia vascular, hiperaldosteronismo primário e secundário, diabetes, neuropatia diabética, glomerulonefrite, escleroderma, esclerose glomerular, falência renal, terapia de transplante de órgãos, retinopatia diabética, neuropatia, angioplastia e disfunção erétil. A Ala1-Ang-(1-7) e/ou compostos relacionados também podem ser usados para tratar e prevenir doenças como, neuropatia diabética periférica, dor, acidente vascular cerebral e isquemia cerebral. Portanto, a Ala1-Ang-(1-7) e/ou compostos relacionados também podem ser usados como agentes neuroprotetores.

Um aspecto da presente invenção relaciona-se ao uso em métodos para tratamento e prevenção de doenças vasculares e cardiovasculares, compreendendo a administração de quantidades efetivas de Ala1-Ang-(1-7) e/ou compostos relacionados ou composições farmacêuticas contendo Ala1-Ang-(1-7) e/ou compostos relacionados.

Outro aspecto da presente invenção relaciona-se ao uso em métodos para tratamento e prevenção de doenças relacionadas à disfunção endotelial, compreendendo a administração de quantidades efetivas de

Petição 870190053306, de 11/06/2019, pág. 13/28

11/18

Ala¹-Ang-(1-7) e/ou compostos relacionados ou composições farmacêuticas contendo Ala1-Ang-(1-7) e/ou compostos relacionados.

Compreende ainda o uso em métodos para tratamento e prevenção de doenças neurológicas, compreendendo na administração de quantidades efetivas de Ala1-Ang-(1-7) e/ou compostos relacionados ou composições farmacêuticas contendo Ala1-Ang-(1-7) e/ou compostos relacionados. Estas doenças neurológicas compreendem, por exemplo, neuropatia diabética periférica, dor, acidente vascular cerebral ou isquemia cerebral.

A presente invenção relaciona-se ainda à obtenção de composições farmacêuticas contendo um ou mais compostos com Ala1-Ang-(1-7) e/ou compostos relacionados, assim como veículos carreadores e/ou excipientes farmacêutica e fisiologicamente aceitáveis.

A produção de composição farmacêutica compreende o uso de uma combinação contendo Ala1-Ang-(1-7) e/ou compostos relacionados juntamente com outro composto para o tratamento de doenças vasculares, cardiovasculares e neurológicas. Por exemplo, a Ala1-Ang-(1-7) e/ou compostos relacionados podem ser usados em combinação com fármacos inibidores da enzima conversora de angiotensina (ECA) para o tratamento de doenças em que os inibidores de ECA são convencionalmente usados.

A presente invenção pode ser melhor entendida seguindo, referências, descrição detalhada e exemplos ilustrativos que são entendidos como incorporação exemplificada não limitada da invenção.

Exemplo 1 - O efeito vasodilatador da Ala¹-Ang-(1-7) independente do receptor Mas.

Este exemplo descreve o efeito vasodilatador independente do receptor Mas produzido pela Ala1-Ang-(1-7) em anéis aorta de camundongos com deleção genética do receptor Mas (Mas-/-) e camundongo tipo selvagem (Mas+/+), em duas linhagens diferentes, C57/Bl-6 e FVB/N.

Petição 870190053306, de 11/06/2019, pág. 14/28

12/18

Anéis originários da aorta torácica descendente (2 mm), livre de tecido adiposo e tecido conectivo, foram incubados em solução gaseificada (95% O₂ and 5%CO₂) de Krebs-Henseleit (mmol/L): NaCl 110,8; KCl 5,9; NaHCO3 25,0; MgSO4 1,07; CaCl₂ 2,49; NaH₂PO₄ 2,33 e glicose 11,51; sob uma temperatura de 37^oC e uma tensão de 0,5 g, sendo equilibrado por 1 hora. A presença funcional de endotélio foi testada pela capacidade de relaxamento produzida pela acetilcolina [ACh] (10 μΜ) em vasos précontraídos com fenilefrina (0,3 μΜ). Foram considerados vasos que apresentaram relaxamento superior a 70% da extensão de contração produzida pela fenilefrina. Os dados de atividade mecânica foram adquiridos isometricamente através de um transdutor de força (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA), amplificado (Model TMB-4; World Precision Instruments, Inc.) e convertido em sinal digital (AD16JR; World Precision Instruments, Inc.). Também foi utilizado um software específico para aquisição dos dados (World Precision Instruments, Inc.).

Os anéis de aorta de camundongos Mas-/- e Mas+/+ de ambas linhagens (C57/Bl-6 e FVB/N) foram pré-contraídos ao mesmo nível de tensão (aproximadamente 1,0 g de tensão) com uma concentração submáxima de fenilefrina (0,1 μΜ). Ala1-Ang-(1-7) e Ang-(1-7) foram adicionados em concentrações crescentes e acumulativas após a resposta de contração a fenilefrina ser estabilizada. Os resultados são apresentados como média ± E.P.M. Foi utilizado como método comparativo das curvas o teste de análise estatística de variância Two-way (ANOVA) seguido do pós-teste de Bonferroni para comparar as curvas concentração dependente obtidas nos anéis de aorta. O efeitos vasodilatadores da Ala1-Ang-(1-7) e Ang-(1-7) foram expressos como porcentagem de relaxamento relativo a máxima contração induzida pela fenilefrina. As análises estatísticas foram consideradas significativas quando o valor de p foi menor que 0,05.

Petição 870190053306, de 11/06/2019, pág. 15/28

13/18

Ambos peptídeos, Ala1-Ang-(1-7) e Ang-(1-7), produziram vasorelaxamento em anéis de aorta de camundongos Mas+/+ em ambas linhagens usadas (C57/Bl-6 e FVB/N). Entretanto, a resposta vasodilatadora da Ala1-Ang-(17) foi completamente preservada nos camundongos Mas-/- (em ambas linhagens, C57/Bl-6 e FVB/N), constatando à ausência de resposta da Ang(1-7) (em ambas linhagens, C57/Bl-6 e FVB/N). A figura 1 demonstra o efeito da Ala1-Ang-(1-7) (Figura 1A) e Ang-(1-7) (Figura 1B) anéis de aorta de camundongos Mas-/- e Mas+/+ da linhagem FVB/N. A figura 2 demonstra o efeito da Ala1-Ang-(1-7) (Figura 2A) e Ang-(1-7) (Figura 2B) em anéis de aorta de camundongos Mas-/- e Mas+/+ da linhagem C57/Bl-6. Estes resultados demonstram o efeito vasodilatador produzido pela Ala¹Ang-(1-7) e que este efeito é independente do receptor Mas, diferentemente do efeito vasodilatador da Ang-(1-7) que é Mas dependente.

Exemplo 2 - O efeito vasodilatador da Ala¹-Ang-(1-7) é independente do receptor AT₂.

Este exemplo descreve o efeito vasodilatador independente do receptor AT2 produzido pela Ala1-Ang-(1-7) e Ang-(1-7) em anéis de aorta de camundongo com deleção genética do receptor AT₂ (AT₂-/-).

Anéis originários da aorta torácica descendente (2 mm), livre de tecido adiposo e tecido conectivo, foram incubados em solução gaseificada (95% O₂ and 5%CO₂) de Krebs-Henseleit (mmol/L): NaCl 110,8; KCl 5,9; NaHCO3 25,0; MgSO4 1,07; CaCl₂ 2,49; NaH₂PO₄ 2,33 e glicose 11,51; sob uma temperatura de 37^oC e uma tensão de 0,5 g, sendo equilibrado por 1 hora. A presença funcional de endotélio foi testada pela capacidade de relaxamento produzida pela acetilcolina [ACh] (10 μΜ) em vasos précontraídos com fenilefrina (0,3 μΜ). Foram considerados vasos que apresentaram relaxamento superior a 70 % da extensão de contração produzida pela fenilefrina. Os dados de atividade mecânica foram adquiridos isometricamente através de um transdutor de força (World

Petição 870190053306, de 11/06/2019, pág. 16/28

14/18

Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA), amplificado (Model TMB-4; World Precision Instruments, Inc.) e convertido em sinal digital (AD16JR; World Precision Instruments, Inc.). Também foi utilizado um software específico para aquisição dos dados (World Precision Instruments, Inc.).

Os anéis de aorta de camundongos AT2-/- foram pré-contraídos (aproximadamente 1,0 g de tensão) com uma concentração submáxima de fenilefrina (0,1 μΜ). Ala1-Ang-(1-7) e Ang-(1-7) foram adicionados em concentrações crescentes e acumulativas após a resposta de contração a fenilefrina ser estabilizada. Os resultados são apresentados como média ± E.P.M. Foi utilizado como método comparativo das curvas o teste de análise estatística de variância Two-way (ANOVA) seguido do pós-teste de Bonferroni para comparar as curvas de concentração dependente, obtidas nos anéis de aorta. Os efeitos vasodilatadores da Ala1-Ang-(1-7) e Ang-(17) foram expressos como porcentagem de relaxamento relativo à máxima contração induzida pela fenilefrina. As análises estatísticas foram consideradas significativas quando o valor de p foi menor que 0,05.

O efeito vasodilatador produzido pela Ala1-Ang-(1-7) e Ang-(1-7) foram preservados em anéis de aorta de camundongos AT2-/- (Figura 3). Este resultado demonstra que os efeitos vasodilatadores produzidos pela Ala¹Ang-(1-7) e Ang-(1-7) são independentes do receptor.

Exemplo 3 - O efeito vasodilatador da Ala¹-Ang-(1-7) é dependente do endotélio.

Este exemplo descreve a dependência do endotélio para a atividade vasorelaxante da Ala1-Ang-(1-7).

Anéis originários da aorta torácica descendente (2 mm), livre de tecido adiposo e tecido conectivo, foram incubados em solução gaseificada (95% O₂ e 5% CO₂) de Krebs-Henseleit (mmol/L): NaCl 110,8; KCl 5,9; NaHCO₃25,0; MgSO₄ 1,07; CaCl₂ 2,49; NaH₂PO₄ 2,33 e glicose 11,51; sob uma temperatura de 37^oC e uma tensão de 0,5 g, sendo equilibrado por 1 hora.

Petição 870190053306, de 11/06/2019, pág. 17/28

15/18

A presença funcional de endotélio foi testada pela capacidade de relaxamento produzida pela acetilcolina [ACh] (10 μM) em vasos précontraídos com fenilefrina (0,3 μΜ). Para os protocolos experimentais na ausência de endotélio, o endotélio foi removido por leve fricção na superfície interna do vaso. Foram considerados vasos que apresentaram relaxamento, promovido pela acetilcolina, superior a 70 % da extensão de contração produzida pela fenilefrina. Os dados de atividade mecânica foram adquiridos isometricamente através de um transdutor de força (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA), amplificado (Model TMB-4; World Precision Instruments, Inc.) e convertido em sinal digital (AD16JR; World Precision Instruments, Inc.). Também foi utilizado um software específico para aquisição dos dados (World Precision Instruments, Inc.).

A atividade vaso-relaxante da Ala1-Ang-(1-7) foi medida em vasos (Mas+/+ e Mas-/-, nas linhagens C57/Bl-6 e FVB/N) na presença ou ausência de endotélio funcional pré-contraídos (aproximadamente 1,0 g de tensão) com uma concentração submáxima de fenilefrina (0,1 μΜ). Foi adicionado Ala¹Ang-(1-7) em concentrações crescentes e acumulativas após a resposta de contração a fenilefrina ser estabilizada. Os resultados são apresentados como média ± E.P.M. Foi utilizado como método comparativo das curvas o teste de análise estatística de variância Two-way (ANOVA) seguido do pósteste de Bonferroni para comparar as curvas concentração dependentes obtidas nos anéis de aorta. Os efeitos vasodilatadores da Ala1-Ang-(1-7) foram expressos como porcentagem de relaxamento relativo à máxima contração induzida pela fenilefrina. As análises estatísticas foram consideradas significativas quando o valor de p foi menor que 0,05.

O efeito vasodilatador produzido pela Ala1-Ang-(1-7) foi abolido em vasos que não apresentavam endotélio funcional (Figura 4). Estes resultados demonstram que o efeito vasodilatador produzido pela Ala1-Ang-(1-7) é dependente de endotélio.

Petição 870190053306, de 11/06/2019, pág. 18/28

16/18

Exemplo 4 - Ala¹-Ang-(1-7) promove inibição da enzima conversora de angiotensina.

Este exemplo descreve a atividade de inibição da enzima conversora de angiotensina (ECA) promovida pela Ala1-Ang-(1-7).

A atividade plasmática da ECA foi medida pelo método fluorimétrico utilizando Hip-His-Leu como substrato, como previamente descrito (Santos, R.A.S. et al., Hypertension, 7:244 -52, (1985)). Alíquotas de plasma (10 pL) de ratos Wistar foram incubadas com 500 mL de uma solução contendo, 1mM de substrato (Hip-His-Leu) e 0,4 M de borato de sódio, 0,9 M NaCl (pH = 8,3) por um período de 15 minutos a 37^oC. A reação foi parada pela adição de 1,2 mL de NaOH a 0,34 M e 100 mL de ortoftaldeído (20 mg/ mL em metanol). Após um período de 10 minutos a temperatura ambiente foi adicionado 200 mL de HCl a 3 N. Posteriormente, após a centrifugação a 800 x g por 5 minutos a fluorescência da solução sobrenadante foi medida (excitação 365 nm e emissão 495 nm). O branco foi preparado invertendo a ordem de adição de plasma e NaOH. Uma curva de 0,5 a 20 nmol contendo o produto (His-Leu) formado quebra do substrato Hip-His-Leu pela atividade da ECA plasmática foi preparada em cada ensaio. Para testar o efeito de inibição da ECA pela peptídeos Ang-(1-7) e Ala1-Ang-(1-7), foi adicionado

3,3 x 10^-7 ou 3,3 x 10^-6 M de cada peptídeo antes da adição do plasma. A especificidade do ensaio foi demonstrada pela inibição de 98% da atividade da ECA utilizando 5 mM de enalaprilato. A porcentagem inibição da atividade enzimática foi calculada em função da atividade máxima obtida.

Os peptídeos Ang-(1-7) and Ala1-Ang-(1-7) inibiram a atividade da ECA. Entretanto, o efeito inibitório promovido pela Ala1-Ang-(1-7) (3,3 x 10^-7 M: 76,3% da inibição de ECA; 3,3 x 10^-6 M: 98,3 % da inibição) foi maior que o promovido pela Ang-(1-7) (3,3 x 10^-7 M: 42,4 % da inibição de ECA; 3,3 x 10^-6 M: 85,8 % da inibição).

Petição 870190053306, de 11/06/2019, pág. 19/28

17/18

Exemplo 5 - Preparação e caracterização dos compostos de inclusão do peptídeo Ala¹-Ang-(1-7) em ciclodextrinas.

Preparação do composto de inclusão entre a β-ciclodextrina e seus derivados e Ala1-Ang-(1-7) e seus compostos relacionados.

A preparação é feita em proporções equimolares de β-ciclodextrina e seus derivados e a Ala1-Ang-(1-7) e seus compostos relacionados em soluções aquosas. A mistura de soluções é submetida à agitação constante até a completa dissolução da β-ciclodextrina.

Posteriormente a mistura é congelada a temperatura de nitrogênio líquido e submetida ao processo de liofilização por 24 horas. O sólido assim obtido foi caracterizado através das técnicas físico-químicas de análises. A técnica que forneceu características importantes da interação hospedeiro: convidado foi a fluorescência e a espectoscopia de absorção na região do ultravioleta-visível.

Os testes de absorção e estabilidade biológica foram feitos com soluções do composto de inclusão peptídeo-ciclodextrina. Foram preparados dispositivos de liberação controlada do peptídeo, bem como de seus compostos de inclusão peptídeo-ciclodextrina.

Dessa forma, o peptídeo Ala1-Ang-(1-7) e seus compostos relacionados incluídos à ciclodextrina permitem obter uma formulação oral, ou sistêmica com uma maior duração do efeito.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. Demonstra o efeito vasodilatador da Ala1-Ang-(1-7) (A) e Ang-(1-7) (B) em anéis de aorta de camundongos Mas-/- e Mas+/+ (linhagem FVB/N). Cada ponto representa a média ± E.P.M.

Figura 2. Demonstra o efeito vasodilatador da Ala1-Ang-(1-7) (A) e Ang-(1-7) (B) em anéis de aorta de camundongos Mas-/- e Mas+/+ (linhagem C57/Bl-6). Cada ponto representa a média ± E.P.M.

Petição 870190053306, de 11/06/2019, pág. 20/28

18/18

Figura 3. Demonstra o efeito vasodilatador da Ala¹-Ang-(1-7) e Ang(1-7) em anéis de aorta de camundongos AT₂-/-. Cada ponto representa a média ± E.P.M.

Figura 4. Demonstra a dependência do endotélio para o efeito 5 vasodilatador da Ala¹-Ang-(1-7) e Ang-(1-7) em anéis de aorta de camundongos Mas-/- (A) e Mas+/+ (B) de linhagem FVB/N, e camundongos Mas-/-(C) e Mas+/+ (D) de linhagem C57/BL-6. Cada ponto representa a média ± E.P.M.

Figura 5. Demonstra a atividade inibidora de ECA pelos peptídeos 10 Ala¹-Ang-(1-7) e Ang-(1-7). Cada ponto representa a média ± E.P.M.

Petição 870190053306, de 11/06/2019, pág. 21/28

Claims

REIVINDICAÇÕES

1- COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por conter o peptídeo Des-[Asp¹]-[Ala¹]-Angiotensina-(1-7), definido pela sequência de aminoácido SEQ ID N° 1, num composto com ciclodextrina, na presença de

5 carreadores e/ou excipientes farmacêutica e fisiologicamente aceitáveis.
2- COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser administrada pela via oral, intramuscular, intravenosa, subcutânea, tópica, transdérmica ou com dispositivos que possam ser implantados ou injetados, para o tratamento de doenças.

10 3- COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizada pelos carreadores serem sistemas de liberação controlada de fármacos selecionados do grupo compreendendo ciclodextrinas, polímeros biodegradáveis, polímeros mucoadesivos, géis ou lipossomas.

15 4- USO DO PEPTÍDEO conforme definido pela SEQ ID N° 1, caracterizado por ser na preparação de medicamentos para tratamento ou prevenção de doenças vasculares e cardiovasculares, doenças ou desordens neurológicas, renais, endócrinas, reprodutivas, dermatológicas, neoplásicas e sanguíneas, de humanos ou mamíferos.

Petição 870190053306, de 11/06/2019, pág. 22/28